JP2017507918A - Ｈｐｖおよび関連する疾病のための免疫増強治療ワクチン - Google Patents

Abstract

組換えアデノウイルスに基づく遺伝子ベクターと、以下の３つの主要素を含む免疫増強治療ワクチンを提供する。１）ＨＰＶ１６型、１８型のＥ６およびＥ７多価融合タンパク質を含むＨＰＶ抗原。２）結核菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）とすることができる、該抗原と融合した免疫アジュバントタンパク質。３）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とすることができる、免疫刺激剤。本ワクチンは、ヒトパピローマウイルス感染および関連する疾病の治療に用いられる。

Description

本発明は、ワクチンの分野に関し、具体的には、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）持続感染、子宮頸癌や、その他ＨＰＶ持続感染によって誘起される病変のための治療ワクチンに関する。さらに具体的には、免疫増強剤を含んだＨＰＶのための治療ワクチンに関する。

子宮頸癌は、全世界で、女性における発生率が２番目に多い癌であり、毎年約２７４，０００人の患者がその疾病で死亡している。全ての子宮頸癌において、ＨＰＶ感染が検出される。加えて、肛門や陰茎の癌、一部の口腔癌、咽頭癌も、ＨＰＶ感染に関連している。現在までのところ、２種の予防ワクチンが市場に投入されているが、それらは既に起こってしまったＨＰＶ感染を治療するのには効果を有さず、病変の悪性度の進行を阻止するのにはなおさら効果を有さない。そして、ＨＰＶに感染している患者の人口は既に非常に多いと推定される。その結果、子宮頸癌の発生率の減少を実質的に達成するためには、少なくとも２０年間、大規模な予防ワクチンの接種が必要となる可能性がある。多くの人々がＨＰＶに感染し、子宮頸癌あるいは前癌病変にまで進行している可能性があることに鑑みると、それらの細胞や既に感染している癌細胞を除去する目的の治療ワクチンの開発が、緊急に必要である。ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７タンパク質は、ＨＰＶウイルスに運搬される２つの発癌遺伝子にコードされる癌タンパク質であり、自家性でなく外来性のタンパク抗原に属し、前癌病変から子宮頸癌の発生に至るまで、安定に発現し続ける。そのため、免疫療法の理想的な標的である。ウイルス、ポリペプチド、タンパク質、ＤＮＡの各組換え型ワクチンに関する研究を含め、多数の臨床研究において、これら２つの癌タンパク質を標的とすることが試みられてきた。これらの治療ワクチンは優れた安全性を示し、一部の患者において病変の減退および生存期間の延長が見られる。さらに、ワクチン接種に誘起されるＴ細胞免疫の程度が、治療法の治療効果に関連している可能性があることが、研究によって示されている。しかしながら、一部の臨床研究には既に展望があるものの、持続感染を完全に治癒し、癌を除去する目的のためには、特定の抗原に対する抗腫瘍性Ｔ細胞免疫応答を十分に誘起するための新しい戦略が、依然として必要である。

熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、細胞機能を調整し、免疫応答を増強するのに効果を有しうる。熱ショックタンパク質は、第一に、タンパク質の輸送および配置、フォールディングを補助する「シャペロン」として機能する。第二に、自己の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化することができる。ＨＳＰ７０は、マクロファージのレセプターに結合することができ、それによって効果的に免疫応答を誘起する。ＳＧＮ−００１０１は、ＨＰＶ１６型のＥ７タンパク質および結核菌のＨＳＰ６５と融合した融合タンパク質であり、安全性が高く、子宮頸部上皮細胞の高度異型増殖を抑制する効果をいくぶん有する。

顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、幅広く研究され、最も効果的な治療剤の１つであると認識されている。ＧＭ−ＣＳＦは、ナチュラルキラー細胞を媒介し、抗原提示細胞を介して、腫瘍に対して特異的にＣＤ８＋キラーＴリンパ球を活性化することができ、それによって抗腫瘍作用を生じさせる。多数の動物実験や臨床試験において、それらの能力が、抗腫瘍免疫応答を長期にわたって効果的に刺激することが示されてきた。例えば、免疫治療薬であるシプリューセル−Ｔは、ＧＭ−ＣＳＦによって抗原提示細胞を活性化するのに有利なものであり、現在、米国食品医薬品局に市販を承認されている。Ｊｅｎｎｅｒｅｘ等の最新の臨床研究も、ＧＭ−ＣＳＦを発現させた腫瘍溶解性ワクシニアが、種々の癌の病変を軽減することができることを示している。しかしながら、これらの免疫増強法は全て、腫瘍抗原に対する選択性に乏しかったり、あるいは免疫刺激が十分でなかったりと、治療効果が満足できる水準で得られるものではない。

先行技術の免疫増強法において、腫瘍抗腫瘍抗原に対する選択性に乏しかったり、あるいは免疫刺激が十分でなかったりと、治療効果が満足できる水準で得られるものではないという問題を解決するために、本発明は、ＨＰＶ感染および関連する疾病のための免疫増強治療ワクチンを提供するものである。

第一に、本発明はＨＰＶの５つの遺伝子型と、免疫増強因子とを有する融合抗原であって、ＨＰＶ１６型のＥ６およびＥ７タンパク質と、ＨＰＶ１８型のＥ６およびＥ７タンパク質と、免疫増強因子としてのアジュバントタンパク質と、を含む融合抗原を提供する。

