ES2221198T3

ES2221198T3 - Vacuna contra pvh.

Info

Publication number: ES2221198T3
Application number: ES98945269T
Authority: ES
Inventors: Claudine SmithKline Beecham Biologicals SA BRUCK; Teresa SmithKline Beecham Biologic CABEZON SILVA; Anne-Marie E.F. SmithKline Beecham Biol. DELISSE; Catherine Marie G. SmithKline Beecham GERARD; Angela SmithKline Beecham LOMBARDO-BENCHEIKH
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1997-08-22
Filing date: 1998-08-17
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2018-08-17
Also published as: CA2301920A1; ATE267211T1; US20020182221A1; NZ502632A; HUP0004327A1; AU732946B2; GB9717953D0; TR200000480T2; DE69824013T2; BR9812139A; NO20000850D0; CN1276833A; ZA987591B; EP1007551A2; PL339009A1; DE69824013D1; AU9263998A; UY25146A1; IL134392A0; CA2301920C

Abstract

Una proteína de fusión que comprende un antígeno de papilomavirus humano seleccionado del grupo constituido por: i) proteína E6, ii) proteína E7, iii) proteína de fusión E6E7, iv) proteína E7 en la que se introduce una mutación para reducir la unión al producto del gen de retinoblastoma, o v) proteína E6 en la que se introduce una mutación en la región p53 de la proteína E6; dicha proteína ligada a la proteína D o a un derivado de la misma de Haemophilus influenzae, en la que el derivado de proteína D comprende aproxiamdamente los primeros 100 aminoácidos N- terminales de la proteína D.

Description

Vacuna contra PVH.

La presente invención se refiere a proteínas de fusión, que comprenden una proteína o parte de una proteína que proporciona epítopos auxiliares de T y un antígeno de un papilomavirus humano, que encuentran utilidad en el tratamiento o la profilaxis de tumores inducidos por papiloma humano. En particular, la invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden una proteína E6 o E7 de PVH de cepa 16 ó 18 ligada a proteína D de Haemophilus influenzae B.

Los papilomavirus son virus tumorales pequeños de ADN desnudo (7,9 kilobases, bicatenarios) que son altamente específicos de especie. Se han descrito más de 70 genotipos de papilomavirus humanos (PVH) individuales. Los papilomavirus se clasifican basándose en la especie de origen (humana, bovina, etc.) y en el grado de relación genética con otros papilomavirus de la misma especie. Los PVH son generalmente específicos de las superficies dérmica o mucosa, y se han clasificado ampliamente en de "alto" y "bajo" riesgo basándose en su detección rara y común, respectivamente, en tejido anormal o tumoral. Los PVH de bajo riesgo causan habitualmente lesiones (verrugas o papilomas) que persisten durante varios meses o años. Los PVH de alto riesgo están asociados al cáncer. La asociación positiva más fuerte entre un virus PVH y el cáncer humano es la que existe entre PVH 16 y 18 y el carcinoma cervical. Se han encontrado también más de otros diez tipos de PVH en carcinomas cervicales incluyendo PVH 31 y PVH 33, aunque con menos frecuencia.

La infección genital por PVH en mujeres jóvenes sexualmente activas es común, y la mayoría de los individuos eliminan la infección, o si se desarrollan lesiones, éstas retroceden. Sólo un subconjunto de individuos afectados tiene lesiones que progresan a neoplasia intraepitelial de alto grado y sólo una fracción de estos progresan adicionalmente a carcinoma invasivo.

Los eventos moleculares que conducen a la infección por PVH no se han establecido claramente. La falta de un sistema in vitro adecuado para propagar los papilomavirus humanos ha obstaculizado la progresión a una mejor información sobre el ciclo viral.

Hoy en día, se han aislado y caracterizado diferentes tipos de PVH con la ayuda de sistemas de clonación en bacterias y más recientemente mediante amplificación por PCR. La organización molecular de los genomas de PVH se ha definido comparativamente con el bien caracterizado papilomavirus bovino de tipo I (PVB1).

Aunque aparecen variaciones menores, todos los genomas de PVH descritos tienen al menos siete genes tempranos, E1 a E7 y dos genes tardíos L1 y L2. Además, una región reguladora cadena arriba alberga las secuencias reguladoras que parecen controlar la mayoría de los eventos transcripcionales del genoma de PVH.

Los genes E1 y E2 están implicados en la replicación y el control transcripcional viral, respectivamente, y tienden a desestabilizarse mediante integración viral. E6 y E7 están implicados en la transformación viral. E5 se ha implicado también en este proceso.

En los PVH implicados en carcinoma cervical tales como PVH 16 y 18, el proceso oncogénico se inicia después de la integración de ADN viral. La integración da como resultado la inactivación de genes que codifican las proteínas de cápsida L1 y L2, y la pérdida de la función represora de E2 conduce a la desregulación del marco abierto de lectura E6/E7 instalando una sobreexpresión continua de las dos proteínas tempranas E6 y E7, que conducirá a una pérdida gradual de la diferenciación celular normal y al desarrollo del carcinoma. E6 y E7 superan el ciclo celular normal inactivando las proteínas supresoras de tumores mayoritarias, p53 y pRB, el producto del gen de retinoblastoma, respectivamente.

El carcinoma del cuello del útero es común en mujeres y se desarrolla mediante una etapa intermedia precancerosa hasta el carcinoma invasivo, que frecuentemente conduce a la muerte. Las etapas intermedias de la enfermedad son conocidas como neoplasia intraepitelial cervical y se gradúan de I a III en términos de gravedad creciente (NIC I-III).

Clínicamente, la infección por PVH en el tracto anogenital femenino se manifiesta en forma de condilomas planos cervicales, cuya marca es la coilocitosis que afecta predominantemente a células superficiales e intermedias del epitelio escamoso cervical.

Los coilocitos, que son la consecuencia de un efecto citopático del virus, aparecen en forma de células multinucleadas con un halo transparente perinuclear. El epitelio se engrosa con una queratinización anormal responsable de la apariencia verrugosa de la lesión.

Dichos condilomas planos, cuando son positivos de los serotipos PVH 16 ó 18, son factores de alto riesgo para la evolución de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) y de carcinoma in situ (CIS), que se consideran como lesiones precursoras de carcinoma invasivo del cuello de la matriz.

El historial natural de la infección por PVH oncogénico presenta 3 fases consecutivas, a saber:

(1) una fase de infección latente,

(2) una fase de replicación viral intranuclear que produce viriones completos, que corresponde a la aparición de coilocitos. En esta etapa, el PVH está produciendo todo el intervalo de proteínas incluyendo E2, E5, E6, E7, L1 y L2.

(3) una fase de integración viral en el genoma celular, que desencadena el inicio de la transformación maligna, y corresponde a NIC II y NIC III/CIS con desaparición progresiva de los coilocitos. En esta etapa, la expresión de E2 está inhibida y la expresión de E6 y E7 está potenciada. Entre NIC II/III y NIC III/carcinoma cervical, el ADN viral cambia de ser episomal en las células basales a la integración de sólo los genes E6 y E7 (células tumorales). El 85% de todos los carcinomas cervicales son carcinomas de células escamosas relacionadas principalmente con el serotipo PVH 16. El 10% y 5% son adenocarcinomas y carcinomas de células escamosas, respectivamente, y ambos tipos están relacionados principalmente con el serotipo PVH 18. Sin embargo, existen otros PVH oncogénicos.

La solicitud de patente internacional nº WO 96/19496 da a conocer variantes de las proteínas E6 y E7 de papilomavirus humano, particularmente proteínas de fusión de E6/E7 con una deleción en ambas proteínas E6 y E7. Estas proteínas de fusión con deleción se dice que son inmunogénicas.

La presente invención proporciona composiciones que comprenden una proteína E6 o E7 o de fusión E6/E7 ligada a un asociado de fusión inmunológico que tiene epítopos de células T.

En una forma preferida de la invención, el asociado de fusión inmunológico deriva de proteína D de Haemophilus influenzae B. Preferiblemente, el derivado de proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la proteína, en particular aproximadamente los primeros 100-110 aminoácidos N-terminales. La proteína D puede lipidarse (lipoproteína D). Otros asociados de fusión inmunológicos incluyen la proteína no estructural del virus de la gripe NS1 (hemaglutinina). Típicamente, se utilizan los 81 aminoácidos N-terminales, aunque pueden utilizarse diferentes fragmentos a condición de que incluyan epítopos auxiliares de T.

En consecuencia, la presente invención en una realización preferida proporciona proteínas de fusión que comprenden proteína D-E6 de PVH 16, proteína D-E7 de PVH 16, proteína D-E7 de PVH 18, proteína D-E6 de PVH18 y proteína D-E6E7 tanto de PVH16 como PVH18. La parte de proteína D comprende preferiblemente el primer tercio de proteína D. Se apreciará que pueden utilizarse otras proteínas E6 y E7 de otros subtipos de PVH.

Las proteínas de la presente invención se expresan preferiblemente en E. coli. En una realización preferida, las proteínas se expresan con una cola de histidina que comprende entre 5 y 9, y preferiblemente 6 residuos de histidina. Éstas son ventajosas para ayudar a la purificación.

La proteína E7 puede portar en una realización preferida una mutación para reducir la unión al sitio rb (producto del gen de retinoblastoma) y eliminar por tanto cualquier capacidad transformante potencial. Las mutaciones preferidas para E7 de PVH16 implican reemplazar Cys_{24} por glicina, o ácido glutámico_{26} por glutamina. En una realización preferida, la proteína E7 contiene ambas de estas mutaciones.

Las mutaciones preferidas para E7 de PVH18 implican reemplazar Cys_{27} por glicina y/o ácido glutámico_{29} por glutamina. De nuevo, están presentes preferiblemente ambas mutaciones.

Pueden introducirse también mutaciones sencillas o dobles en la región p53 de E6 para eliminar cualquier capacidad transformante potencial.

En una realización adicional de la invención, se proporciona una proteína de fusión E6E7 de PVH ligada a un asociado de fusión inmunológico. Es un asociado de fusión inmunológico preferido la proteína D, más preferiblemente el primer tercio de la proteína D.

La presente invención proporciona también un ADN que codifica las proteínas de la presente invención. Dichas secuencias pueden insertarse en un vector de expresión adecuado y expresarse en un hospedador adecuado.

Puede sintetizarse una secuencia de ADN que codifica las proteínas de la presente invención utilizando técnicas de síntesis de ADN estándar, tales como mediante ligamiento enzimático como se describe por D.M. Roberts et al. en Biochemistry 1985, 24, 5090-5098, mediante síntesis química, mediante polimerización enzimática in vitro o mediante tecnología de PCR utilizando por ejemplo una polimerasa termoestable, o mediante una combinación de estas técnicas.

La polimerización enzimática de ADN puede llevarse a cabo in vitro utilizando una ADN polimerasa tal como la ADN polimerasa I (fragmento Klenow) en un tampón adecuado que contiene los trifosfatos de nucleósidos dATP, dCTP, dGTP y dTTP según sean necesarios a una temperatura de 10-37ºC, generalmente en un volumen de 50 \mul o menor. El ligamiento enzimático de fragmentos de ADN puede llevarse a cabo utilizando una ADN ligasa tal como ADN ligasa T4 en un tampón apropiado, tal como Tris 0,05 M (pH 7,4), MgCl_{2} 0,01 M, ditiotreitol 0,01 M, espermidina 1 mM, ATP 1 mM y seroalbúmina bovina 0,1 mg/ml, a una temperatura de 4ºC a ambiente, generalmente en un volumen de 50 ml o menor. La síntesis química del polímero de ADN o fragmentos puede llevarse a cabo mediante la química convencional de fosfotriéster, fosfito o fosforamidita, utilizando técnicas en fase sólida tales como las descritas en "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual" (ed. H.G. Gassen y A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), o en otras publicaciones científicas, por ejemplo M.J. Gait, H.W.D. Mathes, M. Singh, B.S. Sproat y R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat y W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci y M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci y M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus y H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; y H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801.

El procedimiento de la invención puede realizarse mediante técnicas recombinantes convencionales tales como las descritas en Maniatis et al., "Molecular Cloning - A Laboratory Manual"; Cold Spring Harbor, 1982-1989.

En particular, el procedimiento de la invención puede comprender las etapas de:

i): preparar un vector de expresión replicable o integrador capaz, en una célula hospedadora, de expresar un polímero de ADN que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la proteína o un derivado inmunogénico de la misma;

ii): transformar una célula hospedadora con dicho vector;

iii): cultivar dicha célula hospedadora transformada en condiciones que permitan la expresión de dicho polímero de ADN para producir dicha proteína; y

iv): recuperar dicha proteína.

El término "transformar" se utiliza en la presente memoria para indicar la introducción de ADN extraño en una célula hospedadora. Esto puede conseguirse por ejemplo mediante transformación, transfección o infección con un plásmido o vector viral apropiado utilizando, por ejemplo, técnicas convencionales como las descritas en "Genetic Engineering"; ed. S.M. Kingsman y A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, Inglaterra, 1988. El término "transformado" o "transformante" se aplicarán en adelante en la presente memoria a la célula hospedadora resultante que contiene y expresa al gen extraño de interés.

Preferiblemente, el antígeno recombinante de la invención se expresa en E. coli. La estrategia de expresión incluye la fusión de E7, E6 o la fusión E6/E7 con el tercio N-terminal de la proteína D de Haemophilus influenzae B, un asociado de fusión inmunológico que proporciona epítopos de células T auxiliares. Se inserta por ingeniería genética una cola de polihistidina de afinidad en la terminación carboxi de la proteína de fusión, permitiendo una purificación simplificada. Dicho antígeno recombinante se sobreexpresa en E. coli. en forma de proteína insoluble.

Preferiblemente, las proteínas de la invención se coexpresan con tioredoxina en trans (TIT). Se prefiere la coexpresión de la tioredoxina en trans frente a cis para mantener al antígeno exento de tioredoxina sin necesidad de proteasa. La coexpresión de tioredoxina facilita la solubilización de las proteínas de la invención. La coexpresión de tioredoxina tiene también un impacto significativo sobre el rendimiento de purificación de proteína y sobre la solubilidad y calidad de la proteína purificada.

Los vectores de expresión son nuevos y forman también parte de la invención.

Los vectores de expresión replicables pueden prepararse según la invención, escindiendo un vector compatible con la célula hospedadora para proporcionar un segmento de ADN lineal que tiene un replicón intacto, y combinando dicho segmento lineal con una o más moléculas de ADN que, junto con dicho segmento lineal, codifican el producto deseado, tal como el polímero de ADN que codifica la proteína de la invención, o derivado de la misma, en condiciones de ligamiento.

