JP6001064B2 - ヒトパピローマウイルスl1タンパク質の生産収率を向上させる方法 - Google Patents
ヒトパピローマウイルスl1タンパク質の生産収率を向上させる方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6001064B2 JP6001064B2 JP2014515747A JP2014515747A JP6001064B2 JP 6001064 B2 JP6001064 B2 JP 6001064B2 JP 2014515747 A JP2014515747 A JP 2014515747A JP 2014515747 A JP2014515747 A JP 2014515747A JP 6001064 B2 JP6001064 B2 JP 6001064B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- hpv
- carbon source
- medium
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20051—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
実験方法
1.細胞株製作及び細胞培養
HPV 16 L1エンコードポリヌクレオチド配列は、野生型アミノ酸配列を維持しながらmRNAがなるべく2次構造を形成しないようにデザインした[23]。ポリヌクレオチドは、Blue Heron Biotechnology(Blue Heron Biotechnology、Inc.、WA、USA)に依頼して合成し、プラスミドYEGα−MCSでライゲイションした。このように製造した組み換えプラスミドYEGα−MCS−HPV 16 L1をサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)Y2805に形質転換した。形質転換体をウラシル(uracil)がない合成完全培地(complete medium)である“SD−ura”に塗抹し、4日または5日間培養した。単一コロニーをSD−ura液体培地に接種し、2日間培養した。GAL10プロモータからHPV 16 L1タンパク質を発現させるために、培養した形質転換細胞を1%酵母抽出物(Duchefa、Netherlands)、2%ペプトン(Duchefa)及び多様な濃度及び比率のグルコース(Duchefa)及びガラクトース(Duchefa)を含むYPDG培地で培養した。SD−ura液体培地で培養した細胞は、600nmで測定した光学密度(optical density、OD)は、0.6まで到逹した。液体培養物を10倍ずつ希釈し、50または150mLのYPDG培地を含むフラスコに接種し、30℃、230rpmの振とう条件下で指定された時間の間に培養した。細胞の密度は、OD 600nmで測定した。
HPV 16 L1タンパク質は、既に公知された方法によって精製した[13]。図1aに示されたように、細胞をガラスビーズ(BioSpec Products、OK、USA)に破砕した後、細胞残渣を除去した。HPV 16 L1タンパク質を40%飽和アンモニウムサルフェート内で沈殿させ、沈殿されたタンパク質をPBS(phosphate−buffered saline)+0.01% Tween 80に対して透析した。タンパク質の濃度は、バッファー[10mM ソジウムホスフェートpH 7.2、150mM NaCl+0.01% Tween 80]を使用して5mg/mLに調整し、懸濁液を常温で12時間の間に維持した。沈殿されたタンパク質汚染物を除去して得たサンプルを陽イオン交換クロマトグラフィー用結合バッファー[PBS+0.37M NaCl+0.01% Tween 80、final NaCl conc.0.5M]に対して透析処理した。4mLのP−11ホスホセルロースレジン(P−11 resin、Whatman、UK)でパッキングされたカラムを結合緩衝液で平衡化させ、透析したサンプルをカラム上にローディングした。カラムは、カラム体積の6倍容量の結合緩衝液で洗浄した後、0.6、0.7、0.8、0.9及び1M NaClを含む緩衝液で溶出させた。溶出された分画を回収し、Amicon Ultra−4(Millipore、USA)を使用して濃縮させた。
タンパク質濃度は、牛血清アルブミン(BSA;Pierce、USA)を標準物質としてBio−Rad Bradford protein assay kit(Bio−Rad Laboratories、USA)を使用して測定した。
SDS−PAGEは、Laemmliの方法[24]によって行い、ウェスタンブロットは、既に公知された方法[25]を使用して行った。HPV 16 L1タンパク質は、1次抗体としてウサギの抗−HPV 16 L1血清を使用し、2次抗体としてヤギHRP−コンジュゲートされた抗−ウサギIgGポリクロナル抗体(Pab、Pierce、USA)を使用して検出した[13]。チューブリンは、白色ネズミ(rat)抗−チューブリンポリクロナル抗体(Abcam、USA)、及びHRPコンジュゲートされたヤギ抗−ウサギIgGポリクロナル抗体(Pierce、USA)を使用して検出した。バンドの強度は、NIH open source software Image Jで測定し、公知方法によって算出した。