本発明は、多価抗原が線形に配置された形態をとっており、そのため、融合抗原のＴ細胞エピトープには影響がない。Ｔ細胞免疫応答が治療ワクチン接種において中心的な役割を果たす。Ｔ細胞抗原決定基は、抗原提示の過程で線形の短いペプチドに分解され得、認識部位は、典型的にはアミノ酸を８個のみ有している。従って、抗原配置における順序の変化は、免疫刺激にも実質的な影響を及ぼさない。本発明において、発明者らは、ＨＰＶ１６型および１８型の４つの抗原タンパク質を熱ショックタンパク質分子と融合させている。多くのＨＰＶ抗原を融合させるほど、可能性のある抗原決定基を多数提供すること、抗原提示を増強すること、免疫応答を増大させること、遺伝子型の異なる多くのＨＰＶ感染に対して機能することが可能であるという点において、有利であり、それによって、ワクチンによる免疫付与によって潜在的に恩恵を受ける人口を効果的に増加させることができる。加えて、大きなタンパク質ほど、分解されやすく、提示されやすいので、強力な免疫応答を刺激することができる。

本発明の一実施形態においては、前記融合抗原は、以下のような１つ以上の変異点を有する。含まれる変異点としては、ＨＰＶ１６型のＥ６タンパク質の１２１番目の位置でグルタミン酸がグリシンで置換されており、１２２番目の位置でリシンがグリシンに置換されている。また、ＨＰＶ１６型のＥ７タンパク質の２４番目の位置でシステインがグリシンに置換されており、２６番目の位置でグルタミン酸がグリシンに置換されている。また、ＨＰＶ１８型のＥ６タンパク質の１１６番目の位置でグルタミン酸がグリシンに置換されており、１１７番目の位置でリシンがグリシンに置換されている。また、ＨＰＶ１８型のＥ７タンパク質の２７番目の位置でシステインがグリシンに置換されており、２９番目の位置でグルタミン酸がグリシンに置換されている。

本発明において、アミノ酸の点変異は、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質において細胞のｐ５３タンパク質に結合される領域、およびＨＰＶ Ｅ７タンパク質において細胞のｐＲｂタンパク質に結合される領域において、行われている。変異を導入したタンパク質は、上記２種のタンパク質のいずれにも特異的に結合せず、その結果、ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７タンパク質が正常な細胞を潜在的に変化させる可能性が生じる危険が排除される。本発明において、点変異はいくつかの主要位置にのみ導入することができ、そのため、点変異がタンパク質の抗原性に影響を及ぼさないことに留意すべきである。

本発明において、前記免疫増強因子のアジュバントタンパク質は、原核生物または哺乳類由来の熱ショックタンパク質としてもよく、好ましくは、結核菌由来の熱ショックタンパク質としてもよい。

本発明の特定の実施形態において、ＨＰＶの５つの遺伝子と免疫増強因子との融合抗原は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で表現されるアミノ酸配列を有している。

さらに、本発明は、上記融合抗原を発現させるための組換え遺伝子発現ベクターを提供する。

本発明の一実施形態において、前記ベクターは、好ましくは免疫刺激剤の発現カセットも運搬してもよい。

前記免疫刺激剤は、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはインターロイキン、またはインターフェロン、またはケモカインとしてもよく、好ましくは顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）としてもよい。

本発明の特定の実施形態において、前記発現ベクターは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３で表現されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡフラグメントを運搬してもよい。

本発明において、前記ベクターは、組換えアデノウイルスベクター、または組換えアデノ随伴ウイルスベクター、または組換えレトロウイルスベクター、または組換えレンチウイルスベクター、または組換えヘルペスウイルスベクター、または組換えワクシニアベクター、または組換えセンダイウイルスベクターとすることができる。また、裸ＤＮＡベクター、ナノ粒子、ポリマー、リポソームよりなる群から選択される非ウイルスベクターとしてもよい。

さらに、本発明は、治療効果を有する量の上記の融合抗原、または治療効果を有する量の上記の組換え遺伝子発現ベクターを含む、ＨＰＶ感染に誘起される疾病を治療するための医薬製剤を提供する。

好ましい実施形態において、医薬製剤は、治療効果を有する量の融合抗原と、免疫刺激剤とを含む。

医薬製剤において、前記免疫刺激剤は、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはインターロイキン、またはインターフェロン、またはケモカイン、好ましくは顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）としてもよい。

本発明の特定の実施形態において、医薬製剤は、ＨＰＶ１６型および１８型のＥ６およびＥ７と、結核菌由来の熱ショックタンパク質であり、上記多価融合タンパク質と再融合された免疫増強因子のアジュバントと、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である免疫刺激剤と、の複数遺伝子融合抗原である抗原を発現させることを目的とする。

本発明の別の特定の実施形態において、医薬製剤は、さらに、医薬的に許容されるキャリア、医薬品添加物、補助剤等を含有してもよい。

本発明の特定の実施例において、医薬製剤は、単回注射、あるいは単回または複数回の免疫増強注射によって、ワクチンとして患者に直接注射し、免疫刺激および免疫増強の効果を達成してもよい。あるいは、医薬製剤は、リンパ球、樹状細胞、腫瘍細胞、臍帯血細胞等を含む患者の自家細胞あるいはドナーの細胞を、イン・ビトロで処理し、培養するための抗原として、間接的に使用することができる。そして、それらの細胞は、単回または複数回の注射によって、患者に注射し、免疫刺激および免疫増強の効果を達成してもよい。

