KR20170115066A - 유산균 함유 조성물, hpv 감염증 및 hpv 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물, 및 점막 면역 유도제 - Google Patents
유산균 함유 조성물, hpv 감염증 및 hpv 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물, 및 점막 면역 유도제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인유두종 바이러스(HPV)의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드를 균체 표면에 갖는 유산균 함유 조성물로서, 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드의 함유량이, 유산균 1×108 균체당 0.03㎍∼1.0㎍인 유산균 함유 조성물, 그리고 상기 유산균 함유 조성물을 포함하는, HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물 및 점막 면역 유도제이다.
Description
본 발명은, 인유두종 바이러스(HPV)의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드를 균체 표면에 갖는 유산균 함유 조성물, 그리고 상기 유산균 함유 조성물을 포함하는 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물 및 점막 면역 유도제에 관한 것이다.
인유두종 바이러스(HPV)는 DNA 바이러스로서, 현재까지 100종류 이상의 다른 형태가 보고되고 있다. 상기 HPV는 피부(예를 들면, HPV1, HPV2)나 점막 표면(예를 들면, HPV6, HPV11)에 감염됨으로써, 수개월부터 수년 단위로 존재하는 양성 종양(사마귀)을 형성한다.
또한, 상기 HPV 중 15형(예를 들면, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV52, HPV58 등)은, 점막에 장기간 감염됨으로써 악성 종양을 일으키는 점 때문에 고리스크 HPV로 불리고 있다.
여성 특유의 암으로서 유방암에 이어 이환율이 높은 자궁경부암에 대해서는, 그 거의 100％가 상기 HPV의 생식기에의 장기간 감염에 의해 발증하는 것이며, 세계에서 53만명, 일본에서도 1만 5천명의 신규 환자가 매년 보고되고 있다.
자궁경부암에 의한 연간 사망자수는 세계에서 27만명, 일본에서도 3,500명에 이른다.
이론적으로는, 상기 HPV 감염의 전부를 미연에 방지할 수 있다면, 상기 자궁경부암은 완전히 근절할 수 있다.
상기 HPV의 감염은, 상기 자궁경부암 이외에도, 외음암, 항문암, 구강암, 질암, 음경암, 인두암, 그리고 첨규콘딜로마(성기 사마귀)에도 관련되어 있는 것이 밝혀지고 있어, 이들 암 및 성감염증의 예방을 위해 상기 HPV의 감염에 대한 예방 백신은 유효하다고 생각된다. 그러나, 기존의 HPV 예방 백신은, 고리스크 HPV 중 2개의 형태(型)밖에 예방할 수 없다.
상기 HPV 중에서도, 특히 HPV16과 HPV18이 일본인 여성의 상기 자궁경부암의 발증 원인의 약 65％, 특히 20대에서는 자궁경부암의 발증 원인의 약 90％를 차지하고 있다.
상기 HPV16과 상기 HPV18은, 상기 외음암에 선행하여 보여지는 외음 상피내 종양의 고도병변에 있어서도 발증 원인의 50％ 가까이를 차지하고, 또한 상기 질암으로 진행할 가능성이 있는 질 상피내 종양의 발증의 85％에도 관련되어 있는 것이 알려져 있다.
상기 HPV 감염에 의한 상기 자궁경부암의 전암병변인 자궁경부 상피내 종양(Cervical intraepithelial neoplasia; CIN)은, 자궁질부(자궁경부의 아래쪽 절반, 질에 돌출하고 있는 부분)의 점막 상피에 발생한다. HPV 감염증은, 성행위에 의한 미세한 상처에 의해 HPV가 점막 상피(중층편평상피)의 기저 세포에 침입하여, 편평상피 내에서 바이러스 증식하는 바이러스 감염증이다. 장기간 지속적으로 상피 내에서 HPV가 증식하면, 상피 세포가 불사화, 암화가 일어난다. 이것이 자궁경부암의 기원인 것으로 생각되고 있다.
상기 자궁경부암의 발생 과정에서는, 기저 세포에의 상기 HPV의 증식이 지속되면, 그 일부에서 바이러스 유전자가 상피 세포의 유전자에 삽입되어, 저레벨이었던 E6 단백질과 E7 단백질의 발현이 지속적으로 항진되는 변화가 일어나는 것으로 생각된다.
상기 E6 단백질과 상기 E7 단백질의 발현은, 바이러스 감염상(感染像)인 CIN1(경도 이형성)에서는 매우 낮은 것에 반해, 종양화를 마친 CIN2(중도 이형성)와 CIN3(고도 이형성)에서는 고발현이 인지되는 점에서, 상기 E6 단백질과 상기 E7 단백질의 발현의 지속적인 항진은 상기 CIN2 이후에 발생하는 것으로 생각된다.
상기 HPV의 상기 E6 단백질과 상기 E7 단백질, 그 중에서도 특히 상기 E7 단백질이, HPV 관련 암에 대한 치료용 백신의 개발에 있어서 매우 매력적인 타겟이라고 생각된다. E7 단백질은 사람에서의 항원성이 높기 때문이다.
지금까지, 상기 HPV의 E7 단백질을 항원으로 한 상기 치료용 백신이 이미 몇 가지 개발되어 있지만(예를 들면, 비특허문헌 1, 특허문헌 1 참조), 그들이 환자 자궁경부의 전암병변(상기 CIN)이나 암세포를 배제하는 것까지는 나타나 있지 않아, 실제로 치료 효과를 가진 백신의 개발이 강하게 요망되고 있다.
본 발명자들은, 상기 HPV16의 상기 E7 단백질에 있어서, 상기 Rb 단백질과의 결합에 관여하는 제21번째의 Asp, 제24번째의 Cys 및 제26번째의 Glu를 모두 Gly로 치환한 변이형 E7 단백질(서열번호 2)을, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)에 발현시키고, 열처리에 의해 사균화한 것을 건조, 분말화한 백신(LacE7)을 마우스에 경구투여함으로써, 비장뿐만 아니라, 점막에서도 E7 특이적 세포성 면역 응답을 유도할 수 있는 것을 나타냈다(비특허문헌 2 참조).
또, 본 발명자들은, HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물로서, HPV의 E7 폴리펩티드와, 자양강장 작용을 갖는 한방약과의 조합에 대한 연구도 진행하고 있다(특허문헌 2 참조).
지금까지의 본 발명자들의 연구에 의해, 어느 정도의 임상 효과를 발휘하는 백신이 개발되고 있다.
그러나, 상기 치료 백신으로는 CIN3(고도 이형성)로부터 CIN2(중등도 이형성)까지의 퇴축 효과에 그치고, 정상화는 어렵다. 자궁경부 상피내 종양 및 초기 자궁경부암 중 적어도 어느 하나의 환자에 있어서의 임상 효과를 더욱 높여 정상화를 목표로 하기 위해, 보다 뛰어난 점막 면역 유도능을 갖는 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물의 조속한 제공이 강하게 요구되고 있다.
H. Poo et al., Int J. Cancer, 2006, vol.119, pp.1702-1709
K. Adachi et al., Vaccine, 2010, vol.28, pp.2810-2817
본 발명은, 종래의 상기 여러 문제를 해결하고, 이하의 목적을 달성하는 것을 과제로 한다. 즉, 본 발명은, 뛰어난 점막 면역 유도능을 갖는 유산균 함유 조성물, 그리고 상기 유산균 함유 조성물을 포함하는 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물 및 점막 면역 유도제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단은 이하와 같다. 즉,
＜1＞ 인유두종 바이러스(HPV)의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드를 균체 표면에 갖는 유산균 함유 조성물로서,
상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드의 함유량이, 유산균 1×108 균체 당 0.03㎍∼1.0㎍인 것을 특징으로 하는 유산균 함유 조성물이다.
＜2＞ 상기 ＜1＞에 기재한 유산균 함유 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물이다.
＜3＞ 상기 ＜1＞에 기재한 유산균 함유 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 점막 면역 유도제이다.
