KR20070078561A - 비독성 콜레라 독소 ｂ 서브유닛과 사람 파필로마바이러스16형 ｅ7의 단백질이 융합된 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae)의 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB; cholera toxin B subunit)과 사람 파필로마바이러스 16형 E7 (HPV16 E7)의 융합단백질(chimeric protein)과 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 융합단백질은 사람 파필로마바이러스 16형 E7에 대한 특이적인 항체를 유발시킴과 동시에 점막면역반응을 효과적으로 유도하므로, 자궁경부암의 예방 또는 치료를 위한 경구용 백신의 제조에 유효성분으로서 이용될 수 있다.

CTB, HPV16 E7, 융합단백질, 항체, 점막면역반응, 자궁경부암, 경구용 백신.

Description

비독성 콜레라 독소 Ｂ 서브유닛과 사람 파필로마바이러스 16형 Ｅ7의 단백질이 융합된 단백질 및 이의 용도 {Chimeric protein consisting of CTB and HPV16 E7 protein and the use thereof}

도 1는 본원발명의 HPV16 E7와 CTB의 재조합 유전자인 E7-CTB의 모식도이고,

도 2은 대장균 발현벡터인 pET29a에 HPV16 E7와 CTB의 재조합 유전자인 E7-CTB를 서브클로닝 할 위치를 나타낸 모식도이며,

도 3은 대장균 발현벡터인 pET29a에 E7-CTB 재조합 유전자를 서브클로닝 하여 플라스미드 E7-CTB/pET29a를 만드는 과정을 나타낸 모식도이고,

도 4는 HPV E7과 CTB를 재조합한 유전자를 얻어낸 다음 확인하기 위해 EcoR1, Xho1 두 개로 자른 것과 BamH1 하나로 자른 것을 확인하기 위해 1% 아가로스 젤에 전기영동 한 결과를 나타낸 도이며,

도 5은 본원발명의 플라스미드 E7-CTB/pET29a로 형질전환 된 대장균 BL21:E7-CTB/pET29a의 세포파쇄액을 12 % SDS 폴리아크릴아미드 젤 (SDS poleacrylamide gel)에 적용하여 전기영동 한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae)의 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB; cholera toxin B subunit)과 사람 파필로마바이러스 (HPV) 16형 E7의 융합단백질 (chimeric protein)과 이의 용도에 관한 것이다.

파필로마바이러스 (Papilloma virus)는 길이 약 45~55 nm, 8 kb 크기를 가진 이중나선상의 DNA 바이러스로써 토끼의 유두종에서 발견되었다. 처음에는 파필로마바이러스가 양성 종양 뿐 아니라 악성 종양의 발생에 관여하는 것으로만 알려져 있었는데 이후 대부분의 동물에 보편적으로 존재함이 밝혀지면서 동물계 종양바이러스의 하나로 취급하게 되었다. 1970년대 전반까지 파필로마바이러스는 사람에게 감염을 일으켜 피부질병을 일으키는 바이러스로 잘 알려져 있었다. 그런데 1970년대를 전후하며 암 조직 내에서도 파필로마바이러스가 존재한다는 것이 알려지면서 각광을 받게 되었다. 특히 새로운 종의 파필로마바이러스가 밝혀지는 과정에서 자궁경부암의 발병과 밀접한 관련이 있다는 것이 밝혀지면서 자궁경부암과 관련하여 많은 실험이 이루어지게 되었다. 그 결과 파필로마바이러스와 다양한 종류의 질환들과의 관계가 서서히 알려지게 되었고, 자궁경부암 뿐 아니라 전립선암, 구강암, 후두암, 폐암, 식도암, 생식기 양성 종양, 피부암 등의 다양한 종류의 종양과 밀접한 관련이 있는 것을 알게 되었다. 현재 약 100여종 이상의 다른 유전형의 파필로마바이러스가 알려져 있으며 그 위험성에 따라 크게 고위험군, 중위험군, 저위험군의 세가지로 분류된다. 고위험군으로는 자궁암의 원인군으로 약 70 %를 차지하는 16형 및 18형이며, 중위험군으로는 31, 32, 35, 45, 52형이 있고, 저위험군으로는 6, 11형의 파필로마바이러스가 있다.

