CN1262665C - 经过密码子最优化的乳头状瘤病毒序列 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在治疗和预防人类乳头状瘤病毒感染以及与其相关的症状和疾病中有用的方法和组合物。具体地，本发明涉及编码人乳头状瘤病毒(HPV)氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列中的密码子使用模式与高表达的哺乳动物基因的密码子使用模式相似。
Description
本发明涉及在治疗和预防人类乳头状瘤病毒感染以及与其相关的症状和疾病中有用的方法和组合物。
已发现在多种物种，包括绵羊，狗，兔子，猴子，牛和人中有乳头瘤病毒的感染。人乳头瘤病毒(HPV)已分出超过80个型别(Epideminlogy andBiology of Cervical Cancer.Seminars in Surgical Oncology 1999 16：203-211)。如果L1基因与以前鉴定的型别的L1序列的同一性低于90％，那么这种型别可确定为新的型别，如果L1序列同一性是在90到98％之间则为亚型，同一性在98％以上为变体(与原型(亲代类型)相比)。乳头瘤病毒通常感染上皮细胞，但不同型别的HPV引起不同的疾病。例如，1-4，7，10和26-29型的乳头瘤病毒引起良性皮下疣，16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型的乳头瘤病毒与宫颈癌有关，6和11型的乳头瘤病毒与尖锐湿疣(生殖道的非恶性湿疣)有关。
大部分尖锐湿疣(＞90％)包含HPV基因型6和11。然而，HPV-6是在单纯感染中鉴定出来的最常见的基因型，HPV-6和HPV-11偶尔发生在同一损伤中。疣通常发生在受感染个体的多个部位，并且60％以上的配偶有尖锐湿疣的患者发生损伤，潜伏期平均为3个月。目前对其有多种方法进行治疗。然而，它们依赖切除或脱落和/或局部应用凝胶制剂和膏剂。它们引起疼痛，可能需要频繁就医，但效力有很大不同。疾病的复发仍是有效控制该种疾病所面临的显著问题。
尖锐湿疣可自然退化，退化的主要原因可能是细胞介导的免疫。自然退化高发生率提示宿主的细胞免疫可解决该种临床疾病，从而使免疫治疗成为治疗或预防尖锐湿疣的一种选择。控制该种疾病的目标是特异性针对病毒的治疗，所述治疗是无痛的，仅需要极少次的诊治，具有很高的疾病治愈率和可降低疾病的复发/使疾病极少复发。
已证明HPV在组织培养中很难生长，所以没有传统的活的或减毒的病毒疫苗。由于缺乏适当的在其中研究人病毒的动物模型，所以HPV疫苗的开发滞后。因为所述病毒是高度种属特异性的，所以不可能用人乳头瘤病毒感染具有免疫力的动物，而这正是疫苗第一次在人体内试用之前进行安全检测所必需的。
乳头瘤病毒具有编码“早期”和“晚期”基因(称为E1到E7，L1和L2)的DNA基因组。所述早期基因序列已显示具有如下功能：与病毒DNA复制和转录有关，与逃避宿主的免疫有关，与正常宿主细胞周期的改变有关以及与其它过程有关。例如E1蛋白是一种ATP依赖的DNA解旋酶，参与病毒DNA复制过程的起始，E2是一种调控蛋白，控制病毒基因的表达和DNA的复制。E2通过其既结合E1又结合病毒复制起点的作用，使E1在所述起点局部聚集，从而，刺激病毒DNA的复制起始。E4蛋白具有多种没确定的功能，但结合宿主细胞骨架属于上述功能，E5延迟内体的酸化，导致细胞表面的EGF受体表达增加，已知E6和E7各自都能结合细胞蛋白p53和pRB。E6和E7蛋白形成与宫颈癌有关的HPV型别，是已知的致癌基因。L1和L2编码两种病毒结构(衣壳)蛋白。
疫苗在历史上一直被视为预防病原体感染的一种方式，如果发生感染，疫苗可激发免疫系统，以识别并中和病原体。疫苗包含一种或多种来自病原体的抗原通常是已灭活的或减毒的完整生物体，或者是来自所述生物体的特定抗原肽。当将免疫系统暴露于抗原时，产生使个体终生保持对所述抗原免疫“记忆”的细胞。再次接触相同抗原(例如感染所述病原体时)刺激特异性免疫应答，从而清除感染的病原体或使感染的病原体失活。
有两种武器进行免疫应答，即体液(抗体)应答和细胞介导的应答。衍生自细胞内复制的病原体(病毒和某些细菌)的蛋白抗原在受感染的宿主细胞内加工，释放短肽，然后这些短肽与I类主要组织相容性分子(MHC-I)结合并展示在受感染的细胞表面。当该MHC I肽结合复合物与抗原特异性CD8+T细胞相遇时，所述T细胞被活化，获得细胞毒活性。这些细胞毒性T细胞(CTLs)能裂解已被感染的宿主细胞，从而限制感染病原体的复制和传播。免疫应答的另一重要武器受控于CD4+T细胞。衍生自病原体的抗原释放到细胞外环境，然后被专职抗原呈递细胞(APCs)摄取，和MHC II类分子结合并共同展示在这些细胞表面。对该复合物中抗原的识别刺激CD4+T细胞分泌可溶性因子(细胞因子)，它们调节其它T细胞的效应机制。B细胞产生抗体。抗原与分泌型抗体的结合可中和病原体的感染性。抗原与B细胞表面膜结合型抗体的结合可刺激B细胞的分裂，从而扩大B细胞的应答。通常，对控制病原体的感染而言，抗体和细胞介导的免疫应答(CD8+和CD4+)都是需要的。
据信，甚至在发生病原体感染之后，利用免疫系统灭活或清除病原体从而控制和消除感染都是可能的。尽管体液和细胞介导的免疫应答都能被激发，但这种免疫治疗(也可以称为“治疗性”疫苗或免疫治疗物)更需要细胞免疫应答来发挥作用。
已发现(Benvenisty，N and Reshaf，L PNAS 83 9551-9555)用硫酸钙沉淀的DNA接种小鼠可引起由该DNA编码的肽的表达。随后，观察小鼠肌肉内注射未经沉淀的质粒DNA，发现所述DNA被摄入到所述肌肉细胞中，并表达所编码的蛋白。因为DNA的表达导致宿主细胞中所编码的病原体蛋白的产生(如天然感染的状况)，这种机制可以刺激免疫治疗或治疗性免疫接种所需的细胞介导的免疫应答，因此基于DNA的药物可用作预防性疫苗或免疫治疗。对DNA疫苗的描述参考WO90/11092(Vicai，Inc.)。
DNA疫苗除了肌肉内注射外，可用多种机制传输。例如可传输到皮肤内，该种传输利用了在这些作为感染屏障的皮肤和粘膜等组织中免疫机制高度活化的优势。皮肤内传输可通过注射，使用喷射式注射器(在压力下强迫液体进入皮肤，或下面的组织包括肌肉)或利用粒子轰击(particlebombardment)，其中将DNA以足够的密度包被到粒子上以便穿过上皮(美国专利5371015)。例如，将核苷酸序列掺入质粒中，所述质粒被包被到金粒上，然后将该金粒在高压下给药到表皮，如Haynes等所述J.Biotechnology44：37-42(1996)。将这些粒子发射到皮肤中，导致表皮细胞和表皮朗罕氏细胞的直接转染。朗罕氏细胞是抗原呈递细胞(APC)，其摄取DNA，表达所编码的肽并进行加工，展示在细胞表面MHC蛋白上。被转染的朗罕氏细胞迁移到淋巴结，在那儿它们将所展示的抗原片段呈递给淋巴细胞，引发免疫应答。通过粒子介导的皮肤内传输仅需要极少量的DNA(少于1μg，通常少于0.5μg)便能诱导免疫应答，这与直接肌肉注射后产生免疫应答所需的毫克量的DNA形成对比。
在转染后的哺乳动物细胞，如HeLa，293，或CHO细胞中表达和检测HPV蛋白已证明通常是困难的，为进行那些需要能检测蛋白表达的生物化学和免疫学研究，或为对纯蛋白进行定量，通常使用大肠杆菌，杆状病毒或酵母蛋白表达系统。在这些系统中，蛋白产量足够进行功能性分析和纯化，以及随后的生物化学和免疫学研究。然而，直接的蛋白检测法(例如Western印迹)通常不能检测感染的哺乳动物细胞中E1蛋白的表达，甚至在使用具有强启动子如CMV或SV40的载体时也不能如此。对方法进行设计以增加哺乳动物细胞中E1蛋白的表达，所述方法包括克隆E1基因的5’侧翼序列(Remm et al.J.Virol 199973，3062-3070)和在转染后扩增转染的E1质粒载体(Zou et al.J.Virol 199872，3436-3441)。通过转染后的复制来扩增输入的载体质粒具有增加细胞中E1基因拷贝数的最终作用，如此可提高蛋白水平，从而便于蛋白的检测(通过Western印迹)。因为E1蛋白在哺乳动物细胞中的表达和检测是难以解决的，所以有作者已经求助于用兔网织红细胞系统(Promega)，用35S标记的蛋氨酸，通过体外的转录-翻译检测所述蛋白的表达(Gopalakrishnan et al.Virology 1999 256，330-339.，Safari et al.Virology1995 211，385-396)。然而，这是一种无细胞系统，其需要应用修饰的启动子，所述启动子包含来自噬菌体T7的结合RNA聚合酶的序列。
