JP2018158954A - 乳酸菌含有組成物、hpv感染症及びhpv関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物、及び粘膜免疫誘導剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】優れた粘膜免疫誘導能を有する乳酸菌含有組成物を提供すること。
【解決手段】ヒトパピローマウイルス(HPV)のE7タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌含有組成物であって、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドが、乳酸菌の菌体表面に結合又は発現されたものであり、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における含有量が、乳酸菌1×108菌体当たり、0.03μg〜1.0μgであることを特徴とする乳酸菌含有組成物。
【選択図】なし
【解決手段】ヒトパピローマウイルス(HPV)のE7タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌含有組成物であって、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドが、乳酸菌の菌体表面に結合又は発現されたものであり、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における含有量が、乳酸菌1×108菌体当たり、0.03μg〜1.0μgであることを特徴とする乳酸菌含有組成物。
【選択図】なし
Description
本発明は、ヒトパピローマウイルス(HPV)のE7タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌含有組成物、並びに前記乳酸菌含有組成物を含むHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物及び粘膜免疫誘導剤に関する。
ヒトパピローマウイルス(HPV)はDNAウイルスであって、現在まで100種類以上の異なる型が報告されている。前記HPVは皮膚(例えば、HPV1、HPV2)や粘膜表面(例えば、HPV6、HPV11)に感染することで、数ヶ月から数年単位で存在する良性腫瘍(イボ)を形成する。
更に、前記HPVのうち15型(例えば、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58など)は、粘膜に長期間感染することで、悪性腫瘍を引き起こすことから高リスクHPVと呼ばれている。
更に、前記HPVのうち15型(例えば、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58など)は、粘膜に長期間感染することで、悪性腫瘍を引き起こすことから高リスクHPVと呼ばれている。
女性特有のがんとして乳がんに次いで罹患率が高い子宮頚がんについては、そのほぼ100%が、前記HPVの生殖器への長期間感染により発症するものであり、世界で53万人、日本でも1万5千人の新規患者が毎年報告されている。
子宮頚がんによる年間の死亡者数は、世界で27万人、日本でも3,500人に達する。
理論的には、前記HPVの感染の全てを未然に防ぐことができれば、前記子宮頚がんは完全に根絶することができる。
子宮頚がんによる年間の死亡者数は、世界で27万人、日本でも3,500人に達する。
理論的には、前記HPVの感染の全てを未然に防ぐことができれば、前記子宮頚がんは完全に根絶することができる。
前記HPVの感染は、前記子宮頚がん以外にも、外陰がん、肛門がん、口腔がん、腟がん、陰茎がん、咽頭がん、そして尖圭コンジローマ(性器イボ)にも関連していることが明らかになっており、これらのがん及び性感染症の予防のために、前記HPVの感染に対する予防ワクチンは有効であると考えられる。しかし、既存のHPV予防ワクチンは、高リスクHPVのうち2つの型しか予防できない。
前記HPVの中でも、特にHPV16とHPV18が、日本人女性の前記子宮頚がんの発症原因の約65%、特に20代では子宮頚がんの発症原因の約90%を占めている。
前記HPV16と前記HPV18は、前記外陰がんに先行してみられる外陰上皮内腫瘍の高度病変においても発症原因の50%弱を占め、更に前記腟がんに進行する可能性のある腟上皮内腫瘍の発症の85%にも関連していることが知られている。
前記HPV16と前記HPV18は、前記外陰がんに先行してみられる外陰上皮内腫瘍の高度病変においても発症原因の50%弱を占め、更に前記腟がんに進行する可能性のある腟上皮内腫瘍の発症の85%にも関連していることが知られている。
前記HPV感染による前記子宮頚がんの前がん病変である子宮頚部上皮内腫瘍(Cervical intraepithelial neoplasia;CIN)は、子宮腟部(子宮頚部の下半分、腟に突き出している部分)の粘膜上皮に発生する。HPV感染症は、性行為による微細な傷によってHPVが粘膜上皮(重層扁平上皮)の基底細胞に侵入し、扁平上皮内でウイルス増殖するウイルス感染症である。長期間持続的に上皮内でHPVが増殖すると、上皮細胞が不死化、癌化を生じる。これが子宮頚がんの起源であると考えられている。
前記子宮頚がんの発生過程では、基底細胞への前記HPVの増殖が持続すると、その一部でウイルス遺伝子が上皮細胞の遺伝子に挿入され、低レベルであったE6タンパク質とE7タンパク質の発現が持続的に亢進されるという変化が生じると考えられる。
前記E6タンパク質と前記E7タンパク質の発現は、ウイルス感染像であるCIN1(軽度異形成)では非常に低いのに対して、腫瘍化を遂げたCIN2(中度異形成)とCIN3(高度異形成)では高発現が認められることから、前記E6タンパク質と前記E7タンパク質の発現の持続的な亢進は前記CIN2以降で起こると考えられる。
前記HPVの前記E6タンパク質と前記E7タンパク質、その中でも特に前記E7タンパク質が、HPV関連がんに対する治療用ワクチンの開発においてとても魅力的なターゲットであると考えられる。E7タンパク質はヒトでの抗原性が高いからである。
前記E6タンパク質と前記E7タンパク質の発現は、ウイルス感染像であるCIN1(軽度異形成)では非常に低いのに対して、腫瘍化を遂げたCIN2(中度異形成)とCIN3(高度異形成)では高発現が認められることから、前記E6タンパク質と前記E7タンパク質の発現の持続的な亢進は前記CIN2以降で起こると考えられる。
前記HPVの前記E6タンパク質と前記E7タンパク質、その中でも特に前記E7タンパク質が、HPV関連がんに対する治療用ワクチンの開発においてとても魅力的なターゲットであると考えられる。E7タンパク質はヒトでの抗原性が高いからである。
これまでに、前記HPVのE7タンパク質を抗原とした前記治療用ワクチンが既にいくつか開発されている(例えば、非特許文献1、特許文献1参照)ものの、それらが患者子宮頚部の前がん病変(前記CIN)や癌細胞を排除することまでは示されてはおらず、実際に治療効果をもったワクチンの開発が強く望まれている。
本発明者らは、前記HPV16の前記E7タンパク質において、前記Rbタンパク質との結合に関与する第21番目のAsp、第24番目のCys及び第26番目のGluを全てGlyに置換した変異型E7タンパク質(配列番号2)を、Lactobacillus caseiに発現させ、熱処理により死菌化したものを乾燥、粉末化したワクチン(LacE7)をマウスに経口投与することで、脾臓だけでなく、粘膜においてもE7特異的細胞性免疫応答を誘導できることを示した(非特許文献2参照)。
また、本発明者らは、HPV感染症治療用経口医薬組成物として、HPVのE7ポリペプチドと、滋養強壮作用を有する漢方薬との組合せについての研究も進めている(特許文献2参照)。
これまでの本発明者らの研究によって、ある程度の臨床効果を奏するワクチンが開発されつつある。
しかしながら、前記治療ワクチンではCIN3(高度異形成)からCIN2(中等度異形成)までの退縮効果に留まり、正常化は難しい。子宮頸部上皮内腫瘍及び初期子宮頸がんの少なくともいずれかの患者における臨床効果を更に高めて正常化を目指すために、より優れた粘膜免疫誘導能を有するHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物の速やかな提供が強く求められている。
しかしながら、前記治療ワクチンではCIN3(高度異形成)からCIN2(中等度異形成)までの退縮効果に留まり、正常化は難しい。子宮頸部上皮内腫瘍及び初期子宮頸がんの少なくともいずれかの患者における臨床効果を更に高めて正常化を目指すために、より優れた粘膜免疫誘導能を有するHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物の速やかな提供が強く求められている。
H. Poo et al., Int J. Cancer, 2006, vol.119, pp.1702−1709
K. Adachi et al., Vaccine, 2010, vol.28, pp.2810−2817
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れた粘膜免疫誘導能を有する乳酸菌含有組成物、並びに前記乳酸菌含有組成物を含むHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物及び粘膜免疫誘導剤を提供することを目的とする。
前記課題を解決するための手段は、以下の通りである。即ち、
<1> ヒトパピローマウイルス(HPV)のE7タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌含有組成物であって、
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの含有量が、乳酸菌1×108菌体当たり、0.03μg〜1.0μgであることを特徴とする乳酸菌含有組成物である。
<2> 前記<1>に記載の乳酸菌含有組成物を含むことを特徴とするHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物である。
<3> 前記<1>に記載の乳酸菌含有組成物を含むことを特徴とする粘膜免疫誘導剤である。
<1> ヒトパピローマウイルス(HPV)のE7タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌含有組成物であって、
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの含有量が、乳酸菌1×108菌体当たり、0.03μg〜1.0μgであることを特徴とする乳酸菌含有組成物である。
<2> 前記<1>に記載の乳酸菌含有組成物を含むことを特徴とするHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物である。
<3> 前記<1>に記載の乳酸菌含有組成物を含むことを特徴とする粘膜免疫誘導剤である。
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、優れた粘膜免疫誘導能を有する乳酸菌含有組成物、並びに前記乳酸菌含有組成物を含むHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物及び粘膜免疫誘導剤を提供することができる。
(乳酸菌含有組成物)
本発明の乳酸菌含有組成物は、ヒトパピローマウイルス(HPV)のE7タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
本発明の乳酸菌含有組成物は、ヒトパピローマウイルス(HPV)のE7タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
<乳酸菌>
前記乳酸菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Lactobacillus属の乳酸菌が好ましく、ヘルパーT細胞1型(Th1)細胞の誘導能が確認されている点で、Lactobacillus caseiがより好ましい。前記乳酸菌は、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
前記乳酸菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Lactobacillus属の乳酸菌が好ましく、ヘルパーT細胞1型(Th1)細胞の誘導能が確認されている点で、Lactobacillus caseiがより好ましい。前記乳酸菌は、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
前記乳酸菌含有組成物は、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有さない乳酸菌を含んでいてもよいが、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌の含有割合が、80%以上が好ましく、90%以上がより好ましく、95%以上が特に好ましい。
<<HPVのE7タンパク質由来のポリペプチド>>
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドとしては、抗原性を有するものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドとしては、抗原性を有するものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