Por tanto, el polímero de ADN puede preformarse o formarse durante la construcción del vector, si se desea.

La elección del vector se determinará en parte por la célula hospedadora, que puede ser procariótica o eucariótica, pero que es preferiblemente E. coli. Los vectores adecuados incluyen plásmidos, bacteriófagos, cósmidos y virus recombinantes.

La preparación del vector de expresión replicable puede llevarse a cabo convencionalmente con enzimas apropiadas para restricción, polimerización y ligamiento del ADN, mediante procedimientos descritos en, por ejemplo, Maniatis et al., citado anteriormente.

La célula hospedadora recombinante se prepara, según la invención, transformando una célula hospedadora con un vector de expresión replicable de la invención en condiciones transformantes. Las condiciones transformantes adecuadas son convencionales y se describen, por ejemplo, en Maniatis et al., citado anteriormente, o en "DNA Cloning", vol. II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd., 1985.

La elección de las condiciones transformantes se determina por la célula hospedadora. Por tanto, una bacteria hospedadora tal como E. coli puede tratarse con una solución de CaCl_{2} (Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1973, 69, 2110) o con una solución que comprende una mezcla de RbCl, MnCl_{2}, acetato de potasio y glicerol, y después con ácido 3-[N-morfolino]propanosulfónico, RbCl y glicerol. Las células de mamífero en cultivo pueden transformarse mediante coprecipitación con calcio del ADN vectorial en las células. La invención se extiende también a una célula hospedadora transformada con un vector de expresión replicable de la invención.

El cultivo de la célula hospedadora transformada en condiciones que permitan la expresión del polímero de ADN se lleva a cabo convencionalmente, como se describe, por ejemplo, en Maniatis et al. y "DNA Cloning", citados anteriormente. Por tanto, preferiblemente se suministra a la célula nutriente y se cultiva a una temperatura menor de 50ºC.

Se recupera el producto mediante procedimientos convencionales según la célula hospedadora. Por tanto, cuando la célula hospedadora es bacteriana, tal como E. coli, puede lisarse física, química o enzimáticamente y aislarse el producto de proteína del lisado resultante. Cuando la célula hospedadora es de mamífero, el producto puede aislarse generalmente del medio nutriente o de extractos exentos de células. Las técnicas de aislamiento de proteína convencionales incluyen precipitación selectiva, cromatografía de adsorción y cromatografía de afinidad, incluyendo una columna de afinidad de anticuerpo monoclonal.

Cuando las proteínas de la presente invención se expresan con una cola de histidina (marcaje de histidina), las proteínas pueden purificarse fácilmente mediante cromatografía de afinidad utilizando una columna de cromatografía de afinidad de metal iónico (IMAC).

Puede utilizarse una segunda etapa cromatográfica, tal como Q-Sepharose, antes o después de la columna IMAC para proporcionar una proteína altamente purificada.

Las proteínas de la presente invención se proporcionan preferiblemente al menos un 80% puras, más preferiblemente un 90% puras como se visualiza por SDS PAGE. La proteína presenta una banda única mayoritaria cuando se analiza por SDS PAGE en condiciones reductoras, y el análisis de transferencia Western muestra menos de un 5% de contaminación de proteína de célula hospedadora.

La presente invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende una proteína de la presente invención en un excipiente farmacéuticamente aceptable. Una composición de vacuna preferida comprende al menos proteína D-E6 de PVH16 o un derivado de la misma junto con proteína D-E7 de PVH16. Como alternativa, E6 y E7 pueden presentase en una sola molécula, preferiblemente una fusión de proteína D-E6/E7. Dicha vacuna puede contener opcionalmente una cualquiera o ambas proteínas E6 y E7 de PVH18, preferiblemente en forma de una proteína de fusión proteína D-E6 o proteína D-E7 o proteína D-E6/E7. Las vacunas de la presente invención pueden contener otros antígenos de PVH de PVH16 o 18. En particular, la vacuna puede contener antígenos monoméricos L1 o L2. Como alternativa, dichos antígenos L1 o L2 pueden presentarse juntos en forma de una partícula viroide o la proteína L1 sola puede presentarse en forma de una partícula viroide o estructura de capsómero. Dichos antígenos, partículas viroides y capsómeros son conocidos por sí mismos. Véanse por ejemplo los documentos WO 94/00152, WO 94/20137, WO 94/05792 y WO 93/02184. Pueden incluirse proteínas tempranas adicionales tales como E2 o preferiblemente E5, por ejemplo. La vacuna de la presente invención puede comprender adicionalmente antígenos de otras cepas de PVH, preferiblemente de las cepas PVH6, 11, PVH 31 ó 33.

La preparación de vacuna se describe en general en "Vaccine Design - The subunit and adjuvant approach" (ed. Powell y Newman), "Pharmaceutical Biotechnology" vol. 6, Plenum Press 1995. La encapsulación con liposomas se describe por Fullerton, patente de EE.UU. 4.235.877.

Las proteínas de la presente invención se coadyuvan preferiblemente en la formulación de vacuna de la invención. Los coadyuvantes preferidos incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alúmina) o fosfato de aluminio, pero pueden ser también una sal de calcio, hierro o cinc, o pueden ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente o polifosfazonas.

En la formulación de la invención se prefiere que la composición de coadyuvante induzca una respuesta preferencial TH1. Los sistemas coadyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil-lípido A, preferiblemente monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) junto con una sal de aluminio.

Un sistema potenciado implica la combinación de un monofosforil-lípido A y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se da a conocer en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica en la que el QS21 se inactiva con colesterol como se da a conocer en el documento WO 96/33739.

Se describe una formulación coadyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua en el documento WO 95/17210, y es una formulación preferida.

En consecuencia, en una realización de la presente invención se proporciona una vacuna que comprende una proteína D (o derivado de la misma)-E6 o una proteína D (o derivado de la misma)-E7 coadyuvada con un monofosforil-lípido A o derivado del mismo.

Preferiblemente, la vacuna comprende adicionalmente una saponina, más preferiblemente QS21.

Preferiblemente, la formulación comprende adicionalmente una emulsión de aceite en agua y tocoferol. La presente invención proporciona también un procedimiento para producir una formulación de vacuna que comprende mezclar una proteína de la presente invención junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como
3D-MPL.

La invención se describirá con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos:

Ejemplo I Construcción de una cepa de E. coli que expresa la fusión proteína D1/3-E7-His (PVH16) 1) Construcción del plásmido de expresión

a) El plásmido pMG MCS prot D1/3 (=pRIT14589) es un derivado de pMG81 (descrito en la solicitud de patente del R.U. nº 9513261.9 publicada como WO 97/01640) en el que los codones 4-81 de la región de codificación de NS1 de la gripe se reemplazaron por los codones correspondientes a los residuos Ser20\rightarrowThr127 de proteína D madura de Haemophilus influenzae de cepa 772, biotipo 2 (H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, enero. pág. 119-125). La secuencia de protD1/3 es seguida por un sitio de clonación múltiple (11 residuos) y una región de codificación de una cola de histidina C-terminal (6 His). Este plásmido se utiliza para expresar la proteína de fusión D1/3-E7-His.

b) Las secuencias E6 y E7 de PVH genómico de tipo PVH16 (véase Dorf et al., Virology 1985, 145, pág. 181-185) se amplificaron del genoma de PVH16 completo clonado en pBR322 (obtenido del Deutsches

\hbox{Krebsforschungszentrum}

(DKFZ), Referenzzentrum für human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg) y se subclonaron en pUC19 proporcionando TCA 301 (=pRIT14462). Construcción del plásmido TCA 308 (=pRIT14501): un plásmido que expresa la fusión proteína D1/3-E7-His

Se amplifican las secuencias nucleotídidicas correspondientes a los aminoácidos 1\rightarrow98 de la proteína E7 de pRIT14462. Durante la reacción en cadena con polimerasa, se generaron sitios de restricción NcoI y SpeI en los extremos 5' y 3' de las secuencias de E7, permitiendo la inserción en los mismos sitios del plásmido pMGMCS prot D/13, proporcionando el plásmido TCA 308 (=pRIT14501). Se secuenció el inserto para verificar que no se había generado ninguna modificación durante la reacción en cadena con polimerasa. La secuencia para la fusión proteína D1/3-E7-His (PVH16) se describe en la figura 1.

2) Transformación de la cepa AR58

Se introdujo el plásmido pRIT14501 en AR58 de E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un represor termosensible del promotor pL \lambda.

3) Crecimiento e inducción de cepas bacterianas - expresión de prot D1/3-E7-His

Se hicieron crecer células AR58 transformadas con plásmido pRIT14501 en 100 ml de medio LB suplementado con 50 \mug/ml de canamicina a 30ºC. Durante la fase de crecimiento logarítmico, se cambiaron las bacterias a 39ºC para inactivar el represor \lambda y activar la síntesis de proteína D1/3-E7-His. La incubación a 39ºC se continuó durante 4 horas. Se sedimentaron las bacterias y se almacenaron a -20ºC.

Ejemplo II Caracterización de la fusión proteína D1/3-E7-His (PVH16)

Se descongelan células congeladas y se resuspenden en 10 ml de tampón PBS. Se rompen las células en una prensa French de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres pasadas). Se centrifuga el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a 4ºC.

Después de la centrifugación de los extractos descrita anteriormente, se analizaron alícuotas del sobrenadante y sedimento mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y transferencia Western. Se visualizó una banda mayoritaria de aproximadamente 33 kDa localizada en la fracción de sedimento mediante geles teñidos con Coomasie, y se identificó en transferencias Western mediante anticuerpo policlonal de conejo anti-proteína D y mediante conjugado Ni-NTA acoplado a fosfatasa alcalina intestinal bovina (nº de catálogo Qiagen 34510), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel de expresión representa aproximadamente un 5% de la proteína total como se muestra en un gel de SDS-poliacrilamida teñido con Coomasie.

Ejemplo III Purificación de proteína-D1/3-E7-His (PVH16)

Se centrifuga un litro de cultivo de bacterias que expresan proteína D1/3-E7-His a 11.300 g durante 30 min a 4ºC, y se mantiene el sedimento celular a -80ºC hasta tratamiento posterior. Después de la resuspensión en 75 ml de tampón PBS, se rompen las células de E. coli en una prensa French de celda a presión (SLM Aminco®) a 138 MPa. Se sedimentan las células lisadas mediante centrifugación a 17.000 g durante 30 minutos. El sedimento, que contiene la proteína D1/3-E7-His, se lava una vez con 30 ml de NaCl 2 M, fosfato 50 mM, pH 7,5, y después dos veces con 30 ml de fosfato 50 mM pH 7,5. Las proteínas se solubilizan después de 2 horas de incubación del sedimento en 30 ml de urea 8 M, fosfato 50 mM, pH 7,5 a TA. Se eliminan los residuos celulares mediante centrifugación de 15 min a 17.000 g, 4ºC. Se lleva a cabo la purificación de proteína a TA, se aplican 15 ml de proteína solubilizada a 5 ml de resina Ni2+NTA (Qiagen) (columna Pharmacia XK 16/20) preequilibrada con urea 8 M, fosfato 50 mM, pH 7,5 a un caudal de 0,2 ml/min. Se lava la columna con el mismo tampón hasta que la absorbancia a 280 nm alcanza la línea base. Se eluye la proteína con un gradiente de imidazol 0-600 mM en urea 8 M, fosfato 50 mM, pH 7,5. Se lleva el caudal de estas dos etapas a 1 ml/min. Se analizan las fracciones eluidas mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y mediante transferencia Western. La prot D1/3-E7-His, visualizada mediante tinción con azul de Coomasie, mediante un anticuerpo policlonal anti-proteína D o mediante un anticuerpo monoclonal anti-E7, aparece en forma de una banda mayoritaria de aproximadamente 32 kDa y se estima como proteína pura a un 95%. No se observan contaminantes de E. coli analizando con un anticuerpo policlonal anti-proteínas de
E. coli.

Para eliminar la urea, se dializan 9 ml de antígeno purificado a 1,33 mg/ml (Bradford) frente a 3 litros de tampón PBS durante una noche a TA, seguido de una diálisis de 4 horas frente a tampón PBS reciente. Se recupera un 80% de proteína exenta de urea en forma de proteína soluble. Para eliminar las endotoxinas contaminantes, se incuban 6 ml de proteína dializada con 1 ml de gel de polimixina Affiprep (Biorad) durante 3 horas a 4ºC con agitación suave. Se realiza una segunda incubación con 500 \mul de resina de polimixina Affiprep para minimizar el nivel de endotoxina a 8,8 UE/\mug de proteína. Después de filtración estéril en un dispositivo de filtrado de 0,22 \mum (Millex 0,22 GV, Millipore), se ensaya la estabilidad de la prot D1/3-E7-His a 0,665 mg/ml. El análisis de SDS-PAGE no mostró evolución de la proteína después de 7 días de incubación a -20ºC, 4ºC, TA o 37ºC.

Ejemplo IV Construcción de una cepa de E. coli que expresa la fusión proteína D/13-E6-His/PVH16 1. Construcción del plásmido de expresión

a) El plásmido pMG MCS prot D1/3 (= pRIT14589) es un derivado de pMG81 (descrito en el documento WO 97/01640) en el que los codones 4-81 de la región de codificación de NS1 de la gripe se reemplazaron por los codones correspondientes a los residuos Ser20\rightarrowThr127 de la proteína D madura de Haemophilus influenzae cepa 772, biotipo 2 (H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, enero. pág. 119-125). La secuencia de la prot-D1/3 es seguida por un sitio de clonación múltiple (11 residuos) y una región de codificación de una cola de histidina C-terminal (6 His). Este plásmido se utiliza para expresar la proteína de fusión D1/3-E6-His.

b) Se amplificaron las secuencias E6 y E7 de PVH genómico de tipo PVH16 (Seedorf et al., Virology 1985, 145, pág. 181-185) a partir del genoma de PVH16 completo clonado en pBR322 (obtenido del Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum für human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg) y se subclonaron en pUC19 proporcionando TCA 301 (=pRT14462).

Construcción del plásmido TCA 307 (= pRIT14497): un plásmido que expresa la fusión proteína D1/3-E6-His/PVH16

Las secuencias nucleotídicas correspondientes a los aminoácidos 1\rightarrow151 de la proteína E6 se amplificaron a partir de pRIT14462. Durante la reacción en cadena con polimerasa, se generaron sitios de restricción NcoI y SpeI en los extremos 5' y 3' de las secuencias E6, permitiendo la inserción en los mismos sitios del plásmido pMGMCS prot D1/3, proporcionando el plásmido TCA 307 (= pRIT14497) (véase la figura 2). Se secuenció el inserto para verificar que no se había generado ninguna modificación durante la reacción en cadena con polimerasa. Se describe la secuencia de codificación para la fusión proteína-D1/3-E6-His en la figura 3.