세계적으로 자궁경부암은 암으로 인한 여성 사망원인의 2위를 차지하고 있는 질병으로 세계보건기구의 추정에 따르면 매년 자궁경부암으로 진단받는 여성이 약 51만 명에 이르고 그 중의 약 56 %에 이르는 28만 8천명 정도가 사망한다. 또한 자궁경부암은 미국이나 선진국의 발병률이 10위인데 반해 우리나라나 다른 후진국의 경우, 유방암과 더불어 매년 발병률 1,2위를 달리고 치사율이 매우 높은 질병이다. 자궁경부암의 발생은 나이와 성교 개시 연령이 낮거나, 불특정다수의 성교 상대를 갖는 것과 관계가 있다고 밝혀졌다. 15~25살 까지는 꾸준히 발병이 증가하지만 그 시기를 정점으로 하여 그 이후에는 감소하는 것이 확인 되었다 (Scheurer ME et al., Int . J. Gynecol . Cancer, 15(5), pp727-746, 2005). 또한 자궁경부암의 원인으로 매독이나 클라미디아 등과 같은 성병의 성적 감염인자가 주요 원인으로 지적되어왔다. 자궁경부암이 발병되는 부위인 자궁경부는 만성염증이 일어나기 쉬운 부위이므로 더욱 발병률이 높다. 파필로마바이러스의 일반적인 감염증인 피부 사마귀 같은 것들은 염증반응을 나타내지 않을뿐더러 숙주의 바이러스에 대한 강한 면역반응이 일어나므로 병변이 자연 퇴축되는 경우도 많고, 이러한 경우 숙주에서 중화 항체 (neutralizing antibody)의 존재가 발견된다. 중화항체가 만들어지는 자궁경부암 환자를 포함한 여성에서 파필로마바이러스의 항체를 조사한 결과, 파필로마바이러스 16형 E6 단백질에 대한 항체는 18.1%, E7 단백질에 대해서는 3.9%를 보였으며, 특히 11세~20세 여성 사이에서는 40.7%가 16형의 E6 단백질의 항체가 존재함 을 확인 할 수 있었다. 자궁경부암을 일으키는 파필로마바이러스는 고위험균인 16형이나 18형이 대부분을 차지한다. 16형과 18형의 파필로마바이러스가 자궁경부암을 일으키는 과정은 E6나 E7 같이 초기에 발현하는 유전자와 나중에 발현하는 L1, L2 같은 유전자의 작용에 의해 유도되는 것으로 밝혀졌다 (Sanclemente G and Gill DK, J. Eur . Acad . Dermatol . Venereol., 16(3), pp231-240. 2002). 그러므로 파필로마 바이러스의 백신에 대한 연구와 백신의 개발은 주로 16형과 18형의 E6, E7 단백질을 이용하는 방향으로 이루어졌다. E6나 E7 단백질 항원에 대한 면역반응을 유도하여 항체를 생산하여 제거하는 한편, 바이러스에 감염된 세포를 파괴하여 제거하기 위한 면역반응이 일어나므로 결국 바이러스의 감염으로부터 치료되는 효과를 얻을 수 있는 것이다.

자궁경부암 백신 개발은 크게 예방백신과 치료백신, 두 가지 형태의 방법으로 연구가 진행되었다. 예방 백신은 HPV의 L1과 L2 단백질에 의하여 중화 항체가 생성되게 하여 숙주가 HPV에 감염되는 것을 방지하고, 감염되었다면 질병이 더 진행되지 않도록 하는 것에 중점을 둔다. 반면 치료 백신은 HPV의 E6와 E7 유전자를 이용하여 면역을 유도하므로 종양이나 암을 죽이므로 치료하는 방법을 취한다. 현재까지 주로 개발된 백신의 형태는 박테리아, 효모, 동물 세포 등을 이용하여 HPV 유전자로 인해 만드는 재조합 생백신 (live recombinant vaccine)이나 펩타이드 등의 형태이다.