前記HPVの型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、がんに関しての高リスク群に属する、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73、HPV82、HPV26、HPV53、HPV63が好ましく、HPV16、HPV18がより好ましく、HPV16が特に好ましい。前記HPV16のE7タンパク質は、子宮頸がんをはじめとするHPV関連がん(肛門がん、咽頭がん、陰茎がん、外陰がん、腟がん等)に恒常的に発現しているがん抗原である。
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドは、前記HPVのE7タンパク質の全長タンパク質であってもよいし、1から数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されたタンパク質であってもよい。
また、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドは、野生型のE7タンパク質に由来するものであってもよいし、変異型のE7タンパク質に由来するものであってもよい。
また、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドは、野生型のE7タンパク質に由来するものであってもよいし、変異型のE7タンパク質に由来するものであってもよい。
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの中でも、HPV16の野生型E7タンパク質(配列番号1)における第21番目のAsp、第24番目のCys及び第26番目のGluに相当する、E7タンパク質のRbタンパク質との結合に関与するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換した変異型E7タンパク質が好ましく、HPV16の野生型E7タンパク質(配列番号1)の第21番目のAsp、第24番目のCys及び第26番目のGluの全てをGlyに置換した変異型E7タンパク質(配列番号2)がより好ましい。
−含有量−
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における含有量としては、乳酸菌1×108菌体当たり、0.03μg〜1.0μgであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、0.03μg〜0.3μgが好ましく、0.06μg〜0.3μgがより好ましく、0.09μg〜0.3μgが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より優れた薬理効果(粘膜免疫誘導能)を発揮することができる点で、有利である。
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における含有量としては、乳酸菌1×108菌体当たり、0.03μg〜1.0μgであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、0.03μg〜0.3μgが好ましく、0.06μg〜0.3μgがより好ましく、0.09μg〜0.3μgが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より優れた薬理効果(粘膜免疫誘導能)を発揮することができる点で、有利である。
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における含有量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、HPVのE7タンパク質に特異的な抗体を用いたFlow cytometer(FACS)により測定する方法などが挙げられる。
前記FACSにより測定する方法では、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における含有量が既知の試料と同じ条件で測定することにより、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における含有量が未知の試料の含有量を測定することができる。
前記FACSにより測定する方法では、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における含有量が既知の試料と同じ条件で測定することにより、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における含有量が未知の試料の含有量を測定することができる。
<<態様>>
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドは、乳酸菌の菌体表面に結合されたもの(以下、「E7タンパク質結合型乳酸菌」と称することがある)であってもよいし、乳酸菌の菌体表面に発現されたもの(以下、「E7タンパク質発現型乳酸菌」と称することがある)であってもよい。また、両者を組み合わせた態様であってもよい。
また、前記乳酸菌は、生菌であってもよいし、死菌であってもよい。
前記死菌とする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、オートクレーブで80℃、5分間加熱処理する方法などが挙げられる。
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドは、乳酸菌の菌体表面に結合されたもの(以下、「E7タンパク質結合型乳酸菌」と称することがある)であってもよいし、乳酸菌の菌体表面に発現されたもの(以下、「E7タンパク質発現型乳酸菌」と称することがある)であってもよい。また、両者を組み合わせた態様であってもよい。
また、前記乳酸菌は、生菌であってもよいし、死菌であってもよい。
前記死菌とする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、オートクレーブで80℃、5分間加熱処理する方法などが挙げられる。
−E7タンパク質結合型乳酸菌−
前記E7タンパク質結合型乳酸菌は、形質転換細菌を用いる遺伝子組換えによる方法や化学合成による方法などにより製造した前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドを乳酸菌の菌体表面に結合することにより、製造することができる。
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドは、コストなどの点で、形質転換細菌を用いる遺伝子組換えによる方法が好ましい。
前記E7タンパク質結合型乳酸菌は、形質転換細菌を用いる遺伝子組換えによる方法や化学合成による方法などにより製造した前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドを乳酸菌の菌体表面に結合することにより、製造することができる。
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドは、コストなどの点で、形質転換細菌を用いる遺伝子組換えによる方法が好ましい。
前記遺伝子組換えによる方法の宿主に用いる細菌としては、特に制限はなく、目的に応じて選択することができ、例えば、酵母、大腸菌、枯草菌、乳酸菌などが挙げられる。
前記細菌における前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの発現に適した発現ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、pQE31などが挙げられる。
前記形質転換の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記細菌における前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの発現に適した発現ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、pQE31などが挙げられる。
前記形質転換の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記形質転換菌により生産された前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドは、公知の方法を適宜選択することにより、精製することができる。
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドを前記乳酸菌の菌体表面に結合する方法としては、特に制限はなく、共有結合、電気的に結合するなどの公知の方法を適宜選択することができるが、アンカータンパク質を介して前記乳酸菌の菌体表面に電気的に結合する方法が好ましい。
前記アンカータンパク質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Lactococcus lactisのペプチドグリカン加水分解酵素であるAcmA由来の細胞壁結合タンパクであるcAなどが挙げられる。
前記アンカータンパク質を介して前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドを前記乳酸菌の菌体表面に結合する場合は、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドは、前記アンカータンパク質との融合タンパク質とすることが好ましい。
前記融合タンパク質における、前記アンカータンパク質と、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドとの順序としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記アンカータンパク質と、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドとがこの順に融合されている態様が好ましい。前記好ましい態様の具体例としては、配列番号3で表される配列が挙げられる。
前記融合タンパク質における、前記アンカータンパク質と、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドとの順序としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記アンカータンパク質と、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドとがこの順に融合されている態様が好ましい。前記好ましい態様の具体例としては、配列番号3で表される配列が挙げられる。
前記電気的に結合(以下、「固定化」と称することがある)する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記乳酸菌に、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドを含む溶液を添加し、混和する方法などが挙げられる。
前記混和する時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、1時間程度などが挙げられる。
前記混和する時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、1時間程度などが挙げられる。
前記電気的に結合する方法では、前処理を行ってもよい。
前記前処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、加熱処理などが挙げられる。前記加熱処理により、前記乳酸菌が死菌化される。
前記加熱処理の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、100℃で30分間加熱するなどが挙げられる。
前記加熱処理は、前記乳酸菌をトリクロロ酢酸(TCA)で懸濁した状態で行ってもよいし、前記乳酸菌をPBSで懸濁した状態で行ってもよい。
前記前処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、加熱処理などが挙げられる。前記加熱処理により、前記乳酸菌が死菌化される。
前記加熱処理の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、100℃で30分間加熱するなどが挙げられる。
前記加熱処理は、前記乳酸菌をトリクロロ酢酸(TCA)で懸濁した状態で行ってもよいし、前記乳酸菌をPBSで懸濁した状態で行ってもよい。
−E7タンパク質発現型乳酸菌−
前記E7タンパク質結合型乳酸菌は、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを用いて形質転換された乳酸菌を培養することにより、製造することができる。
前記E7タンパク質結合型乳酸菌は、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを用いて形質転換された乳酸菌を培養することにより、製造することができる。
前記発現ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、pIGM2などが挙げられる。前記pIGM2は、Lactobacillus brevis ATCC1559のS−layerタンパク質のプロモーター配列の下流にLactobacillus brevis ATCC1559のprtP遺伝子の分泌シグナルを有し、これらの下流にLacotobacillus casei由来のアンカー遺伝子(proteinase sequence of L. casei)を有する。
