JP2022540951A - キメラパピローマウイルスｌ１タンパク質 - Google Patents
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Abstract
本発明は、キメラパピローマウイルスL1タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド、並びにHPVウイルス様粒子及びその調製方法に関する。前記キメラパピローマウイルスL1タンパク質は、第1のパピローマウイルス型のL1タンパク質に由来するN末端断片であって、HPV型に対応するL1タンパク質の免疫原性を維持する前記N末端断片と、第2のパピローマウイルス型のL1タンパク質に由来し、発現量及び溶解度について、その他の型のL1タンパク質のものと比較して、それより良好な特性を有するC末端断片とを含み、前記キメラパピローマウイルスL1タンパク質は、HPV型に対応するL1タンパク質の免疫原性を有する。前記キメラパピローマウイルスLタンパク質は、より高い発現量及びより良好な溶解度を有し、そしてワクチンの大量生産に使用可能である。
Description
本発明は、パピローマウイルス(HPV)L1タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドに関し、またHPVウイルス様粒子及びその調製方法にも関する。
パピローマウイルス(PV)は、パピローマウイルス科(papillomaviridae)に属し、そしてヒト、ウシ、イヌ、及びウサギにおいて乳頭腫を引き起こす。そのメンバーの1つであるヒトパピローマウイルス(HPV)は、非エンベロープDNAウイルスである。このウイルスのゲノムは、サイズ約7.2～8kbの二本鎖閉環状DNAであり、8つのオープンリーディングフレームを有するが、それらはその機能に基づき、3つの領域:(1)ウイルスの複製、転写、及びトランスフォーメーションと関連する合計6つの非構造タンパク質E1、E2、E4～E7をコードする、約4.5kbの前期領域(E);(2)メジャーカプシドタンパク質L1及びマイナーカプシドタンパク質L2をコードする、約2.5kbの後期領域(L);(3)長さ約800～900bpであり、そしてタンパク質のいずれもコードしない、DNAの複製及び発現調節エレメントとして働く、L領域の末端部とE領域の開始部の間に位置する長尺制御領域(LCR)に分割され得る。
L1タンパク質及びL2タンパク質は、HPV感染サイクルの後期に合成される。L1タンパク質は、メジャーカプシドタンパク質であり、また55～60kDaの分子量を有する。L2タンパク質は、マイナーカプシドタンパク質である。72個のL1タンパク質ペンタマーは、正二十面体HPV粒子(直径45～55nm)の外殻を形成し、それが閉環状二本鎖DNAを内包する。L2タンパク質はL1タンパク質の内側に位置する(Structure of Small Virus-like Particles Assembled from the L1 Protein of Human Papillomavirus 16 Chen, X.S.、R. L. Garcea、Mol.Cell.5(3):557～567頁、2000年)。
PVゲノムにおいて最も保存された遺伝子であるL1タンパク質のORFは、新しいPV型を同定するのに使用可能である。新しいPV型は、その全ゲノムがクローン化され、そしてそのL1 ORF DNA配列が最も近い公知のPV型と10%を超えて異なる場合に同定される。2%～10%の差異を有する相同性は異なるサブタイプとして定義され、そして2%未満の差異は同一サブタイプの異なるバリアントとして定義される(E.-M. de Villiersら/Virology 324 (2004) 17～27頁)。
HPV感染症の後期段階では、細胞質内の新たに合成されたL1タンパク質が、最終的に分化したケラチンの核に輸送され、L2タンパク質と共に、複製されたHPVゲノムDNAをパッケージングして感染性ウイルスを形成する(Nelson, L.Mら、2002年、Nuclear import strategies of high risk HPV16 L1 major capsid protein. J. Biol. Chem. 277:23958～23964頁)。これは、L1タンパク質の核内移行が、HPV感染症及び生成において非常に重要な役割を果たしていることを示唆する。ウイルスが核進入する能力は、HPV L1タンパク質のC末端における核局在化シグナル(NLS)により決定されるが、NLSは塩基性アミノ酸が多量に存在することにより特徴づけられる(Garcia-Bustos, J.ら、1991年、Nuclear protein localization. Biochimica et Biophysica Acta 1071:83～101頁)。
15の高リスク(HR)HPV型が、子宮頸部、肛門、ペニス、膣、外陰、及び中咽頭のがんを引き起こすおそれがあり、とりわけHPV-16及びHPV-18が、がんの最も一般的な原因であり、子宮頸がんのおよそ70%を占め、その他のHR-HPV型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、及び82型)が残りを引き起こす。HPV-16は、HPV陽性中咽頭がん(OPC)のおよそ95%を占める。遷延性の低リスク遺伝子型であるHPV-6及びHPV-11は、ほとんどの肛門性器疣贅及び呼吸器乳頭腫においてその原因となるが、しかしがんとはほぼ無関係である(Human Papillomavirus in Cervical Cancer and Oropharyngeal Cancer:One Cause, Two Diseases Tara A. Bermanand John T. Schiller、PhD2 Cancer 2017年;123:2219～29頁)。
L1タンパク質は、ポックスウイルス、バキュロウイルス、又は酵母系により組換え発現可能であり、次に自己組織化して、ウイルスカプシドに類似したおよそ72個のL1タンパク質を含有するウイルス様粒子(VLP)を形成する。VLPは無兆候である。VLPは接種動物において中和抗体を誘発し、そして実験動物を、後続する感染性ウイルスによる攻撃から保護する。したがって、VLPはパピローマウイルスワクチンに対する優れた候補のように見える(Structure of Small Virus-like Particles Assembled from the L1 Protein of Human Papillomavirus 16 Chen, X.S.、R. L. Garcea、Mol. Cell. 5(3):557～567頁、2000年)。
二価の組換えHPVワクチンである、Glaxo社のCERVARIX(登録商標)は、HPV16型の組換えL1タンパク質及びHPV18型組換えL1タンパク質を含有する。L1タンパク質は、夜行性の蛾(イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni))の昆虫細胞内で、組換えバキュロウイルス発現ベクター系を発現させることにより得られる。L1タンパク質は、自己組織化して、9～25歳の女性における、HPV16型及び18型により引き起こされたin situの子宮頸がん、グレード2又は3の子宮頸部上皮内新生物、及び腺癌、並びにグレード1子宮頸部上皮内新生物(発癌性)を予防するためのウイルス様粒子となる(https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProducts/UCM186981.pdf)。
GARDASIL(登録商標)は、9～26歳の少女及び女性において、HPV6、11、16、及び18型により引き起こされた子宮頸がん、性器疣贅(尖圭コンジローマ)、及び前がん性又は増殖性の異常な病変を予防するための、並びに9～26歳の少年及び男性において、HPV6、11、16、及び18型により引き起こされた肛門がん、性器疣贅(尖圭コンジローマ)、及び前がん性又は異常な発達性病変を予防するための、Merck社から販売されているヒトパピローマウイルス四価(6、11、16、及び18型)組換えワクチンである(https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/vaccines/gardasil)。
GARDASIL(登録商標)9は、HPV6、11、16、18、31、33、45、52、及び58型のL1タンパク質のウイルス様粒子を含有する、Merck社から販売されている九価組換えヒトパピローマウイルスワクチンであり、L1タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の発酵、及びVLPへの自己組織化により生成される。これは、9～45歳の少女及び女性において、HPV16、18、31、33、45、52、及び58型により引き起こされた子宮頸がん、外陰部がん、腟がん、及び肛門がん、HPV6及び11型により引き起こされた性器疣贅(尖圭コンジローマ)、並びにHPV6、11、16、18、31、33、45、52、及び58型により引き起こされた前がん性又は増殖性の異常を予防するために、そして9～45歳の少年及び男性において、HPV16、18、31、33、45、52、及び58型により引き起こされた肛門がん、HPV6及び11型により引き起こされた性器疣贅(尖圭コンジローマ)、並びにHPV6、11、16、18、31、33、45、52、及び58型により引き起こされた前がん性又は発達性の異常な病変を予防するために使用される(https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/vaccines/gardasil-9)。
GARDASIL(登録商標)9の指示書では、子宮頸がんの約70%がHPV16及び18型を原因とし、症例の残りの20%が31、33、45、52、及び58型に帰属されると公表しており、したがってGARDASIL(登録商標)9は、子宮頸がんの90%を予防する(https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProducts/ucm426445.htm)。
ウイルス様粒子の工業生産はHPVワクチン開発にとって重要である。ウイルス様粒子を生産するための一般的な系は、真核生物発現系と原核生物発現系とに主に分類される。
一般的に使用される真核生物発現系として、ポックスウイルス発現系、昆虫バキュロウイルス発現系、及び酵母菌発現系が挙げられる。真核生物発現系内で発現するHPV L1タンパク質は、その天然の立体構造がそれほど破壊されないので、ウイルス様粒子に自発的に組織化し得るが、しかしその収率は低い。原核生物発現系、主に大腸菌(E.coli)発現系内で発現するHPV L1タンパク質の収率は高いものの、主に封入体の形態であり、この形態のタンパク質は容易に精製することができず、したがって生産プロセスは複雑化する。
したがって、高収率のHPVウイルス様粒子を得る必要性がなおも存在する。
Structure of Small Virus-like Particles Assembled from the L1 Protein of Human Papillomavirus 16 Chen, X.S.、R. L. Garcea、Mol.Cell.5(3):557～567頁、2000年
E.-M. de Villiersら/Virology 324 (2004)17～27頁
Nelson, L.Mら、2002年、nuclear import strategies of high risk HPV16 L1 major capsid protein. J. Biol. Chem. 277:23958～23964頁
Garcia-Bustos, J.ら、1991年、Nuclear protein localization. Biochimica et Biophysica Acta 1071:83～101頁
Human Papillomavirus in Cervical Cancer and Oropharyngeal Cancer:One Cause, Two Diseases Tara A. Bermanand John T. Schiller、PhD2 Cancer 2017年;123:2219～29頁
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https://www.uniprot.org
Epitope design of L1 protein for vaccine production against Human Papilloma Virus types 16 and 18, Bioinformation 13(3):86～93頁、2017年3月
Chimeric papilloma virus-like particles expressing a foreign epitope on capsid surface loops、Journal of General Virology (2001) 82 2799～2804頁
Crystal Structures OF Four type of Human Papillomavirus L1 Capsid Proteins UNDERSTANDING THE SPECIFICITY OF NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES、The Journal OF Biological Chemistry、282、31803～31811頁
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Jun Yangら、Predicting the Nuclear Localization Signals of 107 Types of HPV L1 Proteins by Bioinformatic Analysis, Genomics, Proteomics & Bioinformatics Volume 4、Issue 1、 2006年、34～41頁
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Pastrana D V、Buck C B、Pang Y S、Thompson C D、Castle P E、FitzGerald P C、Kjaer S K、Lowy D R、Schiller J T. Reactivity of human sera in a sensitive, high-throughput pseudovirus-based papilloma virus neutralization assay for HPV16 and HPV18. [J] Virology 2004年、321:205-216頁
1つの態様では、本発明は、
a.第1のパピローマウイルス型のL1タンパク質に由来するN末端断片であって、対応するヒトパピローマウイルス型のL1タンパク質の免疫原性を維持する前記N末端断片と、
b.第2のパピローマウイルス型のL1タンパク質に由来するC末端断片であって、第2のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質が、その他の型のL1タンパク質と比較して、それより良好な発現レベル及び溶解度を有するC末端断片と
をそのN末端からC末端方向に含むキメラパピローマウイルスL1タンパク質であって、
第1のパピローマウイルス型のL1タンパク質の免疫原性を有する、キメラパピローマウイルスL1タンパク質を提供する。
a.第1のパピローマウイルス型のL1タンパク質に由来するN末端断片であって、対応するヒトパピローマウイルス型のL1タンパク質の免疫原性を維持する前記N末端断片と、
b.第2のパピローマウイルス型のL1タンパク質に由来するC末端断片であって、第2のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質が、その他の型のL1タンパク質と比較して、それより良好な発現レベル及び溶解度を有するC末端断片と
をそのN末端からC末端方向に含むキメラパピローマウイルスL1タンパク質であって、
第1のパピローマウイルス型のL1タンパク質の免疫原性を有する、キメラパピローマウイルスL1タンパク質を提供する。
別の態様では、本発明は、キメラパピローマウイルスL1タンパク質を含むパピローマウイルス様粒子を提供する。
別の態様では、本発明は、これまでに記載したようなパピローマウイルス様粒子及びアジュバントを含む、パピローマウイルス関連の疾患又は感染症を予防するための免疫原性組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、キメラパピローマウイルスL1タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
更なる態様では、本発明は、キメラパピローマウイルスL1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
更なる態様では、本発明は、キメラパピローマウイルスL1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むバキュロウイルスを提供する。
別の態様では、本発明は、これまでに記載したような前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、又は前記バキュロウイルスを含む宿主細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、これまでに記載したような宿主細胞を培養して前記キメラパピローマウイルスL1タンパク質を発現させ、及びウイルス様粒子に組織化させる工程、そして前記パピローマウイルス様粒子を精製する工程を含む、パピローマウイルス様粒子を調製する方法を提供する。
特定の実施形態
1つの態様では、本発明は、
a.対応するヒトパピローマウイルス型のL1タンパク質に由来するN末端断片であって、対応する型のHPVのL1タンパク質の免疫原性を維持する前記N末端断片と、
b.第2のパピローマウイルス型のL1タンパク質に由来するC末端断片であって、第2のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質が、その他の型のL1タンパク質と比較して、それより良好な発現レベル及び溶解度を有するC末端断片と