HPV 16 L1の免疫原性評価のために6週齢Balb/cネズミを使用した(Orientbio.south Korea)。ネズミは、1週間適応期を経た後、L1タンパク質で免疫化させた。ネズミは、皮下注射を通じて免疫化させ、2週間隔で3回免疫化させた。1回免疫化に10ngのL1タンパク質及び200μgの水酸化アルミニウム(aluminium hydroxide)(Sigma、USA)を投与した。同一量の精製したHPV 16 L1タンパク質をネズミに免疫化させるために公知されたタンパク質定量法及びSDS−PAGE方法によってL1タンパク質の純度及び濃度を確認した。3次免疫10日後、ネズミのしっぽの静脈から血液を採取し、抗−HPV 16 L1 IgG抗体の力価と抗−HPV16中和活性を測定した。ネズミ血液内の抗−HPV 16 L1 IgG抗体の力価と抗−HPV16中和活性は、既に公知された方法によってELISA(Enzyme−linked immnosorbent assay)とpseudovirus−based neutralization assayを通じて測定した[Kim H. J.et al.、PLoS One.2012;7(4):e35893.Epub 2012 April 26;The choice of resin−bound ligand affects the structure and immunogenicity of column−purified human papillomavirus type 16 virus−like particles]。
グループ間の差異の統計学的有意性は、two tailed Student’s t−testを使用して決定した。P<0.05を有意的差異として見なした。
1.炭素源濃度による細胞の成長率及び細胞当たりHPV 16 L1タンパク質の発現量比較
HPV 16 L1タンパク質発現及び生産に対して及ぶ全炭素源濃度の影響を調査するために、炭素源の濃度によるサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)細胞の成長と、細胞当たりHPV 16 L1タンパク質の発現量を比較した。炭素源としてグルコースとガラクトースの含有量をグルコース(%):ガラクトース(%)=1:1〜6:6まで変化させて培地を組成した後、L1タンパク質を発現させて精製した(図1b参照)。実験結果、図2aから分かるように、144時間培養時に最終細胞密度は、培地内で炭素源であるグルコース及びガラクトースの総合計の濃度が増加するにつれて増加する傾向を示した。それぞれの炭素源濃度条件で培養した細胞は、0〜120時間培養時まで対数期(exponential phase)の成長を示し、120時間以後の培養時には、細胞の成長率が減少し、停止期(stationary phase)の態様を示した(図2a参照)。
炭素源の濃度による培養液内のHPV 16 L1タンパク質の量を比較するために、容積収率(volumetric yeild)を比較した。容積収率は、一定体積の細胞培養液内に存在するL1タンパク質の量を示す。図3aから分かるように、グルコース(%):ガラクトース(%)が1:1条件である場合、L1タンパク質の容積収率は、細胞密度が増加するにつれて減少し、2:2条件である場合、細胞密度が増加するにつれて、L1タンパク質の容積収率が制限的に増加した。しかし、グルコース(%):ガラクトース(%)が3:3以上である条件では、細胞密度が増加するにつれてHPV 16 L1タンパク質の容積収率が比例して増加することを確認することができた(図3a及び図3b参照)。このような結果は、図2bの結果から確認されたように、全炭素源が6%以上の条件では、細胞当たりHPV 16 L1タンパク質発現量が停止期まで安定的に維持されるからであると認められる。したがって、HPV 16 L1タンパク質を高効率で発現させるために培地内の全炭素源が6%以上が要求されることを確認した。
グルコース(%):ガラクトース(%)=1:1、2:2、4:4でそれぞれ組成された培地で停止期まで培養した細胞内HPV 16 L1タンパク質を精製して回収されたL1タンパク質の純度を比較した。図5aの結果から分かるように、各条件でのHPV 16 L1タンパク質は、精製が完了した後、最小92%以上の純度を示した。また、150mL培養液で培養された細胞内HPV 16 L1タンパク質を精製し、その量を比較した結果、全炭素源の濃度が増加するにつれてHPV 16 L1タンパク質の回収量も比例して増加することを確認することができた(図5b参照)。このような結果は、培養液内の全炭素源の濃度がHPV 16 L1タンパク質の最終収率に重要な影響を及ぼすことを示す結果である。総合的に6%超過の全炭素源濃度条件では、L1タンパク質の発現だけでなく、最終回収されたHPV 16 L1タンパク質の収率も増加することを確認した。