우리 몸에 질병을 일으키는 주요 항원은 각종 미생물로써 주로 공기나 음식물을 매개체로 하여 우리 몸의 호흡기관이나 소화기관의 점막 부분을 통해 침투한 다. 우리 몸의 점막부분은 감염 통로가 되는 동시에 초기 면역 반응을 유도한 중요한 부분이다. 이러한 점막조직은 크게 두 개의 두 부분으로 나눌 수 있다. 코와 입으로 흡입되는 기체성 항원들에 대하여 반응하는 비강과 입의 천정 부분의 조직으로 주로 구성된 비강 관련 림프 조직 (Nasal Associated Lymphoid Tissue, NALT)과 음식물이나 액체 상태의 항원들이 주로 침투하는 소장과 대장의 표면으로 이루어진 위장관 관련 림프 조직 (Gut Associated Lymphoid Tissue, GALT)이다. 주요 점막 조직인 NALT와 GALT 이 둘을 합하여 복합 관련 림프 조직 (multiple Associsted Lymphoid Tissue; MALT)라고 부르기도 한다. 이중 GALT는 페이어 패치 (Payer's patches; PP), 장간막 림프절 (mesenteric lymph nodes; MLN) 및 점막고유층 (lamina propria)과 소장 상피에 걸쳐 분산되어 있는 수많은 림프세포로 구성된다. 페이어 패치는 항원 자극을 일으키는 장소로서, 돔 모양의 지역이 난포연합성 상피세포 (M 세포)로 덮혀있다. M세포의 상피내 함입부 (intraepithelial pocket)은 고분자 물질, 미생물, 바이러스 등의 엔도시토시스 (endocytosis) 경로 및 수송 경로를 제공한다. 수송된 분자는 항원을 보유한 조세포 및 림프 세포에 의해서 가공되어 숙주의 국소 면역반응을 자극하는데, 상기 국수 면역반응은 점막에서의 면역반응으로 M 세포를 통한 항원의 수송에 의존한다 (Wolf JL and Bye WA, Ann . Rev . Med., 35, pp95-112, 1984).

감염성 질병의 유발은 이런 점막표면을 통한 병원성 물질의 침입으로부터 시작되며 이에 대한 면역계의 방어 또한, 점막표면 상에서 병원성 물질에 대응하기 위한 기작을 포함하기 때문에, 혈관이나 근육에 주사된 백신은 점막면역과 관련된 일련의 반응들을 효과적으로 유도하지 못한다는 단점을 가지고 있다. 이러한 단점을 해소하기 위해 소화기관, 비뇨생식기관, 또는 호흡기관 등의 점막조직 분포 구역을 통한 백신전달방법의 연구가 활발히 이루어져 왔으며, 그 결과 장의 점막부분을 통해 흡수되게 하는 경구투여 방법에 대한 연구가 많이 이루어졌는데 경구투여 백신은 투여 방법이 간단하다는 장점 외에 흡수 효율만 보장된다면 전달 (delivery)이 매우 쉽기 때문에 대량으로 면역을 일으키기에도 유용하다는 장점이 있다. 그러나 연구의 결과는 기대만큼 좋지 못했는데 그 원인은 백신이 점막 표면으로 항원의 흡수가 제대로 이루어지지 않았기 때문이었다.

효과적으로 점막에 흡수되는 백신 문제를 해결하기 위해 연구하던 중 사람의 장에 서식하며 설사를 일으키는 대장균 (E. coli)와 비브리오 콜레라 (Vibrio Cholera)의 장내 침투 유전자 등의 세균성 내부 독소인 열-불안정성 장독소 (Heat labile enterotoxin, LT)와 콜레라 독소 (Cholera toxin, CT)를 이용하여 점막부분으로의 흡수를 효과적으로 높이는 방법이 대두되었다. LT와 CT는 자체 내재된 독성 때문에 사용의 제약이 있어, 그들의 유전자 중 독성은 없으며 점막 침투능력은 동일한 대장균 열-불안정성 장독소 B 서브유닛 (Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit, LTB)과 비브리오 콜레라의 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛 (cholera toxin B subunit, CTB)을 이용하게 되었다. LTB와 CTB는 서로 비슷한 크기와 구조로 생화학적 특징도 거의 비슷하여 이들을 백신의 흡수를 돕는 보조제 (adjuvant)로 사용하는 연구가 다양하게 이루어져왔다. LTB와 CTB는 항원과 관련되지 않은 다양하고 조직적인 항체 반응 뿐만 아니라 점막의 분비성 면역글로불린A (Secretory IgA, S-IgA)가 생성되도록 하는 운반체의 역할도 담당하고 있음을 알게 되었다.

자궁암 치료에 유용하게 이용될 수 있는 사람 파필로마바이러스 16형 E6 단백질에 대한 특허로는 단백질 대량 생산방법 (대한민국 등록특허공보 10-196416), 자궁암 치료제 조성물에 대한 특허 (대한민국 등록특허공보 10-207956), 항암제 (대한민국 등록특허공보 10-380288) 등이 있으나, 본 발명의 융합단백질을 자궁경부암의 치료를 위한 백신의 유효성분으로 이용한 예는 상기 문헌 어디에도 교시되거나 기재된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛과 사람 파필로마바이러스 16형 E7의 융합단백질을 발현할 수 있는 미생물 시스템을 제작하여 정제 및 내독소 제거하여 수득한 본 발명의 융합단백질을 항원으로 작용시켰을 때 사람 파필로마바이러스 16형 E7에 대한 특이적인 항체를 유발시킴과 동시에 점막면역을 효과적으로 유도함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛과 사람 파필로마바이러스 16형 E7의 융합단백질 및 이를 함유하는 자궁경부암 예방 및 치료를 위한 경구용 백신을 제공하는 것이다.

상기 목적을 수행하기 위하여, 본 발명은 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae)의 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB; cholera toxin B subunit)의 유전자 및 사람 파필로마바이러스 16형 E7 (HPV16 E7)의 유전자가 재조합된 유전자 E7-CTB로부터 발현되는 융합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터가 도입된 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 융합 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 형질전환 미생물에 도입하는 제 1단계; 형질전환된 미생물을 배양하여 상기 융합 단백질을 대량 발현시키는 제 2단계; 상기 배양한 형질전환된 미생물로부터 상기 융합 단백질을 분리, 정제 및 내독소를 제거하는 제 3단계로 이루어짐을 특징으로 하는 융합 단백질의 생산방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 방법으로 생산된 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 경구 투여용 백신을 제공한다.

이하, 본 발명은 상세히 설명한다.

본 발명은 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae)의 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB; cholera toxin B subunit)의 유전자 및 사람 파필로마바이러스 16형 E7 (HPV16 E7)의 유전자가 재조합된 유전자 E7-CTB로부터 발현되는 융합 단백질을 제공한다.

본 발명에서 상기 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB; cholera toxin B subunit)은 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛이며, 상기 사람 파필로마바이러스 16형 E7 (HPV16 E7)은 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛은 신호 펩티드 (signal peptide)가 결실 (deletion)된 부위인 23-124번 아미노산으로 기재되는 서열을 포함하는 것이 가장 바람직하다. 그러나, 본 발명의 융합단백질은 상기 서열에 한정되는 것은 아니며, 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB; cholera toxin B subunit)과 사람 파필로마바이러스 16형 E7 (HPV16 E7)를 융합시킨 모든 가능한 융합단백질을 포함한다.

본 발명의 융합단백질은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 융합단백질을 수득하기 위해, 서열번호: 1의 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB)의 유전자, 바람직하게는 신호 펩티드 부위가 결실된 CTB 유전자와 서열번호: 3의 사람 파필로마바이러스 16형 E7 (HPV16 E7)의 유전자를 수득하여 연결 (ligation) 반응을 통해 서열번호: 5의 재조합 유전자 E7-CTB를 제작할 수 있다. 상기의 방법으로 제작된 재조합 유전자 E7-CTB를 대장균에서 발현시키기에 적당한 벡터, 바람직하게는 pET29a (Novagen사, 미국)에 삽입함으로써 본 발명의 플라스미드를 제조할 수 있다. 상기와 같이 제조한 플라스미드를 적당한 숙주 미생물, 바람직하게는 대장균 BL21(DE3)에 삽입하여 형질전환시킨 후 (수탁번호 KCTC 10894BP), 서열번호: 6의 본 발명의 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB; cholera toxin B subunit) 및 사람 파필로마바이러스 16형 E7 (HPV16 E7)의 융합 단백질 E7CTB의 발현을 위해 적당한 배지, 예를 들면 카나마이신(70㎍/ml)을 포함하는 LB배지 (1 ℓ당 트립톤 10 g, 효모 추출물 5 g 및 염화나트륨 10 g)에서 형질전환된 균주를 배양하면서, 이소프로필-베타-디-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 배양액에 첨가하여 융합 단백질의 발현을 유도하고, 본 발명의 융합 단백질 E7CTB의 C-말단에 있는 히스티딘 잔기가 붙을 수 있는 니켈 비드 컬럼을 이용하여 정제하고 내독소를 제거함으로써 본 발명의 융합 단백질 E7CTB를 수득할 수 있다.

본 발명은 상기 방법으로 생산 가능한 융합단백질을 코딩하는 재조합 유전자, 바람직하게는 비브리오 콜레라의 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB; cholera toxin B subunit)의 신호 펩티드 부위가 제거된 cDNA와 사람 파필로마바이러스 16형 E7 (HPVE7)의 DNA를 연결시킨 재조합 유전자, 서열번호: 5의 염기서열을 갖는 재조합 유전자를 포함한다. 그러나, 본 발명의 유전자는 상기 서열에만 한정되는 것이 아니며, 모든 비브리오 콜레라의 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB; cholera toxin B subunit)과 사람 파필로마바이러스 16형 E7 (HPV16 E7)의 융합단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다.

본 발명은 상기 융합단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터, 바람직하게는 도 4에 도시된 개열지도를 갖는 플라스미드 E7-CTB/pET29a인 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터가 도입된 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생 물, 바람직하게는 형질전환된 대장균을 제공한다.

본 발명자들은 상기 벡터가 도입된 형질전환된 대장균을 “BL21:E7-CTB/pET29a"라 명명하고, 이를 2006년 1월 16일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호 KCTC 10894BP).

또한, 본 발명은 융합 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 형질전환 미생물에 도입하는 제 1단계; 형질전환된 대장균을 배양하여 상기 융합 단백질을 대량 발현시키는 제 2단계; 상기 배양한 형질전환된 미생물로부터 상기 융합 단백질을 분리, 정제 및 내독소를 제거하는 제 3단계로 이루어짐을 특징으로 하는 융합 단백질의 생산방법을 제공한다.

본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 본 발명의 융합단백질 E7CTB를 유효성분으로 함유하는 자궁경부암의 예방 또는 치료를 위한 경구용 백신을 제공한다.

본 발명의 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 백신은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 백신의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 융합단백질을 포함하는 백신은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비 톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 융합단백질을 포함하는 백신의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내 지 1000 mg/㎏의 양을 1주에 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질환의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고 예 1. 사용 세포의 배양

미국 표준 균주 (ATCC; American Type Culture Collection)로부터 구입한 CaSki 세포주 (ATCC CRL-1550)를 배양하기 위하여 10 % 우태아 혈청 (FBS, fetal bovine serum, sigma, USA)이 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, sigma, USA) 배지를 사용하였으며, 37 ℃에서 6 %의 이산화탄소 (CO₂) 농도를 유지하면서 배양하였다.

실시 예 1. CTB 및 HPV16 E7 의 재조합 유전자 제작

1-1. CTB 유전자의 확보

본 발명의 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB) 단백질을 발현하는 유전자를 얻기 위해 비브리오 콜레라의 게놈 DNA를 미국 표준 균주(ATCC, American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였다. 구입한 콜레라 게놈 DNA를 주형으로 하여 하기의 조건으로 중합효소연쇄반응 (Polymerase chain reaction ,PCR)을 수행함으로서 본 발명의 CTB 유전자를 증폭하였다. CTB 유전자를 증폭하기 위해 디자인한 서열번호: 7 (5‘- GC GGA TCC ATG ATT AAA TTA AAA TTT GGT -3)의 정방향 (forward) 프라이머와 서열번호: 8 (5‘- GCT CGA GAT TTG CCA TAC TAA TTG CGG C -3)의 역방향 (reverse) 프라이머 각각 5 pmole, 10 μM dNTP , Taq polymerase (2 unit/㎕) 1 ㎕, 1× 반응완충액을 넣고 증류수로 최종 부피가 50 ㎕가 되게 한 후 45 cycle로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 이때 반응시간은 변성 (denaturation; 95℃, 30초), 결합 (annealing; 45℃, 1분), 신장 (extention; 72℃, 1분)으로 하였다. 이 결과 증폭된 CTB 유전자를 1 % 아가로스 젤에 적용하여 전기영동한 후 크기 (306 bp)를 확인하고 원하는 CTB 유전자가 증폭되었음을 확인하였으며, 하기 실험의 재료로 사용하였다.(이하, CTB라 명명함)

1-2. HPV16 E7 유전자의 확보

본 발명의 HPV16 E7 유전자를 수득하기 위해 사람 자궁경부암 세포인 CaSki 세포를 상기 참고 예와 같이 배양한 후 세포를 수거하여 트리졸 (TRIzol, Invitrogen, USA)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였다.

상기의 CaSki 전체 RNA를 주형으로 cDNA를 합성한 후 합성된 cDNA를 주형으로 하여, 서열번호: 9 (5‘- GC GAA TTC ATG CAT GGA GAT ACA CCT ACA -3’)의 정방향 (forward) 프라이머와 서열번호: 10 (5‘- GC GGA TCC TGG TTT CTG AGA ACA GAT GGG - 3’)의 역방향 (reverse) 프라이머를 사용하여 HPV16 E7 유전자를 증폭하는 역전사-중합효소연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하였다. PCR이 끝난 뒤 증폭된 HPV16 E7 유전자를 1 % 아가로스 젤에 적용하여 전기영동한 후 크기(294 bp)를 확인하고 원하는 HPV16 E7 유전자가 증폭되었음을 확인하였으며, 하기 실험의 재료로 사용하였다 (이하, HPV16E7이라 명명함).

1-3. E7 - CTB 재조합 유전자 제작

앞부분에 HPV16E7 유전자를 위치시키고 뒷부분에 CTB 유전자를 연결할 수 있도록, 상기에서 수득한 HPV16 E7 및 CTB 유전자 10㎕에 제한효소 BamH 1을 넣어주고 37 ℃에서 1시간 처리하여 각각 절단한 후, 절단한 DNA 2 ㎕, DNA 연결효소 (T4 DNA ligase, Roche, USA) 2 ㎕, 10× 완충액 2 ㎕, 멸균수 13.5 ㎕를 사용한 연결 반응 (ligation, 37 ℃, 1시간) 을 통해 두 유전자를 재조합하였다. 재조합 한 유전자를 확인하기 위해 1 % 아가로스 젤에 적용하여 전기영동한 후 크기 (600bp)를 확인하여 HPV16E7-CTB 재조합 유전자 (이하, E7-CTB라 명명함)의 제작을 확인하였으며, 하기 실험의 재료로 사용하였다 (도 1 참조).

실시예 2. 재조합 발현벡터 E7 - CTB / pET29a 의 제작 및 균주의 형질전환

대장균 발현벡터인 pET29a (Novagen, Madison, WI, 미국) 및 상기 실험예 1-3의 E7-CTB를 제한효소 EcoRI 및 XhoI으로 처리한 후, 발현벡터와 재조합 유전자의 연결 (ligation)반응을 수행하고 대장균 발현주인 BL21(DE3) (Stratagene, USA)에 형질전환 (transformation)하였으며, 형질전환체는 카나마이신 (70 ㎍/㎖, Sigma, USA)이 첨가된 LB 플레이트에 깔아 콜로니를 배양하였다. 배양한 콜로니로부터 키트를 사용하여 (QIAprep miniprep kit, Qiagen, Germany)플라스미드 DNA를 뽑아낸 다음, 제한효소 EcoRI 및 XhoI으로 처리하고 전기영동하여 형질전환 여부를 확인하였다. 형질전환체로부터 약 600bp크기의 E7-CTB 재조합 유전자가 삽입된 발현벡터 (5971bp)를 확인할 수 있었으며, 이를 E7-CTB/pET29a라 명명하였다 (도 3 및 도 4 참조).

상기 형질전환균주를 카나마이신 (70 ㎍/㎖, Sigma, USA)이 첨가된 LB 배지에서 하루밤 배양하였으며, 선별된 형질전환균주 BL21:E7-CTB/pET29a를 생명공학연구원 내 유전자 은행에 균주로 기탁하였다 (수탁번호 KCTC 10894BP).

실시예 3. 융합 단백질 E7CTB 의 발현, 정제 및 내독소제거

3-1. 융합 단백질 E7CTB 의 발현

상기 기탁된 형질전환균주 BL21:E7-CTB/pET29a (수탁번호 KCTC 10894BP)를 카나마이신 (70 ㎍/㎖)을 포함하는 LB 배지 1 ℓ(트립톤 10 g, 효모 추출물 5 g, 염화나트륨 10 g)에 접종하고 37 ℃에서 진탕배양 하여 600 nm에서의 흡광도가 0.4~ 0.6 정도 되었을 때 (Ultrospec1100pro, Amersham Bioscience, USA) 이소프로필-베타-디-티오갈락토피라노시드 (IPTG; isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, Sigma, USA)를 최종 농도가 0.5 mM 되도록 첨가한 뒤 배양 온도를 25 ℃로 낮추어 진탕배양하여 융합단백질 E7CTB의 발현을 유도하였다. 4시간 배양한 뒤 단백질의 발현이 유도된 배양 세포를 원심분리기 (UNION 55R, 한일, KOREA)를 사용하여 3500 rpm, 4 ℃에서 10분간 원심분리하여 배양액은 버리고 균체를 수득하였다. 얻어낸 균체를 분산액인 트리스 완충용액 (Tris-HCl, pH8.0)을 첨가하여 재현탁 (resuspension)시킨 뒤 상기와 동일한 조건에서 원심분리하여 상등액을 버리는 방법으로 3번 이상 세척한 후, 단백질분해효소 저해제 (protease inhibitor, Sigma, USA)가 함유된 1× 인산염완충액 (PBS, Phosphate buffered saline)으로 풀어 초음파분쇄기 (sonicator, GE, USA)로 30초씩 3번 얼음에 담근 상태에서 파쇄하였다. 파쇄 후 원심분리 (5000rpm, 15분)하여 수득한 상등액은 4 ℃에 보관하였으며, 침전물은 8 M 우레아 (UREA)를 첨가, 재현탁하여 12000 rpm, 4 ℃에서 15분간 원심분리한 후 상등액을 수득하여 4 ℃에 보관하였다. 본 발명의 융합단백질 E7CTB의 발현 확인을 위해 4종류 (발현하지 않은 형질전환세포, 4시간 발현한 형질전환체, 발현시킨 형질전환체를 초음파 파쇄하여 수득한 상등액 및 침전물을 8M 우레아로 재현탁, 초음파 파쇄하여 수득한 상등액)의 샘플 각각 20㎕과 5X sample buffer 5㎕를 섞은 다음 끓는 물에서 10분간 끓여서 샘플을 준비하였다. 준비된 상기 샘플들은 12 % SDS-폴리아크릴아미드 젤에 적용하여 전기영동하여 발현여부를 확인하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 펠렛을 8M 우레아로 녹여 초음파 파쇄하여 수득한 상등액 샘플에서 본 발명의 융합단백질 E7CTB의 발현을 확인하였다.

3-2. 융합단백질 E7CTB 의 발현, 정제 및 내독소제거

융합단백질 E7CTB를 정제하기 위하여 형질전환균주 BL21:E7-CTB/pET29a를 카나마이신을 함유한 LB 배지 100 ㎖에 배양하였으며, 원심분리하여 수득한 균체(약 0.4~0.6g)를 Tris-HCl(pH8.0)으로 세척하고, 1X PBS를 넣고 균체를 현탁한 다음 초음파분쇄기를 사용하여 파쇄하였다.

발현된 융합단백질 E7CTB는 원심분리한 침전물의 구역에 존재하므로 파쇄액을 원심분리한 후, 상층액을 버리고 남은 침전물을 8M 요소 (UREA)에 용해하여 융합단백질 E7CTB를 함유하는 용액을 수집하였다. 이후, E7CTB 단백질의 정제를 위해서, 본 발명의 융합단백질 E7CTB 발현시 단백질의 C-말단에 발현된 히스티딘 잔기를 이용하여 니켈 비드 컬럼 (His-trap chelating HP column, Amersham bioscience, Uppsala, Sweden) 1 ㎖에 흡착시킨 후, 흡착된 융합 단백질 E7CTB는 이미다졸 (imidazole)의 농도를 100 mM로 증가 시킨 것을 사용하여 하여 정제하였다. 상기의 과정으로 수득한 융합 단백질 E7CTB는 LAL 어세이 Kit (QCL-1000, Camblex bioscience, USA)를 이용한 LAL 어세이 (Limulus amoebocyte lysate assay) 방법을 사용하여 내독소 (endotoxin)의 농도를 측정하였으며, 상기 정제물을 내독소 제거 컬럼 (AffinityPak Detoxi-Gel, Pierce, Rockford, USA)에 적용, 내독소를 제거하여 융합단백질의 정제를 완료하였다.

본 발명의 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB; cholera toxin B subunit)과 사람 파필로마바이러스 16형 E7 (HPV16 E7)의 융합단백질은, 사람 파필로마바이러스 16 형 E7에 대한 특이적인 항체를 유발시킴과 동시에 점막면역반응을 효과적으로 유도하므로, 자궁경부암의 예방 또는 치료를 위한 경구용 백신의 제조에 유효성분으로 사용될 수 있다.

<110> Good Cell Life Co.,Ltd. <120> Chimeric protein consisting CTB and HPV16 E7 protein and the use thereof. <130> DIF/2005-12-0012/LH <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 375 <212> DNA <213> Vibrio cholerae <220> <221> sig_peptide <222> (4)..(66) <400> 1 atgattaaat taaaatttgg tgtttttttt acagttttac tatcttcagc atatgcacat 60 ggaacacctc aaaatattac tgatttgtgt gcagaatacc acaacacaca aatatatacg 120 ctaaatgata agatattttc gtatacagaa tctctagctg gaaaaagaga gatggctatc 180 attactttta agaatggtgc aatttttcaa gtagaagtac caggtagtca acatatagat 240 tcacaaaaaa aagcgattga aaggatgaag gataccctga ggattgcata tcttactgaa 300 gctaaagtcg aaaagttatg tgtatggaat aataaaacgc ctcatgcgat tgccgcaatt 360 agtatggcaa attaa 375 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <220> <221> SIGNAL <222> (2)..(22) <400> 2 Met Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu Ser Ser 1 5 10 15 Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu 20 25 30 Tyr His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr 35 40 45 Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys 50 55 60 Asn Gly Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp 65 70 75 80 Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala 85 90 95 Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys 100 105 110 Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn 115 120 <210> 3 <211> 297 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 16 <400> 3 atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60 gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120 ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180 tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240 gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 297 <210> 4 <211> 98 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 4 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 5 <211> 621 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E7-CTB recombinant DNA <220> <221> misc_recomb <222> (1)..(6) <223> EcoRI cleavage site <220> <221> misc_recomb <222> (301)..(306) <223> BamHI cleavage site <220> <221> misc_recomb <222> (616)..(621) <223> XhoI cleavage site <400> 5 gaattcatgc atggagatac acctacattg catgaatata tgttagattt gcaaccagag 60 acaactgatc tctactgtta tgagcaatta aatgacagct cagaggagga ggatgaaata 120 gatggtccag ctggacaagc agaaccggac agagcccatt acaatattgt aaccttttgt 180 tgcaagtgtg actctacgct tcggttgtgc gtacaaagca cacacgtaga cattcgtact 240 ttggaagacc tgttaatggg cacactagga attgtgtgcc ccatctgttc tcagaaacca 300 ggatccacac ctcaaaatat tactgatttg tgtgcagaat accacaacac acaaatatat 360 acgctaaatg ataagatatt ttcgtataca gaatctctag ctggaaaaag agagatggct 420 atcattactt ttaagaatgg tgcaattttt caagtagaag taccaggtag tcaacatata 480 gattcacaaa aaaaagcgat tgaaaggatg aaggataccc tgaggattgc atatcttact 540 gaagctaaag tcgaaaagtt atgtgtatgg aataataaaa cgcctcatgc gattgccgca 600 attagtatgg caaatctcga g 621 <210> 6 <211> 207 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E7CTB chimeric protein <400> 6 Glu Phe Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp 1 5 10 15 Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp 20 25 30 Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu 35 40 45 Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp 50 55 60 Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr 65 70 75 80 Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys 85 90 95 Ser Gln Lys Pro Gly Ser Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala 100 105 110 Glu Tyr His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser 115 120 125 Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe 130 135 140 Lys Asn Gly Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile 145 150 155 160 Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile 165 170 175 Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn 180 185 190 Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Leu Glu 195 200 205 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTB forward primer <400> 7 ccggatccac acctcaaaat attactgat 29 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTB reverse primer <400> 8 gctcgagatt tgccatacta attgcggc 28 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV16 E7 forward primer <400> 9 gcgaattcat gcatggagat acacctaca 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV16 E7 reverse primer <400> 10 gcggatcctg gtttctgaga acagatggg 29

Claims (12)

1. 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae)의 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB; cholera toxin B subunit)의 유전자 및 사람 파필로마바이러스 16형 E7 (HPV16 E7)의 유전자가 재조합된 유전자 E7-CTB로부터 발현되는 융합 단백질.
2. 제 1항에 있어서, 상기 비독성 콜레라 독소 B 서브유닛은 신호 펩티드 (signal peptide) 부위가 결실 (deletion)됨을 특징으로 하는 융합단백질.
3. 제 1항에 있어서, 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 융합 단백질.
4. 제 1항의 융합 단백질을 코딩하는 재조합 유전자.
5. 제 4항에 있어서, 서열번호 5의 염기 서열을 가지는 재조합 유전자.
6. 제 4항의 재조합 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
7. 제 6항에 있어서, 상기 벡터는 도 3에 도시된 개열지도를 갖는 플라스미드 E7-CTB/pET29a인 것을 특징으로 하는 벡터.
8. 제 6항의 벡터가 도입된 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
9. 제 8항에 있어서, 상기 형질전환된 미생물은 제 6항의 벡터가 도입되어 있는 대장균 BL21(DE3):E7-CTB/pET29a임을 특징으로 하는 형질전환된 미생물 (수탁번호: KCTC 10894BP).
10. 융합 단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 형질전환 미생물에 도입하는 제 1단계; 형질전환된 미생물을 배양하여 상기 융합 단백질을 대량 발현시키는 제 2단계; 상기 배양한 형질전환된 미생물로부터 상기 융합 단백질을 분리, 정제 및 내독소를 제거하는 제 3단계로 이루어짐을 특징으로 하는 융합 단백질의 제조 방법.
11. 제 10항에 있어서, 상기 형질전환된 미생물은 상기 제 8항의 형질전환된 미생물인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
12. 제 10항의 방법으로 생산된 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 경구 투여용 백신.

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