前記発現ベクターのその他の例としては、repE変異遺伝子と、乳酸菌由来アルドラーゼプロモーター(Pald)と、pgsB、pgsC及びpgsAで構成された群から選択されるポリグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子とを含むベクター(特表2012−514468号公報、特表2012−514469号公報参照)などが挙げられる。
前記形質転換の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記E7タンパク質発現型乳酸菌とする場合には、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドをコードする核酸は、アンカー遺伝子と結合したものとすることが好ましい。
前記アンカー遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Lacotobacillus casei由来のアンカー遺伝子(proteinase sequence of L. casei)が好ましい。
前記アンカー遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Lacotobacillus casei由来のアンカー遺伝子(proteinase sequence of L. casei)が好ましい。
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドをコードする核酸と、前記アンカー遺伝子との順序としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドをコードする核酸と、前記アンカー遺伝子とがこの順に結合されている態様が好ましい。前記好ましい態様の具体例としては、配列番号4で表される配列が挙げられる。
前記E7タンパク質発現型乳酸菌に用いる乳酸菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Lactobacillus casei IGM393株、Lactobacillus casei IGM394株が好ましい。前記Lactobacillus casei IGM394株は、前記Lactobacillus casei IGM393株の継代派生株であり、形質転換効率が高い変異株である。前記Lactobacillus casei IGM393株、及びLactobacillus casei IGM394株は、Lactobacillus casei BL23株の全ゲノム配列に相同性が最も高い。
前記E7タンパク質発現型乳酸菌の培養方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記E7タンパク質発現型乳酸菌における、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における発現量を調節する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養液のpHを調整する方法などが挙げられる。
後述する製造例2で示されるように、炭酸水素ナトリウムの濃度を変更し、培養液のpHを調整した培養液を用いることにより、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における発現量を調節することができる。
前記培養液のpHとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、pH7程度が好ましい。
後述する製造例2で示されるように、炭酸水素ナトリウムの濃度を変更し、培養液のpHを調整した培養液を用いることにより、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における発現量を調節することができる。
前記培養液のpHとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、pH7程度が好ましい。
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドが、前記アンカータンパク質との融合タンパク質である場合、前記融合タンパク質の菌体表面における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、乳酸菌1×108菌体当たり、0.1μg〜3.3μgが好ましく、0.1μg〜1.0μgがより好ましく、0.2μg〜1.0μgが更に好ましく、0.3μg〜1.0μgが特に好ましい。前記好ましい範囲内であると、より優れた薬理効果(粘膜免疫誘導能)を発揮することができる点で、有利である。
<その他の成分>
前記乳酸菌含有組成物におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
前記乳酸菌含有組成物におけるその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記乳酸菌含有組成物におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
前記乳酸菌含有組成物におけるその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
(HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物)
本発明のHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、乳酸菌含有組成物を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
本発明のHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、乳酸菌含有組成物を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
<乳酸菌含有組成物>
前記乳酸菌含有組成物は、上記した本発明の乳酸菌含有組成物である。
前記乳酸菌含有組成物の前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記乳酸菌含有組成物は、上記した本発明の乳酸菌含有組成物である。
前記乳酸菌含有組成物の前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
<その他の成分>
前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、滋養強壮作用(免疫増強作用)を有する漢方薬、粘膜アジュバント、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、滋養強壮作用(免疫増強作用)を有する漢方薬、粘膜アジュバント、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
−滋養強壮作用(免疫増強作用)を有する漢方薬−
前記滋養強壮作用(免疫増強作用)を有する漢方薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、葛根湯、十全大補湯、補中益気湯、小紫胡湯、小青竜湯などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
前記滋養強壮作用(免疫増強作用)を有する漢方薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、葛根湯、十全大補湯、補中益気湯、小紫胡湯、小青竜湯などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
−粘膜アジュバント−
前記粘膜アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記滋養強壮作用(免疫増強作用)を有する漢方薬と協調して、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドなどの経口ワクチン特異的な液性免疫と細胞性免疫を更に増強するものが好ましい。
前記粘膜アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記滋養強壮作用(免疫増強作用)を有する漢方薬と協調して、前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドなどの経口ワクチン特異的な液性免疫と細胞性免疫を更に増強するものが好ましい。
前記粘膜アジュバントの例としては、細菌毒素由来アジュバント、合成セラミド(αGalCer)、CpGオリゴヌクレオチド、SP−C(サーファクテン)、SP−B、IFN−α(野生型又は変異型)、二本鎖RNA、活性増幅型TNF変異体などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
前記細菌毒素由来アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コレラ毒素(CT)に由来するポリペプチド、大腸菌易熱性毒素(LT)に由来するポリペプチド、ベロ毒素(VT)に由来するポリペプチド、ジフテリア毒素(DT)に由来するポリペプチド、百日咳毒素(PT)に由来するポリペプチドなどが挙げられる。
前記細菌毒素由来アジュバントは、野生型細菌毒素由来アジュバントであってもよいし、変異型細菌毒素由来アジュバントであってもよいが、ヒトへの経口投与において重篤な副作用を生じないようにあらかじめ変異が導入された変異型細菌毒素由来アジュバントが好ましい。
前記細菌毒素由来アジュバントは、野生型細菌毒素由来アジュバントであってもよいし、変異型細菌毒素由来アジュバントであってもよいが、ヒトへの経口投与において重篤な副作用を生じないようにあらかじめ変異が導入された変異型細菌毒素由来アジュバントが好ましい。
−医薬的に許容され得る担体−
前記医薬的に許容され得る担体としては、特に制限はなく、剤形に応じて公知の担体を適宜選択することができる。
前記医薬的に許容され得る担体としては、特に制限はなく、剤形に応じて公知の担体を適宜選択することができる。
前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物におけるその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
<使用>
前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用してもよい。
前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用してもよい。
<剤形>
前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物の剤形としては、経口投与できるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤(錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等)、経口液剤(内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等)などが挙げられる。これらの剤形の前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、常法に従い製造することができる。
前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物の剤形としては、経口投与できるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤(錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等)、経口液剤(内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等)などが挙げられる。これらの剤形の前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、常法に従い製造することができる。
<投与>
前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物の投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物の投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象としては、ヒトが好適に挙げられる。
前記HPV関連腫瘍としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、子宮頸がん、外陰がん、肛門がん、口腔がん、腟がん、陰茎がん、咽頭がん、及びこれらの前がん病変などが挙げられる。
前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、子宮頸部上皮内腫瘍及び初期子宮頸がんの少なくともいずれかの治療用として、好適に利用可能である。
前記初期子宮頸がんには、微小浸潤がんの状態が含まれる。
前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、HPV感染症の患者に投与することにより、その治療用ワクチンとして使用するのに好適である。
前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、子宮頸部上皮内腫瘍及び初期子宮頸がんの少なくともいずれかの治療用として、好適に利用可能である。
前記初期子宮頸がんには、微小浸潤がんの状態が含まれる。
前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、HPV感染症の患者に投与することにより、その治療用ワクチンとして使用するのに好適である。
(HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかを治療する方法)
前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、個体に経口投与することにより、個体におけるHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかを治療することができる。したがって、本発明は、個体に前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物を経口投与することを特徴とする、HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかを治療する方法にも関する。
前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物は、個体に経口投与することにより、個体におけるHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかを治療することができる。したがって、本発明は、個体に前記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物を経口投与することを特徴とする、HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかを治療する方法にも関する。
(粘膜免疫誘導剤)
本発明の粘膜免疫誘導剤は、乳酸菌含有組成物を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
本発明の粘膜免疫誘導剤は、乳酸菌含有組成物を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
<乳酸菌含有組成物>
前記乳酸菌含有組成物は、上記した本発明の乳酸菌含有組成物である。
前記乳酸菌含有組成物の前記粘膜免疫誘導剤における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記乳酸菌含有組成物は、上記した本発明の乳酸菌含有組成物である。
前記乳酸菌含有組成物の前記粘膜免疫誘導剤における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
<その他の成分>
前記粘膜免疫誘導剤におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物のその他の成分の項目に記載のものと同様とすることができる。
前記粘膜免疫誘導剤におけるその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記粘膜免疫誘導剤におけるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記HPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物のその他の成分の項目に記載のものと同様とすることができる。
前記粘膜免疫誘導剤におけるその他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
<使用>
前記粘膜免疫誘導剤は、単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記粘膜免疫誘導剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用してもよい。
前記粘膜免疫誘導剤は、単独で使用してもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記粘膜免疫誘導剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用してもよい。
<剤形>
前記粘膜免疫誘導剤の剤形としては、経口投与できるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤(錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等)、経口液剤(内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等)などが挙げられる。これらの剤形の前記粘膜免疫誘導剤は、常法に従い製造することができる。
前記粘膜免疫誘導剤の剤形としては、経口投与できるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤(錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等)、経口液剤(内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等)などが挙げられる。これらの剤形の前記粘膜免疫誘導剤は、常法に従い製造することができる。
<投与>
前記粘膜免疫誘導剤の投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記粘膜免疫誘導剤の投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬や薬剤の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象としては、ヒトが好適に挙げられる。
前記粘膜免疫誘導剤は、粘膜におけるHPVのE7タンパク質特異的細胞性免疫応答を誘導することができる。
(粘膜免疫を誘導する方法)
前記粘膜免疫誘導剤は、個体に経口投与することにより、個体における粘膜免疫を誘導することができる。したがって、本発明は、個体に前記粘膜免疫誘導剤を経口投与することを特徴とする、粘膜免疫を誘導する方法にも関する。
前記粘膜免疫誘導剤は、個体に経口投与することにより、個体における粘膜免疫を誘導することができる。したがって、本発明は、個体に前記粘膜免疫誘導剤を経口投与することを特徴とする、粘膜免疫を誘導する方法にも関する。
以下に本発明の製造例及び試験例を説明するが、本発明はこれらの製造例及び試験例に何ら限定されるものではない。
(比較製造例1:公知のLacE7製剤の製造)
公知の製剤であるLacE7製剤を、Poo H. et al.,Int.J.Immunol.,2006,vol.119,pp.1,702−1,709に記載の方法に従って製造した。
簡単に述べると、HPV16由来の変異型E7タンパク質(配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる、野生型E7タンパク質のRbタンパク質との結合に関与する第21番目のAsp、第24番目のCys及び第26番目のGluを全てGlyに置換したもの)を、ヘルパーT細胞1型(Th1細胞)の誘導能が確認されているLactobacillus caseiに発現ベクターを用いて導入した。培養後の組換え体(LacE7)は、熱で死菌化した。培地から精製したLacE7を蒸留水で何度か洗浄した後、乾燥・粉体化し(LacE7製剤)、使用するまで4℃で保存した。前記LacE7製剤は水性溶媒に不溶性であった。
公知の製剤であるLacE7製剤を、Poo H. et al.,Int.J.Immunol.,2006,vol.119,pp.1,702−1,709に記載の方法に従って製造した。
簡単に述べると、HPV16由来の変異型E7タンパク質(配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる、野生型E7タンパク質のRbタンパク質との結合に関与する第21番目のAsp、第24番目のCys及び第26番目のGluを全てGlyに置換したもの)を、ヘルパーT細胞1型(Th1細胞)の誘導能が確認されているLactobacillus caseiに発現ベクターを用いて導入した。培養後の組換え体(LacE7)は、熱で死菌化した。培地から精製したLacE7を蒸留水で何度か洗浄した後、乾燥・粉体化し(LacE7製剤)、使用するまで4℃で保存した。前記LacE7製剤は水性溶媒に不溶性であった。
(製造例1:変異型E7タンパク質結合型乳酸菌の製造)
HPVのE7タンパク質由来ポリペプチドである変異型E7タンパク質(配列番号2)が、乳酸菌の菌体表面に結合された変異型E7タンパク質結合型乳酸菌を以下のようにして製造した。
HPVのE7タンパク質由来ポリペプチドである変異型E7タンパク質(配列番号2)が、乳酸菌の菌体表面に結合された変異型E7タンパク質結合型乳酸菌を以下のようにして製造した。
<変異型E7タンパク質の作製>
−cAと変異型E7タンパク質との融合配列を挿入したタンパク質発現用プラスミドの構築−
前記cAは、アンカータンパク質であり、前記変異型E7タンパク質を乳酸菌の菌体表面へ固定化するツールとして用いた。前記cAは、電荷と特定のモチーフによりグラム陽性菌のペプチドグリカンへ固定化することができるものであり、Lactococcus lactisのペプチドグリカン加水分解酵素であるAcmA由来の細胞壁結合タンパクである(Tjibbe Bosma, Rolf Kanninga, Jolanda Neef, Sandrine A. L. Audouy, Maarten L. van Roosmalen, Anton Steen, Girbe Buist, Jan Kok, Oscar P. Kuipers, George Robillard, and Kees Leenhouts (2006) Novel Surface Display System for Proteins on Non−Genetically Modified Gram−Positive Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. p. 880−889)。
前記cAと変異型E7タンパク質との融合配列(配列番号3参照)をベクタープラスミドであるpQE31に常法により挿入した(以下、「pQE31::cA=E7Rb」と称することがある、図1A参照)。
−cAと変異型E7タンパク質との融合配列を挿入したタンパク質発現用プラスミドの構築−
前記cAは、アンカータンパク質であり、前記変異型E7タンパク質を乳酸菌の菌体表面へ固定化するツールとして用いた。前記cAは、電荷と特定のモチーフによりグラム陽性菌のペプチドグリカンへ固定化することができるものであり、Lactococcus lactisのペプチドグリカン加水分解酵素であるAcmA由来の細胞壁結合タンパクである(Tjibbe Bosma, Rolf Kanninga, Jolanda Neef, Sandrine A. L. Audouy, Maarten L. van Roosmalen, Anton Steen, Girbe Buist, Jan Kok, Oscar P. Kuipers, George Robillard, and Kees Leenhouts (2006) Novel Surface Display System for Proteins on Non−Genetically Modified Gram−Positive Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. p. 880−889)。
前記cAと変異型E7タンパク質との融合配列(配列番号3参照)をベクタープラスミドであるpQE31に常法により挿入した(以下、「pQE31::cA=E7Rb」と称することがある、図1A参照)。
−形質転換−
前記cAと変異型E7タンパク質との融合タンパク質を発現させる宿主として、ClearColi(登録商標)(E. coli BL21DE3 LPS改変株、Lucigen)を用いた。
まず、pREP4(invitrogen)を導入するために、エレクトロポレーション法によりClearColi(登録商標)の形質転換を行った。
次いで、得られた形質転換体に、pQE31::cA=E7Rbを塩化カルシウム法により導入し、前記cAと変異型E7タンパク質との融合タンパク質を発現させる大腸菌(以下、「ClearColi(登録商標) pQE31::cA=E7Rb, pREP4」と称することがある)を得た。
前記cAと変異型E7タンパク質との融合タンパク質を発現させる宿主として、ClearColi(登録商標)(E. coli BL21DE3 LPS改変株、Lucigen)を用いた。
まず、pREP4(invitrogen)を導入するために、エレクトロポレーション法によりClearColi(登録商標)の形質転換を行った。
次いで、得られた形質転換体に、pQE31::cA=E7Rbを塩化カルシウム法により導入し、前記cAと変異型E7タンパク質との融合タンパク質を発現させる大腸菌(以下、「ClearColi(登録商標) pQE31::cA=E7Rb, pREP4」と称することがある)を得た。
−融合タンパク質の発現及び精製−
アンピシリン(終濃度 100μg/mL)及びカナマイシン(終濃度 25μg/mL)を含むLuria−Bertani(LB)液体培地(Difco Laboratories)に前記菌体を一白金耳接種し、37℃で一晩振盪培養した。
前記培養物を集菌し、洗浄後、培養時と同量のPBSでメスアップし、アンピシリン(終濃度 100μg/mL)及びカナマイシン(終濃度 25μg/mL)を含む本培養用のLB液体培地の1/20量になるよう接種した。
本培養は37℃で振盪培養し、O.D.600が0.5に達したところで、終濃度が1mMになるようにIPTGを添加し、37℃、4時間振盪培養し、前記融合タンパク質の発現誘導を行った。