본 발명에 의하면, 종래의 상기 여러 문제를 해결하고, 상기 목적을 달성할 수 있어, 뛰어난 점막 면역 유도능을 갖는 유산균 함유 조성물, 그리고 상기 유산균 함유 조성물을 포함하는 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물 및 점막 면역 유도제를 제공할 수 있다.
도 1a는 제조예 1에 있어서의 pQE31::cA＝E7Rb의 모식도이다.
도 1b는 제조예 1의 FACS 분석의 결과를 나타내는 도-1이다.
도 1c는 제조예 1의 FACS 분석의 결과를 나타내는 도-2이다.
도 1d는 웨스턴 블롯(Western blot)법에 의해 각종의 단백질에 대해 확인한 결과의 일례를 나타내는 도면이다.
도 2a는 제조예 2에 있어서의 pIGM2::E7Rb＝prtP anchor의 모식도이다.
도 2b는 제조예 2의 FACS 분석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 3a는 시험예 1의 FACS 분석(측정 조건은 Voltage: 525)의 결과를 나타내는 도면이다.
도 3b는 시험예 1의 FACS 분석(측정 조건은 Voltage: 600)의 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 시험예 2의 ELISPOT Assay의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 시험예 3의 ELISPOT Assay의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1b는 제조예 1의 FACS 분석의 결과를 나타내는 도-1이다.
도 1c는 제조예 1의 FACS 분석의 결과를 나타내는 도-2이다.
도 1d는 웨스턴 블롯(Western blot)법에 의해 각종의 단백질에 대해 확인한 결과의 일례를 나타내는 도면이다.
도 2a는 제조예 2에 있어서의 pIGM2::E7Rb＝prtP anchor의 모식도이다.
도 2b는 제조예 2의 FACS 분석의 결과를 나타내는 도면이다.
도 3a는 시험예 1의 FACS 분석(측정 조건은 Voltage: 525)의 결과를 나타내는 도면이다.
도 3b는 시험예 1의 FACS 분석(측정 조건은 Voltage: 600)의 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 시험예 2의 ELISPOT Assay의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 시험예 3의 ELISPOT Assay의 결과를 나타내는 그래프이다.
(유산균 함유 조성물)
본 발명의 유산균 함유 조성물은, 인유두종 바이러스(HPV)의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드를 균체 표면에 갖는 유산균을 적어도 포함하고, 필요에 따라 추가로 그 외의 성분을 포함한다.
＜유산균＞
상기 유산균으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 락토바실러스속(屬)의 유산균이 바람직하고, 헬퍼 T세포 1형(Th1) 세포의 유도능이 확인되어 있는 점에서, 락토바실러스 카제이가 보다 바람직하다. 상기 유산균은 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
상기 유산균 함유 조성물은, 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드를 균체 표면에 갖지 않는 유산균을 포함하고 있어도 되지만, 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드를 균체 표면에 갖는 유산균의 함유 비율이, 80％ 이상이 바람직하고, 90％ 이상이 보다 바람직하며, 95％ 이상이 특히 바람직하다.
＜＜HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드＞＞
상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드로는, 항원성을 갖는 것이면 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드는 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
상기 HPV의 형태로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 암에 관하여 고리스크군에 속하는 HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, HPV82, HPV26, HPV53, HPV63이 바람직하고, HPV16, HPV18이 보다 바람직하며, HPV16이 특히 바람직하다. 상기 HPV16의 E7 단백질은 자궁경부암을 비롯한 HPV 관련 암(항문암, 인두암, 음경암, 외음암, 질암 등)에 항상적(恒常的)으로 발현하고 있는 암 항원이다.
상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드는 상기 HPV의 E7 단백질의 전장(全長) 단백질이어도 되고, 1부터 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 단백질이어도 된다.
또, 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드는 야생형의 E7 단백질에서 유래하는 것이어도 되고, 변이형의 E7 단백질에서 유래하는 것이어도 된다.
상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드 중에서도, HPV16의 야생형 E7 단백질(서열번호 1)에 있어서의 제21번째의 Asp, 제24번째의 Cys 및 제26번째의 Glu에 상당하는, E7 단백질의 Rb 단백질과의 결합에 관여하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 변이형 E7 단백질이 바람직하고, HPV16의 야생형 E7 단백질(서열번호 1)의 제21번째의 Asp, 제24번째의 Cys 및 제26번째의 Glu 모두를 Gly로 치환한 변이형 E7 단백질(서열번호 2)이 보다 바람직하다.
－ 함유량 －
상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드의 균체 표면에 있어서의 함유량으로는, 유산균 1×108 균체당 0.03㎍∼1.0㎍이면 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 0.03㎍∼0.3㎍이 바람직하고, 0.06㎍∼0.3㎍이 보다 바람직하며, 0.09㎍∼0.3㎍이 특히 바람직하다. 상기 바람직한 범위 내이면, 보다 뛰어난 약리 효과(점막 면역 유도능)를 발휘할 수 있는 점에서 유리하다.
상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드의 균체 표면에 있어서의 함유량을 측정하는 방법으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 HPV의 E7 단백질에 특이적인 항체를 이용한 플로우 사이토미터(Flow cytometer(FACS))에 의해 측정하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 FACS에 의해 측정하는 방법에서는, 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드의 균체 표면에 있어서의 함유량이 기존의 시료와 동일한 조건에서 측정함으로써, 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드의 균체 표면에 있어서의 함유량이 미지인 시료의 함유량을 측정할 수 있다.
＜＜양태＞＞
상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드는, 유산균의 균체 표면에 결합된 것(이하, 「E7 단백질 결합형 유산균」이라고 칭하는 경우가 있다)이어도 되고, 유산균의 균체 표면에 발현된 것(이하, 「E7 단백질 발현형 유산균」이라고 칭하는 경우가 있다)이어도 된다. 또, 양자를 조합한 양태여도 된다.
또, 상기 유산균은 생균이어도 되고, 사균이어도 된다.
상기 사균으로 하는 방법으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 오토클레이브에서 80℃, 5분간 가열 처리하는 방법 등을 들 수 있다.
－ E7 단백질 결합형 유산균 －
상기 E7 단백질 결합형 유산균은, 형질전환 세균을 이용하는 유전자 재조합에 의한 방법이나 화학 합성에 의한 방법 등에 의해 제조한 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드를 유산균의 균체 표면에 결합함으로써 제조할 수 있다.
상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드는 비용 등의 면에서, 형질전환 세균을 이용하는 유전자 재조합에 의한 방법이 바람직하다.
상기 유전자 재조합에 의한 방법의 숙주에 이용하는 세균으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 선택할 수 있으며, 예를 들면, 효모, 대장균, 고초균, 유산균 등을 들 수 있다.
상기 세균에 있어서의 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드의 발현에 적합한 발현벡터로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, pQE31 등을 들 수 있다.
상기 형질전환의 방법으로는, 특별히 제한은 없고, 공지의 방법을 적절히 선택할 수 있다.
상기 형질전환균에 의해 생산된 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드는, 공지의 방법을 적절히 선택함으로써 정제할 수 있다.
상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드를 상기 유산균의 균체 표면에 결합하는 방법으로는, 특별히 제한은 없고, 공유결합, 전기적으로 결합하는 등의 공지의 방법을 적절히 선택할 수 있지만, 앵커(anchor) 단백질을 통해 상기 유산균의 균체 표면에 전기적으로 결합하는 방법이 바람직하다.
상기 앵커 단백질로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)의 펩티드글리칸 가수분해효소인 AcmA 유래의 세포벽 결합 단백인 cA 등을 들 수 있다.
상기 앵커 단백질을 통해 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드를 상기 유산균의 균체 표면에 결합하는 경우는, 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드는, 상기 앵커 단백질과의 융합 단백질로 하는 것이 바람직하다.
상기 융합 단백질에 있어서의, 상기 앵커 단백질과, 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드의 순서로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 상기 앵커 단백질과, 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드가 이 순서로 융합되어 있는 양태가 바람직하다. 상기 바람직한 양태의 구체예로는, 서열번호 3으로 표시되는 서열을 들 수 있다.
상기 전기적으로 결합(이하, 「고정화」라고 칭하는 경우가 있다)하는 방법으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기 유산균에, 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드를 포함하는 용액을 첨가하고, 혼화하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 혼화하는 시간으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 1시간 정도 등을 들 수 있다.