HPV 16 L1タンパク質発現サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)をグルコース(%):ガラクトース(%)=7:1の条件で144時間培養した後、144、168、192時間にガラクトースを培地に添加した。ガラクトースは、培地で1.4%濃度になるように添加し、細胞は、216時間まで追加培養した。図6a及び図6bから分かるように、ガラクトースが添加された後、HPV 16 L1タンパク質の発現量が大きく増加することを確認した。これは、6%以上の炭素源条件の培養時に培養液に炭素源を追加する場合、L1タンパク質の発現量がさらに増加することができることを示す。
HPV 16 L1タンパク質発現サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)は、ガラクトース(%)=7:1の条件で96時間培養した後、ガラクトースを培地内に1.4%濃度になるように添加し、144時間まで追加培養した。細胞内のHPV 16 L1タンパク質を精製した結果、1.5mgのHPV 16 L1タンパク質を回収した(下記表1参照)。これは、グルコース(%):ガラクトース(%)=7:1条件で培養し、且つガラクトースの添加なしに培養した条件のL1タンパク質の量より2倍程度高い量である。このような結果は、全炭素源濃度6%以上の培養条件で培養した後、培地にガラクトースを添加すれば、HPV 16 L1タンパク質の発現量の増加が最終精製収率の増加につながることができることを示す。
HPV 16 L1タンパク質を発現するサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)を2%、4%、6%、8%全炭素源が含有された培地で停止期まで培養した。HPV 16 L1タンパク質の精製のために150mL培地の各培養条件で細胞を培養した。培養した細胞を600nmで測定時に単位面積当たり細胞密度が18〜38の数値を示した(図7)。図7には、2%、4%、6%、8%全炭素源含有条件で生産されたHPV 16 L1タンパク質を精製して最終回収したL1タンパク質の量を示した。上記説明された結果と同様に、6%以上の炭素源が含有された培地で培養時に最終精製されて回収されたHPV 16 L1タンパク質の量が大きく増加することを確認した。この結果は、高効率でHPV 16 L1を精製するために6%以上の炭素源が要求されることをさらに明確に示す。
実験方法
サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)のコドン(codon)使用に最適化されたHPV 18 L1タンパク質のDNA(MO)配列をBlue Heron Biotechnology(Blue Heron Biotechnology、Inc.、USA)に依頼して合成した。HPV 18 L1発現のための細胞株製作及び発現は、既存文献に公知された方法によって進行した[H.J.Kim、S.J.Lee、H.−J.Kim、J.Biotechnol.150(2010)31−36]。HPV 18 L1タンパク質の発現のための細胞培養と、HPV 18 L1タンパク質の精製、濃度測定及びSDS−PAGE及びウェストンブロットによるタンパク質確認は、上記実施例1のHPV 16 L1タンパク質の生産と同一の過程で行った。
1.炭素源の濃度によるHPV 18 L1タンパク質の容積収率比較
グルコース:ガラクトース=1:1にして全炭素源の濃度がそれぞれ2%、4%、6%、8%及び10%でそれぞれ組成した培地でHPV 18 L1タンパク質発現サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)を144時間培養し、停止期まで培養した後、細胞内で発現されたHPV 18 L1タンパク質を精製して回収したL1タンパク質の量を比較した。図9から分かるように、HPV 18 L1タンパク質の生産量は、全炭素源の濃度が6%以上てあるとき、大きく増加した。このような結果は、6%以上の炭素源が含まれた培地で培養する場合、HPV 18 L1タンパク質を高効率で発現させることができることを意味する。
図11aは、2%、4%、6%、8%濃度で全炭素源を含有する培地で停止期まで細胞を培養した後、HPV 18 L1タンパク質を精製して比較した結果である。HPV 18 L1タンパク質精製のために細胞を150mL培地容量で各炭素源濃度条件で停止期まで培養した。最終精製産物のHPV 18 L1タンパク質の確認のためにBradfordタンパク質定量法でタンパク質濃度を定量した後、500ngと250ngをSDS−PAGEゲルにローディングして確認した。最終精製産物の各培養条件別に定量されたタンパク質の総量は、2%全炭素源の場合、0.4mg、4%全炭素源の場合、0.4mg、6%全炭素源の場合、0.4mg、8%全炭素源の場合、0.4mgであって、同一のものと確認された。しかし、55kDaのHPV 18 L1タンパク質バンドは、6%と8%全炭素源条件だけで鮮明に確認された。