をそのN末端からC末端方向に含むキメラパピローマウイルスL1タンパク質であって、
第1のパピローマウイルス型のL1タンパク質の免疫原性を有する、キメラパピローマウイルスL1タンパク質を提供する。
1つの態様では、本発明は、
a.対応するヒトパピローマウイルス型のL1タンパク質に由来するN末端断片であって、対応する型のHPVのL1タンパク質の免疫原性を維持する前記N末端断片と、
b.第2のパピローマウイルス型のL1タンパク質に由来するC末端断片であって、第2のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質が、その他の型のL1タンパク質と比較して、それより良好な発現レベル及び溶解度を有するC末端断片と
をそのN末端からC末端方向に含むキメラパピローマウイルスL1タンパク質であって、
第1のパピローマウイルス型のL1タンパク質の免疫原性を有する、キメラパピローマウイルスL1タンパク質を提供する。
1つの実施形態では、前記N末端断片は、第1のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質の天然配列のC末端を、そのα5領域内の任意のアミノ酸位置でトランケートすることにより得られた断片、及びそれと少なくとも98%の同一性を有する断片であり、前記C末端断片は、第2のパピローマウイルス型のL1タンパク質の天然配列のN末端を、そのα5領域内の任意のアミノ酸位置でトランケートすることにより得られた断片、並びに該断片に対する更なる変異、欠失、及び/又は付加により得られた機能的バリアントである。
別の実施形態では、前記N末端断片は、前記第1のパピローマウイルス型のL1タンパク質の天然配列のC末端を、そのα5領域内の任意のアミノ酸位置でトランケートすることにより得られた断片と、少なくとも98.5%、99%、99.5%、又は100%の同一性を有する。
1つの実施形態では、前記C末端断片は、1つの又は複数の核局在化配列を含む。
1つの実施形態では、前記パピローマウイルスL1タンパク質はHPVL1タンパク質である。
1つの実施形態では、第2のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質は、HPV1、2、3、4、6、7、10、11、13、16、18、22、26、28、31、32、33、35、39、42、44、45、51、52、53、56、58、59、60、63、66、68、73、又は82型のL1タンパク質から選択される。
好ましくは、第2のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質は、HPV16、28、33、59、又は68型のL1タンパク質から選択される。
より好ましくは、第2のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質は、HPV33型又はHPV59型のL1タンパク質から選択される。
1つの実施形態では、第2のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質は、HPV33型L1タンパク質であり、前記C末端断片は配列番号2、又はアミノ酸m1個の長さを有する断片、好ましくは配列番号2の1～m1位(m1は8～26の整数である)のアミノ酸をカバーする断片であり、或いは前記C末端断片は配列番号132、又はアミノ酸m2個の長さを有する断片、好ましくは配列番号132の1～m2位(m2は13～31の整数である)のアミノ酸をカバーする断片である。
1つの実施形態では、HPV33型L1タンパク質のC末端断片は核局在化配列を有する。別の実施形態では、HPV33型L1タンパク質のC末端断片は、2つの核局在化配列を有する。いくつかの実施形態では、キメラパピローマウイルスL1タンパク質は、HPV33型L1タンパク質の1つ又は複数のC末端断片を含む。HPV33型L1タンパク質の前記複数のC末端断片は、同一であってもまた異なってもよい。1つの実施形態では、配列番号2のアミノ酸番号7～8(KR)を有するアミノ酸配列、及びアミノ酸番号20～23(KRKK)を有するアミノ酸配列は、HPV33型L1タンパク質のC末端断片の核局在化配列である。
別の実施形態では、第2のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質はHPV59型L1タンパク質であり、前記C末端断片は、配列番号13、又はアミノ酸n個の長さを有する断片、好ましくは配列番号13の1～n位(nは16～38の整数である)のアミノ酸をカバーする断片である。
1つの実施形態では、HPV59型L1タンパク質のC末端断片は、核局在化配列を有する。別の実施形態では、HPV59型L1タンパク質のC末端断片は、2つの核局在化配列を有する。いくつかの実施形態では、キメラパピローマウイルスL1タンパク質は、HPV59型L1タンパク質の1つの又は複数のC末端断片を含む。前記HPV59型L1タンパク質の複数のC末端断片は、同一であってもまた異なってもよい。
1つの実施形態では、第1のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質は、HPV6、11、16、18、31、35、39、45、51、52、56、又は58型のL1タンパク質から選択される。
1つの実施形態では、前記N末端断片のC末端は、前記C末端断片のN末端と、直接又はリンカーを介して接続している。
リンカーは、前記N末端断片の免疫原性に影響を及ぼさず、且つタンパク質の発現レベル又は溶解度に影響を及ぼさない。1つの実施形態では、前記N末端断片及び前記C末端断片は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸を含むリンカーを介して接続している。1つの実施形態では、リンカーは人工的配列である。別の実施形態では、リンカーは、HPV L1タンパク質内の天然の配列である。別の実施形態では、リンカーは、HPV33型L1タンパク質の部分配列であり得る。別の実施形態では、リンカーは、HPV59型L1タンパク質の部分配列であり得る。
1つの実施形態では、前記N末端断片のC末端が前記C末端断片のN末端に接続されると、連続するアミノ酸配列RKFLが、接続ポイントから、±4個のアミノ酸位置の範囲内に存在し、好ましくは連続するアミノ酸配列LGRKFLが、接続ポイントから、±6個のアミノ酸位置の範囲内に存在する。
1つの態様では、本発明は、これまでに記載したようなキメラパピローマウイルスL1タンパク質を含む、パピローマウイルス様粒子を提供する。1つの実施形態では、パピローマウイルス様粒子は、HPVウイルス様粒子であり、また1つの実施形態では、HPVウイルス様粒子は、前記キメラHPVL1タンパク質の72個のペンタマーを含む正二十面体である。1つの実施形態では、HPVウイルス様粒子は、正しく形成されたジスルフィド結合を有し、したがって良好な天然立体構造を有する。1つの実施形態では、HPVウイルス様粒子は、in vivo発現系において自己組織化する。
1つの態様では、本発明は、これまでに記載したようなパピローマウイルス様粒子及びアジュバントを含む、パピローマウイルス関連の疾患又は感染症を予防するための免疫原性組成物を提供する。前記予防は処置とみなすことができ、それらは交換可能に使用可能である。
1つの態様では、上記免疫原性組成物は対象に投与される。1つの実施形態では、対象はヒトである。1つの実施形態では、対象はウサギである。1つの実施形態では、対象はイヌである。
1つの態様では、本発明は、これまでに記載したようなキメラパピローマウイルスL1タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。1つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、いくつかの種類の発現系に対するコドン最適化ポリヌクレオチドである。1つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、昆虫バキュロウイルス発現系に対するコドン最適化ポリヌクレオチドである。
1つの態様では、本発明は、これまでに記載したようなポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。1つの実施形態では、ベクターはバキュロウイルスベクターである。1つの実施形態では、ベクターはバキュロウイルス発現系用のトランスファーベクターであり得る。別の実施形態では、ベクターはバキュロウイルス発現系のための発現ベクターであり得る。別の実施形態では、ベクターはバキュロウイルス発現系用の組換えベクターであり得る。
1つの態様では、本発明は、これまでに記載したようなポリヌクレオチドを含むバキュロウイルスを提供する。
1つの態様では、本発明は、これまでに記載したようなポリヌクレオチド、ベクター、又はバキュロウイルスを含む宿主細胞を提供する。1つの実施形態では、宿主細胞は昆虫細胞であり、好ましくは、前記昆虫細胞は、Sf9細胞、Sf21細胞、Hi5細胞、及びS2細胞から選択される。
1つの態様では、本発明は、これまでに記載したようなパピローマウイルス様粒子を調製するための方法であって、これまでに記載したような宿主細胞を培養してウイルス様粒子に組織化する前記キメラパピローマウイルスL1タンパク質を発現させる工程、及び前記パピローマウイルス様粒子を精製する工程を含む方法を提供する。
1つの実施形態では、宿主細胞は昆虫細胞である。1つの実施形態では、宿主細胞はHi5細胞である。1つの実施形態では、キメラパピローマL1タンパク質は、宿主細胞において、HPVウイルス様粒子に自己組織化するキメラHPVL1タンパク質である。1つの実施形態では、キメラHPVL1タンパク質は、宿主細胞においてHPVウイルス様粒子(前記キメラHPVL1タンパク質の72個のペンタマーを含む正二十面体を有する)に自己組織化する。1つの実施形態では、HPVウイルス様粒子は、正しく形成されたジスルフィド結合を有し、したがって良好な天然立体構造を有する。
1つの実施形態では、精製はカチオン交換クロマトグラフィーを使用して実施される。1つの実施形態では、精製は、強カチオン交換クロマトグラフィーを使用して実施される。別の実施形態では、精製は、弱カチオン交換クロマトグラフィーを使用して実施される。1つの実施形態では、精製は、複数のカチオン交換クロマトグラフィーを併用して実施される。1つの実施形態では、精製は、HS強カチオン交換クロマトグラフィーを使用して実施される。別の実施形態では、精製は、MMAイオン交換クロマトグラフィーを使用して実施される。別の実施形態では、精製は、HS-MMA 2工程クロマトグラフィーを使用して実施される。
真核生物発現系により発現されるパピローマウイルスL1タンパク質は、自発的に組織化してウイルス様粒子となることができるが、しかし発現レベルが低いことから、大量生産には適さない。
各HPV型のL1タンパク質の配列は、https://www.uniprot.orgから容易に得ることができる。所与のHPV型について、L1タンパク質は異なる系統に由来してもよく、したがってそのアミノ酸配列は複数のバージョンを有し得るが、天然配列の任意のバージョンが本発明において使用可能である。本発明の概念及びデザイン構築期間中に使用される所与の型のHPV L1タンパク質の配列は、下記の実施例で使用される配列とは相違し得る可能性もあるが、しかしそのような相違は、本発明者らの決定及び結論に影響を及ぼさない。
L1タンパク質のC末端には主要な中和性抗原エピトープが含まれないことが、当業者により一般的に認められており、したがってHPV L1タンパク質のC末端をトランケートすることにより発現を増加させる試みがなされており、例えばHPV16 L1タンパク質のC末端において、アミノ酸1～34個、好ましくはアミノ酸26個がトランケートされているGlaxo社の米国特許第6361778B1号では、VLPの収率が数倍、好ましくは少なくとも10倍、特に約10～100倍増加することが記載されている。これに着想を得て、本発明者らは、HPV16 L1タンパク質のC末端からアミノ酸31個をトランケートすることを試み、そしてこのトランケートされたタンパク質をHPV16 L1(1～474)と命名した。タンパク質は高レベルの発現を有するが、難溶性であり、また抽出及び精製が困難である(比較例を参照)。
このトランケーションに起因するタンパク質の難溶性は、C末端に位置する核局在化配列の欠失に起因する可能性があるが、しかし本発明はこの憶測に拘泥しない。研究及び生産の間に、本発明者は、HPV16型L1タンパク質、HPV28型L1タンパク質、HPV33型L1タンパク質、HPV59型L1タンパク質、及びHPV68型L1タンパク質は、その他のHPV型L1タンパク質よりも良好な発現レベル及び溶解度を有することを発見した。この発見に鼓舞されて、本発明者らは、抽出性がより劣る又は溶解度がより低い特定のHPV型L1タンパク質のC末端を、より良好な発現レベル及び溶解度を有する特定のHPV型L1タンパク質のC末端と置き換えた。すなわち、本発明者らは、N末端からC末端の方向で、第1のパピローマウイルス型(例えば、HPV)の免疫原性を提供する第1のパピローマウイルス型のL1タンパク質(例えば、HPV L1タンパク質)に由来するN末端断片、並びにより良好な発現レベル及び溶解度特性を提供する第2のパピローマウイルス型のL1タンパク質(例えば、HPV L1タンパク質)に由来するC末端断片を含む、キメラタンパク質を構築した。これら2つの断片は直接又はリンカーを介して接続され得る。
第1のHPV型のL1タンパク質の免疫原性を維持し、そしてVLPの形成を確実にするのに適するHPV L1タンパク質のN末端断片の長さが決定される。以下の報告は、一般的なHPV型のエピトープ研究と関連する。
Sunanda Baidyaらは、L1タンパク質48EEYDLQFIFQLCKITLTA65、45RHGEEYDLQFIFQLCKITLTA65、63LPDPNKF69、79PETQRLVWAC88、36PVPGQYDA43、77YNPETQRLVWAC88、188DTGYGAMD195、36PVPGQYDATK45、45KQDIPKVSAYQYRVFRV61、130RDNVSVDYKQTQLCI144、及び49YSRHVEEYDLQFIF62のエピトープが、HPV16及び18ワクチンを設計するためのツールとして使用可能であることを報告した(参照として本明細書にその全体が組み込まれているEpitope design of L1 protein for vaccine production against Human Papilloma Virus types 16 and 18、Bioinformation 13(3):86～93頁、2017年3月を参照)。
Katharina Slupetzkyらは、HPV-16のaa282～286及び351～355の近傍に位置する領域が中和エピトープに寄与すること、及び後者が免疫優性部位であることを報告した(参照として本明細書にその全体が組み込まれているChimeric papilloma virus-like particles expressing a foreign epitope on capsid surface loops、Journal of General Virology(2001年)、82、2799～2804頁を参照)。
Brooke Bishopらは、HPV11、16、18、及び35 L1タンパク質の下記の3つのバリアント:そのN末端におけるアミノ酸9個の欠失、α4(HPV16のアミノ酸残基404～436に対応する)の欠失、及びそのC末端におけるアミノ酸31個の欠失をそれぞれ調製し、そして前者の2つはVLPに組織化しないことを報告したが、しかしこの現象は後者の1つにおいては報告されなかった(参考として本明細書にそのまま組み込まれているCrystal Structures OF Four type of Human Papillomavirus L1 Capsid Proteins UNDERSTANDING THE SPECIFICITY OF NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES、The Journal OF Biological Chemistry、282、31803～31811頁)。各型のHPV L1タンパク質のαへリックス、βフォールドシート、及びループ領域のそれぞれは、当分野で一般的に使用される配列分析ソフトウェアにより、好都合に決定され得る。その場合、αへリックス領域は、α1領域、α2領域、α3領域、α4領域、及びα5領域を含有する。
本発明者らは、14個のHPV型(6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、及び59型)のL1タンパク質について、その配列アラインメントを実施し、次に上記で引用された文献(Crystal Structures OF Four Types of Human Papillomavirus L1 Capsid Proteins UNDERSTANDING THE SPECIFICITY OF NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES、The Journal OF Biological Chemistry、282、31803～31811頁)に従い、二次構造予測を実施し、その結果を下記に示すが、下向き矢印間の部分は、当該文献においてバリアントを調製するために削除された領域に対応する。
配列アラインメントのために本発明者らが使用した方法に付加して、予測に使用可能であるタンパク質二次構造予測ソフトウェアとして下記のものが挙げられるが、これらに限定されない。
1. JPred:http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/index.html
2. ProtPredicct:http://predictprotein.org
3. PsiPred:http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred
4. SCRATCH-1D:http://download.igb.uci.edu
5. Nnpredict:http://www.cmpharm.ucsf.edu/～nomi/nnpredict
6. predictprotein:http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/SOPMA
http://www.ibcp.fr/predict.html
7. SSPRED:http://www.embl-heidelberg.de/sspred/ssprd_info.html.
1. JPred:http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/index.html
2. ProtPredicct:http://predictprotein.org
3. PsiPred:http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred
4. SCRATCH-1D:http://download.igb.uci.edu
5. Nnpredict:http://www.cmpharm.ucsf.edu/～nomi/nnpredict
6. predictprotein:http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/SOPMA
http://www.ibcp.fr/predict.html
7. SSPRED:http://www.embl-heidelberg.de/sspred/ssprd_info.html.
本発明の1つの実施形態では、本発明者らは、第1の型に由来するHPV L1タンパク質のN末端断片の長さを以下のように決定する:L1タンパク質の天然配列を、そのα5領域及びその近傍領域内でトランケートし、そのN末端からα5領域内の新規に生成されたC末端までの配列を保持する。そのようなトランケートされた配列は、それが第1の型の免疫原性を有し、そしてVLPを形成する能力を有することを保証する。
第1の型に由来するHPV L1タンパク質のN末端断片は、それが第1の型の免疫原性を保持し、そしてVLPを形成する能力を有する限り、更に改変可能である。
第2の型に由来するHPV L1タンパク質のC末端断片の長さは、以下のように決定される:L1タンパク質の天然配列を、そのα5領域及びその近傍領域内でトランケートし、次にそのα5領域内の新規に生成されたN末端からC末端までの配列を保持する。そのようなトランケートされた配列は、主要な中和性抗原エピトープを有さないので、得られたキメラタンパク質の免疫原性を妨害しない。
第2の型に由来するHPV L1タンパク質のC末端断片について、好ましくはその核局在化配列の少なくとも1つを保持しながら、更に変異、欠失させ、及び/又はそれに付加することができる。Yangらは、107個のHPVサブ型の核局在化配列を予測した(参考として本明細書にそのまま組み込まれているYangら、Predicting the nuclear localization signals of 107 type of HPV L1 proteins by bioinformatic analysis. Geno. Prot. Bioinfo. Vol. 4 No. 1 2006年)。各型のHPV L1タンパク質の核局在化配列は、当分野で一般的に使用され配列分析ソフトウェアにより好都合に決定され得る。
N末端断片をC末端断片に結びつける上記接続は、前者の新規に生成されたC末端、及び後者の新規に生成されたN末端において生ずる。これは、直接的な接続であってもまたリンカーを介する接続であってもよい。接続が生ずる部位は原点座標として定義され、原点のN末端側はマイナス、一方C末端側はプラスとみなされる。
HPV6 L1タンパク質のアミノ酸453～469の配列、及びその他のHPV型のL1タンパク質の対応する配列を下記に示す。これらの配列はそのα5領域でそれぞれ重複する。これらの配列は非常に類似していることが理解され得る。カッコ内の数字は、リスト化された配列の最後のアミノ酸残基の位置を表し、HPV45型の場合、追加の26個のアミノ酸が、一部のHPV45型系統のL1タンパク質のN末端に存在する一方、その他のHPV45型系統のN末端には、前記追加の26個のアミノ酸は存在せず、したがって数字は(478)+26として示される。
HPV6 ELDQYPLGRKFLLQSGY(469)
HPV11 ELDQFPLGRKFLLQSGY(470)
HPV16 DLDQFPLGRKFLLQAGL(474)
HPV18 DLDQYPLGRKFLVQAGL(475)
HPV31 DLDQFPLGRKFLLQAGY(475)
HPV35 DLDQFPLGRKFLLQAGL(472)
HPV39 ELDQFPLGRKFLLQARV(474)
HPV45 DLDQYPLGRKFLVQAGL(478)+26
HPV51 DLDQFALGRKFLLQVGV(474)
HPV52 DLDQFPLGRKFLLQAGL(478)
HPV56 DLDQFPLGRKFLMQLGTRS(474)
HPV58 DLDQFPLGRKFLLQSGL(473)
HPV33 DLDQFPLGRKFLLQAGL(473)KAKPKLKRAAPTSTRTSSAKRKKVKK
式中、480～481位におけるKR及び493～496位におけるKRKKは核局在化配列である。
式中、480～481位におけるKR及び493～496位におけるKRKKは核局在化配列である。
HPV59 DLDQFPLGRKFLLQLGA(475)RPKPTIGPRKRAAPAPTSTPSPKRVKRRKSSRK
式中、484～486位におけるRKR、及び498～504位におけるKRVKRRKは核局在化配列である。
式中、484～486位におけるRKR、及び498～504位におけるKRVKRRKは核局在化配列である。
本発明の1つの実施形態では、本発明者らは、HPV型間においてα5領域及び近傍領域の配列が類似するという利点を利用することにより、異なるHPV型間でのL1タンパク質のC末端置換を完了した。
本発明の最も好ましい実施形態において、本発明者らは、各HPV型のL1タンパク質は、類似した位置においてテトラペプチドRKFL、又はより有利にはヘキサペプチドLGRKFLを有することを指摘した。本発明者らは、このオリゴペプチド内の任意のアミノ酸位置において、キメラタンパク質接続ポイントを配置するのに、この高度に保存された配列を巧妙に利用した。一方では、キメラタンパク質のN末端から開始してRKFL又はLGRKFLに至る配列は、第1のHPV型のL1タンパク質に由来するN末端断片の配列と同一であるが、一方、RKFL又はLGRKFLから開始してキメラタンパク質のC末端に至る配列は、第2の型のL1タンパク質に由来するC末端断片の配列と同一である。
そのように生成されたキメラタンパク質は、天然HPV L1タンパク質に対して高度の類似性を維持し、また製造において、及びその後の医学的又は予防的手順においてさえも良好な成果を上げるものと期待され得る。
当業者は、所与のHPV型の異なる天然配列を有する異なる系統が存在し、異なる系統を使用して構築されたキメラタンパク質も本発明の範囲に含まれることを理解しているであろう。
異なるHPV型のL1タンパク質間でも類似性が高いことから、キメラタンパク物質の構築期間中に、第1のHPV型のL1タンパク質に由来するN末端断片が、C末端に向かって、より多くのアミノ酸残基によって延長され、又は第2のHPV型のL1タンパク質に由来するC末端断片が、N末端に向かって、より多くのアミノ酸残基によって延長される場合でも、対応する部位にあるアミノ酸が同一である又は類似することから、本発明と構造的に同一のキメラタンパク質を形成することがやはり可能であるものと当業者には理解され得る。そのように形成されたキメラタンパク質も、やはり本発明の範囲に含まれる。
上記実施形態のキメラタンパク質に基づけば、キメラタンパク質のバリアントが、アミノ酸残基の変異、欠失、及び/又は付加により形成され得ると当業者には理解され得る。これらのバリアントは、第1のHPV型のL1タンパク質の免疫原性を有する可能性があり、VLPを形成することができ、また良好な収率及び溶解度を有する。そのように形成されたキメラタンパク質も、やはり本発明の範囲に含まれる。
本発明の有益な効果
ウイルス様粒子を生成するための一般的に使用される発現系は、真核生物発現系及び原核生物発現系に分類される。真核生物発現系により発現されるパピローマウイルスLタンパク質は、自発的に組織化してウイルス様粒子となることができるが、しかし発現レベルが低いという欠点を有し、したがって大量生産には適さない。原核生物発現系により発現されるパピローマウイルスLタンパク質は、多くの場合、天然立体構造が壊れてしまうので、ウイルス様粒子を得るのにin vitro処理を必要とし、また収率も低く、工業化で使用するのは困難である。
ウイルス様粒子を生成するための一般的に使用される発現系は、真核生物発現系及び原核生物発現系に分類される。真核生物発現系により発現されるパピローマウイルスLタンパク質は、自発的に組織化してウイルス様粒子となることができるが、しかし発現レベルが低いという欠点を有し、したがって大量生産には適さない。原核生物発現系により発現されるパピローマウイルスLタンパク質は、多くの場合、天然立体構造が壊れてしまうので、ウイルス様粒子を得るのにin vitro処理を必要とし、また収率も低く、工業化で使用するのは困難である。
本発明は、パピローマウイルス(例えば、ヒトパピローマウイルス)のLタンパク質のC末端を、例えば、それをHPV16型L1タンパク質、HPV28型L1タンパク質、HPV33型L1タンパク質、HPV59型L1タンパク質、又はHPV68型L1タンパク質のC末端断片と置換することにより改変し、したがって、発現系(例えば宿主細胞、例えば昆虫細胞)におけるパピローマウイルスLタンパク質の発現レベル及び溶解度を改善するために、発現系(例えば宿主細胞、例えば昆虫細胞)において使用可能である。これは、ワクチン、例えばHPVワクチン等の大量生産に使用可能である。
本発明者らは、HPV16型L1タンパク質、HPV28型L1タンパク質、HPV33型L1タンパク質、HPV59型L1タンパク質、及びHPV68型L1タンパク質は、その他のHPV型のL1タンパク質と比較して、発現レベルが増加しており、また溶解度も増加していること、並びに前記タンパク質の発現レベルの増加、及び溶解度の増加は前記HPV L1タンパク質のC末端配列に依存することを見出した。107個のHPV型L1タンパク質において、そのほとんどがC末端に核局在化配列を有し、そしてC末端配列はある程度の類似性を有する。
現在発現不可能である、発現レベルが非常に低い、又は発現後に不溶性であるパピローマウイルスLタンパク質の場合、そのC末端断片を、HPV16型L1タンパク質、HPV28型L1タンパク質、HPV33型L1タンパク質、HPV59型L1タンパク質、又はHPV68型L1タンパク質のC末端断片と置換することで、可溶性発現及びその後の精製が可能となる。この戦略は、多価ワクチン(例えば、HPVワクチン)の大量生産に使用可能であり、広範囲にわたるパピローマウイルス感染症、特にHPVに対するより徹底した防御を提供することが可能になる。
大量生産目的で、昆虫細胞におけるHPV L1タンパク質の発現レベル及び溶解度を増加させる必要がある。それに加えて、HPV Lタンパク質から組織化されたウイルス様粒子は、適正なジスルフィド結合を形成する不具合に起因して、酵母菌細胞において良好な立体構造を欠いている。
昆虫細胞において発現不十分及び不溶性であるHPV L1タンパク質の場合、そのC末端断片をHPV33又は59型L1タンパク質のC末端断片に改変することで、その後、発現レベル及び溶解度を有意に増加させることができ、したがってそれをHPVワクチンの大量生産に使用することができる。
その他のHPV型のL1タンパク質と比較して、昆虫細胞においてそれより発現が良好であり、そして溶解性が良好であるHPV L1タンパク質、例えばHPV16型タンパク質、HPV28型L1タンパク質、HPV68型L1タンパク質等の場合、ワクチンの大量生産を実現するために、発現レベル及び溶解度を更に改善するする必要がある。本発明では、例えば、HPV16型L1タンパク質のC末端断片を、HPV33型L1タンパク質のC末端断片に改変した後に、改変後のキメラHPV16型タンパク質の発現レベル及び溶解度は改善するが、それはHPVワクチンの大量生産に役立つ。
要約すれば、キメラHPV L1タンパク質は、非改変型HPV L1タンパク質と比較して、昆虫細胞においてそれよりかなり高い発現レベル及び溶解度を示した。これは、HPVワクチンの大量生産に使用可能である。それに加えて、キメラHPV L1タンパク質はジスルフィド結合を正しく形成することができ、したがって昆虫細胞において良好な立体構造を有するHPVウイルス様粒子に組織化可能である。これは、HPVウイルス様粒子の免疫原性を向上することができ、そしてより良好な免疫応答を引き起こすことができる。
定義
別途記載がなければ、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解される意味を有する。本発明を理解しやすくするために、以下の用語を、その通常の意味において下記に引用する。
別途記載がなければ、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解される意味を有する。本発明を理解しやすくするために、以下の用語を、その通常の意味において下記に引用する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「1つの(a/an)」、「別の(another)」、及び「前記(said/the)」は、文脈が別途明示しない限り、対象の複数形を含む。別途明示的に記載されない限り、用語「含む(include)/含む(comprise)/有する(have)」、「例えば」等は、限定的ではなく包括的であることを伝達するように意図されている。
用語「免疫原性」とは、免疫応答を引き起こす、例えばタンパク質又はペプチド等の物質の能力、すなわち抗体産生を引き起こす能力、特に体液性又は細胞性応答を引き起こす能力を指す。
用語「抗体」とは、抗原に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、ポリクローナル混合物又はモノクローナルであり得る。抗体は、天然起源又は組換え起源のインタクトな免疫グロブリンであり得る、又はインタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。抗体は、例えばFv、Fab'、F(ab')2を含む様々な形態及び単鎖として存在し得る。
用語「抗原性」とは、例えばタンパク質又はペプチド等の物質の、それと特異的に結合する抗体の産生を引き起こす能力を指す。
用語「エピトープ」として、抗体又はT細胞受容体と特異的に結合する任意のタンパク質決定基クラスターが挙げられる。エピトープ決定基は、分子の化学的に活性な表在基(例えば、アミノ酸若しくは糖側鎖、又はその組合せ)から一般的に構成され、そして特別な三次元構造特性と共に、特別な電荷特性を一般的に有する。
用語「サブ型」又は「型」は、本明細書ではウイルスの遺伝的バリアント(それが型毎に異なる抗原として免疫系により認識され得るのを可能にする)を指すのに互換的に使用される。例えば、HPV16は、HPV33から免疫学的に区別可能である。
用語「HPV L1タンパク質」、用語「HPV」及び「ヒトパピローマウイルス」とは、本明細書で使用される場合、パピローマウイルスファミリーのエンベロープを含まない二本鎖DNAウイルスを指す。そのゲノムは環状であり、そしてサイズはおよそ8キロ塩基対である。ほとんどのHPVは、8つの主要タンパク質(「初期」領域(E1～E2)内の6つ、及び「後期」領域内の2つ(L1(メジャーカプシドタンパク質)及びL2(マイナーカプシドタンパク質)))をコードする。120を超えるHPV型が同定されており、それらは番号により識別される(例えば、HPV-16、HPV-18等)。
用語「HPV」又は「HPVウイルス」とは、パピローマウイルス科のパピローマウイルスを指し、3領域:
(i)初期領域(E)(ウイルスの複製、転写、及びトランスフォーメーションと関連する非構造タンパク質をコードする6つのオープンリーディングフレームE1、E2、E4～E7と共に、オープンリーディングフレームE3及びE8を含有する);
(ii)後記領域(L)(メジャーカプシドタンパク質L1及びマイナーカプシドタンパク質L2をコードするリーディングフレームを含有する);並びに
(iii)長尺制御領域(LCR)(タンパク質のいずれもコードしないが、しかし複製開始点及び複数の転写因子結合部位を有する)
に通常分類される、サイズおよそ8kbの二本鎖閉環状DNAゲノムを有する、エンベロープを含まないDNAウイルスである。
(i)初期領域(E)(ウイルスの複製、転写、及びトランスフォーメーションと関連する非構造タンパク質をコードする6つのオープンリーディングフレームE1、E2、E4～E7と共に、オープンリーディングフレームE3及びE8を含有する);
(ii)後記領域(L)(メジャーカプシドタンパク質L1及びマイナーカプシドタンパク質L2をコードするリーディングフレームを含有する);並びに
(iii)長尺制御領域(LCR)(タンパク質のいずれもコードしないが、しかし複製開始点及び複数の転写因子結合部位を有する)
に通常分類される、サイズおよそ8kbの二本鎖閉環状DNAゲノムを有する、エンベロープを含まないDNAウイルスである。
用語「HPV L1タンパク質」及び「HPV L2タンパク質」とは、HPV遺伝子の後期領域(L)によりコードされ、及びHPV感染症サイクルの後期に合成されるタンパク質を指す。L2タンパク質はマイナーカプシドタンパク質である。72個のL1ペンタマーは、閉環状二本鎖DNA微小染色体を包含する、正二十面体HPV粒子の外殻を形成する。
用語「ウイルス様粒子」とは、ウイルス核酸を含まず、ウイルスの1つ又は複数の構造タンパク質を含有する中空粒子を指す。
「HPV偽ウイルス」は、HPV VLPの非特異的核酸カプセル化特性を長所として利用して、HPVをin vitroで中和するための理想的モデルであり、HPV偽ウイルスは、遊離DNAをラッピングすること、又は細胞内発現されたHPV L1及びL2から構成されるVLP中に外因性プラスミドを導入することにより形成される。
「偽ウイルス中和アッセイ」は、抗体の中和活性を評価するための方法である。免疫化した動物の血清を所定量の偽ウイルスと共にインキュベーションして細胞を感染させた後、血清中和抗体が増加するとき、細胞の量が減少するが、それはある特定の範囲において直線的な負の相関を示す。血清中の抗体の中和活性は、したがって細胞の量の変化を測定することにより評価可能である。
用語「その断片」又は「そのバリアント」とは、本発明のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の欠失、挿入、及び/又は置換を指す。好ましくは、本発明により提供されるポリペプチドの断片又はバリアントは、動物又はヒトにおいて体液性及び/又は細胞性免疫応答を引き起こす能力を有する。
用語「キメラの」とは、異なる親分子に由来するポリペプチド又はヌクレオチドの配列が、それぞれ、-CO-NH-又は3',5'-ホスホジエステル結合により共に接続していることを意味する。好ましくは、そのような配列は、追加のリンカー配列によって間隔を置くことはなく、相互に直接に隣接している。
用語「トランケーション」とは、1つの又は複数のアミノ酸をポリペプチドのN末端及び/又はC末端から除去すること、或いは1つ又は複数のアミノ酸をポリペプチドの内部から欠失させること指す。
用語「核局在化配列」とは、タンパク質を核内に誘導するアミノ酸配列を指す。いくつかのHPV L1タンパク質において、塩基性残基の2つタイトクラスター(すなわち、核局在化配列)(例えば、一方はKRKR、KRKK、KRKRK、KRKKRK、KRVKRRK等であり、また他方はKR、RKR、KRK等である)は、それらの間に10～14個のアミノ酸からなるスペーサー領域を有する。上記塩基性残基のクラスターは、核局在化配列に属する。いくつかのその他のHPV L1タンパク質において、核局在化配列は、アルギニン及び/又はリジンにより形成された、塩基性残基のタイトクラスターである。核局在化配列として、上記したような塩基性残基のクラスターの例が挙げられるが、これらに限定されない。全内容が本明細書において参考として組み込まれている、Jun Yangら、Predicting the Nuclear Localization Signals of 107 Types of HPV L1 Proteins by Bioinformatic Analysis、Genomics、Proteomics & Bioinformatics Volume 4、Issue 1、2006年、34～41頁を参照。
用語「機能的バリアント」とは、トランケーション、変異、欠失、及び/又は付加後に、所望の活性又は特性を保持するポリペプチド又はタンパク質のバージョンを指す。
ポリペプチド又は核酸の2配列間の「配列同一性」は、前記配列間の同一残基の数を、総残基数に占める割合(%)として表し、そして比較される分子のより短い一方のサイズに基づき計算される。同一性割合(%)を計算するとき、特別なアルゴリズムによって一致した中に空白位置(存在する場合には)を当てはめながら、配列間で最大一致が生ずるように、比較される配列を一致させる。2配列間の同一性を決定する好ましいコンピュータープログラム法として、GAP、BLASTP、BLASTN、及びFASTAを含む、GCGプログラムパッケージが挙げられるが、これらに限定されない(Altschulら、1990年、J. Mol. Biol. 215:403～410頁)。上記プログラムは、アメリカ国立生物工学情報センター(National Center of Biotechnology Information;NCBI)及びその他の供給源から公的に入手可能である。周知のSmith Watermanアルゴリズムも、同一性の決定に使用可能である。
重要でないアミノ酸は、タンパク質の正常な機能に影響を及ぼすことなく保存的に置換され得る。保存的置換とは、アミノ酸を化学的又は機能的に類似したアミノ酸と置換することを意味する。類似したアミノ酸を提示する保存的置換に関する表は、当技術分野において周知されている。例として、いくつかの実施形態では、Table 1～3(表1～3)に提示されるアミノ酸の基は相互に保存的置換とみなされる。
用語「アミノ酸」とは、20種類の一般的な天然のアミノ酸を指す。天然のアミノ酸として、アラニン(Ala;A)、アルギニン(Arg;R)、アスパラギン(Asn;N)、アスパラギン酸(Asp;D)、システイン(Cys;C)、グルタミン酸(Glu;E)、グルタミン(Gln;Q)、グリシン(Gly;G)、ヒスチジン(His;H)、イソロイシン(Ile;I)、ロイシン(Leu;L)、リジン(Lys;K)、メチオニン(Met;M)、フェニルアラニン(Phe;F)、プロリン(Pro;P)、セリン(Ser;S)、トレオニン(Thr;T)、トリプトファン(Trp;W)、チロシン(Tyr;Y)、及びバリン(Val;V)が挙げられる。
用語「アジュバント」とは、免疫応答を強化する化合物又は混合物を指す。特に、ワクチンはアジュバントを含み得る。本発明で使用されるアジュバントとして、無機物含有アジュバント組成物、オイルエマルジョンアジュバント、サポニンアジュバント製剤、細菌又は病原菌の誘導体のうちの1つの又は複数を挙げることができるが、これらに限定されない。
用語「ベクター」とは、それと結びついた別の核酸を増殖させる能力を有する核酸分子を指す。該用語には、核酸構造を自己複製するようなベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが挙げられる。ある特定のベクターは、そのようなベクターが作動的に結びついた核酸の発現を誘発する能力を有する。
用語「宿主細胞」とは、外因性核酸が導入された細胞、並びにそのような細胞の子孫を指す。宿主細胞として、「トランスフォーマント」(又は「形質転換細胞」)、「トランスフェクタント」(又は「トランスフェクト細胞」)、又は「インフェクタント」(又は「感染細胞」)が挙げられ、そのそれぞれには、一次形質転換細胞、トランスフェクト細胞、又は感染細胞、及びそれらに由来する子孫が含まれる。そのような子孫は、核酸含有量に関して親細胞と同一でない可能性があり、また変異を含有し得る。
投与量は、好ましくは「予防上有効な量」であり(本明細書では、予防とは処置とみなすことができ、そして両者は交換可能に使用され得る)、個人に対して利益をもたらすのに十分である。
(実施例1)
キメラ遺伝子の構築
(実施例1.1)
HPV6 L1のC末端がHPV33 L1のC末端で置換されたキメラ遺伝子の構築
1.1.1 テンプレートとしてのpFB-HPV6 L1の構築
合成された配列の両端部にKpnI及びXbaI切断部位を有するHPV6 L1遺伝子を、Thermo Fisher社[以前はInvitrogen(Shanghai)Trading Co.社]により合成した。その配列を配列番号5に示す。HPV6 L1のアミノ酸1～500をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドpcDNA3-HPV6-L1は、合成された遺伝子断片を、KpnI及びXbaI切断部位において、pcDNA3ベクター(販売業者:Thermo Fisher社)とライゲートすることにより得た。
キメラ遺伝子の構築
(実施例1.1)
HPV6 L1のC末端がHPV33 L1のC末端で置換されたキメラ遺伝子の構築
1.1.1 テンプレートとしてのpFB-HPV6 L1の構築
合成された配列の両端部にKpnI及びXbaI切断部位を有するHPV6 L1遺伝子を、Thermo Fisher社[以前はInvitrogen(Shanghai)Trading Co.社]により合成した。その配列を配列番号5に示す。HPV6 L1のアミノ酸1～500をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドpcDNA3-HPV6-L1は、合成された遺伝子断片を、KpnI及びXbaI切断部位において、pcDNA3ベクター(販売業者:Thermo Fisher社)とライゲートすることにより得た。
得られたpcDNA3-HPV6-L1プラスミドに、KpnI及びXbaIを用いたダブル酵素消化を施して、HPV6 L1(1～500)の遺伝子断片を得た。該断片を、次にKpnI/XbaIダブル消化pFastBac(商標)1ベクター(販売業者:Thermo Fisher社)にライゲートして、HPV6 L1(1～500)遺伝子断片を含有するロッドベクターを得て、pFB-HPV6 L1と命名した。
1.1.2 テンプレートとしてのpFB-HPV33 L1の構築
合成された配列の両端部にKpnI及びXbaI切断部位を有するHPV33 L1遺伝子を、Thermo Fisher社[以前はInvitrogen(Shanghai)Trading Co.社)により合成した。その配列を配列番号6として示す。HPV33 L1のアミノ酸1～499をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドpcDNA3-HPV33-L1は、合成された遺伝子断片を、KpnI及びXbaI切断部位においてpcDNA3ベクター(販売業者:Thermo Fisher社)とライゲートすることにより得た。
合成された配列の両端部にKpnI及びXbaI切断部位を有するHPV33 L1遺伝子を、Thermo Fisher社[以前はInvitrogen(Shanghai)Trading Co.社)により合成した。その配列を配列番号6として示す。HPV33 L1のアミノ酸1～499をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドpcDNA3-HPV33-L1は、合成された遺伝子断片を、KpnI及びXbaI切断部位においてpcDNA3ベクター(販売業者:Thermo Fisher社)とライゲートすることにより得た。
pcDNA3-HPV33-L1プラスミドに、KpnI及びXbaIを用いたダブル酵素消化を施して、HPV33 L1(1～499)遺伝子の断片を得た。該断片を、次にKpnI及びXbaIダブル消化pFastBac(商標)1ベクター(販売業者:Thermo Fisher社)にライゲートして、HPV33 L1(1～499)遺伝子断片を含有するロッドベクターを得て、pFB-HPV33 L1と命名した。
1.1.3 pFB-HPV6 L1:33Cの構築
HPV6 L1 C末端がHPV33 L1 C末端で置換されたキメラ遺伝子、すなわち構築後の組換えプラスミドpFB-HPV6 L1を、プライマーF1及びR1を使用して、1426bpの遺伝子断片を増幅するための遺伝子テンプレートとして使用した。プライマー配列F1を配列番号7に示し、そしてR1を配列番号8に示す。
HPV6 L1 C末端がHPV33 L1 C末端で置換されたキメラ遺伝子、すなわち構築後の組換えプラスミドpFB-HPV6 L1を、プライマーF1及びR1を使用して、1426bpの遺伝子断片を増幅するための遺伝子テンプレートとして使用した。プライマー配列F1を配列番号7に示し、そしてR1を配列番号8に示す。
この遺伝子断片は、HPV33 L1のアミノ酸474～499をコードする遺伝子断片と10塩基重複する、HPV6 L1のアミノ酸1～469をコードする断片、及びKpnI消化部位の断片(GGTAC^C)を含有する。増幅された配列を配列番号9に示す。
PCR増幅パラメーター:94℃にて5分間予備変性;98℃にて10秒間変性、69℃にて15秒間アニーリング、72℃にて1kb/分を30サイクル;72℃にて5分間伸長;16℃にて終了。
プライマーF2及びR2を使用して長さ101bpの遺伝子断片を増幅するための遺伝子テンプレートとして、組換えプラスミドpFB-HPV33 L1を使用した。F2プライマーの配列を配列番号10に示し、そしてR2のプライマー配列を配列番号11に示す。
この遺伝子断片は、HPV6 L1のアミノ酸1～469のC末端をコードする遺伝子断片と10bpの塩基が重複する、HPV33 L1のC末端アミノ酸26個(474～499)をコードする遺伝子断片、及びXbaI(T^CTAGA)消化部位を含有する。増幅された配列を配列番号12に示す。
PCR増幅パラメーター:94℃にて5分間予備変性;98℃にて10秒間変性、69℃にて15秒間アニーリング、72℃にて1kb/分を30サイクル;72℃にて5分間伸長;16℃にて終了。
PCRライゲート配列:
ライゲートプライマーはF1及びR2であり、また上記プライマーを使用して増幅された断片(F1及びR1の増幅された断片、F2及びR2の増幅された断片)をテンプレートとして使用した。
ライゲートプライマーはF1及びR2であり、また上記プライマーを使用して増幅された断片(F1及びR1の増幅された断片、F2及びR2の増幅された断片)をテンプレートとして使用した。
PCRライゲートパラメーター:94℃にて5分間予備変性;98℃にて10秒間変性、52℃にて15秒間アニーリング、72℃にて1kb/分を5サイクル;98℃にて10秒間変性、68℃にて15秒間アニーリング、72℃にて1kb/分を25サイクル;72℃にて5分間伸長;16℃にて終了。
最終結果は、両端部にKpnI及びXbaI切断部位を有する、HPV6 L1のアミノ酸1～469及びHPV33 L1のC末端アミノ酸26個(aa474～499)をコードするヌクレオチド配列、配列番号4であった(以後、ライゲート配列と呼ぶ)。
組換えプラスミドpFB-HPV6 L1:33Cは、pFB-HPV6 L1:33C(HPV6 L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子)を得るために、KpnI+XbaI酵素を用いてpFastBac(商標)1ベクター及びライゲート配列断片をダブル消化し、そしてライゲート配列をpFastBac(商標)1ベクター中にクローニングすることにより得た。
(実施例1.2)
HPV11 L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録2を参照。
HPV11 L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録2を参照。
(実施例1.3)
HPV16 L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録3を参照。
HPV16 L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録3を参照。
(実施例1.4)
HPV18 L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録4を参照。
HPV18 L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録4を参照。
(実施例1.5)
HPV31 L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録5を参照。
HPV31 L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録5を参照。
(実施例1.6)
HPV35 L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録6を参照。
HPV35 L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録6を参照。
(実施例1.7)
HPV39 L1のC末端がHPV59L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
1.7.1 テンプレートとして使用されるpFB-HPV39 L1の構築
合成された配列の両端部にKpnI及びXbaI切断部位を有するHPV39 L1遺伝子を、Thermo Fisher社(以前はInvitrogen(Shanghai)Trading Co.社)により合成した。その配列を配列番号83として示す。HPV39 L1のアミノ酸1～505をコードするヌクレオチド配列を含有するプラスミドpcDNA3-HPV39-L1は、合成された遺伝子断片を、KpnI及びXbaI切断部位において、pcDNA3ベクター(販売業者:Thermo Fisher社)とライゲートすることにより得た。
HPV39 L1のC末端がHPV59L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
1.7.1 テンプレートとして使用されるpFB-HPV39 L1の構築
合成された配列の両端部にKpnI及びXbaI切断部位を有するHPV39 L1遺伝子を、Thermo Fisher社(以前はInvitrogen(Shanghai)Trading Co.社)により合成した。その配列を配列番号83として示す。HPV39 L1のアミノ酸1～505をコードするヌクレオチド配列を含有するプラスミドpcDNA3-HPV39-L1は、合成された遺伝子断片を、KpnI及びXbaI切断部位において、pcDNA3ベクター(販売業者:Thermo Fisher社)とライゲートすることにより得た。
PcDNA3-HPV39-L1プラスミドに、KpnI及びXbaIを用いたダブル消化を施して、HPV39 L1遺伝子の断片(1～505)を得た。該断片を、次にKpnI及びXbaIダブル消化pFastBacTM1ベクター(販売業者:Thermo Fisher社)にライゲートして、HPV39 L1(1～505)遺伝子断片を含有するロッドベクターを得て、pFB-HPV39 L1と命名した。
1.7.2 テンプレートとしてのpFB-HPV59L1の構築
HPV59 L1遺伝子を、Thermo Fisher社(以前はInvitrogen (Shanghai) Trading Co.社)により合成を行って、HPV59L1のアミノ酸1～508をコードするヌクレオチド配列を含有するプラスミドpcDNA3-HPV59-L1を得た。
HPV59 L1遺伝子を、Thermo Fisher社(以前はInvitrogen (Shanghai) Trading Co.社)により合成を行って、HPV59L1のアミノ酸1～508をコードするヌクレオチド配列を含有するプラスミドpcDNA3-HPV59-L1を得た。
pcDNA3-HPV59-L1プラスミドを、KpnI及びXbaIを用いてダブル消化して、HPV59L1(1～508)遺伝子の断片を得た。該断片を、次にKpnI/XbaIダブル消化pFastBacTM1ベクター(販売業者:Thermo Fisher社)にライゲートして、HPV59L1(1～508)遺伝子断片を含有するロッドベクターを得て、pFB-HPV59L1と命名した。
1.7.3 pFB-HPV39 L1:59Cの構築
HPV39 L1 C末端がHPV59L1のC末端で置換されたキメラ遺伝子:構築された組換えプラスミドpFB-HPV39 L1を、プライマーF1及びR1を使用して1428bpの遺伝子断片を増幅するための遺伝子テンプレートとして使用した。プライマー配列F1を配列番号85に示し、またプライマー配列R1を配列番号86に示す。
HPV39 L1 C末端がHPV59L1のC末端で置換されたキメラ遺伝子:構築された組換えプラスミドpFB-HPV39 L1を、プライマーF1及びR1を使用して1428bpの遺伝子断片を増幅するための遺伝子テンプレートとして使用した。プライマー配列F1を配列番号85に示し、またプライマー配列R1を配列番号86に示す。
この断片は、HPV59L1のアミノ酸471～508をコードする断片と12塩基重複するHPV39 L1のアミノ酸1～469をコードする断片、及びKpnI消化部位のセグメント(GGTAC^C)を含有する。増幅された配列を配列番号87に示す。
PCR増幅パラメーター:94℃にて5分間予備変性;98℃にて10秒間変性、69℃にて15秒間アニーリング、72℃にて1kb/分を30サイクル;72℃にて5分間伸長;16℃にて終了。
組換えプラスミドpFB-HPV59L1を、プライマーF2及びR2を使用して、長さ139bpの遺伝子断片を増幅するための遺伝子テンプレートとして使用した。プライマー配列F2を配列番号88に示し、またR2を配列番号89に示す。
この遺伝子断片は、HPV39 L1のアミノ酸1～469をコードする遺伝子断片と12bp塩基重複する、HPV59L1のC末端アミノ酸38個(471～508)をコードする遺伝子断片及びXbaI(T^CTAGA)消化部位を含有し、増幅された配列を配列番号90に示す。
PCR増幅パラメーター:94℃にて5分間予備変性;98℃にて10秒間変性、69℃にて15秒間アニーリング、72℃にて1kb/分を30サイクル;72℃にて5分間伸長;16℃にて終了。
PCRライゲート配列
ライゲートプライマーはF1及びR2であり、そして上記プライマーを使用することにより増幅された断片(F1及びR1増幅断片、F2及びR2増幅断片)をテンプレートとして使用した。
ライゲートプライマーはF1及びR2であり、そして上記プライマーを使用することにより増幅された断片(F1及びR1増幅断片、F2及びR2増幅断片)をテンプレートとして使用した。
PCRライゲートパラメーター:94℃にて5分間予備変性;98℃にて10秒間変性、52℃にて15秒間アニーリング、72℃にて1kb/分を5サイクル;98℃にて10秒間変性、68℃にて15秒間アニーリング、72℃にて1kb/分を25サイクル;72℃にて5分間伸長;16℃にて終了。
最終結果は、両端部にKpnI及びXbaI酵素切断部位を有するHPV39 L1のアミノ酸1～469及びHPV59L1のC末端アミノ酸38個(471～508)をコードするヌクレオチド配列、配列番号82であった(以後、ライゲート配列と呼ぶ)。
HPV39 L1のC末端がHPV59L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子であるpFB-HPV39 L1:59Cを得るために、組換えプラスミドpFB-HPV39 L1:59Cを、KpnI+XbaI酵素を用いて、pFastBac(商標)1ベクター及びライゲート配列断片をダブル消化し、そしてライゲート配列をpFastBac(商標)1ベクター中にクローン化することにより得た。
(実施例1.8)
HPV45 L1のC末端がHPV33L1のC末端で置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録8を参照。
HPV45 L1のC末端がHPV33L1のC末端で置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録8を参照。
(実施例1.9)
HPV51 L1のC末端がHPV33L1のC末端で置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録9を参照。
HPV51 L1のC末端がHPV33L1のC末端で置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録9を参照。
(実施例1.10)
HPV52L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録10を参照。
HPV52L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録10を参照。
(実施例1.11)
HPV56L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録11を参照。
HPV56L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録11を参照。
(実施例1.12)
HPV58L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録12を参照。
HPV58L1のC末端がHPV33 L1のC末端により置換されたキメラ遺伝子の構築
実験方法及び手順は実施例1.1と同一であった。関連する配列については付録12を参照。
(実施例2)
組換えバキュロウイルスパッケージング
(実施例2.1)
HPV6 L1:33C組換えバキュロウイルスパッケージング
実施例1において構築されたpFB-HPV6 L1:33Cの組換えプラスミドを同定し、そして配列決定を行い適正であることが判明し、そしてDH10Bac細菌コンピテント細胞(Bac-to-Bac(登録商標)キット、Thermo Fisher社から購入)に形質転換し、増殖させるために37℃でインキュベートし、そして画線培養するために平底皿内でインキュベートした。白色コロニーを選択し、オーバーナイトでインキュベートした。細菌培養物を収集し、そして組換えバキュロウイルスDNAを、アルカリ溶解法を使用して抽出した。
組換えバキュロウイルスパッケージング
(実施例2.1)
HPV6 L1:33C組換えバキュロウイルスパッケージング
実施例1において構築されたpFB-HPV6 L1:33Cの組換えプラスミドを同定し、そして配列決定を行い適正であることが判明し、そしてDH10Bac細菌コンピテント細胞(Bac-to-Bac(登録商標)キット、Thermo Fisher社から購入)に形質転換し、増殖させるために37℃でインキュベートし、そして画線培養するために平底皿内でインキュベートした。白色コロニーを選択し、オーバーナイトでインキュベートした。細菌培養物を収集し、そして組換えバキュロウイルスDNAを、アルカリ溶解法を使用して抽出した。
組換えバキュロウイルスDNAを、カチオン性トランスフェクション試薬(Sino Biological社から購入)を使用して昆虫細胞SF9中にトランスフェクトして、組換えバキュロウイルス毒性株をパッケージングした。手順は以下の通りであった:
a. 対数期のSF9細胞を、細胞0.6×106個/皿の密度で皿内にイノキュレーションした。SF9細胞でイノキュレーションされた皿を、細胞が皿の壁面に接着するように2時間、室温放置した。
b. 抽出後のプラスミドであるBacmid DNA(20μL)を、グレース培地(無血清、無添加剤、Gibico社から購入)(200μL)に添加し、そして5回転倒混和した。
c. 0.2×TF1(トランスフェクション試薬、Sino Biological社から購入)(25μL)を、グレース培地(200μL)に一滴ずつ添加し、そして軽く混合した。
d. bとcを混合した。室温で15～45分間インキュベートした。
e. Cellfectin(Sino Biological社から購入)と共にDNAをインキュベートしている間に、細胞上清を廃棄し、そしてグレース培地(血清・添加剤を含まない)(0.8mL)を皿中に添加した。
f. インキュベート後のDNAの混合物、及びdのトランスフェクション試薬を、一滴ずつ皿に添加した。
g. 27℃にて2時間インキュベートした。
h. 細胞培養培地を廃棄し、そして完全増殖培地(SCD6 SF + 10% FBS)(SCD6 SFはSino Biological社から購入、FBSは、Gibico社から購入)、2.5mL/皿を添加した。
i. 培養を27℃にて7日間実施し、そしてウイルスの感染が生じたか否かを観察した。
トランスフェクト細胞に目視可能な病変が認められた後に、一般的には培養から7～11日後に、ウイルス上清を収集した。ウイルス上清、すなわちHPV6 L1:33CのP1世代ウイルス系統を、ピペットを用いて無菌的に収集した。細胞2×106個/mLの密度のSF9細胞を、HPV6 L1:33CのP1世代ウイルス系統を使用して、1:50(V/V)の比で感染させ、27℃にて3日間培養し、そして室温、1000g ± 200gにて10分間遠心分離した。収集したウイルス上清はP2世代ウイルスであったが、それは宿主細胞の感染及び生成に使用することができる。
(実施例2.2)
HPV11 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1と同一であった。
HPV11 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1と同一であった。
(実施例2.3)
HPV16L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
HPV16L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
(実施例2.4)
HPV18 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
HPV18 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
(実施例2.5)
HPV31 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
HPV31 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
(実施例2.6)
HPV35 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
HPV35 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
(実施例2.7)
HPV39 L1:59C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
HPV39 L1:59C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
(実施例2.8)
HPV45 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
HPV45 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
(実施例2.9)
HPV51 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
HPV51 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
(実施例2.10)
HPV52 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
HPV52 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
(実施例2.11)
HPV56 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
HPV56 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
(実施例2.12)
HPV58 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
HPV58 L1:33C組換えバキュロウイルスのパッケージング
実験方法及び手順は実施例2.1のものと同一であった。
(実施例3)
キメラタンパク質の発現
(実施例3.1)
HPV6 L1:33Cの発現
ハイファイブ細胞を、実施例2で得られたHPV6 L1:33C組換え遺伝子を含有するバキュロウイルスを用いて、1:200(V/V)の比で感染させ、そして細胞沈殿物を遠心分離により、室温、1000g±100gにて収集した。細胞を、超音波処理により低温で3分間破壊し、>10,000gにて10分間遠心分離し、そして上清をSDS-PAGE用として収集した。レーン1:マーカー(マーカーは、Thermo Scientific社製の、分子量が14.4kDa～116kDaの範囲にある精製タンパク質7種混合物である);レーン2:細胞溶解物;レーン3:遠心分離により収集した溶解物の上清。
キメラタンパク質の発現
(実施例3.1)
HPV6 L1:33Cの発現
ハイファイブ細胞を、実施例2で得られたHPV6 L1:33C組換え遺伝子を含有するバキュロウイルスを用いて、1:200(V/V)の比で感染させ、そして細胞沈殿物を遠心分離により、室温、1000g±100gにて収集した。細胞を、超音波処理により低温で3分間破壊し、>10,000gにて10分間遠心分離し、そして上清をSDS-PAGE用として収集した。レーン1:マーカー(マーカーは、Thermo Scientific社製の、分子量が14.4kDa～116kDaの範囲にある精製タンパク質7種混合物である);レーン2:細胞溶解物;レーン3:遠心分離により収集した溶解物の上清。
結果を図1Aに示す。この方法により調製されたHPV6 L1:33C L1タンパク質は、>100mg/Lの収率、及びおよそ56KDのタンパク質サイズを有し、大量生産に使用可能である。
(実施例3.2)
HPV11 L1:33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
HPV11 L1:33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
結果を図1Bに示す。この方法により調製されたHPV11 L1:33C L1タンパク質は、>100mg/Lの収率、及びおよそ56KDのタンパク質サイズを有し、大量生産に使用可能である。
(実施例3.3)
HPV16L1:33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
HPV16L1:33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
結果を図1Cに示す。この方法により調製されたHPV16L1:33C L1タンパク質は、>100mg/Lの収率、及びおよそ56KDのタンパク質サイズを有し、大量生産に使用可能である。
(実施例3.4)
HPV18 L1:33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
HPV18 L1:33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
結果を図1Dに示す。この方法により調製されたHPV18 L1:33C L1タンパク質は、>100mg/Lの収率、及びおよそ56KDのタンパク質サイズを有し、大量生産に使用可能である。
(実施例3.5)
HPV31 L1:33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
HPV31 L1:33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
結果を図1Eに示す。この方法により調製されたHPV31 L1:33C L1タンパク質は、>100mg/Lの収率、及びおよそ56KDのタンパク質サイズを有し、大量生産に使用可能である。
(実施例3.6)
HPV35 L1:33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
HPV35 L1:33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
結果を図1Fに示す。この方法により調製されたHPV35 L1:33C L1タンパク質は、>100mg/Lの収率、及びおよそ56KDのタンパク質サイズを有し、大量生産に使用可能である。
(実施例3.7)
HPV39 L1:59Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
HPV39 L1:59Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
結果を図1Gに示す。この方法により調製されたHPV39 L1:59C L1タンパク質は、>100mg/Lの収率、及びおよそ56KDのタンパク質サイズを有し、大量生産に使用可能である。
(実施例3.8)
HPV45 L1:33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
HPV45 L1:33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
結果を図1Hに示す。この方法により調製されたHPV45L1: 33CのL1タンパク質は、>100mg/Lの収率及びおよそ56KDのタンパク質サイズを有し、大量生産に使用可能である。
(実施例3.9)
HPV51 L1: 33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
HPV51 L1: 33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
結果を図1Iに示す。この方法により調製されたHPV51L1: 33CのL1タンパク質は、>100mg/Lの収率及びおよそ56KDのタンパク質サイズを有し、大量生産に使用可能である。
(実施例3.10)
HPV52 L1: 33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
HPV52 L1: 33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
結果を図1Jに示す。この方法により調製されたHPV52L1: 33CのL1タンパク質は、>100mg/Lの収率及びおよそ56KDのタンパク質サイズを有し、大量生産に使用可能である。
(実施例3.11)
HPV56 L1: 33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
HPV56 L1: 33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
結果を図1Kに示す。この方法により調製されたHPV56L1: 33CのL1タンパク質は、>100mg/Lの収率及びおよそ56KDのタンパク質サイズを有し、大量生産に使用可能である。
(実施例3.12)
HPV58 L1: 33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
HPV58 L1: 33Cの発現及び生成
実験方法及び手順は実施例3.1と同一であった。
結果を図1Lに示す。この方法により調製されたHPV58L1: 33CL1タンパク質は、>100mg/Lの収率及びおよそ56KDのタンパク質サイズを有し、大量生産に使用可能である。
(実施例4)
精製されたウイルス様粒子の調製
(実施例4.1)
精製されたHPV6 L1:33C ウイルス様粒子の調製
HPV6 L1:33C ウイルス様粒子を、2工程クロマトグラフィー法、すなわちHS-MMA法により精製し、実施例3において収集した上清を精製し、そして最終的に高純度ウイルス様粒子を得た。
精製されたウイルス様粒子の調製
(実施例4.1)
精製されたHPV6 L1:33C ウイルス様粒子の調製
HPV6 L1:33C ウイルス様粒子を、2工程クロマトグラフィー法、すなわちHS-MMA法により精製し、実施例3において収集した上清を精製し、そして最終的に高純度ウイルス様粒子を得た。
第1工程のクロマトグラフィー:
媒体:Thermo Fisher社製のPOROS(登録商標)50 HS強カチオン交換媒体を使用した。
媒体:Thermo Fisher社製のPOROS(登録商標)50 HS強カチオン交換媒体を使用した。
媒体容積:媒体容積150mL、線流速30mL/分。
クロマトグラフィー条件:平衡バッファー(pH6.2、塩濃度は、50mMリン酸/0.5M NaClである);洗浄バッファー(塩濃度は、50mMリン酸/0.75M NaCl、pH6.2である)。
クロマトグラフィーカラムを5CVの平衡バッファーを用いて最初に平衡化し、次にサンプルを負荷した。負荷後、次に5CVの平衡バッファー及び洗浄バッファーをそれぞれ用いてカラムから溶出させ、タンパク質不純物を取り除いた。
溶出条件:溶出塩濃度が1.25M NaClである、50mM塩酸アルギニンを含有する50mMリン酸バッファー、pH6.2を使用した。
第2工程のクロマトグラフィー
媒体:Bestchrom(Shanghai)Biosciences Co., Ltd社製のMMAイオン交換媒体を使用した。
媒体:Bestchrom(Shanghai)Biosciences Co., Ltd社製のMMAイオン交換媒体を使用した。
媒体容積:媒体容積は150mLである一方、線流速は30mL/分である。
クロマトグラフィー条件:平衡バッファー:50mM PB/1.25M NaCl、pH6.2。クロマトグラフィーカラムを最初に4CVの平衡バッファーを用いて平衡化し、次にサンプルを負荷した。負荷後、5CVの平衡バッファーを用いてタンパク質不純物を洗い流し、次に溶出バッファーを用いて標的タンパク質を溶出させ、そして収集した。
溶出条件:100mM NaAC/150mM NaCl/0.01%ツイーン80、pH4.5。
(実施例4.2)
精製されたHPV11 L1:33Cウイルス様粒子の調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
精製されたHPV11 L1:33Cウイルス様粒子の調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
(実施例4.3)
HPV16L1:33Cウイルス様粒子の精製及び調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
HPV16L1:33Cウイルス様粒子の精製及び調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
(実施例4.4)
HPV18 L1:33Cウイルス様粒子の精製及び調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
HPV18 L1:33Cウイルス様粒子の精製及び調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
(実施例4.5)
HPV31 L1:33Cウイルス様粒子の精製及び調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
HPV31 L1:33Cウイルス様粒子の精製及び調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
(実施例4.6)
精製されたHPV35 L1:33Cウイルス様粒子の調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
精製されたHPV35 L1:33Cウイルス様粒子の調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
(実施例4.7)
精製されたHPV39 L1:59Cウイルス様粒子の調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
精製されたHPV39 L1:59Cウイルス様粒子の調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
(実施例4.8)
精製されたHPV45 L1:33Cウイルス様粒子の調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
精製されたHPV45 L1:33Cウイルス様粒子の調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
(実施例4.9)
精製されたHPV51 L1:33Cウイルス様粒子の調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
精製されたHPV51 L1:33Cウイルス様粒子の調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
(実施例4.10)
精製されたHPV52 L1:33Cウイルス様粒子の調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
精製されたHPV52 L1:33Cウイルス様粒子の調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
(実施例4.11)
精製されたHPV56 L1:33Cウイルス様粒子の調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
精製されたHPV56 L1:33Cウイルス様粒子の調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
(実施例4.12)
精製されたHPV58 L1:33Cウイルス様粒子の調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
精製されたHPV58 L1:33Cウイルス様粒子の調製
実験方法及び手順は実施例4.1と同一であった。
(実施例5)
ウイルス様粒子の形態学的観察
(実施例5.1)
HPV6 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
透過型電子顕微鏡用としてサンプル(10μL)を採取した。サンプルを、炭素被覆銅格子上に2分間固定し、残りの液体を濾紙で吸い取り、次にリンタングステン酸(Beijing Electron Microscopy China Technology Co., Ltd.社、濃度2%、pH6.5)を用いて、2回、各回30秒間染色し、残りの染色溶液を濾紙で吸い取り、サンプルを乾燥放置し、次に透過型電子顕微鏡観察を実施した。透過型電子顕微鏡(ブランド:Hitachi社、モデル番号:H-7650)は、80KV、倍率80,000×であった。
ウイルス様粒子の形態学的観察
(実施例5.1)
HPV6 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
透過型電子顕微鏡用としてサンプル(10μL)を採取した。サンプルを、炭素被覆銅格子上に2分間固定し、残りの液体を濾紙で吸い取り、次にリンタングステン酸(Beijing Electron Microscopy China Technology Co., Ltd.社、濃度2%、pH6.5)を用いて、2回、各回30秒間染色し、残りの染色溶液を濾紙で吸い取り、サンプルを乾燥放置し、次に透過型電子顕微鏡観察を実施した。透過型電子顕微鏡(ブランド:Hitachi社、モデル番号:H-7650)は、80KV、倍率80,000×であった。
電子顕微鏡観察を図2Aに示す。図2Aで見られる通り、C末端が改変されたHPV6 L1:33Cは、平均直径がおよそ60nmの均一な大きさのウイルス様粒子を形成することができる。
(実施例5.2)
HPV11 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
HPV11 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
電子顕微鏡観察を図2Bに示す。図2Bで見られる通り、C末端が改変されたHPV11 L1:33Cは、平均直径がおよそ60nmの均一な大きさのウイルス様粒子を形成することができる。
(実施例5.3)
HPV16L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
HPV16L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
電子顕微鏡観察を図2Cに示す。図2Cで見られる通り、C末端が改変されたHPV16L1:33Cは、平均直径がおよそ60nmの均一な大きさのウイルス様粒子を形成することができる。
(実施例5.4)
HPV18 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
HPV18 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
電子顕微鏡観察を図2Dに示す。図2Dで見られる通り、C末端が改変されたHPV18 L1:33Cは、平均直径がおよそ60nmの均一な大きさのウイルス様粒子を形成することができる。
(実施例5.5)
HPV31 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
HPV31 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
電子顕微鏡観察を図2Eに示す。図2Eで見られる通り、C末端が改変されたHPV31 L1:33Cは、平均直径がおよそ60nmの均一な大きさのウイルス様粒子を形成することができる。
(実施例5.6)
HPV35 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
HPV35 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
電子顕微鏡観察を図2Fに示す。図2Fで見られる通り、C末端側が改変されたHPV35 L1:33Cは、平均直径がおよそ60nmの均一な大きさのウイルス様粒子を形成することができる。
(実施例5.7)
HPV39 L1:59Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
HPV39 L1:59Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
電子顕微鏡観察を図2Gに示す。図2Gで見られる通り、C末端が改変されたHPV39 L1:59Cは、平均直径がおよそ60nmの均一な大きさのウイルス様粒子を形成することができる。
(実施例5.8)
HPV45 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
HPV45 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
電子顕微鏡観察を図2Hに示す。図2Hに見られる通り、C末端が改変されたHPV45L1: 33Cは、平均直径がおよそ60nmの均一な大きさのウイルス様粒子を形成することができる。
(実施例5.9)
HPV51L1: 33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
HPV51L1: 33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
電子顕微鏡観察を図2Iに示す。図2Iで見られる通り、C末端が改変されたHPV51 L1:33Cは、平均直径がおよそ60nmの均一な大きさのウイルス様粒子を形成することができる。
(実施例5.10)
HPV52 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
HPV52 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
電子顕微鏡観察を図2Jに示す。図2Jで見られる通り、C末端が改変されたHPV52 L1:33Cは、平均直径がおよそ60nmの均一な大きさのウイルス様粒子を形成することができる。
(実施例5.11)
HPV56 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
HPV56 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
電子顕微鏡観察を図2Kに示す。図2Kで見られる通り、C末端が改変されたHPV56 L1:33Cは、平均直径がおよそ60nmの均一な大きさのウイルス様粒子を形成することができる。
(実施例5.12)
HPV58 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
HPV58 L1:33Cウイルス様粒子の形態学的観察
実験方法及び手順は実施例5.1と同一であった。
電子顕微鏡観察を図2Lに示す。図2Lで見られる通り、C末端が改変されたHPV58 L1:33Cは、平均直径がおよそ60nmの均一な大きさのウイルス様粒子を形成することができる。
(実施例6)
動物を対象とするウイルス様粒子の免疫原性評価
(実施例6.1)
動物を対象とするHPV6 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
6.1.1 偽ウイルス中和細胞のモデリング
HPVは、in vitroでの培養が困難であり、また強い宿主特異性を有するので、ヒト以外の生物において複製するのが困難であり、したがって適する動物モデルが存在しない。したがって、ワクチンの免疫防御性を評価するための好適且つ有効なin vitroでの中和実験モデルを確立する必要性が存在する。
動物を対象とするウイルス様粒子の免疫原性評価
(実施例6.1)
動物を対象とするHPV6 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
6.1.1 偽ウイルス中和細胞のモデリング
HPVは、in vitroでの培養が困難であり、また強い宿主特異性を有するので、ヒト以外の生物において複製するのが困難であり、したがって適する動物モデルが存在しない。したがって、ワクチンの免疫防御性を評価するための好適且つ有効なin vitroでの中和実験モデルを確立する必要性が存在する。
HPV偽ウイルスは、HPVのin vitro中和にとって理想的なモデルである。すなわち、核酸を非特異的にカプセル化するというHPV VLPの特徴により、遊離DNAをカプセル化すること又は外因性プラスミドを導入することによって、HPV偽ウイルスを、VLP(細胞内で発現したHPV L1及びL2から構成される)から形成可能である。
免疫化動物血清サンプルの免疫原性を、偽ウイルス中和アッセイ法により分析した。HPV6ウイルス様粒子で免疫化した動物は、HPV6に対する中和抗体を生成することができ、該中和抗体はHPV6偽ウイルスを中和することができる。免疫化動物血清を所定量の偽ウイルスと共にインキュベートし、次に細胞を感染させたとき、血清中の中和抗体が増加すると、GFP蛍光発現能力を有する細胞の数が減少し、ある特定の範囲において直線的な負の相関を示すが、それゆえに、GFPを発現する細胞数の変化を検出することによって、血清中の抗体の中和活性を評価することができる。
偽ウイルスの構築方法:HPV6 pCMV3-3-HPV6 L1+L2(L1配列はUniprot P69898に由来し、L2配列はUniprot Q84297に由来した)プラスミド(Sino Biological社から購入)、及び蛍光プラスミド(PSEU-GFP Spark、Sino Biological社から購入)を、293FT接着細胞(Thermo Fisher社から購入)中に同時トランスフェクトした。具体的な方法については、公表文献(Pastrana D V、Buck C B、Pang Y S、Thompson C D、Castle P E、FitzGerald P C、Kjaer S K、Lowy D R、Schiller J T. Reactivity of human sera in a sensitive、high-throughput pseudovirus-based papilloma virus neutralization assay for HPV16 and HPV18. [J] Virology 2004年、321:205～216頁)を参照のこと。偽ウイルス上清を収集、小分けし、そしてストック用として-80℃の冷凍庫に保管した。
6.1.2 動物を対象とするHPV6 L1:33Cウイルス様粒子の免疫防御評価
マウスにおける免疫化手順:
HPV6 L1:33Cウイルス様粒子を、リン酸アルミニウムアジュバント上に吸着、混合し、そしてマウス1匹当たり0.15μg/200μLの用量でマウス(合計10匹)を免疫化するのに使用した。0、7、及び21日目に、稀釈したサンプルを用いてマウスを免疫化したが、コントロールマウスはブランク血清で免疫化した。28日目にマウスの眼から血液を収集し、そして血清を偽ウイルス中和力価アッセイ用として単離した。
マウスにおける免疫化手順:
HPV6 L1:33Cウイルス様粒子を、リン酸アルミニウムアジュバント上に吸着、混合し、そしてマウス1匹当たり0.15μg/200μLの用量でマウス(合計10匹)を免疫化するのに使用した。0、7、及び21日目に、稀釈したサンプルを用いてマウスを免疫化したが、コントロールマウスはブランク血清で免疫化した。28日目にマウスの眼から血液を収集し、そして血清を偽ウイルス中和力価アッセイ用として単離した。
マウスのEC50アッセイ:
マウス血清を、56℃にて30分間不活性化し、6000gにて5分間遠心分離し、そしてアッセイ用として上清を収集した。アッセイ前の4～8時間、293FT細胞を、細胞15,000個/ウェルの密度で、96ウェルプレート中にイノキュレーションし、そして5% CO2を含むCO2インキュベーター中、37℃にてインキュベートした。免疫後のマウス血清及びブランクコントロール血清を、中和培地を用いてそれぞれ連続稀釈し、次に6.1において調製したHPV6偽ウイルスと、1:1の容積比で混合し、2～8℃にて1時間インキュベートし、次に100μL/ウェルの混合物を293FT細胞(予め4～8時間イノキュレーションしてある)に添加した。各サンプルは二重で使用し、ブランク血清コントロール群、偽ウイルス陽性コントロール群、及び偽ウイルス陰性コントロール群を使用した。偽ウイルスに感染した細胞について、5% CO2を含むCO2インキュベーター内、37℃にて62～96時間インキュベートし、蛍光スキャニング写真撮影を行い、そしてELISPOTアナライザー(モデル番号:S6 Universal-V Analyzer、製造業者:CTL)において計測した。Reed-Muench法に従い、各マウス血清サンプルの中和阻害に基づいて、50%中和阻害するときの血清の最大稀釈率、すなわち半有効稀釈率(half efficacy dilution)EC50をマウス血清サンプル毎に計算した。
マウス血清を、56℃にて30分間不活性化し、6000gにて5分間遠心分離し、そしてアッセイ用として上清を収集した。アッセイ前の4～8時間、293FT細胞を、細胞15,000個/ウェルの密度で、96ウェルプレート中にイノキュレーションし、そして5% CO2を含むCO2インキュベーター中、37℃にてインキュベートした。免疫後のマウス血清及びブランクコントロール血清を、中和培地を用いてそれぞれ連続稀釈し、次に6.1において調製したHPV6偽ウイルスと、1:1の容積比で混合し、2～8℃にて1時間インキュベートし、次に100μL/ウェルの混合物を293FT細胞(予め4～8時間イノキュレーションしてある)に添加した。各サンプルは二重で使用し、ブランク血清コントロール群、偽ウイルス陽性コントロール群、及び偽ウイルス陰性コントロール群を使用した。偽ウイルスに感染した細胞について、5% CO2を含むCO2インキュベーター内、37℃にて62～96時間インキュベートし、蛍光スキャニング写真撮影を行い、そしてELISPOTアナライザー(モデル番号:S6 Universal-V Analyzer、製造業者:CTL)において計測した。Reed-Muench法に従い、各マウス血清サンプルの中和阻害に基づいて、50%中和阻害するときの血清の最大稀釈率、すなわち半有効稀釈率(half efficacy dilution)EC50をマウス血清サンプル毎に計算した。
HPV6血清偽ウイルス中和力価アッセイの結果をTable 4(表4)に詳記する。
注記:
1. 動物の数、N = 10。
2. GMT(Geometric Mean Titer):幾何平均力価。
3. SEM(Standard Error of Mean):標準誤差。
1. 動物の数、N = 10。
2. GMT(Geometric Mean Titer):幾何平均力価。
3. SEM(Standard Error of Mean):標準誤差。
上記評価結果は、本発明により調製されたHPV6 L1:33Cウイルス様粒子は良好な免疫原性を有し、動物において高い力価を有する中和抗体(HPV感染症を予防するためのワクチン調製に使用可能)を生成し得ることを示している。
(実施例6.2)
動物を対象とするHPV11 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P04012に由来し、L2配列はUniprot P04013に由来した。
動物を対象とするHPV11 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P04012に由来し、L2配列はUniprot P04013に由来した。
HPV11血清偽ウイルス中和力価アッセイの結果をTable 5(表5)に詳記する。
上記評価結果は、本発明により調製されたHPV11 L1:33Cウイルス様粒子は良好な免疫原性を有し、動物において高力価の中和抗体を生成し得ること、及びHPV感染症を予防するためのワクチン調製に使用可能であることを示している。
(実施例6.3)
動物を対象とするHPV16L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P03101に由来し、L2配列はUniprot P03107に由来した。
動物を対象とするHPV16L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P03101に由来し、L2配列はUniprot P03107に由来した。
HPV16血清偽ウイルス中和力価アッセイの結果をTable 6(表6)に詳記する。
上記評価結果は、本発明により調製されたHPV16L1:33Cウイルス様粒子は良好な免疫原性を有すること、及び動物において高力価の中和抗体(HPV感染症を予防するためのワクチン調製に使用可能)を生成し得ることを示している。
(実施例6.4)
動物を対象とするHPV18 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot Q80B70に由来し、L2配列はUniprot P06793に由来した。
動物を対象とするHPV18 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot Q80B70に由来し、L2配列はUniprot P06793に由来した。
HPV18血清偽ウイルス中和力価アッセイの結果をTable 7(表7)に詳記する。
上記評価結果は、本発明により調製されたHPV18 L1:33Cウイルス様粒子は良好な免疫原性を有し、動物において高力価の中和抗体を生成し得ること、及びHPV感染症を予防するためのワクチン調製に使用可能であることを示している。
(実施例6.5)
動物を対象とするHPV31 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P17388に由来し、L2配列はUniprot P17389に由来した。
動物を対象とするHPV31 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P17388に由来し、L2配列はUniprot P17389に由来した。
HPV31血清偽ウイルス中和力価アッセイの結果をTable 8(表8)に詳記する。
上記評価結果は、本発明により調製されたHPV31 L1:33Cウイルス様粒子は良好な免疫原性を有し、動物において高力価の中和抗体を生成し得ること、及びHPV感染症を予防するためのワクチン調製に使用可能であることを示している。
(実施例6.6)
動物を対象とするHPV35 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P27232に由来し、L2配列はUniprot P27234に由来した。
動物を対象とするHPV35 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P27232に由来し、L2配列はUniprot P27234に由来した。
HPV35血清偽ウイルス中和力価アッセイの結果をTable 9(表9)に詳記する。
上記評価結果は、本発明により調製されたHPV35 L1:33Cウイルス様粒子は良好な免疫原性を有し、動物において高力価の中和抗体を生成し得ること、及びHPV感染症を予防するためのワクチン調製に使用可能であることを示している。
(実施例6.7)
動物を対象とするHPV39 L1:59Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P24838に由来し、L2配列はUniprot P24839に由来した。
動物を対象とするHPV39 L1:59Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P24838に由来し、L2配列はUniprot P24839に由来した。
HPV39血清偽ウイルス中和力価アッセイの結果をTable 10(表10)に詳記する。
上記評価結果は、本発明により調製されたHPV39 L1:59Cウイルス様粒子は良好な免疫原性を有し、動物において高力価の中和抗体を生成し得ること、及びHPV感染症を予防するためのワクチン調製に使用可能であることを示している。
(実施例6.8)
動物を対象とするHPV45 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P36741に由来し、L2配列はUniprot P36761に由来した。
動物を対象とするHPV45 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P36741に由来し、L2配列はUniprot P36761に由来した。
HPV45血清偽ウイルス中和力価アッセイの結果をTable 11(表11)に詳記する。
上記評価結果は、本発明により調製されたHPV45 L1:33Cウイルス様粒子は良好な免疫原性を有し、動物において高力価の中和抗体を生成し得ること、及びHPV感染症を予防するためのワクチン調製に使用可能であることを示している。
(実施例6.9)
動物を対象とするHPV51 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P26536に由来し、L2配列はUniprot P26539に由来した。
動物を対象とするHPV51 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P26536に由来し、L2配列はUniprot P26539に由来した。
HPV51血清偽ウイルス中和力価アッセイの結果をTable 12(表12)に詳記する。
上記評価結果は、本発明により調製されたHPV51 L1:33Cウイルス様粒子は良好な免疫原性を有し、動物において高力価の中和抗体を生成し得ること、及びHPV感染症を予防するためのワクチン調製に使用可能であることを示している。
(実施例6.10)
動物を対象とするHPV52 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot Q05138に由来し、L2配列はUniprot F8S4U2に由来した。
動物を対象とするHPV52 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot Q05138に由来し、L2配列はUniprot F8S4U2に由来した。
HPV52血清偽ウイルス中和力価アッセイの結果をTable 13(表13)に詳記する。
上記評価結果は、本発明により調製されたHPV52 L1:33Cウイルス様粒子は良好な免疫原性を有し、動物において高力価の中和抗体を生成し得ること、及びHPV感染症を予防するためのワクチン調製に使用可能であることを示している。
(実施例6.11)
動物を対象とするHPV56 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P36743に由来し、L2配列はUniprot P36765に由来した。
動物を対象とするHPV56 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P36743に由来し、L2配列はUniprot P36765に由来した。
HPV56血清偽ウイルス中和力価アッセイの結果をTable 14(表14)に詳記する。
上記評価結果は、本発明により調製されたHPV56 L1:33Cウイルス様粒子は良好な免疫原性を有し、動物において高力価の中和抗体を生成し得ること、及びHPV感染症を予防するためのワクチン調製に使用可能であることを示している。
(実施例6.12)
動物を対象とするHPV58 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P26535に由来し、L2配列はUniprot B6ZB12に由来した。
動物を対象とするHPV58 L1:33Cウイルス様粒子の免疫原性評価
実験方法及び手順は実施例6.1と同一であった。L1配列はUniprot P26535に由来し、L2配列はUniprot B6ZB12に由来した。
HPV58血清偽ウイルス中和力価アッセイの結果をTable 15(表15)に詳記する。
上記評価結果は、本発明により調製されたHPV58 L1:33Cウイルス様粒子は良好な免疫原性を有し、動物において高力価の中和抗体を生成し得ること、及びHPV感染症を予防するためのワクチン調製に使用可能であることを示している。
比較例1:C末端トランケートHPV16L1(aa1～474)の発現
本発明者らは、HPV16L1のC末端をアミノ酸31個分トランケートするように試み、そしてそれをHPV16L1(1～474)(配列番号27)と命名した。しかしながら、トランケートされたHPV16L1(1～474)タンパク質は高度に発現するものの、かなり不溶性であり、そして抽出及び精製が困難であることが試験で判明した。発現及び抽出の詳細な結果を図3に示す。
本発明者らは、HPV16L1のC末端をアミノ酸31個分トランケートするように試み、そしてそれをHPV16L1(1～474)(配列番号27)と命名した。しかしながら、トランケートされたHPV16L1(1～474)タンパク質は高度に発現するものの、かなり不溶性であり、そして抽出及び精製が困難であることが試験で判明した。発現及び抽出の詳細な結果を図3に示す。
例証及び実施形態として、これまで本発明を詳細に記載してきたが、それは理解しやすくするように意図されている。添付の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱せずに、様々な改変及び改善を本発明の技術的解決策に対してなし得ること、それらが業者にとって明らかに可能であることは当業者にとって明白である。
付録1:配列リスト-キメラヒトパピローマウイルス6型L1タンパク質
付録2:配列リスト-キメラヒトパピローマウイルス11型L1タンパク質
付録3:配列リスト-キメラヒトパピローマウイルス16型L1タンパク質
付録4:配列リスト-キメラヒトパピローマウイルス18型L1タンパク質
付録5:配列リスト-キメラヒトパピローマウイルス31型L1タンパク質
付録6:配列リスト-キメラヒトパピローマウイルス35型L1タンパク質
付録7:配列リスト-キメラヒトパピローマウイルス39型L1タンパク質
付録8:配列リスト-キメラヒトパピローマウイルス45型L1タンパク質
付録9:配列リスト-キメラヒトパピローマウイルス51型L1タンパク質
付録10:配列リスト-キメラヒトパピローマウイルス52型L1タンパク質
付録11:配列リスト-キメラヒトパピローマウイルス56型L1タンパク質
付録12:配列リスト-キメラヒトパピローマウイルス58型L1タンパク質
Claims (20)
- a.第1のパピローマウイルス型のL1タンパク質に由来するN末端断片であって、第1のパピローマウイルス型のL1タンパク質の免疫原性を維持する前記N末端断片と、
b.第2のパピローマウイルス型のL1タンパク質に由来するC末端断片であって、第2のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質が、その他の型のL1タンパク質と比較して、それより良好な発現レベル及び溶解度を有するC末端断片と
をそのN末端からC末端方向に含むキメラパピローマウイルスL1タンパク質であって、
第1のパピローマウイルス型のL1タンパク質の免疫原性を有する、キメラパピローマウイルスL1タンパク質。 - 前記N末端断片が、第1のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質の天然配列のC末端を、そのα5領域内の任意のアミノ酸位置でトランケートすることにより得られた断片、及びそれと少なくとも98%の同一性を有する断片であり、
前記C末端断片が、第2のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質の天然配列のN末端を、そのα5領域内の任意のアミノ酸位置でトランケートすることにより得られた断片、及び前記断片に対する更なる変異、欠失、及び/又は付加に起因する機能的バリアントである、
請求項1に記載のキメラパピローマウイルスL1タンパク質。 - 前記C末端断片が、1つ又は複数の核局在化配列を含有する、請求項2に記載のキメラパピローマウイルスL1タンパク質。
- 前記パピローマウイルスL1タンパク質が、HPVL1タンパク質である、請求項1に記載のキメラパピローマウイルスL1タンパク質。
- 第2のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質が、HPV1、2、3、4、6、7、10、11、13、16、18、22、26、28、31、32、33、35、39、42、44、45、51、52、53、56、58、59、60、63、66、68、73、又は82型のL1タンパク質から選択され、
好ましくは、第2のHPV型の前記L1タンパク質が、HPV16、28、33、59、又は68型のL1タンパク質から選択され、
より好ましくは、第2のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質が、HPV33型又はHPV59型のL1タンパク質から選択される、
請求項1に記載のキメラパピローマウイルスL1タンパク質。 - 前記C末端断片が、配列番号2、又はアミノ酸m1個の長さを有する断片、好ましくは配列番号2の1～m1位のアミノ酸をカバーする断片であり、m1は8～26の整数であり、或いは
前記C末端断片が、配列番号132、又はアミノ酸m2個の長さを有し、好ましくは配列番号132の1～m2位のアミノ酸をカバーする断片であり、m2は13～31の整数である、
請求項5に記載のキメラパピローマウイルスL1タンパク質。 - 前記C末端断片が、配列番号13、又はアミノ酸n個の長さを有するその断片、好ましくは配列番号13のアミノ酸1～nをカバーする断片であり、nは16～38の整数である、請求項5に記載のキメラパピローマウイルスL1タンパク質。
- 第1のパピローマウイルス型の前記L1タンパク質が、HPV6、11、16、18、31、35、39、45、51、52、56、又は58型のL1タンパク質から選択される、請求項1に記載のキメラパピローマウイルスL1タンパク質。
- 前記N末端断片の前記C末端が、前記C末端断片のN末端と、直接又はリンカーを介して接続している、請求項1から8のいずれか一項に記載のキメラパピローマウイルスL1タンパク質。
- 前記N末端断片のC末端が、前記C末端断片のN末端に接続されると、連続するアミノ酸配列RKFLが、接続ポイントから±4個のアミノ酸位置の範囲内に存在し、好ましくは、連続するアミノ酸配列LGRKFLが、接続ポイントから±6個のアミノ酸位置の範囲内に存在する、請求項1から9のいずれか一項に記載のキメラパピローマウイルスL1タンパク質。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載のキメラパピローマウイルスL1タンパク質を含むパピローマウイルス様粒子。
- 請求項11に記載のパピローマウイルス様粒子及びアジュバントを含む、パピローマウイルス関連の疾患又は感染症を予防するための免疫原性組成物。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載のキメラパピローマウイルスL1タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項13に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 前記ベクターが、バキュロウイルスベクターである、請求項14に記載のベクター。
- 請求項13に記載のポリヌクレオチドを含むバキュロウイルス。
- 請求項13に記載のポリヌクレオチド、請求項14若しくは請求項15に記載のベクター、又は請求項16に記載のバキュロウイルスを含む宿主細胞。
- 昆虫細胞であり、好ましくは前記昆虫細胞が、Sf9細胞、Sf21細胞、Hi5細胞、及びS2細胞から選択される、請求項17に記載の宿主細胞。
- 請求項11に記載のパピローマウイルス様粒子を調製する方法であって、
請求項17から18のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養して、前記キメラパピローマウイルスL1タンパク質を発現させ、及びウイルス様粒子に組織化させる工程と、
前記パピローマウイルス様粒子を精製する工程と
を含む方法。 - 前記精製が、カチオン交換クロマトグラフィーを使用して実施され、好ましくは前記カチオン交換クロマトグラフィーが、HS-MMA 2工程クロマトグラフィーである、請求項19に記載の方法。
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