CN1900118A - 包含热休克蛋白和hpv16z蛋白抗原的无佐剂治疗性蛋白疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及热休克蛋白与HPV16Z E6/E7的融合蛋白,该融合蛋白的获得方法,表达该融合蛋白的表达载体和转化了该表达质粒的宿主,以及所述融合蛋白在治疗和预防HPV相关疾病的药物中的应用。此融合蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中表达后,通过柱上复性和层析纯化后,纯度大于95%,在无佐剂的情况下在小鼠体内成功诱导了针对E6、E7的特异性细胞免疫反应,对TC-1细胞小鼠移植瘤有显著的治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及热休克蛋白与HPV16Z E6/E7的融合蛋白,该融合蛋白的获得方法,表达该融合蛋白的表达载体和转化了该表达质粒的宿主,以及所述融合蛋白在治疗和预防HPV相关疾病的药物中的应用。
技术背景
HPV与多种上皮来源的肿瘤和增生关系密切,高危型HPV的感染是女性宫颈癌形成的主要原因。在我国妇女宫颈癌组织中HPV感染检出率大于99%,其中HPV16占90%以上。世界范围内每年有40万新发宫颈癌病例,20万人死于该病,位居女性肿瘤死亡人数的第二位。目前宫颈癌的治疗主要是手术和放疗,其治疗5年生存率仅50%左右,效果不理想,另外对宫颈的早期病变的治疗尚缺乏理想的方法。因此研制新的药物用于治疗HPV感染尤其是HPV16型引起的相关疾病具有重要意义。流行病学资料证实,HPV感染有种属地域分布不均匀性,且不同地区的同型HPV往往存在变异,所以疫苗的研究必须要对我国的HPV16具有较高的针对性。张伟教授在80年代末期于HPV高发省份山西省成功克隆了一株HPV16病毒—HPV16Z(中国病毒学,8(1):45-52,1993)。现经测序并与德国HPV16标准株进行比较,证实同源性为98%,E5基因部分和一段非编码序列较大差异,E6基因发现点突变,E7基因完全一致,在此病毒基础上研制的HPV治疗性疫苗对我国的HPV16型感染性疾病将具有较高的针对性和临床应用前景。
人乳头瘤病毒是具有约8000bp的无包膜双链环状DNA病毒,广泛感染生殖道粘膜和口腔、咽部粘膜上皮细胞等,目前已发现100多种型别HPV,其中35个型别与生殖道疾患有关,其基因组由早期基因编码区、晚期基因编码区和非编码区组成。晚期基因区包含2个独立的编码病毒衣壳蛋白L1和L2的开放读码框。L1是主要衣壳蛋白,在不同HPV型别之间高度保守;而早期蛋白包括6个开放读码框,分别形成E1、E2、E4、E5、E6、E7蛋白。蛋白E6、E7为癌基因产物,是HPV感染导致细胞发生转化的主要原因。E6是大小约17KD的多肽,能与P53结合引起P53经泛素化降解,E7是大小约11KD的多肽,能与成视网膜细胞瘤基因产物RB结合,阻碍RB与E2F的复合物的形成,P53和RB的正常功能被抑制是HPV致癌的机理。
由于HPV无法体外培养,难以获得减毒或灭活疫苗,所以目前对于预防HPV感染的疫苗研究只能通过基因工程的方法来获得,研究方向主要是针对病毒晚期蛋白L1或者L1与L2;而通过基因工程的途径获得的抗原必须具有正确的空间表位,在体内获得抗HPV晚期蛋白的抗体,才能有效保护机体。目前已通过真核表达系统获得了构象正确的病毒样颗粒(VLP),试验证明能有效抗HPV的感染。但是这种疫苗对已感染HPV者无治疗作用,所以有效治疗HPV相关疾病的治疗性疫苗的研发具有一定的意义。E6、E7由于其在转化方面的特性被认为是治疗HPV相关肿瘤和癌前病变理想的靶点,所以治疗性疫苗多以E6、E7作为主攻方向。E7免疫原性强,易于表达,在HPV疫苗中常用作抗原部分,而E6没有得到足够重视,且部分疫苗采用野生型E6、E7,其具有潜在致癌性。单纯的E6/E7融合蛋白免疫原性不足以激发细胞免疫反应,需要佐剂的配合,但是目前尚缺乏有效的被批准应用的佐剂。由于上述原因,目前治疗性蛋白疫苗的研究正进入无危险、无佐剂的阶段。