상기 전기적으로 결합하는 방법에서는 전(前)처리를 실시해도 된다.
상기 전처리로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 가열 처리 등을 들 수 있다. 상기 가열 처리에 의해 상기 유산균이 사균화된다.
상기 가열 처리의 조건으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 100℃로 30분간 가열하는 것 등을 들 수 있다.
상기 가열 처리는, 상기 유산균을 트리클로로초산(TCA)에 현탁한 상태에서 실시해도 되고, 상기 유산균을 PBS에 현탁한 상태에서 실시해도 된다.
－ E7 단백질 발현형 유산균 －
상기 E7 단백질 결합형 유산균은, 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 포함하는 발현벡터를 이용하여 형질전환된 유산균을 배양함으로써 제조할 수 있다.
상기 발현벡터로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, pIGM2 등을 들 수 있다. 상기 pIGM2는 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis ) ATCC1559의 S-layer 단백질의 프로모터 서열의 하류에 락토바실러스 브레비스 ATCC1559의 prtP 유전자의 분비 시그널을 갖고, 이들의 하류에 락토바실러스 카제이 유래의 앵커 유전자(proteinase sequence of L. casei)를 갖는다.
상기 발현벡터의 그 밖의 예로는, repE 변이 유전자와, 유산균 유래의 알돌라아제 프로모터(Pald)와, pgsB, pgsC 및 pgsA로 구성된 군에서 선택되는 폴리글루타민산 합성효소 복합체 유전자를 포함하는 벡터(일본국 특표2012-514468호 공보, 일본국 특표 2012-514469호 공보 참조) 등을 들 수 있다.
상기 형질전환의 방법으로는, 특별히 제한은 없고, 공지의 방법을 적절히 선택할 수 있다.
상기 E7 단백질 발현형 유산균으로 하는 경우에는, 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드를 코드하는 핵산은 앵커 유전자와 결합한 것으로 하는 것이 바람직하다.
상기 앵커 유전자로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 락토바실러스 카제이 유래의 앵커 유전자(proteinase sequence of L. casei)가 바람직하다.
상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드를 코드하는 핵산과, 상기 앵커 유전자의 순서로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드를 코드하는 핵산과, 상기 앵커 유전자가 이 순서로 결합되어 있는 양태가 바람직하다. 상기 바람직한 양태의 구체예로는, 서열번호 4로 표시되는 서열을 들 수 있다.
상기 E7 단백질 발현형 유산균에 이용하는 유산균으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 락토바실러스 카제이 IGM393주(株), 락 토바실러스 카제이 IGM394주가 바람직하다. 상기 락토바실러스 카제이 IGM394주는, 상기 락토바실러스 카제이 IGM393주의 계대(繼代) 파생주이며, 형질전환 효율이 높은 변이주이다. 상기 락토바실러스 카제이 IGM393주 및 락토바실러스 카제이 IGM394주는, 락토바실러스 카제이 BL23주의 전체 게놈 서열에 상동성이 가장 높다.
상기 E7 단백질 발현형 유산균의 배양 방법으로는, 특별히 제한은 없고, 공지의 방법을 적절히 선택할 수 있다.
상기 E7 단백질 발현형 유산균에 있어서, 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드의 균체 표면에 있어서의 발현량을 조절하는 방법으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 배양액의 pH를 조정하는 방법 등을 들 수 있다.
후술하는 제조예 2에서 나타내는 바와 같이, 탄산수소나트륨의 농도를 변경하여, 배양액의 pH를 조정한 배양액을 이용함으로써, 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드의 균체 표면에 있어서의 발현량을 조절할 수 있다.
상기 배양액의 pH로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, pH 7 정도가 바람직하다.
상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드가, 상기 앵커 단백질과의 융합 단백질인 경우, 상기 융합 단백질의 균체 표면에 있어서의 함유량으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 유산균 1×108 균체당 0.1㎍∼3.3㎍이 바람직하고, 0.1㎍∼1.0㎍이 보다 바람직하며, 0.2㎍∼1.0㎍가 더욱 바람직하고, 0.3㎍∼1.0㎍이 특히 바람직하다. 상기 바람직한 범위 내이면, 보다 뛰어난 약리 효과(점막 면역 유도능)를 발휘할 수 있는 점에서 유리하다.
＜그 외의 성분＞
상기 유산균 함유 조성물에 있어서의 그 외의 성분으로는, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 한 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 의약적으로 허용될 수 있는 담체 등을 들 수 있다. 이들은 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
상기 유산균 함유 조성물에 있어서의 그 외의 성분의 함유량으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
(HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물)
본 발명의 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물은, 유산균 함유 조성물을 적어도 포함하고, 필요에 따라 추가로 그 외의 성분을 포함한다.
＜유산균 함유 조성물＞
상기 유산균 함유 조성물은, 상기한 본 발명의 유산균 함유 조성물이다.
상기 유산균 함유 조성물의 상기 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물에 있어서의 함유량으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
＜그 외의 성분＞
상기 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물에 있어서의 그 외의 성분으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 자양강장 작용(면역증강 작용)을 갖는 한방약, 점막 애주번트(adjuvant), 의약적으로 허용될 수 있는 담체 등을 들 수 있다. 이들은 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
－ 자양강장 작용(면역증강 작용)을 갖는 한방약 －
상기 자양강장 작용(면역증강 작용)을 갖는 한방약으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 갈근탕, 십전대보탕, 보중익기탕, 소시호탕, 소청룡탕 등을 들 수 있다. 이들은 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
－ 점막 애주번트 －
상기 점막 애주번트로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기 자양강장 작용(면역증강 작용)을 갖는 한방약과 협조하여, 상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드 등의 경구 백신 특이적인 액성 면역과 세포성 면역을 더욱 증강하는 것이 바람직하다.
상기 점막 애주번트의 예로는, 세균 독소 유래 애주번트, 합성 세라미드(αGalCer), CpG 올리고 뉴클레오티드, SP-C(서팩텐), SP-B, IFN-α(야생형 또는 변이형), 2중 가닥 RNA, 활성증폭형 TNF 변이체 등을 들 수 있다. 이들은 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
상기 세균 독소 유래 애주번트로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 콜레라 독소(CT)에서 유래하는 폴리펩티드, 대장균 이열성 독소(LT)에서 유래하는 폴리펩티드, 베로 독소(VT)에서 유래하는 폴리펩티드, 디프테리아 독소(DT)에서 유래하는 폴리펩티드, 백일해 독소(PT)에서 유래하는 폴리펩티드 등을 들 수 있다.
상기 세균 독소 유래 애주번트는, 야생형 세균 독소 유래 애주번트여도 되고, 변이형 세균 독소 유래 애주번트여도 되지만, 사람에의 경구투여에 있어서 심각한 부작용이 생기지 않도록 미리 변이가 도입된 변이형 세균 독소 유래 애주번트가 바람직하다.
－ 의약적으로 허용될 수 있는 담체 －
상기 의약적으로 허용될 수 있는 담체로는, 특별히 제한은 없고, 제형에 따라 공지의 담체를 적절히 선택할 수 있다.
상기 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물에 있어서의 그 외의 성분의 함유량으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
＜사용＞
상기 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물은, 단독으로 사용해도 되고, 다른 성분을 유효 성분으로 하는 의약과 함께 사용해도 된다. 또, 상기 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물은, 다른 성분을 유효 성분으로 하는 의약 중에 배합된 상태로 사용해도 된다.
＜제형＞
상기 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물의 제형으로는, 경구투여할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 경구 고형제(정제, 피복정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등), 경구 액제(내복액제, 시럽제, 엘릭시르제 등) 등을 들 수 있다. 이들 제형의 상기 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물은 상법(常法)에 따라 제조할 수 있다.
＜투여＞
상기 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물의 투여량, 투여 시기 및 투여 대상으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 투여량으로는, 특별히 제한은 없고, 투여 대상 개체의 연령, 체중, 체질, 증상, 다른 성분을 유효 성분으로 하는 의약이나 약제의 투여 유무 등, 여러 가지 요인을 고려하여 적절히 선택할 수 있다.
