ES2848064T3 - Vacuna terapéutica potenciadora de inmunidad para VPH y enfermedades relacionadas - Google Patents
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Abstract
Un antígeno de fusión de cinco genes de virus de papiloma humano (VPH) y un factor inmunopotenciador que comprende proteínas E6 y E7 de VPH tipo 16, proteínas E6 y E7 de VPH Tipo 18 y una proteína de choque térmico de Mycobacterium tuberculosis, comprendiendo el antígeno de fusión una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2.
Description
DESCRIPCIÓN
Vacuna terapéutica potenciadora de inmunidad para VPH y enfermedades relacionadas
La presente invención se refiere al campo de las vacunas y, en particular, a una vacuna terapéutica para infecciones persistentes por el virus del papiloma humano (VPH) y cáncer cervical y otras lesiones inducidas por ellos, más concretamente a una vacuna terapéutica para el VPH que comprende un potenciador inmune.
ESTADO DE LA TÉCNICA
El cáncer cervical es el segundo cáncer con mayor incidencia en mujeres en todo el mundo, y aproximadamente 274.000 pacientes mueren por esta enfermedad cada año. Todos los cánceres cervicales se pueden detectar con infecciones por VPH. Además, los cánceres anal, vaginal, de pene, algunos cánceres orales y laríngeos también están asociados con infecciones por VPH. Aunque hasta ahora se han comercializado dos vacunas preventivas, son ineficaces para tratar las infecciones por VPH existentes, y mucho menos para prevenir la progresión de la malignidad de las lesiones. Y se estima que ya existe una población muy grande de pacientes infectados con VPH. Como resultado, una vacunación preventiva a gran escala puede requerir al menos 20 años para lograr una incidencia del cáncer cervical sustancialmente menor. En vista de la gran población infectada con los virus, que incluso puede haber desarrollado un cáncer cervical o una lesión precancerosa, existe una necesidad urgente de desarrollar una vacuna terapéutica con el fin de limpiar las células y las células cancerosas que han sido infectadas. Las proteínas E6 y E7 del VPH son oncoproteínas codificadas por dos oncogenes transportados por los virus VPH, pertenecen a antígenos proteicos exógenos no autólogos y persisten con una expresión estable desde en lesiones precancerosas hasta en la aparición de cánceres cervicales, por lo que son dianas ideales para la inmunoterapia. Numerosos estudios clínicos han intentado enfocarse en estas dos oncoproteínas, incluyendo estudios de virus recombinantes, polipéptidos, proteínas y vacunas de ADN. Estas vacunas terapéuticas exhiben una excelente seguridad y muestran lesiones degradadas y supervivencia prolongada en algunos de los pacientes. Además, los estudios indican que el grado de inmunidad de las células T inducido por la vacunación puede estar asociado con el efecto terapéutico del tratamiento. Sin embargo, con el fin de curar por completo las infecciones persistentes y eliminar el cáncer, todavía existe la necesidad de una nueva estrategia para inducir una respuesta inmune suficiente de las células T antitumorales a un antígeno específico, aunque ya existe una perspectiva en algunos de los estudios clínicos.
La proteína de choque térmico (HSP) puede ser eficaz para regular la función celular y mejorar las respuestas inmunitarias. En primer lugar, puede funcionar como "chaperona" para ayudar al transporte y posicionamiento proteico y al plegamiento de proteínas; en segundo lugar, puede activar células presentadoras de antígeno apropiadas (APC). HSP70 es capaz de unirse a un receptor en un macrófago, induciendo así una respuesta inmune del mismo de forma eficaz. SGN-00101 es una proteína de fusión fusionada con una proteína E7 del VPH tipo 16 y HSP65 de Mycobacterium tuberculosis, que ha demostrado ser segura y cierto efecto sobre la inhibición de la proliferación altamente atípica en células epiteliales cervicales.
El factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) ha sido ampliamente estudiado y es reconocido como uno de los agentes terapéuticos más eficaces. Puede mediar las células asesinas naturales y activar los linfocitos T asesinos CD8+ específicos de tumores a través de las células presentadoras de antígenos para producir un efecto antitumoral. Se ha demostrado en muchos ensayos clínicos y en animales su capacidad para estimular eficazmente la respuesta inmunitaria supresora de tumores durante un largo período de tiempo. Por ejemplo, Sipuleucel-T, como fármaco inmunoterapéutico, es el único que aprovecha la activación de las células presentadoras de antígenos con un GM-CSF y ahora ha sido aprobado para su comercialización por la U.S. Food and Drug Administration. El último estudio clínico de Jennerex et al. también demuestra que la vacuna oncolítica con una expresión de GM-CSF permite la reducción de diversas lesiones cancerosas. Sin embargo, todos estos métodos inmunopotenciadores tienen un efecto terapéutico insatisfactorio de su escasa especificidad para el antígeno tumoral o de insuficiente estimulación inmunitaria.