前記誘導後の培養液を集菌し、菌体1g当たり5mLのLysis buffer(100mM NaH2PO4、10mM Tris・Cl、8M Urea、pH8)を加え、室温にて1時間穏やかに撹拌した。4℃、10,000×gで30分間遠心分離し、上清を回収した。
回収した上清4mLに対してLysis bufferにより平衡化したTALON(登録商標) Metal Affinity Resin 1mL(Clontech)を室温で40分間穏やかに混和した。上清とレジンの混合液をPolypropylene columns(QIAGEN)に移し上清を除去した。4mLのWash buffer(100mM NaH2PO4、10mM Tris・Cl、8M Urea、pH6.3)により2回洗浄し、Elution buffer 1(100mM NaH2PO4、10mM Tris・Cl、8M Urea、150mM Imidazole、pH5.9)及びElution buffer 2(100mM NaH2PO4、10mM Tris・Cl、8M Urea、300mM Imidazole、pH4.5)により、Hisタグ融合タンパク質を溶出した。
回収したタンパク質溶液は、透析により脱塩し、Ultracel(登録商標)−10k(Merk Millipore)を用いた限外濾過により濃縮した。
濃縮後のタンパク質溶液は、Quick StartTM Bradford Protein Assay(BIO−RAD)により濃度を測定した後、使用時まで−80℃で保存した。
アンピシリン(終濃度 100μg/mL)及びカナマイシン(終濃度 25μg/mL)を含むLuria−Bertani(LB)液体培地(Difco Laboratories)に前記菌体を一白金耳接種し、37℃で一晩振盪培養した。
前記培養物を集菌し、洗浄後、培養時と同量のPBSでメスアップし、アンピシリン(終濃度 100μg/mL)及びカナマイシン(終濃度 25μg/mL)を含む本培養用のLB液体培地の1/20量になるよう接種した。
本培養は37℃で振盪培養し、O.D.600が0.5に達したところで、終濃度が1mMになるようにIPTGを添加し、37℃、4時間振盪培養し、前記融合タンパク質の発現誘導を行った。
前記誘導後の培養液を集菌し、菌体1g当たり5mLのLysis buffer(100mM NaH2PO4、10mM Tris・Cl、8M Urea、pH8)を加え、室温にて1時間穏やかに撹拌した。4℃、10,000×gで30分間遠心分離し、上清を回収した。
回収した上清4mLに対してLysis bufferにより平衡化したTALON(登録商標) Metal Affinity Resin 1mL(Clontech)を室温で40分間穏やかに混和した。上清とレジンの混合液をPolypropylene columns(QIAGEN)に移し上清を除去した。4mLのWash buffer(100mM NaH2PO4、10mM Tris・Cl、8M Urea、pH6.3)により2回洗浄し、Elution buffer 1(100mM NaH2PO4、10mM Tris・Cl、8M Urea、150mM Imidazole、pH5.9)及びElution buffer 2(100mM NaH2PO4、10mM Tris・Cl、8M Urea、300mM Imidazole、pH4.5)により、Hisタグ融合タンパク質を溶出した。
回収したタンパク質溶液は、透析により脱塩し、Ultracel(登録商標)−10k(Merk Millipore)を用いた限外濾過により濃縮した。
濃縮後のタンパク質溶液は、Quick StartTM Bradford Protein Assay(BIO−RAD)により濃度を測定した後、使用時まで−80℃で保存した。
−ウェスタンブロット法による融合タンパク質の確認−
前記−融合タンパク質の発現及び精製−における本培養において、IPTGを添加し、37℃、4時間振盪培養した後の培養液を10,000×gで3分間遠心を行い、集菌した。上清を捨て、ペレットを100μLの1×SDS−PAGEサンプルバッファーで懸濁した。前記懸濁した懸濁液を100℃で5分間加熱した。
加熱後の懸濁液をSDS−PAGEで泳動し、PVDF膜(EDM Millipore)に転写した。
前記転写後の膜を一次抗体溶液(1% BSA, 0.05% Tween 20 in PBS(−), mouse anti−His IgG(Anti−His−tag mAb、株式会社 医学生物学研究所)(1:2,000))中で、室温で1時間インキュベートした。
その後、前記膜をPBSTで2回洗浄した。
次いで、二次抗体溶液(1% BSA, 0.05% Tween 20 in PBS(−), goat anti−mouse IgG HRP(Anti−Mouse IgG (whole moledule)−Peroxidase antibody produced in goat、SIGMA−ALDRICH社)(1:10,000))中で、室温で1時間インキュベートした。
その後、前記膜をPBSTで2回洗浄した。
次いで、ECL Plus(GE Health care Life Science)を用いて、Chemi doc(Bio−Rad Laboratories)にてバンドを検出し、目的の融合タンパク質が発現していることを確認した。
前記−融合タンパク質の発現及び精製−における本培養において、IPTGを添加し、37℃、4時間振盪培養した後の培養液を10,000×gで3分間遠心を行い、集菌した。上清を捨て、ペレットを100μLの1×SDS−PAGEサンプルバッファーで懸濁した。前記懸濁した懸濁液を100℃で5分間加熱した。
加熱後の懸濁液をSDS−PAGEで泳動し、PVDF膜(EDM Millipore)に転写した。
前記転写後の膜を一次抗体溶液(1% BSA, 0.05% Tween 20 in PBS(−), mouse anti−His IgG(Anti−His−tag mAb、株式会社 医学生物学研究所)(1:2,000))中で、室温で1時間インキュベートした。
その後、前記膜をPBSTで2回洗浄した。
次いで、二次抗体溶液(1% BSA, 0.05% Tween 20 in PBS(−), goat anti−mouse IgG HRP(Anti−Mouse IgG (whole moledule)−Peroxidase antibody produced in goat、SIGMA−ALDRICH社)(1:10,000))中で、室温で1時間インキュベートした。
その後、前記膜をPBSTで2回洗浄した。
次いで、ECL Plus(GE Health care Life Science)を用いて、Chemi doc(Bio−Rad Laboratories)にてバンドを検出し、目的の融合タンパク質が発現していることを確認した。
<乳酸菌の菌体表面への結合>
前記cAと変異型E7タンパク質との融合タンパク質の乳酸菌の菌体表面への結合(以下、「固定化」と称することもある)は、Tjibbe Bosma, Rolf Kanninga, Jolanda Neef, Sandrine A. L. Audouy, Maarten L. van Roosmalen, Anton Steen, Girbe Buist, Jan Kok, Oscar P. Kuipers, George Robillard, and Kees Leenhouts (2006) Novel Surface Display System for Proteins on Non−Genetically Modified Gram−Positive Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. p. 880−889を参考にして、以下のように行った。
前記cAと変異型E7タンパク質との融合タンパク質の乳酸菌の菌体表面への結合(以下、「固定化」と称することもある)は、Tjibbe Bosma, Rolf Kanninga, Jolanda Neef, Sandrine A. L. Audouy, Maarten L. van Roosmalen, Anton Steen, Girbe Buist, Jan Kok, Oscar P. Kuipers, George Robillard, and Kees Leenhouts (2006) Novel Surface Display System for Proteins on Non−Genetically Modified Gram−Positive Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. p. 880−889を参考にして、以下のように行った。
−乳酸菌の培養−
乳酸菌として、抗原運搬体としてアジュバント効果が既に確認されているLactobacillus casei IGM393(Kajikawa A, Igimi S (2010) Innate and acquired immune responses induced by recombinant Lactobacillus casei displaying flagellin−fusion antigen on the cell−surface. Vaccine 28:3409−3415)を用いた。
前記乳酸菌をMann−Rogosa−Sharp(MRS)液体培地(Difco Laboratories)により、37℃で一晩静置培養した。培養液を集菌し、PBSにより2回洗浄した。
乳酸菌として、抗原運搬体としてアジュバント効果が既に確認されているLactobacillus casei IGM393(Kajikawa A, Igimi S (2010) Innate and acquired immune responses induced by recombinant Lactobacillus casei displaying flagellin−fusion antigen on the cell−surface. Vaccine 28:3409−3415)を用いた。
前記乳酸菌をMann−Rogosa−Sharp(MRS)液体培地(Difco Laboratories)により、37℃で一晩静置培養した。培養液を集菌し、PBSにより2回洗浄した。
−固定化の前処理−
前記固定化の前処理として、「前記乳酸菌をトリクロロ酢酸(TCA)で処理したもの」(以下、「TCA処理あり」と称することがある)、及び「前記乳酸菌をPBSで処理したもの」(以下、「TCA処理なし」と称することがある)の2種類を用意した。
前記TCAによる処理は、菌体を培養液の0.2倍量の10% TCAにより再懸濁し、100℃で30分間加熱後、PBSにて3回洗浄した。
前記PBSによる処理は、菌体を培養液の0.2倍量のPBSにより再懸濁し、100℃で30分間加熱後、PBSにて3回洗浄した。
前記固定化の前処理として、「前記乳酸菌をトリクロロ酢酸(TCA)で処理したもの」(以下、「TCA処理あり」と称することがある)、及び「前記乳酸菌をPBSで処理したもの」(以下、「TCA処理なし」と称することがある)の2種類を用意した。
前記TCAによる処理は、菌体を培養液の0.2倍量の10% TCAにより再懸濁し、100℃で30分間加熱後、PBSにて3回洗浄した。
前記PBSによる処理は、菌体を培養液の0.2倍量のPBSにより再懸濁し、100℃で30分間加熱後、PBSにて3回洗浄した。
−固定化−
前記前処理後の乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記融合タンパク質を1.0μg、0.3μg、0.1μg、又は0.03μg(それぞれ前記変異型E7タンパク質の量として、0.3μg、0.09μg、0.03μg、又は0.009μgに相当する)加え、前記融合タンパク質を含むPBS溶液中で1時間混和した。これにより、乳酸菌の表面に前記融合タンパク質を電気的に結合させた。
前記混和後、PBSにより3回洗浄し、−80℃で保存した。
前記前処理後の乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記融合タンパク質を1.0μg、0.3μg、0.1μg、又は0.03μg(それぞれ前記変異型E7タンパク質の量として、0.3μg、0.09μg、0.03μg、又は0.009μgに相当する)加え、前記融合タンパク質を含むPBS溶液中で1時間混和した。これにより、乳酸菌の表面に前記融合タンパク質を電気的に結合させた。
前記混和後、PBSにより3回洗浄し、−80℃で保存した。
以上により、下記の変異型E7タンパク質結合型乳酸菌が得られた。
(1)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.3μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理あり)。
(2)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.09μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理あり)。
(3)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.03μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理あり)。
(4)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.009μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理あり)。
(5)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.3μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理なし)。
(6)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.09μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理なし)。
(7)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.03μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理なし)。
(8)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.009μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理なし)。
(1)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.3μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理あり)。
(2)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.09μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理あり)。
(3)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.03μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理あり)。
(4)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.009μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理あり)。
(5)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.3μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理なし)。
(6)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.09μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理なし)。
(7)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.03μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理なし)。
(8)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.009μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理なし)。
<FACS分析>
前記(1)〜(8)の変異型E7タンパク質結合型乳酸菌について、HPVのE7タンパク質に特異的な抗体を用い、蛍光標識を行った後、Flow cytometer(FACS、BD社製)により、固定化を確認した。
具体的には、前記変異型E7タンパク質結合型乳酸菌を、0.5mLの一次抗体溶液(1% BSA, 0.05% Tween 20 in PBS(−), anti−HPV16 E7 mouse IgG(HPV Type 16 E7 Protein antibody [289−17013(TVG−701Y)]、GeneTex社)(1:1000))中で転倒混和(室温、60分間)した。その後、遠心(15,000×g、3分間)した後、PBS(−)にて洗浄を2回行った。次いで、0.5mLの二次抗体溶液(1% BSA, 0.05% Tween 20 in PBS(−), anti−mouse IgG Alexa Fluor 488(Alexa Fluor(R) 488 goat anti−mouse IgG(H+L)、Life technologies社)(1:500))中で遮光しながら転倒混和(室温、60分間)した。その後、遠心(15,000×g、3分間)した後、PBS(−)にて洗浄を2回行った。
その後、PBS(−)にて0.6mLにメスアップし、FACSにより蛍光を検出した。
なお、前記融合タンパク質を用いなかった以外は、同一の操作を行ったものをネガティブコントロールとして用いた。
結果を図1B及び図1Cに示す。
前記(1)〜(8)の変異型E7タンパク質結合型乳酸菌について、HPVのE7タンパク質に特異的な抗体を用い、蛍光標識を行った後、Flow cytometer(FACS、BD社製)により、固定化を確認した。
具体的には、前記変異型E7タンパク質結合型乳酸菌を、0.5mLの一次抗体溶液(1% BSA, 0.05% Tween 20 in PBS(−), anti−HPV16 E7 mouse IgG(HPV Type 16 E7 Protein antibody [289−17013(TVG−701Y)]、GeneTex社)(1:1000))中で転倒混和(室温、60分間)した。その後、遠心(15,000×g、3分間)した後、PBS(−)にて洗浄を2回行った。次いで、0.5mLの二次抗体溶液(1% BSA, 0.05% Tween 20 in PBS(−), anti−mouse IgG Alexa Fluor 488(Alexa Fluor(R) 488 goat anti−mouse IgG(H+L)、Life technologies社)(1:500))中で遮光しながら転倒混和(室温、60分間)した。その後、遠心(15,000×g、3分間)した後、PBS(−)にて洗浄を2回行った。
その後、PBS(−)にて0.6mLにメスアップし、FACSにより蛍光を検出した。
なお、前記融合タンパク質を用いなかった以外は、同一の操作を行ったものをネガティブコントロールとして用いた。
結果を図1B及び図1Cに示す。
図1B中、「N」は、ネガティブコントロールの結果を示し、「(1)」は、乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.3μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理あり)の結果を示し、「(2)」は、乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.09μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理あり)の結果を示し、「(3)」は、乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.03μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理あり)の結果を示し、「(4)」は、乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.009μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理あり)の結果を示す。
図1C中、「N」は、ネガティブコントロールの結果を示し、「(5)」は、乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.3μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理なし)の結果を示し、「(6)」は、乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.09μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理なし)の結果を示し、「(7)」は、乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.03μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理なし)の結果を示し、「(8)」は、乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.009μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理なし)の結果を示す。
図1B及び図1Cの結果から、変異型E7タンパク質の量の増加に伴い、蛍光強度が強くなることが示された。
なお、前記変異型E7タンパク質の量を乳酸菌1.0×108菌体当たり、0.9μgとした場合には、乳酸菌1.0×108菌体当たり、0.3μgの場合と同様の結果となり、乳酸菌の菌体表面に結合できる前記変異型E7タンパク質の量は、0.3μg程度で飽和することもわかった。
なお、前記変異型E7タンパク質の量を乳酸菌1.0×108菌体当たり、0.9μgとした場合には、乳酸菌1.0×108菌体当たり、0.3μgの場合と同様の結果となり、乳酸菌の菌体表面に結合できる前記変異型E7タンパク質の量は、0.3μg程度で飽和することもわかった。
なお、図1Dに、ウェスタンブロット法により、以下のタンパク質について確認した一例を示す。
[タンパク質]
・ Hisタグ付きの、cAと変異型E7タンパク質との融合タンパク質(48kDa)
・ Hisタグ付きのcA(33kDa)
・ Hisタグ付きの変異型E7タンパク質(15kDa)
図1D中、「1」は「Hisタグ付きの、cAと変異型E7タンパク質との融合タンパク質」の結果を示し、「2」は「Hisタグ付きのcA」の結果を示し、「3」及び「5」は「Hisタグ付きのcAの発現を誘導する前の大腸菌から調製したサンプル」の結果を示し、「4」及び「6」は「Hisタグ付きのcAの発現を誘導した後の大腸菌から調製したサンプル」の結果を示し、「7」は「Hisタグ付きの変異型E7タンパク質」の結果を示し、「8」及び「10」は「Hisタグ付きの変異型E7タンパク質の発現を誘導する前の大腸菌から調製したサンプル」の結果を示し、「9」及び「11」は「Hisタグ付きの変異型E7タンパク質の発現を誘導した後の大腸菌から調製したサンプル」の結果を示す。
[タンパク質]
・ Hisタグ付きの、cAと変異型E7タンパク質との融合タンパク質(48kDa)
・ Hisタグ付きのcA(33kDa)
・ Hisタグ付きの変異型E7タンパク質(15kDa)
図1D中、「1」は「Hisタグ付きの、cAと変異型E7タンパク質との融合タンパク質」の結果を示し、「2」は「Hisタグ付きのcA」の結果を示し、「3」及び「5」は「Hisタグ付きのcAの発現を誘導する前の大腸菌から調製したサンプル」の結果を示し、「4」及び「6」は「Hisタグ付きのcAの発現を誘導した後の大腸菌から調製したサンプル」の結果を示し、「7」は「Hisタグ付きの変異型E7タンパク質」の結果を示し、「8」及び「10」は「Hisタグ付きの変異型E7タンパク質の発現を誘導する前の大腸菌から調製したサンプル」の結果を示し、「9」及び「11」は「Hisタグ付きの変異型E7タンパク質の発現を誘導した後の大腸菌から調製したサンプル」の結果を示す。
(製造例2:変異型E7タンパク質発現型乳酸菌の製造)
HPVのE7タンパク質由来ポリペプチドである変異型E7タンパク質(配列番号2)が、乳酸菌の菌体表面に発現された変異型E7タンパク質結合型乳酸菌を以下のようにして製造した。
HPVのE7タンパク質由来ポリペプチドである変異型E7タンパク質(配列番号2)が、乳酸菌の菌体表面に発現された変異型E7タンパク質結合型乳酸菌を以下のようにして製造した。
ベクタープラスミドとして、pIGM2(Kajikawa Akinobu, Eiko Ichikawa, and Shizunobu Igimi (2010) Development of a Highly Efficient Protein−Secreting System in Recombinant Lactobacillus casei. J. Microbiol. Biotechnol., 20(2), 375−382)を用い、変異型E7タンパク質(配列番号2)をコードする配列とLacotobacillus casei由来のアンカー遺伝子(proteinase sequence of L. casei)の配列とをこの順に結合した配列(配列番号4)を挿入したベクタープラスミド(以下、「pIGM2::E7Rb=prtP anchor」と称することがある)を作製した(図2A参照)。
前記ベクタープラスミドのターミネーター配列を除去し、エレクトロポレーション法により、Lactobacillus casei IGM394に導入した(以下、「L. casei IGM394[pEK7::E7Rb]」と称することがある)。
また、ネガティブコントロールとして、変異型E7タンパク質(配列番号2)をコードする配列とLacotobacillus casei由来のアンカー遺伝子(proteinase sequence of L. casei)の配列とをこの順に結合した配列(配列番号4)を挿入しないベクタープラスミドを用いた以外は同様にして、Lactobacillus casei IGM394にベクタープラスミドを導入した株を作製した(以下、「L. casei IGM394[pLPempty]」と称することがある)。
また、ネガティブコントロールとして、変異型E7タンパク質(配列番号2)をコードする配列とLacotobacillus casei由来のアンカー遺伝子(proteinase sequence of L. casei)の配列とをこの順に結合した配列(配列番号4)を挿入しないベクタープラスミドを用いた以外は同様にして、Lactobacillus casei IGM394にベクタープラスミドを導入した株を作製した(以下、「L. casei IGM394[pLPempty]」と称することがある)。
前記乳酸菌を、Mann−Rogosa−Sharp(Difco Laboratories)にEm 5μg/mLを添加した液体培地(MRSE)に播き、37℃で一晩(約14時間)培養した。培養液を集菌(5,000g×10分間)し、PBSにより1回洗浄(5,000g×10分間)した。PBSを添加し、細胞懸濁液濃度を1×109CFU/mLに調整した。
1LのMRSE((i)NaHCO3を無添加、pH6.4、(ii)10mM NaHCO3を添加、pH6.8、又は(iii)25mM NaHCO3を添加、pH7.1)に、前記調整した細胞懸濁液を10%播き(1×108CFU/mL)、37℃で約5時間、穏やかに攪拌しながら、嫌気条件下(アネロパック使用)で培養した。
なお、ネガティブコントロールの乳酸菌は、(i)NaHCO3を無添加のMRSEを用いて培養した。
なお、ネガティブコントロールの乳酸菌は、(i)NaHCO3を無添加のMRSEを用いて培養した。
培養液を集菌(5,000g×10分間)し、PBSにより1回洗浄(5,000g×10分間)した。PBSを30mL添加し、細胞懸濁液濃度を終濃度7.5×109cells/mL(OD≒7.5)に調整した。なお、乳酸菌数は、血球計算盤を用いて数えた。
前記細胞懸濁液をオートクレーブで80℃、5分間加熱処理し、死菌とした。
また、前記加熱処理を行わなかったものを生菌の試料とした。
また、前記加熱処理を行わなかったものを生菌の試料とした。
以上により、下記の変異型E7タンパク質発現型乳酸菌が得られた。
(i−1)NaHCO3を無添加のMRSE(pH6.4)で培養し、死菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
(i−2)NaHCO3を無添加のMRSE(pH6.4)で培養し、生菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
(ii−1)10mM NaHCO3を添加したMRSE(pH6.8)で培養し、死菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
(ii−2)10mM NaHCO3を添加したMRSE(pH6.8)で培養し、生菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
(iii−1)25mM NaHCO3を添加したMRSE(pH7.1)で培養し、死菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
(iii−2)25mM NaHCO3を添加したMRSE(pH7.1)で培養し、生菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
(i−1)NaHCO3を無添加のMRSE(pH6.4)で培養し、死菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
(i−2)NaHCO3を無添加のMRSE(pH6.4)で培養し、生菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
(ii−1)10mM NaHCO3を添加したMRSE(pH6.8)で培養し、死菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
(ii−2)10mM NaHCO3を添加したMRSE(pH6.8)で培養し、生菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
(iii−1)25mM NaHCO3を添加したMRSE(pH7.1)で培養し、死菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
(iii−2)25mM NaHCO3を添加したMRSE(pH7.1)で培養し、生菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
<FACS分析>
前記(i−1)、(ii−1)、及び(iii−1)の変異型E7タンパク質発現型乳酸菌、並びにネガティブコントロールの乳酸菌について、前記製造例1と同様にしてFACS分析を行い、乳酸菌1.0×108菌体当たりの菌体表面の変異型E7タンパク質の発現の程度を確認した。結果を図2Bに示す。
前記(i−1)、(ii−1)、及び(iii−1)の変異型E7タンパク質発現型乳酸菌、並びにネガティブコントロールの乳酸菌について、前記製造例1と同様にしてFACS分析を行い、乳酸菌1.0×108菌体当たりの菌体表面の変異型E7タンパク質の発現の程度を確認した。結果を図2Bに示す。
図2B中、「N」は、ネガティブコントロール(死菌)の結果を示し、「(i−1)」は、NaHCO3を無添加のMRSE(pH6.4)で培養し、死菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌の結果を示し、「(ii−1)」は、10mM NaHCO3を添加したMRSE(pH6.8)で培養し、死菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌の結果を示し、「(iii−1)」は、25mM NaHCO3を添加したMRSE(pH7.1)で培養し、死菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌の結果を示す。
図2Bの結果から、培養液のpHを調整することにより、菌体表面の変異型E7タンパク質の発現量を調節可能であることが示された。
(試験例1:菌体表面の変異型E7タンパク質の量の比較)
以下の試料について、前記製造例1と同様にしてFACS分析を行い、乳酸菌1.0×108菌体当たりの菌体表面の変異型E7タンパク質の量を比較した。結果を図3A及び図3Bに示す。
<試料>
(I) ・・・ 前記製造例2におけるネガティブコントロール(死菌)。
(II) ・・・ 前記比較製造例1で製造したLacE7製剤。
(III) ・・・ 前記製造例1における(3)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.03μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理あり)。
(IV) ・・・ 前記製造例2における(iii−1)25mM NaHCO3を添加したMRSE(pH7.1)で培養し、死菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
以下の試料について、前記製造例1と同様にしてFACS分析を行い、乳酸菌1.0×108菌体当たりの菌体表面の変異型E7タンパク質の量を比較した。結果を図3A及び図3Bに示す。
<試料>
(I) ・・・ 前記製造例2におけるネガティブコントロール(死菌)。
(II) ・・・ 前記比較製造例1で製造したLacE7製剤。
(III) ・・・ 前記製造例1における(3)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.03μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理あり)。
(IV) ・・・ 前記製造例2における(iii−1)25mM NaHCO3を添加したMRSE(pH7.1)で培養し、死菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
図3A及び図3B中、「(I)」は、前記試料(I)の結果を示し、「(II)」は、前記試料(II)の結果を示し、「(III)」は、前記試料(III)の結果を示し、「(IV)」は、前記試料(IV)の結果を示す。
図3A(測定条件は、Voltage:525)の結果から、既存のLacE7製剤では、菌体表面における変異型E7タンパク質の発現を発現している乳酸菌と、発現していない乳酸菌とのバラつきが多いことが示された。また、図3B(測定条件は、Voltage:600)の結果から、既存のLacE7製剤では、菌体表面における変異型E7タンパク質の発現量が低いことが示された。
一方、前記製造例2における(iii−1)25mM NaHCO3を添加したMRSE(pH7.1)で培養し、死菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌では、乳酸菌1.0×108菌体当たりの変異型E7タンパク質の発現量が0.3μg程度と推測された。
一方、前記製造例2における(iii−1)25mM NaHCO3を添加したMRSE(pH7.1)で培養し、死菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌では、乳酸菌1.0×108菌体当たりの変異型E7タンパク質の発現量が0.3μg程度と推測された。
(試験例2:抗HPV粘膜免疫誘導能試験−1)
比較製造例1で製造したLacE7製剤を用い、以下のようにして抗HPV粘膜免疫誘導能試験を行った。
比較製造例1で製造したLacE7製剤を用い、以下のようにして抗HPV粘膜免疫誘導能試験を行った。
<マウスの免疫>
マウスのLacE7製剤による経口免疫は、K. Adachi et al., Vaccine, 2010, vol.28, pp.2810−2817に記載の方法に従って行った。
マウスのLacE7製剤による経口免疫は、K. Adachi et al., Vaccine, 2010, vol.28, pp.2810−2817に記載の方法に従って行った。
<<マウスへのLacE7製剤の経口投与>>
6週齢の雌SPF C67BLマウス(日本クレア株式会社)に対して、前記LacE7製剤を経口投与することで免疫した。
1匹当たり0.1mg、0.3mg、又は1.0mgの前記LacE7製剤を第1週、第2週、第4週、及び第6週の合計4クール投与した。全ての投与は、前記LacE7製剤を200μLのPBSに懸濁したものを経胃チューブを用いて、毎週連続5日間、1日1回3時間の絶食後に行った。
6週齢の雌SPF C67BLマウス(日本クレア株式会社)に対して、前記LacE7製剤を経口投与することで免疫した。
1匹当たり0.1mg、0.3mg、又は1.0mgの前記LacE7製剤を第1週、第2週、第4週、及び第6週の合計4クール投与した。全ての投与は、前記LacE7製剤を200μLのPBSに懸濁したものを経胃チューブを用いて、毎週連続5日間、1日1回3時間の絶食後に行った。
<腸の回収>
前記LacE7製剤の最後の接種から1週間後(接種開始から7週目)に、前記LacE7製剤を接種した5匹のマウスを解剖し、腸を採取した。前記腸は、排泄物を除いた後、プロテアーゼ阻害剤を加えたHBSS 10mLで腸管内部を洗浄した。
前記LacE7製剤の最後の接種から1週間後(接種開始から7週目)に、前記LacE7製剤を接種した5匹のマウスを解剖し、腸を採取した。前記腸は、排泄物を除いた後、プロテアーゼ阻害剤を加えたHBSS 10mLで腸管内部を洗浄した。
<マウスの粘膜リンパ球の調製>
腸は縦方向に切開して10質量% FBS、100units/mL ペニシリン、及び100μg/mL ストレプトマイシンを添加したPRMI1640(10質量% 非働化牛胎児血清、2mM L−グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸、50mM 2−メルカプトエタノール含有)培地で37℃、30分間激しく振とうした。回収した細胞懸濁液は、BDファルコン(商標)セルストレーナー(BDバイオサイエンス株式会社,米国)で組織残屑を除き、次いで、70質量%と40質量%のPercoll PLUSを重層した15mLチューブを用いた不連続濃度勾配遠心を行った。約107個〜108個の細胞を上に重層し、600×g、室温で20分間遠心することで、70質量%と40質量%のPercoll PLUSの界面に粘膜リンパ球(生存率95%)が集まった。約5×106個〜10×106個の粘膜リンパ球が各マウスから得られた。
腸は縦方向に切開して10質量% FBS、100units/mL ペニシリン、及び100μg/mL ストレプトマイシンを添加したPRMI1640(10質量% 非働化牛胎児血清、2mM L−グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸、50mM 2−メルカプトエタノール含有)培地で37℃、30分間激しく振とうした。回収した細胞懸濁液は、BDファルコン(商標)セルストレーナー(BDバイオサイエンス株式会社,米国)で組織残屑を除き、次いで、70質量%と40質量%のPercoll PLUSを重層した15mLチューブを用いた不連続濃度勾配遠心を行った。約107個〜108個の細胞を上に重層し、600×g、室温で20分間遠心することで、70質量%と40質量%のPercoll PLUSの界面に粘膜リンパ球(生存率95%)が集まった。約5×106個〜10×106個の粘膜リンパ球が各マウスから得られた。
<ELISPOTアッセイ>
腸粘膜リンパ球(5×106細胞/mL)の懸濁液50μLを、24時間、37℃で抗原提示細胞と共にインキュベートした。
マウスIFN−γ用ELISPOTキット(マブテックAB、スウェーデン)のメーカープロトコールに従い、HPV16のE7タンパク質(配列番号1)においてCTLエピトープとして報告されている、E7タンパク質の第49番から第57番のアミノ酸配列からなる10μLの合成ペプチド(1μg/mL)、マイトジェン(ホルボールミリステートアセテート 40ng/mL+イオノマイシン 4μg/mL)、又は培地のみ(コントロール)を、抗マウスIFN−γ抗体でコートされた96ウェルプレート(ELIIPプレート、ミリポア株式会社、USA)に滴下した。96ウェルプレート上のIFN−γ陽性のスポット数を解析した。その際、KS ELISPOT(カールツァイスビジョン社、ドイツ)のコンピュータ完全補助ビデオイメージング解析システムを用いた。
腸粘膜リンパ球(5×106細胞/mL)の懸濁液50μLを、24時間、37℃で抗原提示細胞と共にインキュベートした。
マウスIFN−γ用ELISPOTキット(マブテックAB、スウェーデン)のメーカープロトコールに従い、HPV16のE7タンパク質(配列番号1)においてCTLエピトープとして報告されている、E7タンパク質の第49番から第57番のアミノ酸配列からなる10μLの合成ペプチド(1μg/mL)、マイトジェン(ホルボールミリステートアセテート 40ng/mL+イオノマイシン 4μg/mL)、又は培地のみ(コントロール)を、抗マウスIFN−γ抗体でコートされた96ウェルプレート(ELIIPプレート、ミリポア株式会社、USA)に滴下した。96ウェルプレート上のIFN−γ陽性のスポット数を解析した。その際、KS ELISPOT(カールツァイスビジョン社、ドイツ)のコンピュータ完全補助ビデオイメージング解析システムを用いた。
<統計解析>
ELISPOTアッセイのデータを平均値±標準偏差で示した。これらの値又は相対値は免疫グループ(各グループはマウス5匹)間で比較した。その際、両側ステューデントt−検定を行った。p値が<0.05の場合有意とみなした。
ELISPOTアッセイのデータを平均値±標準偏差で示した。これらの値又は相対値は免疫グループ(各グループはマウス5匹)間で比較した。その際、両側ステューデントt−検定を行った。p値が<0.05の場合有意とみなした。
試験例2の結果を図4に示す。
図4から明らかなように、投与量に依存して、106細胞当たりのIFN−γ産生細胞数が増加していた。
また、図4から、LacE7製剤を0.5mg投与した場合の106細胞当たりのIFN−γ産生細胞数は、65.8細胞と算出された(図4中の矢印部分)。
図4から明らかなように、投与量に依存して、106細胞当たりのIFN−γ産生細胞数が増加していた。
また、図4から、LacE7製剤を0.5mg投与した場合の106細胞当たりのIFN−γ産生細胞数は、65.8細胞と算出された(図4中の矢印部分)。
(試験例3:抗HPV粘膜免疫誘導能試験−2)
以下の試料を用い、試料の投与量を0.5mg/マウスとした以外は、試験例2と同様にして抗HPV粘膜免疫誘導能試験を行った。
<試料>
・ 試料−1 : 製造例1における(1)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.3μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理あり)。
・ 試料−2 : 製造例1における(6)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.09μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理なし)。
・ 試料−3 : 製造例1における(5)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.3μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理なし)。
・ 試料−4 :製造例2における(iii−2)25mM NaHCO3を添加したMRSE(pH7.1)で培養し、生菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
・ 試料−5 :製造例2における(iii−1)25mM NaHCO3を添加したMRSE(pH7.1)で培養し、死菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
以下の試料を用い、試料の投与量を0.5mg/マウスとした以外は、試験例2と同様にして抗HPV粘膜免疫誘導能試験を行った。
<試料>
・ 試料−1 : 製造例1における(1)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.3μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理あり)。
・ 試料−2 : 製造例1における(6)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.09μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理なし)。
・ 試料−3 : 製造例1における(5)乳酸菌1.0×108菌体当たり、前記変異型E7タンパク質を0.3μg結合させた変異型E7タンパク質結合型乳酸菌(TCA処理なし)。
・ 試料−4 :製造例2における(iii−2)25mM NaHCO3を添加したMRSE(pH7.1)で培養し、生菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
・ 試料−5 :製造例2における(iii−1)25mM NaHCO3を添加したMRSE(pH7.1)で培養し、死菌とした変異型E7タンパク質発現型乳酸菌。
結果を図5に示す。図5中、横軸の1〜5は、前記試料の番号を示す。
また、図5では、前記試験例2の結果も併せて示した。図5中、Aは試験例2におけるLacE7製剤の投与量が0.1mg/マウスの結果を示し、Bは試験例2におけるLacE7製剤の投与量が0.3mg/マウスの結果を示し、Cは試験例2におけるLacE7製剤の投与量が1.0mg/マウスの結果を示す。
図5における矢印は、前記試験例2の結果から算出されたLacE7製剤を0.5mg/マウスで投与した場合の106細胞当たりのIFN−γ産生細胞数を示す。
また、図5では、前記試験例2の結果も併せて示した。図5中、Aは試験例2におけるLacE7製剤の投与量が0.1mg/マウスの結果を示し、Bは試験例2におけるLacE7製剤の投与量が0.3mg/マウスの結果を示し、Cは試験例2におけるLacE7製剤の投与量が1.0mg/マウスの結果を示す。
図5における矢印は、前記試験例2の結果から算出されたLacE7製剤を0.5mg/マウスで投与した場合の106細胞当たりのIFN−γ産生細胞数を示す。
図5の結果から、本発明の変異型E7タンパク質結合型乳酸菌又は変異型E7タンパク質発現型乳酸菌である試料−1〜5を用いた場合には、公知の製剤であるLacE7製剤を同量投与した場合と比較して、優れた抗HPV免疫誘導能を有することが示された。
中でも、試料−2〜5を用いた場合には、公知の製剤であるLacE7製剤を同量投与した場合と比較して、約2倍程度の非常に優れた抗HPV免疫誘導能を有することが示された。
本発明者らによる公知の製剤であるLacE7製剤を用いたヒトのCIN3患者での臨床試験では、病気が治った群と、病気が治らなかった群とにおけるIFN−γ産生細胞数を比較すると、前者は、後者よりもIFN−γ産生細胞数が2倍程度多いことが示されている(K. Kawana et al., “Oral vaccination against HPV E7 for treatment of cervical intraepithelial neoplasia grade 3 (CIN3) elicits E7−specific mucosal immunity in the cervix of CIN3 patients.”, Vaccine, 2014 Oct 29;32(47):6233−9.)。
したがって、本発明の変異型E7タンパク質結合型乳酸菌又は変異型E7タンパク質発現型乳酸菌が、公知の製剤であるLacE7製剤よりも、同じ投与量で、IFN−γ産生細胞数が2倍程度多いことは、臨床効果(奏効率)が有意に上がることが予想される。
中でも、試料−2〜5を用いた場合には、公知の製剤であるLacE7製剤を同量投与した場合と比較して、約2倍程度の非常に優れた抗HPV免疫誘導能を有することが示された。
本発明者らによる公知の製剤であるLacE7製剤を用いたヒトのCIN3患者での臨床試験では、病気が治った群と、病気が治らなかった群とにおけるIFN−γ産生細胞数を比較すると、前者は、後者よりもIFN−γ産生細胞数が2倍程度多いことが示されている(K. Kawana et al., “Oral vaccination against HPV E7 for treatment of cervical intraepithelial neoplasia grade 3 (CIN3) elicits E7−specific mucosal immunity in the cervix of CIN3 patients.”, Vaccine, 2014 Oct 29;32(47):6233−9.)。
したがって、本発明の変異型E7タンパク質結合型乳酸菌又は変異型E7タンパク質発現型乳酸菌が、公知の製剤であるLacE7製剤よりも、同じ投与量で、IFN−γ産生細胞数が2倍程度多いことは、臨床効果(奏効率)が有意に上がることが予想される。
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
<1> ヒトパピローマウイルス(HPV)のE7タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌含有組成物であって、
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの含有量が、乳酸菌1×108菌体当たり、0.03μg〜1.0μgであることを特徴とする乳酸菌含有組成物である。
<2> HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドが、乳酸菌の菌体表面に結合されたものである前記<1>に記載の乳酸菌含有組成物である。
<3> HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドが、乳酸菌の菌体表面に発現されたものである前記<1>に記載の乳酸菌含有組成物である。
<4> 乳酸菌が、Lactobacillus caseiである前記<1>から<3>のいずれかに記載の乳酸菌含有組成物である。
<5> 前記<1>から<4>ののいずれかに記載の乳酸菌含有組成物を含むことを特徴とするHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物である。
<6> 子宮頸部上皮内腫瘍及び初期子宮頸がんの少なくともいずれかの治療用である前記<5>に記載のHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物である。
<7> 前記<1>から<4>のいずれかに記載の乳酸菌含有組成物を含むことを特徴とする粘膜免疫誘導剤である。
<1> ヒトパピローマウイルス(HPV)のE7タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌含有組成物であって、
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの含有量が、乳酸菌1×108菌体当たり、0.03μg〜1.0μgであることを特徴とする乳酸菌含有組成物である。
<2> HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドが、乳酸菌の菌体表面に結合されたものである前記<1>に記載の乳酸菌含有組成物である。
<3> HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドが、乳酸菌の菌体表面に発現されたものである前記<1>に記載の乳酸菌含有組成物である。
<4> 乳酸菌が、Lactobacillus caseiである前記<1>から<3>のいずれかに記載の乳酸菌含有組成物である。
<5> 前記<1>から<4>ののいずれかに記載の乳酸菌含有組成物を含むことを特徴とするHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物である。
<6> 子宮頸部上皮内腫瘍及び初期子宮頸がんの少なくともいずれかの治療用である前記<5>に記載のHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物である。
<7> 前記<1>から<4>のいずれかに記載の乳酸菌含有組成物を含むことを特徴とする粘膜免疫誘導剤である。
Claims (5)
- ヒトパピローマウイルス(HPV)のE7タンパク質由来のポリペプチドを菌体表面に有する乳酸菌含有組成物であって、
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドが、乳酸菌の菌体表面に結合又は発現されたものであり、
前記HPVのE7タンパク質由来のポリペプチドの菌体表面における含有量が、乳酸菌1×108菌体当たり、0.03μg〜1.0μgであることを特徴とする乳酸菌含有組成物。 - 乳酸菌が、Lactobacillus caseiである請求項1に記載の乳酸菌含有組成物。
- 請求項1または2に記載の乳酸菌含有組成物を含むことを特徴とするHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物。
- 子宮頸部上皮内腫瘍及び初期子宮頸がんの少なくともいずれかの治療用である請求項3に記載のHPV感染症及びHPV関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物。
- 請求項1または2に記載の乳酸菌含有組成物を含むことを特徴とする粘膜免疫誘導剤。
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