상기 투여 대상으로는, 사람을 적합하게 들 수 있다.
상기 HPV 관련 종양으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 자궁경부암, 외음암, 항문암, 구강암, 질암, 음경암, 인두암 및 이들의 전암병변 등을 들 수 있다.
상기 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물은, 자궁경부 상피내 종양 및 초기 자궁경부암 중 적어도 어느 하나의 치료용으로서 적합하게 이용 가능하다.
상기 초기 자궁경부암에는 미소침윤암의 상태가 포함된다.
상기 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물은, HPV 감염증의 환자에게 투여함으로써, 그 치료용 백신으로서 사용하는 데 적합하다.
(HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나를 치료하는 방법)
상기 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물은, 개체에 경구투여함으로써, 개체에 있어서의 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나를 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 개체에 상기 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물을 경구투여하는 것을 특징으로 하는, HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나를 치료하는 방법에 관한 것이기도 하다.
(점막 면역 유도제)
본 발명의 점막 면역 유도제는, 유산균 함유 조성물을 적어도 포함하고, 필요에 따라 추가로 그 외의 성분을 포함한다.
＜유산균 함유 조성물＞
상기 유산균 함유 조성물은, 상기한 본 발명의 유산균 함유 조성물이다.
상기 유산균 함유 조성물의 상기 점막 면역 유도제에 있어서의 함유량으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
＜그 외의 성분＞
상기 점막 면역 유도제에 있어서의 그 외의 성분으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 상기 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물의 그 외의 성분의 항목에 기재한 것과 같은 것으로 할 수 있다.
상기 점막 면역 유도제에 있어서의 그 외의 성분의 함유량으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
＜사용＞
상기 점막 면역 유도제는, 단독으로 사용해도 되고, 다른 성분을 유효 성분으로 하는 의약과 함께 사용해도 된다. 또, 상기 점막 면역 유도제는, 다른 성분을 유효 성분으로 하는 의약 중에 배합된 상태로 사용해도 된다.
＜제형＞
상기 점막 면역 유도제의 제형으로는, 경구투여할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 경구 고형제(정제, 피복 정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등), 경구 액제(내복액제, 시럽제, 엘릭시르제 등) 등을 들 수 있다. 이들 제형의 상기 점막 면역 유도제는, 상법에 따라 제조할 수 있다.
＜투여＞
상기 점막 면역 유도제의 투여량, 투여 시기 및 투여 대상으로는, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 투여량으로는, 특별히 제한은 없고, 투여 대상 개체의 연령, 체중, 체질, 증상, 다른 성분을 유효 성분으로 하는 의약이나 약제의 투여 유무 등, 여러 가지 요인을 고려하여 적절히 선택할 수 있다.
상기 투여 대상으로는, 사람을 적합하게 들 수 있다.
상기 점막 면역 유도제는, 점막에 있어서의 HPV의 E7 단백질 특이적 세포성 면역 응답을 유도할 수 있다.
(점막 면역을 유도하는 방법)
상기 점막 면역 유도제는, 개체에 경구투여함으로써, 개체에 있어서의 점막 면역을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 개체에 상기 점막 면역 유도제를 경구투여하는 것을 특징으로 하는 점막 면역을 유도하는 방법에 관한 것이기도 하다.
실시예
이하에 본 발명의 제조예 및 시험예를 설명하지만, 본 발명은 이들 제조예 및 시험예에 조금도 한정되는 것은 아니다.
(비교 제조예 1: 공지의 LacE7 제제(製劑)의 제조)
공지의 제제인 LacE7 제제를, Poo H. et al., Int. J. Immunol., 2006, vol. 119, pp.1,702-1,709에 기재된 방법에 따라 제조했다.
간단히 말하면, HPV16 유래의 변이형 E7 단백질(서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 야생형 E7 단백질의 Rb 단백질과의 결합에 관여하는 제21번째의 Asp, 제24번째의 Cys 및 제26번째의 Glu를 모두 Gly로 치환한 것)을, 헬퍼 T세포 1형(Th1 세포)의 유도능이 확인되어 있는 락토바실러스 카제이에 발현벡터를 이용하여 도입했다. 배양 후의 재조합체(LacE7)는 열로 사균화했다. 배지로부터 정제한 LacE7을 증류수로 몇 번 세정한 후, 건조·분체화하고(LacE7 제제), 사용할 때까지 4℃에서 보존했다. 상기 LacE7 제제는 수성 용매에 불용성이었다.
(제조예 1: 변이형 E7 단백질 결합형 유산균의 제조)
HPV의 E7 단백질 유래 폴리펩티드인 변이형 E7 단백질(서열번호 2)이, 유산균의 균체 표면에 결합된 변이형 E7 단백질 결합형 유산균을 이하와 같이 하여 제조했다.
＜변이형 E7 단백질의 제작＞
－ cA와 변이형 E7 단백질과의 융합 서열을 삽입한 단백질 발현용 플라스미드의 구축 －
상기 cA는 앵커 단백질이며, 상기 변이형 E7 단백질을 유산균의 균체 표면에 고정화하는 툴로서 이용했다. 상기 cA는, 전하와 특정의 모티프에 의해 그램 양성균의 펩티드글리칸에 고정화할 수 있는 것이며, 락토코커스 락티스의 펩티드글리칸 가수분해효소인 AcmA 유래의 세포벽 결합 단백이다(Tjibbe Bosma, Rolf Kanninga, Jolanda Neef, Sandrine A. L. Audouy, Maarten L. van Roosmalen, Anton Steen, Girbe Buist, Jan Kok, Oscar P. Kuipers, George Robillard, and Kees Leenhouts(2006) Novel Surface Display System for Proteins on Non-Genetically Modified Gram-Positive Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. p.880-889).
상기 cA와 변이형 E7 단백질과의 융합 서열(서열번호 3 참조)을 벡터 플라스미드인 pQE31에 상법에 의해 삽입했다(이하, 「pQE31::cA＝E7Rb」라고 칭하는 경우가 있음, 도 1a 참조).
－ 형질전환 －
상기 cA와 변이형 E7 단백질과의 융합 단백질을 발현시키는 숙주로서, ClearColi(등록상표)(E. coli BL21DE3 LPS 개변주, Lucigen사)를 이용했다.
우선, pREP4(invitrogen사)를 도입하기 위해, 일렉트로포레이션(Electroporation)법에 의해 ClearColi(등록상표)의 형질전환을 실시했다.
이어서, 얻어진 형질전환체에, pQE31::cA＝E7Rb를 염화 칼슘법에 의해 도입하고, 상기 cA와 변이형 E7 단백질과의 융합 단백질을 발현시키는 대장균(이하, 「ClearColi(등록상표) pQE31::cA＝E7Rb, pREP4」라고 칭하는 경우가 있다)을 얻었다.
－ 융합 단백질의 발현 및 정제 －
암피실린(종(終)농도 100㎍/mL) 및 카나마이신(종농도 25㎍/mL)을 포함하는 Luria-Bertani(LB) 액체 배지(Difco Laboratories사)에 상기 균체를 1 백금이(platinum loop) 접종하고, 37℃에서 하룻밤 진탕 배양했다.
상기 배양물을 집균하고, 세정 후, 배양 시와 동량의 PBS로 메스업하여, 암피실린(종농도 100㎍/mL) 및 카나마이신(종농도 25㎍/mL)을 포함하는 본 배양용 LB 액체 배지의 1/20량이 되도록 접종했다.
본 배양은 37℃에서 진탕 배양하고, O.D.600이 0.5에 달했을 때, 종농도가 1mM이 되도록 IPTG를 첨가하고, 37℃, 4시간 진탕 배양하여, 상기 융합 단백질의 발현 유도를 실시했다.
상기 유도 후의 배양액을 집균하고, 균체 1g당 5mL의 라이시스 버퍼(Lysis buffer)(100mM NaH2PO4, 10mM Tris·Cl, 8M Urea, pH 8)를 첨가하여, 실온에서 1시간 부드럽게 교반했다. 4℃, 10,000×g으로 30분 원심분리하여, 상청(上淸)을 회수했다.
회수한 상청 4mL에 대하여 라이시스 버퍼에 의해 평형화한 TALON(등록상표) Metal Affinity Resin 1mL(Clontech사)를 실온에서 40분 부드럽게 혼화했다. 상청과 레진의 혼합액을 Polypropylene columns(QIAGEN사)로 옮겨 상청을 제거했다. 4mL의 워시 버퍼(Wash buffer)(100mM NaH2PO4, 10mM Tris·Cl, 8M Urea, pH 6.3)에 의해 2회 세정하고, 일루션 버퍼(Elution buffer) 1(100mM NaH2PO4, 10mM Tris·Cl, 8M Urea, 150mM Imidazole, pH 5.9) 및 일루션 버퍼 2(100mM Na2HPO4, 10mM Tris·Cl, 8M Urea, 300mM Imidazole, pH 4.5)에 의해 His 태그 융합 단백질을 용출했다.
회수한 단백질 용액은, 투석에 의해 탈염하여, Ultracel(등록상표)-10k(Merk Millipore사)를 이용한 한외여과에 의해 농축했다.
농축 후의 단백질 용액은, Quick StartTM Bradford Protein Assay(BIO-RAD)에 의해 농도를 측정한 후, 사용 시까지 -80℃에서 보존했다.
－ 웨스턴 블롯법에 의한 융합 단백질의 확인 －
상기 － 융합 단백질의 발현 및 정제 －의 본 배양에 있어서, IPTG를 첨가하고, 37℃, 4시간 진탕 배양한 후의 배양액을 10,000×g으로 3분간 원심을 실시하여, 집균했다. 상청을 버리고, 펠릿을 100μL의 1×SDS-PAGE 샘플 버퍼로 현탁했다. 상기 현탁한 현탁액을 100℃로 5분간 가열했다.
가열 후의 현탁액을 SDS-PAGE로 영동(泳動)하고, PVDF 막(EMD Millipore사)에 전사했다.
상기 전사 후의 막을 1차 항체 용액(1％ BSA, 0.05％ Tween 20 in PBS(-), mouse anti-His IgG(Anti-His-tag mAb, 가부시키가이샤 이가쿠세이부츠가쿠겐큐쇼)(1:2,000)) 중에서, 실온에서 1시간 인큐베이트했다.
그 후, 상기 막을 PBST로 2회 세정했다.
이어서, 2차 항체 용액(1％ BSA, 0.05％ Tween 20 in PBS(-), goat anti-mouse IgG HRP(Anti-Mouse IgG(whole molecule)-Peroxidase antibody produced in goat, SIGMA-ALDRICH사)(1:10,000)) 중에서, 실온에서 1시간 인큐베이트했다.
그 후, 상기 막을 PBST로 2회 세정했다.
이어서, ECL Plus(GE Health care Life Science사)를 이용하여, Chemi doc(Bio-Rad Laboratories사)로 밴드를 검출하고, 목적의 융합 단백질이 발현하고 있음을 확인했다.
＜유산균의 균체 표면에의 결합＞
상기 cA와 변이형 E7 단백질과의 융합 단백질의 유산균의 균체 표면에의 결합(이하, 「고정화」라고 칭하는 경우도 있다)은, Tjibbe Bosma, Rolf Kanninga, Jolanda Neef, Sandrine A. L. Audouy, Maarten L. van Roosmalen, Anton Steen, Girbe Buist, Jan Kok, Oscar P. Kuipers, George Robillard, and Kees Leenhouts(2006) Novel Surface Display System for Proteins on Non-Genetically Modified Gram-Positive Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. p.880-889를 참고하여, 이하와 같이 실시했다.
－ 유산균의 배양 －
유산균으로서, 항원 운반체로서 애주번트 효과가 이미 확인되어 있는 락토바 실러스 카제이 IGM393(Kajikawa A, Igimi S(2010) Innate and acquired immune responses induced by recombinant Lactobacillus casei displaying flagellin-fusion antigen on the cell-surface. Vaccine 28:3409-3415)을 이용했다.
상기 유산균을 Mann-Rogosa-Sharp(MRS) 액체 배지(Difco Laboratories사)에 의해, 37℃로 하룻밤 정치 배양했다. 배양액을 집균하여, PBS에 의해 2회 세정했다.
－ 고정화의 전처리 －
상기 고정화의 전처리로서, 「상기 유산균을 트리클로로초산(TCA)으로 처리한 것」(이하, 「TCA 처리 있음」이라고 칭하는 경우가 있다), 및 「상기 유산균을 PBS로 처리한 것」(이하, 「TCA 처리 없음」이라고 칭하는 경우가 있다)의 2종류를 준비했다.
상기 TCA에 의한 처리는, 균체를 배양액의 0.2배량의 10％ TCA에 의해 재현탁하고, 100℃로 30분간 가열 후, PBS로 3회 세정했다.
상기 PBS에 의한 처리는, 균체를 배양액의 0.2배량의 PBS에 의해 재현탁하고, 100℃로 30분간 가열 후, PBS로 3회 세정했다.
－ 고정화 －
상기 전처리 후의 유산균 1.0×108 균체당, 상기 융합 단백질을 1.0㎍, 0.3㎍, 0.1㎍, 또는 0.03㎍(각각 상기 변이형 E7 단백질의 양으로서, 0.3㎍, 0.09㎍, 0.03㎍, 또는 0.009㎍에 상당한다) 첨가하고, 상기 융합 단백질을 포함하는 PBS 용액 중에서 1시간 혼화했다. 이것에 의해, 유산균의 표면에 상기 융합 단백질을 전기적으로 결합시켰다.
상기 혼화 후, PBS에 의해 3회 세정하고, -80℃에서 보존했다.
이상에 의해, 하기의 변이형 E7 단백질 결합형 유산균을 얻을 수 있었다.
(1) 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.3㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 있음).
(2) 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.09㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 있음).
(3) 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.03㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 있음).
(4) 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.009㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 있음).
(5) 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.3㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 없음).
(6) 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.09㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 없음).
(7) 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.03㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 없음).
(8) 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.009㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 없음).
＜FACS 분석＞
상기 (1)∼(8)의 변이형 E7 단백질 결합형 유산균에 대해, HPV의 E7 단백질에 특이적인 항체를 이용하여, 형광 표지를 실시한 후, 플로우 사이토미터(Flow cytometer)(FACS, BD사 제조)에 의해 고정화를 확인했다.
구체적으로는, 상기 변이형 E7 단백질 결합형 유산균을, 0.5mL의 1차 항체 용액(1％ BSA, 0.05％ Tween 20 in PBS(-), anti-HPV16 E7 mouse IgG(HPV Type 16 E7 Protein antibody [289-17013(TVG-701Y)], GeneTex사)(1:1000)) 중에서 전도 혼화(실온, 60분간)했다. 그 후, 원심(15,000×g, 3분간)한 후, PBS(-)로 세정을 2회 실시했다. 이어서, 0.5mL의 2차 항체 용액(1％ BSA, 0.05％ Tween 20 in PBS(-), anti-mouse IgG Alexa Fluor 488(Alexa Fluor(R) 488 goat anti-mouse IgG(H＋L), Life technologies사)(1:500)) 중에서 차광하면서 전도 혼화(실온, 60분간)했다. 그 후, 원심(15,000×g, 3분간)한 후, PBS(-)로 세정을 2회 실시했다.
그 후, PBS(-)로 0.6mL로 메스업하고, FACS에 의해 형광을 검출했다.
또한, 상기 융합 단백질을 이용하지 않은 것 이외에는, 동일한 조작을 실시한 것을 네거티브 컨트롤로서 이용했다.
결과를 도 1b 및 도 1c에 나타낸다.
도 1b 중, 「N」은 네거티브 컨트롤의 결과를 나타내고,「(1)」은 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.3㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 있음)의 결과를 나타내며,「(2)」는 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.09㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 있음)의 결과를 나타내고,「(3)」은 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.03㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 있음)의 결과를 나타내며,「(4)」는 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.009㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 있음)의 결과를 나타낸다.