E1蛋白的表达还可通过检测体外质粒DNA的复制而间接检测，所述质粒包含HPV的DNA复制起点。可将包含该复制起点的质粒作为E1(和E2)蛋白表达的替代物来检测(Gopalakrishnan et al.，Virolugy 1999 256，330-339.，Lu et al.J.Virol 1993 67，7131-7139 and Del Vecchio et al J.Virol1992 66，5949-5958)。HPV起点的复制既需要E1又需要E2，用包含编码E1和E2基因的质粒对哺乳动物细胞进行转染，再加入携带HPV的DNA复制起点的第三种质粒，如果E1蛋白(和E2蛋白)表达成功(即使不能被标准蛋白检测法(Western印迹)检测出来)，将仅仅能使携带起点的质粒复制。
DNA代码有4种(A，T，C和G)，用它们可拼出三个字母的“密码子”，这些密码子代表生物体的基因所编码的蛋白的氨基酸。沿DNA分子线性排列的密码子被翻译成所述基因所编码的蛋白质中氨基酸的线性序列。密码子有高度的简并性，61种密码子编码20种天然氨基酸，3种密码子代表“终止”信号。因此，大部分氨基酸由一种以上的密码子编码-实际上数种氨基酸由4种或更多种不同的密码子编码。
当有一种以上的密码子编码一种特定的氨基酸时，已发现生物体密码子的使用模式是极不随机的。不同物种在密码子的选择方面显示不同的偏好，且密码子的使用在单一物种的高水平表达和低水平表达的基因之间也有显著的不同。这种偏好在病毒，植物，细菌和哺乳动物细胞中是不同的，一些物种比其它物种有更强的偏好。例如，人和其它哺乳动物不如某些细菌或病毒偏好强。基于这些原因，在大肠杆菌中表达的哺乳动物基因或在哺乳动物细胞中表达的病毒基因具有对于有效的表达来说不适当的密码子分布。然而，具有适合大肠杆菌表达的密码子使用模式的基因也可在人体中有效表达。可以相信，如果异源DNA序列中存在即将在其中进行表达的宿主中罕见的密码子簇，那么所述异源基因在所述宿主中的低水平异源表达是可预料的。
已发现数例以下情况：将宿主中罕见的密码子更改为宿主优选的密码子(“密码子最优化”)提高了异源表达水平，例如，已有人针对哺乳动物密码子使用模式而将BPV(牛乳头瘤病毒)晚期基因L1和L2的密码子最优化，结果显示出，在哺乳动物细胞(Cos-1)培养中，表达水平超过了野生型HPV序列(Zhou et al.J.Virol 1999.73，4972-4982)。在该项工作中，每种在BPV中比在哺乳动物中出现频率高两倍(使用比例＞2)的BPV密码子，以及使用比例大于1.5的大部分密码子被保守替代为优先使用的哺乳动物密码子。在WO97/31115，WO97/48370和WO98/34640(Merck&Co.，Inc.)中，将已经过密码子最优化的序列在作为最优化依据的宿主哺乳动物中用作DNA疫苗时，HIV基因或其片段的密码子最优化使蛋白表达增加，并且提高了免疫原性。在该项工作中，所述序列完全由最优化的密码子组成(除了会因此引入不期望的限制性位点，内含子剪切位点等的部位)，因为针对所选宿主的优化的密码子保守取代了每种病毒密码子。
依照第一方面，本发明提供了一种多核苷酸序列，该序列编码HPV氨基酸序列，其中多核苷酸序列的密码子使用模式与高表达的哺乳动物基因的密码子使用模式相似。优选，所述多核苷酸序列是DNA序列。期望所述多核苷酸序列的密码子使用模式与高表达的人基因的密码子使用模式相似。理想的是，所述多核苷酸序列的密码子使用模式与高表达的大肠杆菌基因的密码子使用模式也相似。所述多核苷酸序列可以是DNA序列，例如双链DNA序列。优选所述多核苷酸序列编码与宫颈癌，良性皮疣或尖锐湿疣有关的HPV型或亚型的HPV多肽，所述型别例如1-4，6，7，10，11，16，18，26-29，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68，优选的型别有6，11，16，18，33或45，它们具体与宫颈癌和尖锐湿疣有关，最优选HPV11，6a或6b。
因此，本发明提供了一种合成基因，该基因包含一组密码子，它们在一起可编码HPV氨基酸序列，其中通过选择使可能用于编码所述氨基酸序列的密码子类似哺乳动物的优化密码子，以使在合成基因中密码子的使用频率极类似于高表达的哺乳动物基因，而不是乳头瘤病毒基因。优选，所述密码子使用模式实际上与高表达的人类基因相同。
在某些实施例中，所编码的氨基酸序列是野生型HPV氨基酸序列。在另外的实施方案中，所编码的氨基酸序列是突变的HPV氨基酸序列，包含具有氨基酸改变的野生型序列，例如所述氨基酸改变是足以使所述多肽的一种或多种天然生物功能减低或失活的点突变。突变的氨基酸序列优选保持野生型多肽的免疫原性。
所编码的HPV多肽可包含早期基因产物，如E1，E2或E7，或其片段，类似物或融合体，或可以是晚期基因产物如L1或L2，或其片段，类似物或融合体。本发明的多肽可以，例如编码如下融合体：两种或多种HPV早期基因产物之间，HPV早期基因产物和HPV晚期基因产物之间，或两种或多种晚期基因产物之间，或HPV基因产物的一种或多种片段之间，或HPV基因产物(或其片段)和衍生自除HPV外的其它来源(例如佐剂或靶向肽，或多肽，如HBV核心肽)的多肽之间的融合体。所述融合体可以是衍生自同一或不同病毒型别或亚型的HPV基因产物之间的融合体。这种融合体将优选保留被融合的肽成分的免疫原性。优选，所编码的HPV多肽包含早期基因产物的全部或一部分，最优选E1或E2。在一具体的实施方案中，所述多核苷酸序列编码如图1所示的HPV 6b野生型E1多肽，或其片段或类似物。在另外的实施方案中，多核苷酸序列编码以下一种或多种物质：图2所示的突变的HPV6b E1的氨基酸序列；图3所示的HPV11或6a或6b的野生型E2氨基酸序列；图4b所示的突变的HPV6b E2氨基酸序列；图4a所示的突变的HPV11 E2序列，或其片段，类似物或融合体，其中所编码的多肽保留免疫原性。
依照本发明，多核苷酸的密码子使用模式优选排除靶生物体的高表达基因中RSCU值小于0.2的密码子。相对同义密码子应用(RSCU，relatvesynonymous codon usage)值是观察到的密码子数除以所期望的数(如果该氨基酸的所有密码子的使用频率相同)。本发明的多核苷酸对高表达的人基因来说将通常有一个大于0.3的密码子使用系数(如下定义)，优选大于0.4，最优选大于0.5但小于1。期望所述多肽对高表达的大肠杆菌基因来说也有一个大于0.5的密码子使用系数，优选大于0.6，最优选大于0.7。
在一个实施方案中，本发明提供了如图5所示的多核苷酸序列(SEQ IDNO：10)或图6所示的多核苷酸序列(SEQ ID NO：11)，或保持了它们的密码子使用模式的其片段或类似物。在另一实施方案中，本发明提供了互补于图5或图6所示的序列的多核苷酸序列。
本发明的第二方面提供了表达载体，其包含本发明第一方面的多核苷酸序列并能够指导该多核苷酸序列的表达，该多核苷酸序列编码HPV氨基酸序列，其中所述多核苷酸序列的密码子使用模式类似于高表达的哺乳动物基因，优选高表达的人基因。所述载体适合驱动异源DNA在细菌，昆虫或哺乳动物细胞中表达，特别是在人细胞中表达。在一个实施方案中，所述表达载体是p7313PLc(图7)。
本发明的第三方面提供了一种宿主细胞，该细胞包含本发明第一方面的多核苷酸序列，或第二方面的表达载体。所述宿主细胞可以是细菌细胞，例如大肠杆菌，可以是哺乳动物细胞，例如人，或者可以是昆虫细胞。包含本发明载体的哺乳动物细胞可以是体外转染的培养细胞，或者可以是通过将载体给予哺乳动物而体内转化的细胞。