HPV 18 L1タンパク質発現サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)をグルコース(%):ガラクトース(%)=2:2及び7:1の比率で含有する培地で144時間まで培養した後、144時間の時点にガラクトースを培地内で1.4%の濃度になるように添加し、168時間の時点まで追加培養した。培養された2つの培養条件の細胞でHPV 18 L1タンパク質を精製し、精製されたL1タンパク質の量を比較した。その結果、グルコース(%):ガラクトース(%)=7:1条件で生産されたHPV 18 L1タンパク質だけが精製され、グルコース(%):ガラクトース(%)=2:2条件で生産されたHPV 18 L1タンパク質は、ほとんど精製されなかった(図11c及び表2参照)。このような結果は、7:1条件で生産されたHPV 18 L1タンパク質が精製して回収するのに良い形態であることを意味する。結論的に、全炭素源が6%以上に添加された培養条件で高いL1タンパク質の発現量を示し、全炭素源が高いグルコースの比率と低いガラクトースの比率で構成された培地で停止期まで培養した細胞内でL1タンパク質の精製収率が最も高いことを確認することができた。
実験方法
1.細胞株製作
サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)のコドン(codon)使用に最適化されたHPV 58 L1タンパク質のDNA(MO)配列をBlue Heron Biotechnology(Blue Heron Biotechnology、Inc.、USA)に依頼して合成した。HPV 58 L1 MO遺伝子のアップストリーム(upstream)とダウンストリーム(downstream)にHind IIIとSal Iサイトがそれぞれ含まれるように製作した。合成されたHPV 58 L1 MOは、YEG α−MCSのHind IIIとSal Iサイトとの間に挿入し、HPV 58 L1 MOを挿入したYEG α−MCSは、YEG α−HPV 58 L1 MOと命名した。サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)Y2805は、既存に公知された方法によってリチウムアセテート(lithium acetate)方法を使用して形質転換した[H.J.Kim、S.J.Lee、H.−J.Kim、J.Biotechnol.150(2010)31〜36]。HPV 58 L1タンパク質の発現のための細胞培養と、HPV 58 L1タンパク質の精製、濃度測定及びSDS−PAGE及びウェストンブロットによるタンパク質確認は、上記実施例1のHPV 16 L1タンパク質の生産と同一の過程を通じて行った。
1.炭素源濃度によるHPV58L1タンパク質の発現量比較
図12aは、2%、4%、6%、8%の全炭素源で組成された培地でHPV 58 L1タンパク質を発現するサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)を停止期まで培養した後、発現されたL1タンパク質の容積収率をウェスタンブロットで比較した結果である。HPV 16 L1とHPV 18 L1タンパク質発現態様と同様に、6%以上の炭素源を含有する培養培地条件で格段に高いL1タンパク質の発現を確認することができた。図12bは、図12aに示されたHPV 58 L1バンドの強度をグラフ化したものである。HPV 58 L1タンパク質発現量の相対比較のために8%炭素源条件のHPV 58 L1タンパク質のバンド強度を100%にして相対値を求めた。
炭素源濃度によるHPV 58 L1タンパク質の精製収率を比較するために、2%、4%、6%、8%の全炭素源を含有する培地で停止期まで細胞を培養した後、HPV 58 L1タンパク質を精製して比較した。各培地条件でグルコースとガラクトースの比率を1:1にした。細胞を150mLの培地で停止期(A600でOD値29〜34)まで培養し、HPV 58 L1タンパク質を精製した後、タンパク質の量をSDS−PAGE上で確認した(図14a)。このために培養細胞からHPV 58 L1タンパク質を精製した後、Bradford法でタンパク質を定量した。定量したタンパク質濃度に基づいてウェル当たり300ngと150ngのタンパク質をローディングした。その結果、各培養条件から精製されたHPV58L1タンパク質は、高い純度を示したが、2%炭素源条件で精製されたHPV 58 L1タンパク質の場合、非常に弱いバンド強度を示した。
[1] C.B. Woodman, S.I. Collins, L.S. Young, The natural history of cervical HPV infection: unresolved issues, Nat. Rev. Cancer 7 (2007) 11-22.