2. Transformación de la cepa AR58

Se introdujo el plásmido pRIT14497 en AR58 de E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un represor termosensible del promotor pL \lambda.

3. Crecimiento e inducción de cepas bacterianas - expresión de prot D1/3-E6-His

Se hicieron crecer células AR58 transformadas con plásmido pRIT14497 en 100 ml de medio LB suplementado con 50 \mug/ml de canamicina a 30ºC. Durante la fase de crecimiento logarítmico, las bacterias se cambiaron a 39ºC para inactivar el represor \lambda y activar la síntesis de proteína D1/3-E6-His. La incubación a 39ºC se continuó durante 4 horas. Se sedimentaron las bacterias y se almacenaron a -20ºC.

4. Caracterización de la fusión proteína D1/3-E6-His (PVH16) Preparación de extractos

Análisis en geles de SDS-poliacrilamida teñidos con Coomasie y transferencias Western

Después de la centrifugación de los extractos descrita anteriormente, se analizaron alícuotas de sobrenadante y sedimento mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y transferencia Western.

Se visualizó una banda mayoritaria de aproximadamente 32 kDa, localizada en la fracción de sedimento, mediante geles teñidos con Coomasie y se identificó en transferencias Western mediante anticuerpo policlonal de conejo anti-proteína D y conjugado Ni-NTA acoplado con fosfatasa alcalina intestinal bovina (nº de catálogo Qiagen 34510), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel de expresión representa aproximadamente un 5% de la proteína total.

5. Coexpresión con tioredoxina

De forma análoga a la expresión de la prot D1/3-E7-His de PVH18 (ejemplo XIII), se transformó una cepa AR58 de E. coli con un plásmido que codifica tioredoxina y proteína D1/3-E7-His (PVH16).

Ejemplo V Purificación de prot D1/3-E6-His (PVH16)

Se expresó antígeno recombinante prot D1/3-E6 de PVH16 en E. coli (AR58). La estrategia de expresión incluía la fusión de E6 con la porción del tercio N-terminal de la proteína D de Haemophilus influenzae, un asociado de fusión inmunlógico que proporciona epítopos de células T auxiliares. Se insertó por ingeniería genérica una cola de afinidad de polihistidina en la terminación carboxi de la proteína de fusión. Se sobreexpresó el antígeno recombinante en E. coli en forma de proteínas insolubles.

La solubilización del antígeno requirió agentes desnaturalizantes. En ausencia de agente desnaturalizante, precipitó prot D1/3-E6-His a pH neutro. Para evitar los problemas de solubilidad, se llevó a cabo la coexpresión de estas proteínas con tioredoxina en trans (TIT), un asociado de plegamiento.

Las expresiones bacterianas se realizan en medio LB en presencia de 0,05 mg/ml de canamicina a 30ºC más 0,2 mg/ml de ampicilina cuando se coexpresa la tioredoxina. La expresión de proteína recombinante se induce térmicamente transfiriendo las células a 42ºC cuando se alcanza una densidad óptica celular (DO_{600 nm}) de 0,4. La expresión de proteína se mantiene durante 4 horas. La purificación se llevó a cabo según el siguiente protocolo.

Sedimento de cultivo celular: DO_{600}60 Pefabloc 1 mM, NaCl 2 M, PBS, pH 7,4 (tampón A)

Disruptor de prensa French: Tres pasadas 138 Mpa

Centrifugación: 17.000 g, 30 min, 4ºC

Lavados de sedimento: NaCl 2 M, PBS, pH 7,5 (tampón B) x 1 PBS pH 7,4 (tampón C) \hskip1.6cm x 2

Centrifugación: 17.000 g, 30 min, 4ºC

Solubilización de sedimento: cloruro de guanidina 6 M, PO4 20 mM, pH 7,0 (tampón D), durante una noche a 4ºC

Centrifugación: 17.000 g, 30 min, 4ºC

Sobrenadante en IMAC: Equilibrado: Cloruro de guanidina 6 M, PO4 20 mM, pH 7,0 (Tampón D). Elución: etapas de imidazol (0,025 M, 0,1 M, 0,5 M) en urea 8 M, PO4 20 mM, pH 7,0

Polimixina Affiprep: Urea 8 M, PO4 20 mM, pH 7,0 (tampón E) 2 h a TA

\newpage

Diálisis: Urea 4 M, arginina 0,5 M, NaCl 150 mM, PO4 10 mM, pH 6,8 (tampón I) Urea 2 M, arginina 0,5 M, NaCl 150 mM, PO4 10 mM, pH 6,8 (tampón J) Urea 0 M, arginina 0,5 M, NaCl 150 mM, PO4 10 mM, pH 6,8 (tampón K)

Las células se rompen eficazmente mediante homogeneización a alta presión utilizando un dispositivo de celda a presión French. Se extrae el antígeno con alta concentración de desnaturalizante proteico. Esta primera etapa abre la pared de la célula bacteriana y extrae dicho antígeno de la fracción bacteriana insoluble. Se llevó a cabo la siguiente purificación en un cultivo de 4 l.

Tampones

A. PBS/NaCl 2 M/Pefabloc 1 mM

B. PBS/NaCl 2 M

C. PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, NaH_{2}PO_{4} 8,1 mM, KH_{2}PO_{4} 1,47 mM, pH 7,4

D: cloruro de guanidina 6 M, PO4 20 mM (NaH_{2}PO_{4} (2H_{2}O)/K_{2}HPO_{4} (3H_{2}O)), pH 7,0

El material de partida es 10 matraces de 400 ml de cultivo cada uno.

Se suspende la pasta celular a DO_{600} 60 en tampón A (240 ml de tampón A en este caso), antes de la lisis celular mediante tres pasadas a través de un disruptor de prensa French (138 MPa). Se sedimentan las células lisadas durante 30 min a 15.000 g a 4ºC. Se lava una vez el sedimento de células bacterianas que contiene la proteína recombinante con 240 ml de tampón B, después dos veces con 240 ml de tampón C.

Se solubiliza la prot D-E6-His (TIT) mediante 240 ml de tampón D durante una noche a 4ºC en una rueda giratoria. Se sedimentan los residuos celulares durante 30 min a 15.000 g a 4ºC. Se almacena el sobrenadante (230 ml) a -20ºC. Se somete después el material a cromatografía IMAC.

Se une el ligando quelante NTA (ácido nitrilotriacético) a un soporte de agarosa (Qiagen). Se carga el ligando NTA con ión metálico níquel, con el que interacciona a través de 4 de los 6 sitios de coordinación del níquel. Los dos sitios de coordinación restantes del níquel interaccionan fuertemente con los residuos de histidina de la proteína marcada con 6 His. Se consigue la elución mediante competición con imidazol, que se une a Ni-NTA y desplaza al antígeno marcado.

Se utilizó agarosa Ni-NTA Qiagen (número de catálogo: 30250).

Soluciones

E: urea 8 M, PO4 20 mM (NaH_{2}PO_{4} (2H_{2}O)/K_{2}HPO_{4} (3H_{2}O)), pH 7,0

F: E + imidazol 0,025 M

G: E + imidazol 0,1 M

H: E + imidazol 0,5 M

NaOH 0,5 M

Agua desionizada

NaN_{3} al 0,02%

Purificación

a) Se empaqueta la resina (15 ml de resina/230 ml de muestra) y se equilibra en 10 volúmenes de columna (VC) de tampón D a 15 cm h^{-1}.

b) Se inyecta el sobrenadante de la fracción solubilizada en la columna a 15 cm h^{-1}.

c) Se lava la columna a 15 cm h^{-1} con tampón D hasta que la DO280 nm vuelve a la línea base.

d) Se lava la columna con 2 VC de tampón E a 15 cm h^{-1}. Se recupera la fracción de lavado.

e) Se eluye primero la columna con 5 VC de tampón F. Se elimina el contaminante mayoritario de 25 kDa.

f) Se eluye después la columna con 2 VC de tampón G.

g) Se eluye finalmente la columna con 3 VC de tampón H. Elución del antígeno.

Se combinan las fracciones positivas de antígeno (30 ml).

Se retira la endotoxina mediante cromatografía Affiprep.

El soporte de polimixina Affi-Prep® consiste en polimixina B de pureza USP acoplada a la matriz Affi-Prep®. Debido a su alta afinidad por el resto de lípido A de las endotoxinas, la polimixina B se une a moléculas de endotoxina con alta capacidad y selectividad.

Soluciones

E: Urea 8 M, PO4 20 mM (NaH_{2}PO_{4} (2H_{2}O)/K_{2}HPO_{4} (3H_{2}O)), pH 7,0 (apirogénico)

NaOH 0,5 M

Agua apirogénica desionizada

Procedimiento

1) Se lava la resina de polimixina Affi-Prep® en 10 volúmenes de NaOH 0,1 M, seguido de 10 volúmenes de agua exenta de pirógenos.

2) Se equilibra la resina en 10 volúmenes de tampón E.

3) Se incuban 15 ml (media combinación) de muestra eluida de IMAC con 3 ml de resina polimixina Affi-Prep® en modo por cargas.

4) Se prosigue la incubación durante 4 horas a temperatura ambiente o durante una noche a 4ºC en una rueda giratoria.

5) Se centrifuga la muestra durante 10 min a 2000 g (Beckman GS-6R).

6) Se recoge el sobrenadante que contiene el antígeno y se somete a ensayos de endotoxinas y proteínas.

7) Se desecha la resina.

Las moléculas pequeñas se difunden a través de una membrana semipermeable, mientras que las moléculas grandes se retienen. El proceso de diálisis es impulsado por la diferencia de concentración de los solutos en los dos lados de la membrana. Se introduce nueva solución tampón hasta que se iguala la composición de tampón en cada lado.

Tampones

I: Urea 4 M, arginina 0,5 M, NaCl 0,15 M, PO4 10mM (NaH_{2}PO_{4} (2H_{2}O)/K_{2}HPO_{4} (3H_{2}O)), pH 6,8

J: Urea 2 M, arginina 0,5 M, NaCl 0,15 M, PO4 10 mM (NaH_{2}PO_{4} (2H_{2}O)/K_{2}HPO_{4} (3H_{2}O)), pH 6,8

K: Urea 0 M, arginina 0,5 M, NaCl 0,15 M, PO4 10 mM (NaH_{2}PO_{4} (2H_{2}O)/K_{2}HPO_{4} (3H_{2}O)), pH 6,8.

1) se introduce la muestra (15 ml) en un tubo de diálisis (20,4 mm de diámetro y 6 cm de altura),

2) se dispone el tubo de diálisis en un cilindro de 2 litros que contiene tampón I con agitación a 4ºC durante 2 horas,

3) se dispone el tubo de diálisis en un cilindro de 2 litros (con agitación) que contiene tampón J a 4ºC durante 2 horas,

4) se dispone el tubo de diálisis en un cilindro de 2 litros que contiene tampón K (con agitación) a 4ºC durante una noche. Se cambia el tampón y se prosigue la diálisis 2 horas más a 4ºC.

Millipore Sterile Millex-GV 0,22 \mum, 13 mm. Número de catálogo: SLGV1030S.

Se realizan todas las etapas a temperatura ambiente (TA 22ºC), el antígeno parece estable.

Se filtra la solución de antígeno a través de un filtro de 0,2 \mum para evitar cualquier crecimiento bacteriano. Se mantiene el antígeno a -20ºC en viales Nunc.

Caracterización

La proteína D1/3-E6-His se caracteriza de la manera siguiente:

La proteína D1/3-E6-His es un péptido de 273 aminoácidos de longitud con 112 aminoácidos que proceden de la parte de proteína D. La proteína D1/3-E6-His tiene un peso molecular medio teórico de 32 kDa y migra en SDS-PAGE en forma de una proteína de 33 kDa. El punto isoeléctrico teórico de la proteína D1/3-E6-His es 8,17.

La proteína viral E6 es una proteína básica que contiene 14 residuos de cisteína, ocho de ellos (Cys 30, 33, 63, 66 y Cys 103, 106, 136, 139) están implicados en dos motivos de unión a cinc C-terminales.

La proteína D1/3-E6-His se expresa en forma de proteína insoluble en la cepa AR58 de E. coli con tioredoxina en trans, un asociado de plegamiento. El cultivo celular se produce en un matraz de 400 ml.

Se obtienen 5,4 mg de proteína pura al 95% por litro de cultivo.

Ejemplo VI Construcción de una cepa de E. coli que expresa la fusión proteína D1/3-E6E7-His/PVH16 1. Construcción del plásmido de expresión

a) El plásmido pMG MCS prot D1/3 (=pRIT14589) es un derivado de pMG81 (descrito anteriormente) en el que los codones 4-81 de la región de codificación de NS1 de la gripe se reemplazaron por los codones correspondientes a los residuos Ser20\rightarrowThr127 de proteína D madura de Haemophilus influenzae cepa 772, biotipo 2 (H. Janson et al., Infection and Immunity, enero. pág. 119-125). La secuencia de prot-D1/3 es seguida por un sitio múltiple de clonación (11 residuos) y una región de codificación de una cola de histidina C-terminal (6 His). Este plásmido se utiliza para expresar la fusión proteína D1/3-E6E7-His.

b) las secuencias E6 y E7 de PVH genómico de tipo PVH16 (Seedorf et al., Virology 1985, 145, pág. 181-185) se amplificaron del genoma de PVH16 completo clonado en pBR322 (obtenido del Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum für human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg) y se subclonaron en pUC19 proporcionando TCA 301 (=pRT14462).

c) Se modificaron las secuencias de codificación de E6 y E7 en TCA301 (=pRIT14462) con un adaptador de oligonucleótidos sintéticos (insertado entre los sitios Afl III y Nsi I), introduciendo una deleción de 5 nucleótidos entre los genes E6 y E7 para retirar el codón de paro de E6 y crear secuencias de codificación de E6 y E7 condensadas en el plásmido TCA309 (=pRIT14556), véase la figura 4.

Construcción del plásmido TCA 311 (=pRIT14512): un plásmido que expresa la fusión proteína D1/3-E6E7-His/PVH16

Se amplifican las secuencias nucleotídicas correspondientes a los aminoácidos 1\rightarrow249 de la proteína condensada E6E7 de pRIT14556. Durante la reacción en cadena con polimerasa, se generaron sitios de restricción NcoI y SpeI en los extremos 5' y 3' de las secuencias de E6E7, permitiendo la inserción en los mismos sitios del plásmido pMGMCS prot D/13, proporcionando el plásmido TCA 311 (=pRIT14512) (véase la figura 5). Se secuenció el inserto para verificar que no se había generado ninguna modificación durante la reacción en cadena con polimerasa. La secuencia de codificación para la fusión proteína D1/3-His se describe en la figura 6.