发明内容
本发明涉及应激蛋白与人乳头瘤病毒蛋白抗原的融合蛋白。本发明使用的HPV16为本科室自我国山西宫颈癌高发区分离得到的HPV16常见亚型:HPV16Z,从HPV16Z毒株中克隆出E6和E7基因片段用于构建疫苗,对我国的HPV16将具有较高的针对性。本发明的HPV蛋白抗原优选HPV16Z E6/E7融合蛋白,包括E6C端88个氨基酸和经修饰E7完整片段,E7基因编码第24位的半胱氨酸和第26位的谷氨酸的密码子可采用定点突变的方法进行基因突变,使其丧失导致抑癌基因失活能力,另外在优选的方案中通过将E7 58,91位密码子同时突变,使其编码的氨基酸由半胱氨酸突变成甘氨酸,降低E7蛋白稳定性,免疫呈递效果更佳。本发明的应激蛋白为热休克蛋白,优选牛结核杆菌来源的热休克蛋白65(Hsp65),热休克蛋白在种属间高度同源,健康人有识别自身应激蛋白的T细胞群,所以自身反应性T细胞的存在与正常健康相容,不会导致自身免疫病,这证实人体中应激蛋白的安全性;另外卡介苗(BCG)接种的成功和相对安全性也证实了此应激蛋白的安全。此融合蛋白在无佐剂的情况下在体内成功诱导了针对E6、E7的特异性细胞免疫反应。
本发明涉及融合蛋白的获得方法,融合蛋白最好在大肠杆菌中表达,在一个优选的实施方案中,表达具有5-9个、最好6个组氨酸残基的组氨酸尾的所述蛋白,这在纯化中是有利的。包含了组氨酸尾(His)标志融合蛋白利用金属亲和层析柱纯化(IMAC),可以通过亲和层析复性融合蛋白及达到部分纯化效果。在IMAC柱产生高度纯化的蛋白以后,可以利用离子交换进行第二步纯化,利用简单的二步纯化,可以使目的蛋白的纯度达到95%以上,达到药用标准。
本发明同时也涉及了编码融合蛋白的DNA序列及获得表达该融合蛋白的表达载体和表达宿主的方法。
本发明还涉及到融合蛋白在医学中应用。包含本文所述的应激蛋白和HPV抗原的融合物可用于增强对HPV或表达HPV抗原的HPV感染细胞或HPV转化细胞的免疫应答反应,特别是细胞免疫反应,优选地以所述融合蛋白在治疗和预防HPV感染相关疾病的药物中的应用。
附图说明
图1:SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
图3:经纯化后的蛋白纯度分析
图4:融合蛋白对肿瘤生长的抑制作用
图5:小鼠脾淋巴细胞的特异性杀伤作用
图6:疫苗对TC-1肿瘤的治疗作用
图7:疫苗对荷瘤小鼠生存期的影响
图8:肿瘤大小—时间曲线
具体实施方式
实施例一 Hsp65-E6/E7融合蛋白表达质粒和菌株的构建
1.1 E6/E7融合基因的合成
使用张伟教授自山西克隆的HPV16Z病毒株全基因组序列作为模板,通过PCR的方法得到E6和E7片段,在此基础上设计3对引物对E7的24、26、58、91位密码子进行点突变,同时PCR扩增出E6C端88个氨基酸的密码子,将获得的部分E6片段和突变的E7片段进行融合。
1.2 PET28a-Hsp65的获得