도 1c 중, 「N」은 네거티브 컨트롤의 결과를 나타내고,「(5)」는 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.3㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 없음)의 결과를 나타내며,「(6)」은 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.09㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 없음)의 결과를 나타내고,「(7)」은 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.03㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 없음)의 결과를 나타내며,「(8)」은 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.009㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 없음)의 결과를 나타낸다.
도 1b 및 도 1c의 결과로부터, 변이형 E7 단백질의 양의 증가에 수반하여 형광 강도가 강해지는 것으로 나타났다.
또한, 상기 변이형 E7 단백질의 양을 유산균 1.0×108 균체당 0.9㎍로 한 경우에는, 유산균 1.0×108 균체당 0.3㎍인 경우와 마찬가지의 결과가 되어, 유산균의 균체 표면에 결합할 수 있는 상기 변이형 E7 단백질의 양은, 0.3㎍ 정도에서 포화하는 것도 알 수 있었다.
또한, 도 1d에, 웨스턴 블롯법에 의해 이하의 단백질에 대해 확인한 일례를 나타낸다.
[단백질]
· His 태그 부착의, cA와 변이형 E7 단백질과의 융합 단백질(48kDa)
· His 태그 부착의 cA(33kDa)
· His 태그 부착의 변이형 E7 단백질(15kDa)
도 1d 중, 「1」은 「His 태그 부착의, cA와 변이형 E7 단백질과의 융합 단백질」의 결과를 나타내고, 「2」는 「His 태그 부착의 cA」의 결과를 나타내며, 「3」 및 「5」는 「His 태그 부착의 cA의 발현을 유도하기 전의 대장균으로부터 조제한 샘플」의 결과를 나타내고, 「4」 및 「6」은 「His 태그 부착의 cA의 발현을 유도한 후의 대장균으로부터 조제한 샘플」의 결과를 나타내며, 「7」은 「His 태그 부착의 변이형 E7 단백질」의 결과를 나타내고, 「8」 및 「10」은 「His 태그 부착의 변이형 E7 단백질의 발현을 유도하기 전의 대장균으로부터 조제한 샘플」의 결과를 나타내며, 「9」 및 「11」은 「His 태그 부착의 변이형 E7 단백질의 발현을 유도한 후의 대장균으로부터 조제한 샘플」의 결과를 나타낸다.
(제조예 2: 변이형 E7 단백질 발현형 유산균의 제조)
HPV의 E7 단백질 유래 폴리펩티드인 변이형 E7 단백질(서열번호 2)이, 유산균의 균체 표면에 발현된 변이형 E7 단백질 결합형 유산균을 이하와 같이 하여 제조했다.
벡터 플라스미드로서, pIGM2(Kajikawa Akinobu, Eiko Ichikawa, and Shizunobu Igimi (2010) Development of a Highly Efficient Protein-Secreting System in Recombinant Lactobacillus casei. J. Microbiol. Biotechnol., 20(2), 375-382)를 이용하고, 변이형 E7 단백질(서열번호 2)을 코드하는 서열과 락토바실 러스 카제이 유래의 앵커 유전자(proteinase sequence of L. casei)의 서열을 이 순서로 결합한 서열(서열번호 4)을 삽입한 벡터 플라스미드(이하, 「pIGM2::E7Rb＝prtP anchor」라고 칭하는 경우가 있다)를 제작했다(도 2a 참조).
상기 벡터 플라스미드의 터미네이터 서열을 제거하고, 일렉트로포레이션법에 의해, 락토바실러스 카제이 IGM394에 도입했다(이하, 「L. casei IGM394 [pEK7::E7Rb]」라고 칭하는 경우가 있다).
또, 네거티브 컨트롤로서, 변이형 E7 단백질(서열번호 2)을 코드하는 서열과 락토바실러스 카제이 유래의 앵커 유전자(proteinase sequence of L. casei)의 서열을 이 순서로 결합한 서열(서열번호 4)을 삽입하지 않는 벡터 플라스미드를 이용한 것 이외에는 동일하게 하여, 락토바실러스 카제이 IGM394에 벡터 플라스미드를 도입한 주(株)를 제작했다(이하, 「L. casei IGM394 [pLPempty]」라고 칭하는 경우가 있다).
상기 유산균을, Mann-Rogosa-Sharp(Difco Laboratories사)에 Em 5㎍/mL를 첨가한 액체 배지(MRSE)에 뿌리고, 37℃에서 하룻밤(약 14시간) 배양했다. 배양액을 집균(5,000g×10분간)하고, PBS에 의해 1회 세정(5,000g×10분간)했다. PBS를 첨가하여, 세포 현탁액 농도를 1×109CFU/mL로 조정했다.
1L의 MRSE((i) NaHCO3 무첨가, pH 6.4, (ⅱ) 10mM NaHCO3 첨가, pH 6.8 또는 (ⅲ) 25mM NaHCO3 첨가, pH 7.1)에, 상기 조정한 세포 현탁액을 10％ 뿌리고(1×108CFU/mL), 37℃에서 약 5시간 부드럽게 교반하면서, 혐기 조건하(아내로 팩(AnaeroPack) 사용)에서 배양했다.
또한, 네거티브 컨트롤의 유산균은, (i) NaHCO3 무첨가의 MRSE를 이용하여 배양했다.
배양액을 집균(5,000g×10분간)하고, PBS에 의해 1회 세정(5,000g×10분간)했다. PBS를 30mL 첨가하여, 세포 현탁액 농도를 종농도 7.5×109cells/mL(OD≒7.5)로 조정했다. 또한, 유산균 수는, 혈구 계산반을 이용하여 세었다.
상기 세포 현탁액을 오토클레이브에서 80℃, 5분간 가열 처리하여 사균으로 했다.
또, 상기 가열 처리를 실시하지 않은 것을 생균의 시료로 했다.
이상에 의해, 하기의 변이형 E7 단백질 발현형 유산균을 얻을 수 있었다.
(ⅰ-1) NaHCO3 무첨가의 MRSE(pH 6.4)에서 배양하고, 사균으로 한 변이형 E7 단백질 발현형 유산균.
(ⅰ-2) NaHCO3 무첨가의 MRSE(pH 6.4)에서 배양하고, 생균으로 한 변이형 E7 단백질 발현형 유산균.
(ⅱ-1) 10mM NaHCO3를 첨가한 MRSE(pH 6.8)에서 배양하고, 사균으로 한 변이형 E7 단백질 발현형 유산균.
(ⅱ-2) 10mM NaHCO3를 첨가한 MRSE(pH 6.8)에서 배양하고, 생균으로 한 변이형 E7 단백질 발현형 유산균.
(ⅲ-1) 25mM NaHCO3를 첨가한 MRSE(pH 7.1)에서 배양하고, 사균으로 한 변이형 E7 단백질 발현형 유산균.
(ⅲ-2) 25mM NaHCO3를 첨가한 MRSE(pH 7.1)에서 배양하고, 생균으로 한 변이형 E7 단백질 발현형 유산균.
＜FACS 분석＞
상기 (i-1), (ⅱ-1) 및 (ⅲ-1)의 변이형 E7 단백질 발현형 유산균, 그리고 네거티브 컨트롤의 유산균에 대해, 상기 제조예 1과 마찬가지로 하여 FACS 분석을 실시하여, 유산균 1.0×108 균체당의 균체 표면의 변이형 E7 단백질의 발현의 정도를 확인했다. 결과를 도 2b에 나타낸다.
도 2b 중, 「N」은 네거티브 컨트롤(사균)의 결과를 나타내고, 「(i-1)」은 NaHCO3 무첨가의 MRSE(pH 6.4)에서 배양하고, 사균으로 한 변이형 E7 단백질 발현형 유산균의 결과를 나타내며, 「(ⅱ-1)」은 10mM NaHCO3를 첨가한 MRSE(pH 6.8)에서 배양하고, 사균으로 한 변이형 E7 단백질 발현형 유산균의 결과를 나타내고, 「(ⅲ-1)」은 25mM NaHCO3를 첨가한 MRSE(pH 7.1)에서 배양하고, 사균으로 한 변이형 E7 단백질 발현형 유산균의 결과를 나타낸다.