2. Transformación de la cepa AR58

Se introdujo el plásmido pRIT14512 en AR58 de E. coli (Mott et al., 1985, Prot. Natl. Acad. Sci. , 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un represor termosensible del promotor pL \lambda.

3. Crecimiento e inducción de cepas bacterianas - expresión de prot D1/3-E6E7-His

Se hicieron crecer células AR58 transformadas con el plásmido pRIT14512 en 100 ml de medio LB suplementado con 50 \mug/ml de canamicina a 30ºC. Durante la fase de crecimiento logarítmico, las bacterias se cambiaron a 39ºC para inactivar el represor \lambda y activar la síntesis de proteína D1/3-E6E7-His. La incubación a 39ºC se continuó durante 4 horas. Se sedimentaron las bacterias y se almacenaron a -20ºC.

4. Caracterización de la fusión proteína D1/3-E6E7-His

\newpage

Después de la centrifugación de los extractos descrita anteriormente, se analizaron las alícuotas de sobrenadante y sedimento mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y transferencia Western.

Se visualizó una banda mayoritaria de aproximadamente 48 kDa, localizada en la fracción de sedimento, mediante geles teñidos con Coomasie y se identificó en transferencias Western mediante anticuerpo policlonal de conejo anti-proteína D y mediante conjugado Ni-NTA acoplado a fosfatasa alcalina intestinal bovina (nº de catálogo Qiagen 34510), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel de expresión representa aproximadamente un 1% de la proteína total.

Ejemplo VIb

De forma análoga, se expresó la proteína de fusión lipo D1/3-E6E7 de PVH16 en E. coli en presencia de tioredoxina.

La terminación N de la preproteína (388 aa) contiene residuos de MDP seguidos de 16 aminoácidos del péptido señal de lipoproteína D (de Haemophilus influenzae), que se escinden in vivo proporcionando la proteína madura (370 aa). La porción de lipoproteína (aa 1 a 127) es seguida por las proteínas E6 y E7 condensadas. La terminación C de la proteína se prolonga con TDGHHHHHH.

Se purificó la proteína mediante el siguiente protocolo:

Ejemplo VII Purificación de lipopoteína D1/3-E6E7-His (TIT) A) Solubilización

Se suspende pasta celular a DO_{600} 60 en NaCl 2 M, fosfato 20 mM (NaH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4}), pH 7,5 en presencia de Pefabloc 1 mM como inhibidor de proteasa antes de la lisis celular mediante tres pasadas a través de un disruptor de prensa French (138 MPa). Las células lisadas se sedimentan durante 30 min a 15.000 g a 4ºC. Para reducir el nivel de endotoxina, se lava el sedimento celular bacteriano que contiene la proteína recombinante dos veces con urea 4 M, NaCl 2 M, fosfato 20 mM, pH 7,5, una vez con 2% de Emphigen BB, fosfato 20 mM, pH 7,5 y finalmente dos veces con tampón fosfato 20 mM a pH 7,0 para eliminar las trazas de detergente (cada lavado se realiza en el mismo volumen utilizado para la suspensión celular). Se solubiliza la lipoprot. D1/3-E6E7-His (TIT) (en el mismo volumen utilizado para la suspensión celular) mediante urea 8 M en \beta-mercaptoetanol 0,2 M (=\beta-MeOH), PO4 20 mM, pH 12 durante una noche a 4ºC, seguido de una incubación de dos horas a TA frente al mismo tampón. Se sedimentan los residuos celulares durante 30 min a 15.000 g a 4ºC. Se mantiene el sobrenadante a -20ºC.

B) Purificación 1) Cromatografía de intercambio aniónico en Q-Sepharose de flujo rápido

Se descongelan 225 ml de muestra congelada a temperatura ambiente en un baño de agua fría y se aplican a una columna de Q-Sepharose de flujo rápido (Pharmacia, XK 26/20) preequilibrada con urea 8 M, \betaMeOH 0,2 M, PO4 20 mM, pH 12 (30 ml resina/225 ml sobrenadante) a 45 cm/h. Se lava la columna con urea 8 M, \betaMeOH 0,2 M, PO4 20 mM, pH 12, hasta que la DO280 alcanza la línea base, seguido de un segundo lavado en urea 8 M, fosfato 20 mM, pH 12 (en 2 volúmenes de columna). La elución se realiza con etapas de NaCl (NaCl 0,1 M, 0,25 M, 0,5 M, cada etapa en aproximadamente 2 volúmenes de columna) en urea 8 M, fosfato 20 mM, pH 12, a 45 cm/h. Se combinan las fracciones eluidas de NaCl 0,5 M.

2) Cromatografía de afinidad de ión metálico (IMAC)

Se combinan las fracciones eluidas de NaCl 0,5 M de la etapa de Q-Sepharose y se dializan frente a NaCl 0,2 M, urea 8 M, fosfato 20 mM, pH 10 antes de cargarlas en una columna de Ni2+NTA (Qiagen) (XK 26/20, Pharmacia) preequilibrada con urea 8 M, PO4 20 mM, pH 12 (30 ml resina/61 ml muestra) a 5,6 cm/h. Se lava la columna con urea 8 M, PO4 20 mM, pH 12 hasta que se alcanza la línea base y después con urea 8 M, PO4 20 mM, pH 10. Se eluye el antígeno mediante etapas de imidazol (imidazol 0,025 M, 0,05 M, 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,5 M, cada etapa en dos volúmenes de columna) en urea 8 M, PO4 20 mM, pH 10 a 45 cm/h. Se combinan las fracciones eluidas de imidazol 0,05 M.

C) Concentración

Se concentra la muestra de IMAC aproximadamente 5 veces (hasta 0,407 mg/ml) en una membrana Filtron Omega de 5 kDa en una celda agitada de AMICON a TA.

D) Diálisis

Se dializa la muestra concentrada a TA frente a etapas de concentración decreciente de urea (urea 4 M, 2 M) en arginina 0,5 M, NaCl 150 mM, PO4 10 mM, pH 6,8. La última diálisis frente a arginina 0,5 M, NaCl 150 mM, PO4 10 mM, pH 6,8 se realiza a 4ºC.

Resultados

La etapa de IMAC es capaz de eliminar un contaminante de 32 kDa a imidazol 0,025 M, que eluyó también con algo de antígeno. El antígeno eluido con imidazol 0,05 M se estima puro al 90% por tinción con azul de Coomasie de SDS-PAGE. Después de estas dos etapas de purificación, la muestra está exenta de contaminantes de E. coli. El análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos específicos de antígeno de terminación N y/o C muestra un patrón heterogéneo de bandas con PM mayor y menor que la proteína completa. Este patrón sugiere la presencia de agregados y proteína procesada incompletamente y/o degradada, copurificados con la proteína completa.

Ejemplo VIII Construcción de cepa B1002 de E. coli que expresa la fusión protD1/3-E7 mutada (cys24\rightarrowgly,glu26\rightarrowgln) de tipo PVH16 1) Construcción del plásmido de expresión Material de partida

a)- Plásmido pRIT14501 (=TCA 308) que codifica la fusión protD1/3-E7-His

b)- Plásmido LITMUS 28 (New England Biolabs, nº de cat. 306-28), un vector de clonación derivado de pUC.

c)- Plásmido pMG MCS ProtD1/3 (pRIT14589), un derivado de pMG81 (descrito anteriormente) en el que los codones 4-81 de la región de codificación de NS1 de la gripe se reemplazaron por los codones correspondientes a los residuos Ser20\rightarrowThr127 de la proteína D madura de Haemophilus influenzae cepa 772, biotipo 2 (H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, enero. pág. 119-125). La secuencia de Prot-D1/3 es seguida por un sitio de clonación múltiple (11 residuos) y una región de codificación para una cola de histidina C-terminal (6 His).

Construcción del plásmido pRIT14733 (=TCA347): un plásmido que expresa la fusión proteína D1/3-E7 mutada (cys24\rightarrowgly,glu26\rightarrowgln) con cola de His

Se subclonó el fragmento NcoI-XbaI de pRIT14501 (=TCA 308) que porta la secuencia de codificación del gen E7 de PVH16, prolongada con una cola de His, en un vector intermedio Litmus 28 útil para mutagénesis, proporcionando pRIT14909 (=TCA337). Se eligieron dobles mutaciones cys24\rightarrowgly (Edmonds y Vousden, J. Virology 63: 2650 (1989) y glu26\rightarrowgln (Phelps et al., J. Virology 66: 2418-2427 (1992) para deteriorar la unión al producto antioncogénico del gen de retinoblastoma (pRB). La introducción de mutaciones en el gen E7 se realizó con el kit "Quick Change Site directed Mutagenesis" (nº de cat. Stratagene 200518), proporcionando el plásmido pRIT14681 (=TCA 343). Después de la verificación de la presencia de mutaciones y de la integridad del gen E7 completo mediante secuenciación, se introdujo el gen E7 mutado en el vector pRIT14589 (=pMG MCS prot D1/3), proporcionando el plásmido pRIT14733 (=TA 347) (Figura 7).

La secuencia para la fusión proteína D1/3-E7 mutada (cys24\rightarrowgly,glu26\rightarrowgln)-His se describe en la figura 8.

2) Construcción de la cepa B1002 que expresa prot D1/3-E7 mutada (cys24\rightarrowgly,glu26\rightarrowgln)-His/PVH16

Se introdujo el plásmido pRIT14733 en AR58 de E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un represor termosensible del promotor pL \lambda, proporcionando la cepa B1002, mediante selección de transformantes resistentes a la canamicina.

3) Crecimiento e inducción de la cepa bacteriana B1002 - expresión de protD1/3-E7 mutada (cys24\rightarrowgly,glu26\rightarrowgln)-His/PVH16

Se hicieron crecer células AR58 transformadas con plásmido pRIT14733 (cepa B1002) a 30ºC en 100 ml de medio LB suplementado con 50 \mug/ml de canamicina. Durante la fase de crecimiento logarítmico, las bacterias se cambiaron a 39ºC para inactivar el represor \lambda y activar la síntesis de proteína D1/3-E7 mutada-His/PVH16. La incubación a 39ºC se continuó durante 4 horas. Las bacterias se sedimentaron y se congelaron a -20ºC.

4) Caracterización de la fusión proteína D1/3-E7 mut (cys24\rightarrowgly,glu26\rightarrowgln)-His de tipo PVH16

Se descongelaron células congeladas y se resuspendieron en 10 ml de tampón PBS. Se lisaron las células en una prensa French de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres pasadas). Se centrifugó el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a 4ºC.

Después de la centrifugación de los extractos descrita anteriormente, se analizaron alícuotas de sobrenadante y sedimento mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y transferencia Western. Se visualizó una banda mayoritaria de aproximadamente 33 kDa, localizada en la fracción de sedimento, mediante geles teñidos con Coomasie, y se identificó en transferencias Western mediante anticuerpo policlonal de conejo 22J 70 anti-proteína D, mediante anticuerpo monoclonal anti-E7/PVH16 de Zymed y mediante conjugado Ni-NTA acoplado a fosfatasa alcalina intestinal bovina (nº de cat. Qiagen 34510), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel de expresión representa aproximadamente 3 a 5% de la proteína total.

Se separaron las células B1002 del caldo de cultivo mediante centrifugación. Las células B1002 concentradas se almacenaron a -65ºC.

Ejemplo IX Purificación de prot D1/3-E7 (Dmutante) PVH16

1

a) Preparación de suspensión celular

Se descongelaron células B1002 concentradas congeladas y se resuspendieron en un tampón de disrupción celular a +4ºC (véase la Tabla 1) hasta una densidad óptica final DO_{650} de 60 (correspondiente a una concentración celular de aproximadamente 25 g de DCW l^{-1}).

b) Disrupción celular

Se rompieron las células mediante dos pasadas a 1000 bar a través de un homogeneizador a alta presión (Rannie). Se recogió la suspensión de células rotas en un matraz mantenido a 4ºC.

Tampón de disrupción celular: Na_{2}HPO_{4} (0,02 N), NaCl (2 M) pH ajustado a 7,5 con HCl 3 N (Merck).

Purificación 2a) Filtración en membrana dinámica (DMF®-PALL FILTRON)

Se cargan 2 l de suspensión de células rotas (DO 60) en el DMF®, un sistema de filtración dinámica de PALL equipado con una membrana de corte de 0,2 \mum.

La concentración de 2 l a 1 l proporciona la muestra PCC1,

el lavado a volumen constante con 3 volúmenes (3 l) de tampón Empigen-EDTA (concentración de EDTA 1,86 g, Empigen (al 30%) 3,33 ml, PO_{4}^{3-} 0,5 M, 40,00 ml) proporcionó la muestra PD1,

la concentración de 1 l a 300 ml proporcionó la muestra PCC2,

el lavado a volumen constante con 10 volúmenes (3 l) de tampón Empigen (concentración en l^{-1}: Empigen al 30%, 3,33 ml, PO_{4}^{3-} 0,5 M, 40 ml), pH 7,5, proporcionó la muestra PD2,

solubilización de la proteína mediante la adición del mismo volumen (300 ml) de tampón clorhidrato de guanidina 8 M (concentración en l^{-1} de Gu\cdotHCl 764 g; Empigen al 30%, 3,33 ml, PO_{4}^{3-} 0,5 M, 40 ml), pH 7,5,

recuperación de la proteína: recogida del permeado, muestra P3, durante la concentración al volumen inicial (300 ml) y

diafiltración con 3 volúmenes de tampón de clorhidrato de guanidina 4 M (concentración en l^{-1}: Gu\cdotHCl 328,12 g, Empigen (30%), 3,33 ml de PO_{4}^{3-} 0,5 M, 40,00 ml) pH 7,5.

Todas estas etapas se realizan en una sala fría (2-8ºC), con el pH ajustado con PO_{4}^{3-} 0,5 M.

La fracción P3 se almacena a -20ºC esperando a la siguiente etapa de purificación.

2b) Cromatografía en Sepharose quelante de Zn

Se descongela la fracción P3 y se inyecta en una columna de Sepharose FFF quelante de Zn empaquetada y equilibrada.