[2] National Cancer Institutue, Women's Health Report, Fiscal Years 2005-2006, NCI Women's Health Report FY2005-2006 (2007).
[3] T. Nyari, I. Cseh, M. Woodward, J. Szollosi, M. Bak, J. Deak, Hum. Reprod. 16 (2001) 2235-312 2237.
[4] T.A. Nyari, L. Kalmar, J. Deak, J. Szollosi, I. Farkas, L. Kovacs, Eur. J. Obstet. Gynecol.Reprod. Biol. 115 (2004) 99-100.
[5] M.J. Conway, C. Meyers, J. Dent. Res. 88 (2009) 307-317.
[6] B. Bishop, J. Dasgupta, M. Klein, R.L. Garcea, N.D. Christensen, R. Zhao, X.S. 14 Chen, J. Biol. Chem. 282 (2007) 31803-31811.
[7] I.H. Frazer, Gynecol. Oncol. 118 (2010) S8-11.
[8] V. Madrid-Marina, K. Torres-Poveda, G. Lopez-Toledo, A. Garcia-Carranca, Arch. Med. Res. 40 (2009) 471-477.
[9] M. Deschuyteneer, A. Elouahabi, D. Plainchamp, M. Plisnier, D. Soete, Y. Corazza, L. Lockman, S. Giannini, M. Deschamps, Hum. Vaccine 6 (2010) 407-419.
[10] National Cancer Institute, Human Papillomavirus (HPV) Vaccines,
[11] L. Schadlich, T. Senger, C.J. Kirschning, M. Muller, L. Gissmann, Vaccine 27 (2009) 1511-1522.
[12] G. Walsh, Biopharmaceutical benchmarks 2010, Nat Biotechnol 28 (2010) 917-924.
[13] H.J. Kim, S.Y. Kim, S.J. Lim, J.Y. Kim, S.J. Lee, H.-J. Kim, Protein Expr. Purif. 70 (2010) 68-74.
[14] M. Rubio-Texeira, FEMS Yeast Res. 5 (2005) 1115-1128.
[15] M.D. Kim, K.C. Han, H.A. Kang, S.K. Rhee, J.H. Seo, J. Biotechnol. 101 (2003) 81-87.
[16] J. van den Brink, M. Akeroyd, R. van der Hoeven, J.T. Pronk, J.H. de Winde, P. Daran-Lapujade, Microbiology 155 (2009) 1340-1350.
[17] E.S. Choi, J.H. Sohn, S.K. Rhee, Appl. Microbiol. Biot. 42 (1994) 587-594.
[18] J. Whang, J. Ahn, C.S. Chun, Y.J. Son, H. Lee, E.S. Choi, Process Biochem. 44 (2009) 1190-1192.
[19] N. Hadiji-Abbes, I. Borchani-Chabchoub, H. Triki, R. Ellouz, A. Gargouri, R. Mokdad-Gargouri, Protein Expr. Purif. 66 (2009) 131-137.
[20] J.C. Cook, J.G. Joyce, H.A. George, L.D. Schultz, W.M. Hurni, K.U. Jansen, R.W. Hepler, C. Ip, R.S. Lowe, P.M. Keller, E.D. Lehman, Protein Expr. Purif. 17 (1999) 477-484.
[21] S.N. Kim, H.S. Jeong, S.N. Park, H.-J. Kim, J. Virol. Methods 139 (2007) 24-30.