さらに、本発明は、上記の組換え遺伝子発現ベクターを運搬する組換えアデノウイルスを提供する。

本発明の特定の実施形態において、組替えアデノウイルスは、ＨＰＶ１６型および１８型のＥ６およびＥ７、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現させることができる。

本発明の別の特定の実施形態において、組替えアデノウイルスは、ＨＰＶ１６型および１８型のＥ６およびＥ７タンパク質、結核菌由来の熱ショックタンパク質、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現させられることが好ましい。

組替えアデノウイルスにおいて、ＨＰＶ１６型および１８型のＥ６およびＥ７タンパク質は、結核菌由来の熱ショックタンパク質と融合させ、多価融合タンパク質としてもよい。また、融合タンパク質の発現カセットは、ＧＭ−ＣＳＦの発現カセットと、同じベクターの中で共発現させてもよい。

組替えアデノウイルスにおいて、ＨＰＶ１６型および１８型のＥ６およびＥ７タンパク質は、多価融合タンパク質に組み込んでもよく、その多価融合タンパク質は熱ショックタンパク質と融合させなくてもよい。また、融合タンパク質の発現カセットは、ＧＭ−ＣＳＦの発現カセットと、同じベクターの中で共発現させてもよい。

さらに、本発明は、ＨＰＶ感染によって誘起される疾病を治療するための医薬品の製造に用いるという、上記融合抗原、または上記組換え遺伝子発現ベクター、または上記アデノウイルス、または上記医薬製剤の使用方法を提供する。

前記ＨＰＶ感染によって誘起される疾病は、ＨＰＶ慢性感染に関連する疾病であり、特に、子宮頸癌、陰茎癌、肛門癌、咽頭癌、口腔癌、頭および首の癌、子宮頸部前癌病変、子宮頸部過形成である。

イン・ビトロのＴリンパ球活性化実験が示すところによると、ＨＰＶ抗原のＨＳＰとの融合タンパク質を発現しているベクターと、ＨＰＶ抗原とＧＭ−ＣＳＦを共発現しているベクターは、ともに、ＨＰＶ抗原を単独で発現しているベクターよりも強いＴ細胞免疫応答を誘起することができる。また、ＨＰＶ抗原のＨＳＰとの融合タンパク質とＧＭ−ＣＳＦをともに発現しているベクターは、最も強いＴ細胞免疫応答を誘起することができる。さらに、ＧＭ−ＣＳＦの発現により、高ドーズおよび低ドーズのグループのそれぞれにおいて、Ｔ細胞免疫レベルを顕著に向上させることができ、多数の腫瘍浸潤Ｔ細胞を誘起できるようになる。ＨＰＶ抗原をマウスに発現させる腫瘍治療実験において、各グループのマウスにおける腫瘍発生率および腫瘍サイズの評価結果によると、ＨＳＰ融合したベクターおよびＧＭＳ−ＣＳＦを発現しているベクターは、腫瘍の排除および再発の防止に優れており、ＨＰＶ抗原のＨＳＰとの融合タンパク質とＧＭＳ−ＣＳＦをともに発現しているベクターは、最も高い効果を示しうる。これらは、イン・ビトロの実験の結果と整合している。このように、本発明は、初めて、ＨＳＰ融合タンパク質に由来する免疫刺激のＧＭ−ＣＳＦとの相乗効果を提示し、また、子宮頸癌の治療におけるワクチンの効果を増強する新規な方法を提供するものである。

マウスでの現行の実験結果によると、同じ機構で、このワクチンが、人間においても、ＨＰＶウイルスが発現した抗原に特異的な免疫応答を誘起することができ、その結果、ＨＰＶに感染した細胞や子宮頸癌に対するＴ細胞のような特定の免疫細胞の強力な致死効果を達成し、また増強することができると考えられる。このようなワクチンが、ＨＰＶウイルスの２つの主要な癌たんぱく質、つまり長期にわたって発現され、感染した細胞を慢性的に増殖させて最終的に癌を進行させる能力のある２つの癌抗原たんぱく質であるＥ６およびＥ７に特異的な免疫応答を誘起することに鑑みると、ワクチンは、ＨＰＶ慢性感染によって誘起される子宮頸癌、子宮頸部前癌病変、子宮頸部過形成、そして咽頭癌や口腔癌等、ＨＰＶ慢性感染によって誘起される他の癌の治療に用いることができる。

図１は、組換えアデノウイルスの構築および同定を示している。図１のaは、Ａｄ−Ｅａｓｙ系を用いて調製した対応する組換えアデノウイルスの５つのｃＤＮＡの構造パターンを示す。図１のｂは、ウエスタンブロット法によって測定されたＨＥＫ２９３細胞における組換えアデノウイルスベクターの発現を示し、図中において、ＨＥＫ２９３細胞は、組換えアデノウイルスに感染しており、外因性遺伝子の発現は、Ａｄ−ＧＦＰを有する抗ＨＰＶ１６Ｅ７抗体を陰性対照として用いて測定されている。図１のｃは、ウエスタンブロット法によって測定されたＨＥＫ２９３細胞における対応組換えアデノウイルスベクターのＧＭ−ＣＳＦの発現を示す。図１のｄは、コドン最適化をしていないものと比較した場合のコドン最適化の結果として、組換えアデノウイルスＡｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ−ＧＭによって著しく増加された融合タンパク質ＨＰＶ１８ ／１６Ｅ６Ｅ７−ＨＳＰの発現を示す。