La CN 102002 105 A describe una proteína de fusión VPH16E6E7 expresada por un vector adenovirus. La RU 2229 307 C1 describe proteínas de fusión de E7 (de VPH16 o 18) con Hsp70.
Para resolver el efecto terapéutico insatisfactorio de los métodos inmunopotenciadores de la técnica anterior, de escasa especificidad para el antígeno tumoral o con una estimulación inmune insuficiente, la presente invención proporciona una vacuna terapéutica inmunopotenciadora para una infección por VPH y enfermedades relacionadas.
En primer lugar, de acuerdo con la reivindicación 1, la presente invención proporciona un antígeno de fusión que comprende las proteínas E6 y E7 del VPH de tipo 16, las proteínas E6 y E7 del VPH de tipo 18 y una proteína adyuvante como factor inmunopotenciador, donde el antígeno de fusión comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2.
La presente invención adopta una forma de disposición lineal de antígenos multivalentes, por lo que no tiene ningún efecto sobre los epítopos de las células T de la proteína de fusión. Las respuestas inmunitarias de las células T juegan un papel central en una vacunación terapéutica. Un determinante antigénico de células T se puede degradar en péptidos cortos lineales durante la presentación del antígeno, y un sitio de reconocimiento tiene típicamente sólo alrededor de 8 aminoácidos. Por tanto, las variaciones de orden en la disposición de los antígenos tampoco tendrán un efecto sustancial en la inmunoestimulación. En la presente invención, los inventores fusionan 4 proteínas antigénicas del VPH de los tipos 16 y 18 con una molécula de una proteína de choque térmico, pudiendo ser más ventajosa la fusión de más antígenos del VPH para proporcionar más determinantes antigénicos potenciales, mejorar la presentación del antígeno, aumentar la respuesta inmune y ser funcional para más infecciones por VPH con diferentes genotipos, con el fin de aumentar efectivamente la población que potencialmente se beneficia de la inmunización con la vacuna; además, las proteínas más grandes se pueden degradar y presentar más fácilmente con el fin de estimular respuestas inmunes más fuertes.
En la presente invención, dicho antígeno de fusión tiene uno o más sitios de mutación que incluyen sitios de mutación en la proteína E6 del VPH tipo 16 en la posición 121, reemplazándose el ácido glutámico por glicina, y en la posición 122, donde la lisina se reemplaza por glicina; sitios de mutación en la proteína E7 del VPH tipo 16 en la posición 24, donde la cisteína se reemplaza por glicina, y en la posición 26, donde el ácido glutámico se reemplaza por glicina; sitios de mutación en la proteína E6 del VPH Tipo 18 en la posición 116, reemplazándose el ácido glutámico por glicina, y en la posición 117, donde la lisina se reemplaza por glicina; y sitios de mutación en la proteína E7 del VPH tipo 18 en la posición 27, reemplazándose la cisteína por glicina, y en la posición 29, donde el ácido glutámico es reemplazado por glicina.
En la presente descripción, la mutación puntual de un aminoácido se puede realizar en una región de la proteína E6 del VPH destinada a unirse a la proteína p53 de una célula y en una región de la proteína E7 destinada a unirse a la proteína pRb de una célula. Una proteína mutada no se unirá específicamente a ninguna de las dos proteínas anteriores, por lo que se elimina el posible riesgo de que las proteínas E6 y E7 del VPH puedan potencialmente transformar las células normales. Cabe señalar que la mutación puntual se puede realizar sólo en varias posiciones clave y, por tanto, no tendrá efecto alguno en la antigenicidad de la proteína.
En la presente invención, la proteína adyuvante de un factor inmunopotenciador es una proteína de choque térmico de Mycobacterium tuberculosis, tal como está comprendida en la SEQ ID NO: 2.
También se describe que el antígeno de fusión de 5 genes de los VPH y un factor inmunopotenciador tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1.
Además, de acuerdo con la reivindicación 2, la presente invención proporciona un vector de expresión recombinante que expresa el antígeno de fusión.
En una realización de la presente invención, el vector también puede portar un casete de expresión de un inmunoestimulante.
Preferentemente, el inmunoestimulante puede ser un factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), una interleucina, un interferón o una quimiocina, preferentemente un factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF).
En una realización particular de la presente invención, el vector de expresión puede portar un fragmento de ADN con la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 3.
En la presente invención, el vector puede ser un vector adenoviral recombinante, un vector viral recombinante adenoasociado, un vector retroviral recombinante, un vector lentiviral recombinante, un vector viral recombinante Herpes, un vector recombinante Vaccinia o un vector viral recombinante Sandai; y también puede ser un vector no viral seleccionado del grupo consistente en un vector de ADN desnudo, una nanopartícula, un polímero o un liposoma.
Además, la presente invención también proporciona una formulación farmacéutica para tratar una enfermedad inducida por la infección por VPH según la reivindicación 9, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del antígeno de fusión descrito o una cantidad terapéuticamente eficaz del vector de expresión génica recombinante tal como se describe.