Después de ello, la columna

se lava con aproximadamente 3 volúmenes de tampón de clorhidrato de guanidina 4 M (véase anteriormente), muestra Zn-FT,

se lava con aproximadamente 5 volúmenes de tampón de urea 4 M (concentración en l^{-1}: urea 240,24 g, empigen 3,33 ml, PO_{4}^{3-} 0,5 M, 40,00 ml), muestra Zn-W,

se eluye con aproximadamente 3 volúmenes de tampón de urea 4 M-imidazol 20 mM (concentración en l^{-1}:urea 240,24 g, Empigen (al 30%) 3,33 ml, imidazol (1,36 g), PO_{4}^{3-} 0,5 M, 40,00 ml, pH 7,5) como anteriormente, pero la concentración en l^{-1} de imidazol es de 34,04 g, muestra Zn-20,

se eluye con urea 4 M-imidazol 500 mM hasta el final del pico UV, muestra Zn-500

se lava la columna con EDTA 50 mM y NaOH 0,5 M. Se almacena el eluido de Sepharose quelante de Zn (Zn-500) a entre 2-8ºC antes de la siguiente etapa de purificación.

Las operaciones de cromatografía en Sepharose quelante de Zn se llevan a cabo a temperatura ambiente.

2c) Cromatografía en Q-Sepharose

Se inyecta la fracción Zn-500 en una columna de Q-Sepharose FF empaquetada y equilibrada.

Después de ello, la columna

se lava con aproximadamente 7 volúmenes de tampón de urea 4 M sin Empigen (concentración en l^{-1}: urea 240,24 g, PO_{4}^{3-} 0,5 M, 40,00 ml), muestra QS-W1,

se lava con aproximadamente 10 volúmenes de tampón de urea 6 M sin Empigen (urea 360,36 g/l), muestra QS-W2,

se eluye con aproximadamente 5 volúmenes de tampón de urea 6 M-NaCl 200 mM (concentración en l^{-1}: urea 360,36 g, NaCl 11,69 g, 40,00 ml de PO_{4}^{3-},

se eluye con aproximadamente 3 volúmenes de tampón de urea 6 M-NaCl 500 mM (como anteriormente, pero con NaCl 29,22 g/l). Se determina el final exacto de la fracción mediante el final del pico UV, muestra QS-500,

se eluye con 4 volúmenes de tampón de urea 4 M-NaCl 1 M (concentración en l^{-1}: urea 360,36, NaCl 58,44, 40,00 ml de PO_{4}^{3-} (0,5), muestra QS-1M,

la columna se lava después con NaOH 0,5 M,

se almacena el eluido de QS-Sepharose (QS-500) a entre 2-8ºC antes de la siguiente etapa de purificación.

Las etapas de cromatografía en Q-Sepharose se llevan a cabo a temperatura ambiente.

2d) Ultrafiltración

Se trata después la fracción QS-500 en una unidad de ultrafiltración de 10 kDa (Ultrasette-Pall Filtron).

Se concentra primero el producto aproximadamente a 1 mg/ml de proteína y después se diafiltra de nuevo frente a 10 volúmenes de tampón fosfato.

Se desecha el permeado (fracción UF-P) y se almacena el retenido (fracción UF-R) a 2-8ºC esperando la filtración final.

Las operaciones de ultrafiltración se llevan a cabo a 2-8ºC.

2e) Filtración final

Se filtra el producto bruto final (fracción UF-R) a través de un filtro estéril de 0,22 \mum (Millipak-Millipore) a flujo laminar y en una sala aséptica de clase 100. La concentración final está entre 0,5 y 1,0 \mug/ml. El producto bruto estéril se almacena a -20ºC.

Ejemplo comparativo X

Construcción de una cepa de E. coli que expresa la fusión clyta-E6-his (PVH16) 1. Construcción del plásmido de expresión

a) Plásmido pRIT14497 (=TCA 307) que codifica la fusión prot D1/3-E6-His/PVH16

b) Plásmido pRIT14661 (=DVA2), un vector intermedio que contiene la secuencia de codificación de los 117 codones C-terminales de LytA de Streptococcus pneumoniae. Lyta deriva de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alaninamidasa, la amidasa LYTA (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986), pág. 265-272}, una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en la cadena principal de peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad por la colina o algunos análogos de la colina tales como
DEAE.

1b. Construcción del plásmido pRIT14634 (=TCA332): un plásmido que expresa la fusión clyta-E6-His/PVH16

a) La primera etapa fue la purificación del fragmento de restricción grande NcoI-AflII del plásmido pRIT14497 y la purificación del fragmento de restricción pequeño AflII-AflII de pRIT14661.

b) La segunda etapa fue la unión de las secuencias de clyta a las secuencias de E7-His (NcoI y AflII son sitios de restricción compatibles), que dio lugar al plásmido pRIT14634 (=TCA332), que codifica la proteína de fusión clyta-E6-His bajo el control del promotor pL (véase la figura 9).

La secuencia de codificación para la proteína de fusión clyta-E6-His se describe en la figura 10.

Transformación de la cepa AR58

Se introdujo el plásmido pRIT14634 en AR58 de E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un represor termosensible del promotor pL \lambda.

Crecimiento e inducción de la cepa bacteriana - expresión de clyta-E6-His

Se hicieron crecer células AR58 transformadas con plásmido pRIT14634 en 100 ml de medio LB suplementado con 50 \mug/ml de canamicina a 30ºC. Durante la fase de crecimiento logarítmico, las bacterias se cambiaron a 39ºC para inactivar el represor ë y activar la síntesis de proteína clyta-E6-His. La incubación a 39ºC se continuó durante 4 horas. Las bacterias se sedimentaron y almacenaron a -20ºC.

4. Caracterización de la fusión clyta-E6-His

Se descongelaron células congeladas y se resuspendieron en 10 ml de tampón PBS. Se rompieron las células en una prensa French de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres pasadas). Se centrifugó el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a 4ºC. Después de la centrifugación de los extractos descrita anteriormente, se analizaron alícuotas de sobrenadante y sedimento mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y transferencia Western. Se visualizó una banda mayoritaria de aproximadamente 33 kDa, localizada en la fracción de sedimento, mediante geles teñidos con Coomasie y se identificó en transferencias Western mediante anticuerpos policlonales de conejo anti-clyta y conjugado Ni-NTA acoplado a fosfatasa alcalina intestinal bovina (nº de cat. Qiagen 34510), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel de expresión representa aproximadamente un 3% de la proteína total.

Ejemplo comparativo XI

Construcción de una cepa de E. coli que expresa la fusión clyta-E7-his (PVH16) 1. Construcción del plásmido de expresión 1a. Materiales de partida

a) Plásmido pRIT14501 (=TCA 308) que codifica la fusión prot D1/3-E7-His/PVH16

b) Plásmido pRIT14661 (=DVA2), un vector intermedio que contiene la secuencia de codificación de los 117 codones C-terminales de LytA de Streptococcus pneumoniae.

1b. Construcción del plásmido pRIT14626 (=TCA 330): un plásmido que expresa la fusión clyta-E7-His/PVH16

a) La primera etapa fue la purificación del fragmento de restricción grande NcoI-AflII del plásmido pRIT14501 y la purificación del fragmento de restricción pequeño AflII-AflIII de pRIT14661.

b) La segunda etapa fue la unión de las secuencias de clyta a las secuencias de E7-His (NcoI y AflII son sitios de restricción compatibles), que dio lugar al plásmido pRIT14626 (=TCA330), que codifica la proteína de fusión clyta-E7-His bajo el control del promotor pL (figura 11).

La secuencia de codificación para la proteína de fusión clyta-E7-His se describe en la figura 12.

2. Transformación de la cepa AR58

Se introdujo el plásmido pRIT14626 en AR58 de E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un represor termosensible del promotor pL \lambda.

3. Crecimiento e inducción de la cepa bacteriana - expresión de clyta-E7-His

Se hicieron crecer células AR58 transformadas con plásmido pRIT14626 en 100 ml de medio LB suplementado con 50 \mug/ml de canamicina a 30ºC. Durante la fase de crecimiento logarítmico, las bacterias se cambiaron a 39ºC para inactivar el represor ë y activar la síntesis de proteína clyta-E7- His. La incubación a 39ºC se continuó durante 4 horas. Las bacterias se sedimentaron y almacenaron a -20ºC.

4. Caracterización de la fusión clyta-E7-His

Se descongelaron células congeladas y se resuspendieron en 10 ml de tampón PBS. Se rompieron las células en una prensa Frencha de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres pasadas). Se centrifugó el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a 4ºC. Después de la centrifugación de los extractos descrita anteriormente, se analizaron alícuotas de sobrenadante y sedimento mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y transferencia Western. Se visualizó una banda mayoritaria de aproximadamente 35 kDa, localizada en la fracción de sedimento, mediante geles teñidos con Coomasie y se identificó en transferencias Western mediante anticuerpos policlonales de conejo anti-clyta y conjugado Ni-NTA acoplado a fosfatasa alcalina intestinal bovina (nº de cat. Qiagen 34510), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel de expresión representa aproximadamente un 5% de la proteína total.

Ejemplo comparativo XII

Construcción de una cepa de E. coli que expresa la fusión clyta-E6E7-his (PVH16) 1. Construcción del plásmido de expresión 1a. Materiales de partida

a) Plásmido pRIT14512 (=TCA 311) que codifica la fusión prot D1/3-E6E7-His/PVH16

1b. Construcción del plásmido pRIT14629 (=TCA331): un plásmido que expresa la fusión clyta-E6E7-His/PVH16

a) La primera etapa fue la purificación del fragmento de restricción grande NcoI-AflII del plásmido pRIT14512 y la purificación del fragmento de restricción pequeño AflII-AfIlII de pRIT14661.

b) La segunda etapa fue la unión de las secuencias de clyta a las secuencias de E7-His (NcoI y AflII son sitios de restricción compatibles) que dio lugar al plásmido pRIT14629 (=TCA331), que codifica la proteína de fusión clyta-E6E7-His bajo el control del promotor pL (véase la figura 13).

La secuencia de codificación para la proteína de fusión clyta-E6E7-His se describe en la figura 14.

2. Transformación de la cepa AR58

Se introdujo el plásmido pRIT14629 en AR58 de E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un represor termosensible del promotor pL \lambda.

3. Crecimiento e inducción de la cepa bacteriana - expresión de clyta-E6E7-His

Se hicieron crecer células AR58 transformadas con plásmido pRIT14629 en 100 ml de medio LB suplementado con 50 \mug/ml de canamicina a 30ºC. Durante la fase de crecimiento logarítmico, las bacterias se cambiaron a 39ºC para inactivar el represor \lambda y activar la síntesis de proteína clyta-E7-His. La incubación a 39ºC se continuó durante 4 horas. Las bacterias se sedimentaron y almacenaron a -20ºC.

4. Caracterización de la fusión clyta-E6E7-His

Se descongelaron células congeladas y se resuspendieron en 10 ml de tampón PBS. Se rompieron las células en una prensa French de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres pasadas). Se centrifugó el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a 4ºC.

Se visualizó una banda mayoritaria de aproximadamente 48 kDa, localizada en la fracción de sedimento, mediante geles teñidos con Coomasie y se identificó en transferencias Western mediante anticuerpos policlonales de conejo anti-clyta y conjugado Ni-NTA acoplado a fosfatasa alcalina intestinal bovina (nº de cat. Qiagen 34510), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel de expresión representa aproximadamente un 1% de la proteína total.

Ejemplo XIII Prot D1/3-E7-His (PVH18) (B1011 de E. coli) Proteína D1/3-E7-his de PVH expresada con tioredoxina en trans (B1012 de E. coli) 1) Construcción de plásmidos de expresión 1)a. Construcción del plásmido TCA 316 (=pRIT14532), un plásmido que expresa la fusión proteína-D1/3-E7-His/PVH18 Materiales de partida

a) El plásmido pMG MCS prot D1/3 (=pRIT14589) es un derivado de pMG81 (descrito en la solicitud de patente del R.U. nº 9513261.9 publicada como WO 97/01640) en el que los codones 4-81 de la región de codificación de NS1 de la gripe se reemplazaron por los codones correspondientes a los residuos Ser20\rightarrowThr127 de proteína D madura de Haemophilus influenzae de cepa 772, biotipo 2 (H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, enero. pág. 119-125). La secuencia de prot D1/3 es seguida por un sitio de clonación múltiple (11 residuos) y una región de codificación de una cola de histidina C-terminal (6 His). Este plásmido se utiliza para expresar la proteína de fusión D1/3-E7-His.

b) Se amplificaron las secuencias E6 y E7 de PVH genómico del prototipo PVH18 (Cole et al., J. Mol. Biol. (1987) 193, 599-608) del genoma completo de PVH16 clonado en pBR322 (obtenido del Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum für human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg) y se subclonaron en pUC19 proporcionando TCA 302 (=pRT14467).

Construcción del plásmido TCA 316 (=pRIT14532)

Se amplificaron las secuencias nucleotídicas correspondientes a los aminoácidos 1\rightarrow105 de la proteína E7 de pRIT14467. Durante la reacción en cadena con polimerasa, se generaron sitios de restricción NcoI y SpeI en los extremos 5' y 3' de las secuencias de E7, permitiendo la inserción en los mismos sitios del plásmido pMGMCS prot D1/3, proporcionando el plásmido TCA 316 (=pRIT14532). Se secuenció el inserto y se identificó una modificación frente a la secuencia prototípica de E7/PVH18 en el gen E7 (nucleótido 128 G\rightarrowA) que generaba una sustitución de una glicina por un ácido glutámico (aa43 en E7, posición 156 en la proteína de fusión). La secuencia para la fusión proteína D1/3-E7-His/PVH18 se describe en la figura 16.

1)b. Construcción del plásmido TCA 313 (=pRIT14523): un plásmido que expresa tioredoxina Materiales de partida

a) Plásmido pBBR1MCS4 (Antoine R, y C. Locht, Mol. Microbiol. 1992, 6, 1785-1799; M.E. Kovach et al., Biotechniques 16, (5), 800-802), que es compatible con plásmidos que contienen orígenes de replicación ColE1 o P15a.

b) Plásmido pMG42 (descrito en el documento WO 93/04175) que contiene la secuencia del promotor pL del fago lambda.

c) Plásmido pTRX (Invitrogen, kit Thiofusion K350-01) que porta la secuencia de codificación de la tioreoxina seguida del terminador de la transcripción AspA.

Construcción del plásmido TCA 313 (=pRIT14523)

Se purificaron el fragmento EcoRI-NdeI de pMG42, que porta el promotor pL, y el fragmento NdeI-HindIII de pTRX, que porta la secuencia de codificación de la tioredoxina seguida por el terminador AspA, y se ligaron en los sitios EcoRI y HindIII del vector de plásmido pBBR1MCS4, proporcionando el plásmido TCA313 (=pRIT14523) (véase la figura 17).

Se describe la secuencia de la tioredoxina en la figura 18.

2) Transformación de la cepa AR58

2).a Para obtener la cepa B1011 que expresa la prot D1/3-E7-His/PVH18, se introdujo el plásmido pRIT14532 en AR58 de E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un represor termosensible del promotor pL \lambda, mediante selección de transformantes resistentes a la canamicina.

2).b Construcción de la cepa B1012 que expresa prot D1/3-E7-His/PVH18 y tioredoxina

Se introdujeron el plásmido pRIT14532 y pRIT14523 en AR58 de E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un represor termosensible del promotor pL \lambda, mediante doble selección de transformantes resistentes a canamicina y ampicilina.

3) Crecimiento e inducción de las cepas bacterianas B1011 y B1012 - expresión de la prot-D1/3-E7-His/PVH18 con y sin tioredoxina en trans

Se hicieron crecer células AR58 transformadas con plásmidos pRIT14532 (cepa B1011) y células AR58 transformadas con plásmidos PRIT14532 y pRIT14523 (cepa B1012) a 30ºC en 100 ml de medio LB suplementado con 50 \mug/ml de canamicina para la cepa B1011 y suplementado con 50 \mug/ml de canamicina y 100 \mug/ml de ampicilina para la cepa B1012. Durante la fase de crecimiento logarítmico, se cambiaron las bacterias a 39ºC para inactivar el represor ë y activar la síntesis de proteína D1/3-E7-His/PVH18 y tioredoxina. La incubación a 39ºC se continuó durante 4 horas. Las bacterias se sedimentaron y se almacenaron a -20ºC.

Caracterización de la fusión proteína D1/3-E7-his/PVH18 Preparación de extractos

La fusión prot D1/3-E7-His (aproximadamente 31 kDa) se visualizó mediante geles teñidos con Coomasie en la fracción de sedimento para la cepa B1011, se localizó parcialmente (al 30%) en la fracción de sobrenadante de la cepa B1012 y se identificó en transferencias Western mediante anticuerpo policlonal de conejo anti-proteína D y conjugado Ni-NTA acoplado a fosfatasa alcalina intestinal bovina (nº de cat. Qiagen nº 34510), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel de expresión representa aproximadamente 1-3% de proteína total mostrada en un gel de SDS-poliacrilamida teñido con Coomasie.

Para el extracto de la cepa B1012, se visualizó la tioredoxina (aproximadamente 12 kDa) mediante gel teñido con Coomasie en el sobrenadante, y se identificó en transferencias Western mediante anticuerpo monoclonal anti-tioredoxina (Invitrogen R920-25).

Purificación de prot D1/3-E7-his/PVH18

Se expresa prot D1/3-E7-His de PVH18 en la cepa AR58 de E. coli (como se describe anteriormente). Todas las etapas se realizan a temperatura ambiente (TA \approx 22ºC). Las proteínas se siguen mediante el control de la DO_{280 nm}. Entre las etapas, se mantienen las fracciones positivas de antígeno a -20ºC.

El antígeno purificado es estable durante una semana a -20ºC y a 4ºC (sin degradación), pero parece más susceptible de oxidación después de incubación a 37ºC.

d) Solubilidad

La solubilidad de la proteína depende del pH (véase a continuación) con una reducción de la solubilidad para pH < 7,4:

PBS pH 7,4	686 \mug/ml	100%
PBS pH 7,2	560 \mug/ml	81%
PBS pH 7,0	498 \mug/ml	72%
PBS pH 6,8	327 \mug/ml	48%

e) La proteína ProtD1/3-E7 de PVH18 está compuesta por 227 aminoácidos. Su peso molecular teórico es de 25,9 kDa, y su punto isoeléctrico teórico de 5,83. Migra aproximadamente a 31,5 kDa en SDS PAGE reductor.

Ejemplo XIV Purificación de proteína D1/3-E7 de PVH18 a) Solubilización

Se suspende la pasta celular a DO_{600}60 en NaCl 2 M, fosfato 20 mM (NaH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4}), pH 7,6 antes de la lisis celular mediante dos pasadas a través de un disruptor Rannie. Las células lisadas se sedimentan durante 30 minutos a 9.000 rpm en un rotor JA 10 a 4ºC. Para reducir el nivel de endotoxinas, se lava el sedimento de células bacterianas que contiene la proteína recombinante una vez en EDTA 5 mM, NaCl 2 mM, PBS, pH 7,4; una vez en urea 4 M, fosfato 20 mM, pH 7,4 y finalmente una vez en PBS, pH 7,4 para eliminar las trazas de EDTA (cada lavado se realiza en el doble del volumen utilizado para la suspensión celular). Se solubiliza la prot D1/3-E7-His de PVH18 (TIT para tioredosina en trans) (en el mismo volumen utilizado para la suspensión celular) con cloruro de guanidina 6 M, PO4 50 mM, a pH 7,6 durante una noche a 4ºC. Se sedimentan los residuos celulares durante 30 minutos a 9.000 rpm en un rotor JA 10 a 4ºC. Se suplementa el sobrenadante con 0,5% de Empigen BB y es incuba durante 30 minutos a TA.

b) Purificación 1)a. Cromatografía de afinidad de metal inmovilizado

Se cargan 125 ml de muestra en una columna de Sepharose FF quelante de Zn (XK 26/20, Pharmacia; 50 ml gel/125 ml de solubilización) preequilibrada con 0,5% de Empigen BB, cloruro de guanidina 6 M, PO4 50 mM, pH 7,6 a 4 ml/min. Se lava la columna con cloruro de guanidina 6 M, PO4 50 mM, pH 7,6 hasta alcanzar la línea base, y después con urea 6 M, NaCl 0,5 M, PO4 50 mM, pH 7,6. Se eluye el antígeno con imidazol 0,25 M en urea 6 M, NaCl 0,5 M, PO4 50 mM, pH 7,6 a 2 ml/min (Fig. 1B). La muestra eluida de IMAC se dializa a 4ºC frente a PBS a pH 7,4.

1)b. Polimixina Affi-Prep® (Bio-Rad)

Para reducir el nivel de endotoxina, se incuban 28 mg (37 ml) de antígeno en modo de cargas con 2 ml de resina polimixina Affiprep preequilibrada con PBS a pH 7,4 durante una noche a temperatura ambiente. La recuperación de proteína se estima en un 60% y el contenido de endotoxinas se reduce 6,5 veces.

1)c. Análisis

El antígeno purificado analizado en SDS-PAGE reductor presenta una banda mayoritaria a 30 kDa con una segunda banda a 55 kDa, después de tinción con azul de Coomasie o plata. En un SDS-PAGE no reductor, la prot D1/3-E7-His de PVH18 aparece principalmente como una mancha con peso molecular = 175 kDa. Sin embargo, esta oxidación puede invertirse mediante la adición de \beta-mercaptoetanol 5 mM. Este patrón se confirma mediante análisis de transferencia Western anti-protD o anti-His.

c) Estabilidad

d) Solubilidad

La solubilidad de la proteína depende del pH (véase a continuación) con una reducción de la solubilidad para pH < 7,4.

La proteína prot D1/3-E7-His de PVH18 está compuesta por 227 aminoácidos. Su peso molecular teórico es de 25,9 kDa. Migra aproximadamente a 31,5 kDa en SDS-PAGE reductor. El punto isoeléctrico teórico es 5,83.

Ejemplo XV Construcción de una cepa B1098 de E. coli que expresa la fusión protD1/3-E7 mutada (cys27\rightarrowgly,glu29\rightarrowgln) de tipo PVH18 1) Construcción del plásmido de expresión Material de partida

a) Plásmido pRIT14532 (=TCA 316) que codifica la fusión protD1/3-E7-His

b) Plásmido LITMUS 28 (nº de cat. New England Biolabs 306-28), un vector de clonación derivado de pUC

c) Plásmido pMG MCS prot D1/3 (pRIT14589), un derivado de pMG81 (descrito anteriormente) en el que los codones 4-81 de la región de codificación de NS1 de la gripe se reemplazaron por los codones correspondientes a los residuos Ser20\rightarrowThr127 de la proteína D madura de Haemophilus influenzae cepa 772, biotipo 2 (H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, enero. pág. 119-125). La secuencia de prot D1/3 es seguida por un sitio de clonación múltiple (11 residuos) y una región de codificación para una cola de histidina C-terminal (6 His).

Construcción del plásmido pRIT14831 (=TCA 355): un plásmido que expresa la fusión proteína D1/3-E7 mutada (cys27\rightarrowgly,glu29\rightarrowgln) con cola de His

Se subclonó el fragmento NcoI-XbaI de pRIT14532 (=TCA 316) que porta la secuencia de codificación del gen E7 de PVH18, prolongada con una cola de His, en un vector intermedio Litmus 28 útil para mutagénesis, proporcionando pRIT14910 (=TCA348). Por analogía con la mutagénesis de E7/PVH16, se eligieron las dobles mutaciones cys27\rightarrowgly y glu20\rightarrowgln para deteriorar la unión al producto antioncogénico del gen de retinoblastoma (pRB).

Se realizó la introducción de mutaciones en el gen E7 con el kit (Quick Change Site directed Mutagenesis (nº de cat. Stratagene 200518). Como la secuenciación de pRIT14532 había indicado la presencia de un ácido glutámico en posición 43 de E7 en lugar de una glicina en la secuencia prototípica de PVH18, se realizó un segundo ciclo de mutagénesis para introducir una glicina en posición 43. Se obtuvo el plásmido pRIT14829 (=TCA 353). Después de la verificación de la presencia de mutaciones y de la integridad del gen E7 completo mediante secuenciación, se introdujo el gen E7 mutado en el vector pRIT14589 (=pMG MCS prot D1/3), proporcionando el plásmido pRIT14831 (=TCA 355) (véase la figura 17).

Se describe la secuencia de la fusión proteína D1/3-E7 mutada (cys27\rightarrowgly,glu29\rightarrowgln)-His en la figura 18.

2) Construcción de la cepa B1098 que expresa prot D1/3-E7 mutada (cys-27\rightarrowgly,glu29\rightarrowgln)-His/PVH18

Se introdujo el plásmido pRIT14831 en AR58 de E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un represor termosensible del promotor pL \lambda, proporcionando la cepa B1098, mediante selección de transformantes resistentes a la canamicina.

3) Crecimiento e inducción de la cepa bacteriana B1098 - expresión de prot D1/3-E7 mutada (cys27\rightarrowgly,glu29\rightarrowgln)-His /PVH18

Se hicieron crecer células AR58 transformadas con el plásmido pRIT14831 (cepa B1098) a 30ºC en 100 ml de medio LB suplementado con 50 \mug/ml de canamicina. Durante la fase de crecimiento logarítmico, se cambiaron las bacterias a 39ºC para inactivar el represor \lambda y activar la síntesis de prot D1/3-E7 mutada-His/PVH18. La incubación a 39ºC se continuó durante 4 horas. Las bacterias se sedimentaron y se almacenaron a -20ºC.

4) Caracterización de la fusión prot D1/3-E7 mutante (cys24\rightarrowgly,glu26\rightarrowgln)-His de tipo PVH16

Se descongelaron células congeladas y se resuspendieron en 10 ml de tampón PBS. Se rompieron las células en una prensa French de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres pasadas). Se centrifugó el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a 4ºC).

Después de la centrifugación de los extractos descrita anteriormente, se analizaron alícuotas de sobrenadante y sedimento mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y transferencia Western. Se visualizó una banda mayoritaria de aproximadamente 31 kDa, localizada en la fracción de sedimento, mediante geles teñidos con Coomasie y se identificó en transferencias Western mediante anticuerpo policlonal de conejo 22 J70 anti-proteína D y anticuerpo monoclonal penta-His (nº de cat. Qiagen 34660), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel de expresión representa aproximadamente 3 a 5% de la proteína total.

Ejemplo XVI Construcción de una cepa de E. coli que expresa la fusión proteína D1/3-E6-His/PVH18 1. Construcción del plásmido de expresión

a) El plásmido pMG MCS prot D1/3 (=pRIT14589) es un derivado de pMG81 (descrito anteriormente) en el que los codones 4-81 de la región de codificación de NS1 de la gripe se reemplazaron por los codones correspondientes a los residuos Ser20\rightarrowThr127 de la proteína D madura de Haemophilus influenzae de cepa 772, biotipo 2 (H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, enero. pág. 119-125). La secuencia de prot D1/3 es seguida por un sitio de clonación múltiple (11 residuos) y una región de codificación de una cola de histidina C-terminal (6 His). Este plásmido se utiliza para expresar la proteína de fusión D1/3-E6-His.

Las secuencias E6 y E7 de PVH genómico de tipo PVH18 (Cole et al., J. Mol. Biol. 1987, 193, pág. 599-608) se amplificaron del genoma de PVH18 completo clonado en pBR322 (obtenido del Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum für human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg) y se subclonaron en pUC19 proporcionando TCA 302 (=pRT14467).

Construcción del plásmido TCA 314 (=pRIT14526): un plásmido que expresa la fusión proteína D1/3-E6-His/PVH18

Se amplifican las secuencias nucleotídidicas correspondientes a los aminoácidos 1\rightarrow158 de pRIT14467. Durante la reacción en cadena con polimerasa, se generaron sitios de restricción NcoI y SpeI en los extremos 5' y 3' de las secuencias de E6, permitiendo la inserción en los mismos sitios del plásmido pMGMCS prot D/13, proporcionando el plásmido TCA 314 (=pRIT14526) (véase la figura 21). Se secuenció el inserto para verificar que no se había generado ninguna modificación durante la reacción en cadena con polimerasa. La secuencia para la fusión proteína D1/3-E6-His se describe en la figura 22.

Transformación de la cepa AR58

Se introdujo el plásmido pRIT14526 en AR58 de E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un represor termosensible del promotor pL \lambda.

Se hicieron crecer células AR58 transformadas con plásmido pRIT14526 en 100 ml de medio LB suplementado con 50 \mug/ml de canamicina a 30ºC. Durante la fase de crecimiento logarítmico, se cambiaron las bacterias a 39ºC para inactivar el represor \lambda y activar la síntesis de proteína D1/3-E6-His. La incubación a 39ºC se continuó durante 4 horas. Se sedimentaron las bacterias y se almacenaron a -20ºC.

4. Caracterización de la fusión proteína D1/3-E6-His

Se descongelan células congeladas y se resuspenden en 10 ml de tampón PBS. Se rompen las células en una prensa French de celda a presión SLM Aminco a 138 MPa (tres pasadas). Se centrifuga el extracto a 16.000 g durante 30 minutos a 4ºC. Después de la centrifugación de los extractos descrita anteriormente, se analizaron alícuotas de sobrenadante y sedimento mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y transferencia Western. Se visualizó una banda mayoritaria de aproximadamente 32 kDa, localizada en la fracción de sedimento, mediante geles teñidos con Coomasie, y se identificó en transferencias Western mediante anticuerpo policlonal de conejo anti-proteína D y mediante conjugado Ni-NTA acoplado a fosfatasa alcalina intestinal bovina (nº de cat. Qiagen 34510), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel de expresión representa aproximadamente 3 a 5% de la proteína total.

