DE60124918T2

DE60124918T2 - Kodon-optimierte papillomavirussequenzen

Info

Publication number: DE60124918T2
Application number: DE60124918T
Authority: DE
Inventors: Peter F. Stevenage ERTL; Gerald W. Stevenage GOUGH; Christopher J. Stevenage RING; Marina GlaxoSmithKline Sarah WALCOTT
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2000-07-21
Filing date: 2001-07-20
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2021-07-21
Also published as: HUP0300745A3; CA2416488A1; ATE346947T1; EP1301614A1; DK1301614T3; AU7569501A; CN1462309A; AU2001275695B9; IL154009A0; JP2004504057A; NO20030219L; AU2001275695B2; DE60124918D1; CZ2003180A3; NZ523683A; HK1056195A1; BR0112637A; MXPA03000554A; KR100874552B1; CY1106334T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen, die zur Behandlung und Prävention von Menschen-Papilloma-Virusinfektionen und den Symptomen und damit assoziierten Erkrankungen nützlich sind.
Papilloma-Virusinfektionen sind in einer Vielzahl von Arten beobachtet worden, einschließlich Schafen, Hunden, Kaninchen, Affen, Rindern und Menschen. Menschliche Papilloma-Viren (HPV) sind in mehr als 80 Typen klassifiziert worden (Epidemiology and Biology of Cervical Cancer. Seminars in Surgical Oncology 1999 16: 203–211). Neue (novel) Typen werden als solche definiert, in denen das L1-Gen weniger als 90% Sequenzidentität mit den L1-Sequenzen zuvor identifizierter Typen aufweist, während ein Subtyp zwischen 90% und 98% L1-Sequenzidentität aufweist, und eine Variante mehr als 98% Sequenzidentität (zum prototypischen (Parental-) Typ) hat. Papilloma-Viren infizieren im Allgemeinen Epithelien, aber die verschiedenen HPV-Typen verursachen verschiedene Erkrankungen. Beispielsweise verursachen die Typen 1–4, 7, 10 und 26–29 benigne kutane Warzen, die Typen 16, 18, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68 sind mit Gebärmutterhalskrebs assoziiert, und die Typen 6 und 11 sind an Genitalwarzen beteiligt (nicht-maligne Condylomata des Genitaltrakts).
Die Mehrzahl der Genitalwarzen (> 90%) enthält HPV-Genotypen 6 und 11. Während HPV 6 der in einzelnen Infektionen am meisten vorliegende Genotyp ist, können sowohl HPV 6 und HPV 11 gelegentlich in der gleichen Läsion auftreten. Warzen treten im Allgemeinen bei infizierten Individuen an mehreren Stellen auf, mehr als 60% der Patienten mit Partnern, die Condylome (Genitalwarzen) haben, entwickeln Läsionen, mit einer durchschnittlichen Inkubationszeit von 3 Monaten. Ein Spektrum an Behandlungsmöglichkeiten ist gegenwärtig verfügbar. Jedoch beruhen sie auf der Excision oder Ablation und/der Verwendung topischer Gele und Cremes. Sie sind nicht schmerzfrei, sie können häufige klinische Untersuchungen notwendig machen, und die Wirksamkeit ist stark variabel. Das Wiederauftreten von Erkrankungen bleibt ein signifikantes Problem bei der wirkungsvollen Behandlung dieser Erkrankung.
Genitalwarzen können spontan abklingen, und die zellvermittelte Immunität scheint das Primärereignis zu sein, das für die Warzen-Regression verantwortlich ist. Die hohen Spontan-Regressionsarten weisen darauf hin, dass die zelluläre Immunantwort des Wirts die klinische Erkrankung bereini gen kann, und sie machen eine immuntherapeutische Intervention zu einer Option zur Behandlung oder Prävention von Genitalwarzen aus. Die Ziele für die Handhabung der Erkrankung sind eine Virus-spezifische Therapie, die schmerzfrei ist, ein Minimum an klinischen Aufenthalten benötigt, und hohe Krankheitsbewältigungsraten hat, und das Wiederauftreten der Erkrankungen reduziert/minimiert.
Es hat sich herausgestellt, dass HPV in Gewebekultur schwer zu züchten ist, so dass es keine traditionellen lebenden oder attenuierten viralen Impfstoffe gibt. Die Entwicklung eines HPV-Impfstoffs ist ebenfalls aufgrund des Fehlens eines geeigneten Tiermodells verlangsamt worden, in dem das Humanvirus untersucht werden kann. Dies liegt daran, dass die Viren stark Spezies-spezifisch sind, so dass es nicht möglich ist, ein immunkompetentes Tier mit einem humanen Papillom-Virus zu infizieren, was für die Sicherheitstests benötigt würde, bevor ein Impfstoff zuerst an Menschen probiert wird.
Papilloma-Viren haben ein DNA-Genom, welches „early" und „late"-Gene kodiert, die als E1 bis E7, L1 und L2 bezeichnet werden. Die frühen Gensequenzen haben sich als Funktionen aufweisend herausgestellt, die an der viralen DNA-Replikation und -Transkription, an dem Entkommen des Immunsystems des Wirts, und der Veränderung des normalen Wirtszell-Zyklus und anderen Prozessen beteiligt sind. Beispielsweise ist das E1-Protein eine ATP-abhängige DNA-Helicase und ist an der Initiierung der DNA-Replikation des Virus beteiligt, während E2 ein regulatorisches Protein ist, das sowohl die virale Gen-Expression und die DNA-Replikation kontrolliert. Durch seine Fähigkeit, sowohl an E1 und an den viralen Ursprung der Replikation zu binden, führt E2 zu einer lokalen Konzentration von E1 am Ursprung, wodurch die Initiierung der viralen DNA-Replikation stimuliert wird. Das E4-Protein scheint eine Vielzahl an ungenau gekennzeichneten Funktionen zu haben, aber unter diesen kann die Bindung an das Zytoskelett der Wirtszelle eine sein, während E5 die Ansäuerung der Endosomen zu verzögern scheint, was zu einer erhöhten Expression des EGF-Rezeptors an der Zelloberfläche führt, und sowohl E6 als auch E7 sind dafür bekannt, dass sie die Zellproteine p53 und pRB binden. Die E6- und E7-Proteine von HPV-Typen, die mit Gebärmutterhalskrebs assoziiert sind, sind bekannte Onkogene. L1 und L2 kodieren die zwei viralen Struktur(Kapsid)-Proteine.
Historisch sind Impfstoffe als ein Weg angesehen worden, um die Infektion durch ein Pathogen zu verhindern, indem das Immunsystem stimuliert wird, das Pathogen zu erkennen und es zu neutralisieren, falls eine Infek tion auftritt. Der Impfstoff schließt ein oder mehrere Antigene des Pathogens ein, für gewöhnlich den gesamten Organismus, entweder abgetötet oder in einer abgeschwächten (attenuierten) Form, oder ausgewählte antigene Peptide des Organismus. Wenn das Immunsystem den Antigenen ausgesetzt ist, werden Zellen erzeugt, die eine immunologische „Erinnerung" für die Lebensdauer des Individuums bewahren. Eine anschließende Exposition gegenüber dem gleichen Antigen (z.B. nach einer Infektion durch das Pathogen) stimuliert eine spezifische Immunreaktion, die zur Eliminierung oder Inaktivierung des infektiösen Agens führt.
Es gibt zwei Arme der Immunantwort: eine humorale (Antikörper-) Antwort und eine zellvermittelte Antwort. Protein-Antigene, die von Pathogenen stammen, die sich intrazellulär replizieren (Viren und einige Bakterien) werden innerhalb der infizierten Wirtszelle prozessiert, die kurz Peptide freisetzt, welche anschließend auf der Zelloberfläche der infizierten Zelle in Assoziierung mit Klasse I Haupthistokompatibilität(MHC I)-Molekülen präsentiert werden. Wenn dieser assoziierte Komplex aus MHC I und Peptid durch eine Antigen-spezifische CD8+ T-Zelle kontaktiert wird, wird die T-Zelle aktiviert, und diese erwirbt ihre zytotoxische Aktivität. Diese zytotoxischen T-Zellen (CTLs) können infizierte Wirtszellen lysieren, wodurch sie die Replikation und Ausbreitung des infektiösen Pathogens beschränken. Ein weiterer wichtiger Arm der Immunreaktion wird durch CD4+ T-Zellen kontrolliert. Wenn ein Antigen von Pathogenen stammt, wird es in das extrazelluläre Medium freigesetzt, so dass sie von spezialisierten Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) aufgenommen werden können, und auf der Oberfläche dieser Zellen in Assoziierung mit MHC II-Molekülen präsentiert werden können. Die Erkennung des Antigens in diesem Komplex stimuliert CD4+ T-Zellen, lösliche Faktoren (Cytokine) zu sezenieren, die die Effektor-Mechanismen anderer T-Zellen regulieren. Antikörper werden durch B-Zellen produziert. Die Bindung des Antigens an sezenierte Antikörper kann die Infektiösität eines Pathogens neutralisieren und die Bindung eines Antigens an Membrangebundene Antikörper auf der Oberfläche von B-Zellen stimuliert die Teilung der B-Zelle, wodurch die B-Zell-Reaktion amplifiziert wird. Im Allgemeinen werden sowohl die Antikörper- und die zellvermitttelte Immunreaktion (CD8+ und CD4+) benötigt, um Infektionen durch Pathogene zu kontrollieren.
Es wird vermutet, dass es möglich sein kann, das Immunsystem selbst nach einer Infektion durch ein Pathogen auszurüsten, um die Infektion durch Inaktivierung oder Eliminierung des Pathogens zu kontrollieren oder zu lösen. Solche Immuntherapien (ebenfalls bekannt als „therapeutische" Impf stoffe oder Immuntherapeutika) benötigen idealerweise, dass eine Zell-vermittelte Reaktion wirksam ist, obwohl sowohl die humorale und die Zell-vermittelte Immunreaktion ausgelöst werden können.
Es ist gezeigt worden (Benvenisty, N. und Reshaf, L. PNAS 83 9551–9555), dass die Inokulierung von Mäusen mit Calciumphosphat-präzipitierter DNA zu einer Expression der Peptide, die durch die DNA kodiert werden, führt. Anschließend wurde gezeigt, dass die Injektion von Plasmid-DNA, die nicht präzipitiert wurde, in Mäuse zu einer Aufnahme der DNA in die Muskelzellen führt, und zur Expression des kodierten Proteins. Da die Expression der DNA zur Produktion der kodierten Pathogen-Proteine in den Wirtszellen führt, wie bei einer natürlichen Infektion, kann dieser Mechanismus die Zell-vermittelte Immunreaktion stimulieren, die für Immuntherapien oder therapeutische Impfungen benötigt wird, so dass auf DNA basierende Medikamente als prophylaktische Impfstoffe oder als Immuntherapie angewandt werden könnten. DNA-Impfstoffe sind beschrieben in WO 90/11092 (Vical, Inc.).
Die DNA-Impfung kann durch Mechanismen verabreicht werden, die anders sind als die intramuskuläre Injektion. Beispielsweise profitiert die Verabreichung in die Haut von der Tatsache, dass Immunmechanismen in Geweben stark aktiv sind, die Barrieren gegen eine Infektion sind, wie beispielsweise die Haut oder die Schleimhautmembranen. Die Verabreichung in die Haut könnte durch Injektion, über einen Jet-Injektor (welcher eine Flüssigkeit in die Haut, oder in die darunter liegenden Gewebe, einschließlich der Muskeln, unter Druck zwängt) oder über Partikelbombardierung ablaufen, bei dem die DNA auf Partikel von ausreichender Dichte beschichtet werden kann, um in das Epithelium einzudringen (U.S. Patent Nr. 5371015). Beispielsweise können die Nucleotidsequenzen in ein Plasmid eingebaut werden, das auf Goldkügelchen beschichtet wird, welche dann unter Hochdruck in die Epidermis verabreicht werden, wie beispielsweise beschrieben in Haynes et al. J. Biotechnology 44: 37–42 (1996). Die Beschießung der Haut mit diesen Partikeln führt zur direkten Transfektion sowohl epidermaler Zellen und der epidermalen Langerhans-Zellen. Die Langerhans'schen Zellen sind Antigen präsentierende Zellen (APC), welche die DNA aufnehmen, die kodierten Peptide exprimieren, und diese prozessieren, damit sie auf den MHC-Proteinen der Zelloberfläche präsentiert werden. Transfizierte Langerhans'sche Zellen migrieren in die Lymphknoten, wo sie die präsentierten Antigen-Fragmente den Lymphozyten präsentieren, welche eine Immunreaktion auslösen. Sehr geringe Mengen an DNA (weniger als 1 μg, häufig weniger als 0,5 μg) werden benötigt, um eine Immunreaktion über eine Partikel-vermittelte Verabreichung in die Haut auszulösen, und dies kontrastiert mit den μg-Mengen an DNA, die dafür bekannt sind, dass sie benötigt werden, um Immunreaktionen auszulösen, die direkt auf eine intramuskuläre Injektion folgen.
Die Expression und der Nachweis von HPV-Proteinen in transfizierten Säugerzellen wie HeLa, 293, oder CHO-Zellen hat sich häufig als schwierig herausgestellt, und so wurden für biochemische und immunologische Untersuchungen, die eine nachweisbare Expression von Proteinen oder Mengen reiner Proteine benötigen, E.coli, Baculovirus oder Hefeprotein-Expressionssysteme häufig verwendet. In diesen Systemen sind die Ausbeuten an Proteinen ausreichend, um funktionale Analysen zu machen, und die Reinigung und anschließende biochemische und immunologische Studien sind durchführbar. Jedoch schaffen es direkte Protein-Nachweisverfahren (z.B. Western-Blotting) normalerweise nicht, die E1-Protein-Expression in transfizierten Säugerzellen nachzuweisen, selbst wenn Vektoren mit starken Promotoren wie CMV oder SV40 verwendet werden. Verfahren, die entworfen wurden, um die E1-Protein-Expression in Säugerzellen zu steigern, schließen die Klonierung der 5'-flankierenden Sequenzen nahe dem E1-Gen ein (Remm et al. J. Virol 1999 73, 3062–3070) und die Amplifizierung des transfizierten E1-Plasmidvektors nach der Transfektion (Zou et al. J. Virol 1998 72, 3436–3441). Die Amplifizierung des zugegebenen Vektor-Plasmids durch Replikation nach der Transfektion hat die Netto-Auswirkung der Erhöhung der E1-Gen-Kopienanzahl in der Zelle, wodurch die Protein-Niveaus verstärkt werden, und dadurch den Nachweis des Proteins erleichtert (durch Western-Blotting). Da die E1-Protein-Expression und der Nachweis in Säugerzellen problematisch ist, haben mehrere Autoren den Ausweg genommen, die Expression des Proteins durch in vitro Transkription-Translation mit ³⁵S-markiertem Methionin unter Verwendung von Kaninchen-Reticulocyten-System (Promega), (Gopalakrishnan et al. Virology 1999 256, 330–339., Safari et al. Virology 1995 211, 385–396) nachzuweisen. Jedoch ist dies ein zellfreies System und benötigt die Verwendung eines modifizierten Promotors, der die Bindungssequenz der RNA-Polymerase des Phagen T7 enthält.