[22] D.T. Buonamassa, C.E. Greer, S. Capo, T.S. Yen, C.L. Galeotti, G. Bensi, Virology 293 (2002) 335-344.
[23] H.J. Kim, S.J. Lee, H.-J. Kim, J. Biotechnol. 150 (2010) 31-36.
[24] U.K. Laemmli, Nature 227 (1970) 680-685.
[25] M.A. Park, H.J. Kim, H.-J. Kim, Protein Expr. Purif. 59 (2008) 175-181.
[26] S.Y. Kim, H.J. Kim, H.-J. Kim, Protein Expr. Purif. 76 (2011) 103-108.
[27] R.Z. Rizk, N.D. Christensen, K.M. Michael, M. Muller, P. Sehr, T. Waterboer, M. Pawlita, J. Gen. Virol. 89 (2008) 117-129.
[28] L. Shi, G. Sanyal, A. Ni, Z. Luo, S. Doshna, B. Wang, T.L. Graham, N. Wang, D.B. Volkin, J. Pharm. Sci. 94 (2005) 1538-1551.
[29] J.J. Carter, G.C. Wipf, S.F. Benki, N.D. Christensen, D.A. Galloway, J. Virol. 77 (2003) 11625-11632.
[30] B. Balasundaram, S. Harrison, D.G. Bracewell, Trends Biotechnol. 27 (2009) 477-485.
[31] C.B. Buck, C.D. Thompson, Y.Y. Pang, D.R. Lowy, J.T. Schiller, J. Virol. 79 (2005) 2839-2846.
[32] M.J. Conway, S. Alam, E.J. Ryndock, L. Cruz, N.D. Christensen, R.B. Roden, C. Meyers, J. Virol. 83 (2009) 10515-10526.
[33] S.Y. Li, R. Srivastava, S.L. Suib, Y. Li, R.S. Parnas, Bioresour. Technol. 102 (2011) 4241-397 4250.
[34] C.A. Cardona, O.J. Sanchez, Bioresour. Technol. 98 (2007) 2415-2457.
[35] C. Meyers, M.G. Frattini, J.B. Hudson, L.A. Laimins, Science 257 (1992) 971-973.
[36] M.A. Ozbun, C. Meyers, J. Virol. 71 (1997) 5161-5172.
[37] H.C. Selinka, T. Giroglou, T. Nowak, N.D. Christensen, M. Sapp, J. Virol. 77 (2003) 12961-12967.
[38] L. de Witte, Y. Zoughlami, B. Aengeneyndt, G. David, Y. van Kooyk, L. Gissmann, T.B. Geijtenbeek, Immunobiology 212 (2007) 679-691.
[39] D. Opalka, K. Matys, P. Bojczuk, T. Green, R. Gesser, A. Saah, R. Haupt, F. Dutko, M.T. Esser, Clin. Vaccine Immunol. 17 (2010) 818-827.
[40] C. Schellenbacher, R. Roden, R. Kirnbauer, J. Virol. 83 (2009) 10085-10095.
[41] J.Y. Park, H.M. Pyo, S.W. Yoon, S.Y. Baek, S.N. Parz, C.J. Kim, H. Poo, J. Microbiol. 40 (2002) 313-318.
