TWI332988B - Optimized expression of hpv 58 l1 in yeast - Google Patents

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1332988 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明一般係關於預防及/或治療人類乳突病毒（HPV)之 感染。更特言之，本發明係關於一種編碼HPV58 L1蛋白質 之人造聚核苷酸序列及包括該聚核苷酸序列之重組載體及 宿主。本發明亦關於HPV58類病毒顆粒（VLPs)，其中該VLPs 係藉由在酵母菌細胞中表現重組HPV 58 L1或L1+L2而製 得，及關於其在疫苗上之用途及預防及治療HPV感染之醫 藥組合物。 【先前技術】 有超過80種的人類乳突病毒（HPV)，其中許多已知與廣泛 種類的生物表型有關，從良性增生瘤至惡性癌（見McMurray et al·，Int. J. Exp. Pathol. 82(1): 15-33 (2001))。HPV6及 HPV11為與良性瘤，非惡性尖形濕疣及/或生殖或呼吸黏膜 之低度發育異常之最通常相關種類。HPV16及HPV18為與 子宮頸，陰道，陰戶及肛道之原位及入侵性癌最頻繁相關 之高危險種類。超過90%的子宮頸癌與HPV16，HPV18或最 不普遍的致瘤種類HPV31、-3 3、-45、-52及-58之感染有關 (Schiffman et al., J. Natl. Cancer Inst. 85(12): 958-64(1993))。在超過90%的子宮頸癌檢測出HPV DNA之 觀察，對於HPV引發子宮頸癌提供了強力的流行病學證據。 乳突病毒為小的（50-60 nm)、非包膜、二十面體之DNA 病毒，其編碼高至八個早期及二個晚期基因。病毒基因體 之開放讀架（ORFs)標示為E1至E7，及L1及L2，其中「E」 9698l.doc 1332988 表示早期及「’L」表示為晚期。L1及L2編碼病毒外鞘蛋白 質，而E基因與例如病毒複製及細胞轉形之功能有關。 L1蛋白為最主要的外鞘蛋白質且具有55-60 kDa之分子 量，L2蛋白為最少的外鞘蛋白質。免疫數據建議大部份的 L2蛋白對於病毒外鞘中之L1蛋白為内在的。L1及L2蛋白在 不同的乳突病毒之間具高度保留性。 L1蛋白或L1及L2蛋白之組合在酵母菌 '昆蟲細胞、哺乳 動物細胞或細菌中之表現，導致類病毒顆粒（VLPs)的自我 組裝（見 Schiller and Roden, Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information, pp 101-12 (1996))。VLPs係形態 上與真病毒顆粒相似，且當施用至動物或人類時，能夠誘 發高效價的中和抗體效果。由於VLPs不含潛在的致癌病毒 基因體，其對於HPV疫苗發產中活病毒之利用，呈現安全 的另一方式（見 Schiller and Hidesheim，J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000))。由於此種理由，LI及L2基因已被鑑定為發 展用於HPV感染及疾病之預防及治療疫苗之免疫目標。 HPV疫苗發展及商業化，被在成功轉形宿主生物内外鞘 蛋白之高度表現水平之困難所阻礙，限制了純化蛋白質的 製造。因此，儘管編碼HPV L1蛋白質（如HPV58 L1蛋白）之 野生型核苷酸序列之鑑定，仍高度希望能發展出利用在有 意的宿主細胞内最適化表現出HPV58 L1編碼核苷酸序列之 天然HP V L1蛋白之可容易更新之來源。此外，製造大量具 有用於疫苗發展之天然蛋白質之授與免疫性質之HPV58 L1 96981.doc 1332988 VLP是有用的。 【發明内容】 本發明係關於誘發或增進對HPV58 L1基因表現之蛋白 質產物之免疫性之組合物及方法。特言之，本發明提供編 碼HPV58 L1蛋白之聚核苷酸，其中該聚核苷酸經密碼最適 化以在酵母菌細胞中高水平表現。本發明進一步提供 HPV58類病毒顆粒（VLPs)，其中該VLPs係藉由在酵母菌中 表現重組HPV58 L1蛋白或L1+L2蛋白所製造，及揭示 $ HPV58 VLPs在用於預防及/或治療HPV相關癌症之醫藥組 合物及疫苗之用途。 本發明係關於編碼HPV58 L1蛋白之人造DNA分子。該人 造分子之密碼經設計以使用在酵母菌中較佳的密碼。該人 造分子可作為HP V5 8 L1蛋白之來源，其可自我組裝成 VLPs。該VLPs可用於以VLP為主之疫苗。 本發明之一實施態樣，係包括一編碼如SEQ ID N0:2所示 之HPV58 L1蛋白質之人工核酸分子，該核酸分子包括密碼 翁 最適化以在酵母菌細胞中高水平表現之核苷酸序列。在一 較佳實施態樣中，該核酸包括如SEQ ID NO: 1所示之核苷酸 序列（在此標示為「58 LI R序列」）。 本發明亦提供一種重組載體及重組宿主細胞，其為原核 及真核’其包含揭示於整份說明書之核酸分子。在本發明 之一較佳實施態樣中，該宿主細胞為酵母菌細胞。 本發明亦關於一種在重組宿主細胞内表現HPV58 L1蛋 白之方法，其包括（a)導入一包括編碼HPV58 L1蛋白之核酸 96981.doc 1332988 之載體至酵母菌宿主細胞中；及（b)在允許該HPV58 L1蛋白 表現之條件下，语養該酵母菌宿主細胞。 本發明進一步關於在重組宿主細胞内表現HPV5 8 L1蛋 白之方法，其包栝0)導入一包括編碼HPV58 L1蛋白之核酸 分子之載體至酵母菌宿主細胞中；其中該核酸分子係經密 碼最適化以在酵母菌宿主細胞中最適化表現’及（b)在允許 該HP V5 8 L1蛋白表現之條件下’培養該酵母菌宿主細胞。 在本發明此方面之一較佳實施態樣中’該核酸包括如 SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列。 本發明亦關於〆種在酵母菌細胞中製造之HPV5 8類病毒 顆粒（VLPs),製造HPV58 VLPs之方法及利用HPV58 VLPs 之方法。 在本發明之一較佳實施態樣中’該酵母菌係選自包括啤 酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、漢遞酵母（Hansenula polymorpha)、甲醇酵母（Pichia pastoris)、脆壁克魯維酵母 (Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis)及裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)所構成群 組。 本發明之另一方面係HPV58 VLP，其中該VLP係藉由在 酵母菌中表現重組HPV58 L1或HPV58 L1+L2蛋白所製得。 本發明之再另一方面係HPV58 VLP ’其包括由密碼最適 化之HPV58 L1基因所製造之HPV58 L1蛋白質。在本發明此 方面之一較佳實施態樣中，該密碼最適化之HPV58 L1基因 包括如SEQIDN0:1所示之核苷酸序列。 9698l.doc 1332988 本發明亦提供一種在動物内誘發免疫反應之方法，其包 括投予HPV58類病毒顆粒至動物中。在本發明此之一較佳 實施態樣中，該HPV58 VLPs係由密碼最適化基因所製造。 本發明之再另一方面係預防或治療HP V相關子宮頸癌之 方法，其包括投予包含HPV58 VLPs之疫苗至哺乳動物中。 在本發明此方面之一較佳實施態樣中，該HPV58 VLPs係在 酵母菌中製造。 本發明亦關於一種疫苗，其包括HPV58類病毒顆粒 (VLPs)，其中該HPV58 VLPs係在酵母菌中製造。 在本發明此方面之另一較佳實施態樣中，該疫苗進一步 包括至少一種額外HPV種類之VLPs。該至少一種額外HPV 種類之VLPs可為任何有興趣的HPV種類，包括此技藝中所 述之任何HPV種類或往後鑑定出者。在一較佳實施態樣 中，該HPV種類係為與臨床表型（例如疣或子宮頸癌）有關之 種類。在進一步之較佳實施態樣中，該至少一種額外HPV 種類係選自包括HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、 HPV3 3、HPV3 5、HPV3 9、HPV45、HPV5 卜 HPV52、HPV5 5、 HPV56、HPV59及HPV68所構成群組。 本發明亦關於一種醫藥組合物，其包括HPV58類病毒顆 粒及醫藥上可接受載體，其中該HPV58 VLPs係在酵母菌中 製造。再者，本發明係關於醫藥組合物，其包括HPV58 VLPs 及至少一種額外HPV種類之VLPs。在一較佳實施態樣中， 該至少一種額外HPV種類之VLPs係選自包括HPV6、 HPV11、HPV16、HPV18、HPV3 卜 HPV33、HPV35、HPV39 ' 96981.doc • 10· 1332988 HPV45、HPV5 卜 HPV52、HPV55、HPV56、HPV59及 HPV68 所構成群組。 