Die E1-Protein-Expression ist zusätzlich durch den Nachweis der in vitro DNA-Replikation eines Plasmids, das einen HPV-DNA-Replikationsursprung enthält, indirekt nachgewiesen worden. Der Nachweis dieses Replikationsursprung-haltigen-Plasmids dient als Surrogat für E1-(und E2-)Protein-Expression (Gopalakrishnan et al., Virology 1999 256, 330–339., Lu et al. J. Virol 1993 67, 7131–7139 und Del Veccio et al. J. Virol 1992 66, 5949–5958). Sowohl E1 und E2 werden für die Replikation des HPV-Ursprungs benötigt, so dass die Transfektion von Säugerzellen mit Plasmiden, die beide, die E1- und E2-Gene, kodieren, plus einem dritten Plasmid, das den HPV-DNA-Replikationsursprung trägt, nur zur Replikation des Ursprungs-haltigen-Plasmids führt, wenn die Expression des E1-Proteins (und des E2-Proteins) erfolgreich gewesen ist, obwohl sie durch Standard-Protein-Detektionsverfahren (Western-Blotting) nicht nachweisbar ist.
Der DNA-Code hat 4 Buchstaben (A, T, C und G) und verwendet diese, um die drei Buchstaben-„Codons" zu buchstabieren, welche die Aminosäuren darstellen, die durch die Gene des Organismus kodierte Proteine sind. Die lineare Sequenz von Codons entlang des DNA-Moleküls wird in die lineare Sequenz von Aminosäuren in den Proteinen translatiert, die durch diese Gene kodiert werden. Dieser Code ist stark degeneriert, mit 61 Codons, die für die 20 natürlichen Aminosäuren kodieren, und 3 Codons, die „Stopp"-Signale darstellen. Das bedeutet, dass die meisten Aminosäuren durch mehr als einen Codon kodiert werden – tatsächlich werden einige durch vier oder mehr verschiedene Codons kodiert.
Wenn mehr als ein Codon verfügbar ist, um eine gegebene Aminosäure zu kodieren, ist beobachtet worden, dass die Muster der Codon-Verwendung von Organismen stark Zufalls-unabhängig ist. Verschiedene Spezies zeigen eine unterschiedliche Neigung in ihrer Codon-Auswahl und außerdem kann die Benutzung von Codons in einzelnen Spezies zwischen den Genen, die in großen und niedrigen Mengen exprimiert werden, beträchtlich verschieden sein. Diese Neigung ist in Viren, Pflanzen, Bakterien und Säugerzellen verschieden, und bei einigen Spezies zeigt sich eine stärkere Neigung weg von einer Zufalls-Kodon-Auswahl als in anderen. Beispielsweise sind Menschen und andere Säuger weniger stark festgelegt als einige Bakterien oder Viren. Aus diesen Gründen gibt es eine signifikante Wahrscheinlichkeit, dass ein Säuger-Gen, das in E.coli exprimiert wird, oder ein virales Gen, das in Säugerzellen exprimiert wird, eine ungeeignete Verteilung von Codons für eine wirksame Expression aufweist. Jedoch kann ein Gen mit einem Codon-Verwendungsmuster, das für die Expression in E.coli geeignet ist, auch wirksam in Menschen exprimiert werden. Es wird vermutet, dass das Vorliegen von Ansammlungen von Codons in einer heterologen DNA-Sequenz, die in dem Wirt selten beobachtet werden, in dem die Expression stattfinden soll, niedrige heterologe Expressions-Niveaus in diesem Wirt voraussagen.
Es gibt mehrere Beispiele, das die Änderung von Codons, die in dem Wirt selten sind, in solche, die vom Wirt bevorzugt werden („Codon-Optimie rung"), verstärkte heterologe Expressions-Niveaus, beispielsweise der BPV (Rinder-Papilloma-Virus) späten Gene L1 und L2 zufolge hat, deren Codons für die Säuger-Codon-Verwendungsmuster optimiert wurden, und es ist gezeigt worden, dass dies erhöhte Expressions-Niveaus gegenüber den Wildtyp-HPV-Sequenzen in Säuger(Cos-1)-Zellkultur ergibt (Zhou et al. J. Virol 1999. 73, 4972–4982). In dieser Arbeit wurde jeder BPV-Codon, der mehr als zweimal so häufig in BPV als in Säugern (Verwendungsbehältnis > 2) auftritt, und die meisten Codons mit einem Verwendungsverhältnis von > 1,5 konservativ durch den vorzugsweise verwendeten Säugercodon ersetzt. In WO 97/31115, WO 97/48379 und WO 98/34640 (Merck & Co., Inc.) ist gezeigt worden, dass die Codon-Optimierung von HIV-Genen oder Segmenten davon zu einer erhöhten Protein-Expression führt, und zu einer verbesserten Immunogenizität, wenn die Codon-optimierten Sequenzen als DNA-Impfstoffe in dem Säugerwirt, für den die Optimisierung maßgeschneidert wurde, verwendet werden. In dieser Arbeit bestehen die Sequenzen vollständig aus optimierten Codons (außer wo dies eine ungewünschte Restriktionsschnittstelle, eine Intron-Splicestelle etc. einschleusen würde), da jeder virale Codon konservativ durch den optimalen Codon für den gewünschten Wirt ersetzt wird. In WO 011446 (Merck und Co., Inc.) wurde das gleiche Verfahren auf HPV-Gene angewandt.
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Polynucleotidsequenz bereit, die eine HPV-Aminosäuresequenz von einem HPV-Early-Antigen oder einem Fragment davon kodiert, wobei das Polynucleotid in der Lage ist, eine Immunreaktion auszulösen, wenn es in vivo verabreicht wird, wobei das Polynucleotid einen Codon-Verwendungskoeffizienten (wie unten beschrieben) von mehr als 0,5 hat, aber weniger als 1,0 für stark exprimierte menschliche Gene. Idealerweise ähnelt das Codon-Verwendungsmuster der Polynucleotidsequenz auch dem von stark exprimierten E.coli-Genen. Die Polynucleotidsequenz kann eine DNA-Sequenz sein, z.B. eine doppelsträngige DNA-Sequenz. Vorzugsweise kodiert die Polynucleotidsequenz ein HPV-Polypeptid eines HPV-Typs oder Subtyps, der mit Gebärmutterhalskrebs mit benignen Hautwarzen oder Genitalwarzen assoziiert ist, z.B. mit den Typen 1–4, 6, 7, 10, 11, 16, 18, 26–29, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68, bevorzugt die Typen 6, 11, 16, 18, 33 oder 45, welche insbesondere mit Gebärmutterhalskrebs und Genitalwarzen assoziiert ist, und am meisten bevorzugt HPV 11, 6a oder 6b.
Daher wird ein synthetisches Gen bereitgestellt, das eine Vielzahl an Codons umfasst, die zusammen eine HPV-Aminosäuresequenz kodieren, wobei die Selektion der möglichen Codons, die zum Kodieren der Aminosäuresequenz ver wendet wurde, verändert worden ist, um der optimalen menschlichen Codon-Verwendung zu entsprechen, so dass die Frequenz der Codon-Verwendung in dem synthetischen Gen daher eng der von stark exprimierten menschlichen Genen an Stelle von Papilloma-Virus-Genen ähnelt. Bevorzugterweise ist das Codon-Verwendungsmuster im Wesentlichen das gleiche wie für stark exprimierte menschliche Gene.
In einigen Ausführungsformen ist die kodierte Aminosäuresequenz eine Wildtyp-HPV-Aminosäuresequenz. In alternativen Ausführungsformen ist die kodierte Aminosäuresequenz eine mutierte HPV-Aminosäuresequenz, umfassend die Wildtyp-Sequenz mit Aminosäure-Änderungen, z.B. Aminosäure-Punktmutationen, die ausreichend sind, um eine oder mehrere der natürlichen biologischen Funktionen des Polypeptids zu reduzieren oder zu inaktivieren. Die mutierte Aminosäuresequenz wird wünschenswerterweise die Immunogenizität des Wildtyp-Polypeptids behalten.
Das kodierte HPV-Polypeptid kann ein frühes Genprodukt wie E1, E2 oder E7 umfassen, oder ein Fragment, Analogon oder eine Fusion davon. Ein Polynucleotid der Erfindung kann beispielsweise eine Fusion zwischen zwei oder mehreren HPV frühen Genprodukten kodieren, einem HPV-Früh-Genprodukt und einem HPV-Spät-Genprodukt, z.B. L1 oder L2, oder ein Fragment, Analogon oder eine Fusion davon, oder zwischen zwei oder mehr HPV-Spät-Genprodukten, zwischen einem oder mehreren Fragmenten von HPV-Genprodukten oder zwischen einem HPV-Genprodukt (oder einem Fragment davon) und einem Polypeptid, das von einer Quelle stammt, die nicht HPV ist, z.B. ein Adjuvans oder ein Zielpeptid, oder Polypeptid, wie ein HBV-Kernpeptid. Fusionen können zwischen den HPV-Genprodukten stattfinden, die von gleichen oder von verschiedenen viralen Typen oder Subtypen stammen. Solche Fusionen bewahren bevorzugt die Immunogenizität der fusionierten Polypeptidbestandteile. Vorzugsweise umfasst das HPV-Polypeptid das gesamte oder ein Teil eines Früh-Genprodukts, am bevorzugten E1 oder E2. In einer besonderen Ausführungsform kodiert die Polynucleotidsequenz das Wildtyp-E1-Polypeptid von HPV6b, wie in 1 dargestellt, oder ein Fragment oder Analogon davon. In alternativen Ausführungsformen kann die Polynucleotidsequenz einen oder mehrere der folgenden kodieren: die mutierte HPV6b E1-Aminosäuresequenz, die in 2 dargestellt ist, die Wildtyp-E2-Aminosäuresequenz (3) von HPV 11 oder von 6a oder 6b; die mutierte HPV6b-E2-Aminosäuresequenz der 4b; und die mutierte HPV 11 E2-Sequenz der 4a, oder Fragmente, Analoga oder Fusionen davon, in denen die kodierten Polypeptide Immunogenizität bewahren.
Erfindungsgemäß schließt das Kodon-Verwendungsmuster des Polynucleotids vorzugsweise Kodons mit einem RSCU-Wert von weniger als 0,2 von stark exprimierten Genen des Zielorganismus aus. Ein relativer synonymer Codon-Verwendungs-(RSCU)-Wert ist die beobachtete Anzahl an Codons, geteilt durch die erwartete Anzahl, falls alle Codons dieser Aminosäuresequenz gleichmäßig häufig verwendet werden würden. Ein erfindungsgemäßes Polynucleotid wird im Allgemeinen einen Codon-Verwendungskoeffizienten (wie unten definiert) von stark exprimierten menschlichen Genen von mehr als 0,5, aber weniger als 1 haben. Wünschenswerterweise wird das Polynucleotid auch einen Codon-Verwendungskoeffizienten für stark exprimierte E.coli-Gene von mehr als 0,5, bevorzugterweise mehr als 0,6, am meisten bevorzugt mehr als 0,7 haben.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Polynucleotidsequenz bereit, die in den 5 oder 6 dargestellt ist, oder ein Fragment oder Analogon davon, welches das Codon-Verwendungsmuster davon bewahrt. In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Polynucleotidsequenz bereit, die komplementär zur Sequenz ist, die in den 5 oder 6 dargestellt ist.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, welcher eine Polynucleotidsequenz gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung umfasst und in der Lage ist, die Expression zu steuern, welche eine HPV-Aminosäuresequenz kodiert, wobei das Codon-Verwendungsmuster der Polynucleotidsequenz der von stark exprimierten menschlichen Genen ähnelt. Der Vektor kann zum Steuern der Expression heterologer DNA in bakteriellen, Insekten- oder Säugerzellen geeignet sein, insbesondere für menschliche Zellen. In einer Ausführungsform ist der Expressionsvektor P7313PLc (7).
Gemäß einem dritten erfindungsgemäßen Aspekt wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die eine Polynucleotidsequenz gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung umfasst, oder einen Expressionsvektor gemäß dem zweiten Aspekt. Die Wirtszelle kann bakteriell sein, z.B. E.coli, Säuger, z.B. Mensch, oder kann eine Insektenzelle sein. Säugerzellen, die einen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, können kultivierte Zellen sein, die in vitro transfiziert wurden, oder sie können in vivo durch Verabreichung des Vektors an den Säuger transfiziert werden.
In einem vierten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine Polynucleotidsequenz gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung umfasst. Bevorzugterweise umfasst die Zusammen setzung einen DNA-Vektor gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Zusammensetzung eine Vielzahl an Partikeln, bevorzugterweise an Goldpartikeln, die mit DNA beschichtet sind, welche einen Vektor umfassen, der eine Polynucleotidsequenz kodiert, welche eine HPV-Aminosäuresequenz kodiert, wobei das Codon-Verwendungsmuster der Polynucleotidsequenz der von stark exprimierten Säugergenen ähnelt, insbesondere von menschlichen Genen. In alternativen Ausführungsformen umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten und einen DNA-Vektor gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung. Die Zusammensetzung kann auch ein Adjuvans einschließen.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereit, welches den Schritt der Veränderung des Codon-Verwendungsmusters einer Wildtyp-HPV-Nucleotidsequenz einschließt, oder das Erzeugen einer Polynucleotidsequenz, auf synthetischem Wege, um eine Sequenz herzustellen, die ein Codon-Verwendungsmuster hat, das dem von stark exprimierten Säuregenen ähnelt, und eine Wildtyp-HPV-Aminosäuresequenz kodiert, oder eine mutierte HPV-Aminosäuresequenz, umfassend die Wildtyp-Sequenz mit ausreichenden Aminosäureänderungen, um eine oder mehrere der natürlichen Funktionen des Polypeptids zu inaktivieren.