図２は、Ｔリンパ球増殖実験を示し、特に、Ｅ７ポリペプチドでの刺激下で対応組換えアデノウイルスの免疫を持つマウスにおける脾臓細胞の増殖倍数を示し、縦座標は相対的増殖倍数、すなわち、Ｅ７ポリペプチドで刺激していない脾臓細胞のＯＤ値に対するＥ７ポリペプチドで刺激した脾臓細胞のＯＤ値の割合を表す。ｎ＝３であり、エラーバーはＳＥを表す。記号「^＊」はｐ＜０．０５であることを表す。

図３は、ＥＬＩＳＰＯＴ実験を示し、図３のＡは、対応組換えアデノウイルスの免疫を持つマウスにおけるＥ６ポリペプチド刺激下でのＩＦＮγ分泌脾臓細胞量を示し、図３のＢは、対応組換えアデノウイルスの免疫を持つマウスにおけるＥ７ポリペプチド刺激下でのＩＦＮγ分泌脾臓細胞量を示し、図３において縦座標は、１０^６脾臓細胞あたりのスポット形成細胞数を示す。ｎ＝３であり、エラーバーはＳＥを表す。記号「^＊」はｐ＜０．０５であることを表す。

図４は、腫瘍浸潤のＴリンパ球を示す。組換えアデノウイルスによる免疫付与により、腫瘍浸潤のＣＤ８＋やＣＤ４＋Ｔ細胞の量を増やすことができる。図４において、縦座標は、対照Ａｄ−ＧＦＰとの比較において、４つの表示の総数の平均として各表示のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔリンパ球の数を示す。ｎ＝３であり、エラーバーはＳＥを表す。記号「^＊」はｐ＜０．０５であることを表す。

図５は、組換えアデノウイルスベクターの投与実験を示す。ＥＬＩＳＰＯＴ実験のために、複数のマウスに対し、それぞれ対応組換えアデノウイルスを３種類の投与量で免疫を与え、ＩＦＮγ分泌脾臓細胞量を比較する。ｎ＝３であり、エラーバーはＳＥを表す。

以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１ プラスミド構築およびウイルスパッケージング

ＨＰＶ１８型のＥ６（ジェンバンクアクセス番号：ＡＦ３７３１０９）とＥ７（ＡＦ３７３１１０）と、ＨＰＶ１６型のＥ６（ＡＢ８１８６９１）とＥ７（ＫＣ７３６９３１）と、テンプレートとして結核菌のＨＳＰ（ＥＵ７４７３３４）の遺伝子を用い、コドンを人間において発現させるために最適化し、次いで、中間の終止コドンを除去しながら融合遺伝子のオープンリーディングフレームに接合した。完全な配列は、ジェンスクリプト社によって合成された。Ｅ６およびＥ７による細胞の悪性形質転換のリスクを排除するために、ＨＰＶ１８型および１６型のＥ６およびＥ７タンパク質のいくつかの主要位置に、すなわち、ＨＰＶ１８型のＥ６タンパク質（Ｇｌｕ１１６Ｇｌｙ、Ｌｙｓ１１７Ｇｌｙ）、ＨＰＶ１６型のＥ６タンパク質（Ｇｌｕ１２１Ｇｌｙ、Ｌｙｓ１２２Ｇｌｙ）、ＨＰＶ１８型Ｅ７タンパク質（Ｃｙｓ２７Ｇｌｙ、Ｇｌｕ２９Ｇｌｙ）、ＨＰＶ１６型のＥ７タンパク質（Ｃｙｓ２４Ｇｌｙ、Ｇｌｕ２６Ｇｌｙ）に、点変異を導入した。ＨＰＶ１８型＆１６型／Ｅ６／Ｅ７は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で表されるアミノ酸配列を有し、ＨＰＶ１８型＆１６型／Ｅ６／Ｅ７ＨＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２で表されるアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３で表現されるヌクレオチド配列を有する。ヒト由来のＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ増幅により得た（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）。

Ａｄ−Ｅａｓｙアデノウイルスパッケージングシステム（カリフォルニア州サンタ・クララ市、アジレント・テクノロジー社より購入）を用いて、５つの組換えアデノウイルスを作った。まず、異なる遺伝子が挿入された５つのシャトルプラスミドと、ＣＭＶプロモーターを構築した。具体的には、（１）ＨＰＶ１６型のＥ６およびＥ７の融合タンパク質を発現するためのシャトル−Ｅ６Ｅ７、（２）ＨＰＶ１６型のＥ６およびＥ７とｈｓｐとの融合タンパク質を発現するためのシャトル−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ、（３）（１）をベースにした、ヒト由来ＧＭ−ＣＳＦを共発現するためのシャトル−Ｅ６Ｅ７−ＧＭ、（４）ＨＰＶ１８型／１６型のＥ６およびＥ７とｈｓｐとヒト由来ＧＭ−ＣＳＦとの融合タンパク質を共発現するためのシャトル−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ−ＧＭ、（５）対照としての、ｅＧＦＰを発現するためのシャトル−ＧＦＰの、５つのシャトルプラスミド(図１ａ)である。次に、従来の方法で、前記５つの組換えアデノウイルスを、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７−ＧＭ、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ−ＧＭおよびＡｄ−ＧＦＰにそれぞれパッケージした。

実施例２ 組換え外因性タンパク質発現の測定

アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ社、メリーランド州ロックビル）から購入したヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を、２プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞の感染力価で、実施例１にて作製したパッケージングされた組換えアデノウイルスに感染させ、感染２日後にＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞をレムリー溶解用緩衝液で溶解し、全細胞タンパク質を変性のために５分間煮沸し、その後ＳＤＳ電気泳動を行った。その後、タンパク質をセルロースアセテート膜に電気的に移動させ、対応する抗体、つまり抗ＨＰＶ１６型Ｅ７タンパク質抗体（カリフォルニア州サンタクルーズ、サンタクルーズバイオテクノロジー社）および抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体（カリフォルニア州サンディエゴ、バイオレジェンド社）を用いて、測定を行った。発色のために、増強化学発光（ＥＣＬ）システムを用いた。ＧＭ−ＣＳＦ用ＥＬＩＳＡ分析キット（カリフォルニア州サンディエゴ、バイオレジェンド社）を用いて、マウスにおけるＧＭ−ＣＳＦ濃度を測定した。

５つの組換えアデノウイルスを、標準的な方法に従って調製し、２回の超遠心分離で精製した。外因性遺伝子の発現を検出するために、ウエスタンブロット法を用いて、組換えウイルスに感染した２９３細胞を検出した。その結果、発現バンドが予想分子量のバンド位置で検出されたが、Ａｄ−ＧＦＰに感染した陰性対照試料の対応位置では何も観察されなかったことが証明された（図１ｂ、ｃ）。ＨＰＶ抗原とＧＭ−ＣＳＦとの融合タンパク質が高い効率で発現したことが、結果に示される。ＥＬＩＳＡ分析の結果、マウスにおけるＧＭ−ＣＳＦの血清濃度としては、このテストグループは、注射５日後は対照グループよりも７倍高く、注射２ヶ月後は依然約１．５倍高いことが分かった。

ＨＰＶ抗原の発現効率はコドン最適化後に大幅に改善され、その発現は最適化前よりも３倍を上回って増加した（図１ｄ）。

実施例３ イン・ビトロでのリンパ球増殖およびＥＬＩＳＰＯＴ

雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２^ｂ、６−８週齢）をジャクソン研究所（メイン州バー・ハーバー）から購入し、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ウイルス、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐウイルス、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７−ＧＭウイルス、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ−ＧＭウイルスおよびＡｄ−ＧＦＰウイルスを、１０^７ｐｆｕ／マウスの投与量で皮下注射した。４週間後、マウスの脾臓細胞（１×１０^５／ウェル）を単離および培養し、各マウスの脾臓細胞を５日間、１０μｇ／ｍｌのＥ７ポリペプチド有りまたは無しで培養した。４日目にＢｒｄＵを添加した。Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ細胞増殖キット（マサチューセッツ州ビレリカ、ミリポア社）を用いて、細胞に融合したＢｒｄＵ量を測定した。Ｅ７ポリペプチド有りの場合に読み取られたＯ．Ｄ．をＥ７ポリペプチド無しの場合に読み取られたＯ．Ｄ．で割ることによって計算した相対的増殖倍数として、測定結果を表した。

Ｅ６およびＥ７ポリペプチドに特異的なインターフェロンＩＦＮγ分泌Ｔリンパ球を計数し、Ｔ細胞からの免疫応答を評価する方法で、ＥＬＩＳＰＯＴ実験を行った。最初に、免疫付与のため上記の組換えウイルスを雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに接種した。２−４週間後、１×１０^５細胞／ウェルの抗ＩＦＮγ抗体でコーティングした９６ウェルプレートに、マウスの脾臓細胞を単離および培養した。培養用の各マウスの細胞を、Ｅ６ポリペプチド刺激グループとＥ７ポリペプチド刺激グループに分け、２μｇのＥ６_{４８−５７}（ＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬ、Ｈ−２Ｄｂ制限）ポリペプチドおよびＥ７_{４９−５７}（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、Ｈ−２Ｄｂ制限）ポリペプチドでそれぞれ刺激し、ポリペプチドで刺激していない細胞を陰性対照として用いた。３７℃で２４時間培養後、細胞を除去し、ウェル内の残留物を０．５％−２０％ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、その後、酵素でラベルした抗ＩＦＮγ抗体で再度培養し、最終的にＡＣＥ基質で展開を行った。基質展開および乾燥終了後、ＩＦＮγ応答スポットをＥＬＩＳＰＯＴカウンターを用いて計数し分析した。