도 2b의 결과로부터, 배양액의 pH를 조정함으로써, 균체 표면의 변이형 E7 단백질의 발현량을 조절 가능한 것으로 나타났다.
(시험예 1: 균체 표면의 변이형 E7 단백질의 양의 비교)
이하의 시료에 대해, 상기 제조예 1과 마찬가지로 하여 FACS 분석을 실시하여, 유산균 1.0×108 균체당의 균체 표면의 변이형 E7 단백질의 양을 비교했다. 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타낸다.
＜시료＞
(I)··· 상기 제조예 2에 있어서의 네거티브 컨트롤(사균).
(Ⅱ)··· 상기 비교 제조예 1에서 제조한 LacE7 제제.
(Ⅲ)··· 상기 제조예 1에 있어서의 (3) 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.03㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 있음).
(Ⅳ)··· 상기 제조예 2에 있어서의 (ⅲ-1) 25mM NaHCO3를 첨가한 MRSE(pH 7.1)에서 배양하고, 사균으로 한 변이형 E7 단백질 발현형 유산균.
도 3a 및 도 3b 중,「(I)」은 상기 시료 (I)의 결과를 나타내고, 「(Ⅱ」는 상기 시료 (Ⅱ)의 결과를 나타내며, 「(Ⅲ)」은 상기 시료 (Ⅲ)의 결과를 나타내고, 「(IV)」는 상기 시료 (IV)의 결과를 나타낸다.
도 3a(측정 조건은 Voltage: 525)의 결과로부터, 기존의 LacE7 제제에서는, 균체 표면에 있어서의 변이형 E7 단백질의 발현을 발현하고 있는 유산균과, 발현하고 있지 않은 유산균과의 불균일이 많은 것으로 나타났다. 또, 도 3b(측정 조건은 Voltage: 600)의 결과로부터, 기존의 LacE7 제제에서는, 균체 표면에 있어서의 변이형 E7 단백질의 발현량이 낮은 것으로 나타났다.
한편, 상기 제조예 2에 있어서의 (ⅲ-1) 25mM NaHCO3를 첨가한 MRSE(pH 7.1)에서 배양하고, 사균으로 한 변이형 E7 단백질 발현형 유산균에서는, 유산균 1.0×108 균체당의 변이형 E7 단백질의 발현량이 0.3㎍ 정도로 추측되었다.
(시험예 2: 항 HPV 점막 면역 유도능 시험-1)
비교 제조예 1에서 제조한 LacE7 제제를 이용하여, 이하와 같이 하여 항 HPV 점막 면역 유도능 시험을 실시했다.
＜마우스의 면역＞
마우스의 LacE7 제제에 의한 경구 면역은, K. Adachi et al., Vaccine, 2010, vol.28, pp.2810-2817에 기재된 방법에 따라 실시했다.
＜＜마우스에의 LacE7 제제의 경구투여＞＞
6주령의 암컷 SPF C67BL 마우스(니혼쿠레아 가부시키가이샤)에 대하여, 상기 LacE7 제제를 경구투여함으로써 면역했다.
1마리당 0.1mg, 0.3mg, 또는 1.0mg의 상기 LacE7 제제를 제1주, 제2주, 제4주 및 제6주의 합계 4쿠르 투여했다. 모든 투여는 상기 LacE7 제제를 200μL의 PBS에 현탁한 것을 경위 튜브(intra-gastric tube)를 이용해 매주 연속 5일간, 1일 1회 3시간의 절식 후에 실시했다.
＜장(腸)의 회수＞
상기 LacE7 제제의 마지막 접종으로부터 1주일 후(접종 개시로부터 7주째)에, 상기 LacE7 제제를 접종한 5마리의 마우스를 해부하여 장을 채취했다. 상기 장은, 배설물을 제거한 후, 프로테아제 저해제를 첨가한 HBSS 10mL로 장관 내부를 세정했다.
＜마우스의 점막 임파구의 조제＞
장은 세로 방향으로 절개하여 10질량％ FBS, 100units/mL 페니실린, 및 100㎍/mL 스트렙토마이신을 첨가한 PRMI1640(10질량％ 비활성화 우태아 혈청, 2mM L-글루타민, 1mM 피루빈산나트륨, 1×비필수 아미노산, 50mM 2-메르캅토에탄올 함유) 배지에서 37℃, 30분간 세차게 진탕했다. 회수한 세포 현탁액은 BD 팔콘(Falcon)(상표) 셀 스트레이너(BD 바이오사이언스 주식회사, 미국)로 조직잔해(tissue debris)를 제거하고, 이어서 70질량％와 40질량％의 퍼콜 플러스(Percoll PLUS)를 중층한 15mL 튜브를 이용한 불연속 농도 기울기 원심을 실시했다. 약 107개∼108개의 세포를 위에 중층하고, 600×g, 실온에서 20분간 원심함으로써 70질량％와 40질량％의 Percoll PLUS의 계면에 점막 임파구(생존률 95％)가 모였다. 약 5×106개∼10×106개의 점막 임파구를 각 마우스로부터 얻을 수 있었다.
＜ELISPOT Assay＞
장 점막 임파구(5×106세포/mL)의 현탁액 50μL를, 24시간, 37℃에서 항원 제시 세포와 함께 인큐베이트했다.
마우스 IFN-γ용 ELISPOT 키트(마브테크 AB사, 스웨덴)의 제조사 프로토콜에 따라, HPV16의 E7 단백질(서열번호 1)에 있어서 CTL 에피토프(Epitope)로서 보고되고 있는 E7 단백질의 제49번부터 제57번의 아미노산 서열로 이루어지는 10μL의 합성 펩티드(1㎍/mL), 미토겐(포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate) 40ng/mL＋이오노마이신(Ionomycin) 4㎍/mL), 또는 배지만(컨트롤)을, 항마우스 IFN-γ 항체로 코팅된 96 웰 플레이트(ELIIP 플레이트, 밀리포아사, USA)에 적하했다. 96 웰 플레이트 상의 IFN-γ 양성의 스폿수를 해석했다. 그때, KS ELISPOT(칼자이스 비전사, 독일)의 컴퓨터 완전보조 비디오 영상 해석시스템을 이용했다.
＜통계 해석＞
ELISPOT Assay의 데이터를 평균값±표준 편차로 나타냈다. 이들 값 또는 상대값은 면역 그룹(각 그룹은 마우스 5마리) 간에서 비교했다. 그때, 양측 스튜던트 티-검정(Student's t-test)을 실시했다. p값이 ＜0.05인 경우 유의(有意)로 간주했다.
시험예 2의 결과를 도 4에 나타낸다.
도 4로부터 명백한 바와 같이, 투여량에 의존하여, 106 세포당의 IFN-γ 산생(産生) 세포수가 증가하고 있었다.
또, 도 4로부터, LacE7 제제를 0.5mg 투여한 경우의 106 세포당의 IFN-γ 산생 세포수는, 65.8 세포로 산출되었다(도 4 중의 화살표 부분).
(시험예 3: 항 HPV 점막 면역 유도능 시험-2)
이하의 시료를 이용하고, 시료의 투여량을 0.5mg/마우스로 한 것 이외에는, 시험예 2와 마찬가지로 하여 항 HPV 점막 면역 유도능 시험을 실시했다.
＜시료＞
· 시료-1: 제조예 1에 있어서의 (1) 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.3㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 있음).
· 시료-2: 제조예 1에 있어서의 (6) 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.09㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 없음).
· 시료-3: 제조예 1에 있어서의 (5) 유산균 1.0×108 균체당, 상기 변이형 E7 단백질을 0.3㎍ 결합시킨 변이형 E7 단백질 결합형 유산균(TCA 처리 없음).
· 시료-4: 제조예 2에 있어서의 (ⅲ-2) 25mM NaHCO3를 첨가한 MRSE(pH 7.1)에서 배양하고, 생균으로 한 변이형 E7 단백질 발현형 유산균.
· 시료-5: 제조예 2에 있어서의 (ⅲ-1) 25mM NaHCO3를 첨가한 MRSE(pH 7.1)에서 배양하고, 사균으로 한 변이형 E7 단백질 발현형 유산균.
결과를 도 5에 나타낸다. 도 5 중, 가로축의 1∼5는 상기 시료의 번호를 나타낸다.
또, 도 5에서는, 상기 시험예 2의 결과도 아울러 나타냈다. 도 5 중, A는 시험예 2에 있어서의 LacE7 제제의 투여량이 0.1mg/마우스인 결과를 나타내고, B는 시험예 2에 있어서의 LacE7 제제의 투여량이 0.3mg/마우스인 결과를 나타내며, C는 시험예 2에 있어서의 LacE7 제제의 투여량이 1.0mg/마우스인 결과를 나타낸다.
도 5에 있어서의 화살표는, 상기 시험예 2의 결과로부터 산출된 LacE7 제제를 0.5mg/마우스로 투여한 경우의 106 세포당의 IFN-γ 산생 세포수를 나타낸다.
도 5의 결과로부터, 본 발명의 변이형 E7 단백질 결합형 유산균 또는 변이형 E7 단백질 발현형 유산균인 시료-1∼5를 이용한 경우에는, 공지의 제제인 LacE7 제제를 동량 투여한 경우와 비교하여, 뛰어난 항 HPV 면역 유도능을 갖는 것으로 나타났다.
그 중에서도, 시료-2∼5를 이용한 경우에는, 공지의 제제인 LacE7 제제를 동량 투여한 경우와 비교하여, 약 2배 정도의 매우 뛰어난 항 HPV 면역 유도능을 갖는 것으로 나타났다.
본 발명자들에 의한 공지의 제제인 LacE7 제제를 이용한 사람의 CIN3 환자에서의 임상 실험에서는, 병이 나은 군과, 병이 낫지 않은 군에 있어서의 IFN-γ 산생 세포수를 비교하면, 전자는, 후자보다도 IFN-γ 산생 세포수가 2배 정도 많은 것으로 나타나 있다(K. Kawana et al., 「Oral vaccination against HPV E7 for treatment of cervical intraepithelial neoplasia grade 3(CIN3) elicits E7-specific mucosal immunity in the cervix of CIN3 patients.」 Vaccine, 2014 Oct 29; 32(47): 6233-9.).
따라서, 본 발명의 변이형 E7 단백질 결합형 유산균 또는 변이형 E7 단백질 발현형 유산균이, 공지의 제제인 LacE7 제제보다도, 동일 투여량에서 IFN-γ 산생 세포수가 2배 정도 많은 것은, 임상 효과(주효율(奏效率))가 유의하게 올라갈 것이 예상된다.
본 발명의 양태로는, 예를 들면, 이하의 것 등을 들 수 있다.
＜1＞ 인유두종 바이러스(HPV)의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드를 균체 표면에 갖는 유산균 함유 조성물로서,
상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드의 함유량이, 유산균 1×108 균체당 0.03㎍∼1.0㎍인 것을 특징으로 하는 유산균 함유 조성물이다.
＜2＞ HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드가, 유산균의 균체 표면에 결합된 것인 상기 ＜1＞에 기재된 유산균 함유 조성물이다.
＜3＞ HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드가, 유산균의 균체 표면에 발현된 것인 상기 ＜1＞에 기재된 유산균 함유 조성물이다.
＜4＞ 유산균이, 락토바실러스 카제이인 상기 ＜1＞ 내지 ＜3＞ 중 어느 하나에 기재된 유산균 함유 조성물이다.
＜5＞ 상기 ＜1＞ 내지 ＜4＞ 중 어느 하나에 기재된 유산균 함유 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물이다.
＜6＞ 자궁경부 상피내 종양 및 초기 자궁경부암 중 적어도 어느 하나의 치료용인 상기 ＜5＞ 에 기재된 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물이다.
＜7＞ 상기 ＜1＞ 내지 ＜4＞ 중 어느 하나에 기재된 유산균 함유 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 점막 면역 유도제이다.
SEQUENCE LISTING
<110> The University of Tokyo
Japan Health Sciences Foundation
<120> LACTIC ACID BACTERIA CONTAINING COMPOSITION, ORAL PHARMACEUTICAL
COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF AT LEAST ONE OF HPV INFECTION,
AND HPV-RELATED TUMOR, AND MUCOSAL IMMUNITY INDUCER
<130> N-ST016-15P
<150> JP 2015-017407
<151> 2015-01-30
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 98
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 1
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210> 2
<211> 98
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 2
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210> 3
<211> 975
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 3
tcttctgctg gtacttctaa ttccggtggt tcaacagcta caaataccaa taataattca 60
aatacaagct caaccactta tacagttaaa tctggcgata cactttgggg aatttcgcaa 120
aaatatggaa ttagtgttgc tcaaattcaa agcgcaaaca atcttaaaag tacagtcatc 180
tatattgggc aaaagcttgt attgacaact tcaagttctt cgtctaatac aaatagttca 240
acttcttcag gaaattctgc cggaactaca acgcctacta cttcggtcac tcctgccaaa 300
ccagcttcac agacgacgat taaggttaaa tctggtgata cgctttgggg actctctgtc 360
aaatataaaa cgacgattgc tcaactcaag agttggaatc atttgaattc tgatacaatt 420
ttcattggac aaaacttgat tgtttcacaa tctgccggtt cttcaagttc ttcaacaggt 480
tcaagctcag cctctacgag ttcaacttct aactcttctg cagcttcaaa tacctctatc 540
cataaggttg ttaaaggaga tacgctttgg ggactttcac aaaaatctgg tagcccaatt 600
gcttcaatta aggcttggaa tcatttatca agtgatacca ttttaattgg tcaatatctt 660
cgtattaaag aggatccgat gcatggagat acacctacat tgcatgaata tatgttagat 720
ttgcaaccag agacaactgg tctctacggt tatgggcaat taaatgacag ctcagaggag 780
gaggatgaaa tagatggtcc agctggacaa gcagaaccgg acagagccca ttacaatatt 840
gtaacctttt gttgcaagtg tgactctacg cttcggttgt gcgtacaaag cacacacgta 900
gacattcgta ctttggaaga cctgttaatg ggcacactag gaattgtgtg ccccatctgt 960
tctcagaaac cataa 975
<210> 4
<211> 624
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 4
atgcatggag atacacctac attgcatgaa atatgttaga tttgcaacca gagacaactg 60
gtctctacgg ttatgggcaa ttaaatgaca gctcagagga ggaggatgaa atagatggtc 120
cagctggaca agcagaaccg gacagagccc attacaatat tgtaaccttt tgttgcaagt 180
gtgactctac gcttcggttg tgcgtacaaa gcacacacgt agacattcgt actttggaag 240
acctgttaat gggcacacta ggaattgtgt gccccatctg ttctcagaaa ccactcgagg 300
cagctgccgt tgaagcggcc aagacagctg gtaaaggcga cgatacaagc ggtactagcg 360
acaaaggcgg cggtcaaggt accccggcgc ccgctccagg cgacacaggt aagaacaaag 420
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cattacccaa gacagcagag acaactgagc ggccagcgtt tggcttcttg ggtgtcattg 600
tggtcagtct gatgggggta ttag 624
Claims (7)
- 인유두종 바이러스(HPV)의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드를 균체 표면에 갖는 유산균 함유 조성물로서,
상기 HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드의 함유량이, 유산균 1×108 균체당 0.03㎍∼1.0㎍인 것을 특징으로 하는 유산균 함유 조성물. - 제 1 항에 있어서,
HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드가, 유산균의 균체 표면에 결합된 것인 유산균 함유 조성물. - 제 1 항에 있어서,
HPV의 E7 단백질 유래의 폴리펩티드가, 유산균의 균체 표면에 발현된 것인 유산균 함유 조성물. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
유산균이, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)인 유산균 함유 조성물. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 유산균 함유 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물.
- 제 5 항에 있어서,
자궁경부 상피내 종양 및 초기 자궁경부암 중 적어도 어느 하나의 치료용인 HPV 감염증 및 HPV 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 유산균 함유 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 점막 면역 유도제.
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