如本說明書整份及所附申請專利範圍中所使用者，該單 數形「a」、「an」及rthe」係包括複數，除非本文中另有清 楚規定。 如本說明書整份及所附申請專利範圍中所使用者，下列 定義及縮寫適用： 「啟動子」一詞係指RNA聚合酶結合之〇ΝΑ股上之辨識 位點。啟動子與RNA聚合酶形成複合物，啟動及驅使轉錄 活性。該複合物可由活化名為「增強子」或「上游活化序 列」之序列或抑制名為「沉默子」而經修飾。 「載體」一詞係指DNA片段可藉以經導入至宿主生物體 或宿主組織之一些工具。有不同種類的載體，包括質體、 病毒（包括腺病毒）、噬菌體及黏接質體。 「卡g」一詞係指自載體表現出的核苷酸或基因序列， 例如編碼HPV58 L1蛋白之核苷酸或基因序列。一般而言， 卡匣包括插入至載體之基因序列，其中在某些實施態樣 中’並k供表現調節序列以表現核苷酸或基因序列。在其 他的實施態樣中，核苷酸或基因序列提供其表現之調節序 列。在進一步的實施態樣中’載體提供一些調節序列而核 普酸或基因序列提供其他的調節序列。例如，載體能提供 轉錄核苷酸或基因序列的啟動子，而核苷酸或基因序列提 供轉錄之終止序列。可由載體提供的調節序列，包括但非 限於增強子、轉錄終止序列、剪切接受者及贈予者序列， 96981.doc -11· 1332988 插入子、核糖體結合序列，及多（A)加成序列。 「58 L1野生型序列」及「58 LI wt序列」等詞係指在此 揭示於SEQ ID N0:3之HPV58 L1序列。雖然HPV58 L1野生 型序列先前已被敘述，在臨床株所得之DNAs發現少數的序 列變異並非不尋常。因此，自先前顯示含有HPV58DNA之 臨床樣品分離出代表性58 L1野生型序列（見實例1)。使用58 L1野生型序列作為參考序列，以比較在此揭示之密碼最適 化58 L1序列（見圖1)。 籲 「HPV 58 LI R」及「58 LI R」等詞係指在此所揭示仿 效之人造HP V5 8 L1核苷酸序列，其中該序列經重建使其包 含適用於酵母菌細胞高水平表現之密碼。 「有效量」一詞意為將足夠的疫苗組合物導入以產生適 當水平的多肽，使產生免疫反應。熟習此項技術者認知此 水平可變化。 「保留性胺基酸置換」係指一胺基酸殘基被其他化學相 似的胺基酸殘基所置換。此種保留性胺基酸置換之實例.籲 為：疏水性殘基（異白胺酸、白胺酸、纈胺酸或甲硫胺酸） 置換成另一疏水性殘基；極性殘基置換成帶電相同之另一 極性殘基（如精胺酸換成離胺酸；谷胺酸換成天門冬胺酸）。 「哺乳動物」一詞係指任何哺乳動物，包括人類。 VLP」或「VLPs」意為類病毒顆粒或數個類病毒顆粒。 「人造的」意為HPV58L1基因經創造使其所含之核苷酸 序列，與存在於天然發生的野生型Hpv58 u基因（58 L1 wt，SEQ ID驗取㈣酸序料同。如前述，在此所提 96981.doc 1332988 供之人造分子’’包括含有適合酵母菌中表現之密碼之核苷 酸序列。在此所提供之人造分子編碼與野生型HPV58L1基 因（SEQ ID N0:2)相同之胺基酸序列。 【實施方式】 大部份的子宮頸癌與特定致癌種類之人類乳突病毒 (HPV)之感染有關。本發明係關於誘發或增進對致癌HPV種 類之基因所表現之蛋白質產物之免疫性。特言之，本發明 提供編碼HPV58 L1蛋白之聚核苷酸，其中該聚核苷酸經密 碼最適化以在酵母菌中高水平表現。本發明亦提供HPV5 8 類病毒顆粒（VLPs)，其係在酵母菌中製造，及揭示該聚核 苷酸及VLPs在用於預防及/或治療HPV相關癌症之醫藥組 合物及疫苗之應用。 野生型HPV58 L1核苷酸序列已被報導（Genbank Accession # NC—001443，見 Kirii et al.，Virology 185(1): 424-427 (1991))。本發明提供編碼HPV58 LI蛋白之人造 DNA分子。本發明之人造分子包括多個密碼的序列，其中 至少一些密碼經改變，以使用在酵母菌細胞較佳之密碼用 於高水平表現。該人造分子可作為HPV58 L1蛋白表現之編 碼序列’其可自我組裝成VLPs。該VLPs可用於以VLP為主 之疫苗’藉由中和抗體及細胞媒介的免疫性，提供對抗乳 突病毒感染之有效免疫預防。此種以VLP為主之疫苗，亦 可用於治療已確定的HPV感染。 HPV VLPs在酵母菌中之表現，提供了成本效率及易於在 發酵槽内大量生長的優點《此外，酵母菌基因體可容易地 96981.doc 13 1332988 改變以確保篩選出具有增強生長及表現潛力之重組及經轉 形之酵母菌。然而，許多HPV L1蛋白質，包括HPV58 L1 在酵母菌中的表現水平，低於預期所欲的商業上大量生產。 因此，本發明係關於最適化HPV58 L1基因序列，其經「最 適化j以在酵母菌細胞環境中能高水平表現。 四種可能的核苷酸鹼基構成的「三聯體」密碼組，可存 在超過60種不同的形式。由於這些密碼提供的訊息僅有20 種不同的胺基酸（及轉錄起始及終止），一些胺基酸可由超過 一組岔碼所編碼，此現象已知為密碼重複性。由於一些未 疋全瞭解的原因，替代的密碼並未平均地存在於不同種類 細胞的内源性DNA中。確實地，在特定細胞類型中係存在 不同天然層次或「優選」的特定密碼組。例如，胺基酸白 胺酸係由六種DNA密碼組所特定而成，包括CTA、CTc、 CTG、CTT、TTA及TTG。將微生物的基因體密碼利用頻率 進行徹底分析，顯示出大腸桿菌的内源性DNA含有CTG白 胺酸特異密碼，而酵母菌及黏菌的DNA最常見者則包括 TTA白胺酸特異密碼。由於此種層次差異，一般咸信大腸 桿菌宿主得到富含白胺酸多肽的高水平表現，視某些密碼 使用頻率程度而定。例如，富含TTA密碼組的基因可能在 大腸桿菌_貧乏地表現，而富含CTG基因將可能在此宿主 中尚度表現。同樣地’在酵母菌宿主内表現富含白胺酸多 肽的較佳密碼為TTA。 重組DNA技術中在、碎普好現象的暗示係為明顯的，且此 現象可作為解釋許多先前的失敗，以達到外來DNa在轉形 96981.doc -14· 1332988 伯主生物體内之咼表現水平一較不「喜，好」的密媽可重複地 存在於插入的基因内，而用於表現的宿主細胞機器經可能 …、法有效率地運作。此現象建議了被設計成含有經計劃的 佰主細胞吾好岔碼之人造基因，可提供外來遺傳物質對重 組蛋白質表現之實現之最適當形式。因此，本發明之一方 面為HPV58 L1基因係經密碼最適化以在酵母菌中高水平表 現。在本發明之一較佳實施態樣中，發現使用編碼相同蛋 白質序列之替代密碼組，可移除酵母菌細胞對HpV58 “蛋 白質表現之限制。 根據本發明，HP V5 8 L1基因片段經轉換成具有相同轉譯 序列仁έ有替代也、媽使用之序列，如Sharp and Cowe (Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7:657-678 (1991))所述，在此併入作為參考。此方法 一般包括：鑑定出非一般與高度表現之酵母菌基因相關之 野生型序列中之密碼，並以最適合在酵母菌細胞中高度表 現之岔碼置換。隨後檢查此新的基因序列中由此等密碼置 換所產生的非所欲序列（如，「ATTTA」序列、由插入子剪 切辨識位點不小心產生者、多餘的限制酶位點 '高GC含 里、酵母菌可辨識的轉錄终止訊號之存在等等）。非所欲的 序列可藉由將已存在的密碼以編碼相同胺基酸之不同密碼 组而移除。隨後測試此人造基因片段以改進表現。 上述的方法係用於創建HPV58L1之人造基因片段，結果 產生包含最適合高水平表現的密碼組之基因。上述程序提 供了設計用於HPV疫苗的密碼最適化基因之方法之摘要， 969Sl.doc -15- 1332988 技藝人士當明碌類似的疫苗功效或增強的基因表現可藉由 在該程序中的少數變化或序列中的少量變化而達成。 據此，本發明係關於一種人造聚核苷酸，其包括編碼 HPV58 L1蛋白質或HPV58 L1蛋白質之生物活性片段或變 異體形式之人造聚核苷酸序列，該聚核苷酸序列包括在酵 母菌宿主細胞中最適合表現之密碼。該HPV58 L1蛋白質之 變異體形式，包括但非限於：保留性胺基酸置換、胺基端 截斷、羧基端截斷、刪除、或添加。任何此種生物活性片 段及/或突變株編碼蛋白質或蛋白質片段，其至少實質上模 仿如SEQ ID N0:2所示之HPV58 L1蛋白質之免疫特性。本 發明之人造聚核苷酸編碼表現功能性HPV58 L1蛋白質之 mRNA分子，以用於醫療性或預防性HPV疫苗之發展。 本發明之一方面係一種密碼最適化之核酸分子，其編碼 如SEQ ID N0:2所示之HPV58 L1蛋白質，該核酸分子包括 如SEQ ID N0:1所示之核苷酸序列。 本發明亦關於一種重組載體及重組宿主細胞，其為原核 及真核，其含有揭示於整份說明書之核酸分子。在本發明 之一較佳實施態樣中，該宿主細胞為酵母菌細胞。 透過在此所述方法之人造HPV58 DNA或其片段，可藉由 分子選殖成含有適當啟動子及其他適當轉錄調節元素之表 現載體後重組地表現，或轉移至原核或真核宿主細胞中以 製造重組HPV58 L1。此種操作技術全部參見Sambrook et al. 戶斤述（Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989)； 96981.doc -16- 1332988

Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York (1988) ； Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1990))，在此全部併入參考。 因此，本發明關於一種在重組宿主細胞中表現HPV58 LI 蛋白質之方法，其包括··（a)導入一包括編碼HPV58 L1蛋白 之核酸之載體至酵母菌宿主細胞中；及（b)在允許該HPV58 L1蛋白表現之條件下，培養該酵母菌宿主細胞。 本發明進一步關於一種在重組宿主細胞中表現HPV58 L1蛋白質之方法，其包括：（a)導入一包括編碼HPV58 L1 蛋白之核酸分子之載體至酵母菌宿主細胞中；其中該核酸 分子係經密碼最適化以在酵母菌宿主細胞中最適化表現； 及（b)在允許該HPV5 8 L1蛋白表現之條件下，培養該酵母菌 宿主細胞。 本發明進一步關於一種在重組宿主細胞中表現HPV58 L1蛋白質之方法，其包括：（a)導入一包括如SEQ ID ΝΟ:1 所示之核酸之載體至酵母菌宿主細胞中；及（b)在允許該 HPV58L1蛋白表現之條件下，培養該酵母菌宿主細胞。 本發明之人造基因可組裝成表現卡匣，其包括設計成在 宿主細胞中提供有效率表現HPV5 8 L1蛋白質之序列。該卡 匣較佳含有人造基因，及可操作地連結至其上之相關轉錄 及轉譯控制序列（如啟動子），及終止序列。在一較佳實施態 樣中’該啟動子為酵母菌GAL1啟動子，雖然技藝人士當可 9698l.doc -17· 1332988 認知許多其他·已知之酵母菌啟動子’例如GAL 10、GAL7、 ADH1、TDH3或PGK啟動子，其他真核基因啟動子亦可使 用。較佳的轉錄終止子為酵母菌ADH1終止子，雖然其他已 知的轉錄終止子亦可使用。GAL 1啟動子- ADH 1終止子之組 合特別為較佳者。 本發明進一步提供分離及純化之HPV58L1多肽，其包括 如SEQIDNO:2所示之胺基酸序列。 本發明之另一方面係HPV58類病毒顆粒（VLP)，其係在酵 _ 母菌細胞中重組表現HPV58 L1或LI + L2基因所製造，及製 造HPV58 VLPs之方法，及利用HPV58 VLPs之方法。當L1 (人 類及動物乳突病毒之主要外鞘蛋白質）在酵母菌、昆蟲細 胞、哺乳動物細胞或細菌中表現時，VLPs可自我組裝（見 Schiller and Roden, in Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information, pp 101-12 (1996)))。形態不清楚的 HPV VLPs亦可藉由表現LI及L2外鞘蛋白質之組合而製 鲁 造。VLPs由72種L1的五聚物所構成，其在T=7的二十面體 結構中（Baker et al·，Biophys. J. 60(6): 1445-56 (1991))。 VLPs係形態上與真病毒顆粒相似，且當施用至動物時， 能夠誘發高效價的中和抗體效果。以VLPs對兔子 (Breitburd et al·，J· Virol. 69(6): 3959-63 (1995))及狗 (Suzich et al.} Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(25): 1 1553-57(1995))的免疫作用，顯示可誘發中和抗體及保護 對抗實驗中的乳突病毒感染。然而，由於VLPs不含潛在的 96981.doc -18· 1332988 致癌病毒基因體，且當自單一基因表現時可自我組裝，其 呈現出利用活病毒在HPV疫苗發展中之安全的另一方式 (見 Schiller and Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)) 〇 因此，本發明關於類病毒顆粒，其由HPV58之重組LI蛋 白質或重組L1+L2蛋白質所構成，其中該重組蛋白質係在酵 母菌中表現。 如上所述，在本發明之一較佳實施態樣中，HPV58 VLPs 係在酵母菌中製造。在進一步之較佳實施態樣中，該酵母 菌係選自包括啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、漢遜酵 母（Hansenula polymorpha)、曱醇酵母（Pichia pastoris)、脆 壁克魯維酵母（Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維酵母 (Kluyveromyces lactis)及裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)所構成群組。 本發明之再另一方面係HPV58 VLP，其包括由密碼最適 化之HPV58 L1基因所製造之HPV58 L1蛋白質。在本發明此 方面之一較佳實施態樣中，該密碼最適化之HPV58L1基因 包括如SEQIDNO:l所示之核苷酸序列。 本發明再另一方面係一種製造HPV58 VLPs，其包括：（a) 將編碼HPV58 L1蛋白質或HPV58 L1+L2蛋白質之重組DNA 分子轉形至酵母菌中；（b)在允許重組DNA分子表現的條件 下，培養該經轉形之酵母菌，以製造重組HP V58蛋白質； 及（c)分離該重組HPV58蛋白質以製造HPV58 VLPs。 在本發明此方面之一較佳實施態樣中，該酵母菌係以密 96981.doc 19· 1332988 碼最適化之HPV58 L1基因轉形，以製造HPV58 VLPs。在一 特別較佳實施態樣中，該密碼最適化之HPV58 L1基因包括 如SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列。 本發明亦提供一種在動物内誘發免疫反應之方法，其包 括投予HPV58類病毒顆粒至動物中。在一較佳實施態樣 中，該HPV58 VLPs係由密碼最適化基因所製造。 本發明之再另一方面係預防及/或治療HPV相關子宮頸 癌之方法，其包括投予包含HPV58 VLPs之疫苗至哺乳動物 中。在一較佳實施態樣中，該HP V58 VLPs係在酵母菌中製 造。 本發明亦關於一種疫苗，其包括HPV58類病毒顆粒 (VLPs) 〇 在本發明此方面之另一較佳實施態樣中，該疫苗進一步 包括至少一種額外HPV種類之VLPs ^在一較佳實施態樣 中，該至少一種額外HPV種類係選自包括HPV6、HPV11、 HPV16、HPV18、HPV3 卜 HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、 HPV51、HPV52 ' HPV55、HPV56、HPV59 及 HPV68 所構成 群組。 在本發明此方面之另一較佳實施態樣中，該疫苗進一步 包括 HPV16 VLPs。 在本發明此方面之另一較佳實施態樣中，該疫苗進一步 包括 HPV16 VLPs 及 HPV18 VLPs。 在本發明此方面之另一較佳實施態樣中，該疫苗進一步 包括 HPV6 VLPs、HPV11 VLPs、HPV16 VLPs 及 HPV18 9698l.doc -20· 1332988 VLPs。 本發明亦關於一種醫藥組合物，其包括HPV58類病毒顆 粒。再者，本發明關於一種醫藥組合物，其包括HPV58 VLPs 及至少一種額外HPV種類之VLPs。在一較佳實施態樣中， 該至少一種額外HPV種類係選自包括HPV6、HPV11、 HPV16、HPV18、HPV3 卜 HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、 HPV51、HPV52 ' HPV55 ' HPV56 ' HPV59 及 HPV68 所構成 群組。 本發明之疫苗組合物可以適當的劑量單獨使用，以最低 潛在毒性情況下使HPV58感染得到最適當抑制。此外，亦 可以其他藥劑的共同投藥或連續投藥。 導入至疫苗接受者之類病毒顆粒的量，視表現的基因產 物之免疫原性而定。一般而言，免疫或預防有效劑量約10 微克至100微克，較佳為約20微克至60微克之VLPs，係直接 投予至肌肉組織。皮下注射、穿皮導入、壓透至皮膚、及 其他投藥方式，例如腹膜内、靜脈内或吸入投遞，亦可使 用。亦提供加強之免疫接種。非經腸道投藥，例如靜脈内、 肌肉内、皮下或以佐劑（如明礬或Merck鋁佐劑）之其他方式 投藥，共同或在非經腸導入本發明疫苗之後，亦有好處。 在此所提及之發表文獻。係為了併入作為敘述及揭示與 本發明有關之方法及材料之參考目的，並不能解釋成本發 明不具早於此等先前揭示之資格。 經敘述本發明較佳實施態樣及參考附圖後，應明瞭本發 明並非限定成此等精確的實施態樣，且技藝人士在不悖離 96981.doc •21 · 1332988 如後附申請專利範圍所定義之本發明範圍及精神之情況下 當可進行不同變化及修飾。 下列實施例係用以例示，並非限定本發明。 實例1 代表性HPV 58 L1序列之檢測 HPV58 L1序列已經前面所敘述（Genbank Accession # NC_001443)。然而，在臨床株所得之DNAs發現少數的序歹丨J 變異並非不尋常。為了檢測出代表性HPV58 L1野生型序 列，自先前顯示含有HPV5 8 DNA之三株臨床樣品將DNA分 離出。HPV58 L1序列以聚合酶鏈鎖反應（PCR)利用Taq DNA 聚合酶及下列引子增幅：HPV58 LI F 5·-Α TGTCCGTG TGGCGGCCTAGT-3'(SEQIDNO:4)& 5 8 3，IlBglII 5，-G AGATCTGTGTAAGTACCACAACAATT A-3' (SEQ ID N0:5)。經增幅的產物，在瓊脂膠體經電泳分 離，並以漠化錠染色使顯像。利用Geneclean Spin Kit(Q-Bio Gene，Carlsbad，CA)將〜1500 bp L1帶剪切並將DNA純化。 隨後將DNA接合至ΤΑ選殖載體，pCR2.1 (Invitrogen)。 TOP 1 OF’大腸桿菌以接合混合物轉形並塗佈至氨苄西林加 上IPTG及用於篩選藍色/白色菌落之X-gal之LB瓊脂上。將 培養皿倒置並於37°C下培養16小時。白色菌落在含有氨苄 西林的LB培養基中於37°C下震盪培養16小時。進行微量製 備以萃取質體DNA。