抗原特異的Ｔ細胞免疫応答は、Ｔ細胞増殖およびＥＬＩＳＰＯＴ実験の結果から、イン・ビトロで測定することができる。Ｔ細胞増殖実験では、５日目の細胞の相対的な量を、細胞ＤＮＡに組み込まれたＢｒｄＵ含有量として表すことができる。Ｅ７特異的ポリペプチドでの刺激下において、ＨＰＶ抗原を発現する組換えウイルスを接種したマウスの全脾臓細胞は、Ａｄ−ＧＦＰの免疫を持つ陰性対照マウスの脾臓細胞よりもはるかに増加した（図２）。組換えウイルスＡｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐおよびＡｄ−Ｅ６Ｅ７−ＧＭの免疫を持つマウスの脾臓細胞はそれぞれ、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７を接種したマウスの脾臓細胞よりも高い増殖倍数を有し、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ−ＧＭの免疫を持つマウスは、最も高い増加を示した。抗原特異的キラーＴ細胞からの免疫応答の程度は、ＥＬＩＳＰＯＴ実験の結果からわかる。ＥＬＩＳＰＯＴ実験の結果によると、Ｅ６ポリペプチドでの刺激下において、ＨＰＶ抗原を発現する組換えウイルスの免疫を持つマウスは全て、その抗原に特異的なキラーＴ細胞の免疫応答を得た。特に、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７−ＧＭおよびＡｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ−ＧＭの免疫を持つ各マウスは、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７を接種したマウスよりもはるかに多くのＩＦＮγ分泌脾臓細胞を有し、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ−ＧＭの免疫を持つマウスは、最大量のＩＦＮγ分泌脾臓細胞を有した（図３Ａ）。Ｅ７ポリペプチドでの刺激下において、ＩＦＮγ分泌脾臓細胞は、各グループの絶対量がＥ６ポリペプチドでの刺激下のものよりもはるかに多かったことを除いて、Ｅ６ポリペプチドでの刺激下のものと類似の相対分布を有する。Ｅ７ポリペプチドは、Ｅ６ポリペプチドで刺激したものよりはるかに強力に、マウスにおけるキラーＴ細胞の免疫応答を誘導することもできることが示される（図３Ｂ）。要約すると、Ｔ細胞増殖およびＥＬＩＳＰＯＴ実験の結果から、ＨＳＰおよびＧＭ−ＣＳＦがＥ６およびＥ７抗原に特異的なＴリンパ球の免疫応答を別々に又は相乗的に増強することができることが一貫して示される。

実施例４ 腫瘍浸潤Ｔリンパ球の分析

Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＴＣ−１細胞を接種した（ＨＰＶ１６型のＥ６およびＥ７のｏｎｃｏａｎｔｉｇｅｎで形質転換されたＣ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍細胞は、最も一般的な子宮頸癌モデル細胞株の一つであり、ジョンズ・ホプキンス大学のＴ．Ｃ．Ｗｕ教授に贈呈された）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスＴＣ−１細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および５０Ｕ／ｍｌの２種類の抗生物質を含有するＲＰＭＩ１６４０完全培地で増殖させ、他の細胞をＤＭＥＭ完全培地（Ｇｉｂｃｏ）で増殖させた。皮下腫瘍がひとたび約５ｍｍの直径に成長したら、１×１０^７の組換えアデノウイルスＡｄ−Ｅ６Ｅ７、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７−ＧＭ、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ−ＧＭおよびＡｄ−ＧＦＰをマウスにそれぞれ皮下接種した。７日後に腫瘍を採取し、Ｈ＆Ｅ染色と、抗ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の免疫蛍光分析にかけた。その手順は次のとおりである。まず、腫瘍組織を除去、凍結し、ＯＣＴへの包埋を行い、５．０μｍの厚さの切片に切断した。その後、４％アセトンで固定し、１０％ウマ血清で３０分ブロッキングした。次に、切片を室温で１時間、抗マウスＣＤ４およびＣＤ８抗体（カリフォルニア州サンノゼ、ＢＤバイオサイエンス社）で培養し、ＰＢＳで洗浄後、２ｍｇ／ｍＬのヤギ抗ラット二次抗体Ａｌｅｘａ６４７（カリフォルニア州カールズバッド、インビトロゲン社）で培養した。その後、ＤＡＰＩで核染色し顕微鏡分析を行った。陽性細胞は４つの画像に見られ、統計分析用の平均値±標準誤差を記録した。

担癌マウスの腫瘍が約５ｍｍの直径に成長したら、それぞれ異なる組換えアデノウイルスを用いた免疫治療に供した。７日後、組織学的分析のために腫瘍を取り出し、それぞれ異なるウイルスの免疫を持つマウスの腫瘍中のＴリンパ球浸潤の程度を評価した。ＣＤ８＋細胞の染色結果によると、ＨＰＶ抗原を発現する組換えウイルスを与えられたマウスは、Ａｄ−ＧＦＰ免疫を付与された陰性対照マウスよりも、腫瘍組織におけるＣＤ８＋Ｔリンパ球浸潤が多かった（図４）。ＨＳＰおよびＧＭ−ＣＳＦと融合した融合タンパク質が別々に発現又は同時発現したベクターは両方とも、担癌マウスにおけるＣＤ８＋Ｔリンパ球浸潤を著しく向上することができた（図４）。ＣＤ４＋細胞の染色結果によると、ＧＭ−ＣＳＦを発現する組換えアデノウイルスを免疫付与されたマウスは、腫瘍組織のＣＤ４＋Ｔリンパ球浸潤量が著しく増えている。しかしながら、ＨＳＰはＣＤ８＋Ｔリンパ球浸潤の著しい増加をもたらしたものの、ＨＳＰ融合タンパク質を発現したマウスは、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７およびＡｄ−ＧＦＰの免疫を持つマウスと比較して、腫瘍組織のＣＤ４＋を発現するＴリンパ球量がそれほど増えなかった（図４）。

実施例５ 組換えアデノウイルスの免疫投与

Ａｄ−Ｅ６Ｅ７、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７−ＧＭ、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ−ＧＭおよびＡｄ−ＧＦＰを、２×１０^５、１×１０^６、１×１０^７ｐｆｕ／マウスの３種類の投与量で、それぞれマウスに接種した。接種４週間後、マウスを殺し、その脾臓細胞をＥＬＩＳＰＯＴ実験用に採取した。それぞれ異なる投与量で様々な組換えアデノウイルスの免疫を与えられた各マウスの脾臓細胞のＩＦＮγ応答スポットを読み取り分析し、それぞれ異なる投与量により誘導されたＴ細胞の免疫の程度を評価した。

本発明者らは、それぞれ異なる投与量でＴ細胞免疫応答を誘導する様々な組換えウイルスの能力を評価するために、投与実験を行った。測定されたＩＦＮγ分泌細胞の量によると、２×１０^５および１×１０^６ｐｆｕ／マウスの低投与量の状態では、組換えウイルスＡｄ−Ｅ６Ｅ７−ＧＭおよびＡｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ−ＧＭは、その他のウイルスより強いＴ細胞免疫応答を誘導し、そのうちＡｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ−ＧＭは、最も強いＴ細胞免疫応答を誘導した。１×１０^７ｐｆｕ／マウスの高投与量の状態では、ＨＰＶ抗原を発現するすべての組換えウイルスが、効果的に免疫応答を誘導することができた。興味深いことに、組換えウイルスＡｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐの免疫を有するマウスの方が、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７−ＧＭの免疫を有するマウスよりもＩＦＮγ分泌脾臓細胞量が多かった。Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ−ＧＭ免疫グループは、依然としての最大のＩＦＮγ分泌脾臓細胞量だった（図５）。実験結果によると、ＧＭ−ＣＳＦ発現は、低投与量グループにおけるＴ細胞免疫応答を効果的に増強する一方、ＨＳＰ融合タンパク質は、高投与量においてより良い結果をもたらし、両者の共発現により相乗効果が得られる。

ＧＭ−ＣＳＦは、比較的低投与量でキラーＴリンパ球の免疫応答を増加することができるため、潜在的な副作用を減らしながらもより良い免疫結果が得られるよう、低投与量で用いてもよい。

実施例６ マウスでのインビボ腫瘍治療

この実験は、組換えアデノウイルスの治療効果を評価するのに大変重要である。まず、マウス被験体に１×１０^５／マウスのＴＣ−１細胞を皮下接種した。約９日後に、触知可能な腫瘍塊がマウスの皮下に形成されたら、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７−ＧＭ、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ−ＧＭおよびＡｄ−ＧＦＰを、１×１０^６および１×１０^７ｐｆｕ／マウスの投与量でそれぞれのマウスに皮下注射した。最初の治療から２週間後、同じ投与量で免疫を強化した。最初の治療から２か月後、すべての腫瘍をマウスから取り除き、マウスに同じＴＣ−１細胞を再接種した。マウスの腫瘍を３日間おきに４ヶ月間観察した。腫瘍の発生および腫瘍の大きさについて、それぞれ異なる組換えウイルスを接種したマウス間で比較し、異なる組換えアデノウイルスの治療効果及び腫瘍排除効果を測定した。

上記の腫瘍治療実験の結果によると、異なる組換えウイルスごとに、インビボにおける腫瘍細胞排除能力が異なる。初期の投与実験においては、治療実験のために、１×１０^６および１×１０^７ｐｆｕ／マウスの２種類の投与量を用いた。１×１０^６ｐｆｕ／マウスの投与量の場合、Ａｄ−ＧＦＰで治療した対照グループの５匹のマウスはすべて腫瘍を発症した。Ａｄ−Ｅ６Ｅ７で治療したマウスは１０匹中２匹のみが、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐで治療したマウスは１０匹中６匹が、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７−ＧＭで治療したマウスは１０匹中５匹が、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ−ＧＭで治療したマウスは１０匹中７匹が、治療後２か月間は腫瘍を発症しなかった。実験結果によると、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ−ＧＭで治療したものの治療効果が一番高かった。また、１×１０^７ｐｆｕ／マウスの投与量の場合、２ヶ月後に、Ａｄ−ＧＦＰで治療した対照グループの５匹のマウスはすべて腫瘍を発症したが、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７で治療したマウス５匹中４匹は腫瘍を発症せず、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７−ＧＭおよびＡｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐ−ＧＭで治療したマウスはすべて腫瘍を発症しなかった（表１）。また、同じ期間にわたって、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７ｈｓｐで治療した腫瘍を有するマウスは、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７で治療したマウスよりも小さいサイズの腫瘍を有していた（表示せず）。最初の治療から２ヶ月後、全ての無腫瘍マウスにＴＣ−１腫瘍細胞を再接種した。腫瘍を再接種されたマウスは全て、６ヶ月間の実験の最後まで依然として腫瘍を発症しなかった。要約すれば、実験結果によると、ＨＳＰおよびＧＭ−ＣＳＦは独立に又は相乗的に機能し、ＨＰＶに特異的なＴ細胞免疫応答を増強し、そして更にはマウスの腫瘍を除去し、再発を防止する効果を達成することができる。実験結果によると、ＧＭ−ＣＳＦとＨＳＰの組み合わせが、相乗的治療効果が一番高い。

表１は、腫瘍治療実験における無腫瘍マウスの割合を表している。

上記は、単に本発明を好適な実施形態に基づいて説明したものであり、当業者は、本発明の原理を逸脱しない範囲で修正や変形をしてもよく、そのような修正および変形も本発明の保護の範囲に含まれるべきである。

この進歩的なワクチンは、免疫応答の増強および腫瘍の除去に効果を有し、子宮頸癌、子宮頸部前癌病変、子宮頸部過形成、そして、一部の咽頭癌、口腔癌、肛門癌等、ＨＰＶの慢性感染によって誘起される他の癌の治療に有用である。

Claims (15)

1. ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の５つの遺伝子と、免疫増強因子との融合抗原であって、ＨＰＶ１６型のＥ６およびＥ７タンパク質と、ＨＰＶ１８型のＥ６およびＥ７タンパク質と、免疫増強分子のアジュバントタンパク質と、を含む融合抗原。
2. １つ以上の変異点を有し、ＨＰＶ１６型のＥ６タンパク質の１２１番目の位置でグルタミン酸がグリシンで置換されており、１２２番目の位置でリシンがグリシンに置換されており、ＨＰＶ１６型のＥ７タンパク質の２４番目の位置でシステインがグリシンに置換されており、２６番目の位置でグルタミン酸がグリシンに置換されており、ＨＰＶ１８型のＥ６タンパク質の１１６番目の位置でグルタミン酸がグリシンに置換されており、１１７番目の位置でリシンがグリシンに置換されており、ＨＰＶ１８型のＥ７タンパク質の２７番目の位置でシステインがグリシンに置換されており、２９番目の位置でグルタミン酸がグリシンに置換されていることを特徴とする請求項１に記載の融合抗原。
3. 前記免疫増強因子のアジュバントタンパク質は、原核生物または哺乳類由来の熱ショックタンパク質であって、好ましくは、結核菌由来の熱ショックタンパク質であることを特徴とする請求項１または２に記載の融合抗原。
4. 請求項１から３のいずれか１項に記載の融合抗原を発現させるための組換え遺伝子発現ベクター。
5. 請求項１から３のいずれか１項に記載の融合抗原を発現させるための発現カセット、および免疫刺激剤を発現させるための発現カセットを運搬することを特徴とする請求項４に記載の組換え遺伝子発現ベクター。
6. 前記免疫刺激剤は、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはインターロイキン、またはインターフェロン、またはケモカインであって、好ましくは顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であることを特徴とする請求項５に記載の組換え遺伝子発現ベクター。
7. ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３で表現されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡフラグメントを運搬することを特徴とする請求項４から６のいずれか１項に記載の組換え遺伝子発現ベクター。
8. 組換えアデノウイルスベクター、または組換えアデノ随伴ウイルスベクター、または組換えレトロウイルスベクター、または組換えレンチウイルスベクター、または組換えヘルペスウイルスベクター、または組換えワクシニアベクター、または組換えセンダイウイルスベクターであることを特徴とする請求項４から６のいずれか１項に記載の組換え遺伝子発現ベクター。
9. 裸ＤＮＡベクター、ナノ粒子、ポリマー、リポソームよりなる群から選択される非ウイルスベクターであることを特徴とする請求項４から６のいずれか１項に記載の組換え遺伝子発現ベクター。
10. 治療効果を有する量の請求項１から３のいずれか１項に記載の融合抗原、または治療効果を有する量の請求項４から９のいずれか１項に記載の組換え遺伝子発現ベクターを含む、ＨＰＶ感染に誘起される疾病を治療するための医薬製剤。
11. 治療効果を有する量の請求項１から３のいずれか１項に記載の融合抗原と、免疫刺激剤とを含むことを特徴とする請求項１０に記載の医薬製剤。
12. 前記免疫刺激剤は、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはインターロイキン、またはインターフェロン、またはケモカインであって、好ましくは顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であることを特徴とする請求項１１に記載の医薬製剤。
13. 請求項４から９のいずれか１項に記載の組換え遺伝子発現ベクターを運搬することを特徴とする組換えアデノウイルス。
14. ＨＰＶ感染によって誘起される疾病を治療するための医薬品の製造に用いる、請求項１から３のいずれか１項に記載の融合抗原、または請求項４から９のいずれか１項に記載の組換え遺伝子発現ベクター、または請求項１０から１２のいずれか１項に記載の医薬製剤、または請求項１３に記載のアデノウイルスの使用法用。
15. 前記ＨＰＶ感染によって誘起される疾病は、ＨＰＶ慢性感染に関連する疾病であり、好ましくは、子宮頸癌、陰茎癌、肛門癌、咽頭癌、口腔癌、頭および首の癌、子宮頸部前癌病変、子宮頸部過形成であることを特徴とする請求項１４に記載の使用方法。