Claims (9)
- 次の段階を含むヒトパピローマウイルス(HPV)L1タンパク質の生産収率を向上させる方法:
(a)全炭素源の濃度が6%超過14%以下である培地を用意する段階;及び
(b)上記用意した培地にヒトパピローマウイルス(HPV)L1タンパク質発現細胞を接種して96時間以上培養する段階;
ここで、該全炭素源が、グルコース及びガラクトースであり、
該HPV L1タンパク質発現細胞が、HPV L1タンパク質を発現するベクターで形質転換された酵母細胞である。 - 上記HPV L1タンパク質は、HPVタイプ16、HPVタイプ18またはHPVタイプ58のL1タンパク質であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記段階(a)で、培地の全炭素源の濃度が7〜14%であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記段階(a)で、培地の全炭素源の濃度が8〜14%であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記酵母細胞は、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)またはピキア パストリス(Pichia pastoris)であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記HPV L1タンパク質発現細胞が、A600測定時のOD値=30〜47まで培養されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記段階(b)後に、培地に炭素源をさらに添加して追加培養する段階(c)を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記培地にさらに添加する炭素源は、ガラクトースであることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 上記追加培養は、24時間以上であることを特徴とする請求項7に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20110057748 | 2011-06-15 | ||
KR10-2011-0057748 | 2011-06-15 | ||
PCT/KR2012/004667 WO2012173390A2 (ko) | 2011-06-15 | 2012-06-13 | 인유두종바이러스 l1 단백질의 생산 수율을 향상시키는 방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014519339A JP2014519339A (ja) | 2014-08-14 |
JP6001064B2 true JP6001064B2 (ja) | 2016-10-05 |
Family
ID=47357597
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014515747A Active JP6001064B2 (ja) | 2011-06-15 | 2012-06-13 | ヒトパピローマウイルスl1タンパク質の生産収率を向上させる方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8871466B2 (ja) |
EP (1) | EP2722389B1 (ja) |
JP (1) | JP6001064B2 (ja) |
KR (1) | KR101458270B1 (ja) |
CN (1) | CN103717741B (ja) |
AU (1) | AU2012270418B2 (ja) |
BR (1) | BR112013032338B1 (ja) |
CA (1) | CA2839427C (ja) |
CL (1) | CL2013003545A1 (ja) |
MX (1) | MX348241B (ja) |
WO (1) | WO2012173390A2 (ja) |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL117459A (en) * | 1995-03-22 | 2005-11-20 | Merck & Co Inc | Dna encoding human papillomavirus type 18 |
IL117591A0 (en) * | 1995-03-30 | 1996-07-23 | Merck & Co Inc | Synthetic DNA encoding human papillomavirus type 11 L1 protein |
MY140664A (en) * | 2003-09-29 | 2010-01-15 | Merck Sharp & Dohme | Optimized expression of hpv 45 l1 in yeast |
MY139500A (en) * | 2003-11-12 | 2009-10-30 | Merck Sharp & Dohme | Optimized expression of hpv 58 l1 in yeast |
KR100545563B1 (ko) * | 2003-12-23 | 2006-01-24 | 충남대학교산학협력단 | 재조합 단백질 생산 능력이 향상된 사카로마이세스세레비지애 변이주 |
KR100595864B1 (ko) | 2004-01-27 | 2006-06-30 | 재단법인 목암생명공학연구소 | 형질전환 사카로마이세스 세레비지애 균주 및 이를 이용한lk8 단백질의 생산방법 |
US8298787B2 (en) * | 2006-06-20 | 2012-10-30 | Mogam Biotechnology Research Institute | Methods for enhancing a secretion efficiency of recombinant foreign protein in yeast expression system |
KR100959145B1 (ko) * | 2008-03-21 | 2010-05-25 | 중앙대학교 산학협력단 | 인유두종바이러스 바이러스 유사 입자의 생산 및 정제 방법 |
AU2009348078B2 (en) * | 2009-06-19 | 2013-03-14 | Eyegene Inc. | Vaccine for cervical cancer |
-
2012
- 2012-06-13 US US14/126,091 patent/US8871466B2/en active Active
- 2012-06-13 JP JP2014515747A patent/JP6001064B2/ja active Active
- 2012-06-13 WO PCT/KR2012/004667 patent/WO2012173390A2/ko active Application Filing
- 2012-06-13 MX MX2013014899A patent/MX348241B/es active IP Right Grant
- 2012-06-13 CA CA2839427A patent/CA2839427C/en active Active
- 2012-06-13 AU AU2012270418A patent/AU2012270418B2/en active Active
- 2012-06-13 BR BR112013032338-8A patent/BR112013032338B1/pt active IP Right Grant
- 2012-06-13 CN CN201280029590.XA patent/CN103717741B/zh active Active
- 2012-06-13 EP EP12801099.8A patent/EP2722389B1/en active Active
- 2012-06-13 KR KR1020120063107A patent/KR101458270B1/ko active IP Right Grant
-
2013
- 2013-12-10 CL CL2013003545A patent/CL2013003545A1/es unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2722389A2 (en) | 2014-04-23 |