本发明第四方面提供了一种药用组合物，其包含本发明第一方面的多核苷酸序列。优选所述组合物包含本发明第二方面的DNA载体。在优选实施方案中，所述组合物包含一组粒子，优选金粒子，它们用包含编码多核苷酸序列的载体的DNA包被，所述多核苷酸序列编码HPV氨基酸序列，其中，多核苷酸序列的密码子使用模式类似于高表达的哺乳动物基因，特别是人基因。在另外的实施方案中，所述组合物包含可药用的赋形剂和本发明第二方面的DNA载体。所述组合物也可以包含佐剂。
本发明另一方面提供了制备上述药用组合物的方法，其包括如下步骤：改变野生型HPV核苷酸序列的密码子使用模式，或人工合成一种多核苷酸序列，以产生具有如下特征的序列：该序列的密码子使用模式类似于高表达的哺乳动物基因，并且该序列编码野生型HPV氨基酸序列或突变的HPV氨基酸序列(其包含具有改变的氨基酸的野生型氨基酸序列，所述改变足以灭活所述多肽的一种或多种天然功能)。
本发明还提供了本发明第一方面的多核苷酸，或本发明第二方面的载或尖锐湿疣有关的HPV型或亚型(例如1-4，6，7，10，11，16，18，26-29，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型)所致，在某些实施方案中，本发明提供了本发明第一方面的多核苷酸，或本发明第二方面的载体在治疗或预防6，11，16，18，33或45型HPV感染中的用途，这些型的HPV具体与宫颈癌和尖锐湿疣有关，最优选HPV11，6a或6b。本发明还提供了本发明第一方面的多核苷酸，本发明第二方面的载体或本发明第四方面的药用组合物的用途，所述用途是治疗或预防皮疣，尖锐湿疣，意义未确定的非典型性鳞状细胞(ASCUS)，宫颈发育异常，颈上皮内瘤形成(CIN)或宫颈癌。因此，本发明还提供了本发明第一方面的多核苷酸，或本发明第二方面的载体的用途，所述用途是制备治疗或预防如下任一种或多种型别的HPV感染或与所述型别有关的任何症状或疾病的药物，所述HPV型别为1-4，6，7，10，11，16，18，26-29，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型。
本发明还提供了治疗或预防HPV感染，具体是由如下任一种或多种HPV型所导致的感染，或与所述型有关的任何症状或疾病的方法，所述HPV型为1-4，6，7，10，11，16，18，26-29，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型，该方法包含给药有效量的本发明第一方面的多核苷酸，本发明第二方面的载体或本发明第四方面的药用组合物。所述药用组合物可以以一剂或多剂的方式给药，例如，以“初次免疫-加强免疫(prime-boost)”的治疗性接种方案给药。在某些情况下，“初次免疫”的接种可以通过本发明多核苷酸的粒子介导型DNA传输实现，优选本发明的多核苷酸掺入了质粒衍生的载体，所述“加强免疫”通过给药包含相同多核苷酸序列的重组病毒载体进行。
在本发明的说明书和权利要求中，术语“包含”和“包括”都解释为包含在内。即这些词意指可能包含上下文允许但没有具体描述的其它成分或整体。
术语“类似物”是指一种多核苷酸，它与本发明的另一多核苷酸编码相同的氨基酸序列，但由于遗传密码子的丰余性而具有不同的核苷酸序列，但密码子使用模式可保持相同，例如具有相同的密码子使用系数或密码子使用系数为所述另一多核苷酸的0.1之内，优选在0.05之内。
术语“密码子使用模式”是指所述核苷酸序列，一个或一类基因(例如高表达的哺乳动物基因)中所有密码子的平均频率。可在文献中找到哺乳动物包括人的密码子使用模式(参见例如Nakamura et al.Nucleic Acids Research1996，24：214-215)。
在本发明的多核苷酸中，人乳头瘤病毒典型的密码子使用模式被改变为更接近于靶生物体的偏好，所述生物体例如大肠杆菌或哺乳动物，尤其是人。“密码子使用系数”是衡量给定多核苷酸序列与目标物种的多核苷酸序列的相似程度的一个指标。密码子的频率可参考有关多种物种的高表达基因的文献(参见例如Nakamura et.al.Nucleic Acids Research 1996，24：214-215)。将61种密码子中每种密码子的频率(表示为在所选的一类基因中每1000个密码子中的出现次数)针对20种天然氨基酸中每种氨基酸进行校对，以便针对每种氨基酸来说，将最常用的密码子的值设定到1，将不太常用的密码子的频率设定在0和1之间。这样，靶物种的高表达基因的61种密码子中每种密码子都设定了一个值，该值是1或低于1。为计算特定多核苷酸相对于该物种的高表达基因的密码子使用系数，记录该特定多核苷酸的每种密码子的设定值，然后计算所有这些值的几何平均值(是将这些值的自然对数的总和除以密码子总数，然后取反对数)。所述系数介于0到1之间，系数越高，所述多核苷酸中将有更多的密码子是频繁使用的密码子。如果某一多核苷酸序列的密码子使用系数是1，对于靶物种的高表达基因来说，所有的密码子都是“最常用的”的密码子。
较短的多核苷酸序列也在本发明的范围内。例如，本发明的多核苷酸可编码HPV蛋白的片段。编码长度为至少8个氨基酸，例如8-10个氨基酸，或者20，50，60，70，80，100，150或200个氨基酸的片段的多核苷酸被认为落入本发明的范围之内，只要所述多核苷酸具有类似于高表达的哺乳动物基因的密码子使用模式，并且所编码的寡肽或多肽经证实具有HPV抗原性。具体地，但不是独有地，本发明的这一方面包括以下情况：所述多核苷酸编码完整HPV蛋白序列的片段，且代表该蛋白的一种或多种不连续的表位。
本发明的多核苷酸在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的表达高于编码同一氨基酸序列的相应的野生型序列。不受任何理论的限制，一般认为这种情况至少有两种原因。第一，因为所述序列具有与宿主细胞的序列较接近的密码子使用模式，所以所述序列更容易受到细胞翻译机制的加工。第二，因为核苷酸序列中多达30％(或更多)的部分与野生型序列不同，所以干扰转录或翻译的位点(如蛋白结合位点)将会被除去或改变。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸的密码子使用模式类似于大肠杆菌和哺乳动物(例如，人)基因。这特别有利于在哺乳动物接种和在体外用大肠杆菌细胞制备大量抗原蛋白(例如，用于检测，如免疫检测以判断在哺乳动物或人组织中的表达水平)时使用序列的情况。
如上所述，本发明包括包含本发明核苷酸序列的表达载体。所述表达载体按照分子生物学领域的常规来构建，例如，可使用质粒DNA和适当的起始密码子，启动子，增强子以及其它元件，例如必要的聚腺苷酸化信号，并且将它们以正确的方向放置，以便实现蛋白的表达。其它适当的载体对本领域技术人员来说是已知的。关于这方面的其它实例可参考Sambrooket.al.，Molecular Cloning：a Laborotory Manual.2nd Editon.CSH LaboratoryPress.(1989)。
本发明的多核苷酸，或在本发明载体中应用的多核苷酸，优选可操作地连接于调控序列，所述调控序列能使宿主细胞表达该编码序列，即所述载体是一种表达载体。术语“可操作地连接”是指一种毗连关系，其中，所述成分所处的关系允许它们以预计的方式起作用。调控序列，例如启动子“可操作地连接”编码序列是指，在与调控序列相容的条件下启动子所处的位置能实现所述编码序列的表达。
所述载体可以是(例如，质粒，人工染色体(例如BAC，PAC，YAC)，病毒或噬菌体载体，其带有复制起点，任选还带有可用于多核苷酸表达的启动子并任选带有启动子的调节物。所述载体可以包含一种或多种可供选择的标记基因，例如氨苄青霉素或卡那霉素抗性基因(在细菌质粒的情况下)，或真菌载体的抗性基因。所述载体可以体外应用，例如用于制备DNA或RNA或用于转染或转化宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)，例如制备由载体编码的蛋白。也可以修饰所述载体以在体内应用，例如用于DNA接种方法中或用于基因治疗方法中。
可选择启动子和其它表达调控信号以使其与进行表达的宿主细胞相容。例如哺乳动物启动子包括金属硫蛋白启动子(其能被重金属例如镉诱导)，β肌动蛋白启动子。也可使用病毒启动子例如SV40大T抗原启动子，人巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)启动子，劳斯肉瘤病毒LTR启动子，腺病毒启动子，或HPV启动子，特别是HPV上游调控区(URR)。所有这些启动子都在本领域内有详细的描述并可很容易地得到。
适当的病毒载体的实例包括单纯疱疹病毒载体，痘苗病毒或α病毒载体和逆转录病毒载体，包括慢病毒，腺病毒和腺伴随病毒。使用这些病毒进行的基因转移技术是本领域已知的。逆转录病毒载体例如可以用于将本发明的多核苷酸稳定地整合到宿主基因组中，尽管所述重组不是优选的。复制缺陷的腺病毒载体是附加体形式，所以可进行瞬时表达。可以使用能在昆虫细胞中驱动表达的载体(例如杆状病毒载体)，或在人细胞或细菌中能驱动表达的载体，以产生大量的由本发明多核苷酸所编码的的HPV蛋白，例如用作亚单位疫苗或在免疫检测中应用的蛋白。
由于能表达所编码的蛋白，本发明的多核苷酸可用于制备中，所述表达可在体外，体内或回体(ex vivo)进行。所述多核苷酸因此可参与重组蛋白的合成，例如，能增加产量，或实际上本身可用作治疗剂，在DNA接种技术中应用。本发明的多核苷酸用于在体外或回体制备所编码的蛋白时，可对细胞，例如细胞培养中的细胞进行修饰以使其包含将被表达的多核苷酸。所述细胞包括瞬时的，或优选稳定的哺乳动物细胞系。细胞的具体实例是可通过插入编码本发明多肽的载体进行修饰的细胞，包括哺乳动物HEK293T，CHO，HeLa，293和COS细胞。优选所选择的细胞系不仅是稳定的，还可进行成熟糖基化和进行多肽的细胞表面表达。表达可以在转化的卵母细胞中实现。多肽可以在转基因的非人动物，优选小鼠的细胞中由本发明的多核苷酸表达。从本发明的多核苷酸表达多肽的转基因非人动物包括在本发明的范围之内。
本发明的多核苷酸用作治疗剂时，例如在DNA接种中，可将所述核酸给药将接受接种的哺乳动物，例如人。所述核酸，例如RNA或DNA，优选DNA以可以在哺乳动物细胞中表达的载体(如以上描述的那些)的形式提供。可以任何可利用的技术给药所述多核苷酸。例如，可以通过针注射将所述核酸导入，优选皮内，皮下或肌肉内。或者，将所述核酸通过核酸传输装置，如粒子介导的DNA传输(PMDD)将所述核酸直接传输到皮内。在该方法中，惰性粒子(例如金粒)用核酸包被，并被加速至足以能使它们穿过受试者的表面(例如皮肤)，例如利用发射装置的高压来加速。(用本发明核酸分子包被的粒子在本发明的范围内，载有所述粒子的传输装置也在本发明的范围内)。期望所述组合物包含平均粒径0.5-5μm的金粒，优选约2μm。在优选实施方案中，将所包被的金粒装载到管中，用作药筒，这样每个药筒中包含用0.1-5μg，优选约0.5μgDNA/药筒包被的0.1-1mg，优选0.5mg金。
将裸露的多核苷酸或载体导入患者的适当技术包括适当载体的局部应用。所述核酸可以局部给药到皮肤，或粘膜表面，例如通过鼻内，口腔，阴道内或直肠内给药。所述裸露的多核苷酸或载体可以与可药用赋形剂，例如磷酸盐缓冲液(PBS)一起存在。应用促进剂如丁哌卡因(bupivacaine)(或分开应用或包含在DNA制剂中)可进一步促进DNA的摄取。将所述核酸直接给药于受体的其它方法包括超声，电刺激，电穿孔和显微种植(在US-5,697,901中描述)。
多种已知的转染技术可用来提高核酸构建体的摄取，所述技术例如包括应用转染制剂的那些技术。所述制剂的实例包括阳离子制剂，例如磷酸钙和DEAE-Dextran和脂质转染剂，例如lipofectam和transfectam。核酸的给药剂量可以改变。通常核酸的给药剂量在1pg到1mg的范围内，对于粒子介导的基因传输优选的剂量在1pg到10μg，其它的途径优选的剂量为10μg到1mg。
本发明的核酸序列也可以通过在基因治疗中专用的传输载体给药。基因治疗的方法描述于例如Verme et al，Nuture 1997，389：239-242中。病毒和非病毒载体系统都可以应用。基于病毒的系统包括基于逆转录病毒，慢病毒，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒，金丝雀痘病毒和痘苗病毒的系统。基于非病毒的系统包括直接给药核酸，微球体胶囊化技术(聚(丙交酯-共-乙交酯)和基于脂质体的系统。当初次接种后，期望给予加强注射时可以将病毒和非病毒传输系统相结合，例如，用非病毒载体如质粒进行“初次免疫”的DNA接种，然后用病毒载体或基于非病毒的系统进行一次或多次的“加强免疫”接种。
也可将本发明的核酸序列通过转化细胞的方式给药。所述细胞包括从受试者收获的细胞。可将本发明的裸露多核苷酸或载体在体外导入上述细胞中，之后再使所述转化的细胞返回受试者。本发明的多核苷酸通过同源重组掺入到细胞已有的核酸中。必要时，转化的细胞可以在体外培养，然后将一或多个所得细胞用于本发明中。可用已知的外科学或显微外科学技术(例如，移植，显微注射等)将所述细胞提供到适当的部位。
适当的细胞包括抗原呈递细胞(APC)，如树突细胞，巨噬细胞，B细胞，单核细胞和能被改造成有效的APC的其他细胞。可以(但不是必须)将所述细胞进行基因修饰以增强呈递抗原的能力，改善对T细胞应答的活化和/或维持，具备抗肿瘤，例如抗宫颈癌的作用和/或与受者在免疫学上相容(即HLA单体型匹配)。通常可以从多种生物体液和器官，包括肿瘤和肿瘤周围组织的任何一种中分离APC，所述APC可以是自体的，同种异体的，同基因的或异种的细胞。
本发明的某些优选实施方案中使用了树突细胞或它们的先祖作抗原呈递细胞，用来进行体外转化并返回给患者，或作为在疫苗中所运输的核苷酸的体内靶，例如通过粒子介导的DNA传输。树突细胞是高效APC(Banchereau and Steinman，Nature 392：245-251，1998)，并且作为一种生理佐剂已显示出可有效引发预防性或治疗性的抗肿瘤免疫(参见Timmermanand Levy，Ann.Rev.Med.50：507-529，1999)。树突细胞具有典型的形状(原位放射状(stellate in situ)，具有体外可视的显著的胞质隆起(树突))，它们高效摄取、加工和呈递抗原，它们活化初始T细胞应答，通常可以根据这些对其进行鉴定。当然，可对树突细胞进行改造，使其在体内或回体表达树突细胞中不常见的特异性细胞表面受体或配体，例如本发明构建体编码的抗原，这种修饰的树突细胞包括在本发明的范围内。作为树突细胞的替代物，负载分泌泡抗原的树突细胞(也称为外来体)可用在疫苗中(参见Zitvogel etal.，Nature Med.4：594-600，1998)。
可从外周血，骨髓，肿瘤浸润细胞，浸润肿瘤周围组织的细胞，淋巴结，脾脏，皮肤，脐带血或其他适当的组织或体液中获得树突细胞和先祖。例如，通过将细胞因子如GM-CSF，IL-4，IL-13和/或TNF的组合加入到收获自外周血的单核细胞培养物中可回体分化树突细胞。或者，将GM-CSF，IL-3，TNF，CD40配体，脂多糖LPS，flt3配体(在专职抗原呈递细胞，特别是树突细胞的产生方面重要的细胞因子)和/或诱导树突细胞分化，成熟和增殖的其他化合物的组合加入到培养介质中，可使收获自外周血，脐带血或骨髓的CD34阳性细胞分化成树突细胞。
通常用编码具有抗原性的HPV氨基酸序列的多核苷酸，如本发明密码子最优化的多核苷酸转染APC。所述转染可回体实现，然后可将包含所述转染细胞的组合物或疫苗用于治疗目的，如本发明所述。或者，可将靶向树突细胞或其他抗原呈递细胞的基因传输载体给药患者，从而在体内发生转染。树突细胞的体内和回体转染，例如通常可用本领域已知的任何方法进行，参照WO 97/24447所述方法，或Mahvi et al.，Immunology and CellBiology 75：456-460，1997描述的粒子介导的方法。