Ejemplo XVII Construcción de una cepa de E. coli que expresa la fusión proteína D1/3-E6E7-His/PVH18 1. Construcción del plásmido de expresión

a) El plásmido pMG MCS prot D1/3 (=pRIT14589) es un derivado de pMG81 (descrito anteriormente) en el que los codones 4-81 de la región de codificación de NS1 de la gripe se reemplazaron por los codones correspondientes a los residuos Ser20\rightarrowThr127 de proteína D madura de Haemophilus influenzae de cepa 772, biotipo 2 (H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, enero. Pág. 119-125). La secuencia de prot D1/3 es seguida por un sitio de clonación múltiple (11 residuos) y una región de codificación de una cola de histidina C-terminal (6 His). Este plásmido se utiliza para expresar la proteína de fusión D1/3-E6E7-His.

b) Las secuencias E6 y E7 de PVH genómico de tipo PVH18 (Cole et al., J. Mol. Biol. 1987, 193, pág. 599-608) se amplificaron del genoma de PVH18 completo clonado en pBR322 (obtenido del Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum für human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg) y se subclonaron en pUC19 proporcionando TCA 302 (=pRT14467).

c) Las secuencias de codificación para E6 y E7 en TCA 302 (=pRIT14467) se modificaron con un adaptador de oligonucleótidos sintéticos (insertado entre los sitios HgaI y NsI), introduciendo una deleción de 11 nucleótidos entre los genes E6 y E7, retirando el codon de paro de E6 y creando secuencias condensadas E6 y E7 en el plásmido TCA 320 (=pRIT14618), véase la figura 23.

Construcción del plásmido TCA 328 (=pRIT14567): un plásmido que expresa la fusión proteína D1/3-E6E7-His/PVH18

Se amplifican las secuencias nucleotídicas correspondientes a los aminoácidos 1\rightarrow263 de pRIT14618. Durante la reacción en cadena con polimerasa, se generaron sitios de restricción NcoI y SpeI en los extremos 5' y 3' de las secuencias condensadas de E6E7, permitiendo la inserción en los mismos sitios del plásmido pMGMCS prot D/13, proporcionando el plásmido TCA 328 (=pRIT14567) (véase la figura 24). Se secuenció el inserto para verificar que no se había generado ninguna modificación durante la reacción en cadena con polimerasa. La secuencia para la fusión proteína D1/3-E6E7-His se describe en la figura 25.

2. Transformación de la cepa AR58

Se introdujo el plásmido pRIT14567 en AR58 de E. coli (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), un lisógeno \lambda defectivo que contiene un represor termosensible del promotor pL \lambda.

Se hicieron crecer células AR58 transformadas con plásmido pRIT14512 en 100 ml de medio LB suplementado con 50 \mug/ml de canamicina a 30ºC. Durante la fase de crecimiento logarítmico, se cambiaron las bacterias a 39ºC para inactivar el represor \lambda y activar la síntesis de proteína D1/3-E6E7-His. La incubación a 39ºC se continuó durante 4 horas. Se sedimentaron las bacterias y se almacenaron a -20ºC.

4. Caracterización de la fusión proteína D1/3-E6E7-His

Después de la centrifugación de los extractos descrita anteriormente, se analizaron alícuotas de sobrenadante y sedimento mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y transferencia Western. Se visualizó una banda mayoritaria de aproximadamente 48 kDa, localizada en la fracción de sedimento, mediante geles teñidos con Coomasie, y se identificó en transferencias Western mediante anticuerpo policlonal de conejo anti-proteína D y mediante conjugado Ni-NTA acoplado a fosfatasa alcalina intestinal bovina (nº de cat. Qiagen 34510), que detecta la cola de histidina accesible. El nivel de expresión representa aproximadamente un 1% de la proteína total.

Ejemplo XVIII Formulaciones de vacuna

Se formulan vacunas con una proteína de los ejemplos anteriores expresada en E. coli de la cepa AR58 y, como coadyuvante, la formulación comprende una mezcla de monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) e hidróxido de aluminio o 3D-MPL y/o QS21 opcionalmente en una emulsión de aceite/agua, y opcionalmente formulada con colesterol.

\newpage

3D-MPL: es una forma químicamente detoxificada del lipopolisacárido (LPS) de la bacteria gram-negativa
Salmonella minnesota. Los experimentos realizados en Smith Kline Beecham Biologicals han mostrado que el 3D-MPL combinado con diversos vehículos potencia fuertemente tanto el tipo humoral como TH1 de inmunidad celular.

QS21: es una saponina purificada de un extracto bruto de la corteza del árbol Quillaja Saponaria Molina, que tiene una fuerte actividad coadyuvante: activa tanto la linfoproliferación específica de antígeno como los CTL ante diversos antígenos.

La vacuna que contiene un antígeno de la invención que contiene 3D-MPL y alúmina puede prepararse de manera análoga a la descrita en los documentos WO 93/19780 o WO 92/16231.

Los experimentos realizados en Smith Kline Beecham Biologicals han demostrado un claro efecto sinérgico de las combinaciones de 3D-MPL y QS21 en la inducción tanto de respuestas humorales como de celulares de tipo TH1. Las vacunas que contienen un antígeno como dichos antígenos se describen en el documento US 5750110.

La emulsión de aceite/agua está compuesta por dos aceites (un tocoferol y escualeno) y PBS que contiene Tween 80 como emulsionante. La emulsión comprendía 5% de escualeno, 5% de tocoferol, 0,4% de Tween 80 y tenía un tamaño medio de partícula de 180 nm, y es conocida como SB62 (véase el documento WO 95/17210).

Los experimentos realizados en Smith Kline Beecham Biologicals han probado que la adición de esta emulsión de A/A a MPL/QS21 aumenta adicionalmente sus propiedades inmunoestimulantes.

Preparación de la emulsión SB62 (concentrada 2 veces)

Se disuelve Tween 80 en solución salina tamponada con fosfato (PBS), proporcionando una solución al 2% en PBS. Para proporcionar 100 ml de emulsión concentrada dos veces, se someten a vórtex 5 g de DL-alfa-tocoferol y 5 ml de escualeno para mezclar concienzudamente. Se añaden 90 ml de solución PBS/Tween y se mezcla concienzudamente. Se pasa después la emulsión resultante a través de una jeringuilla y finalmente se microfluidiza utilizando una máquina de microfluidificación M110S. Las gotitas de aceite resultantes tienen un tamaño de aproximadamente 180 nm.

Preparación de prot D/3-E7-QS21/3D-MPL en formulación de aceite en agua

Se diluyó prot D1/3-E7 (5 \mug) en PBS concentrado 10 veces a pH 6,8 y H_{2}O antes de la adición consecutiva de SB62, 3D-MPL (5 \mug), QS21 (5 \mug) y tiomersal 50 \mug/ml como conservante a intervalos de 5 min. El volumen de emulsión es igual al 50% del volumen total (50 \mul para una dosis de 100 \mul). Todas las incubaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente con agitación. Los controles de coadyuvante sin antígeno se prepararon reemplazando la proteína por PBS.

Experimentos de regresión tumoral (PVH16) con protD-E7 Antígeno de vacuna: proteína de fusión prot D-E7

La proteína D es una lipoproteína expuesta en la superficie de la bacteria gram-negativa Haemophilus influenzae. La inclusión de los primeros 109 residuos de la proteína D como asociado de fusión se incorpora para proporcionar al antígeno de vacuna las presentes propiedades auxiliares. El antígeno se formuló con QS21, 3D-MPL y SB62 como se describe anteriormente.

Ejemplo XIX Experimentos de regresión tumoral in vivo Línea de célula tumoral TC1

Se inmortalizaron células epiteliales de pulmón primarias de ratones C57BL6 mediante E6 y E7 de PVH16, y se transformaron después con un oncogén ras activado, produciendo una línea celular tumorigénica que expresa E6 y E7 (Lin K.Y. et al., 1996). La expresión de E7 se ha verificado mediante análisis FACS de células TC1 fijas y permeabilizadas utilizando el Mab anti-E7 de PVH16 de ratón (Triton Corp., Alameda, CA).

Crecimiento tumoral

Se tripsinizaron células TC1 que crecen en cultivo in vitro, se lavaron dos veces con medio exento de suero y se inyectaron por vía s.c. en el costado derecho de los ratones. Para evaluar el tratamiento de los tumores establecidos, se inyectaron células TC1 a una dosis de 3 x 10^{4} células/ratón. Una y dos semanas después de la inyección de células tumorales, se vacunaron los ratones con 5 \mug en 100 \mul de prot D1/3-E7-His a través de la almohadilla de la pata (50 \mul/almohadilla de pata) en PBS o en 3D-MPL, QS21 y SB62, o con PBS o con el coadyuvante solo. Se utilizaron cinco ratones C57BL/6 (Iffa Credo) en cada grupo. Se controló en los ratones dos veces a la semana el crecimiento tumoral. Se muestra la media de masa tumoral/grupo en la figura 26, los ratones vacunados con prot D1/3-E7-His en PBS o con PBS o coadyuvante solo desarrollaron tumores progresivamente crecientes (0-1 animales exentos de tumor/grupo). Por el contrario, cuatro de los cinco ratones vacunados con prot D1/3-E7-His en coadyuvante no desarrollaron un tumor y un animal desarrolló un tumor muy pequeño y estable el día 40. Este resultado indica que la proteína prot D1/3-E7-His de PVH16 formulada en coadyuvante es capaz de inducir la regresión de pequeños tumores establecidos que expresan este antígeno.

Lectura inmunológica Ensayo de proliferación

Para el ensayo in vitro se prepararon linfocitos triturando el bazo o los nódulos linfáticos poplíteos de los ratones vacunados el día 69. Se sembró una alícuota de 2 x 10^{5} células por triplicado en placas de 96 pocillos con concentraciones decrecientes (10, 1, 0,1 \mug/ml) de prot D1/3-E7-His recubierta o no sobre microperlas de látex (Sigma) para reestimular las células in vitro (72 horas). Se midió la proliferación de células T mediante la incorporación de ^{3}H-timidina.

Las figuras 27 y 28 comparan la capacidad de la prot D-E7 de estimular la proliferación de esplenocitos y células de nódulo linfático cebadas in vivo con PBS, 3D-MPL, QS21, SB62, prot D1/3-E7-His y prot D1/3-E7-His + coadyuvante 3D-MPL, QS21, SB62, y muestran que se detectaron respuestas de alta proliferación en bazo sólo en ratones inmunizados con protD1/3-E7-His en coadyuvante en comparación con los demás grupos.

Respuesta de anticuerpo

Se tomaron sueros individuales al mismo tiempo que se extrajeron los órganos y se sometieron a ELISA indirectas.

Se utilizaron 5 \mug/ml de proteína E7 purificada como antígeno recubierto. Después de saturación en PBS + 1% de suero de ternero recién nacido durante 1 h a 37ºC, se diluyeron en serie los sueros (empezando a 1/100) en tampón de saturación y se incubaron durante una noche a 4ºC o durante 90 min a 37ºC. Después de lavar en PBS-Tween 20 al 0,1%, se utilizaron Ig biotinilada de cabra anti-ratón (1/1000) o antisueros de cabra de subclase IgG (IgG total, IgG1,IgG2a, IgG2b) (1/5000) como segundos anticuerpos, después de una incubación de 90 min a 37ºC se añadió estreptavidina acoplada a peroxidasa y se utilizó TMB (tetrametilbencidina/peróxido) como sustrato, después de 10 min se detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 0,5 M y se determinó la DO_{450}.

Las titulaciones anti-E7 específicas de subclase desencadenadas por las vacunaciones en los diferentes grupos de ratones se muestran en la Figura 29 en comparación con el punto medio relativo de dilución del suero.

Estos resultados muestran que se desencadena una débil respuesta de anticuerpo con 2 inyecciones de protD 1/3-E7-PVH16 sola.

Se generan muchos más anticuerpos anti-E7 cuando se inyectó la prot D1/3-E7 en presencia del coadyuvante SB62, QS21 + 3D-MPL.

No se detectaron IgA ni IgM en ninguna de las muestras de suero, ni siquiera en el suero de ratones que recibieron prot D1/3-E7 en coadyuvante SB62 + QS21 + 3D-MPL (datos no mostrados). Por el contrario, aumentó ligeramente el nivel de IgG total mediante la vacunación de los ratones con prot D1/3 sola y aumentó en gran medida mediante la adición del coadyuvante SB62 + QS21 + 3D-MPL a la proteína. El análisis de las concentraciones de las diferentes subclases de IgG muestra que se ha inducido una respuesta de anticuerpo mixta, ya que la concentración de todos los tipos de IgG analizados (IgG1, IgG2a e IgG2b) aumentaba en el suero de los ratones que recibieron el antígeno coadyuvado, en comparación con la concentración observada en el suero de ratones que recibieron el antígeno o el coadyuvante solo. El isotipo predominante encontrado fue IgG2b (que representaba más de un 80% de la IgG total), este isotipo se dice generalmente que está asociado a la inducción de una respuesta inmune de tipo TH1.

Ejemplo XX Experimentos de protección tumoral in vivo

Se inmunizaron ratones 2 veces en un intervalo de 14 días con PBS, coadyuvante del ejemplo 1, 5 \mug de prot D1/3-E7-His o 5 \mug de prot D1/3-E7-His en el coadyuvante del ejemplo 1 a través de la almohadilla de pata en un volumen de 100 \mul (50 \mul/almohadilla de pata).

Crecimiento tumoral

Cuatro semanas después de la última vacunación, se expusieron los ratones a 2 x 10^{5} células TC1/ratón por vía s.c. en el costado. Se tripsinizaron células TC1 que crecían en cultivo in vitro, se lavaron dos veces con medio exento de suero y se inyectaron. Se controló en 5 ratones utilizados en cada grupo dos veces por semana el crecimiento tumoral.

La Figura 30 muestra que la vacunación con la proteína E7 en el coadyuvante SB62 + QS21, 3D-MPL protege a los ratones frente al desarrollo de tumores (sólo un animal de cinco tiene un tumor muy pequeño y estable), en todos los demás grupos que recibieron la proteína E7 sin el coadyuvante o el coadyuvante solo desarrollaron tumores crecientes.

Lectura inmunológica

Tres semanas después de la última vacunación, antes de la exposición a tumor, se sacrificaron 5 ratones en cada grupo para lectura inmunológica.

Ensayo de proliferación

Para el ensayo in vitro, se prepararon linfocitos como se describe anteriormente del bazo y de los nódulos linfáticos poplíteos de drenaje.

