JP2001513986A - ワクチン - Google Patents

ワクチン

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ブリュック，クローディーヌ
シルバ，テレサ カベゾン
フェルナンド デリッス，アンヌ−マリー，エバ
マリー ギスレーヌ ジェラール，カトリーヌ
ロンバールド−ベンチェク，アンジェラ
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スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＨＰＶ抗原に対するＴヘルパーエピトープを供する免疫学的融合パートナーに連結した。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）融合タンパク質を供する。ＨＰＶ誘導性障害の治療又は予防に役立つワクチン製剤を供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、ヒトパピローマ誘導性腫瘍の治療又は予防において利用性が見い出
される、Ｔヘルパーエピトープを供するタンパク質又はタンパク質の一部分、及
びヒトパピローマウイルスからの抗原を含む融合タンパク質に関する。特に、本
発明は、ヘモフィルス−インフルエンゼＢからのプロテインＤに連結したＨＰＶ
株１６又は１８からのＥ６又はＥ７を含む融合タンパク質に関する。
【０００２】 パピローマウイルスは、極めて種特異的である小さな裸のＤＮＡ腫瘍ウイルス
（７．９キロベース；二本鎖）である。７０を超える個々のヒトパピローマウイ
ルス（ＨＰＶ）遺伝子型が記述されている。パピローマウイルスは起源の種（ヒ
ト、ウシ等）及び同じ種からの他のパピローマウイルスとの遺伝子の関連性の程
度に基づいて分類されている。ＨＰＶは皮膚又は粘膜表面に一般に特異的であり
、異常又は腫瘍組織における各々まれな及び一般的な検出に基づいて“低い”及
び“高い”危険性に広く分類されている。低い危険性のＨＰＶは通常、数ヶ月又
は数年間、持続する良性障害（疣贅又は乳頭腫）を引きおこす。ＨＰＶとヒト癌
との間の最も強い陽性の関連性は、ＨＰＶ１６及び１８並びに子宮頸癌の間に存
在するものである。より少い頻度であるが、１０を超える他のＨＰＶ型も子宮頸
癌において見い出されている。
【０００３】 若い性的に活動している女性における生殖器ＨＰＶ感染は一般的であり、ほと
んどの個体が感染を取り除いているか、又は障害が進行しているなら、これらは
回復する。感染した個体のサブセットのみが高グレード上皮内新形成に進行し、
これらの進行のほんの少しだけが更に浸潤癌になる障害を有する。 ＨＰＶ感染を導く分子の出来事は明確に確立されていない。ヒトパピローマウ
イルスを繁殖させる適当な試験管内システムの欠損がウイルスサイクルについて
の最も優れた情報への進行を害している。
【０００４】 今日、異なる型のＨＰＶが単離されており、細菌でのクローニングシステムに
より、及びより最近はＰＣＲ増幅によりキャラクタライズされている。ＨＰＶゲ
ノムの分子機構は十分にキャラクタライズされたウシパピローマウイルス１型（
ＢＰＶ１）のものとの比較に基づいて定義されている。 小さな変異があるが、記述されている全てのＨＰＶは少くとも７の早期遺伝子
Ｅ１〜Ｅ７及び２つの後期遺伝子Ｌ１及びＬ２を有する。更に、上流調節領域は
、ＨＰＶゲノムのほとんどの転写による出来事を制御するようである調節配列を
有する。
【０００５】 Ｅ１及びＥ２遺伝子は、各々ウイルス複製及び転写制御に関連し、ウイルス組
込みにより破壊される傾向がある。Ｅ６及びＥ７はウイルス形質転換に関連する
。Ｅ５もこの過程に関係している。 ＨＰＶ１６及び１８のような子宮頸癌に関連するＨＰＶにおいてオンコジーン
の過程はウイルスＤＮＡの組込み後に開始する。その組込みはキャプシドタンパ
ク質Ｌ１及びＬ２をコードする遺伝子を不活性化させ、Ｅ２レプレッサー機能の
喪失は２つの早期タンパク質Ｅ６及びＥ７の連続的な過剰発現を配置するＥ６／
Ｅ７オープン読み枠の統制排除を導き、それは正常な細胞の分化を次第に失わせ
、癌を進展させるであろう。Ｅ６及びＥ７は、各々、網膜芽腫遺伝子産物である
主要腫瘍サプレッサータンパク質ｐ５３及びｐＲＢを不活性化することにより正
常な細胞周期を克服する。
【０００６】 子宮頸の癌は女性において一般的であり、前癌中間段階を経て浸潤癌に進展し
、頻繁に死を導く。その病気の中間段階は子宮頸上皮内新形成として知られてお
り、激しさの増加と共にＩ〜III 段階である（ＣＩＮＩ−III ）。 臨床的に、女性の肛門性器官のＨＰＶ感染は子宮頸扁平コンジロームとして顕
在化し、その特徴は子宮頸扁平上皮の表面及び中間細胞に主に作用する空胞細胞
症である。
【０００７】 ウイルスの細胞病理効果の結果であるコイロサイト（koilocytes）は核周囲の
透明な光輪を伴う多核化細胞として現れる。その上皮はその障害のいぼ状の外観
の原因である異常な角質化を伴って厚くなる。 このような扁平コンジロームは、ＨＰＶ１６又は１８血清型について陽性であ
る場合、浸潤癌の前駆障害とそれら自体考えられる子宮頸上皮内新形成（ＣＩＮ
）及び上皮内癌（カルチノーマ−イン−サイチュウ）に対する進行に対する高い
危険性の因子である。
【０００８】 発癌性ＨＰＶ感染の自然の経過は、３つの連続段階を示す。即ち、 （１）潜伏感染期、 （２）コイロサイトの発生に相当する、完全なビリオンの生産を伴う核内ウイ
ルス複製の段階。この段階においてＨＰＶは、Ｅ２，Ｅ５，Ｅ６，Ｅ７，Ｌ１及
びＬ２を含むその十分な範囲のタンパク質を生産している。
【０００９】 （３）悪性腫瘍形質転換の初まりを誘発し、コイロサイトの次第の消失を伴う
、ＣＩＮII及びＣＩＮIII ／ＣＩＳに対応する、細胞ゲノムへのウイルス組込み
の段階。この段階において、Ｅ２の発現は下降制御され、Ｅ６及びＥ７の発現は
増強される。ＣＩＮII／III 及びＣＩＮIII ／子宮頸癌の間で、ウイルスＤＮＡ
は基底細胞内でエピソームであったのがＥ６及びＥ７遺伝子のみ（腫瘍細胞）の
組込みに変化する。全ての子宮頸癌の８５％はＨＰＶ１６血清型に最も支配的に
関係する扁平上皮細胞癌である。１０％及び５％が各々腺癌及び腺扁平上皮細胞
癌であり、両方の型は主に、ＨＰＶ１８血清型に関連する。しかしながら他の発
癌性ＨＰＶも存在する。
【００１０】 国際特許出願ＷＯ９６／１９４９６は、ヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７
タンパク質の変異体、特にＥ６及びＥ７タンパク質中に欠失があるＥ６／Ｅ７の
融合タンパク質を開示する。これらの欠失融合タンパク質は免疫原性と呼ばれる
。 本発明は、Ｔ細胞エピトープを有する免疫学的融合パートナーに連結したＥ６
もしくはＥ７又はＥ６／Ｅ７融合タンパク質を含む組成物を供する。
【００１１】 本発明の好ましい形態において、免疫学的融合パートナーは、ヘモフィルス−
インフルエンゼＢのプロテインＤから得られる。好ましくは、プロテインＤ誘導
体は、そのタンパク質の最初の約１／３を含み、特におおよそ最初のＮ末端１０
０〜１１０アミノ酸を含む。プロテインＤは、脂質化され得る（Lipo Protein D
）。他の免疫学的融合パートナーには、インフルエンザウイルスからの非構造タ
ンパク質、ＮＳ１（ヘマグルチニン）がある。典型的にはＮ末端８１アミノ酸が
利用される。但し、それらがＴ−ヘルパーエピトープを含むなら、異なるフラグ
メントを用いることができる。
【００１２】 他の実施形態において、免疫学的融合パートナーはＬＹＴＡとして知られるタ
ンパク質である。好ましくは、その分子のＣ末端タンパク質が用いられる。Ｌｙ
ｔａは、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、（ｌｙｔＡ遺伝子によりコー
ドされる（Gene, 43 (1986) ページ265 〜272 ））アミダーゼＬＹＴＡ、ペプチ
ドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解するアートリシンを合成するスト
レプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）から得られる。Ｌ
ＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインはコリン又は特定のコリンアナログ、例えば
ＤＥＡＥに対するアフィニティーの原因である。この特性は、融合タンパク質の
発現のために役立つプラスミドを発現する大腸菌Ｃ−ＬＹＴＡの開発のために利
用されている。そのアミノ末端にＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッド
タンパク質の精製は開示されている（Biotechnology: 10, (1992) ページ795 〜
798 ）。本明細書に用いる場合、好ましい実施形態は残基１７８で始まるＣ末端
内に見い出されるＬｙｔａ分子の反復部分を利用する。特に好ましい形態は残基
１８８〜３０５を組み込む。
【００１３】 従って、本発明は、好ましい実施形態において、プロテインＤ−ＨＰＶ１６か
らのＥ６、プロテインＤ−ＨＰＶ１６からのＥ７、プロテインＤ−ＨＰＶ１８か
らのＥ７、プロテインＤ−ＨＰＶ１８からのＥ６並びにプロテインＤ−ＨＰＶ１
６及び１８の両方からのＥ６／Ｅ７を含む融合タンパク質を供する。他のＨＰＶ
サブタイプからの他のＥ６及びＥ７タンパク質も利用できることが認められよう
。
【００１４】 本発明のタンパク質は、好ましい大腸菌内で発現される。好ましい実施形態に
おいてタンパク質は５〜９、好ましくは６のヒスチジン残基を含むヒスチジン・
テールと共に発現される。これらは精製を助けることにおいて有利である。 タンパク質Ｅ７は、好ましい実施形態において、ｒｂ部位（網膜芽腫産物）の
ための結合を減少させるための変異を有する。ＨＰＶ１６Ｅ７のための好ましい
変異は、Ｃｙｓ24をグリシンで、グルタミン酸26をグルタミンで置換することに
関する。好ましい実施形態において、Ｅ７タンパク質はこれらの変異の両方を含
む。
【００１５】 ＨＰＶ１８Ｅ7 のための好ましい変異はＣｙｓ27をグリシンで及び／又はグル
タミン酸29をグルタミンで置換することに関する。また、好ましくは、両方の変
異が存在する。 単一又は二重変異も、いずれかの潜在的な形質転換能力を除去するためＥ６の
ｐ５３領域に導入することができる。
【００１６】 本発明の更なる実施形態において、免疫学的融合パートナーに連結したＨＰＶ
からのＥ６Ｅ７融合タンパク質を供する。好ましい免疫学的融合パートナーはプ
ロテインＤ、より好ましくはプロテインＤの最初の１／３である。 本発明は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡも供する。このような配列
は適切な発現ベクター内に挿入し、適切な宿主内で発現させることができる。
【００１７】 本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、標準的なＤＮＡ合成技術を用
いて例えばD.M.Roberts ら（Biochemistry 1985, 24, 5090 〜5098）により記載
される酵素連結により、化学合成により、試験管内酵素重合化により、もしくは
例えば熱安定ポリメラーゼを利用するＰＣＲ技術により、又はこれらの技術の組
合せにより合成することができる。
【００１８】 ＤＮＡの酵素重合は一般に５０μｌ又はそれ未満の容量で、必要に応じて１０
〜３７℃の温度でヌクレオシドトリホスフェートｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰを含む適切な緩衝液中でＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメ
ラーゼＩ（クレノウフラグメント）を用いて行うことができる。ＤＮＡフラグメ
ントの酵素連結は、適切な緩衝液、例えば０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ（pH７．４）、
０．０１Ｍ ＭｇＣｌ2 、０．０１Ｍジチオトレイトール、１mMスペルミジン、
１mM ＡＴＰ及び０．１mg／mlウシ血清アルブミン中で、４℃〜環境温度の温度
で、一般に５０ml又はそれ未満の容量で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなＤＮＡリ
ガーゼを用いて行うことができる。ＤＮＡポリマー又はフラグメントの化学合成
は、慣用的なホスホトリエステル、ホスファイト又はホスホルアミジト化学によ
り、固相技術、例えば‘Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments
-A Laboratory Manual' (ed. H.G.Gassen and A.Lang), Verlag Chemie, Weinhe
im (1982) 、又は他の科学文献、例えばM.J.Gait, H.W.D.Matthes, M.Singh, B.
S.Sproat, and R.C.Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S.Sp
roat, and W.Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D.Matteucc
i and M.H.Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D.Matteucci a
nd M.H.Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3
185; S.P.Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 1
05, 661; N.D.Sinha, J.Biernat, J.McMannus, and H.Koester, Nucleic Acids
Research, 1984, 12, 4539; and H.W.D.Matthes et al., EMBO Journal, 1984,
3, 801に記載されるものを用いて行うことができる。
【００１９】 本発明の方法は、慣用的な組換え技術、例えばManiatisら（Molecular Clonin
g-A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982 〜1989）に記載されるもの
により行うことができる。 特に、その方法は、次のステップ： ｉ）そのタンパク質又はその免疫学的誘導体をコードするヌクレオチド配列を
含むＤＮＡポリマーを宿主細胞内で発現することができる複製可能又は組込み可
能発現ベクターを調製し； ii）該ベクターで宿主細胞を形質転換し； iii) その形質転換された宿主細胞を、前記ＤＮＡポリマーの発現を許容し前
記タンパク質を作り出す条件下で培養し；そして iv）前記タンパク質を回収する ことを含み得る。
【００２０】 用語“形質転換”は、外来ＤＮＡの宿主細胞への導入を意味するとして本明細
書に用いる。これは、例えば形質転換、トランスフェクション又は適切なプラス
ミドもしくはウイルスベクターの感染により、例えばGenetic Engineering; Eds
, S.M.Kingsman及びA.J.Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxfor
d, England, 1988に記載されるような慣用的な技術を用いて達成することができ
る。用語“形質転換”又は“形質転換体”は、以後、関心の外来遺伝子を含み、
それを発現する生じた宿主細胞に適用するであろう。
【００２１】 好ましくは、本発明の組換え抗原は大腸菌内で発現される。その発現ストラテ
ジーは、Ｔ細胞ヘルパーエピトープを供する免疫学的融合パートナーであるヘモ
フィルスインフルエンゼＢからのＤタンパク質の１／３−Ｎ末端部分へのＥ７，
Ｅ６又はＥ６／Ｅ７融合物の融合を含む。アフィニティーポリヒスチジン・テー
ルは、融合タンパク質のカルボキシ末端において工作され、簡単な精製を許容す
る。このような組換え抗原は不溶性タンパク質として大腸菌内で過剰発現される
。
【００２２】 好ましくは、本発明のタンパク質は、トランスでチオレドキシンと同時発現さ
れる。トランス対シスのチオレドキシンの同時発現が、プロテアーゼを必要とす
ることなく、チオレドキシンを含まない抗原を維持するために好ましい。チオレ
ドキシン同時発現は、本発明のタンパク質の可溶化を容易にする。チオレドキシ
ン同時発現は、タンパク質精製収率、精製されたタンパク質の溶解度及び質に大
きな影響を与える。
【００２３】 その発現ベクターは新規でありこれも本発明の一部を形成する。 複製可能発現ベクターは、本発明に従って、宿主細胞に適合するベクターを開
裂して完全なレプリコンを含む直鎖ＤＮＡセグメントを供し、そしてその直鎖セ
グメントを、その直鎖セグメントと一緒に要求される産物をコードする１又は複
数のＤＮＡ分子、例えば本発明のタンパク質をコードするＤＮＡポリマー又はそ
の誘導体と、連結条件下で組み合わせることにより調製することができる。
【００２４】 これにより、そのＤＮＡポリマーは、必要に応じてベクターの作製の間に前も
って形成し又は形成することができる。 ベクターの選択は、原核生物でも真核生物でもよいが好ましくは大腸菌である
宿主細胞により部分的に決定されよう。適切なベクターには、プラスミド、バク
テリオファージ、コスミド及び組換えウイルスがある。
【００２５】 複製可能発現ベクターの調製は、便利にはＤＮＡの制限、重合及び連結のため
の適切な酵素と共に、例えば上述のManiatisらに記載される手順により行うこと
ができる。 組換え宿主細胞は、本発明に従って、宿主細胞を本発明の複製可能発現ベクタ
ーで形質転換条件下で形質転換することにより調製される。適切な形質転換条件
は慣用的であり、例えば上述のManiatisら、又は“DNA Cloning" VolII, D.M.Gl
over ed., IRL Press Ltd, 1985 に記載される。
【００２６】 形質転換条件は宿主細胞により決定される。これにより、細菌宿主、例えば大
腸菌は、ＣａＣｌ2 の溶液（Cohen ら、Proc.Nat.Acad.Sci, 1973, 69, 2110 ）
で、又はＲｂＣｌ，ＭｎＣｌ2 、酢酸カリウム及びグリセロールの混合物を含む
溶液で、次に３−〔Ｎ−モルホリノ〕−プロパン−スルホン酸、ＲｂＣｌ及びグ
リセロールで処理することができる。培養中の哺乳動物細胞は、細胞へのベクタ
ーＤＮＡのカルシウム共沈殿により形質転換することができる。本発明は、本発
明の複製可能発現ベクターで形質転換された宿主細胞にも広げられる。
【００２７】 ＤＮＡポリマーの発現を許容する条件下での形質転換された宿主細胞の培養は
、便利には、例えば上述のManiatisら及び“DNA Cloning ”に記載される通り、
行われる。これにより、好ましくは、その細胞には栄養素が補給され、５０℃未
満の温度で培養される。 産物は、宿主細胞に従って慣用的な方法により回収される。これにより、宿主
細胞が細菌、例えば大腸菌である場合、それは物理的、化学的又は酵素的に溶解
することができ、そのタンパク質産物は生じたライゼートから単離することがで
きる。宿主細胞が哺乳動物である場合、その産物は栄養培地から又は無細胞抽出
物から単離することができる。慣用的なタンパク質単離技術には、選択的沈殿、
吸着クロマトグラフィー、及びモノクローナル抗体アフィニティーカラムを含む
アフィニティークロマトグラフィーがある。
【００２８】 本発明のタンパク質をヒスチジンテール（Ｈｉｓタグ）と共に発現させる場合
、そのタンパク質はイオン金属アフィニティーカラム（ＩＭＡＣ）カラムを用い
てアフィニティークロマトグラフィーにより容易に精製することができる。 高度に精製されたタンパク質を生産するために、ＩＭＡＣカラムの前又は後の
いずれかに、第２のクロマトグラフィーステップ、例えばＱ−セファロースを利
用することができる。免疫学的融合パートナーがＣ−ＬＹＴＡである場合、この
産物を精製するためにコリン及び／又はＤＥＡＥについてのＣ−ＬＹＴＡのアフ
ィニティーを利用することができる。Ｃ−ＬＹＴＡ及びＨｉｓタグの両方を含む
産物は、示差アフィニティークロマトグラフィーに関する２ステッププロセスに
おいて容易かつ効率よく精製することができる。一方のステップはＨｉｓタグの
ＩＭＡＣカラムへのアフィニティーに関し、他方はコリン又はＤＥＡＥについて
のＬＹＴＡのＣ末端ドメインのアフィニティーに関する。
【００２９】 Ｃ−ＬＹＴＡ及びヒスチジンタグの両方を含むタンパク質は新規であり、従っ
て本発明の一態様を形成する。これらは、簡単な２ステップ示差アフィニティー
手順により、高レベル（８０％超、好ましくは９０％超）に精製することができ
る。 本発明のタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化して、好ましくは少く
とも８０％純度、より好ましくは９０％純度で供される。そのタンパク質は還元
条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した場合、主要単一バンドを供し、ウエス
タン・ブロット分析は、５％未満の宿主細胞タンパク質汚染を示す。
【００３０】 本発明は、医薬として許容される賦形剤中に本発明のタンパク質を含む医薬組
成物も供する。好ましいワクチン組成物は、少くとも、プロテインＤ−ＨＰＶ１
６からのＥ７と一緒に、プロテインＤ−ＨＰＶ１６からのＥ６又はその誘導体を
含む。あるいは、Ｅ６及びＥ７は、単一分子、好ましくはプロテインＤ Ｅ６／
Ｅ７融合物において供することができる。このようなワクチンは、任意に、ＨＰ
Ｖ１８からのＥ６及びＥ７タンパク質のいずれか又は両方を、好ましくはプロテ
インＤ−Ｅ６もしくはプロテインＤ−Ｅ７融合タンパク質又はプロテインＤ Ｅ
６／Ｅ７融合タンパク質の形態で含む。本発明のワクチンは、ＨＰＶ１６又は１
８からの他のＨＰＶ抗原を含み得る。特に、本ワクチンは、Ｌ１又はＬ２抗原モ
ノマーを含み得る。あるいは、このようなＬ１及びＬ２抗原は、ウイルス様粒子
として一緒に供しても、Ｌ１単独タンパク質をウイルス様粒子又はキャプソメア
構造として供してもよい。このような抗原、ウイルス様粒子及びキャプソメアは
それ自体周知である。例えばＷＰ９４／００１５２，ＷＯ９４／２０１３７，Ｗ
Ｏ９４／０５７９２、及びＷＯ９３／０２１８４を参照のこと。付加的な早期タ
ンパク質、例えばＥ２又は好ましくはＥ５を含めることができる。本発明のワク
チンは、他のＨＰＶ株から、好ましくは株ＨＰＶ６，１１，ＨＰＶ３１又は３３
からの抗原を更に含み得る。
【００３１】 ワクチン調製は、一般に、Vaccine Design-The Subunit and adjuvant approa
ch (Ed. Powell及びNewman）Pharmaceutical Biotechnology Vol.6 Plenum Pres
s 1995に記載される。リポソーム内への被包は、Fullerton 、米国特許４，２３
５，８７５により記載される。 本発明のタンパク質は、好ましくは、本発明のワクチン製剤において補助され
る。適切なアジュバントは、アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲル及
びリン酸アルミニウムを含むが、カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩であっても、
又はアシル化チロシン又はアシル化糖、カチオン又はアニオン誘導化ポリサッカ
ライド又はポリホスホファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。
【００３２】 本発明の製剤において、アジュバント組成物が優先的なＴＨ１応答を誘導する
ことが好ましい。適切なアジュバントシステムは、例えばモノホスホリル脂質Ａ
、好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）の
、アルミニウム塩との組合せがある。 増強されたシステムは、モノホスホリル脂質Ａとサポニン誘導体との組合せ、
特にＷＯ９４／００１５４に開示されるようなＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組合
せ、又はＱＳ２１がＷＯ９６／３３７３９に開示されるようにコレステロールで
消光されているより少い反応源性の組成物に関する。
【００３３】 水中油エマルション中のＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールに関する
特に潜在的なアジュバント製剤はＷＯ９５／１７２１０に記載され、それは好ま
しい製剤である。 従って、本発明の一実施形態において、モノホスホリル脂質Ａ又はその誘導体
で補助された、プロテインＤ（又はその誘導体）−Ｅ６又はプロテインＤ（又は
その誘導体）−Ｅ７を含むワクチンを供する。
【００３４】 好ましくは、本ワクチンは、サポニン、より好ましくはＱＳ２１を更に含む。 好ましくは本製剤は、水中油エマルション及びトコフェロールを更に含む。本
発明は、医薬として許容される賦形剤、例えば３Ｄ−ＭＰＬと一緒に本発明のタ
ンパク質を混合することを含むワクチン製剤を生産するための方法も供する。 本発明は、以下の例を引用することにより更に記述されよう。
【００３５】 実施例Ｉ：融合タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ（ＨＰＶ１６）を発現す
る大腸菌株の作製 １）発現プラスミドの作製 ａ）プラスミドｐＭＧ ＭＣＳ ｐｒｏｔ Ｄ１／３（＝ｐＲＩＴ１４５８９
）はインフルエンザからのＮＳ１コーディング領域のコドン４〜８１がヘモフィ
ルス−インフルエンゼ株７７２、バイオタイプ２（H Jansonら、1991, Infectio
n and Immunity, Jan. p119-125 ）の成熟プロテインＤの残基Ｓｅｒ２０→Ｔｈ
ｒ１２７に相当するコドンにより置換されている（ＷＯ９７／０１６４０として
公開されたＵＫ特許出願ｎ0 ９５１３２６１．９に記載される）ｐＭＧ８１の誘
導体である。Ｐｒｏｔ−Ｄ１／３の配列の後に多重クローニング部位（１１残基
）及びＣ末端ヒスチジンテールのためのコーディング領域（６Ｈｉｓ）がある。
【００３６】 ｂ）ＨＰＶゲノムＥ６及びＥ７配列タイプＨＰＶ１６（Dortら、Virology 198
5, 145, p.181 〜185 を参照のこと）を、（Deutsches Krebsforschungszentrum
(DKFZ), Referenzzentrum fuer human pathogen Papillomaviruses-D69120-Hei
delberg から得た）ｐＢＲ３２２にクローン化したＨＰＶ１６全長ゲノムから増
幅し、ｐＵＣ１９にサブクローン化してＴＣＡ３０１（＝ｐＲＩＴ１４４６２）
を供した。
【００３７】 プラスミドＴＣＡ３０８（＝ｐＲＩＴ１４５０１）の作製：融合タンパク質−
Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓを発現するプラスミド Ｅ７のアミノ酸１−１９８に相当するヌクレオチド配列をｐＲＩＴ１４４６２
から増幅する。そのポリメラーゼ鎖反応の間、ＮｃｏＩ及びＳｐｅＩ制限部位を
Ｅ７配列の５′及び３′端に作り、プラスミドｐＭＧ ＭＣＳ Ｐｒｏｔ Ｄ１
／３の同じ部位への挿入を許容してプラスミドＴＣＡ３０８（＝ｐＲＩＴ１４５
０１）を供した。その挿入物を配列決定してポリメラーゼ鎖反応の間に改変が形
成されていないことを確認した。その融合タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ
（ＨＰＶ１６）についての配列を図１に記載する。
【００３８】 ２）ＡＲ５８株の形質転換 プラスミドｐＲＩＴ１４５０１をλｐＬプロモーターの熱感受性レプレッサー
を含む欠失λリソゲンを含む大腸菌ＡＲ５８（Mottら、1985, Proc.Natl.Acad.S
ci., 82: 88 ）に導入した。 ３）細菌株の増殖及び誘導−Ｐｒｏｔ−Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓの発現 プラスミドｐＲＩＴ１４５０１で形質転換したＡＲ５８の細胞を、３０℃で５
０μｇ／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地１００ml中で増殖させた。増殖の
対数期の間、細菌を３９℃にシフトしてλレプレッサーを不活性化し、プロテイ
ンＤ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓの合成に向かわせた。３９℃でのインキュベーション
を４時間、続けた。細菌をペレット化し、−２０℃で保存した。
【００３９】 実施例II：融合タンパク質Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ（ＨＰＶ１６）のキャラク
タリゼーション 凍結した細胞を解凍し、１０mlのＰＢＳ緩衝液に再度懸濁する。細菌を、２０
，０００psi でフレンチ圧力細胞プレスＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏで破壊する（３回
）。その抽出液を４℃で３０分、１６，０００ｇで遠心する。
【００４０】 上述の抽出物の遠心の後、上清及びペレットのアリコートをＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動及びウエスタン・ブロッティングにより分析した。ペレ
ット画分中にある約３３kDa の主要バンドをクーマシー染色したゲルにより可視
化し、ウサギポリクローナル抗プロテインＤにより、及びアクセスできるヒスチ
ジンテールを検出するウシ腸アルカリホスファターゼに連結したＮｉ−ＮＴＡコ
ンジュゲート（Qiagen cat. n0 34510）によりウエスタン・ブロットで同定した
。発現のレベルはクーマシー染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に示さ
れる通り、全タンパク質の約５％を示す。
【００４１】 実施例III ：タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ（ＨＰＶ１６）精製 タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓを発現する細菌の１リッター培養物を１
１，３００ｇで３０分、４℃で遠心し、細胞ペレットを更なる処理まで−８０℃
に維持する。７５ml ＰＢＳ緩衝液中への再度の懸濁の後、大腸菌細胞を２０，
０００psi でフレンチ圧力細胞プレス（ＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏ（登録商標））で
破壊する。溶解した細胞を３０分、１７，０００ｇでの遠心によりペレット状に
する。タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓを含むペレットを３０mlの２Ｍ Ｎ
ａＣｌ、５０mM Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ pH７．５で１回、次に３０mlの５０mM
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ pH７．５で２回、洗う。
【００４２】 ＲＴで３０mlの８Ｍ尿素、５０mMホスフェートpH７．５中での２時間のインキ
ュベーションの後、ホスフェートpH７．５タンパク質を溶かす。４℃で１７，０
００ｇでの１５分の遠心により細胞デブリスを除去する。タンパク質精製をＲＴ
°で行い、溶解したタンパク質１５mlを、８Ｍ尿素、５０mMホスフェートpH７．
５で予め平衡化した５mM Ｎｉ２＋ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）樹脂（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａカラムＸＫ １６／２０）に、０．２ml／分の流速で適用する。２８０nm
の吸光度が基底ラインに達するまで同じ緩衝液で洗う。そのタンパク質を８Ｍ尿
素、５０mMホスフェートpH７．５中の０−６００mMイミダゾール勾配で溶出する
。これらの２つの最後のステップの流速を１ml／分にする。溶出した画分をＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動により及びウエスタン・ブロッティングによ
り分析する。クーマシーブルー染色により、ポリクローナル抗プロテインＤによ
り又はモノクローナル抗Ｅ７抗体により可視化したＰｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７−
Ｈｉｓは約３２kDa の主要単一バンドを示し、９５％純度タンパク質として評価
される。ポリクローナル抗大腸菌タンパク質抗体で追跡した大腸菌汚染物は観察
されない。
【００４３】 尿素を除去するために、１．３３mg／mlの精製抗原（Bradford）９mlをＲＴ°
で一晩、ＰＢＳ緩衝液３リッターに対して透析し、次に新しいＰＢＳ緩衝液に対
して４時間、透析する。８０％の無尿素タンパク質を可溶性タンパク質として回
収する。汚染しているエンドトキシンを除去するために、６mlの透析したタンパ
ク質を１mlのＡｆｆｉｐｒｅｐポリミキシンゲル（Biorad）と、３時間、４℃で
、静かに撹拌しながらインキュベートした。５００μｌのＡｆｆｉｐｒｅｐポリ
ミキシン樹脂との第２のインキュベーションを行ってエンドトキシンレベルを８
．８EU／μｇタンパク質に最小化する。０．２２μｍフィルター装置（Millex 0
.22 GV, Millipore ）での滅菌ろ過の後、０．６６５mg／mlのｐｒｏｔ−Ｄ１／
３−Ｅ７−Ｈｉｓを安定性のためにアッセイする。ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析は、−
２０℃、４℃、ＲＴ°又は３７℃における７日のインキュベーションの後にタン
パク質の進化を示さなかった。
【００４４】 実施例IV：融合タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ６−ｈｉｓ／ＨＰＶ１６を発現する
大腸菌株の作製 １．発現プラスミドの作製 ａ）プラスミドｐＭＧ ＭＣＳ ｐｒｏｔ Ｄ１／３（＝ｐＲＩＴ１４５８９
）は、インフルエンザからのＮＳ１コーディング領域のコドン４−８１がヘモフ
ィルス−インフルエンゼ株７７２、バイオタイプ２（H.Jansonら、1991, Infect
ion and Immunity, Jan. p.119〜125 ）の成熟タンパク質の残基Ｓｅｒ２０→Ｔ
ｈｒ１２７に相当するコドンにより置換されている（ＷＯ９７／０１６４０に記
載される）ｐＭＧ８１の誘導体である。Ｐｒｏｔ−Ｄ１／３の配列の後に多重ク
ローニング部位（１１残基）及びＣ末端ヒスチジンテール（６Ｈｉｓ）のための
コドン領域がある。このプラスミドを用いて融合タンパク質Ｄ１／３−Ｅ６−Ｈ
ｉｓを発現させる。
【００４５】 ｂ）ＨＰＶゲノムＥ６及びＥ７配列型ＨＰＶ１６（Seedorf ら、Virology 198
5, 145, p181〜185 ）を、（Deutsche Krebsforschungszentrum (DKFZ), Refere
nzzentrum fuer human pathogen Papillomavirusesから得た）ｐＢＲ３２２にク
ローン化したＨＰＶ１６全長ゲノムから増幅した。 ｃ）Ｄ６９１２０−ＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇをｐＵＣ１９にサブクローン化して
ＴＣＡ３０１（＝ｐＲＩＴ１４４６２）を供する。
【００４６】 プラスミドＴＣＡ３０７（＝ｐＲＩＴ１４４９７）の作製：融合タンパク質−
Ｄ１／３−Ｅ６−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１６を発現するプラスミド Ｅ６タンパク質のアミノ酸１→１５１に相当するヌクレオチド配列をｐＲＩＴ
１４４６２から増幅した。ポリメラーゼ鎖反応の間、ＮｃｏＩ及びＳｐｅＩ制限
部位をＥ６配列の５′及び３′端に作り、プラスミドｐＭＧ ＭＣＳ Ｐｒｏｔ
Ｄ１／３の同じ部位への挿入を許容してプラスミドＴＣＡ３０７（＝ｐＲＩＴ
１４４９７）を作った（図２を参照）。その挿入物を配列決定してポリメラーゼ
鎖反応の間に改変が形成されていないことを確認した。融合タンパク質−Ｄ１／
３−Ｅ６−Ｈｉｓのためのコーディング配列を図３に記載する。
【００４７】 ２．ＡＲ５８株の形質転換 プラスミドｐＲＩＴ１４４９７をλｐＬプロモーターの熱感受性レプレッサー
を含む欠失λリソゲンを含む大腸菌ＡＲ５８（Mottら、1985, Proc.Natl.Acad.S
ci., 82: 88 ）に導入した。 ３．細菌株の増殖及び誘導−Ｐｒｏｔ−Ｄ１／３−Ｅ６−Ｈｉｓの発現 プラスミドｐＲＩＴ１４４９７で形質転換したＡＲ５８の細胞を、３０℃で５
０μｇ／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地１００ml中で増殖させた。増殖の
対数期の間、細菌を３９℃にシフトしてλレプレッサーを不活性化し、プロテイ
ンＤ１／３−Ｅ６−Ｈｉｓの合成に向かわせた。３９℃でのインキュベーション
を４時間、続けた。細菌をペレット化し、−２０℃で保存した。
【００４８】 ４．融合タンパク質Ｄ１／３−Ｅ６−Ｈｉｓ（ＨＰＶ１６）のキャラクタリゼ
ーション 抽出物の調製 凍結した細胞を解凍し、１０mlのＰＢＳ緩衝液に再度懸濁した。細胞を２０，
０００psi でフレンチ圧力細胞プレスＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏで破壊する（３回）
。その抽出物を１６，０００ｇで３０分、４℃で遠心する。
【００４９】 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル及びウエスタンブロットでの分析 上述の抽出物の遠心の後、上清及びペレットのアリコートをＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル及びウエスタン・ブロッティングにより分析した。 そのペレット画分にある約３２kDa の主要バンドをクーマシー染色したゲルに
より可視化し、ウサギポリクローナル抗プロテインＤにより及びアクセスできる
ヒスチジンテールを検出するウシ腸アルカリホスファターゼに連結したＮｉ−Ｎ
ＴＡ（Qiagen cat n0 34510 ）によりウエスタン・ブロットで同定した。発現の
レベルは全タンパク質の約５％を示す。
【００５０】 ５．チオレドキシンとの同時発現 ＨＰＶ１８からのｐｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７ Ｈｉｓの発現（実施例III ）と
同様に、大腸菌株ＡＲ５８をチオレドキシン及びプロテインＤ１／３ Ｅ７ Ｈ
ｉｓ（ＨＰＶ１６）で形質転換した。 実施例Ｖ：Ｐｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ６ Ｈｉｓ（ＨＰＶ１６）の精製 ＨＰＶ−１６ Ｐｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ６組換え抗原を大腸菌（ＡＲ５８）内
で発現させた。発現ストラテジーは、Ｔ細胞ヘルパーエピトープを供する免疫学
的融合パートナーであるヘモフィルス・インフルエンゼからのプロテインＤの１
／３−Ｎ末端部分へのＥ６の融合を含んだ。アフィニティーポリヒスチジンテー
ルをその融合タンパク質のカルボキシ末端に工作した。その組換え抗原は不溶性
タンパク質として大腸菌内で過剰発現された。
【００５１】 抗原の可溶化は変性剤を必要とした。変性剤の欠如下で、Ｐｒｏｔ Ｄ１／３
−Ｅ６−Ｈｉｓは中性pHで沈殿した。可溶性の問題を回避するために、これらの
タンパク質の、ホールディングパートナーであるトランスのチオレドキシン（Th
ioredoxin in Trans)(TIT ）との同時発現を行った。 細菌の発現はＬＢ培地中で、３０℃で０．０５mg／mlのカナマイシン及びチオ
レドキシンを同時発現する場合、０．２mg／mlのアンピシリンの存在下で行う。
組換えタンパク質発現は、細胞光学密度（ＯＤ600nm ）が０．４に達した時に細
胞を４２℃に移すことにより熱的誘導される。タンパク質発現は４時間、維持さ
れる。精製は以下のプロトコルに従って行った。 細胞培養ペレット ６０ＯＤ600 １mM ｐｅｆａｂｌｏｃ、２Ｍ ＮａＣｌ、ＰＢＳ pH ７．４（Ｂｕｆｆｅｒ Ａ） フレンチプレス粉砕機 ３回 ２０，０００psi 遠心 １７，０００ｇ３０分、４℃ ペレット洗浄 ２Ｍ ＮａＣｌ、ＰＢＳ pH７．４（Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ ） ×１ ＰＢＳ pH７．４（Ｂｕｆｆｅｒ Ｃ） ×２ 遠心 １７，０００ｇ３０分、４℃ ペレット可溶化 ６Ｍ塩化グアニジン、２０mM ＰＯ４、pH７．０（Ｂｕ ｆｆｅｒ Ｄ）一晩、４℃ 遠心 １７，０００ｇ３０分、４℃ ＩＭＡＣ上の上清 平衡化： ６Ｍ塩化グアニジン、２０mM ＰＯ４、pH７．０（Ｂｕ ｆｆｅｒ Ｄ） 溶出：イミダゾールステップ（０．０２５Ｍ，０．１Ｍ ，０．５Ｍ） ８Ｍ尿素、２０mM ＰＯ４、pH７．０中 Ａｆｆｉｐｒｅｐポリミキシン ８Ｍ尿素、２０mM ＰＯ４、pH７．０（Ｂｕｆｆｅｒ Ｅ） ２ｈ ＲＴ° 透析 ４Ｍ尿素、０．５Ｍアルギニン、１５０mM ＮａＣｌ、 １０mM ＰＯ４、pH６．８（Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ） ２Ｍ尿素、０．５Ｍアルギニン、１５０mM ＮａＣｌ、 １０mM ＰＯ４ pH６．８（Ｂｕｆｆｅｒ Ｊ） ０Ｍ尿素、０．５Ｍアルギニン、１５０mM ＮａＣｌ、 １０mM ＰＯ４ pH６．８（Ｂｕｆｆｅｒ Ｋ） 細胞は、フレンチプレス細胞装置を用いて高圧ホモジェニゼーションにより効
率よく破壊される。抗原は高濃度のタンパク質変性剤で抽出する。この最初のス
テップは細胞壁を破壊し、その細菌の不溶性画分から抗原を抽出する。以下の精
製を４リッター培養物で行った。
【００５２】 緩衝液 Ａ．ＰＢＳ／２Ｍ ＮａＣｌ／１mM Ｐｅｆａｂｌｏｃ Ｂ．ＰＢＳ／２Ｍ ＮａＣｌ Ｃ．ＰＢＳ：１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ、８．１mM ＮａＨ２ＰＯ
４、１．４７mM ＫＨ２ＰＯ４ pH７．４ Ｄ．６Ｍ塩化グアニジウム、２０mM ＰＯ４（ＮａＨ２ＰＯ４（２Ｈ２Ｏ）／Ｋ
２ＨＰＯ４（３Ｈ２Ｏ））pH７．０ 出発材料は各々４００ml培養物の１０のフラスコである。
【００５３】 細胞ペーストをＢｕｆｆｅｒ Ａ（この場合、２４０mlのＢｕｆｆｅｒ Ａ）
中６０ＯＤ600 に懸濁し、次にフレンチプレス粉砕機に、３回通して細胞を溶解
する。溶解した細胞を１５，０００ｇで４℃で３０分ペレット状にする。組換え
タンパク質を含む細菌の細胞ペレットを２４０ml Ｂｕｆｆｅｒ Ｂで１回、２
４０ml Ｂｕｆｆｅｒ Ｃで２回、洗う。
【００５４】 Ｐｒｏｔ Ｄ Ｅ６−Ｈｉｓ（ＴＩＴ）を回転ホイール上で４℃で一晩、２４
０ml Ｂｕｆｆｅｒ Ｄにより可溶化する。細胞デブリスを４℃で１５，０００
ｇで３０分、ペレット状にする。上清（２３０ml）を−２０℃で保存する。次に
その材料をＩＭＡＣクロマトグラフィーにかける。 キレート化リガンドＮＴＡ（ニトリロ−トリ−酢酸）をアガロース支持体（Ｑ
ｉａｇｅｎ）に結合させる。ＮＴＡリガンドにニッケル金属イオンを満たす。そ
れは、そのニッケルの６の配位部位のうち４つを介して相互作用する。ニッケル
の残りの２つの配位部位は６×Ｈｉｓ標識化タンパク質のヒスチジン残基と強力
に相互作用する。Ｎｉ−ＮＴＡと結合しその標識化抗原に置きかわるイミダゾー
ルとの競合により溶出を行う。
【００５５】 Ni-NTA Agarose Qiagen （カタログ番号：３０２５０）を用いた。 溶液Ｄ ：６Ｍ塩化グアニジン、２０mM ＰＯ４（ＮａＨ2 ＰＯ４（２Ｈ2 Ｏ）／Ｋ2 ＨＰＯ４（３Ｈ2 Ｏ））、pH７．０Ｅ ：８Ｍ尿素、２０mM ＰＯ４（ＮａＨ2 ＰＯ４（２Ｈ2 Ｏ）／Ｋ2 ＨＰＯ４（
３Ｈ2 Ｏ））、pH７．０Ｆ ：Ｅ＋０．０２５ＭイミダゾールＧ ：Ｅ＋０．１ＭイミダゾールＨ ：Ｅ＋０．５Ｍイミダゾール ０．５Ｍ ＮａＯＨ 脱イオン水 ０．０２％ ＮａＮ3 精製 ａ）樹脂（１５ml樹脂／２３０mlサンプル）を充填し、１５cmｈ-1で１０カラ
ム容量（C.V.）のＢｕｆｆｅｒ Ｄで平衡化する。
【００５６】 ｂ）可溶化画分からの上清を１５cmｈ-1でそのカラムに注入する。 ｃ）ＯＤ２８nmがベースラインに戻るまでカラムをＢｕｆｆｅｒ Ｄで１５cm
ｈ-1で洗う。 ｄ）カラムを１５cmｈ-1で２CVのＢｕｆｆｅｒ Ｅで洗う。その洗浄画分を回
収する。
【００５７】 ｅ）カラムを最初に５CVのＢｕｆｆｅｒ Ｆで溶出する。２５kD主要汚染物を
除去する。 ｆ）次にカラムを２CVのＢｕｆｆｅｒ Ｇで溶出する。 ｇ）カラムを最後に３CVのＢｕｆｆｅｒ Ｈで溶出する。抗原を溶出する。 抗原陽性画分をプールする（３０ml）。
【００５８】 エンドトキシンをａｆｆｉｐｒｅｐクロマトグラフィーにより除去する。 Ａｆｆｉ−Ｐｒｅｐ（登録商標）ポリミキシン支持体は、Ａｆｆｉ−Ｐｒｅｐ
（登録商標）Ｍａｔｒｉｘに結合したＵＳＰグレードＰｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂか
らなる。そのエンドトキシンの脂質Ａ成分への高いアフィニティーにより、ポリ
ミキシンＢは高い能力及び選択性でエンドトキシン分子に結合する。
【００５９】 溶液Ｅ ：８Ｍ尿素、２０mM ＰＯ４（ＮａＨ2 ＰＯ４（２Ｈ2 Ｏ）／Ｋ2 ＨＰＯ４（
３Ｈ2 Ｏ））、pH７．０（非発熱性）。 ０．５Ｍ ＮａＯＨ 脱イオン非発熱性水 手順 １）Ａｆｆｉ−Ｐｒｅｐ（登録商標）ポリミキシン樹脂を１０容量の０．１Ｍ
ＮａＯＨ、次に１０容量の無発熱物質水で洗う。
【００６０】 ２）樹脂を１０容量のＢｕｆｆｅｒ Ｅで平衡化する。 ３）１５ml（半分をプール）のＩＭＡＣ溶出サンプルを３mlのＡｆｆｉ−Ｐｒ
ｅｐ（登録商標）ポリミキシン樹脂と、バッチ・モードでインキュベートする。 ４）インキュベーションを、回転ホイール上で４℃で室温又はＯ／Ｎで４時間
、追跡する。
【００６１】 ５）サンプルを２０００ｇで１０分、遠心する（Beckman GS-6R ）。 ６）抗原を含む上清を収集し、エンドトキシン及びタンパク質アッセイにかけ
る。 ７）樹脂を捨てる。 小分子は半透膜を介して拡散するが、大きな分子は保持される。透析の過程は
その膜の２つの側上の溶質の濃度の差により駆動される。各々の側の緩衝組成物
が平衡になるまで、新しい溶液を導入する。
【００６２】 緩衝液Ｉ ：４Ｍ尿素、０．５Ｍアルギニン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０mM ＰＯ４（
ＮａＨ2 ＰＯ４（２Ｈ2 Ｏ）／Ｋ2 ＨＰＯ４（３Ｈ2 Ｏ）） pH６．８Ｊ ：２Ｍ尿素、０．５Ｍアルギニン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０mM ＰＯ４（
ＮａＨ2 ＰＯ４（２Ｈ2 Ｏ）／Ｋ2 ＨＰＯ４（３Ｈ2 Ｏ）） pH６．８Ｋ ：０Ｍ尿素、０．５Ｍアルギニン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０mM ＰＯ４（
ＮａＨ2 ＰＯ４（２Ｈ2 Ｏ）／Ｋ2 ＨＰＯ４（３Ｈ2 Ｏ）） pH６．８ １）サンプル（１５ml）を透析管材（２０．４mm直径及び６cmの高さ）に導入
する。
【００６３】 ２）透析管材を、２時間、４℃で撹拌しながら、Ｂｕｆｆｅｒ Ｉを含む２リ
ッターシリンダーに入れる。 ３）透析管材を、２時間、４℃で、Ｂｕｆｆｅｒ Ｊを含む２リッターシリン
ダー（撹拌下）に入れる。 ４）透析管材を、４℃のＯ／Ｎで、（撹拌下で）Ｂｕｆｆｅｒ Ｋを含む２リ
ッターシリンダーに入れる。
【００６４】 Millipore Sterile Millex-GV ０．２２μ、１３mm。カタログ番号：ＳＬＧＶ
０１３０Ｓ。 全てのステップは室温（ＲＴ≒２２℃）で行う。抗原は安定であるようである
。 抗原溶液は０．２μｍフィルターを通してろ過し、いずれの細菌増殖も防ぐ。
抗原はＮｕｎｃ容器中で−２０℃に維持する。
【００６５】 キャラクタリゼーション： タンパク質Ｄ１／３ Ｅ６ Ｈｉｓは次の通りキャラクタライズする。 タンパク質Ｄ１／３−Ｅ６−ＨｉｓはプロテインＤ部分からの１１２アミノ酸
を伴うこの３アミノ酸長ペプチドである。タンパク質Ｄ１／３−Ｅ６−Ｈｉｓは
３２kDの理論分子量を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３３kDタンパク質として移動す
る。タンパク質Ｄ１／３−Ｅ６−Ｈｉｓの理論等電点は８．１７である。
【００６６】 ウイルスのプロテインＥ６は１４のシステイン残基を含む塩基性タンパク質で
あり、そのシステイン残基のうちの８つ（Ｃｙｓ３０，３３，６３，６６及びＣ
ｙｓ１０３，１０６，１３６，１３９）は２つのＣ末端の亜鉛結合モチーフに関
与している。 タンパク質Ｄ１／３−Ｅ６−Ｈｉｓは、ホールディングパートナーであるトラ
ンスのチオレドキシンと共に、大腸菌−ＡＲ５８株内で不溶性タンパク質として
発現される。細胞培養は４００mlフラスコで行う。
【００６７】 １リッターの培養で５．４mgの９５％純度のタンパク質が得られる。 実施例VI：融合タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ６Ｅ７−ｈｉｓ／ＨＰＶ１６を発現
する大腸菌株の作製 １．発現プラスミドの作製 ａ）プラスミドｐＭＧ ＭＣＳ ｐｒｏｔ Ｄ１／３（＝ｐＲＩＴ１４５８９
）は、インフルエンザからのＮＳ１コーディング領域のコドン４−８１がヘモフ
ィルス−インフルエンゼ株７７２、バイオタイプ２（H.Jansonら、1991, Infect
ion and Immunity, Jan. p.119〜125 ）の成熟プロテインＤの残基Ｓｅｒ２０→
Ｔｈｒ１２７に相当するコドンにより置換されている（上述の）ｐＭＧ８１の誘
導体である。Ｐｒｏｔ−Ｄ１／３の配列の後に多重クローニング部位（１１残基
）及びＣ末端ヒスチジンテール（６Ｈｉｓ）のためのコドン領域がある。このプ
ラスミドを用いて融合タンパク質Ｄ１／３−Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓを発現させる。
【００６８】 ｂ）ＨＰＶゲノムＥ６及びＥ７配列型ＨＰＶ１６（Seedorf ら、Virology 198
5, 145, p181〜185 ）を、（Deutsche Krebsforschungszentrum (DKFZ), Refere
nzzentrum fuer human pathogen Papillomavirusesから得た）ｐＢＲ３２２にク
ローン化したＨＰＶ１６全長ゲノムから増幅し、ｐＵＣ１９にサブクローン化し
てＴＣＡ３０１（＝ｐＲＩＴ１４４６２）を供する。
【００６９】 ｃ）ＴＣＡ３０１（＝ｐＲＩＴ１４４６２）内のＥ６及びＥ７のためのコーデ
ィング配列を、（ＡｆｌIII 及びＮｓｉＩ部位の間に挿入された）合成オリゴヌ
クレオチドアダプターで改変し、Ｅ６及びＥ７遺伝子の間の５ヌクレオチドの欠
失を導入してＥ６の終止コドンを除去し、プラスミドＴＣＡ３０９（＝ｐＲＩＴ
１４５５６）内に融合化Ｅ６及びＥ７コーディング配列を作る。図４を参照のこ
と。
【００７０】 プラスミドＴＣＡ３１１（＝ｐＲＩＴ１４５１２）の作製：融合タンパク質−
Ｄ１／３−Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１６を発現するプラスミド 融合化Ｅ６Ｅ７タンパク質のアミノ酸１→２４９に対応するヌクレオチド配列
をｐＲＩＴ１４５５６から増幅した。ポリメラーゼ鎖反応の間、ＮｃｏＩ及びＳ
ｐｅＩ制限部位をＥ６Ｅ７融合化配列の５′及び３′端に作り、プラスミドｐＭ
Ｇ ＭＣＳ Ｐｒｏｔ Ｄ１／３の同じ部位への挿入を許容してプラスミドＴＣ
Ａ３１１（＝ｐＲＩＴ１４５１２）を供した（図５を参照のこと）。その挿入物
を配列決定してポリメラーゼ鎖反応の間に改変がおこっていないことを確認した
。融合タンパク質Ｄ１／３−Ｈｉｓのためのコーディング配列を図６に記載する
。
【００７１】 ２．ＡＲ５８株の形質転換 プラスミドｐＲＩＴ１４５１２をλｐＬプロモーターの熱感受性レプレッサー
を含む欠失λリソゲンを含む大腸菌ＡＲ５８（Mottら、1985, Proc.Natl.Acad.S
ci., 82: 88 ）に導入した。 ３．細菌株の増殖及び誘導−Ｐｒｏｔ−Ｄ１／３−Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓの発現 プラスミドｐＲＩＴ１４５１２で形質転換したＡＲ５８の細胞を、３０℃で５
０μｇ／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地１００ml中で増殖させた。増殖の
対数期の間、細菌を３９℃にシフトしてλレプレッサーを不活性化し、プロテイ
ンＤ１／３−Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓの合成に向かわせた。３９℃でのインキュベーシ
ョンを４時間、続けた。細菌をペレット化し、−２０℃で保存した。
【００７２】 ４．融合タンパク質Ｄ１／３−Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓのキャラクタリゼーション 凍結した細胞を解凍し、１０mlのＰＢＳ緩衝液に再度懸濁した。細胞を２０，
０００psi でフレンチ圧力細胞プレスＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏで破壊する（３回）
。その抽出物を１６，０００ｇで３０分、４℃で遠心する。 上述の抽出物の遠心の後、上清及びペレットのアリコートをＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動及びウエスタン・ブロッティングにより分析した。
【００７３】 そのペレット画分にある約４８kDa の主要バンドをクーマシー染色したゲルに
より可視化し、ウサギポリクローナル抗プロテインＤにより及びアクセスできる
ヒスチジンテールを検出するウシ腸アルカリホスファターゼに連結したＮｉ−Ｎ
ＴＡ（Qiagen cat n0 34510 ）によりウエスタン・ブロットで同定した。発現の
レベルは全タンパク質の約１％を示す。
【００７４】 実施例VIｂ： 同様に、ＨＰＶ１６からのＬｉｐｏ Ｄ１／３及びＥ６−Ｅ７の融合タンパク
質をチオレドキシンの存在下で大腸菌中で発現させた。プレタンパク質（３８８
ａａ）のＮ末端は、ＭＤＰ残基及び次に（ヘモフィルス・インフルエンゼからの
）リポプロテインＤのシグナルペプチドの１６アミノ酸を含み、それは生体内で
開裂されて成熟タンパク質（３７０ａａ）を供する。リポプロテイン部分（ａａ
１〜１２７）の後に、融合したタンパク質Ｅ６及びＥ７がある。そのタンパク質
のＣ末端にはTSGHHHHHH が延長している。
【００７５】 そのタンパク質を次のプロトコルにより精製した： 実施例VII ：リポプロテインＤ１／３−Ｅ６−Ｅ７−Ｈｉｓ（ＴＩＴ）精製 Ａ）可溶化 細胞ペーストをプロテアーゼインヒビターとして１mM Ｐｅｆａｂｌｏｃの存
在下で２Ｍ ＮａＣｌ、２０mMホスフェート（ＮａＨ2 ＰＯ４／Ｋ2 ＨＰＯ４）
中で６０ＯＤ600 まで懸濁し、次にフレンチプレス粉砕機（２０，０００psi ）
に３回通して細胞を溶解する。溶解した細胞を４℃で１５，０００ｇで３０分、
ペレット状にする。エンドトキシンレベルを減少させるために、組換えタンパク
質を含む細胞ペレットを４Ｍ尿素、２Ｍ ＮａＣｌ、２０mMホスフェートpH７．
５で２回、２％ Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ、２０mMホスフェートpH７．５で１回、
及び最後に２０mMホスフェート緩衝液pH７．０で２回、洗って微量の洗剤を除去
する（各々の洗浄は、細胞懸濁に用いたのと同じ容量で行う）。ＬｉｐｏＰｒｏ
ｔ Ｄ１／３−Ｅ６−Ｅ７−Ｈｉｓ（ＴＩＴ）を、０．２Ｍ β−メルカプトエ
タノール（＝βＭｅＯＨ）、２０mM ＰＯ４ pH１２中の８Ｍ尿素により（細胞
懸濁に用いたのと同量で）４℃で一晩で溶かし、次にＲＴ°で同じ緩衝液中で２
時間、インキュベートする。細胞デブリスを４℃で１５，０００ｇで３０分、ペ
レット状にする。上清を−２０℃に維持する。
【００７６】 Ｂ）精製 １）Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅファーストフローでのアニオン交換クロマトグラ
フィー ２２５mlの凍結サンプルを冷水浴中で室温で解凍し、８Ｍ尿素、０．２Ｍ β
ＭＥＯＨ、２０mM ＰＯ４ pH１２で予め平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅフ
ァーストフローカラム（Pharmacia, XK 26/20 ）（３０ml樹脂／２２５ml上清）
に４５cm／ｈで適用する。ＯＤ２８０nmがベースラインに達するまで、カラムを
８Ｍ尿素、０．２Ｍ βＭＥＯＨ、２０mM ＰＯ４ pH１２により洗い、次に８
Ｍ尿素、２０mMホスフェートpH１２（２カラム容量）で第２の洗浄を行う。８Ｍ
尿素、２０mMホスフェートpH１２中のＮａＣｌのステップ（０．１Ｍ，０．２５
Ｍ．０．５Ｍ ＮａＣｌ、各々のステップは約２カラム容量）により４５cm／ｈ
で溶出を行う。０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出した画分をプールする。
【００７７】 ２）イオン金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ） Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅステップから０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出した画分をプ
ールし、０．２Ｍ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、２０mMホスフェートpH１０に対して透
析し、次に８Ｍ尿素、２０mM ＰＯ４ pH１２で予め平衡化したＮｉ２＋−ＮＴ
Ａ（Ｑｉａｇｅｎ）カラム（XK 26/20, Pharmacia ）（３０ml樹脂／６１mlサン
プル）に５．６cm／ｈで充填する。ベースラインに達するまでカラムを８Ｍ尿素
、２０mM ＰＯ４ pH１２で洗い、次に８Ｍ尿素、２０mM ＰＯ４ pH１０で洗
う。抗原を４５cm／ｈで、８Ｍ尿素中のイミダゾールステップ（０．０２５Ｍ，
０．０５Ｍ，０．１Ｍ，０．１５Ｍ．０．２Ｍ，０．５Ｍイミダゾール；各々の
ステップは２カラム容量）により溶出する。０．０５Ｍイミダゾールで溶出した
画分をプールする。
【００７８】 Ｃ）濃縮 ＩｍａｃサンプルをＲＴ°で、ＡＭＩＣＯＮからの撹拌セル中の５kDa Filtro
n Omega 膜で約５倍に（０．４０７mg／mlに）濃縮する。 Ｄ）透析 濃縮したサンプルを、０．５Ｍアルギニン、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM Ｐ
Ｏ４ pH６．８中減少する尿素濃度ステップ（４Ｍ，２Ｍ尿素）に対してＲＴで
透析する。０．５Ｍアルギニン、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＰＯ４ pH６．
８に対する最後の透析を４℃で行う。
【００７９】 結果： ＩＭＡＣステップは、０．０２５Ｍイミダゾールで３２kD汚染物を除すること
ができ、特定の抗原も溶出した。０．０５Ｍイミダゾール溶出抗原はＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥのクーマシーブルー染色により９０％純度と評価される。これらの２つの
精製ステップの後、サンプルは大腸菌汚染物を含まない。特定の抗原−Ｎ及び／
又はＣ末端抗体を用いるウエスタン・ブロッティング分析は、全長タンパク質よ
り高い及び低いＭＷのバンドの不均一パターンを示す。このパターンは、全長タ
ンパク質と同時に精製された、凝集物及び不完全に処理されたタンパク質及び／
又は分解したものの存在を示す。
【００８０】 実施例VIII：融合Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７変異（ｃｙｓ２４→ｇｌｙ，ｇｌ
ｕ２６→ｇｌｎ）型ＨＰＶ１６を発現する大腸菌株Ｂ１００２の作製 １）発現プラスミドの作製 出発材料： ａ）融合Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７−ＨｉｓをコードするプラスミドｐＲＩＴ
１４５０１（＝ＴＣＡ３０８） ｂ）クローニングベクターｐＵＣ由来のプラスミドＬＩＴＭＵＳ２８（New En
gland Biolabs cat n0 306〜28） ｃ）ヘモフィルス−インフルエンゼ株７２２、バイオタイプ２（H.Jansonら、
1991, Infection and Immunity, Jan. p.119〜125 ）の成熟プロテインＤの残基
Ｓｅｒ２０→Ｔｈｒ１２７に対応するコドンにより、インフルエンザからのＮＳ
１コーディング領域のコドン４−８１が置換されているｐＭＧ８１（上述）の誘
導体であるプラスミドｐＭＧ ＭＣＳ Ｐｒｏｔ Ｄ１／３（ｐＲＩＴ１４５８
９）、Ｐｒｏｔ−Ｄ１／３の配列の後に多重クローニング部位（１１残基）及び
Ｃ末端ヒスチジンテールのためのコーディング領域（６Ｈｉｓ）がある。
【００８１】 プラスミドｐＲＩＴ１４７３３（＝ＴＣＡ３４７）の作製：Ｈｉｓテールを有
する融合タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ７変異体（ｃｙｓ２４→ｇｌｙ，ｇｌｕ２６
→ｇｌｎ）を発現するプラスミド Ｈｉｓテールが伸長したＨＰＶ１６からのＥ７遺伝子のコーディング配列を有
するｐＲＩＴ１４５０１（＝ＴＣＡ３０８）からのＮｃｏＩ−ＸｂａＩフラグメ
ントを変異誘発のために役立つ中間体ベクターＬｉｔｍｕｓ２８にサブクローン
化してｐＲＩＴ１４９０９（＝ＴＣＡ３３７）を供した。網膜芽細胞遺伝子の癌
抑制遺伝子産物への結合を妨害するために二重変異：ｃｙｓ２４→ｇｌｙ（Edmo
nds 及びVousden, J.Virology 63: 2650 (1989））及びｇｌｕ２６→ｇｌｎ（Ph
elpsら、J.Virology 66: 2418 〜27 (1992））を選択した。Ｅ７遺伝子中の変異
の導入は、キット“Quick Change Site directed Mutagenesis (Stratagene cat
n0 200518）で実現し、プラスミドｐＲＩＴ１４６８１（＝ＴＣＡ３４３）を供
した。配列決定により変異の存在及び完全なＥ７遺伝子の組込みを確認した後、
変異したＥ７遺伝子をベクターｐＲＩＴ１４５８９（＝ｐＭＧ ＭＣＳ Ｐｒｏ
ｔ Ｄ１／３）に導入してプラスミドｐＲＩＴ１４７３３（＝ＴＣＡ３４７）を
供した（図７）。
【００８２】 融合タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ７変異（ｃｙｓ２４→ｇｌｙ，ｇｌｕ２６→ｇ
ｌｎ）−Ｈｉｓについての配列を図８に示す。 ２）Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７変異（ｃｙｓ２４→ｇｌｙ，ｇｌｕ２６→ｇｌ
ｎ）−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１６を発現する株Ｂ１００２の作製 プラスミドｐＲＩＴ１４７３３をλｐＬプロモーターの熱感受性レプレッサー
を含む欠失λリソゲンを含む大腸菌ＡＲ５８（Mottら、1985, Proc.Natl.Acad.S
ci., 82: 88 ）に導入してカナマイシンに対して耐性の形質転換体についての選
択により株Ｂ１００２を供した。
【００８３】 ３）細菌株Ｂ１００２の増殖及び誘導−Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７変異（ｃｙ
ｓ２４→ｇｌｙ，ｇｌｕ２６→ｇｌｎ）−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１６の発現 プラスミドｐＲＩＴ１４７３３で形質転換したＡＲ５８の細胞（Ｂ１００２株
）を３０℃で、５０μｇ／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地１００ml中で増
殖させた。増殖の対数期の間、細菌を３９℃にシフトしてλレプレッサーを不活
性化し、Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７変異Ｈｉｓ／ＨＰＶ１６の合成に切りかえた
。３９℃でのインキュベーションを４時間、続けた。細菌をペレット状にし、−
２０℃で保存した。
【００８４】 ４）融合Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７変異（ｃｙｓ２４→ｇｌｙ，ｇｌｕ２６→
ｇｌｎ）−Ｈｉｓ型ＨＰＶ１６のキャラクタリゼーション 凍結した細胞を解凍し、１０mlのＰＢＳ緩衝液に再度懸濁した。細胞を２０，
０００psi でフレンチ圧力細胞プレスＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏで破壊した（３回）
。その抽出物を１６，０００ｇで３０分、４℃で遠心した。
【００８５】 上述の抽出物の遠心の後、上清及びペレットのアリコートをＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動及びウエスタン・ブロッティングにより分析した。 そのペレット画分にある約３３kDa の主要バンドをクーマシー染色したゲルに
より可視化し、ウサギポリクローナル２２Ｊ７０抗プロテインＤにより、Ｚｙｍ
ｅｄからのモノクローナル抗Ｅ７／ＨＰＶ１６により、及びアクセスできるヒス
チジンテールを検出するウシ腸アルカリホスファターゼに連結したＮｉ−ＮＴＡ
（Qiagen cat n0 34510 ）によりウエスタン・ブロットで同定した。発現のレベ
ルは全タンパク質の約３〜５％を示す。
【００８６】 Ｂ１００２の細胞を遠心により培養液から分離した。Ｂ１００２の濃縮細胞を
−６５℃に保存した。 実施例IX：ＰＲＯＴ Ｄ１／３ Ｅ７（Ｄｍｕｔａｎｔ）ＨＰＶ１６の精製
【００８７】
【表１】
【００８８】 ａ）細胞懸濁液の調製 Ｂ１００２の凍結濃縮細胞を解凍し、（約２５ｇ ＤＣＷＬ-1の細胞濃度に相
当する）６０の最終的光学密度ＯＤ650 まで＋４℃で細胞粉砕緩衝液（表１を参
照）に再度懸濁した。 ｂ）細胞粉砕 細胞を、高圧ホモジェナイザー（Ｒａｎｎｉｅ）に１０００bar で２回通すこ
とにより粉砕した。その粉砕した細胞懸濁液を４℃に維持したフラスコに収集し
た。
【００８９】 細胞粉砕緩衝液：３Ｎ ＨＣｌでpHを７．５に調節したＮａ2 ＨＰＯ4 （０．
０２Ｎ）、ＮａＣｌ（２Ｍ） 精製 ２ａ）動的膜ろ過（DMF （登録商標）−PALL FIVTRON） ２リッターの粉砕した細胞懸濁液（ＯＤ６０）を、０．２μｍカットオフ膜を
備えたＰＡＬＬからの動的ろ過システム、ＤＭＦ（登録商標）に充填する。
【００９０】 ２リッターから１リッターに濃縮してサンプルＰＣＣ１を供し、 empigen-EDTA緩衝液（濃度ＥＤＴＡ １．８６ｇ、Ｅｍｐｉｇｅｎ（３０％）
３．３３ml、ＰＯ4 3- ０．５Ｍ ４０．００ml）の３容量（３Ｌ）で一定容量で
洗ってサンプルＰＤ１を供し、 １Ｌから３００mlに濃縮してサンプルＰＣＣ２を供し、 ｅｍｐｉｇｅｎ緩衝液（濃度Ｌ-1：Ｅｍｐｉｇｅｎ ３０％、３．３３ml、Ｐ
Ｏ4 3- ０．５Ｍ ４０ml）pH７．５の１０容量（３Ｌ）で一定容量で洗ってサン
プルを供し、 同じ容量（３００ml）の塩酸グアニジン８Ｍ緩衝液（濃度Ｌ-1：Ｇｕ．ＨＣｌ
７６４ｇ；Ｅｍｐｉｇｅｎ ３０％、３．３３ml、ＰＯ4 3- ０．５Ｍ ４０ml
）pH７．５を加えてタンパク質を可溶化し、 タンパク質を回収する：最初の容量（３００ml）への濃度及び３容量の塩酸グ
アニジン４Ｍ緩衝液（濃度Ｌ-1：Ｇｕ．ＨＣｌ ３２８．１２ｇ；Ｅｍｐｉｇｅ
ｎ（３０％）３．３３ml ＰＯ4 3- ０．５Ｍ ４０．００ml）pH７．５でのディ
アフィルルーションの間に浸透物−サンプルＰ３を収集。
【００９１】 これら全てのステップは、冷室（２〜８℃）で０．５Ｍ ＰＯ4 3- で調製した
pHで行う。 Ｐ３画分は次の精製ステップまで−２０℃で保存する。 ２ｂ）Ｚｎ−キレート化セファロースクロマトグラフィー Ｐ３画分を解凍し、充填し、平衡化したＺｎキレート化セファロースＦＦに注
入する。
【００９２】 その後、そのカラムを、 約３容量の塩酸グアニジン４Ｍ緩衝液（上述）で洗い−サンプルＺｎ−ＦＴ 約５容量の尿素４Ｍ緩衝液（濃度Ｌ-1：尿素２４０．２４ｇ Ｅｍｐｉｇｅｎ
３．３３ml、ＰＯ4 3- ０．５Ｍ ４０．００ml）で洗い−サンプルＺｎ−Ｗ 上述と同じであるが、イミダゾール３４．０４ｇの濃度である約３容量の尿素
４Ｍ−イミダゾール２０mM緩衝液（濃度Ｌ-1：尿素２４０．２４ｇ Ｅｍｐｉｇ
ｅｎ（３０％）３．３３mlイミダゾール（１．３６ｇ）ＰＯ4 3- ０．５Ｍ ４０
．００ml pH７．５）で溶出し−サンプルＺｎ−２０ 尿素４Ｍ−イミダゾール５００mMでＵＶピークの終りまで溶出する−サンプル
Ｚｎ−５００ カラムをＥＤＴＡ ５０mM及びＮａＯＨ ０．５Ｍで洗う。Ｚｎキレート化セ
ファロース溶出液（Ｚｎ−５００）を次の精製ステップまで２〜８℃で保存する
。
【００９３】 Ｚｎキレート化セファロースクロマトグラフィーの作業は室温で行う。 ２ｃ）Ｑ−セファロースクロマトグラフィー Ｚｎ−５００画分を、充填し平衡化したＱ−セファロースＦＦに注入する。 その後、カラムを、 約７容量の尿素４Ｍ緩衝液（上述）で洗い−サンプルＱ
Ｓ−ＦＴ ｅｍｐｉｇｅｎを含まない尿素４Ｍ緩衝液約１０容量（濃度Ｌ-1尿素２４０．
２４ｇ ＰＯ4 3- ０．５Ｍ ４０．００ml）で洗い−サンプルＱＳ−Ｗ１ ｅｍｐｉｇｅｎを含まない尿素６Ｍ緩衝液約１０容量（尿素３６０．３６ｇ／
Ｌ）で洗い−サンプルＱＳ−Ｗ２ 約５容量の尿素６Ｍ−ＮａＣｌ ２００mM緩衝液（濃度Ｌ-1：尿素３６０．３
６ｇ ＮａＣｌ １１．６９ｇ、４０．００ml ＰＯ4 3- ）で溶出し、 約３容量の尿素６Ｍ−ＮａＣｌ ５００mM緩衝液（先と同じだかＮａＣｌ ２
９．２２ｇ／Ｌ）で溶出し、画分の正確な終りをＵＶピークにより決定し−サン
プルＱＳ−５００ ４容量の尿素４Ｍ−ＮａＣｌ／Ｍ緩衝液（濃度Ｌ-1尿素３６０．３６、ＮａＣ
ｌ ５８．４４ｇ、４０．００ml ＰＯ4 3- （０．５１）で溶出する−サンプル
ＱＳ−１Ｍ 次にカラムをＮａＯＨ ０．５Ｍで洗う。
【００９４】 ＱＳ−セファロース溶出物（ＱＳ−５００）は次の精製ステップまで２〜８℃
の間に保存する。 Ｑ−セファロースクロマトグラフィー作業は室温で行う。 ２ｄ）限外ろ過 次にＱＳ−５００画分を１０kD限外ろ過ユニット（Ultrasette-Pall Filtron
）で処理する。
【００９５】 産物を最初に約１mg／mlのタンパク質に濃縮し、次に１０容量のホスフェート
緩衝液に対してディアフィルトレーションする。 浸透物（画分ＵＦ−Ｐ）を捨て、停留物（画分ＵＦ−Ｒ）を最後のろ過まで２
〜８℃で保存する。 限外ろ過作業は２〜８℃で行う。
【００９６】 ２ｅ）最終的なろ過 最後のバルク（ＵＦ−Ｒ画分）を層流下で無菌クラス１００室で０．２２μｍ
滅菌フィルター（Millpak-Millipore ）でろ過する。最終濃度は０．５〜１．０
μｇ／mlである。その滅菌バルクを−２０℃に保存する。 実施例Ｘ：融合ｃｌｙｔａ−Ｅ６−Ｈｉｓ（ＨＰＶ１６）を発現する大腸菌株
の作製 １．発現プラスミドの作製 ａ）融合Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ６−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１６をコードするプラス
ミドｐＲＩＴ１４４９７（＝ＴＣＡ３０７） ｂ）ストレプトコッカス・ニューモニエのＬｙｔＡの１１７Ｃ末端コドンにつ
いてのコーディング配列を含む中間体ベクターであるプラスミドｐＲＩＴ１４６
６１（＝ＤＶＡ２）。Ｌｙｔａは、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、（
ｌｙｔＡ遺伝子（Gene, 43 (1986) p265〜272 ）によりコードされるアミダーゼ
ＬＹＴＡ、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解するオートリシ
ンを合成するシュードモナス・ニューモニエから得られる。ＬＹＴＡタンパク質
のＣ末端ドメインはコリン又はＤＥＡＥのような特定のコリンアナログに対する
アフィニティーの原因である。
【００９７】 １．ｂ．プラスミドｐＲＩＴ１４６３４（＝ＴＣＡ３３２）の作製：融合なｃ
ｌｙｔａ−Ｅ６−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１６を発現するプラスミド ａ）最初のステップは、プラスミドｐＲＩＴ１４４９７からの大きなＮｃｏＩ
−ＡｆｌII制限フラグメントの精製及びｐＲＩＴ１４６６１からの小さなＡｆｌ
II−ＡｆｌIII 制限フラグメントの精製であった。
【００９８】 ｂ）第２のステップは、ｐＬプロモーターの制御下で融合タンパク質ｃｌｙｔ
ａ−Ｅ６−ＨｉｓをコードするプラスミドｐＲＩＴ１４６３４（＝ＴＣＡ３３２
）を作り出す、Ｅ７−Ｈｉｓ配列へのｃｌｙｔａ配列の連結（ＮｃｏＩ及びＡｆ
ｌIII は適合性制限部位である）であった（図９参照）。 融合タンパク質ｃｌｙｔａ−Ｅ６−Ｈｉｓのためのコーディング配列を図１０
に記載する。
【００９９】 ＡＲ５８株の形質転換 プラスミドｐＲＩＴ１４６３４をλｐＬプロモーターの熱感受性レプレッサー
を含む欠失λリソゲンを含む大腸菌ＡＲ５８（Mottら、1985, Proc.Natl.Acad.S
ci., 82: 88 ）に導入した。 細菌株の増殖及び誘導−ｃｌｙｔａ−Ｅ６−Ｈｉｓの発現 プラスミドｐＲＩＴ１４６３４で形質転換したＡＲ５８の細胞を、３０℃で５
０μｇ／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地１００ml中で増殖させた。増殖の
対数期の間、細菌を３９℃にシフトしてλレプレッサーを不活性化し、ｃｌｙｔ
ａ−Ｅ６−Ｈｉｓの合成に向かわせた。３９℃でのインキュベーションを４時間
、続けた。細菌をペレット化し、−２０℃で保存した。
【０１００】 ４．融合ｃｌｙｔａ−Ｅ６−Ｈｉｓのキャラクタリゼーション 凍結した細胞を解凍し、１０mlのＰＢＳ緩衝液に再度懸濁する。細胞を、２０
，０００psi でフレンチ圧力細胞プレスＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏで破壊する（３回
）。その抽出液を４℃で３０分、１６，０００ｇで遠心する。上述の抽出物の遠
心の後、上清及びペレットのアリコートをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動及びウエスタン・ブロッティングにより分析した。
【０１０１】 ペレット画分中にある約３３kDa の主要バンドをクーマシー染色したゲルによ
り可視化し、ウサギポリクローナル抗ｃｌｙｔａ抗体により、及びアクセスでき
るヒスチジンテールを検出するウシ腸アルカリホスファターゼに連結したＮｉ−
ＮＴＡコンジュゲート（Qiagen cat. n0 34510）によりウエスタン・ブロットで
同定した。発現のレベルはクーマシー染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
上に示される通り、全タンパク質の約３％を示す。
【０１０２】 実施例XI：融合ｃｌｙｔａ−Ｅ７−Ｈｉｓ（ＨＰＶ１６）を発現する大腸菌株
の作製 １．発現プラスミドの作製 １．ａ．出発材料 ａ）融合Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１６をコードするプラス
ミドｐＲＩＴ１４５０１（＝ＴＣＡ３０８） ｂ）ストレプトコッカス・ニューモニエのＬｙｔＡの１１７Ｃ末端コドンにつ
いてのコーディング配列を含む中間体ベクターであるプラスミドｐＲＩＴ１４６
６１（＝ＤＶＡ２）。
【０１０３】 １．ｂ．プラスミドｐＲＩＴ１４６２６（＝ＴＣＡ３３０）の作製：融合なｃ
ｌｙｔａ−Ｅ７−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１６を発現するプラスミド ａ）最初のステップは、プラスミドｐＲＩＴ１４５０１からの大きなＮｃｏＩ
−ＡｆｌII制限フラグメントの精製及びｐＲＩＴ１４６６１からの小さなＡｆｌ
II−ＡｆｌIII 制限フラグメントの精製であった。
【０１０４】 ｂ）第２のステップは、ｐＬプロモーターの制御下で融合タンパク質ｃｌｙｔ
ａ−Ｅ７−ＨｉｓをコードするプラスミドｐＲＩＴ１４６２６（＝ＴＣＡ３３０
）を作り出す、Ｅ７−Ｈｉｓ配列へのｃｌｙｔａ配列の連結（ＮｃｏＩ及びＡｆ
ｌIII は適合性制限部位である）であった（図１１参照）。 融合タンパク質ｃｌｙｔａ−Ｅ７−Ｈｉｓのためのコーディング配列を図１２
に記載する。
【０１０５】 ２．ＡＲ５８株の形質転換 プラスミドｐＲＩＴ１４６２６をλｐＬプロモーターの熱感受性レプレッサー
を含む欠失λリソゲンを含む大腸菌ＡＲ５８（Mottら、1985, Proc.Natl.Acad.S
ci., 82: 88 ）に導入した。 ３．細菌株の増殖及び誘導−ｃｌｙｔａ−Ｅ７−Ｈｉｓの発現 プラスミドｐＲＩＴ１４６２６で形質転換したＡＲ５８の細胞を、３０℃で５
０μｇ／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地１００ml中で増殖させた。増殖の
対数期の間、細菌を３９℃にシフトしてλレプレッサーを不活性化し、プロテイ
ンｃｌｙｔａ−Ｅ７−Ｈｉｓの合成に向かわせた。３９℃でのインキュベーショ
ンを４時間、続けた。細菌をペレット化し、−２０℃で保存した。
【０１０６】 ４．融合ｃｌｙｔａ−Ｅ７−Ｈｉｓのキャラクタリゼーション 凍結した細胞を解凍し、１０mlのＰＢＳ緩衝液に再度懸濁する。細胞を、２０
，０００psi でフレンチ圧力細胞プレスＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏで破壊する（３回
）。その抽出液を４℃で３０分、１６，０００ｇで遠心する。上述の抽出物の遠
心の後、上清及びペレットのアリコートをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動及びウエスタン・ブロッティングにより分析した。
【０１０７】 ペレット画分中にある約３５kDa の主要バンドをクーマシー染色したゲルによ
り可視化し、ウサギポリクローナル抗ｃｌｙｔａ抗体により、及びアクセスでき
るヒスチジンテールを検出するウシ腸アルカリホスファターゼに連結したＮｉ−
ＮＴＡコンジュゲート（Qiagen cat. n0 34510）によりウエスタン・ブロットで
同定した。発現のレベルはクーマシー染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
上に示される通り、全タンパク質の約５％を示す。
【０１０８】 実施例XII ：融合ｃｌｙｔａ−Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓ（ＨＰＶ１６）を発現する大
腸菌株の作製 １．発現プラスミドの作製 １．ａ．出発材料 ａ）融合Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１６をコードするプ
ラスミドｐＲＩＴ１４５１２（＝ＴＣＡ３１１） ｂ）ストレプトコッカス・ニューモニエのＬｙｔＡの１１７Ｃ末端コドンにつ
いてのコーディング配列を含む中間体ベクターであるプラスミドｐＲＩＴ１４６
６１（＝ＤＶＡ２）。
【０１０９】 １．ｂ．プラスミドｐＲＩＴ１４６２９（＝ＴＣＡ３３１）の作製：融合ｃｌ
ｙｔａ−Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１６を発現するプラスミド ａ）最初のステップは、プラスミドｐＲＩＴ１４５１２からの大きなＮｃｏＩ
−ＡｆｌII制限フラグメントの精製及びｐＲＩＴ１４６６１からの小さなＡｆｌ
II−ＡｆｌIII 制限フラグメントの精製であった。
【０１１０】 ｂ）第２のステップは、ｐＬプロモーターの制御下で融合タンパク質ｃｌｙｔ
ａ−Ｅ６Ｅ７−ＨｉｓをコードするプラスミドｐＲＩＴ１４６２９（＝ＴＣＡ３
３１）を作り出す、Ｅ７−Ｈｉｓ配列へのｃｌｙｔａ配列の連結（ＮｃｏＩ及び
ＡｆｌIII は適合性制限部位である）であった（図＃１３参照）。 融合タンパク質ｃｌｙｔａ−Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓのためのコーディング配列を図
１４に記載する。
【０１１１】 ２．ＡＲ５８株の形質転換 プラスミドｐＲＩＴ１４６２９をλｐＬプロモーターの熱感受性レプレッサー
を含む欠失λリソゲンを含む大腸菌ＡＲ５８（Mottら、1985, Proc.Natl.Acad.S
ci., 82: 88 ）に導入した。 ３．細菌株の増殖及び誘導−ｃｌｙｔａ−Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓの発現 プラスミドｐＲＩＴ１４６２９で形質転換したＡＲ５８の細胞を、３０℃で５
０μｇ／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地１００ml中で増殖させた。増殖の
対数期の間、細菌を３９℃にシフトしてλレプレッサーを不活性化し、プロテイ
ンｃｌｙｔａ−Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓの合成に向かわせた。３９℃でのインキュベー
ションを４時間、続けた。細菌をペレット化し、−２０℃で保存した。
【０１１２】 ４．融合ｃｌｙｔａ−Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓのキャラクタリゼーション 凍結した細胞を解凍し、１０mlのＰＢＳ緩衝液に再度懸濁する。細胞を、２０
，０００psi でフレンチ圧力細胞プレスＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏで破壊する（３回
）。その抽出液を４℃で３０分、１６，０００ｇで遠心する。 上述の抽出物の遠心の後、上清及びペレットのアリコートをＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動及びウエスタン・ブロッティングにより分析した。
【０１１３】 ペレット画分中にある約３５kDa の主要バンドをクーマシー染色したゲルによ
り可視化し、ウサギポリクローナル抗ｃｌｙｔａ抗体により、及びアクセスでき
るヒスチジンテールを検出するウシ腸アルカリホスファターゼに連結したＮｉ−
ＮＴＡコンジュゲート（Qiagen cat. n0 34510）によりウエスタン・ブロットで
同定した。発現のレベルは全タンパク質の約１％を示す。
【０１１４】 実施例XIII：Ｐｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７ Ｈｉｓ（ＨＰＶ１８）（大腸菌Ｂ１
０１１） トランスのチオレドキシンと共に発現されるタンパク質Ｄ１／３ Ｅ７ Ｈｉ
ｓ ＨＰＶ １）発現プラスミドの作製 １）ａ．融合タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１８を発現するプ
ラスミドであるプラスミドＴＣＡ３１６（＝ｐＲＩＴ１４５３２）の作製 出発材料 ａ）プラスミドｐＭＧ ＭＣＳ ｐｒｏｔ Ｄ１／３（＝ｐＲＩＴ１４５８９
）はインフルエンザからのＮＳ１コーディング領域のコドン４〜８１がヘモフィ
ルス−インフルエンゼ株７７２、バイオタイプ２（H Jansonら、1991, Infectio
n and Immunity, Jan. p119-125 ）の成熟プロテインＤの残基Ｓｅｒ２０→Ｔｈ
ｒ１２７に相当するコドンにより置換されている（ＷＯ９７／０１６４０として
公開されたＵＫ特許出願ｎ0 ９５１３２６１．９に記載される）ｐＭＧ８１の誘
導体である。Ｐｒｏｔ−Ｄ１／３の配列の後に多重クローニング部位（１１残基
）及びＣ末端ヒスチジンテールのためのコーディング領域（６Ｈｉｓ）がある（
図１５を参照）。このプラスミドを融合タンパク質Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓを発
現させるのに用いる。
【０１１５】 ｂ）原型ＨＰＶ１８のＨＰＶゲノムＥ６及びＥ７配列（Coleら、J.Mol.Biol.
(1987) 193, 599 〜608 ）を、（Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), R
eferenzzentrum fuer human pathogen Papillomaviruses-D69120-Heidelberg か
ら得た）ｐＢＲ３２２にクローン化したＨＰＶ１６全長ゲノムから増幅し、ｐＵ
Ｃ１９にサブクローン化してＴＣＡ３０２（＝ｐＲＩＴ１４４６７）を供した。
【０１１６】 ＴＣＡ３１６（＝ｐＲＩＴ１４５３２）の作製 Ｅ７のアミノ酸１−１０５に相当するヌクレオチド配列をｐＲＩＴ１４４６７
から増幅した。そのポリメラーゼ鎖反応の間、ＮｃｏＩ及びＳｐｅＩ制限部位を
Ｅ７配列の５′及び３′端に作り、プラスミドｐＭＧ ＭＣＳ Ｐｒｏｔ Ｄ１
／３の同じ部位への挿入を許容してプラスミドＴＣＡ３１６（＝ｐＲＩＴ１４５
３２）を供した。その挿入物を配列決定して改変対Ｅ７／ＨＰＶ１８原型配列を
、グルタミン酸によるグリシンの置換（Ｅ７中のａａ４３、融合タンパク質中の
位置１５６）を作り出すＥ７遺伝子（ヌクレオチド１２８Ｇ→Ａ）中で同定した
。その融合タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１６についての配列を
図１６に記載する。
【０１１７】 １）ｂ．プラスミドＴＣＡ３１３（＝ｐＲＩＴ１４５２３）の作製：チオレド
キシンを発現するプラスミド 出発材料 ａ）複製のＣｏｌＥ１又はＰ１５ａ起点を含むプラスミドと適合可能であるプ
ラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ４（Antoine R 及びC.Locht, Mol.Microbiol. 1992,
6, 1785 〜1799; M.E.Kovachら、Biotechniques 16 (5), 800 〜802 ） ｂ）ラムダファージのプロモーターｐＬを含むプラスミドｐＭＧ４２（ＷＯ９
３／０４１７５に記載） ｃ）チオレドキシンのためのコーディング配列及び次にＡｓｐＡ転写ターミネ
ーターを有するプラスミドｐＴＲＸ（Invitrogen, Kit Thiofusion K350-01） プラスミドＴＣＡ３１３（＝ｐＲＩＴ１４５２３）の作製 ｐＬプロモーターを有するｐＭＧ４２からのフラグメントＥｃｏＲＩ−Ｎｄｅ
Ｉフラグメント、及びチオレドキシンのコーディング配列の後にＡｓｐＡターミ
ネーターを有するｐＴＲＸからのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントを精製し
、プラスミドベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ４のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII 部位に
連結してプラスミドＴＣＡ３１３（＝ｐＲＩＴ１４５２３）を供した（図１７を
参照）。
【０１１８】 チオレドキシンについての配列を図１８に記載する。 ２）ＡＲ５８株の形質転換 ２）ａ．Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１８を発現する株Ｂ１０
１１を得ること プラスミドｐＲＩＴ１４５３２を、カナマイシンに耐性の形質転換体について
の選択により、λｐＬプロモーターの熱感受性レプレッサーを含む欠失λリソゲ
ンを含む大腸菌ＡＲ５８（Mottら、1985, Proc.Natl.Acad.Sci. 82: 88）に導入
した。
【０１１９】 ２）ｂ．Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１８及びチオレドキシン
を発現する株Ｂ１０１２の作製 プラスミドｐＲＩＴ１４５３２及びｐＲＩＴ１４５２３を、カナマイシン及び
アンピシリンに耐性である形質転換体のための二重選択により、λｐＬプロモー
ターの熱感受性レプレッサーを含む欠失λリソゲンを含む大腸菌ＡＲ５８（Mott
ら、1985, Proc.Natl.Acad.Sci. 82: 88）に導入した。
【０１２０】 ３）細菌株Ｂ１０１１の増殖及び誘導−トランスのチオレドキシンあり及びな
しのＰｒｏｔ−Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１８の発現 プラスミドｐＲＩＴ１４５３２で形質転換したＡＲ５８の細胞（Ｂ１０１１株
）並びにプラスミドｐＲＩＴ１４５３２及びｐＲＩＴ１４５２３で形質転換した
ＡＲ５８の細胞（Ｂ１０１２株）を、３０℃でＢ１０１１株について５０μｇ／
mlのカナマイシンを補給し、Ｂ１０１２株について５０μｇ／mlのカナマイシン
及び１００μｇ／mlのアンピシリンを補給したＬＢ培地１００ml中で増殖させた
。増殖の対数期の間、細菌を３９℃にシフトしてλレプレッサーを不活性化し、
プロテインＤ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１８の合成に向かわせた。３９℃で
のインキュベーションを４時間、続けた。細菌をペレット化し、−２０℃で保存
した。
【０１２１】 融合タンパク質Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１８のキャラクタリゼーショ
ン 抽出物の調製 凍結した細胞を解凍し、１０mlのＰＢＳ緩衝液に再度懸濁する。細菌を、２０
，０００psi でフレンチ圧力細胞プレスＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏで破壊する（３回
）。その抽出液を４℃で３０分、１６，０００ｇで遠心する。
【０１２２】 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル及びウエスタン・ブロットでの分析 上述の抽出物の遠心の後、上清及びペレットのアリコートをＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動及びウエスタン・ブロッティングにより分析した。 融合ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ（約３１kDa ）を、株Ｂ１０１１につ
いてペレット画分中で株Ｂ１０１２について上清中に局在化した（３０％）画分
でクーマシー染色したゲルにより可視化し、ウサギポリクローナル抗プロテイン
Ｄにより、及びアクセスできるヒスチジンテールを検出するウシ腸アルカリホス
ファターゼに連結したＮｉ−ＮＴＡコンジュゲート（Qiagen cat. n0 34510）に
よりウエスタン・ブロットで同定した。発現のレベルはクーマシー染色したＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル上に示される通り、全タンパク質の約１〜３％を示
す。
【０１２３】 株Ｂ１０１２の抽出のために、チオレドキシン（約１２kDa ）を上清中のクー
マシー染色したゲルにより視覚化し、モノクローナル抗チオレドキシン（Invitr
ogen R920-25）によりウエスタンブロットで同定した。 Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７−ｈｉｓ／ＨＰＶ１８の精製 組換えＨＰＶ１８−Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓを（上述の）大腸菌Ａ
Ｒ５８株内で発現させる。全てのステップを室温（ＲＴ≒２２℃）で行う。タン
パク質はＯＤ280nm をモニターすることにより追跡する。ステップの間、抗原陽
性画分は−２０℃に維持する。
【０１２４】 精製した抗原は−２０℃及び４℃で１週間、安定である（分解しない）が、３
７℃でのインキュベーション後により酸化しやすいようである。 ｄ）溶解度 タンパク質溶解度はpH＜７．４で溶解度が減少し、pH依存性である： ＰＢＳ pH７．４ ６８６μｇ／ml １００％ ＰＢＳ pH７．２ ５６０μｇ／ml ８１％ ＰＢＳ pH７．０ ４９８μｇ／ml ７２％ ＰＢＳ pH６．８ ３２７μｇ／ml ４８％ ｅ）ＨＰＶ１８ Ｐｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７タンパク質は２２７アミノ酸から
構成される。その理論分子量は２５．９kDa であり、５．８３の理論等電点であ
る。それは還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約３１．５kDa に動く。
【０１２５】 実施例XIV ：ＨＰＶ１８タンパク質Ｄ１／３ Ｅ７の精製 ａ）可溶化 細胞ペーストを２Ｍ ＮａＣｌ、２０mMホスフェート（ＮａＨ2 ＰＯ４／Ｋ2 ＨＰＯ４）pH７．６中６０ ＯＤ600 に懸濁し、その後、Ｒａｎｎｉｅ粉砕機に
２回通すことにより細胞を溶解させる。溶解した細胞を４℃でＪＡ１０ローター
内で９，０００rpm で３０分、ペレット化する。エンドトキシンレベルを減少さ
せるために、組換えタンパク質を含む細菌細胞ペレットを５mM ＥＤＴＡ、２Ｍ
ＮａＣｌ、ＰＢＳ pH７．４で１回；４Ｍ尿素、２０mMホスフェートpH７．４
中で１回、そして最後にＰＢＳ pH７．４中で１回洗って微量のＥＤＴＡを除去
する（各々の洗浄は、細胞懸濁のために用いる容量の２倍で行う）。ＨＰＶ１８
−Ｐｒｏｔ．Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ（トランスのチオレドキシンについてＴＩ
Ｔ）を６Ｍ塩化のアニジン、５０mM ＰＯ４ pH７．６により一晩、４℃で（細
胞懸濁液のために用いたのと同じ容量で）可溶化した。細胞デブリスを４℃でＪ
Ａ１０ローターで９，０００rpm で３０分、ペレット状にする。上清に０．５％
Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢを補給し、３０分、ＲＴでインキュベートする。
【０１２６】 ｂ）精製 １）ａ．固定化金属アフィニティークロマトグラフィー １２５mlのサンプルを、０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ、６Ｍ塩化グアニジ
ン、５０mM ＰＯ４ pH７．６で予め平衡化したＺｎ2+−キレート化セファロー
スＦＦカラム（XK 26/20, Pharmacia ；５０mlゲル／１２５ml可溶化）に充填す
る。カラムを塩化グアニジン６Ｍ、ＰＯ４ ５０mM pH７．６によりベースライ
ンに達するまで洗い、次に６Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０mM ＰＯ４ pH
７．６で洗う。抗原を２ml／分で６Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０mM ＰＯ
４ pH７．６中０．２５Ｍイミダゾールにより溶出する（図１Ｂ）。ＩＭＡＣで
溶出したサンプルを４℃でＰＢＳ pH７．４に対して透析する。
【０１２７】 １）ｂ．Affi-Prep （登録商標）Polymixin (Bio-Rad) エンドトキシンレベルを減少させるために、２８mg（３７ml）の抗原を、ＰＢ
Ｓ pH７．４で予め平衡化した２mlのAffi prep Polymyxin 樹脂でバッチモード
でインキュベートする。タンパク質回収は６０％と評価されエンドトキシン含有
量は６．５倍、減少する。
【０１２８】 １）ｃ．分析 還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した精製した抗原は、クーマシーブルー又は銀染
色の後、主要３０kDa バンド及び５５kDa の第２のバンドを示す。非還元ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにおいてＨＰＶ−１８−Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓは主に１
７５kDa 以上の分子量で主にスミアのように現れる。しかしながら、この酸化は
、５mMのβ−メルカプトエタノールの添加により回収することができる。このパ
ターンは、抗ＰｒｏｔＤにより又は抗Ｈｉｓウエスタン・ブロット分析により確
認する。
【０１２９】 ｃ）安定性 精製した抗原は−２０℃及び４℃で一週間、安定である（分解なし）が、３７
℃でのインキュベーション後より酸化しやすいようである。 ｄ）溶解度 タンパク質溶解度はpH依存性（以下を参照）でpH７．４で溶解度が減少する。
【０１３０】 ＰＢＳ pH７．４ ６８６μｇ／ml １００％ ＰＢＳ pH７．２ ５６０μｇ／ml ８１％ ＰＢＳ pH７．０ ４９８μｇ／ml ７２％ ＰＢＳ pH６．８ ３２７μｇ／ml ４８％ ＨＰＶ１８−Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓタンパク質は２２７アミノ酸
から構成される。その理論分子量は２５．９kDa である。それは還元ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで約３１．５kDa に移動する。理論等電点は５．８３である。
【０１３１】 実施例XV：融合Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７変異（ｃｙｓ２７→ｇｌｙ，ｇｌｕ
２９→ｇｌｎ）型ＨＰＶ１８の作製 １）発現プラスミドの作製 出発材料： ａ）融合Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７−ＨｉｓをコードするプラスミドｐＲＩＴ
１４５３２（＝ＴＣＡ３１６） ｂ）プラスミドＬＩＴＭＵＳ２８（New England Biolabs cat n0 306-28 ）、
クローニングベクターｐＵＣ由来 ｃ）プラスミドｐＭＧ ＭＣＳ Ｐｒｏｔ Ｄ１／３（ｐＲＩＴ１４５８９）
、ヘモフィルス−インフルエンゼ株７７２、バイオタイプ２（H.Jansonら、1991
, Intection and Immunity, Jan. p.119-125）の成熟プロテインＤの残基Ｓｅｒ
２０→Ｔｈｒ１２７に対応するコドンによりインフルエンザからのＮＳ１コーデ
ィング領域のコドン４〜８１が置換されている（上述の）ｐＭＧ８１の誘導体。
Ｐｒｏｔ−Ｄ１／３の配列の後に、多重クローニング部位（１１残基）及びＣ末
端ヒスチジンテール（６Ｈｉｓ）のためのコーディング領域がある。
【０１３２】 ｐＲＩＴ１４８３１（＝ＴＣＡ３５５）の作製：Ｈｉｓテールを有する融合タ
ンパク質−Ｄ１／３−Ｅ７変異（ｃｙｓ２７→ｇｌｙ，ｇｌｕ２９→ｇｌｎ）を
発現するプラスミド Ｈｉｓテールが伸長したＨＰＶ１８からのＥ７遺伝子のコーディング配列を有
するｐＲＩＴ１４５３２（＝ＴＣＡ３１６）からのＮｃｏＩ−ＸｂａＩフラグメ
ントを変異のために有用な中間体ベクターＬｉｔｍｕｓ２８にサブクローン化し
てｐＲＩＴ１４９１０（＝ＴＣＡ３４８）を供する。Ｅ７／ＨＰＶ１６変異誘発
との類似性により、網膜芽細胞遺伝子の癌抑制遺伝子産物（ｐＲ１３）への結合
を妨害するために二重変異ｃｙｓ２７→ｇｌｙ及びｇｌｕ２９→ｇｌｎを選択し
た。
【０１３３】 Ｅ７遺伝子中の変異の導入をキット“Quick Change Site directed Mutagenes
is (Stratagene cut n0 200518）で実現した。ｐＲＩＴ１４５３２はＨＰＶ１８
の原型配列におけるグリシンのかわりにＥ７の位置４３におけるグルタミン酸の
存在を示したので、位置４３にグリシンを導入するために変異誘発の第２サイク
ルを行った。我々は、プラスミドｐＲＩＴ１４８２９（＝ＴＣＡ３５３）を得た
。配列決定により完全なＥ７遺伝子の変異及び組込みの存在を確認した後、その
変異したＥ７の遺伝子をベクターｐＲＩＴ１４５８９（＝ｐＭＧ ＭＣＳ Ｐｒ
ｏｔ Ｄ１／３）に導入してプラスミドｐＲＩＴ１４８３１（＝ＴＣＡ３５５）
を供した（図１７を参照）。
【０１３４】 融合タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ７変異（ｃｙｓ２７→ｇｌｙ，ｇｌｕ２９→ｇ
ｌｎ）−Ｈｉｓについての配列は図１８に記載される。 ２）Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７変異（ｃｙｓ２７→ｇｌｙ，ｇｌｕ２９→ｇｌ
ｎ）−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１８を発現する株Ｂ１０９８の作製 プラスミドｐＲＩＴ１４８３１を、λｐＬプロモーターの熱感受性レプレッサ
ーを含む欠失λリソゲンを含む大腸菌ＡＲ５８（Mottら、1985, Proc Natl.Acad
.Sci. 82: 88）に導入し、カナマイシンに耐性である形質転換体についての選択
により株Ｂ１０９８を供した。
【０１３５】 ３）細菌性Ｂ１０９８の増殖及び誘導−Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７変異（ｃｙ
ｓ２７→ｇｌｙ，ｇｌｕ２９→ｇｌｎ）−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１８ プラスミドｐＲＩＴ１４８３１で形質転換したＡＲ５８の細胞（Ｂ１０９８株
）を５０μｇ／mMのカナマイシンを補給したＬＢ培地１００ml中で３０℃で増殖
させた。増殖の対数期の間、細菌を３９℃にシフトしてλレプレッサーを不活性
化し、Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７変異−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１８の合成に向かわせた
。３９℃でのインキュベーションを４時間続けた。細菌をペレット状にし、−２
０℃で保存した。
【０１３６】 ４）融合Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７変異（ｃｙｓ２４→ｇｌｙ，ｇｌｕ２６→
ｇｌｎ）−Ｈｉｓ型ＨＰＶ１６のキャラクタリゼーション 凍結した細胞を解凍し、１０mlのＰＢＳ緩衝液に再度懸濁した。細胞を２０，
０００psi でフレンチ圧力細胞プレスＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏで破壊する（３回）
。その抽出物を１６，０００ｇで３０分、４℃で遠心する。
【０１３７】 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル及びウエスタンブロットでの分析 上述の抽出物の遠心の後、上清及びペレットのアリコートをＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル及びウエスタン・ブロッティングにより分析した。そのペレット
画分にある約３１kDa の主要バンドをクーマシー染色したゲルにより可視化し、
ウサギポリクローナル２２Ｊ７０抗プロテインＤにより及びアクセスできるヒス
チジンテールを検出するモノクローナルＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ（Qiagen cat n0 34
660 ）によりウエスタン・ブロットで同定した。発現のレベルは全タンパク質の
約３〜５％を示す。
【０１３８】 実施例XVI ：融合タンパク質Ｄ１／３−Ｅ６−ｈｉｓ／ＨＰＶ１８の作製 １．発現プラスミドの作製 ａ）プラスミドｐＭＧ ＭＣＳ ｐｒｏｔ Ｄ１／３（＝ｐＲＩＴ１４５８９
）はインフルエンザからのＮＳ１コーディング領域のコドン４〜８１がヘモフィ
ルス−インフルエンゼ株７７２、バイオタイプ２（H Jansonら、1991, Infectio
n and Immunity, Jan. p119-125 ）の成熟プロテインＤの残基Ｓｅｒ２０→Ｔｈ
ｒ１２７に相当するコドンにより置換されている（上述の）ｐＭＧ８１の誘導体
である。Ｐｒｏｔ−Ｄ１／３の配列の後に多重クローニング部位（１１残基）及
びＣ末端ヒスチジンテールのためのコーディング領域（６Ｈｉｓ）がある。この
プラスミドを融合タンパク質Ｄ１／３−Ｅ６−Ｈｉｓを発現させるのに用いる。
【０１３９】 ＨＰＶゲノムＥ６及びＥ７配列タイプＨＰＶ１６（Coleら、J.Mol.Biol. 1987
, 193, p.599〜608 ）を、（Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Refer
enzzentrum fuer human pathogen Papillomaviruses-D69120-Heidelberg から得
た）ｐＢＲ３２２にクローン化したＨＰＶ１８全長ゲノムから増幅し、ｐＵＣ１
９にサブクローン化してＴＣＡ３０２（＝ｐＲＩＴ１４４６７）を供した。
【０１４０】 プラスミドＴＣＡ３１４（＝ｐＲＩＴ１４５２６）の作製：融合タンパク質−
Ｄ１／３−Ｅ６−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１８を発現するプラスミド Ｅ６のアミノ酸１−１５８に相当するヌクレオチド配列をｐＲＩＴ１４４６７
から増幅する。そのポリメラーゼ鎖反応の間、ＮｃｏＩ及びＳｐｅＩ制限部位を
Ｅ６配列の５′及び３′端に作り、プラスミドｐＭＧ ＭＣＳ Ｐｒｏｔ Ｄ１
／３の同じ部位への挿入を許容してプラスミドＴＣＡ３１４（＝ｐＲＩＴ１４５
２６）を供した（図２１を参照）。その挿入物を配列決定してポリメラーゼ鎖反
応の間に改変が形成されていないことを確認した。その融合タンパク質−Ｄ１／
３−Ｅ６−Ｈｉｓ（ＨＰＶ１６）についての配列を図２２に記載する。
【０１４１】 ＡＲ５８株の形質転換 プラスミドｐＲＩＴ１４５２６をλｐＬプロモーターの熱感受性レプレッサー
を含む欠失λリソゲンを含む大腸菌ＡＲ５８（Mottら、1985, Proc.Natl.Acad.S
ci., 82: 88 ）に導入した。 ３．細菌株の増殖及び誘導−Ｐｒｏｔ−Ｄ１／３−Ｅ６−Ｈｉｓの発現 プラスミドｐＲＩＴ１４５２６で形質転換したＡＲ５８の細胞を、３０℃で５
０μｇ／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地１００ml中で増殖させた。増殖の
対数期の間、細菌を３９℃にシフトしてλレプレッサーを不活性化し、プロテイ
ンＤ１／３−Ｅ６−Ｈｉｓの合成に向かわせた。３９℃でのインキュベーション
を４時間、続けた。細菌をペレット化し、−２０℃で保存した。
【０１４２】 ４．融合タンパク質Ｄ１／３−Ｅ６−Ｈｉｓのキャラクタリゼーション 凍結した細胞を解凍し、１０mlのＰＢＳ緩衝液に再度懸濁する。細胞を、２０
，０００psi でフレンチ圧力細胞プレスＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏで破壊する（３回
）。その抽出液を４℃で３０分、１６，０００ｇで遠心する。上述の抽出物の遠
心の後、上清及びペレットのアリコートをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動及びウエスタン・ブロッティングにより分析した。ペレット画分中にある約
３２kDa の主要バンドをクーマシー染色したゲルにより可視化し、ウサギポリク
ローナル抗プロテインＤにより、及びアクセスできるヒスチジンテールを検出す
るウシ腸アルカリホスファターゼに連結したＮｉ−ＮＴＡコンジュゲート（Qiag
en cat. n0 34510）によりウエスタン・ブロットで同定した。発現のレベルは全
タンパク質の約３〜５％を示す。
【０１４３】 実施例XVII：融合タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓ（ＨＰＶ１８）を
発現する大腸菌株の作製 １．発現プラスミドの作製 ａ）プラスミドｐＭＧ ＭＣＳ ｐｒｏｔ Ｄ１／３（＝ｐＲＩＴ１４５８９
）はインフルエンザからのＮＳ１コーディング領域のコドン４〜８１がヘモフィ
ルス−インフルエンゼ株７７２、バイオタイプ２（H Jansonら、1991, Infectio
n and Immunity, Jan. p119-125 ）の成熟プロテインＤの残基Ｓｅｒ２０→Ｔｈ
ｒ１２７に相当するコドンにより置換されている（上述の）ｐＭＧ８１の誘導体
である。Ｐｒｏｔ−Ｄ１／３の配列の後に多重クローニング部位（１１残基）及
びＣ末端ヒスチジンテールのためのコーディング領域（６Ｈｉｓ）がある。この
プラスミドを融合タンパク質Ｄ１／３−Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓを発現させるために用
いる。
【０１４４】 ｂ）ＨＰＶゲノムＥ６及びＥ７配列タイプＨＰＶ１８（Coleら、J.Mol.Biol.
1987, 193, p.599〜608 ）を、（Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), R
eferenzzentrum fuer human pathogen Papillomaviruses-D69120-Heidelberg か
ら得た）ｐＢＲ３２２にクローン化したＨＰＶ１８全長ゲノムから増幅し、ｐＵ
Ｃ１９にサブクローン化してＴＣＡ３０２（＝ｐＲＩＴ１４４６７）を供した。
【０１４５】 ｃ）ＴＣＡ３０２（＝ｐＲＩＴ１４４６７）中のＥ６及びＥ７のためのコーデ
ィング配列を、Ｅ６及びＥ７遺伝子の間の１１ヌクレオチドの欠失を導入し、Ｅ
６の終止コドンを除去し、そしてプラスミドＴＣＡ３２０（＝ｐＲＩＴ１４６１
８）中に融合したＥ６及びＥ７コーディング配列を作る（ＨｇａＩ及びＮｓｉＩ
部位の間に挿入した）合成オリゴヌクレオチドアダプターで改変した。図２３を
参照のこと。
【０１４６】 ＴＣＡ３２８（＝ｐＲＩＴ１４５６７）の作製：融合タンパク質−Ｄ１／３−
Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１８を発現するプラスミド 融合Ｅ６Ｅ７タンパク質のアミノ酸１−２６３に相当するヌクレオチド配列を
ｐＲＩＴ１４６１８から増幅する。そのポリメラーゼ鎖反応の間、ＮｃｏＩ及び
ＳｐｅＩ制限部位をＥ６Ｅ７融合配列の５′及び３′端に作り、プラスミドｐＭ
Ｇ ＭＣＳ Ｐｒｏｔ Ｄ１／３の同じ部位への挿入を許容してプラスミドＴＣ
Ａ３２８（＝ｐＲＩＴ１４５６７）を供した（図２４を参照）。その挿入物を配
列決定してポリメラーゼ鎖反応の間に改変が形成されていないことを確認した。
その融合タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓについての配列を図２５に記
載する。
【０１４７】 ２．ＡＲ５８株の形質転換 プラスミドｐＲＩＴ１４５６７をλｐＬプロモーターの熱感受性レプレッサー
を含む欠失λリソゲンを含む大腸菌ＡＲ５８（Mottら、1985, Proc.Natl.Acad.S
ci., 82: 88 ）に導入した。 ３．細菌株の増殖及び誘導−Ｐｒｏｔ−Ｄ１／３−Ｅ６／Ｅ７−Ｈｉｓの発現
プラスミドｐＲＩＴ１４５１２で形質転換したＡＲ５８の細胞を、３０℃で５
０μｇ／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地１００ml中で増殖させた。増殖の
対数期の間、細菌を３９℃にシフトしてλレプレッサーを不活性化し、プロテイ
ンＤ１／３−Ｅ６Ｅ７−Ｈｉｓの合成に向かわせた。３９℃でのインキュベーシ
ョンを４時間、続けた。細菌をペレット化し、−２０℃で保存した。
【０１４８】 ４．融合タンパク質Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ（ＨＰＶ１６）のキャラクタリゼ
ーション 凍結した細胞を解凍し、１０mlのＰＢＳ緩衝液に再度懸濁する。細胞を、２０
，０００psi でフレンチ圧力細胞プレスＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏで破壊する（３回
）。その抽出液を４℃で３０分、１６，０００ｇで遠心する。
【０１４９】 上述の抽出物の遠心の後、上清及びペレットのアリコートをＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動及びウエスタン・ブロッティングにより分析した。ペレ
ット画分中にある約４５kDa の主要バンドをクーマシー染色したゲルにより可視
化し、ウサギポリクローナル抗プロテインＤにより、及びアクセスできるヒスチ
ジンテールを検出するウシ腸アルカリホスファターゼに連結したＮｉ−ＮＴＡコ
ンジュゲート（Qiagen cat. n0 34510）によりウエスタン・ブロットで同定した
。発現のレベルは全タンパク質の約１％を示す。
【０１５０】 実施例XVIII ：ワクチン製剤 ワクチンを、株ＡＲ５８からの大腸菌中で発現された先の例からのタンパク質
、並びにアジュバントとして、任意に油／水エマルション中、及び任意にコレス
テロールと調剤した、３ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰ
Ｌ）及び水酸化アルミニウム又は３Ｄ−ＭＰＬ及び／又はＱＳ２１の混合物を含
む製剤で調剤する。
【０１５１】 ３Ｄ−ＭＰＬはグラム陽性細菌サルモネラ・ミネソタのリポポリサッカライド
（ＬＰＳ）の化学的に無毒化した形態である。Smith Kline Beecham Biological
s で行った実験は、種々のビヒクルと組み合わせた３Ｄ−ＭＰＬが体液性及びＴ
Ｈ１型の細胞免疫性の両方を増強する。 ＱＳ２１は、強力なアジュバント活性を有するキラジャ・サポナリア・モリナ
（Quillaja Saponaria Molina ）樹木の樹皮の粗抽出物から精製された１つのサ
ポニンであり：それは抗原特異的リンパ球増殖及びいくつかの抗原に対するＣＴ
Ｌの両方を活性化する。
【０１５２】 ３Ｄ−ＭＰＬ及びアルムを含む本発明の抗原を含むワクチンは、ＷＯ９３／１
９７８０又は９２／１６２３１に記載されるものと同様に調製することができる
。 Smith Kline Beecham Biologicals で行った実験は、体液性及びＴＨ１型細胞
免疫応答の両方の誘導における３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１の組合せの明らかな共
同効果を証明した。このような抗原を含むワクチンはＵＳ５７５０１１０に記載
される。
【０１５３】 油／水エマルションは２つの油（トコフェロール及びスクアレン）、及び乳化
剤としてＴｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳから構成される。エマルションは、５％ス
クアレン、５％トコフェロール、０．４％ Ｔｗｅｅｎ８０を含み、１８０nmの
平均粒径を有し、ＳＢ６２として知られている（ＷＯ９５／１７２２０を参照の
こと）。
【０１５４】 Smith Kline Beecham Biologicals で行った実験は、このＯ／Ｗエマルション
のＭＰＬ／ＱＳ２１への適用がそれらの免疫刺激特性を更に増加させることを証
明した。 エマルションＳＢ６２（２倍濃縮物）の調製 Ｔｗｅｅｎ８０をリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に溶かしてＰＢＳ中２％溶液
を供する。１００mlの２倍濃縮エマルションを供するために、５ｇのＤＬαトコ
フェロール及び５mlのスクアレンをボルテキシングして全体を混合する。９０ml
のＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液を加え、全体を混合する。次に生じたエマルションを
シリンジに通し、最後にＭ１１０Ｓマイクロフルーディクス機を用いることによ
り微小流体化する。生じた油滴は約１８０nmの大きさを有する。
【０１５５】 Ｐｒｏｔ．Ｄ１／３ Ｅ７ ＱＳ２１／３Ｄ ＭＰＬ水中油製剤の調製 Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７（５μｇ）を１０倍濃度のＰＢＳ pH６．８及びＨ 2 Ｏに希釈し、次にＳＢ６２，３Ｄ−ＭＰＬ（５μｇ）、ＱＳ２１（５μｇ）及
び防腐剤として５０μｇ／mlのチオメルサルを５分間隔で連続的に加える。エマ
ルション容量は全容量の５０％（１００μｌの投与量のために５０μｌ）に等し
い。全てのインキュベーションは撹拌しながら室温で行った。抗原を含まないア
ジュバントをタンパク質をＰＢＳで置きかえることにより調製した。
【０１５６】 ＰＲＯＴ Ｄ Ｅ７ワクチン抗原での腫瘍退化実験（ＨＰＶ１６）：融合タン
パク質Ｐｒｏｔ Ｄ Ｅ７ プロテインＤはグラム陰性細菌ヘモフィルス−インフルエンゼの表面に露出し
たリポプロテインである。融合パートナーとしてのプロテインＤの１０９の最初
の残基の封入物を組み込み、バイスタンダーヘルプ特性を有するワクチン抗原を
供する。その抗原を前掲の通りＱＳ２１ ３Ｄ−ＭＰＬ及びＳＢ６２と共に調剤
した。
【０１５７】 実験XIX ：生体内腫瘍退化実験 腫瘍細胞系ＴＣ１： Ｃ５７ＢＬ．６マウスからの一次肺上皮細胞をＨＰＶ１６Ｅ６及びＥ７により
不死化し、次に活性化ｒａｓオンコジーンで形質転換してＥ６及びＥ７を発現す
る腫瘍細胞系を作った（Lin KYら、1996）。Ｅ７発現は、マウス抗ＨＰＶ１６
Ｅ７ Ｍａｂ（Triton Corp. Alameda, CA）を用いて固定化浸透化ＴＣ１のＦＡ
ＣＳ分析により確認されている。
【０１５８】 腫瘍成長： 試験管内増殖で増殖するＴＣ１細胞をトリプシン処理し、無血清培地で２回、
洗い、マウスの右側腹部にＳ．Ｃ．注入した。確立された腫瘍の治療を評価する
ために、ＴＣ１細胞を３×１０ｅ４細胞／マウスの投与量で注入した。腫瘍注入
後１及び２週に、ＰＢＳ中もしくは３Ｄ−ＭＰＬ，ＱＳ２１及びＳＢ６２中の足
内のｐｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７ Ｈｉｓ １００μｌ（５０μｌ／足）中５μｇ
で又はＰＢＳもしくはアジュバントのみでワクチン接種した。各々のグループに
５のＣ５７ＢＬ／６マウス（Iffa Credo）を用いた。マウスを腫瘍成長について
週に２回、モニターした。平均腫瘍量／グループを図２６に示す。ＰＢＳ中ｐｒ
ｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７ Ｈｉｓで又はＰＢＳもしくはアジュバントのみでワクチ
ン接種したマウスは次第に成長する腫瘍（０〜１の無腫瘍動物／グループ）を発
達させた。反対に、アジュバント中ｐｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７ Ｈｉｓをワクチ
ン接種した５のマウスのうち４つが腫瘍を発展させず、１匹の動物が極めて小さ
くかつ安定な腫瘍を４０日目に発達させた。この結果は、アジュバント中に調剤
したＨＰＶ１６からのタンパク質ｐｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７ Ｈｉｓがこの抗原
を発現する小さな確立された腫瘍の退化を誘導することができることを示す。
【０１５９】 免疫学的読出し 増殖アッセイ： 試験管内アッセイのために、６９日目に、ワクチン接種したマウスからの脾臓
又は膝窩リンパ節を破壊することにより調製した。 ２×１０ｅ５の細胞のアリコートを、ラテックスマイクロビーズ（Sigma ）に
減少濃度（１０，１，０．１μｇ／ml）のｐｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７ Ｈｉｓを
コートし、又はコートしない９６ウェルプレート中で３回重複して入れて試験管
内で細胞を再評価した（７２Ｈｒｓ）。Ｔ細胞増殖を３Ｈチミジン組込みにより
測定した。
【０１６０】 図２７及び２８は、ＰＢＳ，３Ｄ−ＭＰＬ，ＱＳ２１ ＳＢ６２，Ｐｒｏｔ
Ｄ１／３ Ｅ７ Ｈｉｓ及びＰｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７ Ｈｉｓ＋３Ｄ−ＭＰＬ
，ＱＳ２１，ＳＢ６２このアジュバントにより生体内で用意した脾細胞及びリン
パ節細胞の増殖を刺激するｐｒｏｔ Ｄ Ｅ７の能力を比較し、脾臓内の高い増
殖性応答が、他のグループと比較してアジュバント中ｐｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７
Ｈｉｓで免疫化したマウスでのみ検出されたことを示す。
【０１６１】 抗体応答 個体の血清をとり、同時に器官をとって、間接的ＥＬＩＳＡにかけた。 ５μｇ／mlの精製したＥ７タンパク質をコート化抗原として用いた。３７℃で
１時間のＰＢＳ＋１％新生ウシ血清中での飽和の後、その血清を飽和緩衝液中で
（１／１００で始めて）連続的に希釈し、４℃でＯ／Ｎで、又は３７℃で９０分
、インキュベートした。ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０中で洗った後、０．１％のビオ
チニル化ヤギ抗マウスＩｇ（１／１０００）又はヤギ抗マウスＩｇサブクラス（
全部でＩｇＧ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ）抗血清（１／５０００）を
第２抗体として用い、３７℃で９０分のインキュベーションの後、ペルオキシダ
ーゼに結合させたストレプトアビジンを加え、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン
／ペルオキシド）を基質として用い、１０分後、その反応をＨ2 ＳＯ4 ０．５Ｍ
で停止させ、Ｏ．Ｄ．４５０を測定した。
【０１６２】 異なるグループのマウスにおけるワクチン接種により誘発させたサブクラス特
異的抗Ｅ７タイターを、血清の相対的平均中点希釈の比較として図２９に示す。 これらの結果は、Ｐｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７ ＨＰＶ１６単独の２回の注入に
より弱い応答が誘発されることを示す。 アジュバントＳＢ６２，ＱＳ２１＋３Ｄ−ＭＰＬの存在下でＰｒｏｔ Ｄ１／
３ Ｅ７を注入した場合、かなり多い抗Ｅ７抗体が作られる。
【０１６３】 ＩｇＡもＩｇＭも、アジュバントＳＢ６２，ＱＳ２１＋３Ｄ−ＭＰＬ中のＰｒ
ｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７を与えたマウスの血清でさえ、いずれの血清サンプルも検
出されなかった。対照的に、全ＩｇＧレベルはＰｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７単独を
与えたマウスのワクチン接種により少し増加し、アジュバントＳＢ６２，ＱＳ２
１＋３Ｄ−ＭＰＬのタンパク質への添加により大きく増加した。異なるＩｇＧサ
ブクラスの濃度の分析は、抗原又はアジュバントのみを受容させたマウスの血清
中で観察された濃度と比べて、アジュバント抗原を受容したマウスの血清におい
て、分析したＩｇＧサブクラスの全ての型（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２
ｂ）の濃度が増加するにつれ混合された抗体応答が誘導されていることを示す。
見い出された主要な異型は全てのＩｇＧの８０％超を示すＩｇＧ２ｂであり、こ
の異型は一般に、ＴＨ１型免疫応答の誘導に関連しているといわれる。
【０１６４】 実施例XX：生体内腫瘍保護実験 マウスを、ＰＢＳ、実施例１のアジュバント、５μｇのｐｒｏｔ Ｄ１／３
Ｅ７ Ｈｉｓ又は１００μｌの容量中フット・パット内の実施例１のアジュバン
ト中の５μｇのｐｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７ Ｈｉｓのいずれかで１４日間隔で２
回、免疫化した。
【０１６５】 腫瘍成長： 最も新しいワクチン接種後４週間に、マウスを側腹部において２×１０ｅ５
ＴＣ１細胞／マウスＳ．Ｃ．で攻撃した。試験管内培養で増殖中のＴＣ１細胞を
トリプシン処理し、無血清培地で２回、洗い、注入した。各々のグループに用い
た５匹のマウスを腫瘍成長について、１週間に２回、モニターした。
【０１６６】 図３０は、ＳＢ６２，ＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬアジュバント中のＥ７タンパク
質でのワクチン接種が、腫瘍の成長を進展させた、アジュバントなしのＥ７タン
パク質又はアジュバントのみを受容させた他の全てのグループにおける腫瘍の発
達に対してマウスを保護する（５匹のうち１匹だけの動物が極めて小さくかつ安
定な腫瘍を有する）ことを示す。
【０１６７】 免疫学的読出し 最も新しいワクチン接種後３週に、腫瘍攻撃前に、各々のグループ内の５のマ
ウスを免疫学的読出しのために殺した。 増殖アッセイ 試験管内アッセイのために、リンパ球を脾臓から及び膝高排出性リンパ節から
上述の通り調製した。２×１０ｅ５のアリコートを、ラテックスマイクロビーズ
（Sigma ）に減少濃度（１０，１，０．１μｇ／ml）のｐｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ
７ Ｈｉｓをコートした又はコートしない９６ウェルプレート内に３回重複で入
れた。
【０１６８】 図３１及び３２は、各々、脾細胞又は膝高リンパ節細胞の両方で、治療設定に
おいて観察されるように、ＳＢ６２，ＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬアジュバント中の
Ｅ７タンパク質を与えたマウスについてより優れたリンパ球増殖活性が得られた
ことを示す。 抗体応答 図３３は、治療設定と同様に、３Ｄ−ＭＰＬ，ＱＳ２１Ｏ／Ｗアジュバント中
に調剤したＰｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７タンパク質でワクチン接種したマウスの血
清中でより優れた抗体応答が観察されたことを示す。この場合も、テストした全
てのＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ，ＩｇＧ１）において混合され
た抗体応答が誘発され、ＩｇＧ２ｂが全ＩｇＧの７５％を示す主要な異型である
ことが見い出された。
【０１６９】 実施例XXI ：Ｐｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７（ＨＰＶ１８）でのワクチン接種実験
マウスを、ＰＢＳ又はＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及びＳＢ６２、ＷＯ９６／３３
７３９に記載されるＤＱ ＭＰＬ又はＷＯ９８／１５８２７に記載されるＤＱア
ルムＭＰＬ中の１００μｌのｐｒｏｔ Ｄ１／３ １８ Ｅ７ Ｈｉｓイントラ
・フット・パッド（５０μｌ／フット・パッド）中５μｇで２週間間隔で２回、
ワクチン接種した。８匹の６〜８週齢Ｂａｌｂ／ｃマウス（Iffa Credo）を各々
のグループに用いた。１４日後に、免疫学的読出しのために脾臓及びリンパ節を
とり、血清学のために血液サンプリングを行った。
【０１７０】 ○免疫学的読出し： 増殖アッセイ： 試験管内アッセイのために、ワクチン接種したマウスからの脾臓又は膝窩リン
パ節を破壊することによりリンパ球を調製した。 ２×１０ｅ５細胞のアリコートを、減少濃度（１０，１，０．１，０．０１μ
ｇ／ml）のｐｒｏｔ Ｄ１／３ １８ Ｅ７ Ｈｉｓで９６ウェルプレート内に
３回重複して入れてその細胞を試験管内で再刺激した（７２時間）。Ｔ細胞増殖
を３Ｈチミジン組込みにより測定した。結果を、刺激インデックス（ｃｐｍサン
プル／ｃｐｍベースライン）として表す。
【０１７１】 図３４及び３５は、Ｐｒｏｔ Ｄ１／３ １８ Ｅ７ Ｈｉｓ又はＰｒｏｔ
Ｄ１／３ １８ Ｅ７ Ｈｉｓ＋アジュバントのいずれかにより生体内でプライ
ムした脾細胞又はリンパ節細胞の増殖を刺激するｐｒｏｔ Ｄ１／３ １８ Ｅ
７の能力を比較し、タンパク質のみを与えたマウスにおいて基底リンパ球増殖が
見られ、対照的にアジュバント中のｐｒｏｔ Ｄ１／３ １８ Ｅ７で免疫化し
たマウスにおいて脾臓において高い増殖応答が、リンパ節において極めて高い応
答が検出された。
【０１７２】 サイトカイン生産 培地又はＰｒｏｔ Ｄ１／３ １８ Ｅ７（１又は３μｇ／ml）を伴う脾臓又
はリンパ節の試験管内再刺激の９６時間の期間の後、その培養上清中に生産され
たサイトカイン（ＩＬ−５及びＩＦＮｇ）を、記載される通りＥＬＩＳＡにより
測定した： ＩＦＮｇ（Genzyme ） ＩＦＮγの定量をGenzyme からの試薬を用いてＥＬＩＳＡにより行った。サン
プル及び抗体溶液をウェル当り５０μｌで用いた。９６ウェルマイクロタイター
プレート（Maxisorb Imnuno-plate, Nunc, Denmark）を一晩、４℃で、カーボネ
ート緩衝液pH９．５中１．５μｇ／mlに希釈したハムスター抗マウスＩＦＮγ
５０μｌで４℃で一晩、コートした。次に、プレートを１時間、３７℃で、１％
ウシ血清アルブミン及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０（飽和溶液）を含むＰＢＳ
１００μｌとインキュベートした。飽和緩衝液中の試験管内刺激（１／２で開始
）からの上清の２倍希釈物を抗ＩＦＮγ−コート化プレートに加え、１時間３０
分、３７℃でインキュベートした。そのプレートをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．１
％（洗浄液）で４回、洗い、最終濃度０．５μｇ／mlに飽和緩衝液で希釈したビ
オチンコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩＦＮγを各々のウェルに加え、３７℃で
１時間、インキュベートした。洗浄ステップの後、飽和緩衝液に１／１００００
で希釈したＡＭＤＥＸコンジュゲート（Amersham）を３７℃で３０分、加えた。
プレートを上述の通り洗い、１５分、５０μｌのＴＭＢ（Biorad）とインキュベ
ートした。その反応をＨ2 ＳＯ4 ０．４Ｎで停止させ、４５０nmを読んだ。Ｓｏ
ｆｔｍａｘＰｒｏ（４パラメータ等式）により標準曲線（マウスＩＦＮγ標準）
を用いて濃度を計算しpg／mlで表した。
【０１７３】 ＩＬ５（Pharmingen） ＩＬ５の定量を、Pharmingenからの試薬を用いてＥＬＩＳＡにより行った。サ
ンプル及び抗体溶液をウェル当り５０μｌで用いた。９６ウェルマイクロタイタ
ープレート（Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark）を一晩、４℃で、カーボ
ネート緩衝液pH９．５に１μｇ／mlに希釈した５０μｌのラット抗マウスＩＬ５
でコートした。次にプレートを１時間、３７℃で、１％ウシ血清アルブミン及び
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む１００μｌ ＰＢＳ（飽和緩衝液）とインキュ
ベートした。飽和緩衝液中の試験管内刺激（１／２で開始）からの上清の２倍希
釈物を抗ＩＦＮγ−コート化プレートに加え、１時間３０分、３７℃でインキュ
ベートした。そのプレートをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ０．１％（洗浄液）で４回、
洗い、最終濃度１μｇ／mlで飽和緩衝液で希釈したビオチンコンジュゲート化ラ
ット抗マウスＩＬ５を各々のウェルに加え、３７℃で１時間、インキュベートし
た。洗浄ステップの後、飽和緩衝液中１／１００００に希釈したＡＭＤＥＸコン
ジュゲート（Amersham）を３０分、３７℃で加えた。上述の通りプレートを洗い
、１５分、５０μｌのＴＭＢ（Biorad）と共にインキュベートした。その反応を
Ｈ2 ＳＯ4 ０．４Ｎで停止させ、４５０nmで読んだ。ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏ（４
パラメータ等式）により標準曲線（組換えマウスＩＬ−５）を用いて濃度を計算
し、pg／mlで表した。
【０１７４】 脾臓細胞で始めて、テストしたグループ全てでＩＬ−５は検出できず、対照的
に、全てのグループにおいて極めて高い生産量のＩＦＮγ生産が観察され、他の
グループと比べて、ＳＢＡＳ１ｃで補助したタンパク質を与えたマウスのグルー
プにおいて少しだけ増加した。このことは、ＴＨ１型の免疫応答の誘導を示唆す
る。
【０１７５】 リンパ節細胞に関して、タンパク質のみを与えたマウスのグループにおいて極
めて弱いＩＦＮγ生産が観察され、アジュバントをかえたタンパク質で５〜１０
倍の増加が観察される。ＩＬ−５は、ＳＢＡＳ２アジュバント添加タンパク質を
与えたマウスのグループにおいてのみＩＬ−５を検出することができた。 図３６及び３７は、各々脾臓又はリンパ節細胞の試験管内再刺激後のサイトカ
イン（ＩＦＮγ及びＩＬ５）の生産を刺激するＰｒｏｔ Ｄ１／３ １８ Ｅ７
Ｈｉｓの能力を比較する。
【０１７６】 抗体応答 個々の血清を器官と同時に採取し、間接的ＥＬＩＳＡにかけた。 ２．５μｇ／mlの精製したｐｒｏｔ Ｄ１／３ １８ Ｅ７タンパク質ＨＰＶ
１８をコートされた抗原として用いた。３７℃で１時間、ＰＢＳ＋１％新生ウシ
血清中に飽和した後、その血清を飽和緩衝液で（１／１００で始めて）連続的に
希釈し、Ｏ／Ｎで４℃で９０分、３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ Ｔｗｅ
ｅｎ２０で洗った後、ビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇ（１／１０００）又はヤギ
抗マウスＩｇサブクラス（全部でＩｇＧ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ）
抗血清（１／５０００）を二次抗体として用い、３７℃で９０分のインキュベー
ションの後、ペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンを加え、ＴＭＢ（
テトラメチル−ベンジジン／ペルオキシド）を基質として用い、１０分後、その
反応をＨ2 ＳＯ4 ０．５Ｍで停止させ、Ｏ．Ｄ．４５０を測定した。
【０１７７】 Ｐｒｏｔ Ｄ１／３ １８ Ｅ７単独の２回の注入で極めて弱い抗体応答が誘
発される。全体のＩｇＧレベルはアジュバントをタンパク質ワクチンに加えるこ
とにより大きく増加した。 異なるＩｇＧサブクラスの濃度の分析は、アジュバント、ＤＱＳ２１，３Ｄ−
ＭＰＬ又はＳＢ６２，ＱＳ２１／３Ｄ−ＭＰＬの存在下でタンパク質を注入した
時、ＩｇＧ２ａサブタイプの割合が少し増加したことを示す：非アジュバント添
加タンパク質でＩｇＧ１ ４６％、ＩｇＧ２ａ ３２％と比べて各々２８％ Ｉ
ｇＧ１、４８％ ＩｇＧ２ａ及び４３％ ＩｇＧ１、４４％ ＩｇＧ２ａ。最も
強力な抗体応答は、アイソタイプ濃度の明確なシフトを伴うＤＱアルムで調剤し
たタンパク質で得られる。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＩｇＧ２ａアイソタイプ
は一般に、ＴＨ１型の免疫応答の誘導に関連していると考えられるので、これら
の結果はＤＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及びＳＢ６２ ＱＳ２１／３Ｄ−ＭＰＬアジ
ュバントが体液性応答のＴＨ１型プロフィールを増加させる傾向があり、ＳＢＡ
Ｓ５は明らかなＴＨ２型の応答を誘導することを示唆する。
【０１７８】 図３８は、血清の中点希釈、及び異なるグループにおけるワクチン接種により
誘発される異なるアイソタイプの相対的割合の比較を示す。 結論： 我々は、融合タンパク質：１／３ Ｐｒｏｔ Ｄ及びＨＰＶ１６の早期タンパ
ク質Ｅ７が潜在的な全身的抗腫瘍免疫性を誘導することを証明し、融合タンパク
質：Ｐｒｏｔ Ｄ１／３及びＨＰＶ１８のＥ７もマウスにおいて免疫原性を示し
ている。ｐｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７ ＨＰＶ１６融合タンパク質でのワクチン接
種は、Ｅ７発現性腫瘍細胞での腫瘍攻撃からマウスを保護し、ワクチン接種部位
から離れた部位に注入したＨＰＶ１６のＥ７を発現する小さな予め確立された腫
瘍を排除した。
【０１７９】 我々は、アジュバント中のＰｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７ ＨＰＶ１６タンパク質
がヘルパーＴ細胞増殖を増強することができることを証明し、このことは、この
ワクチンにより誘導される抗腫瘍免疫応答がＣＤ４＋Ｔ細胞応答と少くとも部分
的に関連していることを示唆する。 我々は、３Ｄ−ＭＰＬ含有アジュバントの存在下でのＰｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ
７でのワクチン接種によりより優れた抗体応答が誘発されることも証明した。Ｃ
５７ＢＬ／６マウス中に見い出された主要アイソタイプＩｇＧ２ｂはＴＨ１型免
疫応答がおこったことを示唆する。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年２月２２日（２０００．２．２２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項２１】 請求項７〜１１のいずれかに記載のワクチンを生産するた
めの方法であって、請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質を、適切なアジ
ュバント、希釈剤又は他の医薬として許容される賦形剤と混合することを含む方
法。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１２月２１日（２０００．１２．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】 好ましくは、本発明のタンパク質は、トランス（ＴＩＴ）でチオレドキシンと
同時発現される。トランス対シスのチオレドキシンの同時発現が、プロテアーゼ
を必要とすることなく、チオレドキシンを含まない抗原を維持するために好まし
い。チオレドキシン同時発現は、本発明のタンパク質の可溶化を容易にする。チ
オレドキシン同時発現は、タンパク質精製収率、精製されたタンパク質の溶解度
及び質に大きな影響を与える。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３７】 プラスミドＴＣＡ３０８（＝ｐＲＩＴ１４５０１）の作製：融合タンパク質−
Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓを発現するプラスミド Ｅ７のアミノ酸１→９８に相当するヌクレオチド配列をｐＲＩＴ１４４６２か
ら増幅する。そのポリメラーゼ鎖反応の間、ＮｃｏＩ及びＳｐｅＩ制限部位をＥ
７配列の５′及び３′端に作り、プラスミドｐＭＧ ＭＣＳ Ｐｒｏｔ Ｄ１／
３の同じ部位への挿入を許容してプラスミドＴＣＡ３０８（＝ｐＲＩＴ１４５０
１）を供した。その挿入物を配列決定してポリメラーゼ鎖反応の間に改変が形成
されていないことを確認した。その融合タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ（
ＨＰＶ１６）についての配列を図１に記載する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６５】 キャラクタリゼーション： タンパク質Ｄ１／３ Ｅ６ Ｈｉｓは次の通りキャラクタライズする。 タンパク質Ｄ１／３−Ｅ６−ＨｉｓはプロテインＤ部分からの１１２アミノ酸
を伴う２７３アミノ酸長ペプチドである。タンパク質Ｄ１／３−Ｅ６−Ｈｉｓは
３２kDの理論分子量を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３３kDタンパク質として移動す
る。タンパク質Ｄ１／３−Ｅ６−Ｈｉｓの理論等電点は８．１７である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８０】 実施例VIII：融合Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７変異（ｃｙｓ２４→ｇｌｙ，ｇｌ
ｕ２６→ｇｌｎ）型ＨＰＶ１６を発現する大腸菌株Ｂ１００２の作製 １）発現プラスミドの作製 出発材料： ａ）融合Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７−ＨｉｓをコードするプラスミドｐＲＩＴ
１４５０１（＝ＴＣＡ３０８） ｂ）クローニングベクターｐＵＣ由来のプラスミドＬＩＴＭＵＳ２８（New En
gland Biolabs cat n０ 306〜28） ｃ）ヘモフィルス−インフルエンゼ株７７２、バイオタイプ２（H.Jansonら、
1991, Infection and Immunity, Jan. p.119〜125 ）の成熟プロテインＤの残基
Ｓｅｒ２０→Ｔｈｒ１２７に対応するコドンにより、インフルエンザからのＮＳ
１コーディング領域のコドン４−８１が置換されているｐＭＧ８１（上述）の誘
導体であるプラスミドｐＭＧ ＭＣＳ Ｐｒｏｔ Ｄ１／３（ｐＲＩＴ１４５８
９）、Ｐｒｏｔ−Ｄ１／３の配列の後に多重クローニング部位（１１残基）及び
Ｃ末端ヒスチジンテールのためのコーディング領域（６Ｈｉｓ）がある。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１３】 ペレット画分中にある約４８kDa の主要バンドをクーマシー染色したゲルによ
り可視化し、ウサギポリクローナル抗ｃｌｙｔａ抗体により、及びアクセスでき
るヒスチジンテールを検出するウシ腸アルカリホスファターゼに連結したＮｉ−
ＮＴＡコンジュゲート（Qiagen cat. n0 34510）によりウエスタン・ブロットで
同定した。発現のレベルは全タンパク質の約１％を示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１４】 実施例XIII：Ｐｒｏｔ Ｄ１／３ Ｅ７ Ｈｉｓ（ＨＰＶ１８）（大腸菌Ｂ１
０１１） トランスのチオレドキシンと共に発現されるタンパク質Ｄ１／３ Ｅ７ Ｈｉ
ｓ ＨＰＶ（大腸菌Ｂ１０１２） １）発現プラスミドの作製 １）ａ．融合タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１８を発現するプ
ラスミドであるプラスミドＴＣＡ３１６（＝ｐＲＩＴ１４５３２）の作製 出発材料 ａ）プラスミドｐＭＧ ＭＣＳ ｐｒｏｔ Ｄ１／３（＝ｐＲＩＴ１４５８９
）はインフルエンザからのＮＳ１コーディング領域のコドン４〜８１がヘモフィ
ルス−インフルエンゼ株７７２、バイオタイプ２（H Jansonら、1991, Infectio
n and Immunity, Jan. p119-125 ）の成熟プロテインＤの残基Ｓｅｒ２０→Ｔｈ
ｒ１２７に相当するコドンにより置換されている（ＷＯ９７／０１６４０として
公開されたＵＫ特許出願ｎ0 ９５１３２６１．９に記載される）ｐＭＧ８１の誘
導体である。Ｐｒｏｔ−Ｄ１／３の配列の後に多重クローニング部位（１１残基
）及びＣ末端ヒスチジンテールのためのコーディング領域（６Ｈｉｓ）がある（
図１５を参照）。このプラスミドを融合タンパク質Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓを発
現させるのに用いる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１６】 ＴＣＡ３１６（＝ｐＲＩＴ１４５３２）の作製 Ｅ７のアミノ酸１−１０５に相当するヌクレオチド配列をｐＲＩＴ１４４６７
から増幅した。そのポリメラーゼ鎖反応の間、ＮｃｏＩ及びＳｐｅＩ制限部位を
Ｅ７配列の５′及び３′端に作り、プラスミドｐＭＧ ＭＣＳ Ｐｒｏｔ Ｄ１
／３の同じ部位への挿入を許容してプラスミドＴＣＡ３１６（＝ｐＲＩＴ１４５
３２）を供した。その挿入物を配列決定して改変対Ｅ７／ＨＰＶ１８原型配列を
、グルタミン酸によるグリシンの置換（Ｅ７中のａａ４３、融合タンパク質中の
位置１５６）を作り出すＥ７遺伝子（ヌクレオチド１２８Ｇ→Ａ）中で同定した
。その融合タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１８についての配列を
図１６に記載する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３３】 Ｅ７遺伝子中の変異の導入をキット“Quick Change Site directed Mutagenes
is (Stratagene cut n0 200518）で実現した。ｐＲＩＴ１４５３２はＨＰＶ１８
の原型配列におけるグリシンのかわりにＥ７の位置４３におけるグルタミン酸の
存在を示したので、位置４３にグリシンを導入するために変異誘発の第２サイク
ルを行った。我々は、プラスミドｐＲＩＴ１４８２９（＝ＴＣＡ３５３）を得た
。配列決定により完全なＥ７遺伝子の変異及び組込みの存在を確認した後、その
変異したＥ７の遺伝子をベクターｐＲＩＴ１４５８９（＝ｐＭＧ ＭＣＳ Ｐｒ
ｏｔ Ｄ１／３）に導入してプラスミドｐＲＩＴ１４８３１（＝ＴＣＡ３５５）
を供した（図１９を参照）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３４】 融合タンパク質−Ｄ１／３−Ｅ７変異（ｃｙｓ２７→ｇｌｙ，ｇｌｕ２９→ｇ
ｌｎ）−Ｈｉｓについての配列は図２０に記載される。 ２）Ｐｒｏｔ Ｄ１／３−Ｅ７変異（ｃｙｓ２７→ｇｌｙ，ｇｌｕ２９→ｇｌ
ｎ）−Ｈｉｓ／ＨＰＶ１８を発現する株Ｂ１０９８の作製 プラスミドｐＲＩＴ１４８３１を、λｐＬプロモーターの熱感受性レプレッサ
ーを含む欠失λリソゲンを含む大腸菌ＡＲ５８（Mottら、1985, Proc Natl.Acad
.Sci. 82: 88）に導入し、カナマイシンに耐性である形質転換体についての選択
により株Ｂ１０９８を供した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１７７】 Ｐｒｏｔ Ｄ１／３ １８ Ｅ７単独の２回の注入で極めて弱い抗体応答が誘
発される。全体のＩｇＧレベルはアジュバントをタンパク質ワクチンに加えるこ
とにより大きく増加した。 異なるＩｇＧサブクラスの濃度の分析は、アジュバント、ＤＱＳ２１，３Ｄ−
ＭＰＬ又はＳＢ６２，ＱＳ２１／３Ｄ−ＭＰＬの存在下でタンパク質を注入した
時、ＩｇＧ２ａサブタイプの割合が少し増加したことを示す：非アジュバント添
加タンパク質でＩｇＧ１ ４６％、ＩｇＧ２ａ ３２％と比べて各々２８％ Ｉ
ｇＧ１、４８％ ＩｇＧ２ａ及び４３％ ＩｇＧ１、４４％ ＩｇＧ２ａ。最も
強力な抗体応答は、アイソタイプ濃度の明確なシフトを伴うＤＱアルムで調剤し
たタンパク質で得られる。（８０％ ＩｇＧ１、８％ ＩｇＧ２ａ）Ｂａｌｂ／
ｃマウスにおけるＩｇＧ２ａアイソタイプは一般に、ＴＨ１型の免疫応答の誘導
に関連していると考えられるので、これらの結果はＤＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及
びＳＢ６２ ＱＳ２１／３Ｄ−ＭＰＬアジュバントが体液性応答のＴＨ１型プロ
フィールを増加させる傾向があり、ＳＢＡＳ５は明らかなＴＨ２型の応答を誘導
することを示唆する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８】
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１０】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１２】
【手続補正１８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１３】
【手続補正１９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１４】
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１６】
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１８】
【手続補正２２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２０】
【手続補正２３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２２】
【手続補正２４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 37/00 ４Ｈ０４５ 37/00 Ｃ０７Ｋ 14/025 Ｃ０７Ｋ 14/025 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 カベゾン シルバ，テレサ ベルギー国，ベ−1330 リクサンサール, リュ ドゥ ランスティテュ 89，スミス クライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (72)発明者 デリッス，アンヌ−マリー，エバ フェル ナンド ベルギー国，ベ−1330 リクサンサール, リュ ドゥ ランスティテュ 89，スミス クライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (72)発明者 ジェラール，カトリーヌ マリー ギスレ ーヌ ベルギー国，ベ−1330 リクサンサール, リュ ドゥ ランスティテュ 89，スミス クライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (72)発明者 ロンバールド−ベンチェク，アンジェラ ベルギー国，ベ−1330 リクサンサール, リュ ドゥ ランスティテュ 89，スミス クライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA12 BA32 BA80 CA07 DA06 EA04 FA02 GA11 GA19 GA25 HA03 4B064 AG01 AG32 CA02 CA19 CC01 CC06 CC24 CE02 CE03 CE04 CE06 CE08 CE10 CE11 CE12 DA01 DA05 DA13 DA14 4B065 AA01Y AA26X AA41Y AA49Y AA95Y AB01 AC14 AC20 BA02 BC03 BC50 BD01 BD14 BD15 BD16 BD17 BD18 CA24 CA45 4C076 AA17 CC18 CC27 DD08 DD30 DD34 DD59 DD63 DD70 FF04 FF13 4C085 AA38 BA55 CC07 DD62 EE06 FF12 FF14 FF18 FF19 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA01 CA11 DA86 EA28 EA31 FA74 GA01 GA10 GA15 GA20 GA23 GA26 GA31

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 免疫学的融合パートナーに連結したＨＰＶからのＥ６もしく
    はＥ７タンパク質又はＥ６／Ｅ７融合タンパク質。
  2. 【請求項２】 前記融合パートナーが、次の群：ヘモフィルス−インフルエ
    ンゼＢからのプロテインＤ又はそのフラグメント、ヘモフィルス−インフルエン
    ゼＢからのリポプロテインＤ又はそのフラグメント、インフルエンザウイルスか
    らのＮＳ１又はそのフラグメント、及び肺炎連鎖菌からのＬＹＴＡ又はそのフラ
    グメントから選択されることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
  3. 【請求項３】 前記Ｅ６又はＥ７タンパク質が、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８
    から得られることを特徴とする請求項１又は２に記載のタンパク質。
  4. 【請求項４】 前記Ｅ７タンパク質が突然変異されていることを特徴とする
    請求項１，２又は３に記載のタンパク質。
  5. 【請求項５】 前記Ｅ６タンパク質が突然変異されていることを特徴とする
    請求項１，２又は３に記載のタンパク質。
  6. 【請求項６】 少くとも４ヒスチジン残基のヒスチジンタグを更に含む請求
    項１〜５のいずれかに記載のタンパク質。
  7. 【請求項７】 異種タンパク質、ヒスチジンタグ及びＣ−ＬＹＴＡタグを含
    む融合タンパク質。
  8. 【請求項８】 先の請求項のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮ
    Ａ配列。
  9. 【請求項９】 請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質と、医薬として
    許容される希釈剤又は賦形剤と、を含むワクチン。
  10. 【請求項１０】 アジュバントを更に含む請求項９に記載のワクチン。
  11. 【請求項１１】 前記タンパク質が水性エマルションビヒクル中の油内に供
    されることを特徴とする請求項９又は１０に記載のワクチン。
  12. 【請求項１２】 前記アジュバントが、３Ｄ−ＭＰＬもしくはＱＳ２１又は
    それら両方を含むことを特徴とする請求項１０又は１１に記載のワクチン。
  13. 【請求項１３】 更なるＨＰＶ抗原を含む請求項９〜１２のいずれかに記載
    のワクチン。
  14. 【請求項１４】 医薬に用いるための請求項９〜１３のいずれかに記載のワ
    クチン。
  15. 【請求項１５】 ＨＰＶにより誘導される良性又は悪性の腫瘍を患う被検体
    を免疫療法により治療するためのワクチンの製造のための請求項１〜７のいずれ
    かに記載のタンパク質の使用。
  16. 【請求項１６】 ＨＰＶウイルス感染を予防するためのワクチンの製造のた
    めの請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質の使用。
  17. 【請求項１７】 請求項８に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
  18. 【請求項１８】 請求項８に記載のＤＮＡ配列と、チオレドキシンをコード
    するＤＮＡ配列と、を含むベクター。
  19. 【請求項１９】 請求項８に記載のＤＮＡ配列で形質転換された宿主。
  20. 【請求項２０】 請求項１７又は１８に記載のベクターで形質転換された宿
    主。
  21. 【請求項２１】 チオレドキシンをコードするＤＮＡ配列で更に形質転換さ
    れた請求項１９に記載の宿主。
  22. 【請求項２２】 請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質を生産するた
    めの方法であって、宿主細胞を請求項６に記載のＤＮＡ配列で形質転換し、該配
    列を発現させ、そして要求される産物を単離することを含む方法。
  23. 【請求項２３】 請求項９〜１４のいずれかに記載のワクチンを生産するた
    めの方法であって、請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質を、適切なアジ
    ュバント、希釈剤又は他の医薬として許容される賦形剤と混合することを含む方
    法。
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