Ebenfalls bereitgestellt ist die Verwendung eines Polynucleotids gemäß dem ersten Aspekt oder einen Vektor gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung, zur Behandlung oder Prophylaxe einer HPV-Infektion, bevorzugterweise einer Infektion durch einen HPV-Typ oder Subtyp, der mit Gebärmutterhalskrebs, benignen kutanen Warzen oder Genitalwarzen assoziiert ist, z.B. die Typen 1–4, 6, 7, 10, 11, 16, 18, 26–29, 31, 33, 35, 39, 95, 51, 52, 56, 58, 59 und 68. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung die Verwendung eines Polynucleotids gemäß dem ersten Aspekt bereit, oder von einem Vektor gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung, zur Behandlung oder Prophylaxe einer HPV-Infektion vom Typ 6, 11, 16, 18, 33 oder 45, welche besonders mit Gebärmutterhalskrebs und Genitalwarzen assoziiert sind, am meisten bevorzugt sind HPV 11, 6a, oder 6b. Die Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung eines Polynucleotids gemäß dem ersten Aspekt, einen Vektor gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung oder eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß dem vierten Aspekt der Erfindung, zur Behandlung oder Prophylaxe von kutanen (Haut-) Warzen, Genitalwarzen, atypischen schuppenartiten Zellen von unbestimmter Bedeutung (ASCUS), Gebärmutterhalsdysplasie, Gebärmutter hals-intraepithelialer Neoplasie (CIN) oder Gebärmutterhalskrebs bereit. Daher stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Polynucleotids gemäß dem ersten Aspekt, oder eines Vektors gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe einer HPV-Infektion von einem oder mehreren der Typen 1–4, 6, 7, 10, 11, 16, 18, 26–29, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68 bereit, oder irgendwelcher Symptome oder hiermit assoziierter Erkrankungen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von HPV-Infektionen bereit, insbesondere Infektionen durch einen oder mehrere der HPV-Typen 1–4, 6, 7, 10, 11, 16, 18, 26–29, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68, oder irgendewelcher Symptome oder Erkrankungen, die hiermit assoziiert sind, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Polynucleotids gemäß dem ersten Aspekt, eines Vektors gemäß dem zweiten Aspekt, oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß dem vierten Aspekt der Erfindung. Die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung kann die Form einer oder mehrerer individueller Dosierungen einnehmen, z.B. in einem therapeutischen „prime-boost" Impfregime, in einigen Fällen kann die „prime"-Impfung durch Partikel-vermittelte DNA-Verabreichung eines Polynucleotids gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgen, bevorzugterweise eingeschlossen in einen aus einem Plasmid stammenden Vektor und dem „boost" durch Verabreichung eines rekombinanten viralen Vektors, umfassend die gleiche Polynucleotidsequenz.
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und den begleitenden Ansprüchen sind die Wörter „umfassend" und „einschließend" und Variationen wie „umfassen", „umfassend", „einschließen" und „einschließend" einschließlich zu interpretieren. D.h., dass mit diesen Wörtern beabsichtigt wird, den möglichen Einschluss anderer Elemente oder Entitäten, die nicht spezifisch erwähnt sind, in Erwägung zu ziehen, wenn es der Kontext erlaubt.
Der Begriff „Analogon" bezieht sich auf ein Polynucleotid, das die gleiche Aminosäuresequenz wie ein anderes Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kodiert, aber welches aufgrund der Redundanz des genetischen Codes eine andere Nucleotidsequenz hat, während das gleiche Kodon-Verwendungsmuster bewahrt wird, z.B. eine mit dem gleichen Kodon-Verwendungskoeffizienten oder einem Kodon-Verwendungskoeffizienten innerhalb von 0,1, bevorzugt innerhalb von 0,05 von dem des anderen Polynucleotids.
Der Begriff „Kodon-Verwendungsmuster" bezieht sich auf durchschnittliche Häufigkeiten aller Kodons in der Nucleotidsequenz, im Gen oder der Klasse von Genen, die diskutiert werden (z.B. starkt exprimierte Säuger gene). Kodon-Verwendungsmuster für Säuger, einschließlich des Menschen, können in der Literatur gefunden werden (siehe z.B. Nakamura et al. Nucleic Acids Research 1996, 24: 214–215).
In den erfindungsgemäßen Polynucleotiden ist das Kodon-Verwendungsmuster von Menschen-Papilloma-Virus typischen geändert, um die Kodon-Neigung des Zielorganismus, z.B. von E.coli oder eines Säugers, insbesondere eines Menschen, stärker darzustellen. Der „Kodon-Verwendungskoeffizient" ist ein Maß dafür, wie stark das Kodon-Verwendungsmuster einer gegebenen Polynucleotidsequenz der einer Zielspezies ähnelt. Kodon-Frequenzen können aus Literaturquellen für starkt exprimierte Gene von verschiedenen Arten abgeleitet werden (siehe z.B. Nakamura et al. Nucleic Acids Research 1996, 24: 214–215). Die Kodon-Frequenzen für jeden der 61 Kodons (als Anzahl des Auftretens je 1.000 Kodons der ausgewählten Genklasse ausgedrückt) und für jede der 20 natürlichen Aminosäuren normalisiert werden, so dass der Wert für den am meisten verwendeten Kodon für jede Aminosäure als 1 festgesetzt wird, und die Häufigkeiten für weniger häufige Kodons so graduiert sind, dass sie zwischen 0 und 1 liegen. D.h., dass jedem der 61 Kodons ein Wert von 1 oder weniger bei stark exprimierten Genen der Zielspezies zugesprochen wird. Um einen Kodon-Verwendungskoeffizienten eines spezifischen Polynucleotids, bezogen auf stark exprimierte Gene dieser Spezies zu berechnen, werden die graduierten Werte für jeden Kodon des spezifischen Polynucleotids notiert, und der geometrische Mittelwert aller dieser Werte wird herangezogen (durch das Teilen der Summe der natürlichen logarythmischen Werte dieser Werte durch die Gesamtzahl der Kodons, und durch das Heranziehen des negativen Logarhytmus). Der Koeffizient hat einen Wert zwischen 0 und 1 und je höher der Koeffizient ist, desto mehr Kodons in dem Polynucleotid sind häufig verwendete Kodons. Wenn eine Polynucleotidsequenz einen Kodon-Verwendungskoeffizienten von 1 hat, sind alle Kodons die „am meisten häufigen" Kodons für stark exprimierte Gene der Zielspezies.
Kürzere Polynucleotidsequenzen liegen innerhalb des Bereichs der Erfindung. Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßes Polynucleotid ein Fragment eines HPV-Proteins kodieren. Ein Polynucleotid, das ein Fragment von mindestens 8, z.B. 8–10 Aminosäuren oder bis zu 20, 50, 60, 70, 80, 100, 150 oder 200 Aminosäuren Länge kodiert, wird als eines angesehen, das in den erfindungsgemäßen Bereich fällt, sofern das Polynucleotid ein Kodon-Verwendungsmuster hat, das dem stark exprimierter Säugergene ähnelt, und das kodierte Oligo- oder Polypeptid HPV-Antigenizität aufweist. Insbesondere, aber nicht ausschließlich, fasst dieser erfindungsgemäße Aspekt die Situation, wo das Polynucleotid ein Fragment einer kompletten HPV-Proteinsequenz kodiert, und einen oder mehrere einzelne Epitope des Proteins darstellt.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide zeigen eine stärkere Expression in E.coli und Säugerzellen als die entsprechenden Wildtyp-Sequenzen, die die gleichen Aminosäuresequenzen kodieren. Während man nicht an die Theorie gebunden zu sein wünscht, wird vermutet, dass es hierfür mindestens zwei Gründe gibt. Zuerst dadurch, dass ein Kodon-Verwendungsmuster vorliegt, das näher an dem liegt, das in der Wirtszelle verwendet ist, wodurch die Sequenzen leichter durch die Zell-Translationsmaschinerie verarbeitet werden. Zweitens, da bis zu 30% der Nucleotidsequenz (oder mehr) von der Wildtyp-Sequenz verschieden sind, sind Stellen, die mit der Transcription oder Translation (wie Protein-Bindungsstellen) interferieren, entfernt oder verändert worden.
In einigen Ausführungsformen zeigen die erfindungsgemäßen Polynucleotide Kodon-Verwendungsmuster, die denen von E.coli- und Säuger-(z.B. Menschen-)Genen ähneln. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn eine Sequenz bei der Impfung eines Säugers verwendet werden soll, und zur Erzeugung signifikanter Mengen des Antigen-Proteins in vitro unter Verwendung von E.coli-Zellen (z.B. zur Verwendung in Assays wie Immun-Assays, um die Expressions-Niveaus in Säugern oder menschlichen Geweben zu beurteilen).
Wie oben diskutiert wurde, schließt die vorliegende Erfindung Expressionsvektoren ein, die die Nucleotidsequenzen der Erfindung umfassen. Solche Expressionsvektoren werden routinegemäß auf dem Gebiet der Molekularbiologie konstruiert, und können beispielsweise die Verwendung von Plasmid-DNA und geeigneter Initiatoren, Promotoren, Enhancer und anderer Elemente einschließen, wie beispielsweise Polyadenylierungssignalen, die notwendig sein können, und die in richtiger Ausrichtung positioniert sind, um die Proteinexpression zu ermöglichen. Andere geeignete Vektoren sind Fachleuten auf dem Gebiet erkennbar. Als weiteres Beispiel in dieser Hinsicht beziehen wir uns auf Sambrook et al. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2^nd Edition. CSH Laboratory Press. (1989).
Vorzugsweise ist ein Polynucleotid der Erfindung oder zur Verwendung in der Erfindung in einem Vektor operativ an eine Kontrollsequenz gebungen, die in der Lage ist, die Expression der kodierenden Sequenz durch die Wirtszelle zu bewirken, d.h. der Vektor ist ein Expressionsvektor. Der Begriff „oben operativ verbunden" bezieht sich auf eine Benachbarung, worin die hier beschriebenen Bestandteile in einer Beziehung stehen, die ihnen erlaubt, in der gewünschten Weise zu funktionieren. Eine regulatorische Sequenz, wie ein Promotor, der „operativ" an eine kodierende Sequenz „gebunden" ist, ist in einer solchen Weise positioniert, dass die Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit der regulatorischen Sequenz kompatibel ist.
Die Vektoren können beispielsweise Plasmide, künstliche Chromosomen (z.B. BAC, PAC, YAC), Virus- oder Phagen-Vektoren sein, die mit einem Replikationsursprung ausgestattet sind, gegebenenfalls mit einem Promotor zur Expression des Polynucleotids und gegebenenfalls mit einem Regulator des Promotors. Die Vektoren können einen oder mehrere selektierbare Marker-Gene enthalten, z.B. einen Ampicillin- oder Kanamycin-Resistenzgen im Fall eines bakteriellen Plasmids, oder eines Resitenzgens für einen Pilzvektor. Vektoren können in vitro verwendet werden, z.B. zur Herstellung von DNA oder RNA, oder verwendet werden, um eine Wirtszelle zu transfizieren oder zu transformieren, z.B. eine Säugerwirtszelle, z.B. zur Produktion von Protein, das durch den Vektor kodiert wird. Die Vektoren können ebenfalls daran angepasst werden, dass sie in vivo verwendet werden, z.B in einem Verfahren zur DNA-Vakzinierung oder zur Gentherapie.
Promotoren und andere Expressions-Regulations-Signale können so ausgewählt werden, dass sie mit der Wirtszelle kompatibel sind, für deren Expression sie entworfen wurden. Beispielsweise schließen Säugerpromotoren den Metallothionin-Promotor ein, welcher als Reaktion auf Schwermetalle wie Kadmium induziert wird, und den β-Actin-Promotor. Virale Promotoren wie den SV40-großes-T-Antigen-Promotor, humanen Cytomegalievirus (CMV) – Immediate-Early(IE)-Promotor, Rous-Sarcoma-Virus LTR-Promotor, Adenovirus-Promotor, oder einen HPV-Promotor, insbesondere die HPV-stromaufwärts gelegene regulatorische Region (URR), können ebenfalls verwendet werden. Alle diese Promotoren sind in dem Gebiet gut beschrieben und leicht verfügbar.
Beispiele geeigneter viraler Vektoren schließen virale Herpes simplex Vektoren, Vaccinia- oder Alpha-Virus-Vektoren und Retroviren ein, einschließlich Lentiviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren. Gentransfer-Techniken unter Verwendung dieser Viren sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Retrovirus-Vektoren können beispielsweise verwendet werden, um das erfindungsgemäße Polynucleotid in das Wirtsgenom zu integrieren, obwohl eine solche Rekombination nicht bevorzugt ist. Replikationsdefekte Adenovirus-Vektoren hingegen bleiben episomal und erlauben daher eine transiente Expression. Vektoren, die in der Lage sind, die Expression in den Insektenzellen (z.B. Baculovirus-Vektoren), in menschlichen Zellen oder Bakterien anzutreiben, können verwendet werden, um Mengen des HPV-Proteins herzustellen, die durch die erfindungsgemäßen Polynucleotide kodiert werden, z.B. zur Verwendung als Untereinheiten-Impfstoffe oder in Immun-Assays.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide haben einen Nutzen bei der Herstellung durch Expression der kodierten Proteine, wobei die Expression in vitro, in vivo oder ex vivo stattfinden kann. Die Nucleotide können daher bei der Synthese rekombinanter Protein beteiligt sein, z.B. um die Ausbeuten zu erhöhen, oder sie können sogar als therapeutische Mittel selbst Anwendung finden, wenn sie in DNA-Impftechniken verwendet werden. Wenn die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung zur Herstellung der kodierten Proteine in vitro oder ex vivo verwendet werden, werden die Zellen, z.B. in der Zellkultur, so modifiziert, dass sie die zu exprimierenden Polynucleotide einschließen. Solche Zellen schließen transiente oder bevorzugterweise stabile Säugerzelllinien ein. Besondere Beispiele für Zellen, die durch die Insertion von Vektoren modifiziert werden können, welche ein Polypeptid gemäß der Erfindung kodieren, schließen Säuger HEK293T-Zellen, CHO, HeLa, 293 und COS-Zellen ein. Bevorzugt wird die ausgewählte Zelllinie eine sein, die nicht nur stabil ist, sondern auch die reife Glycosilierung und die Zelloberflächen-Expression eines Polypeptids ermöglicht. Die Expression kann auch in transformierten Oocyten erreicht werden. Ein Polypeptid kann von einem erfindungsgemäßen Polynucleotid in Zellen nicht menschlicher transgener Tiere, bevorzugterweise einer Maus, exprimiert werden. Ein transgenes nicht-menschliches Tier, das ein Polypeptid von einem erfindungsgemäßen Polynucleotid exprimiert, ist in den Schutzbereich der Erfindung eingeschlossen.
Wenn die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung als therapeutische Mittel Anwendung finden, z.B. bei der DNA-Impfung, wird die Nucleinsäure an den Säuger, z.B. einen Menschen, der geimpft werden soll, verabreicht. Die Nucleinsäure, wie RNA oder DNA, bevorzugterweise DNA, wird in Form eines Vektors, z.B. eines solchen, der oben beschrieben wurde, bereitgestellt, welcher in Zellen des Säugers exprimiert werden kann. Die Polynucleotide können durch irgendeine verfügbare Technik verabreicht werden. Beispielsweise kann die Nucleinsäure durch Nadelinjektion, bevorzugt intradermal, subkutan oder intramuskulär, eingeschleust werden. Alternativ dazu kann die Nucleinsäure direkt in die Haut verabreicht werden, indem ein Nucleinsäure-Verabreichungsgerät verwendet wird, wie eine Partikel-vermittelte DNA-Verabreichung (PMDD). In diesem Verfahren werden träge Partikel (wie Goldkügelchen) mit einer Nucleinsäure beschichtet, und sie werden auf Geschwindigkeiten beschleunigt, die ausreichend sind, um ihnen zu ermöglichen, die Oberfläche des Empfängers (z.B. die Haut) zu durchdringen, z.B. mit Hilfe einer Entladung unter Hochdruck aus einer Projektilvorrichtung. (Partikel, die mit einem Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung beschichtet sind, liegen innerhalb des erfindungsgemäßen Schutzbereichs, wie auch Verabreichungsvorrichtungen, die mit solchen Partikeln beladen sind). Die Zusammensetzung umfasst wünschenswerterweise Goldpartikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,5–5 μm, bevorzugt ungefähr 2 μm. In bevorzugten Ausführungsformen werden die beschichteten Goldkügelchen in das Röhrchen geladen, die als Patronen dienen, so dass jede Patrone 0,1–1 mg enthält, bevorzugt 0,5 mg an Gold, beschichtet mit 0,1–5 μg, bevorzugt ungefähr 0,5 μg DNA/Patrone.
Geeignete Techniken zum Einschleusen des nackten Polynucleotids oder eines Vektors in einen Patienten schließen die topische Verabreichung mit einem geeigneten Träger ein. Die Nucleinsäure kann topisch über die Haut oder eine Schleimhautoberfläche, z.B. durch intranasale, orale, intravaginale oder intrarektale Verabreichung dargereicht werden. Das nackte Polynucleotid oder der Vektor kann zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Excipienten, wie Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), vorliegen. Die DNA-Aufnahme kann weiter durch die Verwendung von Erleichterungsmitteln wie Bupivacain, entweder separat oder in die DNA-Formulierung eingeschlossen, erleichtert werden. Andere Verfahren zur direkten Verabreichung von Nucleinsäure an einen Empfänger schließen Ultraschall, elektrische Stimulierung, Elektroporation und Microseeding ein, welches in US-5,697,901 beschrieben ist.
Die Aufnahme der Nucleinsäure-Konstrukte kann durch mehrere bekannte Transfektionstechniken verstärkt werden, z.B. durch solche, die die Verwendung von Transfektionsmitteln einschließen. Beispiele dieser Mittel schließen kationische Mittel, beispielsweise Calciumphosphat und DEAE-Dextran ein, und Lipofectamine, beispielsweise Lipofectam und Transfectam. Die Dosierung der Nucleinsäure, die zu verabreichen ist, kann verändert werden. Typischerweise wird die Nucleinsäure in einer Menge verabreicht, die in einem Bereich von 1 pg bis 1 mg liegt, bevorzugt sind 1 pg bis 10 μg Nucleinsäure für den Partikel vermittelten Gentransfer und 10 μg bis 1 mg für andere Wege.
Eine erfindungsgemäße Nucleinsäuresequenz kann ebenfalls durch spezialisierte Zufuhrvektoren verabreicht werden, die in der Gentherapie nützlich sind. Gentherapeutische Ansätze werden beispielsweise von Verme et al., Na ture 1997, 389: 239–242, diskutiert. Sowohl virale als auch nicht-virale Vektorsysteme können verwendet werden. Auf Viren basierende Systeme schließen retrovirale, lentivirale, adenovirale, adeno-assoziierte virale, Herpes-virale, Canarypox- und auf Vaccinia-Virus basierende Systeme ein. Nicht auf Viren basierende Systeme schließen die direkte Verabreichung von Nucleinsäuren, die Microsphären-Verkapselungstechnologie (Poly(lactid-co-glycolid) und auf Liposomen basierende Systeme ein. Virale und nicht-virale Verabreichungssysteme können kombiniert werden, wo es wünschenswert ist, nach einer anfänglichen Impfung Booster-Injektionen zu verabreichen, beispielsweise durch eine anfängliche „prime" DNA-Impfung, unter Verwendung eines nicht-virales Vektors, wie eines Plasmids, gefolgt von einer oder mehreren „Boost"-Impfungen unter Verwendung eines viralen Vektors oder eines nicht auf Viren basierenden Systems.
Eine erfindungsgemäße Nucleinsäuresequenz kann ebenfalls mit Hilfe transformierter Zellen verabreicht werden. Solche Zellen schließen Zellen ein, die aus einem Individuum gewonnen wurden. Das nackte Polynucleotid oder ein Vektor der vorliegenden Erfindung kann in solche Zellen in vitro eingeschleust werden, und die transformierten Zellen können dann später in das Individuum zurückgeführt werden. Das erfindungsgemäße Polynucleotid kann sich in die bereits in einer Zelle vorhandene Nucleinsäure durch homologe Rekombinationsvorgänge integrieren. Eine transformierte Zelle kann, falls gewünscht, in vitro gezüchtet werden, und eine oder mehrere der erhaltenen Zellen können erfindungsgemäß verwendet werden. Die Zellen können an einer geeigneten Stelle des Patienten durch bekannte chirurgische oder mikrochirurgische Techniken (z.B. Verpflanzen, Mikro-Injektion etc.) bereitgestellt werden.
Geeignete Zellen schließen Antigen-präsentierende Zellen (APCs) ein, wie dendritische Zellen, Macrophagen, B-Zellen, Monozyten und andere Zellen, die so konstruiert werden können, dass sie wirksame APCs sind. Solche Zellen können, müssen aber nicht, genetisch modifiziert sein, um die Fähigkeit zu steigern, Antigen zu präsentieren, die Aktivierung zu verbessern und/oder die Aufrechterhaltung der T-Zell-Reaktion zu verbessern, um Anti-Tumor, z.B. Anti-Gebärmutterhalskarzinom-Wirkungen per se zu haben und/oder immunologisch mit dem Empfänger kompatibel zu sein (d.h. einen passenden HLA-Haplotyp zu haben). Die APCs können im Allgemeinen aus irgend einem aus einer Vielzahl biologischer Flüssigkeiten und Organe isoliert werden, einschließlich Tumoren und tumorumgebenden Geweben, und sie können autologe, allogene, syngene oder xenogene Zellen sein.
Einige bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung verwenden dendritische Zellen oder Vorläufer davon als Antigen präsentierende Zellen, entweder für die Transformation in vitro, und führen sie in den Patienten zurück, oder als in vivo-Ziel für Nucleotide, die in dem Impfstoff beliefert werden, z.B. durch eine Partikel-vermittelte DNA-Verabreichung. Dendritische Zellen sind stark leistungsfähige APCs (Banchereau und Steinman, Nature 392: 245–251, 1998) und haben sich als wirksam als physiologisches Adjuvans zum Auslösen prophylaktischer oder therapeutischer Anti-Tumor-Immunität erwiesen (siehe Timmerman und Levy, Ann. Rev. Med. 50: 507–529, 1999). Im Allgemeinen können dendritische Zellen aufgrund ihrer typischen Form (sternförmig in situ, mit auffälligen zytoplasmatischen Verlängerungen (Dendriten), die in vitro sichtbar sind), ihrer Fähigkeit, Antigene mit großer Wirksamkeit aufzunehmen, zu verarbeiten und zu präsentieren, und ihrer Fähigkeit, naive T-Zell-Reaktionen zu aktivieren identifiziert werden. Dendritische Zellen können natürlich konstruiert werden, um spezifischer Zell-Oberflächenrezeptoren zu exprimieren oder Liganden, die nicht für gewöhnlich auf dendritischen Zellen in vivo oder ex vivo gefunden werden, z.B. die Antigene, die durch die Konstrukte der Erfindung kodiert werden, und solche modifizierten dendritischen Zellen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen. Als eine Alternative für dendritische Zellen können sezenierte Vesikel-Antigen-beladene dendritische Zellen (so genannte Exosome) als Impfstoff verwendet werden (siehe Zitvogel et al., Nature Med. 4: 594–600, 1998).
Dendritische Zellen und Vorläufer davon können aus dem peripheren Blut, Knochenmark, aus Tumor-infiltrierenden Zellen, aus peritumoralen Gewebeinfiltrierenden Zellen, aus Lympfknoten, Milz, Haut, Nabelschnurblut oder irgendeinem anderen geeigneten Gewebe oder Flüssigkeit gewonnen werden. Beispielsweise können dendritische Zellen ex vivo differenziert werden, indem eine Kombination aus Cytokinen, wie GM-CSF, IL-4, IL-13 und/oder TNF zu Kulturen von Monozyten gegeben werden, die aus dem peripheren Blut geerntet wurden. Alternativ dazu können CD34-positive Zellen, die aus dem peripheren Blut, dem Nabelschnurblut und dem Knochenmark geerntet wurden, in dendritische Zellen differenziert werden, indem zu dem Kulturmedium Kombinationen aus GM-CSF, IL-3, TNF, CD40-Ligand, Lipopolysaccharid LPS, flt3-Ligand (ein Cytokin, das bei der Erzeugung professioneller Antigenpräsentierender Zellen wichtig ist, insbesondere dendritischer Zellen) und/oder andere Verbindungen, die die Differenzierung, die Reifung und die Proliferation dendritischer Zellen verursachen.
APCs können im Allgemeinen mit einem Polynucleotid transfiziert werden, das eine antigene HPV-Aminosäuresequenz kodiert, z.B. ein Kodon-optimiertes Polynucleotid, wie in dem Rahmen der vorliegenden Erfindung avisiert. Eine solche Transfektion kann ex vivo stattfinden, und eine Kombination oder ein Impfstoff, der solche transfizierte Zellen umfasst, kann dann für therapeutische Zwecke, wie hier beschrieben, verwendet werden. Alternativ dazu kann ein Genverabreichungsträger, das eine dendritische oder andere Antigen-präsentierende Zelle anvisiert, einem Patienten verabreicht werden, was zur Transfektion führt, die in vivo stattfindet. Die in vivo- und ex vivo-Transfektion dendritischer Zellen kann beispielsweise im Allgemeinen durchgeführt werden, indem irgendwelche Methoden, die in dem Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden, wie solche, die beschrieben sind in WO 97/24447, oder der durch Partikel vermittelte Ansatz, der in Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75: 456–460, 1997, beschrieben ist.
Impfstoffe und pharmazeutische Zusammensetzungen können in Einheitsdosen oder Multi-Dosierungsbehältern vorliegen, wie in versiegelten Ampullen oder Phiolen. Solche Behälter werden vorzugsweise hermetisch versiegelt, um die Sterilität der Formulierung bis zur Verwendung zu konservieren. Im Allgemeinen können Formulierungen als Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Trägern gelagert werden. Alternativ dazu kann ein Impfstoff oder eine pharmazeutische Zusammensetzung in einem gefriergetrockneten Zustand gelagert werden, was nur die Zugabe eines sterilen Flüssigträgers direkt vor der Verwendung notwendig macht. Impfstoffe, die Nucleotidsequenzen umfassen, die für die Verabreichung über Partikel vermittelte Verabreichung beabsichtigt sind, können als Patronen vorliegen, die zur Verwendung mit einem komprimierten Gas-Verabreichungsinstrument geeignet sind, wobei die Patronen aus hohlen Röhren bestehen, deren innere Oberfläche mit Partikeln beschichtet ist, die die Impfstoff-Nucleotidsequenz tragen, gegebenenfalls in Gegenwart anderer pharmazeutisch annehmbarer Inhaltsstoffe. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können Adjuvans-Verbindungen einschließen, oder andere Substanzen, die dazu dienen, die Immunreaktion, die durch das Protein, welches durch die DNA kodiert wird, zu modulieren oder zu erhöhen. Diese können durch die DNA kodiert werden, entweder getrennt davon oder als Fusion mit dem Antigen, oder sie können als Nicht-DNA-Elemente der Rezeptur eingeschlossen ein. Beispiele von Substanzen vom Adjuvans-Typ, die in die Formulierungen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein können, schließen Ubiquitin, lysosomales assoziiertes Membranprotein (LAMP), Hepatitis B-Virus Kern-Antigen, flt3-Ligand und andere Cytokine wie IFN-γ und GMCSF ein.
Andere geeignete Adjuvantien sind kommerzielle erhältlich, wie beispielsweise Freund's Unvollständiges Adjuvans oder Vollständiges Adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI); Iniquimod (3M, St. Paul, MN); Resimiquimod (3M, St. Paul, MN); Merck Adjuvans 65 (Merck und Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, FA); Aluminiumsalze wie Alumiumhydroxid-Gel (alum) oder Aluminiumphosphat; Salze von Calcium, Eisen oder Zink; eine unlösliche Suspension acylierten Tyrosins, acylierte Zucker, kationisch oder anionisch derivatisierte Polysaccharide, Polyphosphazene, biologisch abbaubare Microsphären; Monophosphoryl-Lipid A und Quil A. Cytokine wie GM-CSF oder Interleukin-2, -7 oder -12 können ebenfalls als Adjuvantien verwendet werden.
In den Formulierungen der Erfindung wird es bevorzugt, dass die Adjuvans-Zusammensetzung eine Immunreaktion induziert, die vorwiegend vom TH1-Typ ist. D.h., dass das Adjuvans dazu dienen kann, die Immunreaktion, die gegen die DNA-kodierten Antigene erzeugt wird, von einem vorwiegenden TH2 in eine vorwiegende TH1-Typ-Antwort zu modulieren. Hohe Konzentration an TH1-artigen Cytokinen (z.B. IFN-, TNF, IL-2 und IL-12) neigen dazu, die Induktion zellvermittelter Immunreaktionen gegen ein verabreichtes Antigen auszulösen. Innerhalb einer bevorzugten Ausführungsform, in der eine Reaktion vorwiegend vom TH1-Typ ist, wird das Niveau der TH1-artigen Cytokine in einem größeren Ausmaß ansteigen als das Niveau der TH2-artigen Cytokine. Die Mengen dieser Cytokine können leicht unter Verwendung von Standard-Assays untersucht werden. Für einen Übersichtsartikel der Cytokinfamilien siehe Mosmann und Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145–173, 1989.
Demgemäß schließen geeignete Adjuvantien zur Verwendung in der Auslösung einer vorwiegenden TH1-artigen Reaktion beispielsweise eine Kombination aus Monophosphoryl Lipid A, bevorzugt 3-de-O-acyliertes Monophosphoryl Lipid A (3D-MPL) zusammen mit einem Aluminiumsalz ein. Andere bekannte Adjuvantien, die bevorzugt eine TH1-artige Immunreaktion auslösen, schließen CpG-haltige Oligonucleotide ein. Die Oligonucleotide sind dadurch gekennzeichnet, dass das CpG-Dinucleotid nicht methyliert ist. Solche Oligonucleotide sind gut bekannt und sind beispielsweise beschrieben in WO 96/02555. Immunstimulatorische DNA-Sequenzen sind ebenfalls beschrieben, beispielsweise von Sato et al., Science 273: 352, 1996. CpG-haltige Oligonucleotide können separat von den Papilloma-Antigenen in dem gleichen oder verschiede nen Polynucleotidkonstrukt kodiert sein, oder sie können direkt daran anschließen, z.B. als Fusion damit. Alternativ dazu können die CpG-haltigen Oligonucleotide separat verabreicht werden, d.h. nicht als Teil einer Zusammensetzung, die das kodierte Antigen einschließt. CpG-Oligonucleotide können alleine oder in Kombination mit anderen Adjuvantien verwendet werden. Beispielsweise schließt ein verstärktes System die Kombination aus CpG-haltigen Oligonucleotid- und ein Saponin-Derivat ein, insbesondere die Kombination aus CpG und QS21, wie offenbart in WO 00/09159 und WO 00/62800. Bevorzugterweise umfasst die Formulierung zusätzlich eine Öl-in-Wasser-Emulsion und/oder Tocopherol.
Ein weiteres bevorzugtes Adjuvans ist ein Saponin, bevorzugt 4521 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA) welches allein oder in Kombination mit anderen Adjuvantien verwendet werden kann. Beispielsweise schließt ein verstärktes System eine Kombination aus Monophosphoryl Lipid A und Saponin-Derivat ein, wie die Kombination von QS21 und 3D-MPL, die in WO 94/00153 beschrieben ist, oder eine weniger reaktogene Zusammensetzung, wobei das QS21 mit Cholesterol in Verbindung ist, wie in WO 96/33739 beschrieben. Andere bevorzugte Formulierungen umfassen eine Öl-in-Wasser-Emulsion und Tocopherol. Eine besonders starke Adjuvans-Formulierung, die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion einschließt, wird beschrieben in WO 95/17210.
Andere bevorzugte Adjuvantien schließen Montanid ISA 720 (Seppic, Frankreich), SAF (Chiron, Kalifornien, Vereinigte Staaten), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), Detox (Ribi, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) und andere Aminoalkohol-glucosamin-4-phosphate (AGPs) ein.
Andere bevorzugte Adjuvantien schließen Adjuvans-Moleküle der allgemeinen Formel (I) ein, HO(CH2CH2O)n-A-R Formel (I)worin n 1–50 ist, A eine Bindung oder -C(O)- ist, R C1-50-Alkyl oder Phenyl C1-50-Alkyl ist.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform besteht aus einer Formulierung, die einen Polyoxyethylenether der allgemeinen Formel (I) umfasst, wobei n zwischen 1 und 50 ist, bevorzugt 4-24, am meisten bevorzugt 9; der R-Bestandteil ist C1-50, bevorzugt C4-C20-Alkyl und am meisten bevorzugt C12-Alkyl, und A ist eine Bindung. Die Konzentration der Polyoxyethylenether sollte im Bereich von 0,1–20% liegen, bevorzugt von 0,1–10%, und am meisten bevorzugt im Bereich von 0,1–1%. Bevorzugte Polyoxyethylenether werden ausgewählt aus der folgenden Gruppe: Polyoxyethylen-9-laurylether, Polyoxyethylen-9-steorylether, Polyoxyethylen-8-steorylether, Polyoxyethylen-4-laurylether, Polyoxyethylen-35-laurylether und Polyoxyethylen-23-laurylether. Polyoxyethylenether wie Polyoxyethylenlaurylether sind beschrieben im Merck-Index (12. Ausgabe: Eintrag 7717). Diese Adjuvanz-Moleküle sind beschrieben in WO 99/52549. Der Polyoxyethylenether gemäß der allgemeinen Formel (I) oben, kann, falls gewünscht, mit anderen Adjuvantien kombiniert werden. Beispielsweise ist eine bevorzugte Adjuvans-Kombination bevorzugterweise mit einem CpG, wie in der anhängigen UK-Patentanmeldung GB 9820956.2 beschrieben.
Wenn der Impfstoff ein Adjuvans einschließt, kann die Impfstoff-Formulierung in zwei Teilen verabreicht werden. Beispielsweise kann der Teil der Formulierung, der das Nucleotidkonstrukt enthält, welches das Antigen kodiert, zuerst verabreicht werden, z.B. durch subkutane oder intramuskuläre Injektion, oder durch intradermale Partikel-vermittelte Verabreichung, und dann kann der Teil der Formulierung, der das Adjuvans enthält, anschließend, entweder sofort oder nach einer geeigneten Zeitspanne, verabreicht werden, die dem Arzt, der sich im Bereich der Impfstoffe auskennt, einleuchtet. Unter diesen Umständen kann das Adjuvans auf dem gleichen Wege wie die Antigen-Formulierung oder durch einen anderen Weg verabreicht werden. In anderen Ausführungsformen kann der Adjuvansteil der Formulierung vor dem Antigenteil verabreicht werden. In einer Ausführungsform ist das Adjuvans eine topische Formulierung, die über die Haut an der Stelle der Partikel-vermittelten Verabreichung der Nucleotidsequenzen appliziert wird, welche die Antigene kodiert, entweder vor oder nach deren Partikel-vermittelter Verabreichung.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen weiter zu illustrieren, in denen:
1 die Prototyp Wildtyp-Aminosäuresequenzen von E1 von HPV-Typen 11, 6a und 6b zeigt, die aus der Genbank stammen;
2 die prototypische Wildtyp-Aminosäuresequenz von HPV6b E1 aus 1 (6b–e1) aneinandergelagert mit der HPV6b E1 Aminosäuresequenz zeigt, die Punktmutationen einschließt, um die biologische Aktivität zu entfernen (6b–e1 mut);
3 den Prototyp der Wildtyp-Aminosäuresequenzen von E1 von HPV-Typen 11, 6a und 6b zeigt, die aus der Genbank stammen;
4a die Prototyp-Wildtyp-Aminosäuresequenz von HPV11 E2 aus 3 (Hpv-11e2-wt) zeigt, die an die HPV11 E2 Aminosäuresequenz angelagert ist, einschließlich einer Punktmutation, um die biologische Aktivität zu entfernen (Hpv-11e2-mut), und mit der Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotidsequenz der 6 kodiert wird (Hpv-11e2-comut);
4b den Prototyp einer Wildtyp-Aminosäuresequenz von HPV6b E2 aus 3 (Hpv-6be2-wt) aneinandergelagert mit der HPV6b E2 Aminosäuresequenz zeigt, die eine Punktmutation einschließt, um die biologische Aktivität zu entfernen (Hpv-6be2-mut);
5 eine Nucleotidsequenz zeigt, die ein Kodon-Verwendungsmuster hat, das einem stark exprimierten menschlichen Gen ähnelt, welche die mutierte Aminosäuresequenz von HPV6b E1 aus 2 kodiert;
6 eine Nucleotidsequenz mit einem Kodon-Verwendungsmuster, das einem stark exprimierten menschlichen Gen ähnelt, zeigt, welches die mutierte Aminosäuresequenz von HPV11 E2 aus 4 kodiert;
7 den DNA-Vektor P7313-PLc zeigt;
8 Zell-Lysatproben aus Beispiel 4 zeigt, die auf einem Acrylamid-Gel laufen gelassen wurden und gefärbt wurden, um die Antikörper-Bindung an das exprimierte E1-Protein zu zeigen;
9 die zellulären Reaktionen gegen eine Antigen-Forderung nach der Immunisierung von Mäusen mit einem Polynucleotid gemäß der Erfindung (Beispiel 6) zeigt; und
10 Zell-Lysatproben aus Beispiel 7, die auf einem Acrylamid-Gel laufen gelassen wurden, und gefärbt wurden, zeigt, um die Antikörper-Bindung gegen das exprimierte E2-Protein zu zeigen.
Beispiel 1 – Kodon-Optimierung von HPV6bE1
Die Wildtyp-Prototyp-Aminosäuresequenz von HPV6b E1, die aus der Genbank gewonnen wird, wird in 1 (untere Sequenz) dargestellt. Diese Figur zeigt das hohe Niveau der Homologie dieses Proteins zwischen den HPV-Virus-Prototyp-Sequenzen von den Typen 11, 6a und 6b. Gleichermaßen zeigt 3 die Wildtyp-Prototyp-Aminosäuresequenzen des E2-Proteins von HPV11, 6a und 6b. Es wird erwartet, dass eine Immuntherapie (therapeutischer Impfstoff) unter Verwendung von HPV6b-Sequenzen kreuzreagiert, und eine prophylaktische oder therapeutische Immunreaktion gegen alle drei viralen Typen bietet.
Die Kodon-Verwendung der HPV6b E1-Sequenz wurde mit der stark exprimierter menschlicher und E.coli-Gene verglichen, und es wurde herausgefunden, dass sie einen niedrigen Kodon-Verwendungskoeffizienten für beide Spezies hat. Indem einfach die häufigsten Kodons für jeden Aminosäurerest verwendet werden, würde es zu einem verzerrten Kodon-Verwendungsmuster führen, da kein Organismus ausschließlich seinen meist bevorzugten Kodon für eine gegebene Aminosäure verwendet. Konsequenterweise wurden die Kodons unter Verwendung einer statistischen Methode zugeordnet, um ein synthetisches Gen zu ergeben, das eine Kodon-Frequenz hat, die näher an der ist, die natürlicherweise in stark exprimierten E.coli und Menschengenen gefunden wird.
Die Kodons in diesem synthetischen Gen wurden unter Verwendung des Visual Basic Program, das als Calcgene bezeichnet wird, geschrieben von R. S. Hale und G. Thompson (Protein Expression and Purification, Vol. 12, Seiten 185–188 (1998)) zugeordnet. Für jeden Aminosäurerest in der ursprünglichen Sequenz wurde ein Kodon aufgrund der Wahrscheinlichkeit seines Auftretens in stark exprimierten E.coli-Genen zugeordnet. Details über das Programm, das in Microsoft Windows 3.1 arbeitet, können von den Autoren bezogen werden. Da das Programm ein statistisches Verfahren zur Zuordnung von Kodons zu einem synthetischen Gen anwendet, sind nicht alle resultierenden Kodons die am häufigsten in dem Zielorganismus verwendeten. Eher wird der Anteil häufig und nicht häufig verwendeter Kodons des Zielorganismus in der synthetischen Sequenz durch Zuordnung von Kodons in den richtigen Proportionen wiedergespiegelt. Jedoch, da es keine bindende Regel gibt, die einem bestimmten Kodon einer bestimmten Position in der Sequenz zuordnet, wird das Programm jedes Mal, wenn es laufen gelassen wird, ein verschiedenes synthetisches Gen herstellen, obwohl jedes das gleiche Kodon-Verwendungsmuster haben wird, und jedes die gleiche Aminosäuresequenz kodieren wird. Wenn das Programm meherere Male für eine jeweilige Aminosäuresequenz und für einen beliebigen Organismus laufen gelassen wird, werden mehrere verschiedene Nucleotidsequenzen hergestellt, die sich in der Anzahl, der Art und der Position der Restriktionsstellen, den Intron-Splice-Signalen etc. unterscheiden, von denen einige unerwünscht sind. Der gelehrte Fachmann wird in der Lage sein, eine geeignete Sequenz zur Verwendung in der Expression des Polypeptids auf Grundlage dieser Merkmale auszuwählen.
Da die Kodons außerdem zufallsgemäß auf statistischer Grundlage zugeordnet werden, ist es möglich (obwohl vielleicht unwahrscheinlich), dass zwei oder mehr Kodons, die relativ selten in dem Zielorganismus verwendet werden, in Nachbarschaft zusammenfallen können. Es wird vermutet, dass solche Cluster, die Translationsmaschinerie durcheinander bringen können und zu besonders niedrigen Expressionsraten führen, so dass der Algorhythmus zum Auswählen der Kodons in dem optimierten Gen alle Kodons ausschließt, die mit einem RSCU-Wert von weniger als 0,2 für stark exprimierte Gene, um zu verhindern, dass irgendwelche seltenen Kodon-Klaster zufällig ausgewählt werden. Die Verteilung der verbleibenden Kodons wurde dann gemäß den Häufigkeiten für stark exprimierte E.coli-Gene zugeordnet, um eine Gesamtverteilung in dem synthetischen Gen zu ergeben, das der von E.coli-Gen (Koeffizient = 0,85) und auch dem stark exprimierter menschlicher Gene (Koeffizient = 0,50) ähnelte. Ein ähnliches Verfahren wurde verwendet, um eine Kodon-optimierte Nucleotidsequenz für HPV11 E2 zu erhalten, außer das Syngen (Peter Ertl, nicht veröffentlicht), eine auf den neuesten Stand gebrachte Version des Calcgene-Programms verwendet wurde, um die Kodons gemäß des Kodon-Häufigkeitsmusters stark exprimierter menschlicher Gene zuzuordnen, welches den Ausschluss seltener Kodons als optional ermöglicht. Anders als die Kodon-Zuordnung für E1 wurden seltene Kodons nicht ausgeschlossen. Zum gleichen Zeitpunkt wurde in einem der Oligonucleotide, die eine K111A-Aminosäuren-Änderung kodieren, durchgeführt, wie unten beschrieben.
Es wurden Mutationen in die Kodon-optimierten E1- und E2-Gene eingeschleust, um Punktmutationen in den E1 (K83G, R84G und G483D) und E2 (K111A) Aminosäuresequenzen auszulösen. Die Aminosäuresequenzen der mutierten Gene sind in den 2 (HPV6bE1) und 4 (HPV6bE2 und HPV11E2) gezeigt (mit der Wildtyp-Prototypsequenz aneinandergelagert). Die Kodon-optimierte und mutierte Nucleotidsequenz von HPV6b E1 ist in 5 gezeigt. Die Kodon-optimierte und mutierte Nucleotidsequenz für HPV11 E2 ist in 6 gezeigt. In 4 wird ebenfalls die Aminosäuresequenz des Polypeptids angegeben, das durch die Expression des Kodon-optimierten und mutierten HPV11 E2-Gens erhalten wird, in Anlagerung mit dem Prototyp und den mutierten Wildtyp-Sequenzen, um zu zeigen, dass die Kodon-Optimierung der Nucleotidsequenz nicht die Aminosäuresequenz ändert, die kodiert wird (welche identisch mit der mutierten Wildtyp-Sequenz ist).
Beispiel 2 – Konstruktion der Kodon-optimierten HPV6b E1 Polynucleotidsequenz
Gendesign:
Unter Verwendung der oben diskutierten Optimierungssoftware, wurden überlappende 40mer Oligonucleotide von einer optimierten Sequenz berechnet. Die terminalen Oligonucleotide, die die Restriktionsschnittstellen enthalten, waren 60mere. Die Oligonucleotide wurden von Life Technologies Ltd. in einer 50-nM-Konzentration, entschützt und nicht phosphoryliert, bestellt.
Oligonucleotid-Zusammenbau:
Jedes Oligonucleotid wurde in doppelt destilliertem Wasser auf eine 100 micromolare (μmol) Endkonzentration gelöst, und eine gleiche Mischung wurde von allen 96 Oligonucleotiden zu 100 μmol hergestellt. Die Synthese wurde ausgeführt, wie aus der Verwendung der Pwo-Polymerase von Roche Boehringer (Cat No. 1 644 955) folgt.

Doppelt destilliertes Wasser 86 μl

Pwo-10X-Puffer 10 μl

dNTP-Mix 1 μl (gleicher Mix aus 100 mmol dNTPs)

Oligo-Mix 1 μl (gleicher Mix aus 100 μmol Oligos)

Pwo-Polymerase 2 μl
Auf einem Trio-Thermoblock (Biometra) wurde eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) anhand des oben erwähnten Reaktionsmixes unter Verwendung der folgenden Bedingungen durchgeführt:

1. 40°C 2 Min.

2. 72°C 10 Sek.

3. 94°C 15 Sek.

4. 40°C 30 Sek.

5. 72°C 20 Sek. + 2 Sek. pro Zyklus

6. 4°C ∞
Zyklus wurde 25-mal zwischen den Schritten 3 und 5 wiederholt.
Nach Beendigung von 25 Zyklen wurde ein 10 μl Aliquot aus jedem Röhrchen entfernt und auf einen 0,8%igen Trisacetat(TAE)-Agarosegel laufen lassen und unter langwelligem UV-Licht beobachtet. Die erwartete Größe der synthetisierten E1-DNA sollte ungefähr 2 kb betragen.
Gengewinnung:

Das synthetische Gen wurde durch PCR unter Verwendung von Polymerase mit den zwei terminalen Oligos gewonnen, die eine Not I-Restriktionsstelle am N-Terminus des synthetischen Oligos enthalten und eine Bam H1-Stelle am C-Terminus des synthetischen Oligos.

Doppelt destilliertes Wasser	65 μl
Pwo-10X-Puffer	10 μl
dNTP-Mix	1 μl (gleiche Mischung aus 100 mmol dNTPs)
Zusammenbau-Mix	20 μl (aus der vorhergehenden PCR)
N-terminales Oligo	1 μl (100 μmol)
C-terminales Oligo	1 μl (100 μmol)
Pwo-Polymerase	2 μl

1. 94°C	45 Sek.
2. 72°C	2 Min. + 1 Min. pro 500 bp
3. 72°C	10 Min.
4. 4°C	∞

Zyklus wurde 25-mal zwischen den Schritten 2 und 1 wiederholt.
Das PCR-Produkt wurde dann unter Verwendung eines QIA-Quick PCR-Reinigungskits (Qiagen Cat No. 28104) gereinigt, bevor die DNA in einer Gesamtmenge von 50 μl Kit-Elutions-Puffer resuspendiert wurde. Ein 10 μl Aliquot wurde mit Not I- und BamH1-Restriktionsenzymen (von Life Technologies Ltd., 3 Fountain Drive, Inchinnan Business Park, Paisley, Schottland) für 2 h bei 37°C verdaut. Der Verdau wurde auf einem 0,8%igen TAE-Agarosegel gereinigt, und das 2 kb DNA-Produkt ausgeschnitten und unter Verwendung eines QIA-Quick Gel-Extraktionskit (Qiagen Cat No. 28704) extrahiert. Das schließlich verdaute reine DNA-Fragment wurde in eine Gesamtmenge von 50 μl Kit-Elutions-Puffer eluiert. Dieses PCR-Fragment wurde in den Vektor p7313PLc (7) (Powderject Vaccines Inc., siehe weitere Details unten) und in kompetente JM109-Zellen (Promega cat no: P9751) transformiert. Plasmid-DNA aus ausgewählten Klonen wurde mit Restriktionsenzymen durch Verdau mit NcoI-BamH1 und NcoI-EcoRI überprüft. Fünf korrekte Klone mit 2 kb Fragmentinsertionen wurden ausgewählt und die inserierten DNA sequenziert. Ein Klon mit einem Insert, das drei Punktmutationen enthält, wurde für weitere Verwendung ausgewählt. Die drei Punktmutationen wurden durch einen Ligationsaustausch mit homologen Kleinfragmenten anderer Klone korrigiert.
Der korrigierte Klon wurde durch Restriktionsenzym-Verdau erneut geprüft und die inserierte DNA vollständig sequenziert. Dieser Klon wurde als p6bE1c/o bezeichnet. Zum gleichen Zeitpunkt und für die vergleichende Expression und Immunisierungsstudien des Wildtyp-HPV-6b-E1-Gens, und des Wildtyp-HPV-11-E1-Gens wurden von genomischen Klonen von HPV-6b (EMBO J. 2 (12) 2314–2318 1983) und HPV-11 (Virology 151, 124–130 1986) amplifiziert, und die entsprechenden Fragmente wurden in den Not 1 – BamH1-verdauten Vektor p7313PLc kloniert. Diese Klone wurden als p6bE1w/t beziehungsweise p11E1w/t bezeichnet.
Die E1-Gene in den Klonen p6bE1c/o und p6bE1w/t wurden weiter mutiert, um Aminosäureänderungen K83G, R84G und G438D einzuschleusen. Mit den Sequenzen übereinstimmende 3'- und 5'-Oligonucleotid-Primer mit Nucleotid-Substitutionen, die entworfen worden sind, um die benötigten Mutationen einzuschleusen, wurden in PCR-Reaktionen mit anderen Kit-Reagentien durch Verfahren, die in dem QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Cat No. 200518) beschrieben sind, verwendet. Die mutierten P6bE1c/o und P6bE1w/t-Klone wurden als p6bE1c/o mut beziehungsweise p6bE1w/t mut bezeichnet.
Beispiel 3 – Herstellung der Kodon-optimierten HPV11 E2 Polynucleotidsequenz
Der Entwurf, der Zusammenbau und die Gewinnung des E2 Kodon-optimierten Gens wurde durchgeführt, wie oben für E1 beschrieben, aber die überlappenden Oligonucleotide waren 60 Nucleotide lang statt 40, mit 18 Nucleotid-Überlappen. Anders als im E1-Verfahren wurde ein Klon, der eine K111A-Aminosäuremutation enthält, zum gleichen Zeitpunkt erzeugt, wie der Kodonoptimierte E2-Genklon, durch Substituieren der zwei entsprechenden Wildtyp-Sequenz-Oligonucleotide durch zwei 60mer Oligonucleotide, die zusammen die Nucleotidsubstitution umfassen, die benötigt wird, um die K111A-Änderung zu erzeugen.
Zusammensetzung des Plasmids p7313-PLc
Das Plasmid wurde durch Austauschen des beta-Lactamase-Gens, das das Eam1105I – Pst1-Fragment von pUC19 enthält (erhältlich von Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd., Amersham Place, Little Chalfont, Bucks, HP7 9NA) durch ein EcoR1-Fragment von pUC4K (Amersham-Pharmacia) enthaltend das Kanamycin-Resistenzgen konstruiert, gefolgt vom Herstellen glatter Enden an beiden Fragmenten unter Verwendung von T4 DNA-Polymerase. Der menschliche Zytomegalie-Virus IE1 Promotor/Enhancer, Intron A, stammte aus dem Plasmid JW4303, das von Dr. Harriet Robinson, University of Massachusetts stammt, und wurde in die SalI-Schnittstelle von pUC19 als ein XhoI-SalI-Fragment inseriert, wobei das Rinderwachstumshormon Polyadenylierungs-Signal eingeschlossen wurde. Die Deletion des 5' SalI-BanI-Fragments aus dem Promotor erzeugte den minimalen Promotor, der im Vektor verwendet wird (WO 00/23592 – Powderject Vaccines Inc.). HBV-Oberflächen-Antigen 3'UTR stammte aus dem Hepatitis B Virus, Serotyp adw, in Vektor pAM6 (Moriarty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2606–2610, 1981). pAM6 (pBR322 basierender Vektor) wurde von der American Type Culture Collection, Katalog Nr. ATCC 45020, bezogen. Der 3'UTR wurde 5' des Polyadenylierungssignals als ein 1,4 kb BamHI-Fragment inseriert, für die Insertion an den Enden glatt gemacht, um die BamHI-Schnittstellen zu entfernen. In einer Abfolge von Schritten (einschließlich des Verdaus mit Bgl II, Klenow Polymerase Behandlung, Verdau mit BstX I, Verdau mit Nco I, Behandlung mit Mungbohnen-Nuclease, um überhängende Enden zu entfernen, und einen weiteren Verdau mit BstX I) wurden Modifizierungen der Region zwischen der 3' untranslatierten Enhancer-Region des HBV S-Gens und bGHpA-Signal durchgeführt, um alle offenen Leseraster zwischen dem X-Gen-Promotor und dem bGHpA-Signal zu entfernen, die größer als 5 Kodons sind. Dies führte zur Deletion der Sequenz, die den translatierbaren Teil des X-Proteins kodiert (9 Aminosäuren) sowie des X-Gen-Startkodons. Jedoch wurde die schwache Enhancer-/Promotor-Region des X-Gens bewahrt, da diese Region als die Expression des HbsAg vom CMV-Promotor verstärkend befunden wurde. Das Rinder-Wachstumshormon-Polyadenylierungs-Signal wurde durch das Kaninchen-beta-Globin Polyadenylierungs-Signal ersetzt. Die 5'nicht-kodierenden und kodierenden Sequenzen des S-Antigens wurden ausgeschnitten und durch einen Oligonucleotid-Linker ersetzt, um multiple Klonierungsstellen herzustellen, wie gezeigt wurde, um das Plasmid p7313-PL herzustellen.
Die ColE1-cer-Sequenz wurde von einem Subklon des Plasmids pDAH212 von David Hodgeson (Warwick University) bezogen und mittels PCR unter Verwendung der Primer amplifiziert, um die EcoR1-Restriktions-Schnittstellen an die Enden der Sequenz zu platzieren. Die cer-Sequenz wurde dann in die EcoR1-Sequenz von p7313-PL inseriert, um das Plasmid p7313-PLc (7) herzustellen. Die Sequenz des amplifizierten cer wurde gegen den Genbank-Eintrag M11411 geprüft.
Beispiel 4 – Expression von E1 in Säuger-293T-Zellen
Säuger-293T-Zellen wurden bis zur Log-Phase in einer finalen Konzentration von 2 × 10⁵-Zellen je 6 Well Corning Costar^TM (Corning Science Products, 10 The ValleyCentre, Gordon Road, High Wycombe, Bucks, UK) Gewebekultur-Platte über Nacht bei 37°C in 5% CO₂ gezüchtet. Die folgende Transfektionsmischung wurde hergestellt und für 25 Min. komplexiert:
2 μg Plasmid-DNA (Vektor, p6bE1c/o, p6bE1w/t) in 16 μl sterilem doppelt destilliertem Wasser
plus:

OPTI-mem^TM (Gibco BRL, Paisley, Schottland) 8 μl

Lipofektamin^TM (Gibco BRL) 6 μl.
Jede Zell-Monolayer wurde vorsichtig zweimal mit OPTI-mem^TM gewaschen. 800 μl OPTI-mem^TM wurden zu jedem Well hinzugegeben. 200 μl OPTI-mem^TM wurden zu jedem Transfektionsmix hinzugegeben, gemischt und vorsichtig zu der Zell-Monolayer hinzugegeben. Die Platte wurde für 5 h bei 37°C in 5% CO² inkubiert, worauf der Transfektionsmix und das OPTI-mem^TM verworfen wurden. Die Zell-Monolayer wurde vorsichtig mit Zell-Wachstums-Medium zweimal gewaschen und schließlich wurden transfizierte Zellen für 24 h in Dulbecco's Modified Eagle Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum und 29,2 mg/ml L-Glutamin, bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden in Mikroröhrchen abgeschabt, zweimal mit PBS gewaschen, heruntergeschleudert und das Zell-Pellet wurde in SDS-Page-Laemmli-Farbstoff resuspendiert. Die Zell-Pellets wurden gekocht und auf ein 10%iges SDS Page-Gel geladen und electrophoretisch in 1 × Tris Glycin SDS-Puffer aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel auf Nitrozellulose-Membran (Amersham) geblottet und ein Western-Blot durchgeführt. Die Nitrozellulose-Membran wurde mit 5% Marvel^TM (Premier Beverages, Knighton, Adbaston, Stafford, UK) in PBS für 30 Min. bei Raumtemperatur blockiert und zweimal mit PBS und 0,1% Tween 20 gewaschen. Ein polyklonaler Antikörper, der gegen die C-Terminal-Proteinsequenz von HPV6bE1 erzeugt wurde (Proteinsequenz: CSSSLDIQDSEDEEDGSNSQAFR) in Kaninchen wurde in 5% Marvel^TM in PBS verdünnt und zu der Nitrozellulose-Membran hinzugegeben. Dieses wurde bei Raumtemperatur für 1 h unter leichtem Bewegen inkubiert. Der verdünnte Antikörper wurde entfernt, und die Membran wurde dreimal mit PBS und 0,1% Tween 20 gewaschen. Ein zweites Konjugat, Schwein-Anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase (HRP) (DAKO) wurde 1:20000 in PBS verdünnt und 0,1% Tween 20. Dies wurde zu der gewaschenen Membran hinzugegeben und unter leichtem Bewegen bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert. Die Membran wurde dann gut mit PBS und 0,1% Tween 20 gewaschen. Ein Chemilumineszenz HRP-Kit (Amersham) wurde verwendet, um die transfizierten Proteine auf der Membran nachzuweisen.
Ergebnisse:
Die vorhergesagte Größe des translatierten Proteins für E1 beträgt 68 kDa–72 kDa. Die Ergebnisse (8) zeigen die korrekte Proteingröße, die durch p7313-PLc exprimiert wird, welches das Kodon-optimierte HPV6bE1 enthält (Spur 4). Der Vektor, der Wildtyp-E1 enthält, ist in Spur 3 zu sehen, welche zeigt, dass es keine nachweisbare Expression von R1 in menschlichen Zellen hinsichtlich der Wildtyp-Nucleotidsequenz gab. Gleichermaßen wird kein E1 in Spur 2 nachgewiesen (leerer Vektor) oder in Spur 1 (nicht-trans fizierte Zellen). Die ungefähr 60 kD Bande in den Spuren 1–4 ist ein nicht identifiziertes zelluläres Protein, das mit dem Anti-E1-Antikörper kreuzreagiert. Die Bande hat eine ungefähr konstante Intensität über die Banden, was zeigt, dass die Beladung der Proben konsistent war.
Beispiel 5 – Herstellung eines rekombinanten Vaccinia-Virus, das HPV E1- und HPV E2-Protein exprimiert.
Das Vaccinia-Virus, das HPV-6b E1-Protein exprimiert, wurde bei Glaxo Wellcome, Stevenage, UK, erzeugt. Das Vaccinia-Virus, das HPV-11 E1 und HPV-11 E2 exprimiert, war freundlicherweise ein Geschenk von Jeff Engler, University of Alabama in Birmingham, U.S.
Kurzgefasst wurde das E1-Gen von p6bE1w/t in Vaccinia-Virus-Vektor pTM3 kloniert, und dann mit einem Restriktionsenzym-Verdau überprüft und der DNA-sequenzierte rekombinante Vektor wurde verwendet, um HTk^–Zellen zu transfizieren. Rekombinantes Vaccinia-Virus wurde isoliert und Plaque-gereinigt. E1-Protein-Expression wurde durch Western-Blotting und Verwendung von Peptid-Antiseren nach der Infektion permissiver Zellen mit sowohl dem rekombinanten Virus, das HPV-6b E1 exprimiert, und einem zweiten Vaccinia-Virus (vTF7-3), das die Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase exprimiert, überprüft. Die Ko-Infektion von Zellen mit Vaccinia-Virus vFT7-3 ist ebenfalls notwendig, um die Expression von E1- und E2-Protein von den HPV-11 E1 und E2-rekombinanten Vaccinia-Viren zu dirigieren. Der Vaccinia-Virus-Stamm WR wurde für Negativ-Kontroll-Experimente verwendet. Der Vektor pTM3 und Virus vTF7-3 stammen aus den National Institutes of Health, Maryland, U.S.A.
Beispiel 6 – Immunologie – Nachweis der zellulären Reaktionen gegen HPV-Antigene
Alle Reagentien wurden von Gibco BRL, Paisley, Schottland, oder Sigma, Poole, Dorset bezogen, solange nichts anderes angegeben ist.
A. Immunisierungsprotokoll.
Weibliche C57BL/6-Mäuse wurden mit 1,0–2,0 μg DNA immunisiert (entweder p6bE1c/o, p6bE1w/t, p6bE1c/o mut, p6bE1w/t mut oder dem leeren Plasmid p7313PLc) durch PMDD und mit einer identischen Dosis 14 Tage später geboostet. Die Tiere wurden durch Abtrennung des Kopfes getötet, und die Milzen wurden zur Untersuchung der zellulären Reaktionen gegen HPV-Antigene entfernt.
B. Herstellung von Einzelzell-Suspensionen von Splenozyten.
Die Milzen wurden zwischen gemahlenen Gläsern (BDH) zermahlen, die roten Blutkörperchen lysiert (155 mmol NH₄Cl, 10 mmol KHCO₃, 0,1 mmol EDTA) und die Zellen in komplettem RPMI resuspendiert (RPMI-1640 Medium supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 2 mmol Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 5 × 10^–5 mol 2-Mercaptoethanol).
C. Infektion von MC57 Zielzellen.
Immundominante Epitope, die aus HPV-Antigenen stammen, bleiben undefiniert, und daher beruht der Nachweis der Antigen-spezifischen Reaktion in vitro auf der natürlichen Prozessierung des Gesamt-Antigens, das innerhalb der Zielzellen erzeugt wird, die mit cDNA transfiziert worden sind, die die Gesamtproteine kultivieren. MC57-Zellen (K^b positiv) wurden mit rekombinantem Vaccinia-Virus infiziert, das HPV-6b E1 exprimiert, HPV-11 E2 oder HPV-11 E1, unter Verwendung einer „Multiplicity of infection" von 5 für 1 h bei 37°C. Überschüssiges Virus wurde abgewaschen und die Zellen wurden in komplettem RPMI, enthaltend 50 ng/ml rekombinantes menschliches IL-2 (Glaxo Wellcome, Genf) resuspendiert.
D. ELISPOT.
ELISPOT-Platten (96 Well, Millipore MAIP S 45 l 0) wurden mit Ratte-Anti-Maus IFN gamma (Pharmingen 18181D) zu 15 μg/ml in PBS über Nacht (4°C) vor der Zugabe von 4 × 10e5 Splenozyten beschichtet, die aus den experimentellen Gruppen gewonnen wurden. Das Antigen wurde durch die Zugabe von 1 × 10e4 rekombinanten Vaccinia-infizierten MC57-Zellen präsentiert. Wildtyp-Vaccinia-Stamm WR wurde als Negativkontrolle verwendet. Der Assay wurde über Nacht bei 37°C inkubiert (5% CO₂).
Am Tag 2 des Assays wurden die Spot-bildenden Zellen unter Verwendung von biotinyliertem Ratte Anti-Maus IFN gamma (Pharmigen 18112D) zu 1 μg/ml, gefolgt von einem Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat (TCS biologicals SA 1008) in einer 1/1000-Verdünnung in PBS nachgewiesen. Dies wurde unter Verwendung eines alkalische Phosphatase-Substrat-Kits (Biorad 170-6432) dargestellt und durch die Imageanalyse quantifiziert. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt.
Wie aus 9 gesehen werden kann, wurde eine starke zelluläre Reaktion in allen drei Mäusen gesezen, die mit dem Plasmid geimpft wurden, das HPV-6b Kodon-optimierte E1-Sequenz kodiert, wenn sie mit E1 gefordert wurden, das in dem Vaccinia-Vektor (vacc.E1(11) oder vacc.E1(6b)) enthalten ist. Es wurde keine Reaktion gesehen, wenn diese Mäuse mit Wildtyp-Vaccinia (vacc.WT) oder mit Vaccinia gefordert wurden, das HPV-11 E2 (vacc.E2(11)) exprimiert. Im Gegensatz dazu führt die Impfung von Mäusen mit Plasmid, das die Wildtyp-E1-Sequenz kodiert, nicht zu einer T-Zell-Reaktion. Die Splenozyten dieser Mäuse reagieren nicht auf eine Forderung durch Vaccinia, das das E1-Gen trägt, noch auf irgendeine andere Forderung (Daten nicht gezeigt). Die Mutation des E1-Gens ändert die zelluläre Reaktion in Mäusen nicht. Da Mäuse auch mit p6bE1 c/o und p6bE1c/o mut eine stärkere zelluläre Immunreaktion gegen T-Zellen hervorriefen, die mit einem Vaccinia-Virus infiziert waren, welches das E1-Protein von HPV-11 exprimiert, können wir vermuten, dass es ein hohes Niveau immunologischer Kreuzreaktivität zwischen HPV-6b E1 und HPV-11 E1 gibt. Mäuse, die mit leerem p7313-PLc-Vektor geimpft wurden, zeigten keine Reaktion auf irgendeine Forderung.
Beispiel 7 – Expression von HPB 6b E2 in Säuger-293T-Zellen
293T-Zell-Monolayer (80% konfluent) in 24 Well-Platten wurden mit 1 μg jedes Plasmid (p6bw/t, p6bc/o, p6b/w mut, p6bc/o mut) unter Verwendung von 2,5 μl Lipofectamin 2000 (Life Technologies) je Transfektion nach dem Standardprotokoll (siehe Beispiel 4 oben) transfiziert. 24 h nach der Transfektion der Zellen wurden diese geerntet, in Phosphat-gepufferter Salzlösung gespült und durch SDS-PAGE und Western-Blot unter Verwendung eines Anti-E2-Peptid-Antiserums (#1100) untersucht, das gegen die HPV-6b N-terminale Aminosäuresequenz MEAIAKRLDACQEQLLELYEEC (10) erzeugt wurde.
Ergebnisse
Die Ergebnisse zeigen eine überragende Proteinbande der erwarteten Größe (40 kd–45 kD) in Spur 3 (Kodon-optimiertes E2) und in Spur 5 (Kodon-optimiertes und mutiertes E2). Eine geringere Bande der gleichen Größe scheint auch in Spur 4, was ein sehr geringes Expressions-Niveau des mutierten Wildtyp-E2-Plasmids anzeigt, aber nicht in Spur 1 (Negativkontrolle) oder in Spur 2 (Wildtyp-E2-Protein). Eine kreuzreagierende Proteinbande von ~25 kd tritt in allen Spuren auf, was auf gleiche Beladung der Proteinlysate hinweist. Die Mutation von E2 scheint die E2-Protein-Expression nicht zu beeinflussen, welche durch die Kodon-Optimierung signifikant verbessert wird.

Claims

Polynucleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz eines menschlichen Papillomavirus eines HPV-"Early"-Antigens oder eines Fragments davon codiert, wobei das Polynucleotid in der Lage ist, eine Immunantwort auszulösen, wenn es in vivo verabreicht wird, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Polynucleotid einen Codon-Verwendungskoeffizienten von mehr als 0,5, aber weniger als 1,0, eines stark exprimierten menschlichen Gens hat.
Polynucleotidsequenz gemäß Anspruch 1, welche eine DNA-Sequenz ist.
Polynucleotidsequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, welche ein HPV-Polypeptid oder ein HPV-Typ oder -Subtyp codiert, der mit Gebärmutterhalskrebs, benignen Hautwarzen oder Genitalwarzen assoziiert ist.
Polynucleotidsequenz gemäß Anspruch 3, welche ein HPV-Polypeptid eines der Typen 1–4, 6, 7, 10, 11, 16, 18, 26–29, 31, 33, 35, 39, 49, 51, 52, 56, 58, 59 und 68 codiert.
Polynucleotidsequenz gemäß Anspruch 4, welche ein HPV-Polypeptid codiert, oder einen HPV-Typ oder -Subtyp, der mit Gebärmutterhalskrebs oder Genitalwarzen assoziiert ist.
Polynucleotidsequenz gemäß Anspruch 5, welche ein HPV-Polypeptid eines der Typen 6, 11, 16, 18, 33 oder 45 codiert, oder eine Fusion aus zwei oder mehr Polypeptiden, von einem oder mehreren HPV-Virustypen 6, 11, 16, 18, 33 oder 45.
Polynucleotidsequenz gemäß Anspruch 5, welche ein HPV-Polypeptid eines HPV-Typs oder eines Subtyps codiert, der ausgewählt ist aus HPV 11, 6a oder 6b.
Polynucleotidsequenz gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, welche ein mutiertes HPV E1-Polypeptid mit den folgenden Mutationen K83G, R84G und G483D codiert.
Polynucleotidsequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, welche ein mutiertes HPV E2-Polypeptid codiert, das eine KIIIA-Mutation umfasst.
Polynucleotidsequenz gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das codierte HPV-Polypeptid das Ganze oder einen Teil eines HPV-"early"-Genprodukts umfasst.
Polynucleotidsequenz gemäß Anspruch 9, wobei das codierte HPV-Polypeptid das Gesamte oder einen Teil von E1 oder E2 umfasst, oder eine Fusion aus dem Gesamten oder einem Teil von E1 oder E2 mit einem anderen HPV-Polypeptid.
Polynucleotidsequenz gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch mit einem Codon-Verwendungskoeffizienten für E. coli-Gene von mehr als 0,6.
Polynucleotidsequenz wie in (SEQ ID NO: 10, 5) dargestellt, oder ein Fragment oder ein Analogon davon, welches die Codon-Verwendung davon bewahrt.
Polynucleotidsequenz wie in (SEQ ID NO: 11, 6) dargestellt, oder ein Fragment oder ein Analogon davon, welches die Codon-Verwendung davon bewahrt.
Expressionsvektor, umfassend eine Polynucleotidsequenz gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch, operativ an eine Kontrollsequenz gebunden, welche in der Lage ist, die Expression der Polynucleotidsequenz durch eine Wirtszelle zu bewirken.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 15, welche in der Lage ist, die Expression der Polynucleotidsequenz in bakteriellen, Insekten- oder Säugerzellen zu bewirken.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 15 oder Anspruch 16, worin der Vektorhintergrund p7313PLc ist, wie in 7 gezeigt.
Wirtszelle, umfassend eine Polynucleotidsequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14.
Wirtszelle, umfassend einen Expressionsvektor gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17.
Wirtszelle gemäß Anspruch 18 oder Anspruch 19, welche eine bakterielle, Säuger- oder Insektenzelle ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Polynucleotidsequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Vektor gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 21 oder Anspruch 22, umfassend eine Vielzahl an Partikeln, bevorzugt Goldpartikel, die mit DNA beschichtet sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 22, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten und den DNA-Vektor.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 21 bis 24, weiter umfassend ein Adjuvans.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 25, wobei das Adjuvans als eine Fusion mit dem HPV-Polypeptid, das durch das Polynucleotid codiert wird, codiert ist.
Verwendung eines Polynucleotids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe einer HPV-Infektion.
Verwendung eines Vektors gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe einer HPV-Infektion.
Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 27 und 28, wobei die HPV-Infektion eine Infektion von einem oder mehreren der HPV-Typen 6, 11, 16 oder 18 ist.
Verwendung eines Polynucleotids gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, eines Vektors gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe kutaner (Haut-) Warzen, Genitalwarzen, atypischer schuppenartiger Zellen von unbestimmter Bedeutung (ASCUS), Gebärmutterhalsdysplasie, intraepitheliale Gebärmutterhalsneoplasie (CIN) oder Gebärmutterhalskrebs.