為顯示L1基因在質體中的存在，進行限制内切酶消化作 用。限制片段利用瓊脂膠體電泳及溴化錠染色觀察。DNA 9698i.doc -22- 1332988 定序在含有自.三臨床分離株之選殖L.1插入子之質體上進 行。為了產生參考序列用於後面的最適化作用，自該等選 殖株所得的核苷酸及轉譯胺基酸序列與已發表的HPV 58 L1序列進行比較。此三株臨床分離株之序列分析，顯示出 未有序列與Genbank序列相同。pCR2.1 HPV 58 L1選殖株 #4經選擇成為代表性58 L1序列，並在此指「58 L1野生型 序列」或「58 wt序列」（SEQ ID ΝΟ··3，見圖1)。58 LI wt 序列含有五個點突變：二個導致胺基酸改變及三個啞點突 變。對於Genbank HPV58 L1序列，其導致胺基酸改變的點 突變在核苷酸372(A->T)，其改變胺基酸124自白胺酸變成 苯丙胺酸’及核苷酸897(A->G)，其改變胺基酸299自異白 胺酸變成甲硫胺酸。三個啞點突變則位於核苦酸 774(A->G)，792(T->C)及 999(G->A)。 58 L1野生型序列利用Taq聚合酶及下列加入BamHI延伸 之引子進行 PCR增幅：5,58 BamHI 5，-G GGATCCCACA AAAC AAAAT G T C C G T G T G G C-3' (SEQ ID N0：6)

及 3, Bam 5 8 5，-G GGATCCGTGTAAGTACCACA A C A A T T A-3’（SEQ ID N0:7)。最終的PCR產物在填脂膠 體電泳再接以 >臭化旋染色使顯像。利用Geneclean套組將 〜1500 bp帶剪切並將DNA純化。隨後將PCR產物接合至 pCR2.1，而TOP10F'細胞以接合混合物轉形。篩選白色菌落 並培養在含有氨苄西林的LB培養基中，於37°C下震盈16小 時。進行微量製備以萃取質體DNA。為自載體序列中釋出 HPV 58 L1基因’進行BamHI限制内切酶消化作用。經消化 9698l.doc -23- 1332988 的DNA進行瓊·脂膠體電泳並以溴化錠染色檢視。將L1帶利 用Geneclean套組純化並接合至去磷酸化、BarnHI消化的 pGALllO。DH5a大腸桿菌細胞以接合混合物轉形。為篩選 在正確起始位點之HPV 58 L1插入物，將得自菌落的質體 DNA進行PCR增幅。進行DNA定序以確認序列及插入物之 起始位點。選擇單一選殖株並命名為pGALllO-HPV 58L1 #10。自該選定之選殖株大量製備DNA。將酵母菌細胞以酵 素glusulase進行原生質化後製成勝任細胞，並以 pGAL110-HPV 58L1 #1進行轉形β酵母菌轉形混合物塗佈 至Leu(-)山梨醇上覆瓊脂至Leu㈠山梨醇平板上並將培養 皿倒置於30°C下培養3至5天。挑選菌落並在Leu(-)山梨醇瓊 脂平板晝線培養進行分離。經分離的菌落隨後在5毫升之含 有1.6%葡萄糖及4%半乳糖的5倍Leu(-) Ade(-)山梨醇之旋 轉試管中生長，在30°C下誘發5 8 L1轉錄及蛋白質表現。 實例2 酵母菌密碼最適化 較佳之酵母菌密碼已為前人所敘述（Sharp，Paul M and Co we, Elizabeth. Synonymous Codon Usage in

Saccharomyces cerevisiae YEAST 7: 657-678 (1991))。HPV 58 L1 wt蛋白質之表現為可偵測的，然而要得到增強的表 現，HPV 58L1基因利用較佳的酵母菌密碼重建。重建的58 L1序列’其包括酵母菌最適化之密碼序列，相較於58L1 wt 序列，其含有404個核苷酸改變。最終的序列在此係指「5 8 L1 R」（R=重建，見圖1)。58 LI R轉譯的胺基酸序列並未 96981.doc •24- 1332988

改變。HPV 58 Ll R之核苷酸（SEQ ID'N〇])及胺基酸（SEQ ID N0:2)序列，係如圖2所示。該重建序列提供增強的 58L1表現，其相較於野生型具有明顯的增進，可用於疫苗 的發展（見實例4) » 所使用製造最適化基因的策略，係設計跨越基因之長的 重疊有意義及反義寡聚物，以酵母菌之最佳密碼序列核苷 酸置換，但仍維持胺基酸序列❶這些寡聚物係用於取代PCR 反應及Pfu聚合酶中的模板DNA。額外的增幅引子設計並用 於增幅自模板寡聚物之重建序列。 增幅最適當的條件為一段段特定的，然而，最常使用的 程序為95°C下2分鐘，接著在”它下上分鐘進行35個循環（變 性），55 C下1分鐘（退火），72°C下3.5分鐘.(延伸），接著在72°C 下10分鐘的最後延伸及保持在4。(：下。PCR產物以瓊脂膠體 電泳檢查。將適當大小的帶經剪切並將DNA以膠體純化。 經增幅的片段隨後作為模板以聚集1497 nt之重建HPV 58 L1基因。 在重建後，1497 nt帶經膠體純化並接合至pCR-Blunt載體 (Invitrogen，Carlsbad, CA)。在接合後，TOP10細胞以接合 混合物轉形。將菌落在含有康那黴素的LB中生長，將質體 DNA以微製備技術自菌落中萃取出。將質體DNA定序以確 定所欲的58 L1重建之改變。為加入BamHI延伸至二端，58 LI R(重建）自pCR-Blunt-58 LI R以下列引子重新增幅：5, Bam 58 重建 5'-GGATCCCACAAAACAAAATGT CTGTCTGGAGAC C-3' (SEQ ID N0:8)及 3' Bam 58 9698l.doc -25- 1332988 重建 5'-G GATCCTTACTTCTTGACCTTC-3 (SEQ ID N0:9)。 該經增幅之LI產物利用Geneclean套組進行膠體純化，並 選殖至 pCR2.1 (Invitrogen)。ToplOF'細胞以 pCR2.1 質體轉 形。篩選白色菌落並培養在含有氨苄西林的LB培養基中， 於37°C下震盪16小時。進行微量製備以萃取質體DNA。為 自載體序列中釋出HPV 58 L1基因，進行BamHI限制内切酶 消化作用。經消化的DNA進行瓊脂膠體電泳並以溴化錠染 色檢視。將L1帶利用Geneclean套組純化並接合至去填酸 化、BamHI消化的PGAL110。將DH5a大腸桿菌細胞以接合 混合物轉形。 將最後的菌落以PCR篩選在正確起始位點之HPV 58 L1 插入物。自該選定之選殖株大量製備DNA ^由限制酶消化 輪廓及DNA定序確認序列及起始位點。將選擇的單一選殖 株命名為PGALll〇-HPV 58L1R #17。將酵母菌細胞進行原 生質化後製成勝任細胞’並以卩〇八1110-11?\/'581^1尺#17進 行轉形。酵母菌轉形混合物塗佈至Leu(_)山梨醇上覆瓊脂至

Leu(-)山梨醇平板上，並將培養皿倒置於3〇。〇下培養3至5 天。挑選菌落並在Leu(-)山梨醇瓊脂平板畫線培養。將分離 的菌落隨後在5毫升之含有1.6%葡萄糖及4%半乳糖的5倍

Leu( ) Ade㈠山梨醇之紅轉試管中生長，在3〇。匸下誘發[I 轉錄及蛋白質表現。在48小時後，將體積達到〇D6〇〇=i〇細 胞數目之培養物形成㈣，將上清液移除絲沉澱冷;東並 貯存於-70°C。 96981.doc -26- 1332988 實例3 ‘ RNA製備 將欲以半乳糖誘發作用誘發以表現HPV 58 L1或HPV 58 L 1 R之轉形酵母菌細胞之細胞沉澱物，在冰上融解，並懸 浮於 0.8 毫升的 Trizol反應物（Life Technologies，Gibco BRL) 並在室溫下培養5分鐘。將五分之一倍體積的氣仿加入至小 瓶内，並激烈地搖晃15秒中以混合，並在室溫下培養3分 鐘。在1 3k rpms下離心5分鐘後，收集上層並移轉至新的小 管中。0.4毫升異丙醇加入並在室溫下培養10分鐘。為形成 RNA沉澱，在13k rpms下離心10分鐘。將上清液傾倒出， 將RNA沉澱以75% EtOH清洗，並重複離心。將上清液傾倒 出，並將RNA沉澱在空氣中乾燥1 5分鐘，接著懸浮在無 RNase的水中。進行分光光度測量以檢測樣品中RAN的濃 度，以假設A260讀值為1 =40微克/宅升RNA，當A260/280為 1.7-2.0 。 實例4 北方墨點分析 進行1.1 %瓊脂甲醛膠體鑄造。將5及10微克的RNA以變性 緩衝液結合（最終濃度：6%甲醛，50%甲醯胺及0.1 X MOPS)，並力口熱至65〇C後10分鐘。將十分之一倍體積的膠 體裝載緩衝液加入，並將樣品裝載至膠體中。在75伏特下 於1 X MOPS緩衝液中進行電泳3小時。將膠體以10 X SSC清 洗6 0分鐘。 將RNA藉由毛細作用在10 X SSC中以16小時移轉至 96981.doc • 1Ί · 1332988

Hybond- N+ 而t 綸膜（Amersham Bios'ciences，Piscataway, NJ)，然後利用Stratagene UV Stratalinker自動交聯功能 (Stratagene，La Jolla, CA)將RNA固定至而十綸膜上。在固定 後，將耐綸膜於空氣中乾燥。 利用Roche DIG High Prime DNA標記及檢測套組 (Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Switzerland) » 以 DIG標記 58 LI wt及58 LI R DNA序列，以作為探針尾巴在北方墨點 中檢測58 LI wt及58 LI R轉錄物。根據製造商的推薦，利 用抗DIG鹼性磷酸共軛化抗體進行預雜交，雜交及免疫發 展。簡言之，該墨點在37°C下溫和搖晃下預雜交30分鐘。 將探針尾巴以加熱至95°C下維持5分鐘並在冰上降溫進行 變性。再將探針尾巴加至雜交溶液，並在44.6°C下塗覆至膜 上溫和搖晃4小時。隨後將雜交溶液移除，並將墨點以2 X SSC及0.1%SDS於室溫下清洗5分鐘二次，接著額外於65°C 下以0.5 X SSC及0.1% SDS清洗一次。隨後將該墨點進行屏 蔽30分鐘並將抗DIG鹼性磷酸酶共軛化抗體以1:5000比例 稀釋塗覆至上面30分鐘。將墨點清洗後，以鹼性磷酸酶共 輥化抗DIG連結抗體之NBT/BCIP基質檢測，測量探針連結 的RNA存在。 最初的酵母菌表現58 LI wt分析建議了具有功能性HPV 58 L1全長轉錄及轉譯；然而，若序列以酵母菌較佳密碼序 列重建，表現的水平可能增強。將重建的58 L1序列經工程 化後刪了任何可能的不成熟轉錄終止位點，以確保強大的 轉錄作用。58 LI R轉錄物的北方墨點分析，當比較58 LI wt 96981.doc -28- 1332988 的結果’顯示、產生了增強量的全長轉錄物(圖3)。 實例5 HPV 58 L1蛋白質表現 將相當於〇D600= 1 〇細胞數目之半乳糖誘發培養物之冷味 的酵母菌細胞沉澱，在冰上融解並懸浮於300微升的pc緩衝 r,(100 mM Na2HPO4^0.5 M Nacl, ρΗ 7.0)^2 mM PMSF 中。酸清洗的0.5 mm玻璃珠加入至濃度為〜〇 5克/每管。將 試管在4°C下震盪5分鐘3個循環，中間中斷丨分鐘。將75微 升的20%TritonX 100加入，並重複4χ：下震盪5分鐘。將試 管置於冰上15分鐘，接著於下離心1〇分鐘。將上清液移 轉至無菌微離心管中，標記為全酵母菌蛋白質萃取物，記 錄曰期並貯存於_70°C。 實例6 西方墨點分析 自每個58 L1構築體之20個分離的酵母菌菌落所得之總 酵母菌蛋白質萃取物，進行西方墨點分析以確認5 8 L1蛋白 質在半乳糖誘導作用後的表現。 將代表性58 LI wt及58 LI R分離株之1〇、5及2.5微克的 總酵母菌蛋白質萃取物，以SDS-PAGE裝載緩衝液結合，並 加熱至95。(：下1〇分鐘。16 L1蛋白’其約55 kD，包括在内 作為正對照組，而無HPV L1的總酵母菌蛋白質萃取物作為 負對照組（數據未顯示）。 將蛋白質裝載至1〇% SDS-PAGE膠體上，並在Tris-甘胺酸 緩衝液中電泳。在蛋白質分離後，將蛋白質自膠體以西方 9698l.doc -29· 1332988 移轉至硝化纖維上，並將墨點以lx稀釋緩衝液（Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg，MD)在室溫下搖動屏 蔽1小時。將墨點清洗三次，並以酵母菌吸附山羊抗 -trpE-HPV 31 L1血清在室溫下培養16小時，其可與HPV 16 及HPV 58 L1蛋白質交叉反應。將該墨點隨後清洗三次，並 以1:2500稀釋之抗山羊-HRP共軛化抗體培養1小時。將該墨 點再清洗三次，並塗覆在NBT/BCIP檢測基質（Kirkegaard and Perry Laboratories)上。在墨點上，免疫反應性蛋白質 檢測出為紫色。 在所有的情況中，58 L1蛋白質在硝化纖維上檢測出明顯 的免疫反應性帶，對應於約55 kD(圖4)。58 LI R帶的強度 顯示出較58 LI wt為強，此建議了酵母菌密碼最適化達到了 增進的58 L1表現。 實例7 ELISA分析 以ELISA分析一部分58 LI wt及58 LI R總酵母菌蛋白萃 取物，以顯示出58 LI VLP表現。表現HPV 58 L1及HPV 58 L1 R之酵母細胞，係以不同方法培養，包括旋轉管培養、 震盪培養瓶及發酵槽。將酵母細胞溶離並製成蛋白質萃取 物，以測定每毫克總蛋白所產生之HPV 58 L1類病毒顆粒 (VLPs)。以三明治ELISA檢測HPV 58 LI VLP之表現。 使用蛋白G純化H582C3_F7(F7)單株抗體（mAb)與酵母菌 蛋白萃取物中之完整5 8L1 VLPs結合。F7可特定辦識HPV 58 L1 VLP構形抗原表位。將未結合的蛋白沖洗掉並以 9698l.doc -30- 1332988 H586E11.F4(F4)、另一個HPV58 Ll VLP構形特定 mAb 作為 偵測抗體。將真的、構形正確之58 LI VLPs結合後，使用 抗-小鼠IgG2b HRP-連結抗體及TMB幫助偵測。 特別地，使用F7塗覆Immulon 4 HBX 96孔測定盤的底 部，並在在4°C下放至隔夜。以PBS及0.05% Tween 20沖洗 三次，接著以屏蔽溶液（PBS + 0.05% Tween 20 + 1 % BSA) 屏蔽。沖洗測定盤三次並將抗原（總酵母菌細胞溶離液，以 屏蔽溶液稀釋至12.5微克/毫升）塗覆至A排成兩組。將純化 HPV 58 LI VLPs參考標準物，以溶於12.5微克/毫升總酵母 菌蛋白之206微微克/毫升濃度用於A排第3及4列。然後， 將每列對照及試驗樣本連續稀釋二倍。於室溫下三小時 後，將過量的抗原吸走並將測定盤沖洗三次。將F4構形特 異mAb置於屏蔽溶液中稀釋，並加到每個孔槽中於室溫下 放置一小時。將測定盤沖洗三次並將抗-小鼠IgG2b HRP-連結抗體以屏蔽溶液稀釋，於室溫下放置一小時。沖洗測 定盤並塗覆 TMB(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL)5 分鐘，以偵測HRP-連結抗體複合物。加入2 M H2S04終止 偵測反應。於450 nm波長判讀偵測盤，並與溶於微微克VLP/ 微克總蛋白之對照標準液比較，以測定出HPV 58 LI VLP 之濃度。 圖5為由二個分別的實驗中，從表現HPV 58 LI wt及HPV 58 LI R之酵母菌其總蛋白VLPs//ig含量之比較。具有酵母 菌密碼最適化之HPV 58 LI VLP表現量增加約2-3倍。 實例8 96981.doc -31 - 1332988 穿透式電子顯微鏡 爲了驗。立58 L1蛋白事實上係自我組裝以形成五倍體蛋 白衣（pentameric-u caps〇mers)，依次自組裝成類病毒顆 粒，將部分純化58 L1 R蛋白萃取液置於透射電子顯微鏡上 (EM) 〇 將酵母菌以小規模發酵培養並形成沉澱。將生成的沉澱 進行純化處理。將顆粒及澄清的酵母菌萃取液以免疫轉潰 法分析，以驗證經由純化步驟之^蛋白表現及滯留。隨後 將澄清的酵母菌萃取液以45%_蔗糖緩衝液離心，並將生成 的顆粒懸浮於緩衝液中，進行透射]EM分析。 圖6為58L1 RVLPs所產生之一代表性影像。在粗樣本中 球狀顆粒之直徑範圍係從30至60 nm，有些顆粒具有規則排 列的蛋白衣》 【圖式簡單說明】 圖1顯示包括在本發明之人造HPV 58 L1基因中改變之核 苷酸之序列排列（SEQ ID ΝΟ:1，其標示為「58 L1 R」）（見 .實例2)。參考序列為58 L1野生型序列（SEQ ID NO:3，標示 為「5 8 L1 wt」；見實例1)。經改變的核苷酸在其對應位置 被標示出。核苷酸數目係包含在括號内。在58L1重建序列 中相同的核苷酸以標示。 圖2顯示重建的人造HP V 58 L1雙股核酸及單碼胺基酸序 列。核苷酸數目係標示在左側。

圖3顯示HPV 58 LI wt及58 LI R轉錄子之北方墨點圖（見 實例4)。此墨點以等量的DIG標記之58 LI wt及58 LI R DNA 96981.doc -32· 1332988 探針檢測。每道中總RNA電泳的量標示在上面。右側箭頭 指出全長58 L1轉錄子之預測大小。 圖4顯示HPV 58 LI wt (58)及58 LI R (58R)蛋白之西方墨 點圖。其包括HPV 16 L1作為參考（16)。10、5及2.5微克的 總酵母菌蛋白質萃取物經變性並塗覆至10% SDS-PAGE膠 體上。利用酵母菌吸附抗-trpE-HPV 31 L1山羊多株抗血 清，其可與58 L1及16 L1交又反應，檢測出HPV 58 L1蛋白。 分子量標記在左側以kDa標記。 圖5描述在ELISA中每微克總酵母菌蛋白質中所捕獲及 檢測之完整HPV 58 LI VLPs之量（ng)(見實例7)。其包括進 行重複二個實驗的結果。HPV 5 8 L1 wt (黑及灰色區）之VLP 表現為36 ng/微克總酵母菌蛋白質。在實驗#2中，HP V 5 8 L1 R (白及陰影線區）之VLP表現，即重建酵母菌密碼最適化之 58 L1，為咼於HPV 58 LI wt表現之2-3倍，達到95 ng/微 克總酵母菌蛋白質。 圖6顯示由穿透式電子顯微鏡觀察到的Hpv 58 VLps之代 表性樣品，係由HPV 58 LI R蛋白分子所組成（見實例8)。該 橫線代表約100 nm。 96981.doc -33- 1332988 序列表 <110> 美商默克大藥廠

<120> OPTIMIZED EXPRESSION OF HPV 58 hi In YEAST

<130> 21561 PCT <140> 093134524 <141> 2004-11-11 <150> 60/519,2U <1d1> 2003-Ί1-12 <160> 10 <X70> FastSBQ foe Windows Version 4.0

<210> 1 <211> 1497 <212> DNA 人工库列 <220>

<223> HPV58 Ll-R <400> I atgteegtet ggagaccatc cgaagctacc gtctacttgc caccagttcc agtctccaag 60 gtcgtctcca ctgacgaafca egtetetaga acctctacct actactacgc tggttcctct 120 agattgttgg ctgttggtaa cccafcacttc tccatcaagt ctccaaacaa caacaagaag 180 gtcttggtfcc caaaggtctc tggtfctgcaa tacagagfcct teagagteag attgccagac 240 ccaaacaagt tcggtttccc agacacttcc ttctacaacc cagacactca aagattggtc 300 tgggcttgtg tcggtttgga aatcggtaga ggtcaaccafc tgggtgttgg tgfcctctggt 360 cacccatact: tcaacaagtt cgacgacacc gaaacctcca acagataccc agctcaacca 420 ggttctgaca acagagaatg tttgtccatg gactacaagc aaacccaatt gtgtttrgatc 480 ggttgtaagc caccaactgg tgaacactgg ggtaagggtg tegcttgtaa caacaacgct 540 gctgctaccg actgtccacc attggaattg ttcaactcca ccatcgaaga cggtgacatg 600 gtcgacactg gtttcggttg tatggaette ggtaccttgc aagctaacaa gcccgacgtt 660 ccaatcgaca tctgtaactc cacctgtaag tacccagact acctgaagat ggcctctgaa 720 ccatacggtg actccttgtt ettettettg agaagagaac aaatgttcgt cagacacttc 780 ttcaacagag ctggtaaget gggtgaagct gttccagacg acttgtacat caagggttct 840 ggtiaacaccg ctgtcatcca atcctctgct ttcttcccaa ctccatctgg ttccatggtc 900 acctctgaat ctcaattgtt: caacaagcca tactggttgc aaagagetea agg匕cacaac 960 aacggtatct gttggggcaa ccaattgtcc gtcactgtcg tcgacaccac tagatccacc 1020 aacacgacct tgtgcaccga agccaccaag gaaggtacct acaagaacga caacttcaag 1080 gaataegtea gacacgtcga ggaataegae ttgcaattcg tcttccaatt gtgtaagatc 1140 accttgactg ctgaaatcat gacctacatc cacaccatgg actctaacat ettggaagae 1200 tggcaattcg gtttgactcc accaccatct gcttccttgc a.agacaccta cagattcgtc 1260 acctctcaag ctatcacctg tcaaaagact gctccaccaa aggaaaagga agacccatcg 1320 aacaagtaca ccttctggga agtcaacttg aaggaaaagt tctctgctga cttggaccaa 1380 ttcccattgg gtagaaagtc cttgttgcaa tctggtttga aggetaagee ^agattgaag 1440 agatctgctc ceaccactag agccccatcc accaagagaa agaaggtcaa gaagtaa 1497 <210> 2 <211> 498 <212> PRT <213>人類乳突病毒58¾ <400> 2

Met Ser Val Trp Arg Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15

Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ser Arg Thr Ser 20 25 30 9698 丨.doc 1332988

He Tyr Tyr Tyx Ale Gly Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly Asn. Pro 35 40 45

Tyr Phe Ser lie Lys Ser Pro Asn Asn Asn Lys Lvs Val Leu Val Pro 50 55 60

Lys Val Ser Gly Leu Gin Tyr Arg Val Phe Arg Val Arg Leu Pro Ast> 65 70 75 80’

Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr 85 90 95

Gin Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Leu Glu lie Gly Arg Gly Gin. 100 105 110

Pro Leu Gly Val Gly Val Sar Gly His Pro Tyr Phe Asn Lys Phe Asp 115 120 125

Asp Thr Glu Thr Ser Asn Arg Tyr Pro Ala Gin Pro GXy Ser Asp Asa 130 135 140

Arg Glu Cys Leu Ser Met Asp Tyr Lys Gin Thr Gin Leu Cys Leu lie 145 150 155 160

Gly Cys Lys Pro Pro Thr Gly Glu His Trp Gly Lvs Gly val Ala Cys 165 170 ' 175

Asn Asn Asr. Ala Ala Ala Thr Asp Cys Pro ?ro Leu Glu Leu Phe Asn 180 185 190

Ser lie lie Glu Asd Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Cys Met 195 200 205

Asp Phe Gly Thr Leu Gin Ala Asn Lys Ser Asp Val Pro He Asp lie 210 215 220

Cys Asn Ser Thr Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ala Ser Glu 225 230 235 240

Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gin Met Phe 245 250 255

Val Arg His Phe Phe Asn Arg Ala Gly Lys Leu Gly Glu Ala Val Pro 260 265 270

Asp Asp Leu Tyr lie Lys Gly Ser Gly Asn Thr Ala Val lie Gin Ser 275 280 285

Ser Ala Phe Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Glu Ser 290 295 300

Gin Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gin Arg Ala Gla Gly His Asn 305 310 315 320

Asa Gly lie Cys Trp Gly Asn Gin Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr 32S 330 335

Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu Cys Thr Glu Val Thr Lys Glu Gly 340 345 350

Thr Tyx Lys Asn Asp Asn Phe Lys Glu Tyr Val Arg His Val Glu Glu 355 360 365

Tyr Asp Leu Gin Phe Val Phe Gin Leu Cys l.ys He Thr Leu Thr Ala 370 375 380

Glu lie Met Thr Tyr He His Thr Met Asp Ser Asn lie Leu Glu Aso 385 390 395 400

Trp Gin Phe Gly Lsu Thr Pro Pro Pro Ser Ala Ser Leu Gin Asp Thr 405 410 415

Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gin Ala lie Thr Cys Gin Lys Thr Ala Pro 420 425 430

Pro Lys Glu Lys Glu Aso Pro Leu Asn Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val 435 440 445

Asn Leu Ly3 Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Aso Gin Phe Pro Leu Gly 450 455 460

Arg Lys Phe Leu Leu Gin Ser Gly Leu Lys Ala Lys Pro Arg Leu Lys 465 470 475 480

Arg Ser Ala Pro Thr Thr Arg Ala Pro Ser Thr l*ys Arg l*ys Lys Val 485 490 495

Lys Lys 2- 96981.doc 1332988

<210> 3 <2X1> 1497 <212> QNA <213：>人類乳突病毒58型 <400> 3 atgtccgtgt ggcggcctag tgaggccact gtgtacctgc ctcctgtgcc tgtgtctaag 60 gttgtaagca ctgatgaata tgtgtcacgc acaagcattt attattatgc tggcagttcc 120 agacttctgg ctgtcggcaa tccacatctt tccaCcaaaa gtcccaacaa caataaaaaa 180 gcattagttc ccaaggtatc aggcttacag tatagggtct ttagggtgcg tttacctgat 240 cccaataaat ttggttttcc tgatacatct tttfcataacc ctgatacaca acgtttggtc 300 tgggcatgtg taggccttga aataggtagg ggacagccat tgggtgttgg cgtaagtggt 360 catccttatt tcaataaatt tgatgacacl: gaaacca?ca acagatatcc cgcacagcca 420 gggtctgata acagggaatg cctatccatg gattataaac aaacacaatt atgtttaatt 480 ggccgtaaac ctcccactgg tgagcattgg ggfcaaaggtg ttgccfcgtaa caataatgca 540 gctgctactg attgtcctcc attggaactt tttaattct€t ttattgagga tggtgacatg 600 gtagatacag ggtttggatg catggacttt ggtacattgc aggctaataa aagtgatgtg 660 cctattgata tttgtaacag tacatgcaaa tatccagatt atttaaaaat ggccagtgaa 720 ccttatgggg atagtttgtt cttttttctt agacgtgagc agacgtttgt taggcacttc 780 tttaataggg ccggaaaact tggcgaggct gtcccggatg acctttatat taaagggtcc 840 ggtaatactg cagttatcca aagtagtgca ttttttccaa ctcctagtgg ctctafcggtt 900 accfccagaat cacaattatt taataagcct tattggctac agcgtgcaca aggtcataac 960 sia^ggceittt gctggggcaa tcagttattt gttaccgtag ttgataccac tcgtagcact 1020 aatatgacat fcatgcactga agtaactaag gaaggfcacat ataaaaatga taattttaag X080 gaatatgtac gtcatgttga agaatatgac ttacagtttg cttcccagcc tcgcaaaatt 1140 acaccaaccg cagagataat gacatatata catactatgg attccaatat tttggaggac 1200 tggcaatttg gtttaacacc tcctccgtct gccagttcac aggacacafca tagatttgtt 1260 acctcccagg ctatrtactbg ccaaaaaaca gcacccccta aagaaaagga agatccatfca 1320 aataaatata ccccttggga ggttaactta aaggaaaagt tttccgcaga tctagatcag I38Q tcccctctgg gacgaaagtc cttattacaa ccaggcctta aagcaaagcc cagactaaaa 1440 cgttcggccc ctacfcacccg tgcaccatcc accaaacgca aaaaggttaa aaaataa 1497 <2丄0> 4 <211> 21 <212> DNA. 人工痒列 <220> <223> PCR_ 引子 <400> 4 atgtccgtgt ggcggcctag t 21

<210> 5 <211> 28 <212> DNA 人工庠列 <22 0> <223> PCR 引子 <400> 5 gagatctgcg taagtaccac aacaatta 23

<210> 6 <211> 31 <212> DNA <213=人工戽列 <220> <223> PCR 弓I子 96981.doc 311332988 <400> 6 gggatcccac aaaacaaaat gtccgtgtgg c <210> 7 <211> 28 <212> DMA <213>人工库列 <220> <223> ?CR 弓I子 <400>· 7 gggatccgtg taagcaccac aacaafcta <210> 3 <211> 34 <2L2> DWA <2l3>人工庠列 <220> <223> PCR 引子 <400> 8 ggatcccaca aaacaaaatg cctgtctgga gacc <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213>人工库列 <220> <223> PCR 引子 <400> 9 ggatcccaca aaacaaaatg tctgtctgga gacc <210> 10 <211> 1497 <212> DNA <2i3>人工痒列 <220> HPV 58 LI 反典 28 34 34

tacaggcaga cctctggtag gcttcgatgg cagatgaacg gtggtcaagg tcagaggctc 60 cagcagaggt gactgcttat gcagagatct tggagataga tgatgatgcg accaaggaga 120 tctaacaacc gacaaccatt gggcatgaag aggtagttca gaggcttgtt gctgttctcc 180 cagaaccaag gttcccagag accaaacgtt atgtctcaga agtctcagtc taacggtctg 240 ggtttgttca agccaaaggg tcbcrtgaagg aagatgttgg gtctgtgagt ttccaaccag 300 acccgaacac agccaaacct ttagccatct ccagttggta acccacaacc acagagacca 360 gtgggtatga agctgttcaa gccgctgtgg ctttggaggt tgcccatggg tcgagctggc 420 ccaagactgt tgcctcccac aaacaggcac ctgatgttcg tttgggttaa cacaaactag 480 ccaacattcg gtggtcgacc acttgtgacc ccattcccac aacgaacatt gttgttgcga 540 cgacgatggc tgacaggcgg taacctta^c aagttgaggt agtagcttct gccactgtac 600 cagctgtga>c caaagccaac acacctgaag ccatggaacg ttcgattgtt caggctgcaa 660 ggttagctgt agscatcgag gtggacattc atgggtctga tgaactccta ccgaagactt 720 ggcatgccac tgaggaacaa gaagaagaac tcttctcttg tttacaagca gtccgtgaag 780 aagttgtctc gaccatfccaa cccacttcga caaggtctgc tgaacatgta gttcccaaga 840 ccattgcggc gacagtaggt caggagacga aagaagggtt gaggtagacc aaggtaccag 900 tggagactta gagttaacaa gttgttcggc atgaccaacg tttctcgagt tccagtgttg 960 ttgccataga caaccccatt ggttaacaag cagtgacagc agctgtggtg atctaggtga 1020 暴 96981.doc 4- 1332988

Ctgtactgga acacatggct cttatgcagt ctgtgcagct cggaactgac gactttagta eccgttaagc caaactgagg tggagagttc gatagtggac ctgttcatgt ggaagacccc aagggtaacc catctttcaa tctagacgag gttggtgatc tcagtggttc cttccatgga tgttcttgct gttgaagttc 1080 ccttatgctg aacgtfcaagc agaaggttaa cacattctag 1140 ctggatgtag gtgtggtacc tgagattgta gaaccttctg 1200 fcggtggtaga cgaaggaacg ttctgtggat gtctaagcag 1260 agttttctga cgaggcggtt tcctfcttcct tctgggtaac 1320 tcagttgaac ttcctctcca agagacgact gaacctggtt 1380 gaacaacgtt agaccaaact fcccgattcgg ttctaacttc 1440 tcgaggtagg tggttctctt tcttccagtt ctticatt 1497 96981.doc

Claims (1)

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丨 19!"""ίΙΓΊν " * ----—" 4 *月’日修(更)正本 十、申請專利範圍： 1· 一種編碼由SEQ ID NO : 2組成之HPV58 L1蛋白質之核酸 分子’其中該核酸分子係由編碼SEQ ID NO:2之核苷酸序 列組成，該核酸序列係經密碼最適化以在酵母菌細胞中 高水平表現。 2.如請求項1之核酸分子，其中該核苷酸序列包括如SEQ ID ΝΟ:1所示之核苷酸序列。 3· 一種載體，其包括請求項1或2之核酸分子。 4· 一種宿主細胞，其包括請求項3之載體。 5 ·如請求項4之宿主細胞，其中該宿主細胞係酵母菌細胞》 6.如請求項5之宿主細胞，其中該酵母菌細胞係選自由啤酒 酵母（Saecharomyces cerevisiae)、漢遜酵母（Hansenula polymorpha)、曱醇酵母（Pichia pastoris)、脆壁克魯維酵 母（Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis)及裂瘦酵母（schizosaccharomyces pombe)所構成群 組。 7· 一種製造HPV58 L1類病毒顆粒（VLPs)之方法，包括： (a) 以如請求項1之核酸分子轉形酵母菌； (b) 在允許密碼最適化之核酸分子表現之條件下，培養該 經轉形酵母菌以製造重組人類乳突病毒蛋白；及 (c) 分離該重組人類乳突病毒蛋白以製造HPV58 L1類病毒 顆粒。 ,8.如請求項7之方法，其中該酵母菌細胞係選自由啤酒酵 母、漢遜酵母、甲醇酵母、脆壁克魯維酵母、乳酸克魯 96981-990902.doc 1332988 維酵母及裂殖酵母所構成群組。 9.如請求項8之方法，其中該酵母菌細胞係啤酒酵母。 10· —種製備用於治療或預防HPV感染之疫苗之方法，該方法 包括藉由請求項7至9中任一項之方法製造HPV58 L1 VLPs。 11. 如請求項10之方法，其進一步包括至少一種額外HPV種類 之 VLPs。 12. 如請求項11之方法，其中該至少一種額外HPV種類係選自 由 HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、 HPV3 5、HPV3 9、HPV45、HPV5 卜 HPV5 2、HPV5 5、HPV5 6、 HPV59及HPV68所構成群組。 13. 如請求項12之方法，其中該至少一種HPV種類包括 HPV16。 14. 如請求項13之方法，其進一步包括HPV 18 VLPs。 15. 如請求項14之方法，其進一步包括HPV6 VLPs及HPV11 VLPs。 16. 如請求項14或15之方法，其進一步包括HPV31 VLPs。 17. 如請求項16之疫苗，其進一步包括HPV45 VLPs。 96981-990902.doc 2- 1332988 •年月曰修(更)本 第093134524號專利申請案 中文圖式替換本("年9月） 十一、圖式： 58 LI wt ( 1) 58 LI R { 1) 58 LI wt < 51) 58 LI R { 51) 58 LI wt (101) 58 LI R (101) 58 LI wt (151) 58 LI R (151) 58 LI wt (201) 58 hi R < 201) 58 III wt (251) 58 LI R (251) 58 LI Wt < 301) 58 LI R { 301) 58 LI wt (351) 58 LI R (351) 58 LI wt (401) 58 LI R < 401) 58 LI wt (451) 58 LI R (451) 58 LI wt (501) 58 LI R (501) 56 LI wt < 551) 58 LI R (551) 58 LI Wt (601) 58 LI R (601) 58 LI wt (651) 58 LI R (651) 58 LI wt (701) 58 LI R { 701) 58 LI wt { 751) 5Θ LI R (751) 58 LI wt { Θ01) 58 LI R i 801) 5B LI Wt (851) 58 LI R (851) 58 LI Wt (901) 58 LI R (901) AA6TG GTCC. 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M S V W RPS EAT V Y L P P V P 1 ATGTCCGTCT GGAGACCATC CGAAGCTACC GTCTACTTGC CACCAGTTCC TACAGGCAGA CCTCTGGTAG GCTTCGATGG CAGATGAACG GTGGTCAAGG V S K VVST DEY VSR TSIY 51 AGTCTCCAAG GTCGTCTCCA CTGACGAATA CGTCTCTAGA ACCTCTATCT TCAGAGGTTC CAGCAGAGGT GACTGCTTAT GCAGAGATCT TGGAGATAGA YYA GSS RLLA NPYF 101 ACTACTACGC TGGTTCCTCT AGATTGTTGG C GTAA CCCATACTTC TGATGATGCG ACCAAGGAGA TCTAACAACC GACAACCATT GGGTATGAAG SIKS PNN NKK VLVP K V S 151 TCCATCAAGT CTCCAAACAA CAACAAGAAG GTCTTGGTTC CAAAGGTCTC AGGTAGTTCA GAGGTTTGTT GTTGTTCTTC CAGAACCAAG GTTTCCAGAG G L Q Y R V F RVR L P D PNKF 201 TGGTTTGCAA TACAGAGTCT TCAGAGTCAG ATTGCCAGAC CCAAACAAGT ACCAAACGTT ATGTCTCAGA AGTCTCAGTC TAACGGTCTG GGTTTGTTCA GFP DTS FYNP DTQ RLV 251 TCGGTTTCCC AGACACTTCC TTCTACAACC CAGACACTCA AAGATTGGTC AGCCAAAGGG TCTGTGAAGG AAGATGTTGG GTCTGTGAGT TTCTAACCAG W A C V GLE I G R GQPL GVG 301 TGGGCTTGTG TCGGTTTGGA AATCGGTAGA GGTCAACCAT TGGGTGTTGG ACCCGAACAC AGCCAAACCT TTAGCCATCT CCAGTTGGTA ACCCACAACC VSG HPYF N K F DDT ETSN 351 TGTCTCTGGT CACCCATACT TCAACAAGTT CGACGACACC GAAACCTCCA ACAGAGACCA GTGGGTATGA AGTTGTTCAA GCTGCTGTGG CTTTGGAGGT RYP A Q P GSDN REC LSM 401 ACAGATACCC AGCTCAACCA GGTTCTGACA ACAGAGAATG TTTGTCCATG TGTCTATGGG TCGAGTTGGT CCAAGACTGT TGTCTCTTAC AAACAGGTAC D Y K Q T Q L CLI G C K P P T G 451 GACTACAAGC AAACCCAATT GTGTTTGATC GGTTGTAAGC CACCAACTGG CTGATGTTCG TTTGGGTTAA CACAAACTAG CCAACATTCG GTGGTTGACC EHW G K G V A C N NNA A A T D 501 TGAACACTGG GGTAAGGGTG TTGCTTGTAA CAACAACGCT GCTGCTACCG ACTTGTGACC CCATTCCCAC AACGAACATT GTTGTTGCGA CGACGATGGC 圖2 96981-990902.doc 1332988 CPP L E L FNSI IED GDM 551 ACTGTCCACC ATTGGAATTG TTCAACTCCA TCATCGAAGA CGGTGACATG TGACAGGTGG TAACCTTAAC AAGTTGAGGT AGTAGCTTCT GCCACTGTAC V D T G FGC M D F GTLQ A W K 601 GTCGACACTG GTTTCGGTTG TATGGACTTC GGTACCTTGC AAGCTAACAA CAGCTGTGAC CAAAGCCAAC ATACCTGAAG CCATGGAACG TTCGATTGTT SDV P I D I CNS T C K Y P D Y 651 GTCCGACGTT CCAATCGACA TCTGTAACTC CACCTGTAAG TACCCAGACT CAGGCTGCAA GGTTAGCTGT AGACATTGAG GTGGACATTC ATGGGTCTGA LKM ASE PYGD S L F F F L 701 ACTTGAAGAT GGCTTCTGAA CCATACGGTG ACTCCTTGTT CTTCTTCTTG TGAACTTCTA CCGAAGACTT GGTATGCCAC TGAGGAACAA GAAGAAGAAC RREQ M F V RHF F N R A G K L 751 AGAAGAGAAC AAATGTTCGT CAGACACTTC TTCAACAGAG CTGGTAAGTT TCTTCTCTTG TTTACAAGCA GTCTGTGAAG AAGTTGTCTC GACCATTCAA 6 E Ά V P D D L Y I KGS GNTA 801 GGGTGAAGCT GTTCCAGACG ACTTGTACAT CAAGGGTTCT GGTAACACCG CCCACTTCGA CAAGGTCTGC TGAACATGTA GTTCCCAAGA CCATTGTGGC V I Q SSA F F P T P S G SMV 851 CTGTCATCCA ATCCTCTGCT TTCTTCCCAA CTCCATCTGG TTCCATGGTC GACAGTAGGT TAGGAGACGA AAGAAGGGTT GAGGTAGACC AAGGTACCAG T S E S Q L F N K P YWLQ R A Q 901 ACCTCTGAAT CTCAATTGTT CAACAAGCCA TACTGGTTGC AAAGAGCTCA TGGAGACTTA GAGTTAACAA GTTGTTCGGT ATGACCAACG TTTCTCGAGT G Η N NGIC WGN QLF V T V V 951 AGGTCACAAC AACGGTATCT GTTGGGGTAA CCAATTGTTC GTCACTGTCG TCCAGTGTTG TTGCCATAGA CAACCCCATT GGTTAACAAG CAGTGACAGC D T T R S T NMTL CTE VTK 1001 TCGACACCAC TAGATCCACT AACATGACCT TGTGTACCGA AGTCACCAAG AGCTGTGGTG ATCTAGGTGA TTGTACTGGA ACACATGGCT TCAGTGGTTC E G T Y K N D N F K EYVR HVE 1051 GAAGGTACCT ACAAGAACGA CAACTTCAAG GAATACGTCA GACACGTCGA CTTCCATGGA TGTTCTTGCT GTTGAAGTTC CTTATGCAGT CTGTGCAGCT EYD LQFV FQL CKI TLTA [SI 96981-990902.doc -4- 1101 1101 1151 1201 1251 1301 1351 1401 1451 GGAATACGAC CCTTATGCTG £ I M CTGAAATCAT GACTTTAGTA W Q F G TGGCAATTCG ACCGTTAAGC R F V CAGATTCGTC GTCTAAGCAG EKE AGGAAAAGGA TCCTTTTCCT K E K F AAGGAAAAGT TTCCTTTTCA L L Q CTTGTTGCAA GAACAACGTT T T R CAACCACTAG GTTGGTGATC NO; 10) TTGCAATTCG AACGTTAAGC T Y I GACCTACATC CTGGATGTAG L T P GTTTGACTCC CAAACTGAGG T S Q A ACCTCTCAAG TGGAGAGTTC D P L AGACCCATTG TCTGGGTAAC SAD TCTCTGCTGA AGAGACGACT S G L K TCTGGTTTGA AGACCAAACT APS AGCTCCATCC TCGAGGTAGG TCTTCCAATT AGAAGGTTAA Η T M D CACACCATGG GTGTGGTACC P P S ACCACCATCT TGGTGGTAGA I T C CTATCACCTG GATAGTGGAC N K Y T AACAAGTACA TTGTTCATGT L D Q CTTGGACCAA GAACCTGGTT A K P AGGCTAAGCC TCCGATTCGG T K R K ACCAAGAGAA TGGTTCTCTT GTGTAAGATC CACATTCTAG S N I ACTCTAACAT TGAGATTGTA A S L Q GCTTCCTTGC CGAAGGAACG Q K T TCAAAAGACT AGTTTTCTGA ACCTTGACTG TGGAACTGAC LED CTTGGAAGAC GAACCTTCTG D T Y AAGACACCTA TTCTGTGGAT A P P K GCTCCACCAA CGAGGTGGTT F W E V N L CCTTCTGGGA AGTCAACTTG GGAAGACCCT TCAGTTGAAC F P L G R K F TTCCCATTGG GTAGAAAGTT AAGGGTAACC CATCTTTCAA R L K R S Ά P AAGATTGAAG AGATCTGCTC TTCTAACTTC TCTAGACGAG K V K K * (SEQIDNO:2) AGAAGGTCAA GAAGTAA (SEQE)NO:l) TCTTCCAGTT CTTCATT (SEQID 96981-990902.doc 1332988 58wt 58wt 58R 58R

圖3 [£3 96981-990902.doc -6- 1332988 2.5 ug 10 ug 5 ug 16 58 58R 16 58 58R 16 58 58R 96981-990902.doc 60 42 圖4 1332988 0090的70608040302010 1 疝咖争姓衮toon /aHq>bou

HPV 58 L1構築體 圖5 96981-990902.doc 1332988

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