疫苗和药用组合物可存在于单剂或多剂容器中，如密封的安瓶或小瓶中。所述容器优选密封封闭的，以保持所用制剂的无菌状态直至使用时。通常，制剂以悬浮液，溶液或乳液的形式储存在油性或水性载体中。或者，疫苗或药用组合物以冻干的状态储存，仅需在即将使用前加入无菌液体状载体。包含即将通过粒子介导的传输来给药的核苷酸序列的疫苗可以是适于用压缩气体传输装置给药的药筒，在这种情况下，所述药筒由空管构成，其内表面涂有携带疫苗核苷酸序列的粒子，选择地，还存在其他的可药用成分。
本发明的可药用组合物可包含佐剂化合物或用来调整或提高由所述DNA编码的蛋白诱导的免疫应答的其他物质。这些物质可由DNA编码，为单独的形式，或与抗原形成的融合体，或作为制剂中的非DNA成分。可包含在本发明制剂中的佐剂类物质的实例包括遍在蛋白，溶酶体相关膜蛋白(LAMP)，乙型肝炎病毒核心抗原，flt3-配体和其他细胞因子如IFN-γ和GMCSF。
市售的其他合适的佐剂如，例如，弗氏不完全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories，Detroit，MI)；Imiquimod(3M，St.Paul，MN)；Resimiquimod(3M，St.Paul，MN)；Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，PA)；铝盐如氢氧化铝胶(alum)或磷酸铝；钙盐，铁盐或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的微球体；单磷酰脂质A和quilA。细胞因子，如GM-CSF或白细胞介素2，7或12也可用作佐剂。
在本发明的制剂中，优选佐剂组合物诱导以Th1型为主的免疫应答。因此，所述佐剂可用来把对DNA编码抗原所产生的以Th2型为主的免疫应答向Th1型为主的免疫应答方向调整。Th1-型细胞因子(如IFN-，TNF，IL-2和IL-12)的高水平趋向于对诱导细胞介导的针对所给药抗原的免疫应答有利。以Th1型为主要应答的优选实施方案中，Th1型细胞因子的水平提高的程度比Th2型细胞因子的水平高。这些细胞因子的水平可用标准检测法很容易地检测。对细胞因子家族的综述可参见Mosnann and Coffman，Ann.Rev.Immunol.7：145-173，1989。
因此，引发以Th1型为主的应答所用的适当佐剂包括，例如，单磷酰基脂质A，优选3-脱-O-酰化的单磷酰基脂质A(3D-MPL)与铝盐的组合。其他已知的优先诱导Th1型免疫应答的佐剂包括包含CpG的寡核苷酸。所述寡核苷酸的特征在于CpG二核苷酸是非甲基化的。所述寡核苷酸是已知的并描述于，例如，WO96/02555。对免疫刺激性DNA序列也有描述，例如，Sato et al.，Science 273：352，1996。包含CpG的寡核苷酸可在同一或不同的多核苷酸构建体中与乳头瘤抗原分别编码，或它们之间是紧邻的，例如它们是融合体。或者，包含CpG的寡核苷酸可分别给药，即不作为包含编码抗原组合物的一部分。CpG寡核苷酸可单独应用或与其他佐剂联合应用。例如，增强的系统涉及包含CpG的寡核苷酸与皂苷衍生物的组合，尤其是WO 00/09159和WO 00/62800中公开的CpG和QS21的组合。优选所述制剂另外含有水包油乳剂和/或生育酚。
另一优选佐剂是皂苷，优选QS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc.，Framingham，MA)，其可单独应用或与其他佐剂组合应用。例如，一种提高的系统涉及单磷酰基脂质A和皂苷衍生物的组合(如QS21和3D-MPL的组合，描述在WO 94/00153中)，或较弱的反应原性组合物(其中QS21用胆固醇淬灭，这在WO 96/33739中有描述)。其他优选的制剂包括水包油乳剂和生育酚。在水包油乳剂中包含QS 21，3D-MPL和生育酚的特别强效的佐剂制剂描述于WO 95/17210中。
其他优选佐剂包括Montanide ISA 720(Seppic，France)，SAF(Chiron，California，United States)，ISCOMS(CSL)，MF-59(Chiron)，Detox(Ribi，Hamilton，MT)，RC-529(Corixa，Hamilton，MT)和其他氨烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGP)。
其他优选的佐剂包括通式(I)的佐剂分子
通式(I)：HO(CH2CH2O)n-A-R
其中，n是1-50，A是一种化学键或-C(O)-，R是C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
本发明的一个实施方案由包含通式(I)的聚氧乙烯醚的制剂组成，其中n为1-50，优选4-24，最优选9；R成分是C1-50，优选C4-C20烷基，最优选C12烷基，A是一种化学键。聚氧乙烯醚的浓度应在0.1-20％范围内，优选0.1-10％，最优选在0.1-1％的范围内。优选聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯基-9-月桂基醚，聚氧乙烯基-9-steoryl醚，聚氧乙烯基-8-steoryl醚，聚氧乙烯基-4-月桂基醚，聚氧乙烯基-35-月桂基醚，聚氧乙烯基-23-月桂基醚。聚氧乙烯基醚如聚氧乙烯基月桂基醚在Merck索引(第12版，查询号7717)中有描述。这些佐剂分子在WO 99/52549中描述。上述通式(I)的聚氧乙烯醚如果需要可与另一佐剂组合。例如，优选的佐剂组合是优选与正在审理的英国专利申请GB 9820956.2中描述的CpG组合。
当疫苗包括佐剂时，疫苗制剂可以以两部分给药。例如，通过皮下或肌肉注射，或通过皮内粒子介导的传输首先给药包含编码抗原的核苷酸构建体的制剂部分，然后立即或间隔适当时间后给药包含佐剂的制剂部分，这对疫苗领域有经验的医师来说是显而易见的。在这些情况下，所述佐剂可以与抗原制剂按同样的途径给药或通过另外的途径给药。在其他实施方案中，所述制剂的佐剂部分可在抗原部分给药前给药。在一个实施方案中，所述佐剂作为一种局部制剂，给药于编码抗原的核苷酸序列的粒子介导性传输部位的皮肤，可以是在粒子介导的传输之前或之后进行。
以下实施例参考附图用以进一步描述本发明：其中
图1显示来自HPV型11，6a和6b的E1的原型野生型氨基酸序列，来源于Genbank；
图2显示图1(6b-e1)所示HPV6b E1的原型野生型氨基酸序列，与包含用于除去生物活性的点突变的HPV6b E1氨基酸序列(6b-e1 mut)的比对；
图3显示来自HPV型11，6a和6b的E2的原型野生型氨基酸序列，来源于Genbank；
图4a显示图3(Hpv-11e2-wt)所示HPV11 E2的原型野生型氨基酸序列，与包括用于除去生物活性的点突变的HPV11 E2氨基酸序列(Hpv-11e2-mut)，以及与图6(Hpv-11e2-comut)所示核苷酸序列编码的氨基酸序列的比对；
图4b显示图3(Hpv-6be2-wt)所示HPV6b E2的原型野生型氨基酸序列，与包括用于除去生物活性的点突变的HPV6b E2氨基酸序列(Hpv-6be2-mut)的比对；
图5显示一种核苷酸序列，该序列具有类似于高表达的人基因的密码子使用模式，所述核苷酸序列编码图2中突变的HPV6b E1氨基酸序列；
图6显示一种核苷酸序列，其具有类似于高表达的人基因的密码子使用模式，所述核苷酸序列编码图4中突变的HPV11 E2氨基酸序列；
图7显示DNA载体p7313-PLc；
图8表示来自实施例4的细胞裂解物样品在丙烯酰胺凝胶上电泳并染色的结果，以此显示与所表达的E1蛋白结合的抗体；
图9显示用本发明的多核苷酸免疫小鼠后对抗原攻击所产生的细胞应答(实施例6)；和
图10表示来自实施例7的细胞裂解物在丙烯酰胺凝胶上电泳并染色的结果，以此显示与所表达的E2蛋白结合的抗体。
实施例1 HPV6bE1的密码子最优化
HPV6bE1的野生型原型氨基酸序列，从Genbank获得，显示在图1中(底部序列)。该图显示HPV病毒11，6a和6b型中所述蛋白的原型序列之间的高度同源性。类似地，图3显示HPV11，6a和6b的E2蛋白的野生型原型氨基酸序列。预计用HPV6b序列进行的免疫治疗(治疗性疫苗)将发生交叉反应，以提供预防或治疗性的抗所有三种病毒型别的免疫应答。
将HPV6bE1序列的密码子使用与高表达的人和大肠杆菌基因进行比较，发现这两个物种的密码子使用系数都低。对每个氨基酸残基来说只应用最丰富的密码子也会导致不对称的密码子使用模式，因为对给定氨基酸来说，没有生物体仅用其最优选的密码子。因此，可用统计学方法分配密码子，从而得到合成基因，并使其密码子频率接近于在大肠杆菌和人中高表达的基因的天然密码子频率。
用称为Calcgene的Visual Basic程序(由R.S.Hale和G Thompson撰写)可分配合成基因中的密码子(Protein Expression and Purification Vol.12 pp.185-188(1998))。对原始序列中的每一氨基酸残基，基于其在高表达的大肠杆菌基因中出现的概率来分配密码子。所述程序在微软Windows3.1环境下运行的详细情况可从作者处获得。因为该程序应用统计学方法给合成基因分配密码子，所以不是所有得到的密码子都是靶生物体中最常用的。当然，靶生物体中常用和不常用密码子的比例通过以正确的比例分配密码子而反映在合成序列中。然而，因为没有严格的规则确定序列中具体位置上的具体密码子，所以，尽管每次都使用相同的密码子使用模式并且每次都编码同样的氨基酸序列，但每次运行该程序都会产生不同的合成基因。如果对于给定氨基酸序列和给定靶生物体将上述程序运行数次，将产生数种不同的核苷酸序列，它们在限制性位点的数目，类型和位置方面，内含子剪切信号等方面不同，其中有一些可能是不期望的。在这些特征基础上，本领域技术人员能选择适当的序列应用于多肽的表达。
进一步地，因为密码子是按照统计学计算而随机分配的，所以在靶生物体中二个或二个以上的相对罕用的密码子可能(尽管也许未必)极为接近并成簇。据信，这些簇可能会干扰翻译机制，导致特别低的表达率，所以在最优化基因中选择密码子的算法排除了对高表达基因来说RSCU值小于0.2的任何密码子，目的是防止偶然选择出任何罕见密码子簇。然后将剩余密码子的分布依照高表达的大肠杆菌基因的频率分派，以使合成基因中总体分布类似于大肠杆菌基因(系数＝0.85)，还类似于高表达的人基因(系数＝0.50)。用类似的过程获得密码子最优化的HPV11 E2核苷酸序列，不同的是应用Syngene(Peter Ertl，未公开)，这是Calcgene程序更新的版本，它能排除将被选的罕用密码子，使用该程序能依照高表达的人基因的密码子频率模式分派密码子。不象为E1选派密码子，其不排除罕用密码子。同时，改变一种寡核苷酸，以编码K111A的氨基酸变更，如下描述。
将突变引入密码子最优化的E1和E2基因以产生E1(K83G，R84G和G483D)和E2(K111A)氨基酸序列中的点突变。所述突变基因的氨基酸序列显示在图2(HPV6bE1)和图4(HPV6bE2和HPV11E2)中(与野生型原型序列相比对)。HPV6bE1的密码子最优化的且突变的核苷酸序列显示在图5。HPV11E2的密码子最优化的且突变的核苷酸序列显示在图6。图4给出了通过密码子最优化的且突变的HPV11E2基因的表达获得的多肽的氨基酸序列，其与原型野生型和突变的野生型序列相比对，以此显示核苷酸序列的密码子最优化不改变所编码的氨基酸序列(其与突变的野生型序列相同)。
实施例2构建密码子最优化的HPV6b E1多核苷酸序列
基因设计
用上述最优化软件，从最优化的序列中计算出重叠的40体寡核苷酸。包含限制性位点的末端寡核苷酸是60体。所述寡核苷酸从Life TechnologiesLtd定购，浓度是50nmole，是去保护的和非磷酸化的。
寡核苷酸的组装
将每种寡核苷酸溶于双蒸水中，至最终浓度为100微摩尔(μm)，制备所有96种寡核苷酸的等量混合物，浓度为100微摩尔。用来自RocheBoehringer的Pwo聚合酶(目录号为1 644 955)如下进行合成。
双蒸水 86μl
Pwo 10X缓冲液 10μl
dNTP混合物 1μl(100mM dNTP等量混合)
寡核苷酸混合物 1μl(100μM寡核苷酸等量混合)
Pwo聚合酶 2μl
在Trio Thermoblock(Biometra)上，用以下条件对上述反应混合物进行聚合酶链反应(PCR)：
1.40℃2分钟
2.72℃10秒钟
3.94℃15秒钟
4.40℃30秒钟
5.72℃20秒钟+每个循环2秒钟
6.4℃8
在第3步和第5步之间循环重复25次。
25个循环之后，从每个管中取出10μl的等份试样在0.8％的Tris醋酸(TAE)琼脂糖凝胶上电泳，并在长波的紫外光下观察。合成的E1 DNA的期望大小应该约2Kb。
基因的回收：
合成的基因通过用聚合酶进行PCR来回收，所用的两种末端寡核苷酸为合成的寡核苷酸，其中N末端寡核苷酸包含Not1限制性位点，C末端寡核苷酸包含BamH1位点。
双蒸水 65μl
Pwo10X缓冲液 10μl
dNTP混合物 1μl(100mM dNTP等量混合)
装配混合物 20μl(来自先前的PCR)
N末端寡核苷酸 1μl(100μM)
C末端寡核苷酸 1μl(100μM)
Pwo聚合酶 2μl
1.94℃ 45秒钟
2.72℃ 2分钟+每500个bp 1分钟
3.72℃ 10分钟
4.4℃ 8
在第2步和第1步之间循环重复25次。
然后将PCR产物用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen目录号为28104)进行纯化，之后将DNA重新悬浮在总量为50μl的试剂盒洗脱缓冲液中。将10μl等份试样用Notl和BamH1限制性内切酶(来自Life Technologies Ltd，3 Fountain Drive，Inchinnan Business Park，Paisley，Scotland)在37℃消化2小时。然后将该消化物在0.8％的TAE琼脂糖凝胶上进行凝胶纯化，切割并用QIAquick Gel提取试剂盒(Qiagen目录号为28704)提取2Kb的DNA产物。将最终被消化的纯DNA片段洗脱在总量为50μl的试剂盒洗脱缓冲液中。
将该PCR片段克隆到载体p7313PLc(图7)中，(Powderject Vaccines Inc.，参见以下详述)并转化到感受态JM109细胞(Promega分类号为P9751)中。用Ncol-BamH1和Ncol-EcoR1消化对来自所选择克隆的质粒DNA进行限制性酶核对。筛选出5个具有2Kb片段插入片段的正确克隆，对插入片段DNA进行测序。选择出一个具有仅含3个点突变的插入片段的克隆进一步使用。通过与来自其它克隆的同源小片段进行的连接交换修正三个点突变。
用限制性酶消化对修正后的克隆再次进行核对，并将插入的DNA完全测序。该克隆被称为p6bE1c/o。同时，为进行比较表达和免疫研究，野生型HPV-6b E1基因和野生型HPV-11 E1基因PCR扩增自HPV-6b基因组克隆(EMBO J，2(12)2314-2318 1983)和HPV-11基因组克隆(Virology 151，124-130 1986)，然后将各自的片段克隆到Notl-BamH1消化的载体p7313PLc中。这些克隆分别称为p6bE1w/t和p11E1w/t。
将克隆p6bE1c/o和p6bE1w/t中的E1基因进一步突变以引入氨基酸改变K83G，R84G和G438D。经测序的匹配的3’和5’寡核苷酸引物具有核苷酸取代(用于引入所需的突变)，用这些引物以及QuickChange定点突变试剂盒(Stratagene分类号为200518)中的其它制剂一起，按说明书所述方法进行PCR反应。将突变的p6bE1c/o和p6bE1w/t克隆分别命名为p6bE1c/o mut和p6bE1w/t mut。
实施例3构建密码子最优化的HPV11 E2多核苷酸序列
对E2密码子最优化的基因的设计，组装和回收如对E1所描述的那样，但重叠的寡核苷酸是60个核苷酸的长度，而不是40个核苷酸的长度，具有18个核苷酸的重叠。与E1的过程不同，一个包含K1114A氨基酸突变的克隆密码子最优化的E2基因克隆同时产生，方式是用2种60体寡核苷酸(它们合并包含产生K111A改变所需的核苷酸取代)取代上述二者的相应野生型序列寡核苷酸。
质粒p7313-PLc的组成
该质粒用pUC4K的包含卡那霉素抗性基因的EcoRI片段(Amersham-Pharmacia)取代包含pUC19的包含β-内酰胺酶基因的Eam11051-Pst1片段(可从Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.，AmershamPlace，Little Chalfont，Bucks，HP7 9NA获得)，然后用T4 DNA聚合酶使二种片段钝端化。人巨细胞病毒IE1启动子/增强子，内含子A衍生自质粒JW4303(从Dr Harriet Robinson，University of Massachusetts获得)，作为Xhol-Sal1片段插入到pUC19的Sal1位点，掺入牛生长激素的聚腺苷酸化信号。使所述启动子的5’Sal1-Banl片段缺失，产生可应用于载体的最小启动子(WO00/23592-Powderject Vaccines Inc.)。HBV表面抗原的3’UTR衍生自载体pAM6中的乙型肝炎病毒(adw血清型)(Moriarty et al.，Proc.Natl.Acad.Sxi.USA，78，2606-2610，1981)。pAM6(pBR322基础上的载体)从美国典型培养物保藏中心获得，目录号为ATCC 45020。3’UTR以1.4Kb的BamH1片段的形式插入到聚腺苷酸化信号的5’侧，钝端化以便通过插入以除去BamH1位点。在一系列步骤中(包括用BglI消化，Klenow聚合酶处理，用BstXI消化，用NcoI消化，用绿豆核酸酶处理以除去突出端和用BstXI进一步消化)，对HBV S抗原基因的3’非翻译区的增强子区和bGHpA信号之间的区域进行修饰，以除去在X基因启动子和bGHpA信号之间的所有大于5个密码子的开放读框。这导致缺失X蛋白可翻译部分(9个氨基酸)的编码序列和X基因的起始密码子。然而，X基因的弱增强子/启动子区被保留，因为发现该区增强CMV启动子控制下的HBsAg的表达。用兔β珠蛋白聚腺苷酸化信号取代牛生长激素聚腺苷酸化信号。切出S抗原的5’非编码和编码序列，用寡核苷酸接头取代，以提供所示的多克隆位点，以产生质粒p7313-PL。
Hind -- -Notl- -- -EcoRV -Ndel-- --BamHl
AGCTTGCGGCCGCTAGCGATATCGGTACCATATGTCGACGGATCC....
....ACGCCGGCGATCGCTATAGCCATGGTCTACAGCTGCCTAGGCCGG
--Nhel-- --Kpnl-- --Sall-- ΔNotl
ColE1 cer序列从质粒pDAH212(来自David Hodgeson，WarwickUniversity)的亚克隆获得，并用引物通过PCR扩增，以便在该序列末端放置EcoRI限制性位点。然后将所述cer序列插入p7313-PL的Eco RI位点，产生质粒p7313-PLc(图7)。对照Genbank登录号M11411证实扩增后的cer序列。
实施例4在哺乳动物293T细胞中表达E1蛋白
将哺乳动物293T细胞培养到对数生长期，6孔ComingCostarTM(Coming Science Products，10 The ValleyCentre，Gordon Road，HighWycombe，Bucks，UK)组织培养板的每孔中细胞的最终浓度为2×105，在5％的CO2中37℃过夜。制备如下转染混合物并混合25分钟：
2μg质粒DNA(载体，p6bE1c/o，p6bE1w/t)溶于16μl无菌双蒸水中
其中加入：
OPTI-memTM(Gibco BRL，Paisley，Scotland) 8μl
LipofectamineTM(GibcoBRL) 6μl
用OPTI-memTM对每孔细胞单层小心洗涤二次。然后将800μlOPTI-memTM加入到每孔中。将200μl OPTI-memTM加入到每种转染的混合物中，混合并轻轻加入到所述细胞单层。将培养板在5％CO2中37℃温育5小时，之后将转染混合物和OPTI-memTM弃掉。用细胞生长培养基轻轻洗涤细胞单层二次，最后将转染细胞在5％CO2中37℃，在包含10％胎牛血清和29.2mg/ml L谷氨酰胺的Dulbecco’s改良型Eagle培养基中温育24小时。将所述细胞刮入微量管中，用PBS洗二次，离心后将细胞团重悬在SDS PageLaemmli染料中。将所述细胞团煮沸并上样至10％的SDS Page凝胶上，在1X Tris甘氨酸SDS缓冲液中电泳。电泳后，将凝胶印迹至硝酸纤维素膜(Amersham)上并进行Western印迹。用5％MarvelTM(Premier Beverages，Knighton，Adbaston，Stafford，UK)的PBS溶液将硝酸纤维素膜室温下封闭30分钟，然后用PBS和0.1％的Tween20洗二次。将在兔中制备的抗HPV6bE1的C末端蛋白序列(蛋白序列：CSSSLDIQDSEDEEDGSNSQAFR)的多克隆抗体在5％MarvelTM的PBS溶液中进行稀释，然后加到硝酸纤维素膜上。在室温下轻轻摇动温育1小时。将所述稀释的抗体除去，用PBS和0.1％的Tween20洗膜三次。将第二种偶联物，猪抗兔辣根过氧化物酶(HRP)(DAKO)在PBS和0.1％的Tween20中进行1∶20000稀释。将其加到上述洗过的膜上并在室温下轻轻摇动温育1小时。然后将该膜用PBS和0.1％的Tween20彻底洗涤。用Chemiluminescent HRP试剂盒(Amersham)检测膜上的转移蛋白。
结果：
E1翻译蛋白的预测大小是68kDa-72kDa。结果(图8)显示由包含密码子最优化的HPV6bE1的p7313-PLc表达的正确蛋白大小(泳道4)。包含野生型E1的载体在泳道3，其显示在人细胞中没有检测到野生型核苷酸序列表达的E1。同样在泳道2(空载体)和泳道1(未转染的细胞)没有检测到E1。在泳道1-4的大约60kD的带是一种未确定的细胞蛋白，其与抗E1抗体交叉反应。该带在各泳道的强度大致恒定，表明各泳道样品的上样是一致的。
实施例5构建表达HPVE1和HPVE2蛋白的重组痘苗病毒
表达HPV-6bE1蛋白的痘苗病毒在Glaxo Wellcome，Stevenage，UK制备。表达HPV-11 E1和HPV-11 E2的痘苗病毒由Jeff Engler，University ofAlabama at Birmingham，US惠赠。
简言之，将来自p6bE1w/t的E1基因克隆到痘苗病毒载体pTM3中，然后对重组载体进行限制性酶核对和DNA测序并用于转染HTk-细胞。分离重组痘苗病毒并进行噬斑纯化。用肽抗血清通过Western印迹对E1蛋白的表达进行检测，所述抗血清是在用表达HPV-6bE1的重组病毒和表达噬菌体T7RNA聚合酶的第二种痘苗病毒(vTF7-3)感染允许细胞后制备的。为直接表达来自HPV-11E1和E2重组痘苗病毒的E1和E2蛋白，需与痘苗病毒vTF7-3共感染细胞。痘苗病毒株WR用在阴性对照试验中。载体pTM3和病毒vTF7-3来自National Institute of Health，Maryland，US。
实施例6对HPV抗原细胞应答的免疫学检测
除非另有说明，所有试剂都来自Gibco BRL，Paisley，Scotland or Sigma，Poole，Dorset。
A.免疫方案
用1.0-2.0μg DNA(或者p6bE1c/o，p6bE1w/t，p6bE1c/o mut，p6bE1w/t mut或者是空载质粒p7313PLc)通过PMDD对雌性C57BL/6小鼠进行免疫，14天后用同样剂量进行加强免疫。脱颈处死所述动物，取脾研究对HPV抗原的细胞应答。
B.制备脾细胞的单细胞悬液
在毛面玻璃片(BDH)之间“捣碎”脾脏，将红细胞裂解(155mM NH4Cl，10mM KHCO3，0.1mM EDTA)，并将细胞重悬于完全RPMI(补充了10％胎牛血清(FCS)，2mM谷氨酰胺，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素和5×10-5M2-巯基乙醇的RPMI-1640培养基)中。
C.感染MC57靶细胞
衍生自HPV抗原的免疫显性表位仍然未明确，所以在体外对抗原特异性应答的检测依赖于对靶细胞内产生的整个抗原的加工，所述靶细胞已用表明整个蛋白的cDNA转染。MC57细胞(Kb阳性)用表达HPV-6bE1，HPV-11E2或HPV-11E1的重组痘苗病毒以感染复数5在37℃感染1小时。将过多的病毒洗掉，并将所述细胞重悬在包含50ng/ml重组人IL-2(GlaxoWellcome，Geneva)的完全RPMI中。
D.ELISPOT
用大鼠抗小鼠IFNγ(Pharmingen 1818D)以在PBS中15μg/ml的浓度包被ELISPOT板(96孔，Millipore MAIP S 45 1 0)，4℃过夜，之后添加从试验组获得的4×10e5个脾细胞。通过添加1×10e4个重组痘苗病毒感染的MC57细胞实现抗原的呈递。野生型痘苗病毒WR用作阴性对照。将该分析在37℃温育过夜(5％CO2)。
在检测的第2天，用生物素化的大鼠抗小鼠IFNγ(Pharmingen18112D)(以1μg/ml的浓度)，链霉亲和素碱性磷酸酶偶联物(TCS BiologicalsSA 1008)(TCS biologicals SA 1008)(在PBS中以1/1000稀释)检测斑点形成细胞(blot forming cells)。用碱性磷酸酶底物试剂盒(Biorad 170-6432)观察并用图象分析进行定量。所得结果显示在图9。
如图9所示，当用痘苗病毒载体(vacc.E1(11)或vacc.E1(6b))携带的E1进行攻击时，所有三只用编码HPB-6b密码子最优化的E1序列的质粒接种的小鼠都可观察到强细胞应答。当这些小鼠用野生型痘苗病毒(vacc.WT)，或用表达HPV-11 E2的痘苗病毒(vacc.E2(11))进行攻击时，未观察到应答。相反，用编码野生型E1序列的质粒接种小鼠不产生T细胞应答。来自这些小鼠的脾细胞不对携带E1基因的痘苗病毒的攻击产生反应，也不对任何其它的攻击产生反应(资料未显示)。E1基因的突变不改变小鼠体内细胞应答。因为用p6bE1c/o和p6bE1c/o mut免疫的小鼠产生抗靶细胞(所述靶细胞用表达来自HPV-11的E1蛋白的痘苗病毒感染)的强细胞免疫应答，所以我们可以推测在HPV-6bE1和HPV-11E1之间有高水平的免疫交叉反应。用空p7313-PLc载体接种的小鼠对任何攻击显示无应答。
实施例7 HPV6bE2在哺乳动物293T细胞中的表达
用1μg每种质粒(p6bw/t，p6bc/o，p6bw/t mut，p6bc/o mut)转染24孔培养板中的293T细胞单层(80％汇合)，每次转染依照标准方法使用2.5μlLipofectamine 2000(Life Technologies)(参见上述实施例4)。转染24小时后，收获细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤并用抗HPV-6b N末端氨基酸序列MEAIAKRLDACQEQLLELYEEC的抗E2肽抗血清(#1100)，通过SDS-PAGE和Western印迹进行检测(图10)。
结果
结果显示在泳道3(密码子最优化的E2)和泳道5(密码子最优化且突变的E2)中有预计大小(40kD-45kD)的强蛋白带。同样大小的弱蛋白带也显示在泳道4中，这提示突变的野生型E2质粒有极低水平的表达，但在泳道1(阴性对照)，或泳道2(野生型E2蛋白)中无表达。约25kd的交叉反应性蛋白带出现在所有泳道中，提示所有泳道蛋白裂解物的上样量相等。E2的突变未显示损及E2蛋白的表达，该蛋白的表达通过密码子最优化得到明显改善。
Claims (30)
1.一种多核苷酸序列，其编码HPV早期抗原或其片段的人乳头瘤病毒氨基酸序列，该多核苷酸序列的高表达人基因的密码子使用系数大于0.5但小于1.0，并且该多核苷酸序列能在体内产生免疫应答。
2.依照权利要求1的多核苷酸序列，其是DNA序列。
3.依照权利要求1或2的多核苷酸序列，其编码与宫颈癌，良性皮疣或尖锐湿疣有关的HPV型或亚型的HPV多肽。
4.依照权利要求3的多核苷酸序列，其编码1-4，6，7，10，11，16，18，26-29，31，33，35，39，49，51，52，56，58，59和68型之一的HPV多肽。
5.依照权利要求4的多核苷酸序列，其编码与宫颈癌或尖锐湿疣有关的HPV型或亚型的HPV多肽。
6.依照权利要求5的多核苷酸序列，其编码6，11，16，18，33或45型之一的HPV多肽，或HPV病毒6，11，16，18，33或45型中一种或多种病毒的两种或更多种多肽的融合体。
7.依照权利要求5的多核苷酸序列，其编码选自HPV11，6a或6b的HPV型或亚型的HPV多肽。
8.依照上述权利要求的任一项的多核苷酸序列，其编码具有降低的生物功能的突变的HPV多肽。
9.依照权利要求7的多核苷酸序列，其编码突变的HPV多肽，该多肽包含一种或多种点突变，从而使该多肽的一种或多种天然的生物功能被灭活。
10.依照上述权利要求的任一项的多核苷酸序列，其中所编码的HPV多肽包含HPV早期基因产物的全部或一部分。
11.依照权利要求9的多核苷酸序列，其中所编码的HPV多肽包含E1或E2的全部或一部分，或E1或E2的全部或一部分与另一种HPV多肽的融合体。
12.依照上述权利要求的任一项的多核苷酸序列，其具有大肠杆菌基因的密码子使用系数，该系数大于0.6。
13.SEQ ID NO：10所示的多核苷酸序列或保持了其密码子使用模式的其片段或类似物。
14.SEQ ID NO：11所示的多核苷酸序列或保持了其密码子使用模式的其片段或类似物。
15.一种表达载体，其包含与调控序列可操作连接的依照上述权利要求任一项的多核苷酸序列，所述调控序列能使宿主细胞表达该多核苷酸序列。
16.依照权利要求15的表达载体，其能指导所述多核苷酸序列在细菌，昆虫或哺乳动物细胞中的表达。
17.依照权利要求15或16的表达载体，其中所述载体骨架是p7313PLc。
18.一种宿主细胞，其包含依照权利要求1-14的任一项的多核苷酸序列。
19.一种宿主细胞，其包含依照权利要求15-17的任一项的表达载体。
20.依照权利要求18或19的宿主细胞，其是细菌细胞，哺乳动物细胞或昆虫细胞。
21.包含权利要求1-14的任一项的多核苷酸序列的药物组合物。
22.包含权利要求15-17的任一项的载体的药物组合物。
23.依照权利要求21或22的药物组合物，其包含一组粒子，优选金粒子，用DNA包被。
24.依照权利要求22的药物组合物，其包含药学上可接受的赋形剂和DNA载体。
25.依照权利要求21-24的任一项的药物组合物，其进一步包含佐剂。
26.依照权利要求25的药物组合物，其中所述佐剂被编码为与所述多核苷酸编码的HPV多肽的融合体。
27.依照权利要求1-14的任一项的多核苷酸在制备用于治疗或预防HPV感染的药物中的用途。
28.依照权利要求15-17的任一项的载体在制备用于治疗或预防HPV感染的药物中的用途。
29.依照权利要求27-28的任一项的用途，其中HPV感染是HPV 6，11，16或18型的感染。
30.依照权利要求1-14的任一项的多核苷酸，依照权利要求15-17的任一项的载体，在制备用于治疗或预防皮疣，尖锐湿疣，意义未确定的非典型鳞状细胞(ASCUS)，宫颈发育异常，颈上皮内瘤形成(CIN)或宫颈癌的药物中的用途。
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