US20140186888A1 (en) | 2014-07-03 |
CN103717741A (zh) | 2014-04-09 |
US8871466B2 (en) | 2014-10-28 |
EP2722389B1 (en) | 2018-03-07 |
CN103717741B (zh) | 2016-04-13 |
MX2013014899A (es) | 2014-02-17 |
WO2012173390A2 (ko) | 2012-12-20 |
KR20120138683A (ko) | 2012-12-26 |
BR112013032338B1 (pt) | 2021-04-20 |
MX348241B (es) | 2017-06-01 |
WO2012173390A3 (ko) | 2013-03-14 |
CA2839427C (en) | 2016-09-27 |
BR112013032338A8 (pt) | 2018-02-06 |
CA2839427A1 (en) | 2012-12-20 |
AU2012270418B2 (en) | 2015-08-13 |
BR112013032338A2 (pt) | 2016-12-20 |
AU2012270418A1 (en) | 2014-01-16 |
KR101458270B1 (ko) | 2014-11-10 |
EP2722389A4 (en) | 2015-01-21 |
CL2013003545A1 (es) | 2014-07-11 |
JP2014519339A (ja) | 2014-08-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3056502B2 (ja) | ヒトパピローマウイルス16型のe7タンパク質上の免疫原性領域 | |
EP2154147B1 (en) | A truncated l1 protein of human papillomavirus 16 | |
Finnen et al. | Interactions between papillomavirus L1 and L2 capsid proteins | |
Kim et al. | One-step chromatographic purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae | |
CA2543928A1 (en) | Optimized expression of hpv 58 l1 in yeast | |
WO2008098484A1 (fr) | Protéines l1 recombinantes du papillomavirus et leurs utilisations | |
NZ545834A (en) | Optimized expression of HPV 45 L1 in yeast | |
Chen et al. | Human papillomavirus L1 protein expressed in Escherichia coli self-assembles into virus-like particles that are highly immunogenic | |
Kim et al. | Optimizing the secondary structure of human papillomavirus type 16 L1 mRNA enhances L1 protein expression in Saccharomyces cerevisiae | |
WO2024088087A1 (zh) | 人乳头瘤病毒hpv68 l1蛋白的表达和类病毒样颗粒及其制备方法 | |
US9364529B2 (en) | Truncated L1 protein of human papillomavirus type 18 | |
JP2022540951A (ja) | キメラパピローマウイルスl1タンパク質 | |
Kim et al. | Codon optimization of the human papillomavirus type 58 L1 gene enhances the expression of soluble L1 protein in Saccharomyces cerevisiae | |
EP2223933B1 (en) | Genes encoding major capsid protein l1 of human papilloma viruses | |
Kim et al. | The composition of the carbon source and the time of cell harvest are critical determinants of the final yield of human papillomavirus type 16 L1 protein produced in Saccharomyces cerevisiae | |
WO2016026401A1 (zh) | 增强hpv抗原表位肽免疫原性的方法及类病毒颗粒、颗粒制备方法与应用 | |
JP6001064B2 (ja) | ヒトパピローマウイルスl1タンパク質の生産収率を向上させる方法 | |
KR100959145B1 (ko) | 인유두종바이러스 바이러스 유사 입자의 생산 및 정제 방법 | |
CN101440371B (zh) | 一种16型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白l1基因 | |
CN113549634A (zh) | 编码可溶性hpv58 l1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用 | |
CN114174320A (zh) | 嵌合的人乳头瘤病毒18型l1蛋白 | |
RU2489481C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА E7-HSP70 И ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ | |
CN114127093A (zh) | 嵌合的人乳头瘤病毒45型l1蛋白 | |
CN114127095A (zh) | 嵌合的人乳头瘤病毒11型l1蛋白 | |
CN116375816B (zh) | 一种人乳头瘤病毒56型l1蛋白突变体及减少重组蛋白降解的方法及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20140430 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20140430 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150317 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150616 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20150617 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151007 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160106 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160324 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160725 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20160801 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160825 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160831 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6001064 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |