BR112013032338B1

BR112013032338B1 - método para melhorar o rendimento de produção para proteína l1 do papilomavírus humano

Info

Publication number: BR112013032338B1
Application number: BR112013032338-8A
Authority: BR
Inventors: Hong Jin Kim; Hyoung Jin Kim
Original assignee: Posvax Co., Ltd
Priority date: 2011-06-15
Filing date: 2012-06-13
Publication date: 2021-04-20
Also published as: KR101458270B1; CL2013003545A1; WO2012173390A3; JP6001064B2; EP2722389B1; MX348241B; WO2012173390A2; EP2722389A2; CN103717741B; CA2839427A1; JP2014519339A; US8871466B2; KR20120138683A; AU2012270418B2; CN103717741A; US20140186888A1; BR112013032338A2; AU2012270418A1; EP2722389A4; MX2013014899A

Abstract

Método para melhorar o rendimento de produção da proteína L1 do papilomavírus humano. A presente invenção é um método para melhorar o rendimento da produção de proteína L 1 de HPV, incluindo a fase de cultura de células que expressam a proteína L1 de HPV, em um meio contendo alta concentração da fonte de carbono. De acordo com o método de cultura utilizando um meio contendo fontes de carbono altamente concentradas da presente invenção, o rendimento de produção da proteína L1 de HPV pode ser não só extremamente aumentado, mas também a 10 imunogenicidade da proteína L1 de HPV produzida é significativamente aumentada.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção se refere a um método para melhorar o rendimento de produção da proteína L1 do papilomavírus humano (HPV). Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um método para melhorar o rendimento de produção da proteína L1 de HPV, compreendendo a etapa de cultura de uma célula que expressa a proteína L1 de HPV em meios contendo alta concentração da fonte de carbono total.

Estado da Técnica

[002] O câncer do colo do útero é causado pela infecção por papilomavírus humano (HPV) [1], O câncer do colo do útero ocorre em cerca de 500.000 mulheres por ano, resultando em 250.000 mortes [2]. Assumiu-se que a maioria das mulheres têm infecções assintomáticas por HPV, por vezes, em suas vidas [3, 4],

[003] O HPV tipo 16 (HPV 16) é considerado o tipo mais importante porque representa a causa de mais de 50% dos casos de câncer do colo do útero e causa 90% dos cânceres de cabeça e pescoço [5]. A proteína L1 ocupa 80-90% do capsídeo do HPV e tem a propriedade de se auto-organizar em partículas semelhantes a vírus (VLPs), cuja estrutura é semelhante à dos viriões de HPV que ocorrem naturalmente [6]. Então, tem sido considerado que a imunização com VLPs de HPV provoca a neutralização de anticorpos eficientemente [7]. Atualmente, existem dois tipos de vacinas profiláticas baseadas em VLPs disponíveis comercialmente. Uma é a Gardasil® (Merck) que é produzido pelo sistema de expressão do Saccharomyces cerevisiae, e a outra é a Cervarix® (GlaxoSmithKline), que é produzida pelo sistema de expressão de células de insetos [8]. Essas vacinas contêm HPV 16 e VLPs 18 como antígenos, sendo que se adota um protocolo de imunização de três doses e para ter efeitos de proteção de 70% de câncer de colo do útero, teoricamente, porque as infecções de HPV 16 e 18 são responsáveis pela causa de 70% de todos os cânceres de colo do útero [9]. O preço de varejo de Gardasil® ou Cervarix® é de aproximadamente $ 120,00 dólares americanos por dose e 360,00 dólares americanos para a série completa [10]. Os altos preços de varejo atuais das vacinas contra o HPV têm limitado a difusão do uso das mesmas, e estas vacinas são inacessíveis nos países em desenvolvimento por causa de seus altos preços de varejo [11]. Portanto, a estratégia para melhorar o rendimento do antígeno da vacina, a proteína L1, é uma alta prioridade no campo da vacina de HPV.

[004] Para garantir o benefício econômico durante o processo de fabricação de produtos biofarmacêuticos, a produtividade melhorada no biorreator no processo à montante deve levar à melhoria do rendimento do produto final [12]. No entanto, pouca atenção tem sido dada a este princípio, e poucos estudos têm sido feitos para melhorar a taxa de rendimento, otimizando a condição de cultura, no caso da produção de proteína recombinante L1 do HPV. Além disso, o estudo para comparar as produtividades de proteínas L1 em condições de culturas variadas é praticamente difícil, porque o protocolo para purificação da proteína L1 de HPV é demorado, dispendioso e trabalhoso. Recentemente, foi desenvolvido um método de etapa única de purificação cromatográfica para a proteína L1 de HPV produzida por Saccharomyces cerevisiae, que é adequado para a produção em grande escala da proteína L1 de HPV e possível de ser adotado para várias amostras [13].

[005] O promotor GAL10 de Saccharomyces cerevisiae é o promotor mais poderoso e frequentemente usado para a produção heterogênea de proteínas [14, 15]. O Saccharomyces cerevisiae, preferencialmente, utiliza a glicose, caso haja glicose e galactose, e os promotores GAL são induzidos por galactose, quando o sistema de glicose é reprimido [16]. Portanto, a composição das fontes de carbono é o fator mais importante para a produção de proteína recombinante sob o sistema de promotor GAL10 [17-19], Geralmente, a produção da proteína L1 em Saccharomyces cerevisiae requer 4872h de tempo de cultura e 2-4% de fonte de carbono, que são compostas de glicose e galactose [20-22]. No entanto, tem havido poucos estudos sobre os resultados de melhoria de rendimento da expressão da proteína L1 de HPV por meio da alteração da composição e concentração da fonte de carbono no meio de cultura.

[006] Na presente invenção, foram incluídos relatórios e descrições anteriores. Os conteúdos dos relatórios e descrições anteriores foram inseridos no presente conteúdo, e essas referências ajudar a esclarecer sobre o conteúdo do presente relatório.

Descrição Problema do Estado da Técnica

[007] Os presentes inventores tentaram desenvolver uma estratégia para melhorar o rendimento da produção da proteína L1 de HPV no processo de cultura de células para a expressão da proteína L1 de HPV. Como resultado, os presentes inventores confirmaram que a produtividade da proteína L1 de HPV aumenta significativamente quando o meio apresenta concentração elevada de fonte de carbono, sendo que a concentração da fonte de carbono utilizada é maior do que a usada convencionalmente. Além disso, verificou-se que o uso de meios com alta concentração da fonte de carbono aumenta significativamente a imunogenicidade da proteína L1, quando comparada à que é produzida nos meios convencionais. Estes resultados indicam que a utilização dos meios contendo alta concentração de fonte de carbono aumenta, não só a produtividade da proteína L1, mas também a imunogenicidade do que é produzido.

[008] Portanto, o objeto da presente invenção é fornecer o método para melhorar a produtividade da proteína L1 através da utilização do meio contendo alta concentração da fonte de carbono. O benefício e o objeto da presente invenção foram fornecidos pela descrição detalhada da invenção, reivindicações, exemplos, tabelas e figuras abaixo.

Solução Técnica

[009] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para melhorar o rendimento de produção da proteína L1 de HPV, compreendendo a etapa de cultura de uma célula que expressa a proteína L1 de HPV em um meio contendo uma fonte de carbono total em uma concentração de 6 a 14%.

[0010] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é descrito um método para melhorar o rendimento de produção da proteína L1 de HPV, compreendendo a etapa de: (a) preparo do meio contendo a fonte de carbono total em uma concentração de 6 a 14%; e (b) inoculação de uma célula que expressa a proteína L1 de HPV no meio, e cultivo da célula que expressa a proteína L1 HPV no meio.

[0011] Como descrito na presente invenção, o termo “fonte de carbono” refere-se a carboidratos que são absorvidos e utilizados como células fonte de carbono ou fonte de energia por compreende componentes das células. Por exemplo, a fonte de carbono da presente invenção inclui glicose, galactose, sacarose, maltose, frutose, lactose, xilose, piruvato, citrato, succinato, cis-aconitato, a-cetoglutarato, fumarato, malato e oxaloacetato, mas não se limita aos mesmos. De preferência, a fonte de carbono é glicose, galactose, sacarose, maltose, frutose, lactose ou xilose e, de preferência, as fontes de carbono são glicose ou galactose.

[0012] Como descrito na presente invenção, o termo “fonte de carbono total” refere-se a todas as fontes de carbono contidas no meio. Por exemplo, a fonte de carbono total refere-se à soma dos valores de glicose e galactose, quando glicose e galactose estiverem incluídas no meio, como fonte de carbono. Os meios contendo fontes de carbono total em uma concentração de 6 a 14% foram utilizados na presente invenção. A percentagem (%) de fonte de carbono indica o peso de carboidrato ou fonte total de carbono contida no meio para o volume de meio (P/V) no presente relatório descritivo.

[0013] Os níveis de concentração de fonte de carbono, que variam de 6-14%, utilizados na presente invenção são significativamente mais elevados do que os usados em meio convencional para cultura de leveduras, visando produzir uma proteína heterogênea. A presente invenção se baseia nos fatos de que não só o rendimento de produção, mas também a atividade biológica, como a imunogenicidade da proteína L1, é aumentada de forma significativa quando a proteína L1 de HPV é expressa em meios contendo alta concentração da fonte de carbono.

[0014] Preferencialmente, a concentração da fonte de carbono total é maior do que 6% e menor do que 14%, mais preferencialmente, de 6 a 13% ou de 6 a 12%. Ainda mais preferencialmente, de 7 a 14%, de 7 a 13% ou de 7 a 12%, mais preferencialmente de 8 a 14%, 8 a 13% ou 8 a 12%, sendo a concentração mais preferida.

[0015] Quando a fonte de carbono total consiste em glicose e galactose, a proporção de glicose e galactose na fonte de carbono total não é limitada, mas preferencialmente é de 5:5 a 9:1, e mais preferencialmente é 4:4 a 7:1.

[0016] De acordo com uma realização exemplar da presente invenção, o método da presente invenção ainda compreende a etapa (c) de adicionar uma fonte de carbono ao meio após a etapa (b).

[0017] A fonte de carbono adicionada ao meio na etapa (c) é glicose ou galactose e, preferencialmente, galactose.

[0018] Como definido na presente invenção, o termo “proteína L1 de HPV" refere-se à proteína L1, que é a principal proteína de constituição do capsídeo do HPV, e tem propriedades de automontagem que constitui as partículas semelhantes ao vírus (VLPs) em si, quando é expresso de forma recombinante em células hospedeiras. Portanto, na presente invenção, o significado da proteína L1 de HPV é idêntico ao de VLP de HPV.

[0019] Na presente invenção, o tipo de HPV do qual a proteína L1 é derivada a partir de, por exemplo, HPV 6a, 6b, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 ou 68, mas não se limita aos mesmos.

[0020] Preferencialmente, a proteína L1 do HPV é HPV 16, HPV 18 ou HPV 58.

[0021] Na presente invenção, as proteínas L1 do HPV são, preferencialmente, usadas para expressar proteínas L1 do tipo selvagem que são conhecidas no estado da técnica.

[0022] Como definido na presente invenção, o termo “célula que expressa proteína L1 de HPV” refere-se a uma célula hospedeira transformada com o vetor de expressão da proteína L1 de HPV. O vetor de expressão da proteína L1 de HPV pode ser preparado por clonagem da sequência de polinucleotídeos que codifica a proteína L1 no vetor. Tal vetor de expressão pode ser preparado por vários tipos de protocolos de clonagem conhecidos no estado da técnica, e as estratégias de clonagem detalhadas são divulgadas em Sambrook et al. [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)]. Esta literatura é apresentada como referência no presente relatório descritivo.

[0023] O polinucleotídeo que codifica a proteína L1 de HPV pode ser transcrito ou ligado às sequências nucleotídicas de controle de tradução para a expressão eficiente da proteína L1 na célula hospedeira. Por exemplo, um promotor ou uma sequência de terminador de transcrição do gene de L1 pode ser ligado ao polinucleotídeo que codifica a proteína L1 de HPV. De acordo com uma realização preferencial, o promotor de galactose, como o promotor GAL1, promotor de Saccharomyces cerevisiae, pode ser utilizado na presente invenção, e os promotores GAL1, GAL10, ADH1, TDH3 ou PGK ou promotores derivados de outros eucariontes podem ser utilizados. A sequência de terminador de ADH1 de S. cerevisiae pode ser usada, e também sequências de terminadores de outros eucariontes podem ser utilizadas na presente invenção.

[0024] As células de mamíferos, de insetos, leveduras ou bactérias podem ser utilizadas como células hospedeiras, preferencialmente células de animais ou de leveduras, mais preferencialmente de leveduras. As leveduras são apropriadas para a eficiência de expressão de proteína L1 de HPV e a produção em larga escala de proteína heterogênea utilizando biorreator.

[0025] De acordo com uma realização preferencial, leveduras como hospedeiras são Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp., Hansenula spp., Pichia spp., Candida spp., Torulopsis spp., Rhodotorula spp., Paffía spp., Kluyveromyces spp., Talaromyces spp., Brettanomyces spp., Pachysolen spp. e Debaryomyces spp., mas sem se limitar às mesmas.

[0026] As leveduras são, preferencialmente, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis ou Schizosaccharomyces pombe, e mais preferencialmente Saccharomyces cerevisae ou Pichia pastoris.

[0027] Na presente invenção, quando a célula hospedeira é uma célula eucariótica como a de leveduras, microinjeção direta [Capecchi, MR, Cell, 22:479 (1980)], a precipitação com fosfato de cálcio [Graham, FL et al., Virology, 52:456 (1973)], eletroporação [Neumann, E. et al., EMBO J, 1:841 (1982)], a transfecção mediada por lipossomos [Wong, TK et al., Gene, 10:87 (1980)], tratamento de DEAE-dextrano [Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190 (1985)] e o bombardeamento de partículas [Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)] pode ser realizado para a transformação de células eucarióticas com vetor de ancoragem do gene L1 de HPV. Entretanto, quando a célula hospedeira é uma célula eucariótica, o método de CaCfe [Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci., EUA, 9:2110-2114 (1973)], o método de Hanahan [Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci., EUA, 9:2110-2114 (1973), Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580 (1983)] e o método de eletroporação [Dower, WJ et al., Nucleic Acids Res., 16:6127-6145 (1988)] pode ser realizado por transformação da célula procariótica com um vetor que ancora o gene L1 de HPV.

[0028] Os meios que podem ser usados para cultura de leveduras na presente invenção é um meio adequado para a produção da proteína L1 de HPV, e os meios adequados podem ser selecionados dependendo do tipo de célula hospedeira. De acordo com uma realização preferencial, os meios convencionais para a cultura de leveduras podem ser utilizados, e o tipo de meio não está limitado a meios específicos. Por exemplo, meios YPD contendo extrato de levedura, peptona, meio de glicose/dextrose ou um meio que é uma modificação destes podem ser utilizados, e como uma fonte de carbono nos meios YPD, um meio YPDG que inclui, adicionalmente, galactose além de glicose pode ser usada.

[0029] A cultura de células é geralmente realizada sob condições aeróbias, tais como a cultura de caldo ou fermentação utilizando biorreator. A temperatura da cultura é de preferência entre 15 e 40°C, o tempo de cultura é normalmente de 5 a 7 horas, mas o tempo de cultura pode variar de acordo com a condição e as exigências da cultura. De preferência, 3,0-9,0 de pH no meio de cultura deve ser mantido. O pH do meio de cultura pode ser ajustado pela adição de ácido orgânico, solução alcalina, ureia, carbonato de cálcio, amónia, etc. Antibióticos como ampicilina ou tetraciclina podem ser adicionados durante a fermentação.

[0030] O método para a separação de proteínas L1 de HPV expressas a partir de células cultivadas na presente invenção pode ser realizado utilizando a separação convencional e um método de purificação. Por exemplo, fracionamento de solubilidade da proteína L1 utilizando sulfato de amónio ou precipitação com PEG, ultrafiltração, cromatografia (produzida por fracionamento, como função do tamanho, carga elétrica, hidrofobicidade ou afinidade) de fracionamento, fracionamento de diálise e outros métodos podem ser utilizados, e a combinação dos métodos acima são utilizados, principalmente para o fracionamento e purificação. O método para a separação de proteínas L1 de HPV expressas a partir de células cultivadas pode ser, de preferência, realizada através do método enumerado [HJ Kim et a/., Protein Expr. Purif, 70 (2010) 68-74],

[0031] O método da presente invenção pode ser aplicado a vários métodos de cultura de células para a produção de proteínas recombinantes, por exemplo, cultura em lote, cultura contínua, cultura alimentada em lotes, mas não está limitado aos mesmos.

Efeitos Vantajosos

[0032] A presente invenção refere-se a um método para melhorar o rendimento da proteína L1 de HPV que contém a fase de cultura de células que expressam a proteína L1 de HPV de um meio com concentração elevada de fonte de carbono total. De acordo com o método de cultura utilizando os meios que contêm fontes de carbono de alta concentração do presente invento, o rendimento de proteína L1 do HPV não só pode ser significativamente aumentada, mas também podem melhorar a imunogenicidade das VLPs de L1 de HPV finalmente recuperadas.

Descrição dos Desenhos

[0033] A Figura 1a mostra o processo de purificação de L1 de HPV 16.

[0034] A Figura 1b indica a composição da fonte de carbono utilizada na presente invenção. As quantidades de proteínas L1 de HPV expressas como uma função da concentração de fonte de carbono e as quantidades de proteínas L1, finalmente recuperadas após as purificações, foram comparadas. As composições de fontes de carbono em caixas-pretas são as composições que indicam as quantidades de proteínas L1 finalmente recuperadas após purificações.

[0035] A Figura 2a é a medição do resultado dos crescimentos de células que expressam as proteínas L1 de HPV 16 como uma função da composição da fonte de carbono.

[0036] A Figura 2b mostra o resultado da medição do nível de expressão da proteína L1 de HPV 16 por célula, como uma função da composição da fonte de carbono. A tubulina foi utilizada como controle interno (Figura 2b), e análise de Western blotting foi realizada tal como descrita nos Métodos do Exemplo 1.

[0037] Figura 3a é o resultado da medição do rendimento volumétrico da proteína L1 de HPV 16, como uma função da composição de fontes de carbono. Para medir o rendimento volumétrico da proteína L1, foi cultivada Saccharomyces cerevisiae para a produção da proteína L1 em 50 ml_ de meio YPDG. Cada mililitro da cultura foi recolhido a partir de cada condição de fonte de carbono a 48, 96 e 144 horas de ponto de cultura, e a célula foi rompida utilizando 0,2 ml_ de tampão de ruptura [fosfato de sódio 20 mM, NaCI 150 mM, EDTA 1,7 mM com pH 7,2 + 0,01% de Tween 80]. Os lisados celulares foram diluídas a 1:50 com água destilada (AD), e 10 μL de cada diluição foi aplicado, e a eletroforese foi realizada e, então, a banda da proteína L1 foi detectada utilizando o método de análise de Western blotting.

[0038] A Figura 3b é um gráfico que apresenta os rendimentos volumétricos das proteínas L1 de HPV 16, obtidos a partir de células de fase estacionária de cultura durante 144 horas, sob condições adequadas de fontes de carbono total. Os rendimentos volumétricos de proteínas L1 são apresentados como os valores relativos deduzidos a partir de que a intensidade da banda da proteína L1 de HPV 16 de cultura, a proporção de glicose (%) e galactose (%), que é de 6:6, foi fixada em 100%. O resultado deste experimento foi obtido a partir de dois experimentos independentes, e o rendimento volumétrico foi apresentado como média ± desvio padrão (DP).

[0039] A Figura 4a é o resultado da medição dos rendimentos volumétricos das proteínas L1 de HPV 16 obtidos a partir de meios de cultura que foram compostos de 4, 4,5, 5, 5,5 e 6% da fonte de carbono total, respectivamente. Para investigar a quantidade de proteína L1 expressa como uma função da concentração da fonte de carbono total que varia de 4 a 6%, a concentração de fonte de carbono total no meio foi preparada para 4, 4,5, 5, 5,5 ou 6%. A proporção de glicose e galactose em cada fonte de carbono composição total foi ajustada a 1:1. Portanto, a proporção de glicose (%) e galactose (%) nestes meios são 2:2, 2,25:2,25, 2,5:2,5, 2,75:2,75 e 3:3, respectivamente. As células dos meios foram colhidas quando a densidade óptica a 600 nm atingiu 30 (fase estacionária), e foram lisadas utilizando 0,2 ml_ de tampão de ruptura [fosfato de sódio 20 mM, NaCI 150 mM, EDTA 1,7 mM a pH 7,2 + 0,01 % de Tween 80]. Após o lisado celular ser diluído a 1:50 com AD, 10 μL de cada diluição foi aplicado, a eletroforese foi realizada, e, em seguida, a banda da proteína L1 foi medida utilizando o método de Western blotting.

[0040] A Figura 4b mostra o resultado de um gráfico da intensidade da proteína L1 de HPV 16 do Western blotting da Figura 4a. As intensidades de banda L1 foram expressas como os valores relativos deduzidos a partir de que a intensidade da banda de L1 de 6% da condição de fonte de carbono total foi de 100%.

[0041] A Figura 5a mostra as purezas das proteínas L1 de HPV 16 como uma função da composição de fonte de carbono. As células foram colhidas na fase estacionária (A600: 30-47), e as proteínas L1 foram purificadas. As proteínas L1 foram, finalmente, analisadas por SDS-PAGE e Western blotting.

[0042] A Figura 5b mostra as quantidades de proteínas L1 do HPV 16 purificadas recuperadas a partir das células cultivadas em 150 ml_ de meio YPDG até fase estacionária (600 nm: DO 30-47). O resultado foi obtido a partir de duas experiências independentes, e a quantidade de proteína L1 foi apresentada como média ± DP.

[0043] A Figura 6a mostra a expressão aumentada da proteína L1 de HPV 16 por alimentação de galactose na cultura alimentada em lotes. Saccharomyces cerevisiae, que produz a proteína L1 de HPV 16 foi cultivado em meio contendo 7% de glicose e 1% de galactose durante 144 h. Posteriormente, a galactose foi adicionada à cultura para criar o conteúdo de 1,4%, finalmente, cada um a 144, 169 e 192 h, e as células ainda foram cultivadas até 216 h. Depois dos cultivos, as proteínas L1 do HPV 16 foram detectadas por Western blotting.

[0044] A Figura 6b é um gráfico que mostra as intensidades das bandas de proteínas L1 de HPV 16 no Western blotting da Figura 6a. As intensidades das bandas de proteínas L1 de HPV 16 foram apresentadas como os valores relativos deduzidos a partir de que a intensidade da banda da proteína L1 a partir da célula em cultura durante 216 h foi fixada em 100%.

[0045] A Figura 7 mostra o resultado da purificação das proteínas L1 de HPV 16 purificadas a partir de células que foram cultivadas em meio de cultura composto de 2, 4, 6 ou 8% de fonte de carbono total até a fase estacionária (A600: DO = 18-38), sob a condição de fonte de carbono total em que a proporção de glicose e galactose é de 1:1. Confirmou-se que a quantidade de rendimento da proteína L1 aumenta acentuadamente quando as células foram cultivadas em meios contendo mais que 6% da fonte de carbono total.

[0046] A Figura 8a mostra os resultados da medição das purezas e concentrações das proteínas L1 de HPV 16, finalmente, recuperadas a partir de culturas com 2, 4, 6 e 8% de fonte de carbono total, para confirmar se quantidades iguais de proteínas L1 de HPV 16 foram injetadas por imunizações de camundongo. 300, 150 ou 75 ng de proteínas L1 de HPV 16, em que a quantidade de cada uma foi quantificada pelo ensaio de proteína de Bradford, e em que foi aplicado em cada poço de 12% de poliacrilamida, separado e visualizado por coloração com prata. A pureza de cada uma das proteínas L1, as quais foram purificadas a partir de condições de cultura contendo 2, 4, 6 ou 8% de fonte de carbono total, foi confirmado ser a mesma, e as concentrações das proteínas purificadas foram exatas. Por isso, confirmou-se que quantidades iguais de proteínas L1 purificadas a partir da condição de meios contendo 2, 4, 6 e 8% de fonte de carbono total foram utilizadas para imunizar camundongos.

[0047] A Figura 8b mostra os títulos de anticorpo IgG de anti-L1 de HPV 16 e os títulos de anticorpos neutralizantes anti-HPV 16, que foram medidos após os camundongos serem imunizados três vezes com 10 ng de proteínas L1 de HPV 16, que foram purificadas a partir das condições de cultura contendo 2, 4, 6 e 8% de fonte de carbono total, respectivamente, por dose. Enquanto as proteínas L1 do HPV 16 purificadas a partir dos meios de cultura que contém 2 e 4% da fonte de carbono total mostraram menos de 3.200 valores de títulos de anticorpo IgG de anti-L1 de HPV 16, as proteínas L1 do HPV 16 purificadas a partir das condições médias que contêm 6 e 8% da fonte de carbono total mostraram os valores de 51.200 e 512.000, na titulação. Portanto, os títulos de IgG anti-L1 de HPV 16 da condição de 6 e 8% de fonte de carbono são 16 e 160 vezes mais elevados do que a condição de 2 e 4% de fonte de carbono, respectivamente. Do mesmo modo, estas diferenças no título de IgG anti-L1 de HPV 16 foram observadas no título de anticorpos neutralizantes. Foi confirmado experimentalmente que a imunogenicidade da proteína L1 de HPV 16 surpreendentemente melhora quando é usada a condição do meio contendo mais do que 6% da fonte de carbono.

[0048] A Figura 9 mostra o resultado da medição de padrões de expressão de proteínas L1 de HPV 18, como uma função do teor de fonte de carbono em uma forma comparativa. A célula foi cultivada até a fase estacionária (A600 DO: 22-40) em um meio contendo 2, 4, 6 ou 8% da fonte de carbono total e uma proporção de glicose e galactose que é definida em 1:1. A quantidade de proteína L1 do HPV 18, expressa a partir da célula de cultura, foi confirmada por análise de Western blotting. Confirmou-se que a expressão da proteína L1 de HPV 18 aumenta na condição em que contém mais do que 6% da fonte de carbono, em comparação com as condições de 2 ou 4% da fonte de carbono.

[0049] A Figura 10a mostra o resultado que confirma o efeito da condição em que há mais do que 6% de fonte de carbono para a expressão da proteína L1 por meio de análise Western blotting. Os rendimentos volumétricos de proteína L1 de HPV 18 resultante foram medidos a partir de culturas com 4, 4,5, 5, 5,5 e 6% da fonte de carbono total. A proporção de glicose e galactose de cada condição de cultura foi de 1:1. As células foram cultivadas até a fase estacionária, foram colhidas e foram rompidas utilizando 0,2 ml_ de tampão de ruptura [fosfato de sódio 20 mM, NaC1150 mM, EDTA 1,7 mM a pH 7,2 + 0,01% de Tween 80]. Os lisados celulares foram diluídos em 1:50 com AD e 10 mL de cada um foi aplicado, em seguida a eletroforese foi realizada, e a banda da proteína L1 foi analisada utilizando Western blotting.

[0050] A Figura 10b é um gráfico que mostra a intensidade relativa da banda de proteína L1 de Western blotting da Figura 10a. A intensidade da banda de L1 da condição de meio contendo 6% de fonte de carbono foi de 100%, e o valor relativo foi representado. Estes resultados indicam que a expressão da proteína L1 aumenta à medida que a concentração da fonte de carbono total aumenta a partir de 4 a 6%.

[0051] A Figura 11a mostra o resultado da comparação entre as quantidades de proteínas L1 do HPV 18 finalmente purificadas após expressão sob as condições do meio contendo 2%, 4%, 6% e 8% da fonte de carbono total. Após purificação das proteínas L1, o produto final de cada condição de fonte de carbono foi quantificado pelo ensaio de proteína de Bradford, e foram aplicados 500 ou 250 ng de proteína por cavidade e verificado. As bandas de proteína L1 das condições de 2% e 4% da fonte de carbono total não foram detectadas, enquanto as proteínas L1 do HPV 18 produzidas em condições de 6% e 8% da fonte de carbono total foram claramente detectadas como bandas de 55 kDa da proteína L1.

[0052] A Figura 11b é um gráfico que mostra os valores relativos de bandas de proteína L1, em que cada 500 ng de proteína foram carregados para a técnica de Western blotting da Figura 11a. A intensidade da banda da proteína L1 a partir da condição de cultura de fonte de carbono total de 8% foi fixada em 100%, e os valores relativos foram deduzidos. Confirmou-se que a alta concentração da fonte de carbono, mais do que 6%, deve ser contida em meio para purificar a proteína L1 de HPV 18 com um rendimento elevado.

[0053] A Figura 11c mostra os resultados da purificação da proteína L1 de HPV 18 resultante de cultura com 4 e 8% da fonte de carbono total. A proporção de glicose (%) e galactose (%) foi definida em 2:2 ou 7:1 para compreender 4% e 8% da fonte de carbono total. As células de cada condição foram cultivadas durante 144 h, e a galactose foi suplementada para fazer com que a concentração final de galactose fosse de 1,4% no ponto de 144 h, e a cultura foi mantida até 168 h.

[0054] A Figura 12a mostra os rendimentos volumétricos de L1 de proteínas de HPV 58 como uma função do aumento da concentração de fonte de carbono total no meio. As células foram cultivadas até a fase estacionária (A600 DO: 27-38).

[0055] A Figura 12b é um gráfico que indica a quantidade de proteína L1 expressa na intensidade da banda quando as células foram cultivadas na condição de que contém 2, 4, 6 ou 8% de fonte de carbono total. A intensidade da banda de L1 de cada condição de cultura foi apresentada como um valor relativo, quando a intensidade da banda de L1 na condição de 8% de fonte de carbono total foi fixada em 100%. Como mostrado nos resultados, a quantidade de proteína L1 de HPV 58 expressa aumenta significativamente quando o teor de fonte de carbono no meio é maior do que 6%.

[0056] A Figura 13a mostra o rendimento volumétrico da proteína L1 de HPV 58 produzida em cultura com 4, 4,5, 5, 5,5 ou 6% de fonte de carbono. A proporção de glicose e galactose de cada condição de cultura foi de 1:1.

[0057] A Figura 13b é um gráfico que mostra intensidades das bandas de proteínas L1 do HPV 58 da Figura 13a. A intensidade da banda de proteína L1 obtida a partir de cultura com 6% de fonte de carbono foi de 100%.

[0058] A Figura 14a mostra o resultado da comparação entre a pureza da proteína L1 recuperada a partir da condição de cultura contendo 2, 4, 6 ou 8% da fonte de carbono total pela purificação. Para purificar a proteína L1 de HPV 58, as células foram cultivadas até a fase estacionária (A600 DO: 29-34). Após a purificação da proteína L1 de cada condição de cultura, foi quantificada com o ensaio de proteína de Bradford, e foram aplicados 300 ou 150 ng de proteína em cada poço e a técnica de SDS-PAGE foi realizada. As proteínas separadas foram visualizadas por coloração com prata.

[0059] A Figura 14b mostra o rendimento de purificação da proteína L1 de HPV 58 como uma função do teor de fonte de carbono total. Como mostrado nos resultados, confirmou- se que o rendimento final de purificação melhora muito quando a proteína L1 de HPV 58 é obtida a partir de condições de cultura que contém mais do que 6% de fonte de carbono.

Melhor Forma de Realização

[0060] A seguir, realizações preferenciais da presente invenção serão apresentadas para uma melhor compreensão da presente invenção. No entanto, a descrição aqui proposta é apenas um exemplo para uma melhor compreensão, não se destinando a limitar o âmbito da presente invenção. Exemplos Exemplo 1: produção de proteína L1 de HPV 16 Métodos 1. Preparação e cultura celular

[0061] A sequência de polinucleotídeos que codifica a proteína L1 de HPV 16 foi projetada para expressar a sequência de aminoácidos do tipo selvagem, durante a redução da estrutura secundária do mRNA da proteína L1 [23]. O polinucleotídeo foi sintetizado por Blue Heron Biotechnology (EUA) e ligado ao plasmídeo YEGa-MCS. Saccharomyces cerevisiae Y2805 foi transformado com YEGa-MCS-HPV16L1 resultante, construída pelo método acima. Os transformantes são espalhados em placa “SD-ura”, que é um meio sintético completo sem uracila, e cultivados durante 4 ou 5 dias. A única colônia foi inoculada em meio de caldo de SD-ura e foi cultivada durante 2 dias. Para expressar a proteína L1 de HPV 16 a partir do promotor GAL10, os transformantes da cultura acima foram posteriormente cultivados em meio YPDG contendo 1 % de extrato de levedura (Duchefa, Holanda), 2% de peptona (Duchefa) e várias proporções de glicose (Duchefa)Zgalactose (Duchefa). A densidade óptica (DO) das células cultivadas em caldo de SD-ura atingiu 0,6 quando a DO foi medido a 600 nm. A diluição de dez vezes do meio de cultura SD-ura foi inoculada num frasco contendo 50 ou 150 ml_ de meio YPDG e cultivada durante o tempo apropriado a 30°C, com agitação a 230 rpm. A densidade celular foi medida à DO de 600 nm. 2. Purificação de L1 de HPV 16

[0062] A proteína L1 de HPV 16 foi purificada como descrito [13]. Como mostrado na Figura 1a, as células foram lisadas com esferas de vidro (BioSpec Products, OK, EUA), e os restos celulares foram removidos. As proteínas L1 de HPV 16 foram precipitadas em 40% de sulfato de amónio saturado, e as proteínas precipitadas foram dialisadas contra PBS (solução salina tamponada com fosfato) + 0,01% de Tween 80. A concentração de proteína foi ajustada para 5 mg/ml_ com tampão [fosfato de sódio 10 mM a 7,2, NaCI 150 mM + 0,01% de Tween 80], e a suspensão foi mantida à temperatura ambiente durante 12 horas. A amostra obtida por remoção de contaminantes de proteínas precipitados foi dialisada contra um tampão de ligação por cromatografia de troca catiônica [PBS + NaCI 0,37 M + 0,01% de Tween 80, concentração final de NaCI 0,5 M], Uma coluna cheia com 4 mL de resina de fosfocelulose (P-11) foi equilibrada com o tampão de ligação acima, e a amostra dialisada foi carregada na coluna. A coluna foi lavada com um volume de coluna de seis vezes de tampão de ligação, seguida por eluição com tampão contendo NaCI 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 e 1 M. As frações eluídas foram recolhidas e concentradas utilizando Amicon Ultra-4 (Millipore, EUA). 3. Medição da concentração de proteína

[0063] As concentrações de proteína foram medidas usando um kit de ensaio de proteína de Bradford da Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, EUA) com albumina de soro bovino (ASB, Pierce, EUA) como um padrão. 4. SDS-PAGE e Western blotting

[0064] A técnica de SDS-PAGE foi efetuada de acordo com o método de Laemmli [24], e a técnica de Western blotting foi realizada como descrito [25]. A proteína L1 de HPV 16 foi detectada usando um anticorpo anti-L1 de HPV 16 de soro de coelho como anticorpo primário, e anticorpo policlonal de cabra anti-lgG de coelho conjugado com HRP (Pierce, EUA) [13], tal como um anticorpo secundário. A tubulina foi detectada utilizando um anticorpo policlonal anti-tubulina de rato, e anticorpo policlonal anti-lgG de rato conjugado com HRP de cabra (Pierce, EUA). As intensidades das bandas foram medidas com o software Image J de código aberto disponibilizado pelo NIH e calculadas de acordo com o método conhecido no artigo. 5. Avaliação de imunogenicidade e resposta imune de L1 de HPV 16 purificada

[0065] Foi usado um camundongo de seis semanas de idade do tipo BALB/c (Orientbio, Coreia do Sul) para avaliar a imunogenicidade da proteína L1 de HPV 16. O camundongo foi imunizado com a proteína L1 após o período de uma semana de aclimatação. O camundongo foi imunizado por injeção hipodérmica e foi imunizados três vezes em intervalos de duas semanas. O camundongo recebeu 10 ng de proteína L1, juntamente com 200 mg de hidróxido de alumínio (Sigma, EUA) por dose. Para imunizar o camundongo com a mesma quantidade de proteínas purificadas L1 de HPV 16, as purezas e concentrações de proteínas L1 foram verificadas de acordo com o método quantitativo de proteína e método de SDS -PAGE em materiais publicados no estado da técnica. Dez dias após a terceira imunização, o sangue foi colhido por punção da veia caudal, e título de anti-lgG de L1 de HPV 16 e a atividade neutralizante do soro do camundongo foram medidos. O título de anti-lgG de L1 de HPV 16 e a atividade de neutralização no sangue do camundongo foram medidos conforme descrito usando ELISA (ensaio imunoenzimático) e ensaio de neutralização com base em pseudovirus [Kim H.J. et al., PLoS One. 2012;7(4):e35893. Epub 26 de abril de 2012; The choice of resin-bound ligand affects the structure and immunogenicity of column-purified human papillomavirus type 16 virus-like particles]. 6. Análise Estatística

[0066] A significância estatística das diferenças entre os grupos foi determinada por testes t bicaudal de Student. Os valores de p inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Resultados 1. Comparação da taxa de crescimento celular e níveis de expressão de proteína L1 de HPV 16 por célula como uma função da concentração de fonte de carbono

[0067] Para investigar os efeitos da concentração da fonte de carbono total na expressão e de produção da proteína L1 de HPV 16, os crescimentos de Saccharomyces cerevisiae como uma função da concentração da fonte de carbono e os níveis de expressão da proteína L1 do HPV 16 por célula, como uma função desta, foram comparados. A proporção de glicose (%) e galactose (%), que é para a composição do meio como uma fonte de carbono foi, variou de 1:1-6:6, e, em seguida, as proteínas L1 expressas a partir destes meios de cultura foram purificadas (referência à Figura 1b ). Como resultado, mostrado na Figura 2a, as densidades celulares finais mostraram tendências para aumentar com o aumento da concentração da soma de glicose e galactose, que é a fonte de carbono total que o meio compreende, durante 144 horas de período de cultura. As células cultivadas em cada condição de fonte de carbono mostra o crescimento da fase exponencial de 0 a 120 h de cultura, e as taxas de crescimento das células diminuíram, o que mostrou a fase estacionária (referência à Figura 2a) após 120 h.

[0068] Para investigar a quantidade de proteína L1 de HPV 16 expressa por célula como uma função da concentração da fonte de carbono, as mesmas quantidades de proteínas de lisados celulares foram aplicadas, e as quantidades de proteínas L1 foram comparadas utilizando Western blotting. Confirmou-se que os níveis de expressão das proteínas L1 nas condições de 3:3, 4:4, 5:5 e 6:6 [proporção de glicose (%) e galactose (%)] mantiveram-se até a fase estacionária (até 144 h), enquanto os níveis de expressão dos mesmos diminuíram notadamente após 96 h de cultivo, quando a proporção de glicose e galactose era de 1:1 e 2:2 (referência à Figura 2b). Este resultado indica que a quantidade de proteína L1 expressa por célula é estavelmente mantida até a fase estacionária, quando os meios contém mais do que 6% da fonte total de carbono. 2. Comparação dos rendimentos volumétricos da proteína L1 de HPV 16 como uma função da concentração de fonte de carbono

[0069] Os rendimentos volumétricos foram comparados com as quantidades de proteínas L1 de HPV 16 existentes no meio de cultura como uma função da concentração da fonte de carbono. O rendimento volumétrico indica que a quantidade de proteína L1 existia em um volume de cultura fixado. Como mostrado na Figura 3a, o rendimento volumétrico da proteína L1 diminuiu com o aumento da densidade celular, quando a proporção de glicose (%) e galactose (%) foi de 1:1, e o rendimento restritamente aumentou com o aumento da densidade celular, quando a proporção era 2:2. No entanto, verificou-se que o rendimento volumétrico aumentou de acordo com o aumento da densidade celular, quando a proporção de glicose (%) e galactose (%) era maior do que 3:3 (referência à Figura 3a e 3b). Como se confirma no resultado da Figura 2b, parece que o nível de expressão da proteína L1 de HPV 16 é estavelmente mantido até a fase estacionária em condição de fonte total de carbono maior do que 6%. Assim, é necessário ter mais do que 6% de fonte de carbono total no meio para expressar a proteína L1 de HPV 16 com alta eficiência.

[0070] Os resultados acima, as Figuras 3a e 3b, mostram que mais do que 6% da concentração de fonte de carbono total aumenta significativamente a quantidade de proteína L1 de HPV 16 expressa, quando comparado a 4%. Posteriormente, para investigar como a quantidade de L1 de HPV 16 expressa muda na concentração da fonte de carbono total, que varia de 4 a 6% em detalhes, as quantidades de proteínas L1 de HPV 16 expressas no meio contendo 4, 4.5, 5, 5.5 e 6% de fonte de carbono total foram medidas, respectivamente. Como se confirma nos resultados das Figuras 4a e 4b, podemos verificar que a quantidade de proteína L1 de HPV 16 expressa aumenta de acordo com o aumento da concentração da fonte de carbono total no intervalo entre 4 e 6%. Este resultado esclarece que mais do que 6% da fonte de carbono, ou algo superior a este valor, na composição, aumenta a expressão da proteína L1 de HPV 16 de forma significativa. 3. Comparação de pureza e rendimento de proteína L1 de HPV 16 como uma função da concentração de fonte de carbono

[0071] As purezas das proteínas L1 de HPV 16 recuperadas por purificações das células, que foram cultivadas até a fase estacionária no meio, e as proporções de glicose (%) e galactose (%), que são 1:1, 2:2 e 4:4, respectivamente, foram comparadas. Como mostrado no resultado da Figura 5a, a proteína L1 de HPV 16 de cada condição mostrou, pelo menos, mais do que 92% de pureza, após a purificação ter sido concluída. Além disso, confirmou-se que o rendimento da proteína L1 de HPV 16 aumentou de acordo com o aumento da concentração da fonte de carbono total, enquanto os valores das proteínas L1 de HPV 16 purificadas para as células cultivadas em meio de cultura de 150 mL foram comparados (referência à Figura 5b). Este resultado mostra que a concentração de fonte de carbono total no meio de cultura afeta o rendimento final de proteína L1 do HPV 16 de forma significativa. Em geral, há melhora não apenas na expressão da proteína L1, mas também no rendimento final desta, em condição de mais do que 6% de fonte de carbono total. 4. Melhora do nível de expressão de proteína L1 de HPV 16 L1 como uma função da adição de galactose

[0072] Saccharomyces cerevisiae, que expressa a proteína L1 de HPV 16, foi cultivado num meio, com uma proporção de glicose e galactose, que é de 7:1, durante 144 h, e a galactose foi adicionada à cultura de células em 144, 168 e 192 h do ponto de cultura. A galactose foi adicionada à cultura para que a concentração final de galactose fosse de 1,4%, e as células ainda foram cultivadas até 216 h. Tal como mostrado nas Figuras 6a e 6b, foi confirmado que a quantidade de proteína L1 de HPV expressa aumentou notadamente após a adição da galactose. Este resultado mostra que o nível de expressão da proteína L1 pode ser aumentado ainda mais quando a fonte de carbono é adicionada ao meio de cultura na cultura com mais do que 6% da fonte de carbono. 5. Aumento do rendimento de purificação da proteína L1 de HPV 16 como uma função da concentração de fonte de carbono

[0073] Saccharomyces cerevisiae, que produz a proteína L1 de HPV 16, foi cultivado durante 96 horas sob a condição de que a proporção de glicose (%) e galactose (%) é de 7:1, e, em seguida, a galactose foi adicionada para que a concentração final de galactose fosse de 1,4% nos meios, e as células foram cultivadas mais até 144 h. Como resultado da purificação de proteínas intracelulares L1 do HPV 16, foi obtido 1,5 mg de proteína L1 do HPV 16 (referência à Tabela 1 abaixo). Esta quantidade de proteína L1 é cerca de duas vezes maior do que a condição de cultura de 7:1 [glicose (%): galactose (%)], sem adição de galactose. Este resultado mostra que o aumento do nível de expressão da proteína L1 pode conduzir à melhoria do rendimento de purificação final, do que quando as células são cultivadas sob a condição de mais do que 6% da concentração de fonte de carbono total, e, em seguida, a galactose é adicionado à cultura. Tabela 1

6. Comparação de imunogenicidade de proteína L1 de HPV 16 como uma função da concentração de fonte de carbono

[0074] Saccharomyces cerevisiae, que produz proteína L1 do HPV 16, foi cultivado em meios contendo 2, 4, 6 ou 8% da fonte de carbono total até a fase estacionária. Para a purificação da proteína L1 de HPV 16, as células foram cultivadas nessas condições de cultura de 150 mL de meio, respectivamente. A densidade celular por unidade de volume varia de 18 a 38 valores, quando a célula de cultura foi medida a 600 nm (Figura 7). A Figura 7 mostra as quantidades de proteínas L1 finalmente recuperadas por purificações de proteínas L1 de HPV 16 produzidas em condições contendo 2, 4, 6 e 8% de fonte de carbono total, respectivamente. Conforme descrito acima, de forma semelhante, foi confirmado que a quantidade de proteína L1 de HPV 16 finalmente recuperada por purificação aumenta notadamente quando as células foram cultivadas em meios contendo mais do que 6% da fonte de carbono. Este resultado mostra mais claramente que é necessário mais do que 6% da fonte de carbono para purificar L1 de HPV 16 com alta eficiência.

[0075] Para a avaliação quantitativa da proteína L1 do HPV 16 recuperada a partir de cada condição de cultura por purificação, as mesmas quantidades de proteínas foram aplicadas e confirmadas por SDS-PAGE. Como pode ser visto do resultado da Figura 8a, foi confirmado que as purezas e volumes de proteínas L1 de HPV 16, obtidos a partir das condições de 2, 4, 6 e 8% de fonte de carbono, foram os mesmos. Assim, confirmou-se que os camundongos foram imunizados com quantidades iguais de proteínas L1 de HPV 16, as quais foram obtidas a partir das condições de 2, 4, 6 e 8% de fonte de carbono.

[0076] A Figura 8b é o resultado da medição de títulos de anticorpos IgG anti-L1 de HPV 16 e títulos de anticorpos neutralizantes anti-HPV após a 3 vezes de imunizações com 10 ng de proteína L1 do HPV 16, por dose. Tal como mostrado na Figura 8b, os títulos de anticorpos IgG anti-L1 de HPV 16 induzidos por imunização com as proteínas L1 de HPV 16 produzidas nas condições contendo 2 e 4 % da fonte de carbono total foram inferiores a 3.200, enquanto aqueles em condições contendo 6 e 8 % de fonte de carbono total eram 51.200 e 512.000, respectivamente. Além disso, confirmou-se que soros de camundongo imunizado com proteínas L1 obtidas a partir de condições contendo fonte de carbono total de 6 e 8% exercem mais do que 60 % de neutralização de atividade, enquanto que soros de camundongos imunizados com as proteínas L1, obtidas a partir de condições contendo fonte de carbono de 2 e 4% apresentaram atividades neutralizantes fracas. Assim, confirmou-se que que a imunogenicidade da proteína L1 de cultura resultante com mais do que 6% da fonte de carbono total são muito superiores as culturas com menos do que 6 % da condição de fonte de carbono. Exemplo 2: produção de proteína L1 de HPV 18 Métodos

[0077] A sequência de DNA (MO) da proteína L1 de HPV 18 otimizada para a utilização do códon de Saccharomyces cerevisiae foi sintetizada por Blue Heron Biotechnology (Blue Heron Biotechnology, Inc., EUA). O desenvolvimento da linhagem celular e a produção de proteína L1 de HPV 18 foram efetuados tais como descritas no relatório anterior [Kim H.J., Lee, S.J., Kim, H.J. J. Biotechnol. 150 (2010) 31-36]. A cultura de células para a expressão de proteína L1 de HPV 18, a purificação da proteína L1 de HPV 18, a medição da concentração de proteína, SDS-PAGE e Western blotting foram realizados tais como descritos no processo de proteína L1 de HPV 16 do Exemplo 1. Resultados 1. Comparação do rendimento volumétrico de proteína L1 de HPV 18 como uma função da concentração de fonte de carbono

[0078] Saccharomyces cerevisiae, que produz proteína L1 de HPV 18, foi cultivado durante 144 h (referido como fase estacionária) em meio contendo 2, 4, 6, 8 ou 10% da fonte de carbono total, a proporção de glicose e galactose de 1:1, e as quantidades de proteínas L1 recuperadas após as purificações de proteínas L1 de HPV 18 expressas intracelularmente nas células foram comparadas. Como mostrado na Figura 9, a quantidade de produção de proteína L1 do HPV 18 aumenta notadamente quando a concentração de fonte de carbono total é maior do que 6%. Este resultado indica que as células produzem a proteína L1 de HPV 18 com elevada eficiência quando cultivadas em meio contendo fontes de carbono superiores a 6%.

[0079] Para investigar como a quantidade de proteína L1 de HPV 18 expressa se altera na condição que varia de 4 a 6% da fonte de carbono total em detalhe, os níveis de proteínas L1 de HPV 18 expressas nos meios contendo 4, 4,5, 5, 5,5 e 6% de fonte de carbono total foram medidos, respectivamente. A proporção de glicose e galactose de cada condição de fonte de carbono foi de 1:1, e a célula foi cultivada até a fase estacionária.

[0080] Como mostrado nas Figuras 10a e 10b, confirmou-se que a quantidade de proteína L1 de HPV 18 expressa aumenta à medida que aumenta a concentração da fonte de carbono na concentração de fonte de carbono total, que varia de 4 a 6%. Estes melhores resultados esclarecem que a composição contendo mais do que 6% da fonte de carbono aumenta a expressão da proteína L1 de HPV 18. 2. Comparação do rendimento de purificação de proteína L1 de HPV 18 como uma função da concentração de fonte de carbono

[0081] A Figura 11a é o resultado da comparação entre as proteínas L1 de HPV 18 purificadas a partir de células cultivadas até a fase estacionária em meios contendo 2, 4, 6 e 8% de fonte de carbono total. Para a purificação da proteína L1 de HPV 18, as células foram cultivadas até a fase estacionária em cada meio condicionado, sendo que o volume de cada um era de 150 ml_. Para confirmar a proteína L1 de HPV 18 no produto final de purificação, a concentração da proteína foi determinada com o ensaio de proteína de Bradford, e, em seguida, foram aplicados 500 ou 250 ng de proteína em gel SDS-PAGE e verificados. Confirmou-se que as quantidades totais de proteínas quantificadas em condição de fonte de carbono total de 2, 4, 6 e 8% foram de 0,4, 0,4, 0,4 e 0,4 mg, respectivamente, indicando que as quantidades são as mesmas. Mas bandas proteicas de L1 de HPV 18 de 55 kDa foram claramente detectadas apenas em condição de fonte de carbono total de 6 e 8%.

[0082] As intensidades das bandas de proteínas L1 de HPV 18 como uma função do teor de fonte de carbono total estão apresentadas na Figura 11b em detalhes. A Figura 11b mostra as intensidades das bandas de proteínas L1 quando 500 ng de proteína foram aplicados em cada poço, e as intensidades das bandas foram apresentadas como valores relativos deduzidos a partir de que a intensidade da banda da proteína L1 em condição de fonte de carbono de 8% foi de 100%. De acordo com o resultado, as quantidades de proteínas L1 de HPV 18 purificadas a partir das condições de cultura contendo mais do que 6% da fonte de carbono total são significativamente maiores do que as obtidas a partir das condições de cultura contendo 2 e 4% da fonte de carbono total. 3. Aumento do rendimento de purificação da proteína L1 de HPV 18 como uma função da adição de galactose

[0083] Saccharomyces cerevisiae, que produz a proteína L1 de HPV 16, foi cultivado até 144 horas sob a condição de proporção de glicose (%) e galactose (%) de 2:2 ou 7:1. A galactose foi adicionada à cultura para criar uma concentração final de 1,4 % a 144 h do ponto de cultura, e as células ainda foram cultivadas até 168 h. As proteínas L1 do HPV 18 foram purificadas a partir das células cultivadas nos dois tipos de condições de cultura, respectivamente, e as quantidades de proteínas L1 purificadas foram comparadas. Como resultado, apenas a proteína L1 de HPV 18 produzida a partir da cultura em que a proporção de glicose (%) e galactose (%) era de 7:1 foi purificada, enquanto a proteína L1 de HPV 18 produzida em condição 2:2 dificilmente foi purificada (referência à Figura 11c e Tabela 2). Este resultado significa que a proteína L1 de HPV 18 produzida em condição de 7:1 é uma forma superior para purificar e colher. Em conclusão, podemos verificar que sob a condição de cultura com mais de 6% de fonte de carbono total mostrou-se alto nível de expressão de proteína L1, e o rendimento de purificação de proteína L1 na célula cultivada até a fase estacionária nos meios com alta proporção de glicose e baixa proporção de galactose em fonte de carbono total foi o mais elevado. Tabela 2

[0084] A Tabela 2 mostra o resultado da purificação de proteínas L1 de HPV 18, como uma função da adição de galactose. Saccharomyces cerevisiae, que produz a proteína L1 de HPV 18, foi cultivado em 150 mL de meio, em que a proporção de glicose (%) e galactose (%) era de 2:2 e 7:1, respectivamente. As células cultivadas em ambas as condições foram cultivadas durante 144 horas, e, em seguida, a galactose foi adicionada à cultura para criar 1,4% de concentração de galactose, e, finalmente, as células ainda foram cultivadas até 168 h. Exemplo 3: produção de proteína L1 de HPV 58 Métodos 1. Produção de cepa celular

[0085] A sequência de DNA (MO) da proteína L1 do HPV 58 otimizado para a utilização do códon de Saccharomyces cerevisiae foi sintetizada por Blue Heron Biotechnology (Blue Heron Biotechnology, Inc., EUA). Os genes MO à montante e à jusante de L1 de HPV 58 foram construídos de modo a conter sítios Hind UI e Sal I, respectivamente. O gene MO de L1 de HPV 58 sintetizado foi inserido no resíduo entre os sítios de Hindlll e Sall de YEGa-MCS, e o plasmídeo resultante foi denominado YEGα-MCS-HPV58 L1 MO. Saccharomyces cerevisiae Y2805 foi transformado com pelo método de acetato de lítio, tal como descrito anteriormente [Kim, H.J., Lee, S.J., Kim, H.J., J. Biotechnol. 150 (2010) 31-36]. Os métodos para a cultura de células para a expressão de proteína L1 de HPV 58, a purificação da proteína L1 de HPV 58, a determinação da concentração de proteína, a técnica SDS-PAGE e a técnica de Western blotting são as mesmas que as dos processos para a proteína L1 de HPV 16 do Exemplo 1. Resultados 1. Comparação da quantidade de expressão da proteína L1 de HPV 58 como uma função da concentração da fonte de carbono

[0086] A Figura 12a mostra o resultado da comparação entre os rendimentos volumétricos das proteínas L1 produzidas em culturas, em que o Saccharomyces cerevisiae, que expressa proteína L1 de HPV 58, foi cultivado em meios compostos de 2, 4, 6 e 8% de fonte de carbono total até a fase estacionária, respectivamente, por Western blotting. No que diz respeito à tendência de expressão, foram notadamente confirmada uma maior expressão da proteína L1 nas condições de meios de cultura contendo mais do que 6% da fonte de carbono, que são semelhantes às proteínas L1 de HPV 16 e HPV 18. A Figura 12b é um gráfico que mostra as intensidades relativas das bandas das proteínas L1 de HPV 58 da Figura 12a. Para comparar as quantidades relativas de proteína L1 de HPV 58 expressas, a intensidade da banda de L1 de HPV 58 em condição de fonte de carbono de 8% foi fixada em 100%, e os valores relativos foram deduzidos.

[0087] Para investigar como a quantidade de proteína L1 de HPV 58 se altera na concentração de fonte de carbono total que varia de 4 a 6 %, o conteúdo da fonte de carbono no meio foi preparado para 4, 4,5, 5, 5,5 ou 6%. A proporção de glicose e galactose de cada condição foi de 1:1. A Figura 13a mostra o resultado da análise dos rendimentos volumétricos das proteínas L1 de HPV 58 utilizando Western blotting, quando o conteúdo da fonte de carbono nos meios é 4, 4,5, 5, 5,5 e 6%, respectivamente. A Figura 13b é um gráfico que mostra a intensidade da banda de proteínas L1 de HPV 58 da Figura 13a. Para comparar as diferenças entre as intensidades de banda, a intensidade da banda da proteína L1 em condição de fonte de carbono de 6% foi fixada em 100% (Figura 13b). Como resultado da investigação dos rendimentos volumétricos do intervalo de 4-6% de concentração de fonte de carbono total, verificou-se que o rendimento volumétrico de proteína L1 aumenta à medida em que aumenta a concentração da fonte de carbono. Portanto, estes resultados indicam que a quantidade de proteína L1 de HPV 58 expressa aumenta quando a célula é cultivada na condição de meio contendo mais do que 6% da fonte de carbono. 2. Comparação do rendimento de purificação da proteína L1 de HPV 58 como uma função da concentração da fonte de carbono

[0088] Para comparar os rendimentos de purificação de proteína L1 de HPV 58 como uma função da concentração da fonte de carbono, a proteína L1 de HPV 58 foi purificada e comparada depois da célula ser cultivada até a fase estacionária em um meio contendo 2, 4, 6 e 8% da fonte de carbono total. Em cada condição do meio, a proporção de glicose e galactose era de 1:1. As proteínas L1 de HPV 58 foram purificadas depois das células serem cultivadas no meio de 150 ml_ até a fase estacionária (DO: 29-30 a A600), e as quantidades de proteínas foram confirmadas no SDS-PAGE (Figura 14a). A proteína L1 de HPV 58 foi purificada a partir da célula de cultura para realizar o descrito acima, e a concentração de proteína foi determinada com o ensaio de proteína de Bradford. Com base na concentração de proteína quantificada, foram aplicados 300 ou 150 ng de proteína em cada poço. Como resultado, as proteínas L1 de HPV 58 purificadas a partir das condições de cultura mostraram purezas elevadas, exceto para a proteína L1 de HPV 58 purificada a partir da condição de 2% de fonte de carbono, que mostra baixa intensidade da banda.

[0089] A Figura 14b é um gráfico que mostra as quantidades de proteínas L1 de HPV 58 finalmente purificadas. A quantidade de proteína L1 em cada condição foi deduzida a partir dos resultados da análise quantitativa de proteína e SDS-PAGE. Tal como mostrado na Figura 14b, a quantidade de proteínas L1 de HPV 58 finalmente recuperadas aumenta quando o conteúdo de fonte de carbono total no meio é maior do que 6%.

[0090] Embora a presente invenção tenha sido mostrada e descrita com referência a certas formas de realização exemplificativas, deverá ser entendido por aqueles que são técnicos no assunto relacionado que várias alterações na forma e detalhes podem ser feitas sem se afastar do escopo da presente invenção, tal como definida pelas reivindicações anexas. Literaturas não patentárias citadas no presente relatório descritivo

[0091] Seguem abaixo indicadas as referências do estado da técnica mais próximas da invenção: [1] Woodman, C.B., Collins, S.I., Young, L.S., The natural history of cervical HPV infection: unresolved issues, Nat. Rev. Cancer? (2007), 11-22. [2] National Cancer Institutue, Women's Health Report, Fiscal Years 2005-2006, NCI Women's Health Report FY2005-2006 (2007). [3] Nyari, T., Cseh, I., Woodward, M., Szollosi, J., Bak, M., Deak, J., Hum. Reprod. 16 (2001)2235-2237. [4] Nyari, T.A., Kalmar, L., Deak, J., Szollosi, J., Farkas, I., Kovacs, L., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 115 (2004) 99-100. [5] Conway, M.J., Meyers, C., Dent, J. Res. 88 (2009) 307-317. [6] Bishop, B., Dasgupta, J., Klein, M., Garcea, R.L., Christensen, N.D., Zhao, R., Chen, X.S. 14, J. Biol. Chem. 282 (2007) 31803-31811. [7] Frazer, I.H., Gynecol. Oncol. 118 (2010) S8-11. [8] Madrid-Marina, V., Torres-Poveda, K., Lopez-Toledo, G., Garcia-Carranca, A. Arch. Med. Res. 40 (2009) 471-477. [9] Deschuyteneer, M., Elouahabi, A., Plainchamp, D., Plisnier, M., Soete, D., Corazza, Y., Lockman, L., Giannini, S., Deschamps, M., Hum. Vaccine 6 (2010) 407-419. [10] National Cancer Institute, Human Papillomavirus (HPV) Vaccines. [11] Schadlich, L., Senger, T., Kirschning, C.J., Muller, M., Gissmann, L. Vaccine 27 (2009) 1511-1522. [12] Walsh, G., Biopharmaceutical benchmarks 2010, Nat Biotechnol 28 (2010) 917-924. [13] Kim, H.J., Kim, S.Y., Lim, S.J., Kim, J.Y., Lee, S.J., Kim, H.J. Protein Expr. Purif. 70 (2010) 68-74. [14] Rubio-Texeira, M. FEMS Yeast Res. 5 (2005), 1115-1128. [15] Kim, M.D., Han, K.C., Kang, H.A. Rhee, S.K., Seo, J.H., J. Biotechnol. 101 (2003) 8187. [16] van den Brink, J., Akeroyd, M., van der Hoeven, R., Pronk, J.T., de Winde, J.H., Daran-Lapujade, P. Microbiology 155 (2009) 1340-1350. [17] Choi, E.S., Sohn, J.H., Rhee, S.K. Appl. Microbiol. Biot. 42 (1994) 587-594. [18] Whang, J., Ahn, J., Chun, C.S., Son, Y.J., Lee, H., Choi, E.S. Process Biochem. 44 (2009) 1190-1192. [19] Hadiji-Abbes, N., Borchani-Chabchoub, I., Triki, H., Ellouz, R., Gargouri, A., Mokdad- Gargouri, R. Protein Expr. Purif. 66 (2009) 131-137. [20] Cook, J.C., Joyce, J.G., George, H.A., Schultz, L.D., Hurni, W.M., Jansen, K.U., Hepler, R.W., Ip, C., Lowe, R.S., Keller, P.M., Lehman, E.D. Protein Expr. Purif. 17 (1999) 477-484. [21] Kim, S.N., Jeong, H.S., Park, S.N., Kim, H.J. J. Virol. Methods 139 (2007) 24-30. [22] Buonamassa, D.T., Greer, C.E., Capo, S., Yen, T.S., Galeotti, C.L., Bensi, G. Virology 293 (2002) 335-344. [23] Kim, H.J., Lee, S.J., Kim, H.J., J. Biotechnol. 150 (2010) 31-36. [24] Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685. [25] Park, M.A., Kim, H.J., Kim, H.J. Protein Expr. Purif. 59 (2008) 175-181. [26] Kim, S.Y., Kim, H.J., Kim, H.J. Protein Expr. Purif. 76 (2011) 103-108. [27] Rizk, R.Z., Christensen, N.D., Michael, K.M., Muller, M., Sehr, P., Waterboer, T., Pawlita, M. J. Gen. Virol. 89 (2008) 117-129. [28] Shi, L., Sanyal, G., Ni, A., Luo, Z., Doshna, S., Wang, B., Graham, T.L., Wang, N., Volkin, D.B., J. Pharm. Sci. 94 (2005) 1538-1551. [29] Carter, J.J., Wipf, G.C., Benki, S.F., Christensen, N.D., Galloway, D.A., J. Virol. 77 (2003) 11625-11632. [30] Balasundaram, B., Harrison, S., Bracewell, D.G. Trends Biotechnol. 27 (2009) 477485. [31] Buck, C.B., Thompson, C.D., Pang, Y.Y., Lowy, D.R., Schiller, J.T., J. Virol. 79 (2005) 2839-2846. [32] Conway, M.J., Alam, S., Ryndock, E.J., Cruz, L., Christensen, N.D., Roden, R.B., Meyers, C„ J. Virol. 83 (2009) 10515-10526. [33] Li, S.Y., Srivastava, R., Suib, S.L., Li, Y., Parnas, R.S., Bioresour. Technol. 102 (2011)4241-4250. [34] Cardona, C.A., Sanchez, O.J., Bioresour. Technol. 98 (2007) 2415-2457. [35] Meyers, C., Frattini, M.G., Hudson, J.B., Laimins, L.A., Science 257 (1992) 971-973. [36] Ozbun, M.A., Meyers, C. J. Virol. 71 (1997) 5161-5172. [37] Selinka, H.C., Giroglou, T., Nowak, T., Christensen, N.D., Sapp, M., J. Virol. 77 (2003) 12961-12967. [38] de Witte, L., Zoughlami, Y., Aengeneyndt, B., David, G., van Kooyk, Y., Gissmann, L, Geijtenbeek, T.B., Immunobiology 212 (2007) 679-691. [39] Opalka, D., Matys, K., Bojczuk, P., Green, T., Gesser, R., Saah, A., Haupt, R., Dutko, F., Esser, M.T. Clin. Vaccine Immunol. 17 (2010) 818-827. [40] Schellenbacher, C. Roden, R., Kirnbauer, R., J. Virol. 83 (2009) 10085-10095. [41] Park, J.Y., Pyo, H.M., Yoon, S.W., Baek, S.Y., Parz, S.N., Kim, C.J., Poo, H., J. Microbiol. 40 (2002) 313-318. 1/1

Claims

1. Método para melhorar o rendimento da produção de proteína L1 do Papilomavírus Humano (HPV) caracterizado por compreender as etapas de: (a) preparo do meio contendo a fonte de carbono total em uma concentração de 6 a 14%; e (b) inoculação de uma célula que expressa a proteína L1 de HPV no meio, e cultivo da célula que expressa a proteína L1 HPV no meio; em que a célula que expressa proteína L1 de HPV é uma célula de levedura transformada vetor de expressão da proteína L1 de HPV.

2. Método, de acordo com a reivindicação proteína L1 de HPV ser a proteína L1 de HPV 16, HPV 18 ou HPV 58. reivindicação com 1, caracterizado por

3. Método, de acordo com a concentração das fontes de carbono total ser de 7 a 14%.

4. Método, de acordo com a concentração das fontes de carbono total ser de 8 a 14%.

5. Método, de acordo com a reivindicação reivindicação concentração da fonte de carbono total compreender glicose e galactose.

6. Método, de acordo com a reivindicação levedura ser Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o método compreender uma etapa de adicionar uma fonte de carbono ao meio após a etapa (b).

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a fonte de carbono adicionada ao meio ser galactose.