En una realización preferente, la formulación farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del antígeno de fusión y un inmunoestimulante.
En la formulación farmacéutica, el inmunoestimulante puede ser un factor de estimulación de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF), una interleucina, un interferón o una quimiocina, preferentemente un factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF).
En una realización particular de la presente invención, la formulación farmacéutica tiene como objetivo expresar un tal antígeno de fusión tal como el reivindicado y un inmunoestimulante que es un factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF).
En otra realización particular de la presente invención, la formulación farmacéutica puede comprender además un vehículo, excipiente, auxiliar y/o similar farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto particular de la presente descripción, la formulación farmacéutica puede inyectarse directamente en un paciente como una vacuna mediante una única inyección o con una o más inyecciones potenciadoras del sistema inmunológico para lograr los efectos de estimulación y potenciación inmunes. Alternativamente, la formulación farmacéutica puede emplearse indirectamente como un antígeno para el procesamiento in vitro y la incubación de células autólogas de un paciente o de células de un donante, incluyendo linfocitos, células dendríticas, células tumorales, células sanguíneas del cordón umbilical o similares, donde las células pueden además inyectarse al paciente mediante una o más inyecciones, para lograr efectos de estimulación y mejora inmunes.
Además, la presente invención proporciona un adenovirus recombinante que porta el vector de expresión génica recombinante como se describe.
El adenovirus recombinante permite la expresión de E6 y E7 de los VPH tipo 16 y 18 y un factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF).
Preferentemente, el adenovirus recombinante expresa las proteínas E6, E7 del VPH tipo 16 y 18, una proteína de choque térmico de Mycobacterium tuberculosis y un factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF).
En el adenovirus recombinante, las proteínas E6 y E7 del VPH de los tipos 16 y 18 están fusionadas con la proteína de choque térmico de Mycobacterium tuberculosis para producir una proteína de fusión multivalente, y un casete de expresión de la proteína de fusión puede ser co-expresado con un casete de expresión de un GM-CSF en el mismo vector.
También se describe que, en el adenovirus recombinante, las proteínas E6 y E7 del VPH de los tipos 16 y 18 pueden conformarse en una proteína de fusión multivalente, la cual puede no estar fusionada con la proteína de choque térmico, y un casete de expresión de la proteína de fusión puede ser co-expresado con un casete de expresión de un GM-CSF en el mismo vector.
Además, la presente invención proporciona el antígeno de fusión, el vector recombinante, el adenovirus o la formulación farmacéutica para su uso en el tratamiento de enfermedades inducidas por la infección por VPH.
Las enfermedades inducidas por la infección por VPH pertenecen a las enfermedades asociadas a la infección crónica con VPH, en particular cáncer cervical, cáncer de pene, cáncer anal, cáncer de laringe, cáncer oral, cáncer de cabeza y cuello, una lesión precancerosa cervical y/o una hiperplasia cervical.
Los experimentos de activación de linfocitos T in vitro demuestran que tanto un vector que expresa una proteína de fusión de antígenos de VPH con HSP como un vector que co-expresa antígenos de VPH y g M-CSF pueden inducir una respuesta inmune de las células T más fuerte que un vector que expresa por separado los antígenos de VPH, y que un vector que expresa tanto la proteína de fusión de antígenos de VPH con HSP como GM-CSF puede proporcionar la respuesta inmune de las células T inducida más fuerte. Además, la expresión de GM-CSF permite una mejora significativa del nivel de inmunidad de las células T en cada uno de los grupos de dosis alta y baja y una inducción de más células T que infiltran el tumor. En los experimentos de tratamiento de tumores en los que los antígenos de VPH se expresan en ratones, los resultados de evaluar la incidencia tumoral y el tamaño del tumor en los ratones de cada uno de los grupos demuestran que el vector con la fusión HSP y el vector que expresa GM-CSF permiten un mejor aclaramiento del tumor y de la recurrencia de la inhibición y que el vector que expresa tanto la proteína de fusión de antígenos de VPH con HSP como GM-CSF puede exhibir los efectos más fuertes, lo que es consistente con los resultados de los experimentos in vitro. Así, la presente invención da a conocer por primera vez un efecto sinérgico de inmunoestimulación de una proteína de fusión HSP con un GM-CSF y proporciona un nuevo método para potenciar el efecto de una vacuna en el tratamiento de un cáncer cervical.
De acuerdo con los resultados experimentales previos en ratones, se asume que, con el mismo mecanismo, esta vacuna también puede inducir en humanos una respuesta inmune específica a los antígenos expresados por los virus VPH, de forma que se activa y potencia un fuerte efecto letal de las células inmunes específicas, tal como las células T, en las células infectadas con VPH y de cáncer cervical. En vista de que dicha vacuna inducirá respuestas inmunitarias específicas para dos oncoproteínas clave de los virus VPH, es decir, E6 y E7, que son dos proteínas antigénicas del cáncer que se expresan a largo plazo y son capaces de inducir la proliferación crónica de células infectadas para finalmente resultar en el desarrollo de un cáncer, la vacuna puede utilizarse para tratar un cáncer
cervical, una lesión precancerosa cervical y la hiperplasia cervical inducida por una infección crónica por VPH y otros cánceres inducidos por una infección crónica por VpH, tales como un cáncer de laringe y un cáncer oral, etc.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: es la construcción e identificación de un adenovirus recombinante donde “a” muestra patrones estructurales de 5 ADNc de los correspondientes adenovirus recombinantes preparados usando un sistema Ad-easy; “b” muestra las expresiones de los vectores adenovirales recombinantes en células HEK 293 medidas por transferencia Western, donde las células HEK293 se infectan con los adenovirus y se mide la expresión de genes exógenos usando un anticuerpo anti-VPH16E7 con Ad-GFP como control negativo; “c” muestra la expresión de GM-CSF a partir del adenovirus recombinante correspondiente en células HEK 293 según se mide con Western blot; y “d” muestra una expresión significativamente aumentada de la proteína de fusión VPH18/16E6E7-HSP por el adenovirus recombinante Ad-E6E7hsp-GM como resultado de la optimización por codón en comparación con aquella sin optimización por codón.
Figura 2: muestra el experimento de proliferación de linfocitos T, particularmente las veces que aumentan las de células del bazo de los ratones inmunizados con los correspondientes adenovirus recombinantes bajo la estimulación con el polipéptido E7, representando la coordenada longitudinal el aumento relativo, es decir, la proporción entre el valor de OD de las células del bazo estimuladas con el polipéptido E7 y el valor OD de las células del bazo no estimuladas con el polipéptido E7, n = 3; barras, SE; el símbolo “*” representa p <0,05.
Figura 3: muestra un experimento EISPOT, donde A muestra la cantidad de células del bazo secretoras de IFNy en los ratones inmunizados con el adenovirus recombinante correspondiente bajo la estimulación con el polipéptido E6; y B muestra la cantidad de células de bazo secretoras de IFNy en los ratones inmunizados con el adenovirus recombinante correspondiente bajo la estimulación con el polipéptido E7, representando la coordenada longitudinal la cantidad de células formadoras de manchas por 106 células de bazo, n = 3; barras, SE; el símbolo “*” representa p <0,05.
Figura 4: muestra linfocitos T infiltrantes de tumor. La inmunización con adenovirus recombinantes puede aumentar la cantidad de células T CD8 y CD4 que se infiltran en el tumor. La coordenada longitudinal indica el recuento de linfocitos T CD4 o CD8 en cada una de las vistas como promedio de los recuentos de las cuatro vistas. Barras, SE; el símbolo "*" representa p <0,05, en comparación con el control Ad-GFP.
Figura 5: muestra el experimento de dosis de vectores adenovirales recombinantes. Los ratones se inmunizan con 3 dosis de los correspondientes adenovirus recombinantes, respectivamente, para el experimento ELISPOT y se compara la cantidad de células del bazo secretoras de IFNy, n = 3; barras, SE.
REALIZACIÓN ESPECÍFICA
Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de ilustrar la presente invención.
Ejemplo 1. Construcción de plásmidos y empaquetamiento de virus
Con los genes de E6 (número de acceso de Genbank: AF373109) y E7 (AF373110) del VPH tipo 18, E6 (AB818691) y E7 (KC736931) del VPH tipo 16 y HSP (EU747334) de Mycobacterium tuberculosis como plantilla, se optimizaron codones para la expresión en humanos y se empalmaron sucesivamente en un marco de lectura abierto de un gen de fusión sin los codones de terminación intermedios. La secuencia completa fue sintetizada mediante Genescript Corporation. Para eliminar el riesgo de transformación celular maligna debido a E6 y E7, se realizó una mutación puntual en algunas posiciones esenciales de las proteínas E6 y E7 del VPH 18 y 16: proteína de VPH 18 E6 (Glu116Gly; Lys117Gly); Proteína E6 de VPH 16 (Glu121Gly; Lys122Gly); Proteína E7 de VPH 18 (Cys27Gly; Glu29Gly); Proteína de VPH 16 E7 (Cys24Gly; Glu26Gly). VPH18&16/E6/E7 tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO:1 y VPH18&16/E6/E7HSP tiene una secuencia de aminoácidos representada por la s Eq ID NO: 2 y una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO:3. Se obtuvo el ADNc de un gen de GM-CSF derivado de seres humanos mediante amplificación por RT-PCR (SEQ ID NO: 4).
Se utilizó el sistema de empaquetamiento de adenovirus Ad-Easy (adquirido de Agilent Technologies, SantaClara, CA) para producir 5 adenovirus recombinantes. Primero, se construyeron 5 plásmidos pshuttle con diferentes genes insertados y un promotor de CMV: (1) pshuttle-E6E7, para expresar una proteína de fusión de VPH16 E6 y E7; (2) pshuttle-E6E7hsp, para expresar una proteína de fusión de VPH16 E6 y E7 con hsp; (3) pshuttle-E6E7-GM, para coexpresar GM-CSF derivado de seres humanos en base a (1); (4) pshuttle-E6E7hsp-GM, para coexpresar la proteína de fusión VPH18/16E6 y E7 con hsp y GM-CSF de origen humano; y (5) pshuttle-GFP, para expresar eGFP, como control (figura 1a). Luego, con un método convencional, los 5 adenovirus recombinantes se empaquetaron en Ad-E6E7, Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7-GM, Ad-E6E7hsp-GM y Ad-GFP, respectivamente.
Ejemplo 2. Medida de la expresión de las proteínas exógenas recombinantes
Se infectaron células 293 de riñón embrionario humano (HEK293), adquiridas a American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md.), con los adenovirus recombinantes empaquetados preparados en el Ejemplo 1, con un título de infección de 2 unidades formadoras de placas (ufp)/célula y se lavó con PBS dos veces 2 días después de la infección; luego se lisaron las células con un tampón de lisis de Laemmli y se hirvieron las proteínas celulares totales durante 5 minutos para su desnaturalización, seguida de electroforesis en SDS; entonces, las proteínas se electrotransformaron en una membrana de acetato de celulosa y se midieron con los anticuerpos correspondientes: un anticuerpo anti-proteína E7 anti-VPH16 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) y un anticuerpo anti-GM-CSF (Biolegend, San Diego, Calif.). Para el desarrollo del color, se utilizó un sistema de quimioluminiscencia mejorada (ECL). Se usó un kit de ensayo ELISA (Biolegend, San Diego, CA) para GM-CSF para medir la concentración de GM-CSF en ratones.
Los 5 adenovirus recombinantes se prepararon de acuerdo con un método estándar y se purificaron mediante dos ciclos de ultracentrifugación. Mediante Western-Blot, las 293 células infectadas con virus recombinantes fueron detectadas para la expresión de genes exógenos. Como resultado, se observa la detección de una banda de expresión en la posición de la banda de un peso molecular esperado, pero no se observó nada en la posición correspondiente para una muestra de control negativo con infección por Ad-GFP (Figuras 1b, c). Los resultados indican que la proteína de fusión asociada a los antígenos de VPH y GM-CSF se expresaban con una alta eficiencia. Los resultados del ensayo ELISA muestran que, para la concentración sérica de GM-CSF en ratones, los grupos de ensayo fueron más altos que el grupo de control en aproximadamente 7 veces 5 días después de la inyección, y todavía en aproximadamente 1,5 veces 2 meses después de la inyección.
La eficiencia de la expresión de los antígenos del VPH mejoró significativamente después de la optimización porcodón y su expresión se incrementó en más de 3 veces que antes de la optimización (Figura 1d).
Ejemplo 3. Proliferación de linfocitos in vitro y ELISPOT
Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 (H-2b; 6-8 semanas de edad) a Jackson Lab (BarHarbor, Me.), y fueron inyectados subcutáneamente con los virus Ad-E6E7, Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7-GM, Ad-E6E7hsp-GM y Ad-GFP a una dosis de 107 ufp/ratón. Después de 4 semanas, las células del bazo (1x105/pocillo) de los ratones se sometieron a aislamiento y cultivo, y las células del bazo de cada uno de los ratones se incubaron con o sin 10 pg/ml de un polipéptido E7 durante 5 días. Se añadió BrdU el día 4. La cantidad de BrdU fusionada en las células se midió usando un kit de proliferación de células Calbiochem (Millipore, Billerica, MA). Los resultados de la medida se expresaron como veces de aumento relativo, que se calcularon dividiendo la OD leída en el caso del polipéptido E7 entre la OD leída en el caso sin polipéptido E7.
Se realizaron experimentos ELISPOT para contar los linfocitos T secretores de interferón IFNy específicos de los polipéptidos E6 y E7 y se evaluaron las respuestas inmunitarias de las células T. Inicialmente, se inocularon ratones hembra C57BL/6 con virus recombinantes como anteriormente para la inmunización. Después de 2-4 semanas, las células del bazo de los ratones se sometieron a aislamiento y cultivo en una placa de 96 pocillos recubierta con anticuerpo anti-IFNY, a 1x105 células/pocillo. Para el cultivo, las células de cada uno de los ratones se dividieron en un grupo estimulante del polipéptido E6 y un grupo estimulante del polipéptido E7 y se estimularon con 2 pg de un polipéptido E648-57 (EVYd Fa Fr Dl , restringido a H-2Db) y un polipéptido E749-57. (RAHYNIVTF, restringido a H-2Db) respectivamente, las células no estimuladas con polipéptido sirvieron como control negativo. Después de 24 h de incubación a 37 °C, las células se descartaron, los residuos del pocillo se lavaron 3 veces con Tween 20 al 0,5% en PBS (PBST) y luego se volvieron a incubar con un anticuerpo anti-IFNY marcado con enzima, y finalmente sometido a desarrollo de sustrato ACE. Después de la terminación del desarrollo y secado, los puntos sensibles a IFNy se contaron mediante un contador ELISPOT y se analizaron.
La respuesta inmune de células T específicas de antígeno se puede determinar in vitro a partir de los resultados de los experimentos de proliferación de células T y ELISPOT. En el experimento de proliferación de células T, la cantidad relativa de células el día 5 puede expresarse como el contenido de BrdU incorporado en los ADN celulares. Bajo la estimulación con el polipéptido específico E7, todas las células del bazo de los ratones inoculados con los virus recombinantes que expresan antígenos de VPH aumentaron mucho más que las células del bazo de los ratones de control negativo inmunizados con Ad-GFP (Figura 2). Las células de bazo murinas inmunizadas con los virus recombinantes Ad-E6E7hsp y Ad-E6E7-GM, respectivamente, tuvieron un incremento varias veces mayor que las inoculadas con Ad-E67 y los ratones inmunizados con Ad-E6E7hsp-GM mostraron el mayor incremento. El grado de respuesta inmune de las células T asesinas específicas de antígeno se puede ver en los resultados de los experimentos ELISPOT. Los resultados indican que, bajo la estimulación con el polipéptido E6, todos los ratones inmunizados con los virus recombinantes que expresan los antígenos de VPH habían adquirido una respuesta inmune de células T asesinas específicas para los antígenos. En particular, los ratones inmunizados con cada uno de Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7-GM y Ad-E6E7hsp-GM tenían células del bazo secretoras de IFNy mucho más que los ratones inoculados con Ad-E6E7, y los ratones inmunizados con Ad-E6E7hsp-GM tenían la mayor cantidad de células del
bazo secretoras de IFNy (Figura 3A). Bajo la estimulación con el polipéptido E7, las células del bazo secretoras de IFNy tenían una distribución relativa similar a la de la estimulación con el polipéptido E6, excepto que la cantidad absoluta en cada uno de los grupos era mucho mayor que bajo la estimulación con el polipéptido E6. Se indica que el polipéptido E7 también puede inducir una respuesta inmune de las células T asesinas en ratones mucho más fuerte que la estimulada con el polipéptido E6 (Figura 3B). En resumen, los resultados de los experimentos de proliferación de células T y ELISPOT demuestran de forma consistente que HSP y GM-CSF pueden mejorar por separado o sinérgicamente la respuesta inmune de los linfocitos T específica para los antígenos E6, E7.
Ejemplo 4. Análisis de linfocitos T que infiltrantes en tumor
Se inocularon ratones C57BL/6 con células TC-1 (células tumorales de ratones C57BL/6 transformadas con los oncoantígenos E6 y E7 del VPH tipo 16, líneas celulares del modelo de cáncer cervical más comunes, donada por el profesor T.C. Wu, Universidad Johns Hopkins). Las células TC-1 de ratones C57BL/6 se cultivaron en un medio completo RPMI1640 que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10% y 50 U/ml de dos antibióticos, y se cultivaron otras células en un medio completo DMEM (Gibco). Una vez que los tumores subcutáneos crecieron hasta un diámetro de aproximadamente 5 mm, los ratones se inocularon vía subcutánea con 1*107 adenovirus recombinantes Ad-E6E7, Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7-GM, Ad-E6E7hsp-GM y Ad-GFP, respectivamente. Después de 7 días, los tumores se recogieron y se sometieron a tinción H&E y a análisis de inmunofluorescencia para células anti-CD4+ y CD8+, que se realizaron en un procedimiento como sigue: extracción de tejidos tumorales y congelación, inclusión de OCT y corte en secciones de 5,0 pm de espesor, seguido de inmovilización con acetona al 4% y luego bloqueo de 30 minutos con suero de caballo al 10%. Posteriormente, las secciones se incubaron con anticuerpos anti-CD4 y CD8 de ratón (BD Bioscience, San Jose, CA) a temperatura ambiente durante 1 hora y, tras ser lavados con PBS, se incubaron con 2 mg/ml de un segundo anticuerpo de cabra anti-rata Alexa647 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Posteriormente, se sometieron a tinción nuclear con DAPI y a análisis microscópico. Las células positivas se contaron en 4 vistas y se designaron como valor medio ± error estándar para el análisis estadístico.
Cuando los ratones portadores de tumores presentaban tumores desarrollados hasta un diámetro de aproximadamente 5 mm, los ratones se sometieron a inmunoterapia con diferentes adenovirus recombinantes. Después de 7 días, se extrajeron los tumores para análisis histológico, para evaluar el grado de infiltración de linfocitos T en los tumores de los ratones inmunizados con los diferentes virus. Los resultados de la tinción de células CD8+ indican que los ratones que recibieron los virus recombinantes que expresan antígenos de VPH tenían más infiltración de linfocitos T CD8+ en los tejidos tumorales que los ratones de control negativo, que recibieron inmunización con Ad-GFP (Figura 4); y los dos vectores en los que una proteína de fusión fusionada con HSP y un GM-CSF se expresaban o coexpresaban por separado fueron capaces de mejorar significativamente la infiltración de linfocitos T CD8+ en ratones portadores de tumores (Fig. 4). Los resultados de la tinción de células CD4+ mostraron que los ratones que recibieron inmunización con los adenovirus recombinantes que expresan GM-CSF en ellos tenían una cantidad significativamente mayor de infiltración de linfocitos T CD4+ en los tejidos tumorales; sin embargo, los ratones que recibieron la expresión de una proteína de fusión HSP no tenían una cantidad significativamente mayor de linfocitos T que expresaban CD4+ en los tejidos tumorales en comparación con los ratones inmunizados con Ad-E6E7 y Ad-GFP, aunque HSP permitió un aumento significativo de la infiltración de linfocitos T CD8+ (Figura 4).
Ejemplo 5. Dosis inmunizante de adenovirus recombinante
Se utilizaron tres dosis de 2x105, 1x106y 1x107 ufp/ratón para inmunizar a los ratones con Ad-E6E7, Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7-GM, Ad-E6E7hsp-GM y Ad-GFP, respectivamente. Los ratones se sacrificaron cuatro semanas después de la inmunización, se recogieron células de bazo para los experimentos ELISPOT. Se leyeron y analizaron las manchas de respuesta a IFNy de las células del bazo de los ratones inmunizados con cada uno de los diversos adenovirus recombinantes a cada una de las diferentes dosis y se analizaron para evaluar el grado de inmunidad de células T inducidas por las diferentes dosis.
Con el fin de evaluar la capacidad de los diferentes virus recombinantes de inducir la respuesta inmune de las células T a diferentes dosis, los inventores llevaron a cabo experimentos de dosis. En la condición de dosis bajas de 2*105 y 1^10® ufp/ratón, de acuerdo con la cantidad de células secretoras de IFNy medida, los virus recombinantes Ad-E6E7-GM y Ad-E6E7hsp-GM indujeron una respuesta inmune de células T más fuerte que los otros virus y Ad-E6E7hsp-GM indujo la respuesta inmune de células T más fuerte. En la condición de una dosis alta de 1x107 ufp/ratón, todos los virus recombinantes que expresan antígenos de VPH fueron capaces de inducir respuestas inmunes de forma efectiva. Curiosamente, los ratones inmunizados con el virus recombinante Ad-E6E7hsp dieron lugar a una mayor cantidad de células del bazo secretoras de IFNy que la de los ratones inmunizados con Ad-E6E7-GM y el grupo de inmunización Ad-E6E7hsp-GM todavía tenía la mayor cantidad de células de bazo secretoras de IFNy (Figura 5). Los resultados indican que la expresión de GM-CSF puede mejorar eficazmente la respuesta inmune de las células T en grupos de dosis bajas, mientras que la proteína de fusión de HSP puede dar un mejor resultado a dosis altas y la coexpresión de ambas permite un efecto sinérgico.
El GM-CSF puede aumentar la respuesta inmune de los linfocitos T asesinos a dosis relativamente bajas, de modo que se puede usar una dosis más baja para producir un mejor resultado de inmunización, reduciéndose los posibles efectos secundarios.
Ejemplo 6. Tratamiento de tumores in vivo en ratones
Este experimento es muy importante para evaluar los efectos terapéuticos de los adenovirus recombinantes. Primero, se inocularon ratones vía subcutánea con 1x105 células TC-1/ratón; una vez formadas masas tumorales, palpables subcutáneamente, en los ratones después de aproximadamente 9 días, se inyectaron vía subcutánea Ad-E6E7, Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7-GM, Ad-E6E7hsp-GM y Ad-GFP, a dosis de 1*10® y 1*107 ufp/ratón, respectivamente. La inmunización se potenció con la misma dosis 2 semanas después del tratamiento inicial. 2 meses después del tratamiento inicial, se extrajeron todos los tumores de los ratones y se inocularon de nuevo los ratones con las mismas células TC-1. Se observó la presencia de tumores en los ratones cada 3 días durante 4 meses. Se comparó la incidencia y el tamaño del tumor entre los ratones inoculados con diferentes virus recombinantes para determinar el tratamiento y los efectos del aclaramiento tumoral de diferentes adenovirus recombinantes.
Los resultados de los experimentos del tratamiento de tumores anterior indican que los diferentes virus recombinantes pueden tener diferentes capacidades de eliminación de células tumorales in vivo. Según los resultados de los primeros ensayos de dosis, se utilizaron dos dosis de 1x10® y 1x107 ufp/ratón para los experimentos de tratamiento. En el caso de una dosis de 1x10® ufp/ratón, los 5 ratones del grupo de control tratados con Ad-GFP desarrollaron tumores. Solo 2 de 10 ratones tratados con Ad-E6E7, 6 de 10 ratones tratados con Ad-E6E7hsp, 5 de 10 ratones tratados con Ad-E6E7-GM y 7 de 10 ratones tratados con Ad-E6E7hsp-GM no presentaban tumores 2 meses después del tratamiento. Los resultados muestran que este último tuvo el mejor efecto terapéutico. Además, en el caso de una dosis de 1*107 ufp/ratón después de 2 meses, los 5 ratones del grupo de control tratados con Ad-GFP desarrollaron tumores, pero 4 de 5 ratones tratados con Ad-E6E7 portaban tumores y todos los ratones tratados con Ad-E6E7hsp, Ad-E6E7-GM y Ad-E6E7hsp-GM no tenían tumores (Tabla 1). Además, durante el mismo período de tiempo, los ratones portadores de tumores tratados con Ad-E6E7hsp tenían un tamaño de tumor menor que el de los ratones tratados con Ad-E6E7 (no mostrado). 2 meses después del tratamiento inicial, todos los ratones sin tumores se volvieron a inocular con células tumorales TC-1. Hasta el final del experimento de seis meses, todos los ratones que fueron re-inoculados con tumores seguían sin presentar tumores. En resumen, los resultados muestran que HSP y GM-CSF pueden funcionar por separado o sinérgicamente para lograr el efecto de mejorar la respuesta inmune de las células T específicas de VPH y, a su vez, eliminar los tumores en ratones y prevenir la recurrencia. Los resultados indican que una combinación de HSP con GM-CSF permite el mejor efecto terapéutico sinérgico.
T l 1 P r n r n in m r n l x rim n r mi n m r
Lo descrito anteriormente son simplemente realizaciones preferentes de la presente invención.
APLICACIÓN INDUSTRIAL
Las vacunas de la invención son eficaces para mejorar las respuestas inmunitarias y eliminar tumores y son útiles para tratar el cáncer cervical, lesiones precancerosas cervicales, hiperplasia cervical y otros cánceres tales como algunos cánceres de laringe, orales y anales, etc. inducidos por infección crónica por VPH.
Claims (13)
1. Un antígeno de fusión de cinco genes de virus de papiloma humano (VPH) y un factor inmunopotenciador que comprende proteínas E6 y E7 de VPH tipo 16, proteínas E6 y E7 de VPH Tipo 18 y una proteína de choque térmico de Mycobacterium tuberculosis, comprendiendo el antígeno de fusión una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2.
2. Vector de expresión recombinante que expresa el antígeno de fusión según la reivindicación 1.
3. Vector de expresión recombinante según la reivindicación 2, caracterizado porque porta un casete de expresion para expresar el antígeno de fusión según la reivindicación 1 y un casete de expresion para expresar un inmunoestimulante.
4. Vector de expresión recombinante según la reivindicación 2, caracterizado porque el inmunoestimulante es un factor estimulador de crecimiento de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), una interleucina, un interferón o una quimiocina, preferentemente un factor estimulador de crecimiento de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF).
5. Vector de expresión recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, caracterizado porque porta un fragmento de ADN con una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 3.
6. Vector de expresión recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, caracterizado porque es un vector adenoviral recombinante, un vector viral recombinante adeno-asociado, un vector retroviral recombinante, un vector lentiviral recombinante, un vector viral recombinante de Herpes, un vector recombinante de Vaccinia o un vector viral recombinante de Sendai.
7. Vector de expresión recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, caracterizado porque es un vector no viral seleccionado del grupo consistente en un vector de ADN desnudo, una nanopartícula, un polímero o un liposoma.
8. Formulación farmacéutica para tratar una enfermedad inducida por una infección por VPH que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del antígeno de fusión según la reivindicación 1 o una cantidad terapéuticamente efectiva del vector de expresión recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 2-7.
9. Formulación farmacéutica según la reivindicación 8, caracterizada por comprender comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del antígeno de fusión según la reivindicación 1 y un inmunoestimulante.
10. Formulación farmacéutica según la reivindicación 9, caracterizada porque el inmunoestimulante es un factor estimulador de crecimiento de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), una interleucina, un interferón o una quimiocina, preferentemente un factor estimulador de crecimiento de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF).
11. Adenovirus recombinante caracterizado porque porta el vector de expresión recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 2-7.
12. Antígeno de fusión según la reivindicación 1, vector de expresión recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 2-7, formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 8-10 o adenovirus según la reivindicación 11 para su uso en el tratamiento de una enfermedad inducida por una infección por VPH.
13. Antígeno de fusión, vector de expresión recombinante, formulación farmacéutica or Adenovirus para su uso según la reivindicación 12, caracterizado porque la enfermedad inducida por una infección por VPH pertenece a una una enfermedad asociada con una infección crónica por VPH, preferentemente un cáncer cervial, un cáncer de pene, un cáncer anal, un cáncer laríngeo, un cáncer oral, un cáncer de cabeza y cuello, una lesión precancerosa cervical y/o hiperplasia cervical.
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