从中国生物制品研究所购得卡介苗2支,用STE悬浮菌体,离心后再次悬浮于400μl 0.05MTris-HCl(PH 8.5)、0.05M EDTA、15%蔗糖中,加入0.4mg溶菌酶,37℃作用30分钟,再加入2%蛋白酶K至终浓度0.1mg/ml,25℃作用10分钟,再加入4mg SDS,60℃作用2小时,离心分离上清,并用酚:氯仿抽提2次,加入RNAase37℃作用2小时,乙醇沉淀,最终溶解在20UL的去离子水中。设计一对引物,正向引物以包含一个Nde1限制性酶切位点,其编码序列为:5’CAGCC ATATGGCCAAGACAAT TGCG TACGAC,反向引物包括EcoR1和Nhe1限制性酶切位点,其编码序列CTCGAATTCTTATCAGCTAGCGAAATCCATGCCACCCATGTCG。利用上述方法获得的基因组DNA为模板,进行PCR扩增,产物经常规纯化并进行Nde1和EcoR1双酶切,再与经Nde1/EcoR1双酶切的PET28a进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5,在含有抗生素的平板上生长。挑取单克隆菌过夜培养,提取质粒测序,将序列和插入位点正确的质粒进行保种,并大量提取。
1.3 Hsp65-E6/E7表达质粒及高效表达工程菌的构建
将上述获得的E6/E7融合基因进行Nhe1和EcoR1双酶切,并与经相同,酶切的PET28a-Hsp65进行连接,连接产物转化大肠杆菌DH5,挑取单克隆过夜培养,提取质粒测序,将序列和插入位点正确的质粒进行保种。并将表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在含有卡那的平板上进行筛选,随即挑选10个单克隆菌株,在含有相应抗生素的培养基中生长至对数期时加入诱导剂IPTG诱导,观察融合蛋白的表达情况。
实施例二 融合蛋白表达产物的鉴定及表达条件的优化
将上述转化了表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)于含有卡那霉素的培养基中37℃生长至OD600为0.6-1.0之间时,取出部分菌液,其余加入IPTG至中浓度为1mmol/L,继续培养37℃3小时,将诱导和未诱导的菌液各取1ml,离心收集菌体,加入上样缓冲液100℃水浴5分钟,离心取上清和直接进行SDS-PAGE电泳,同时也进行蛋白标准BSA的电泳,电泳完毕后,考马斯亮蓝染色2小时以上,再用脱色液进行脱色处理,可用加热的方法加速脱色的过程,通过与BSA比较,有一分子量高于65KD的明显高表达蛋白带,其位置接近目的蛋白80KD,如附图一所示经用抗Hsp65和E7抗体进行Western-Blot分析,该蛋白为目的蛋白。
在验证了目的蛋白的表达以后,将表达菌株于5ml含Kan的LB培养基中,37℃,150转/分震荡4-6小时。重新取5支培养管,每管加含Kan的LB培养基10.5ml,分别加入500μl获得的菌液,继续培养至OD为0.4-1.0,取出1ml作为对照。分别加入20%IPTG 2μl、4μl、6μl、8μl、10μl,分别于3、4、5、6小时各取1ml菌液。分别离心收集菌体,收集菌体,进行SDS-PAGE电泳,结果IPTG浓度在1mM,诱导时间分别为2、3、4、5、6小时,随着诱导时间的延长,蛋白表达量并未增加,而IPTG浓度分别为0.4、0.6、0.8、1、1.2mM时,IPTG在1mM时表达量达到最大值。结果说明最佳诱导条件是IPTG浓度为1mmol/L,诱导时间为2小时,如附图2所示。
实施例三 融合蛋白的发酵表达及纯化
将保存好的表达菌种复苏后,于10ml LB培养基中,37℃,150转/分震荡培养过夜,取5ml接种于500mlLB培养基中,培养24小时。在9.5L TB培养基中进行发酵培养,将PH值调至6.8,300转/分,培养4小时,在此期间保证溶氧在50%以上。加入终浓度1mmol/L的IPTG,诱导3小时,收获菌液,离心收集菌体,按菌体湿重每克三毫升的比例悬浮于裂解缓冲液A中(10mM Tris-Hcl,0.5mM β-巯基乙醇,pH8.0,200ug/ml溶菌酶),保存于-70℃备用。使用时,将冷冻的细菌悬液在室温中解冻,并加2ug/ml蛋白酶抑制剂PMSF,超声破碎细菌,15000rpm离心10分钟,收集沉淀,将沉淀用包涵体洗涤液B(20mM Tris-Hcl pH 8.0,2M尿素)洗涤2次,离心收集沉淀,沉淀最终熔解在溶液C中(20mM Tris-Hcl pH 8.0,8M尿素),室温放置一小时,充分溶解后。离心收集上清,4℃保存。
将上清上样于溶液C平衡的CU2+整合柱,上样后,溶液C洗涤2个柱体积,直至达到基线水平,然后进行蛋白的复性工作,具体为:通过含溶液D(1M NaCl、20mMTris pH 8.0)与溶液C形成尿素逐渐降低的连续梯度,以逐渐降低流经层析柱中的尿素浓度,当溶液C被完全取代后,继续3倍柱体积溶液D洗脱,完全去除残余的尿素,以达到复性的目的。复性程序完成后,利用20-300mM的咪唑进行梯度洗脱目的蛋白。目的蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定后脱盐处理,利用20mM Tris(PH 8.0)平衡脱盐柱,将样品上样(最大不超过柱体积的1/3),3ml/min,收集第一个出现的蛋白峰,进行SOURCE 30Q阴离子洗脱,具体方法为:用50mM Tris(PH8.0)平衡脱盐柱后,样品上样,用50mM Tris(PH8.0)洗涤至基线稳定,利用A液(50mM Tris,PH7.5)与B液:(50mM Tris PH7.5,1M NaCl)形成梯度,结果获得纯化的蛋白,经HPLC分析,纯度高于95%,如附图3所示。
实施例四 疫苗对免疫组和对照组脾淋巴细胞的增殖活性
C57BL/6雌鼠6只分2组,每组3只,分别在颈背部皮下注射200μg/0.2ml Hsp65-E6/E7融合蛋白(疫苗组)和0.2ml缓冲液(缓冲液组)。14天后再次免疫,方法、剂量和部位同第一次免疫,第二次免疫10天后脱颈处死小鼠,70%酒精中浸泡3分钟。在无菌操作台上剪开腹部,取出脾脏,用玻璃注射器芯在200目不锈钢网上轻轻研磨。PBS冲洗不锈钢网,反复3次,制成单细胞悬液备用。取预先放置到室温的淋巴细胞分离液3ml,加入15ml玻璃离心管中,将6~10ml单细胞悬液轻轻加到分离液上,在水平离心机中2000rpm,离心20min,中间的白色界面层即为淋巴细胞。吸取界面层细胞,PBS洗涤细胞2次,计数,重悬于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中,将疫苗组和缓冲液组淋巴细胞各分为4组,分别加入培养液(空白对照)、GST(终浓度为50μg/ml)、Hsp65-E6/E7融合蛋白(终浓度为100μg/ml)和Con A(终浓度为10μg/ml)。用MTT法检测小鼠脾细胞的增殖,每组设3个复孔,每孔加入40万脾淋巴细胞,总体积为150μl。在37℃,5%CO2条件下培养3天后,加入1mg/mlMTT溶液50μl。37℃孵育4-6小时后,用酶标仪测定波长为570nm时的吸光值(OD)。
此试验结果显示:Hsp65-E6/E7重组疫苗对免疫后小鼠脾淋巴细胞增殖有较强的刺激作用,刺激指数为3.4;而对对照小鼠脾淋巴细胞的增殖作用刺激较弱,刺激指数为1.1,二者差异有显著性意义(P<0.01)。无关蛋白GST对免疫和对照二组小鼠脾淋巴细胞刺激增殖作用均较弱,二组的差异无显著性意义。ConA对免疫和对照小鼠脾细胞增殖都有强烈刺激作用,二组的差异无显著性意义。结果说明,疫苗激发小鼠的淋巴细胞的分裂,如附图4所示。
实施例五 免疫和未免疫小鼠脾淋巴细胞的裂解活性
从小鼠中取出脾细胞直接进行杀伤试验可以反映当时体内的抗肿瘤能力。结果如附图5所示,Hsp65-E6/E7重组疫苗免疫小鼠的脾细胞对HPV16阳性TC-1细胞的裂解明显高于对照组,在效靶比为25∶1的情况下,杀伤率分别为13.28%和4.26%,差异有显著性(P<0.01)意义。另外我们还检测了小鼠脾细胞对HPV16阴性L929细胞的杀伤作用。免疫组和对照组杀伤率均很低,效靶比为25∶1时分别为3.79%和2.5%,差异无显著性意义。
实施例六 融合蛋白疫苗诱导的TC-1移植瘤的消退
实验动物采用C57BL/6小鼠,接种的肿瘤细胞TC-1肿瘤细胞系,TC-1细胞系是来源于C57BL/6的肺上皮细胞,经共转染HPV16 E6/E7和激活的c-H-ras基因后转化而得到的HPV16 E6/E7阳性细胞株,源于T-C Wu实验室,该细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养液中培养。具体实验方案如下:实验动物35只,腋窝下接种1.3×105 TC-1细胞,接种TC-1细胞4天后,即可观察到部分小鼠肿瘤皮下生长。10天后,肿瘤形成率达100%。肿瘤大小均匀,体积约8mm3。我们选择其中的32只小鼠,随机分为4组,每组8只,分别注射PBS、50ug、100ug、200ug融合蛋白疫苗,14天后再次免疫接种。此后观察肿瘤的消退以及小鼠的生存时间。观察期间对照组小鼠肿瘤生长迅速。40天后,对照组小鼠由于肿瘤负荷过大开始死亡;而治疗组小鼠的肿瘤生长受到抑制(附图8)。在接种肿瘤细胞的第32天,对照组小鼠的平均肿瘤为7.5cm3,而治疗组的50μg、100μg和200μg 3个剂量组的肿瘤体积分别为4.1、1.6、0.2cm3。3个剂量的融合蛋白都有显著的抑瘤作用(与对照组相比,3组的P<0.05),而且较高剂量的融合蛋白抑瘤作用要好于较低剂量(200μg vs 100μg,100μg vs50μg,P<0.05)(附图7),剂量效应关系明显,特别是高剂量(200μg/只)治疗组,7只小鼠中的2只在第二次免疫后的3~6天肿瘤完全消退,且持续20天以上(附图6)。治疗组(3个剂量)小鼠的生存期明显长于对照组(P<0.05)。到第64天,所有的对照小鼠(8只)全部死亡,而治疗组的50μg、100μg和200μg组分别有30%、70%和100%的小鼠存活。到第120天,200μg组仍有5只存活。说明疫苗明显延长了小鼠的生存期。
Claims (10)
1.用于在体内诱导针对HPV16Z蛋白抗原的特异性免疫应答的融合蛋白,其特征在于该融合蛋白至少包括应激蛋白与HPV16Z蛋白抗原。
2.权利要求1所要保护的目的蛋白,其中所述的应激蛋白为热休克蛋白65,蛋白抗原为HPV16ZE6与E7的融合蛋白。
3.权利要求1和2所要保护的目的蛋白,其中所述的E6为截短的E6片断,其至少包括E6蛋白C端88个氨基酸,E7为突变的E7蛋白,其24、26、58、91位氨基酸突变成苷氨酸。
4.权利要求1所要保护的目的蛋白,还至少包含4个组氨酸残基的纯化标记。
5.编码本文要求保护的目的蛋白的DNA序列。
6.含权利要求3的DNA序列的载体。
7.权利4所要保护的载体转化的宿主。
8.本文要求保护的融合蛋白的生产方法,包括表达所述序列并分离所需产物。
9.本文要求保护的融合蛋白的生产方法,包括将本文要求保护的蛋白与合适的稀释剂或其他药学上可接受的赋形剂混合。
10.本文要求保护的融合蛋白的用途,在治疗和预防HPV相关疾病的药物中的应用。
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- 2005-07-21 CN CN 200510085461 patent/CN1900118A/zh active Pending
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