Se sembró una alícuota de 2 x 10^{5} células por triplicado en placas de 96 pocillos con concentraciones decrecientes (10, 1, 0,1 \mug/ml) de prot D1/3-E7-His recubiertas o no sobre microperlas de látex (Sigma) para reestimular las células in vitro (72 horas). Se midió la proliferación de células T mediante la incorporación de ^{3}H-timidina.

Las Figuras 31 y 32 muestran respectivamente que, tanto con esplenocitos como con células de nódulo linfático poplíteo, como se observó en los ajustes terapéuticos, se obtenía una mejor actividad linfoproliferativa para los ratones que recibieron la proteína E7 en la respuesta de anticuerpo al coadyuvante SB62 + QS21 + 3D-MPL.

La Figura 33 muestra que, como en los ajustes terapéuticos, se observó una mejor respuesta de anticuerpo en el suero de ratones vacunados con la proteína prot D1/3-E7 formulada en el coadyuvante 3D-MPL + QS21, A/A. Se desencadenó una respuesta de anticuerpo mixta, ya que se ensayaron todas las subclases de IgG (IgG2a, IgG2b, IgG1); en este caso también la IgG2b fue el isotipo predominante encontrado, representando un 75% de la IgG total.

Ejemplo XXI Experimentos de vacunación con prot D1/3-E7 (PVH18)

Se vacunaron dos veces ratones, separados 2 semanas, con 5 \mug en 100 \mul de prot D1/3-E7-His/PVH18 a través de la almohadilla de pata (50 \mul/almohadilla de pata) en PBS o QS21, 3D-MPL y SB62, DQ-MPL como se describe en el documento WO 96/33739 o DQ-alúmina-MPL como se describe en el documento WO 98/15827. Se utilizaron ocho ratones Balb/c de 6-8 semanas (Iffa Credo) en cada grupo. Catorce días después de II, se extrajeron el bazo y los nódulos linfáticos para lectura inmunológica y toma de muestra de sangre para serología.

Lectura inmunológica Ensayo de proliferación

Para el ensayo in vitro, se prepararon los linfocitos triturando el bazo o los nódulos linfáticos poplíteos de los ratones vacunados el día 28.

Se sembró una alícuota de 2 x 10^{5} células por triplicado en placas de 96 pocillos con concentraciones decrecientes (10, 1, 0,1, 0,01 \mug/ml) de prot D1/3-E7-His/PVH18 para reestimular las células in vitro (72 h). Se midió la proliferación de células T mediante la incorporación de ^{3}H-timidina. Los resultados se expresan como índice de estimulación (cpm de muestra/cpm de línea base).

Las Figuras 34 y 35 comparan la capacidad de la prot D1/3-E7/PVH18 de estimular la proliferación de esplenocitos o células de nódulo linfático cebadas in vivo con prot D1/3-E7-His/PVH18 o prot D1/3-E7-His/PVH18 + coadyuvante, y muestran que sólo se observa una linfoproliferación basal en ratones que recibieron la proteína sola; por el contrario, se detectaron respuestas proliferativas altas en bazo y respuestas muy altas en nódulos linfáticos en ratones inmunizados con prot D1/3-E7-His/PVH18 en coadyuvante.

Producción de citoquina

\bullet: Se midieron las citoquinas (IL-5 e IFNg) producidas en el sobrenadante de cultivo después de un periodo de 96 horas de reestimulación in vitro de células de bazo o nódulo linfático con medio o con la prot D1/3-E7/PVH18 (1 ó 3 \mug/ml) mediante ELISA como se describe:

\bullet: IFNg (Genzyme)

Se realizó la cuantificación de IFN\gamma mediante ELISA utilizando reactivos de Genzyme. Se utilizaron soluciones de muestra y anticuerpo a 50 \mul por pocillo. Se recubrieron placas de microvaloración de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) durante una noche a 4ºC con 50 \mul de IFNg de hámster anti-ratón diluida a 1,5 \mug/ml en tampón carbonato a pH 9,5. Se incubaron después las placas durante 1 h a 37ºC con 100 \mul de PBS que contenía 1% de seroalbúmina bovina y 0,1% de Tween 20 (tampón de saturación). Se añadieron diluciones dobles de sobrenadante de estimulación in vitro (empezando a ½) en tampón de saturación a las placas recubiertas con anticuerpo anti-IFNg, y se incubaron durante 1,5 horas a 37ºC. Se lavaron las placas 4 veces con PBS-Tween al 0,1% (tampón de lavado) y se añadió IFNg de cabra anti-ratón conjugada a biotina diluida en tampón de saturación a una concentración final de 0,5 \mug/ml a cada pocillo, y se incubó durante 1 h a 37ºC. Después de una etapa de lavado, se añadió conjugado AMDEX (Amersham) diluido 1/10000 en tampón de saturación durante 30 min a 37ºC. Se lavaron las placas como anteriormente y se incubaron con 50 \mul de TMB (Biorad) durante 15 min. Se detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 0,4 N y se leyó a 450 nm. Se calcularon las concentraciones utilizando una curva patrón (patrón de IFN\gamma estándar) mediante SoftmaxPro (ecuación de cuatro parámetros) y se expresó en pg/ml.

\bullet: IL5 (Pharmingen)

Se realizó la cuantificación de IL-5 mediante ELISA utilizando reactivos de Pharmingen. Se utilizaron soluciones de muestras y anticuerpos a 50 \mul por pocillo. Se recubrieron placas de microvaloración de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) durante una noche a 4ºC con 50 \mul de IL-5 de rata anti-ratón diluida a 1 \mug/ml en tampón carbonato a pH 9,5. Se incubaron después las placas durante 1 h a 37ºC con 100 \mul de PBS que contenía 1% de seroalbúmina bovina y 0,1% de Tween 20 (tampón de saturación). Se añadieron diluciones dobles de sobrenadante de la estimulación in vitro (empezando a ½) en tampón de saturación a las placas recubiertas con anti-IFNg, y se incubó durante 1,5 horas a 37ºC. Se lavaron las placas 4 veces con PBS-Tween al 10% (tampón de lavado) y se añadió IL-5 de rata anti-ratón conjugada a biotina diluida en tampón de saturación a una concentración final de 1 \mug/ml a cada pocillo, y se incubó durante 1 h a 37ºC. Después de una etapa de lavado, es añadió conjugado AMDEX (Amersham) diluido 1/10000 en tampón de saturación durante 30 min a 37ºC. Se lavaron las placas como anteriormente y se incubaron con 50 \mul de TMB (Biorad) durante 15 min. Se detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 0,4 N y se leyó a 450 nm. Se calcularon las concentraciones utilizando una curva patrón (IL-5 recombinante de ratón) mediante SoftmaxPro (ecuación de cuatro parámetros) y se expresó en pg/ml.

Partiendo de células de bazo, no pudo detectarse IL-5 en ninguno de los grupos ensayados; por el contrario, se observó una alta producción de IFNg en todos los grupos, con sólo un ligero aumento en el grupo de ratones que recibió la proteína coadyuvada con SBAS1c en comparación con los otros grupos. Esto sugiere la inducción de una respuesta inmune de tipo TH1.

Respecto a las células de nódulo linfático, se obtuvo una muy débil producción de IFNg en el grupo de ratones que recibió la proteína sola y se observa un aumento de 5-10 veces con la proteína coadyuvada. IL5 no pudo detectarse en el grupo de ratones que recibieron la proteína coadyuvada con SBAS2.

Las Figura 36 y 37 comparan la capacidad de la prot D1/3-E7-His/PVH18 de estimular la producción de citoquinas (IFNg e IL5) después de la reestimulación in vitro de células de bazo o nódulo linfático, respectivamente.

Respuesta de anticuerpo

Se tomaron sueros individuales al mismo tiempo que los órganos se sometían a ELISA indirectas.

Se utilizaron 2,5 \mug/ml de proteína prot D1/3-E8/PVH18 purficada como antígeno recubierto. Después de la saturación con PBS + 1% de suero de ternero recién nacido durante 1 h a 37ºC, se diluyeron en serie los sueros (empezando a 1/100) en tampón de saturación y se incubaron durante una noche a 4ºC o durante 90 min a 37ºC. Después de lavar en PBS-Tween 20, se utilizaron Ig de cabra anti-ratón biotinilada al 0,1% (1/1000) o antisueros de una subclase de IgG de cabra anti-ratón (IgG total, IgG1, IgG2a, IgG2b) (1/5000) como segundos anticuerpos; después de una incubación de 90 min a 37ºC, se añadió estreptavidina acoplada a peroxidasa y se utilizó TMB (tetrametilbencidina/peróxido) como sustrato, después de 10 min la reacción se detuvo con H_{2}SO_{4} 0,5 M y se determinó la DO_{450}.

Se desencadena una muy débil respuesta de anticuerpo con 2 inyecciones de prot D1/3-E7/PVH18 sola. El nivel de IgG total aumentó en gran medida mediante la adición de coadyuvantes a la vacuna de proteína.

El análisis de las concentraciones de las diferentes subclases de IgG muestra que cuando la proteína se inyectó en presencia de los coadyuvantes DQS21, 3D-MPL o SB62, QS21/3D-MPL, se obtuvo un ligero aumento del porcentaje del subtipo IgG2a: 28% de IgG1, 48% de IgG2a y 43% de IgG1, 44% de IgG2a, respectivamente, en comparación con 46% de IgG1, 32% de IgG2a con la proteína no coadyuvada. La respuesta de anticuerpo más fuerte se obtiene con la proteína formulada en DQ-alúmina, con un claro desplazamiento de la concentración de isotipo (80% de IgG1, 8% de IgG2a). Ya que el isotipo IgG2a en ratones Balb/c se considera generalmente asociado a la inducción de una respuesta inmune de tipo TH1, estos resultados sugieren que los coadyuvantes DQS21, 3D-MPL y SB62, QS21/3D-MPL tienden a aumentar el perfil de tipo TH1 de la respuesta humoral, mientras que SBAS5 induce un tipo de respuesta claramente TH2.

Figura 38. Se muestran la comparación de la dilución de punto medio del suero y el porcentaje relativo de los diferentes isotipos desencadenados por las vacunaciones en los diferentes grupos de ratones.

Conclusión

Los inventores han demostrado que la proteína condensada prot D1/3 y la proteína temprana E7 de PVH16 inducían una potente inmunidad sistémica antitumoral, y que la proteína de fusión protD1/3 y E7 de PVH18 han mostrado ser también inmunogénicas en ratones. La vacunación con la proteína de fusión prot D1/3-E7/PVH16 protegía a los ratones de la exposición a tumores con células tumorales que expresaban E7, y eliminó tumores pequeños preestablecidos que expresaban E7 de PVH16 inyectados en un sitio distante del sitio de vacunación.

Han demostrado que la proteína prot D1/3-E7/PVH16 en coadyuvante es capaz de potenciar la proliferación de células T auxiliares, sugiriendo que la respuesta inmune antitumoral inducida por esta vacuna está al menos en parte asociada a una respuesta de células T CD4+.

Han demostrado también que se desencadenó una mejor respuesta de anticuerpo por la vacunación con la prot D1/3-E7 en presencia de coadyuvante que contiene 3D-MPL. Al ser IgG2b el isotipo predominante encontrado en el suero de ratones C57BL/6, se sugiere que se provocó una respuesta inmune de tipo TH1.

Claims

1. Una proteína de fusión que comprende un antígeno de papilomavirus humano seleccionado del grupo constituido por: i) proteína E6, ii) proteína E7, iii) proteína de fusión E6E7, iv) proteína E7 en la que se introduce una mutación para reducir la unión al producto del gen de retinoblastoma, o v) proteína E6 en la que se introduce una mutación en la región p53 de la proteína E6; dicha proteína ligada a la proteína D o a un derivado de la misma de Haemophilus influenzae, en la que el derivado de proteína D comprende aproximadamente los primeros 100 aminoácidos N-terminales de la proteína D.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el derivado de proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la proteína D.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 ó 2, en la que el derivado de proteína D está lipidado.

4. Una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el papilomavirus humano es PVH16 o PVH18.

5. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína E7 de PVH16 mutada comprende un miembro seleccionado del grupo constituido por: (i) reemplazo de Cys_{24} por glicina, (ii) reemplazo de ácido glutámico_{26} por glutamina y (iii) reemplazo de Cys_{24} por glicina y de ácido glutámico_{26} por glutamina.

6. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína E7 de PVH18 mutada comprende un miembro seleccionado del grupo constituido por: (i) reemplazo de Cys_{27} por glicina, (ii) reemplazo de ácido glutámico_{29} por glutamina y (iii) reemplazo de Cys_{27} por glicina y de ácido glutámico_{29} por glutamina.

7. Una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende adicionalmente un marcaje de histidina de al menos 4 residuos de histidina.

8. Una secuencia de ADN que codifica una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Una vacuna que contiene una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

10. Una vacuna según la reivindicación 9, que comprende adicionalmente un coadyuvante.

11. Una vacuna según la reivindicación 9 ó 10, en la que la proteína se presenta en un vehículo de emulsión de aceite en agua.

12. Una vacuna según la reivindicación 10 u 11, en la que el coadyuvante comprende 3D-MPL o QS21 o ambos.

13. Una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende un antígeno de PVH adicio-
nal.

14. La vacuna de la reivindicación 13, en la que el antígeno de PVH adicional es uno o más miembros seleccionados del grupo constituido por E2, E5, L1 y L2.

15. La vacuna de la reivindicación 14, en la que L1 y L2 se presentan conjuntamente en forma de una partícula viroide o en la que L1 sola se presenta en forma de una partícula viroide o estructura de capsómero.

16. Una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15 para uso en medicina.

17. Uso de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de una vacuna para tratar, mediante inmunoterapia, un paciente que sufre lesiones tumorales inducidas por PVH (benignas o malignas).

18. Uso de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de una vacuna para prevenir la infección viral por PVH.

19. Un vector que contiene una secuencia de ADN de la reivindicación 8.

20. Un vector que contiene una secuencia de ADN según la reivindicación 8 y una secuencia de ADN que codifica tioredoxina, que permite la coexpresión de la proteína de fusión con tioredoxina en trans.

21. Una célula hospedadora bacteriana transformada con una secuencia de ADN de la reivindicación 8.

22. Una célula hospedadora bacteriana transformada con un vector de las reivindicaciones 19 ó 20.

\newpage

23. Un procedimiento para la producción de una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende transformar una célula hospedadora con una secuencia de ADN que codifica la proteína, expresar dicha secuencia y aislar el producto deseado.

24. Un procedimiento para la producción de una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, que comprende mezclar la proteína con un coadyuvante, diluyente u otro excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado.