CN103864936B - Hpv18型l2ne7e6融合蛋白基因、表达载体、方法、菌株和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种在大肠杆菌中高效表达的人乳头瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白的基因、表达载体、方法、菌株和用途。本发明将HPV18型L2蛋白第11‑200位氨基酸的L2N蛋白、E7蛋白、E6蛋白氨基酸序列融合,设计出适于大肠杆菌表达的密码子优化基因,将其插入原核表达载体pET9a,获得pET9a‑HPV18L2NE7E6表达载体及其转化菌株,表达水平占全菌的50%,纯化的融合蛋白免疫小鼠,产生的抗体能够中和HPV18型假病毒,能够产生特异性T细胞免疫应答,并能明显推迟小鼠成瘤时间,有20%的小鼠肿瘤生长受到完全抑制。本发明可用于预防和治疗HPV18型感染及相关疾病的疫苗研发。
Description
技术领域
本发明属于医学生物技术领域。具体地,本发明涉及一种人乳头瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白、其编码基因、质粒载体、制备方法及其免疫预防和治疗用途。
背景技术
宫颈癌在世界范围内占女性恶性肿瘤的第二位,严重威胁着女性身体健康。生殖道的高危人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)感染与宫颈癌的发生密切相关,大于90%的宫颈癌病人的宫颈样本中可以检测到HPV-DNA,其中HPV16的检出率最高,其它高危型别在不同地区检出率不同,在我国位于第二位的主要为HPV18。感染HPV18主要引起宫颈腺癌,其病变组织多位于子宫颈内口,在进行宫颈刮片筛查时不容易被检测到,所以发现时肿瘤可能已长得较大,病情进展较快且容易转移,预后较差。因此,研制HPV18型别的疫苗对预防HPV18感染及相关肿瘤的治疗具有重要意义。
目前预防性疫苗已获得了巨大的成功,其免疫策略主要集中在基于L1衣壳蛋白形成的VLP疫苗可诱导机体产生强而持久的高滴度中和抗体来预防感染,由Merk公司用酵母表达系统生产的HPV6、11、16、18型的VLP组成的四价疫苗Gardasil和GSK公司用杆状病毒与昆虫细胞表达系统生产的HPV16、18型VLP蛋白组成的双价疫苗Cervarix都已上市,两者都具有很高的免疫原性,能够保护90%的人群免受疫苗相应型别HPV的感染。然而这种预防性疫苗目前只能用于没有感染过HPV的健康人群,所以在较长时间内仍存在大量感染HPV或宫颈癌患者,而且这种VLP疫苗价格昂贵,限制了其在全球特别是在发展中国家的广泛使用。与VLP相比,单独次要衣壳L2蛋白虽然所诱发的特异性中和抗体滴度比较低,但是不同型别L2蛋白的N端氨基酸序列高度保守,使其具备诱发产生交叉中和抗体的能力,因此L2蛋白作为HPV广谱预防性疫苗的候选疫苗具有研发的潜力。
治疗性疫苗的目标在于诱发机体产生强的细胞免疫应答,将已感染HPV的细胞或已整合HPV DNA的细胞杀伤,从而控制或消除感染HPV的良性和恶性病灶,可作为HPV重度感染或相关肿瘤手术后的辅助治疗。由于HPV E6、E7蛋白持续在肿瘤细胞中表达,是形成肿瘤并维持恶性特征所必需的癌蛋白,因此其成为了治疗性疫苗研究的靶抗原。目前用于治疗HPV16型感染的疫苗研究比较多,细胞免疫反应在清除病毒感染中起重要作用,各种以E6、E7蛋白为靶抗原的治疗性疫苗在免疫小鼠或人后,均可产生相应的特异性的细胞免疫反应。然而针对HPV18型的治疗性疫苗研究相对较少,仅查到用DNA作为载体的HPV18E6蛋白能够诱发小鼠产生的特异性细胞免疫反应,用痘苗病毒作为载体表达的HPV18E6E7融合蛋白能够诱发免疫后的人体产生不同程度的特异性细胞免疫反应。因此,有必要对HPV18型疫苗进行研究和开发。
本研究选择将HPV18型L2N(L2蛋白的第11-200位氨基酸)、E7、E6三个蛋白融合并按大肠杆菌的优势密码子进行密码优化,然后进行原核表达,纯化后的融合蛋白能诱发强的体液免疫反应,产生的抗体可以中和HPV18型假病毒,同时可诱发小鼠产生针对E6的特异性T细胞免疫反应,并能明显推迟小鼠成瘤时间,有20%的小鼠肿瘤生长受到完全抑制,预期在未来用于人体临床试验中亦能表现出强的免疫原性。
发明内容
下面详细讨论本发明各种技术方案的制备和使用,但应该理解,本发明提供了许多适用的发明构思,其可以体现在各种各样的具体方面上。
为有助于理解本发明,下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语可用于说明的具体实例的一般类别,但它们的使用不限制本发明,权利要求中所概括的除外。
除非另外指出,本文所述的“HPV”是指人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus);
除非另外指出,本文所述的“bp”是指碱基对(base pair);
除非另外指出,本文所述的“ELISPOT”是指酶联免疫斑点(Enzyme-linkedimmunospot);
除非另外指出,本文所述的“IPTG”是指异丙基硫代-β-D半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside);
除非另外指出,本文所述的“SDS-PAGE”是指十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis);
除非另外指出,本文所述的“HRP”是指辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase);
除非另外指出,本文所述的“IFN-γ”是指γ-干扰素(Interferon gamma);
除非另外指出,本文所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液(Phosphatebufferedsaline);
本发明旨在提供一种能简单、经济、有效的制备人乳头瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白的基因核苷酸序列,该基因能在大肠杆菌中获得高效表达,表达蛋白能用于HPV18型感染和相关疾病(如宫颈癌)的预防和治疗。
具体而言,本发明的一个目的在于,提供一种人乳头瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白。本发明的另一个目的在于,提供一种用于编码前述的人乳头瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白的DNA序列。本发明的再一个目的在于,提供一种大肠杆菌表达质粒载体。本发明的又一个目的在于,提供一种用于生产前述的人乳头瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白的大肠杆菌菌株。本发明的还一个目的在于,提供一种制备前述的人乳头瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白的方法。
针对上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
一方面,本发明提供一种人乳头瘤病毒(HPV)18型L2N蛋白与E7蛋白、E6蛋白融合在一起的融合蛋白,其氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1所示的序列。本申请中,以“HPV18L2NE7E6”或“L2NE7E6”表示该融合蛋白。
另一方面,本发明提供一种用于前述的人乳头瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白的DNA序列,所述DNA序列的核苷酸序列为SEQ.ID.NO.2所示的序列。
再一方面,本发明提供一种用于表达前述融合蛋白的表达载体,所述表达载体包含前述的DNA序列;优选地,所述表达载体为原核或真核表达载体;更优选地,所述表达载体为大肠杆菌质粒载体。
优选地,所述大肠杆菌质粒载体是由前述HPV18型的L2NE7E6融合蛋白基因DNA序列插入至质粒pET9a的Nde I和BamH I位点间来构建的。
优选地,前述大肠杆菌表达质粒载体中,所述的大肠杆菌是BL21(DE3)。
又一方面,本发明提供一种用于生产前述的人乳头瘤病毒(HPV)18型的L2NE7E6融合蛋白的大肠杆菌菌株,所述大肠杆菌菌株含有前述的表达载体;优选地,所述菌株为大肠杆菌;更优选地,所述大肠杆菌选自BL21(DE3)等适宜表达pET9a的菌株。
还一方面,本发明提供一种制备前述的人乳头瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
1)将前述的HPV18L2NE7E6融合蛋白基因DNA序列插入大肠杆菌表达载体pET9a的Nde I和BamH I位点,构建出重组表达载体pET9a-HPV18L2NE7E6;
2)用步骤1)所构建的重组表达载体转化大肠杆菌,获得含有该重组表达载体的菌株,接种培养,IPTG诱导表达;
3)将步骤2)所得到的大肠杆菌离心裂解后,收获包涵体,用8M尿素悬起,离心,取上清用镍离子亲和层析柱纯化表达蛋白。
优选地,在本发明制备前述的人乳头瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白的方法中,所述的大肠杆菌选自BL21(DE3)等适宜表达pET9a的菌株。
另一方面,本发明提供一种制备用于治疗及预防人乳头瘤病毒18型感染及其相关疾病(如宫颈癌)药物的方法。
此外,本发明还提供了前述的人乳头瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白、前述的人乳头瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白的DNA序列、前述的原核表达载体或前述的大肠杆菌菌株在制备用于预防和治疗人乳头瘤病毒18型感染及其相关疾病(如宫颈癌)药物中的应用;优选地,所述的药物为疫苗。
本发明还提供了一种用于预防和治疗HPV18型感染及相关疾病(如宫颈癌)的疫苗,所述疫苗包括前述的人乳头瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白、前述的人乳头瘤病毒HPV18L2NE7E6融合蛋白的DNA序列、前述的原核表达载体或前述的大肠杆菌菌株。
下面根据本发明的一个优选的实施方式,结合说明书附图对本发明的技术方案进行进一步的详细说明:
本实验采用基因工程技术,根据从宫颈癌患者分离测序获得的HPV18次要衣壳蛋白L2N蛋白核苷酸序列和与早期蛋白E7、E6核苷酸序列,设计出融合蛋白HPV18L2NE7E6的氨基酸序列,然后根据大肠杆菌优势密码子及mRNA的二级结构综合分析,设计出编码HPV18L2NE7E6融合蛋白的核苷酸序列,经公司合成并克隆至原核表达载体pET9a,改造基因获得高效表达,表达水平占全菌的50%,表达蛋白经纯化后免疫小鼠,用动物免疫实验评价合成基因表达蛋白的免疫原性。
本发明根据优化密码子的基因序列来生产乳头瘤病毒18型L2NE7E6融合蛋白的方法包括以下步骤:
将设计的密码子优化HPV18L2NE7E6基因片段插入大肠杆菌表达载体pET9a的NdeI和BamH I位点,将该质粒转化大肠杆菌获得含有pET9a-HPV18L2NE7E6的菌株,接种培养,IPTG诱导表达;
表达菌体经离心裂解后,收获包涵体,用8M尿素悬起,离心,取上清用镍离子亲和层析柱纯化表达蛋白。
优选地,在本发明生产HPV18L2NE7E6融合蛋白的方法中,所述的大肠杆菌是BL21(DE3)(BL21(DE3)是常用的大肠杆菌表达菌株,一般配合以强表达载体来进行目的基因的强表达)。
本发明的含有重组质粒pET9a-HPV18L2NE7E6的大肠杆菌菌株能用于研制治疗人乳头瘤病毒18型感染和与此感染相关的疾病(如宫颈癌)药物。
众所周知,同一种氨基酸有几组密码子,生物学上将几组密码子代表一种氨基酸的现象称为密码子的简并性,而简并性主要是由于密码子的第三个碱基发生摆动现象形成的,也就是说密码子的专一性主要由前两个碱基决定,即使第三个碱基发生突变也能翻译出正确的氨基酸,这对于保证物种的稳定性有一定意义;例如:GCU,GCC,GCA,GCG均代表丙氨酸。除色氨酸和甲硫氨酸外,其他氨基酸的密码子均多于1个(2~6个)。简并性并不意味着密码不完善,每个密码子只对应1种氨基酸。简并性可使突变的有害影响减到最小。大部分密码子具有简并性,即两个或者多个密码子编码同一氨基酸。简并的密码子通常只有第三位碱基不同,例如,GAA和GAG都编码谷氨酰胺。如果不管密码子的第三位为哪种核苷酸,都编码同一种氨基酸,则称之为四重简并;如果第三位有四种可能的核苷酸之中的两种,而且编码同一种氨基酸,则称之为二重简并,一般第三位上两种等价的核苷酸同为嘌呤(A/G)或者嘧啶(C/T)。只有两种氨基酸仅由一个密码子编码,一个是甲硫氨酸,由AUG编码,同时也是起始密码子;另一个是色氨酸,由UGG编码。遗传密码的这些性质可使基因更加耐受点突变。例如,四重简并密码子可以容忍密码子第三位的任何变异;二重简并密码子使三分之一可能的第三位的变异不影响蛋白质序列。由于转换变异(嘌呤变为嘌呤或者嘧啶变为嘧啶)比颠换变异(嘌呤变为嘧啶或者嘧啶变为嘌呤)的可能性更大,因此二重简并密码子也具有很强的对抗突变的能力。遗传学上将基因的这种不影响氨基酸序列的突变称为沉默突变。然而,在特定的表达菌株中,在不改变蛋白的氨基酸序列的前提下,使用不同的密码子对编码蛋白的产量有着非常显著的影响。因此,从多种密码子中选择特定的密码子以获得较高蛋白产量称为“密码子优化”。对于分子量较大,即组成的氨基酸数目较多的蛋白而言,寻找及确定密码子优化的核苷酸序列是具有相当难度的。
本发明人从增强疫苗的免疫原性、并能在大肠杆菌中高效表达两方面考虑:L2的主要目的是诱导体液免疫即中和抗体,同时作为前导蛋白提高E7E6蛋白的表达,因此将L2蛋白截短仅保留含有中和抗体表位的第11-200位氨基酸的L2N蛋白,进行设计研制HPV18L2NE7E6融合蛋白疫苗,以使L2N、E7、E6三个靶抗原融合后能得以高效表达(一般分子量太大,表达水平会低),并根据大肠杆菌优势密码子,设计出编码HPV18L2NE7E6融合蛋白的核苷酸序列,然后根据设计序列合成后,将其插入原核表达载体pET9a,实验证实改造基因获得高效表达,表达水平占全菌的约50%,并进行了该蛋白的纯化,免疫C57BL/6小鼠后,经ELISA抗体检测表明该蛋白在小鼠体内诱发了强的体液免疫反应,所产生的抗体能够中和HPV18型假病毒,ELISPOT检测免疫后的小鼠可产生针对HPV18型E667-75多肽较高水平的特异性T细胞免疫反应,小鼠肿瘤模型实验表明免疫后的小鼠能明显推迟肿瘤形成的时间,有20%的小鼠肿瘤生长受到完全抑制。本发明可用于研发预防和治疗性HPV18型感染和相关疾病(如宫颈癌)的疫苗。
本发明具有如下的明显优点:
本发明中含有可产生中和抗体的HPV18型L2N蛋白,且同时含有能够引起细胞免疫反应的E7和E6蛋白,使用本发明的优化基因能够获得高效表达,表达水平占全菌的50%,表达蛋白经纯化免疫小鼠,实验结果表明该蛋白具有很好的免疫原性,产生的抗体能够中和HPV18型假病毒,能够产生针对E667-75多肽特异性的T细胞免疫反应,并能明显推迟小鼠肿瘤形成时间,有20%的小鼠肿瘤生长受到完全抑制。该优化基因建立的HPV18L2NE7E6融合蛋白原核高效表达系统能用于HPV18感染和相关疾病(如宫颈癌)的预防和治疗性疫苗的中试生产及新药研发。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1为本发明实施例3中所使用的pMD18-T质粒载体结构图谱;
图2为根据本发明实施例3的方法构建的重组原核克隆质粒pMD18-HPV18L2NE7E6的结构简图;
图3为本发明实施例3中所使用的pET9a质粒载体结构图谱;
图4为根据本发明实施例3的方法构建的重组原核表达质粒pET9a-HPV18L2NE7E6的结构简图;
图5为HPV18L2NE7E6融合蛋白原核表达SDS-PAGE,电泳结果具体为根据本发明实施例4进行的在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE凝胶分析的结果;其中,M为低分子量蛋白质Marker,1为空载体对照,2为诱导后基因表达产物;
图6为HPV18L2NE7E6融合蛋白的Western blot鉴定结果,具体为根据本发明实施例5进行的在大肠杆菌中表达蛋白的Western-blot鉴定结果;其中,M为低分子量蛋白质Marker,1为空载体对照,2为诱导后基因表达产物;
图7为纯化后的HPV18L2NE7E6融合蛋白SDS-PAGE纯度分析,具体为根据本发明实施例6进行的在原核系统表达经镍离子亲和层析纯化后的SDS-PAGE凝胶分析的结果,其中,M为低分子量蛋白质Marker,1为纯化后的HPV18L2NE7E6蛋白;
图8为HPV18L2NE7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠体内诱发的体液免疫反应,具体为根据本发明实施例7进行的表达蛋白经纯化,免疫小鼠后的总抗体滴度检测的结果;
图9为HPV18L2NE7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠体内诱发的细胞免疫反应,具体为根据本发明实施例7进行的表达蛋白经纯化,免疫小鼠后的酶联免疫斑点(ELISPOT)检测结果。
图10为HPV18L2NE7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠体内诱发的抗肿瘤免疫反应,具体为根据本发明实施例7进行的表达蛋白经纯化,免疫移植肿瘤细胞的小鼠后观察肿瘤生长情况。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解,这些实施例仅用于说明本发明,其不以任何方式限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照厂商所建议的条件。
实施例1:设计人乳头瘤病毒18型L2NE7E6融合蛋白大肠杆菌表达的优化密码子基因序列
首先将从宫颈癌患者分离测序获得的HPV18序列与Genebank中序列比对,其与AY262282一致,然后将次要衣壳蛋白L2N蛋白的核苷酸序列与早期蛋白E7、E6核苷酸序列融合,并去掉E7、E6蛋白的起始密码子和E7的终止密码子,同时考虑到E7、E6蛋白为HPV18型的癌蛋白,出于对疫苗的安全性考虑,将其与致癌位点相关的氨基酸进行突变,分别是将E7蛋白第27位的Cys和第29位的Glu突变为Gly,E6第65位氨基酸由Cys突变为Gly,设计出编码HPV18L2NE7E6融合蛋白的氨基酸序列,得到具体如SEQ ID NO:1所示的融合蛋白(融合蛋白从N→C端依次为L2N、E7、E6,共451个氨基酸)。
利用基因简并性,在其编码的产物蛋白氨基酸序列保持不变的前提下设计出优化密码子核苷酸序列,发明人将该序列命名为HPV18L2NE7E6,经实验检测证明,此序列适于在大肠杆菌中表达HPV18L2NE7E6融合蛋白,其序列具体如SEQ ID NO:2所示。
实施例2:合成密码子优化的基因序列,并构建含18L2NE7E6目的基因片段的克隆质粒
由北京擎科生物技术有限公司合成质粒pGH-18-33,该质粒含有根据大肠杆菌优势密码子设计的HPV18L2蛋白的第1-600位核苷酸基因片段,先用PCR方法增出L2N蛋白的基因片段,其中上游引物P1:L2F中含有6个组氨酸并同时含有Nde I酶切位点,下游引物P2:L2R中含有BamH I酶切位点,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(引物具体序列如表1所示)。然后将扩增的PCR片段插入克隆载体pMD18-T中构建出pMD18-HPV18L2N,经测序证实HPV18L2N基因序列与设计序列相符。HPV18L2N具体序列如下:
CGTGCAAGCGTTACCGATCTGTATAAAACCTGTAAACAGAGCGGTACCTGTCCGCCGGATGTTGTTCCGAAAGTTGAAGGTACCACCCTGGCAGATAAAATTCTGCAGTGGAGCAGCCTGGGTATCTTTCTGGGTGGTCTGGGTATTGGTACCGGTAGCGGTACCGGTGGTCGTACCGGTTATATTCCGCTGGGTGGTCGTAGCAATACCGTTGTTGATGTTGGTCCGACCCGTCCGCCGGTTGTTATTGAACCGGTTGGTCCGACCGATCCGAGCATTGTTACCCTGATTGAAGATAGCAGCGTTGTTACCAGCGGTGCACCGCGTCCGACCTTTACCGGTACCAGCGGTTTTGATATTACCAGCGCAGGTACCACCACCCCGGCAGTTCTGGATATTACCCCGAGCAGCACCAGCGTTAGCATTAGCACCACCAATTTTACCAATCCGGCATTTAGCGATCCGAGCATTATTGAAGTTCCGCAGACCGGTGAAGTTGCAGGTAATGTGTTTGTTGGTACCCCGACCAGCGGTACCCATGGTTATGAAGAAATTCCGCTGCAGACCTTT(570bp)。
由北京擎科生物技术有限公司合成质粒pGH-18E7E6P,该质粒含有根据大肠杆菌优势密码子设计的HPV18L2基因的第586-600位核苷酸基因片段和E7基因、E6基因的融合基因HPV18E7E6P,其中E7和E6基因均无ATG,并且E7蛋白第27位的Cys和第29位的Glu突变为Gly,E6蛋白第65位氨基酸由Cys突变为Gly。HPV18E7E6P具体序列如下:
CCGCTGCAGACCTTTCATGGTCCGAAAGCAACCCTGCAGGATATTGTTCTGCATCTGGAACCGCAGAATGAAATTCCGGTTGATCTGCTGGGTCATGGTCAGCTGAGCGATAGCGAAGAAGAAAATGATGAAATTGATGGTGTTAATCATCAGCATCTGCCGGCACGTCGTGCAGAACCGCAGCGTCATACCATGCTGTGTATGTGTTGTAAATGTGAAGCACGTATTGAACTGGTTGTTGAAAGCAGCGCAGATGATCTGCGTGCATTTCAGCAGCTGTTTCTGAATACCCTGAGCTTTGTTTGTCCGTGGTGTGCAAGCCAGCAGGCACGTTTTGAAGATCCGACCCGTCGTCCGTATAAACTGCCGGATCTGTGTACCGAACTGAATACCAGCCTGCAGGATATTGAAATTACCTGTGTTTATTGTAAAACCGTTCTGGAACTGACCGAAGTGTTTGAATTTGCATTTAAAGATCTGTTTGTTGTTTATCGTGATAGCATTCCGCATGCAGCAGGTCATAAATGTATTGATTTCTATAGCCGTATTCGTGAACTGCGTCATTATAGCGATAGCGTTTATGGTGATACCCTGGAGAAACTGACCAATACCGGTCTGTATAATCTGCTGATTCGTTGTCTGCGTTGTCAGAAACCGCTGAATCCGGCAGAGAAACTGCGTCATCTGAATGAGAAACGTCGTTTTCATAATATTGCAGGTCATTATCGTGGTCAGTGTCATAGCTGTTGTAATCGTGCACGTCAGGAACGTCTGCAGCGTCGTCGTGAAACCCAGGTTTAA(801bp)。
分别用Nde I酶和BamH I酶对质粒pMD18-HPV18L2N进行酶切,用HindIII对质粒pGH-18E7E6P进行酶切,并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收基因片段HPV18L2N和HPV18E7E6P。然后以这两个基因片段为模板、以根据密码子优化的18L2NE7E6融合基因的核苷酸序列设计的上游引物P1:L2F和下游引物P3:E6R进行PCR扩增,其中上游引物含有Nde I酶切位点,并同时含有6个组氨酸便于目的蛋白的纯化,下游引物中含有BamH I酶切位点,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如表1所示。扩增条件如下:94℃5分钟预变性,循环体为94℃30秒,58℃30秒,72℃1.5分钟,30个循环,然后72℃10分钟,扩增出含Nde I、BamH I酶切位点以及6个组氨酸的L2NE7E6目的基因片段,共计1390bp。
然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR扩增出的含1390bp的HPV18L2NE7E6目的片段,并将目的片段克隆到pMD18-T载体上,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR鉴定正确后,送擎科公司测序。获得了与设计序列相符的pMD18T-HPV18L2NE7E6克隆质粒,该克隆质粒的结构见图2。
本实施例中所使用的pMD18-T载体购自北京六合通经贸有限公司,货号D103A,其具体结构如图1所示。
表1PCR扩增HPV18L2NE7E6目的基因的引物序列
实施例3:原核表达重组质粒pET9a-HPV18L2NE7E6的构建
本实施例为构建原核表达重组质粒pET9a-HPV18L2NE7E6,具体详述如下。
将实施例2中构建的pMD18T-HPV18L2NE7E6克隆质粒用酶切消化以获得
HPV18L2NE7E6基因片段,所述酶切消化的操作具体如下:先用Nde I酶37℃水浴消化2小时,然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收,再BamH I酶37℃水浴消化2小时,最后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收HPV18L2NE7E6片段。
然后将获得的HPV18L2NE7E6片段插入大肠杆菌表达质粒pET9a的Nde I和BamH I位点,经Nde I和BamH I酶切鉴定并测序,筛选获得有正确插入的原核表达重组质粒pET9a-HPV18L2NE7E6,其结构简图如图4所示。
本实施例中所使用的为可商购获得的表达质粒载体,其具体结构图如图3所示,为Novagen公司产品,购自华美生物工程公司北京分公司。
所使用的Nde I和BamH I酶均为Biolabs公司产品,购自北京北方仪涛商贸有限公司;
所使用的琼脂糖凝胶回收试剂盒为北京天根生化科技有限公司产品。
实施例4:HPV18L2NE7E6蛋白在原核系统中的表达
本实施例使用实施例3获得的含有重组质粒pET9a-HPV18L2NE7E6转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Invitrogen公司)。采用重组质粒转化CaCl2法制备BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,具体操作见参考文献:萨姆布鲁克J,弗里奇EF,和曼尼阿蒂斯T,分子克隆实验指南.1992.第二版(北京):科学出版社:第56页。
将所得到的转化了重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)涂平皿,37℃过夜培养。挑单斑在LB培养基(配方见参考文献:萨姆布鲁克J,弗里奇EF,和曼尼阿蒂斯T,分子克隆实验指南.1992.第二版(北京):科学出版社:第908页)中37℃振荡培养,当OD600=0.8时,加入终浓度为0.8mM的IPTG(Promega公司产品,购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司),25℃诱导表达4小时,取适量菌体进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。
电泳凝胶经扫描后,使用Gel-Pro软件分析。结果如图5所示,在分子量约51KD处有一新增蛋白带,蛋白分子量大小与设计理论推测值一致,该蛋白带约占全菌蛋白总量的50%。
实施例5:HPV 18L2NE7E6蛋白在原核系统中表达的Western-blot鉴定
本实施例采用化学发光方法对HPV18L2NE7E6蛋白在原核系统中表达进行Western-blot检测鉴定,具体详述如下。
取实施例4获得的诱导表达菌液200μl,离心收获菌体,重悬于100μl的SDS-PAGE加样缓冲液(具体配方及配制方法见萨姆布鲁克J,弗里奇EF,和曼尼阿蒂斯T,分子克隆实验指南.1992.第二版(北京):科学出版社:第935页)混匀,煮沸加热5分钟。离心后取5-10μl上样于10%的SDS-PAGE胶,进行电泳,然后电转硝酸纤维素膜。
分别使用抗HPV18L2自制小鼠多抗作为第一抗体,辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG作为第二抗体(购自北京中山生物技术有限公司),使用抗HPV18E6、E7蛋白的山羊多抗(Santa Cruz公司产品,购自北京北方仪涛商贸有限公司)作为第一抗体,辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG(购自北京中山生物技术有限公司)作为第二抗体,采用化学发光试剂盒(Pierece公司产品,购自北京北方同正生物技术发展有限公司)进行目的蛋白表达的Western-Blot特异性鉴定(具体操作见参考文献:萨姆布鲁克J,弗里奇EF,和曼尼阿蒂斯T,分子克隆实验指南.1992.第二版(北京):科学出版社:第888-898页)。
其中所使用的抗HPV18L2自制小鼠多抗的制备方法如下:将5’端加上起始密码子和6个组氨酸,3’端加了终止密码子的HPV18L2N基因片段插入pET9a原核表达质粒载体(Novagen公司产品,购自华美生物工程公司北京分公司)的Nde I和BamH I位点之间,获得pET9a-HPV18L2N、表达质粒,并将其转入BL21(DE3)菌株,以1∶100接种于300ml 2×YT培养基,37℃振荡培养至OD600=0.8,加入IPTG至终浓度为0.8mM,25℃诱导表达6小时,收集菌体沉淀。用镍离子亲和层析柱(Amersham Biosciences(安玛西亚)公司产品,购自北京中原公司)纯化HPV18L2N蛋白,所得纯化蛋白纯度为90%,具体的方法详见参考文献:奥斯伯FM,金斯顿RE,塞德曼JG等,精编分子生物学实验指南.2005.第四版(北京):科学出版社:第442-447页。纯化的HPV18L2N加铝佐剂,肌肉注射免疫BALB/C小鼠,免疫两次后摘眼球采血,离心取血清,即得HPV18L2N蛋白抗血清。
Western-Blot结果表明,在分子量约51KD处有一特异性反应条带能分别与HPV18L2N、E7和E6的抗体发生特异结合,分子量与预期大小一致,而载体对照在相应位置无反应,说明HPV18L2NE7E6蛋白能够在原核系统中正确表达,结果参见图6。
实施例6:HPV18L2NE7E6蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化
本实施例为HPV18L2NE7E6蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化,具体参见以下步骤:
a)将实施例4获得的菌种以1∶100接种于400ml 2×YT培养基(其配方见参考文献:萨姆布鲁克J,弗里奇EF和曼尼阿蒂斯T,分子克隆实验指南.1992.第二版(北京):科学出版社:第909页),分成4份在37℃振荡培养至OD600=0.8时,加入IPTG(Promega公司产品,购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司)至终浓度为0.8mM,25℃诱导表达6小时,离心(5000rpm,15分钟,4℃)收集菌体沉淀;
b)将前述步骤a)中获得的表达菌体沉淀重悬于40ml裂解缓冲液(20mMNa2HPO4,0.5M Nacl,PH7.5),在冰浴中超声处理(400W,25次)8秒,间隔16秒,离心(12,000rpm,15分钟,4℃)收集沉淀;
c)将前述步骤b)中获得的沉淀重悬于40ml含2M尿素的缓冲液(2M尿素,50mMTris,PH8.0),在冰浴中超声处理(400W,20次)8秒,间隔16秒。离心(12000rmp,15分钟,4℃)收集沉淀;
d)将前述步骤c)中获得的沉淀重悬于40ml含8M尿素的缓冲液(8M尿素,20mMNa2HPO4,0.2MNacl,PH7.5),在冰浴中超声处理(400瓦,20次)8秒,间隔16秒。离心(12000rmp,15分钟,4℃),收集上清液备用;
e)将前述步骤d)中获得的上清液经镍离子亲和层析柱(AmershamBiosciences(安玛西亚)公司产品,购自北京中原公司)纯化目的蛋白,方法详见奥斯伯FM,金斯顿RE,塞德曼JG等,精编分子生物学实验指南.2005.第四版(北京):科学出版社:第442-447页;
f)将前述步骤e)中获得的层析纯化后的蛋白经透析袋(购自华美生物工程公司北京分公司,规格DM-49,孔径为12-14KD)进行尿素梯度浓度透析,最后透析至PBS缓冲液中,超滤离心浓缩,纯度达90%,储存于-70℃供免疫动物使用,所得纯化蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析结果见图7。
实施例7:HPV18L2NE7E6融合蛋白动物免疫实验
本实施例为使用实施例6中制备的HPV18L2NE7E6融合蛋白进行动物免疫实验,包括检测免疫小鼠的血清特异性抗体、中和抗体和细胞免疫反应,以及对肿瘤生长的抑制作用。
(1)HPV18L2NE7E6融合蛋白免疫小鼠后血清特异性抗体、中和抗体和细胞免疫反应检测
使用由前述实施例6制备得到的HPV18L2NE7E6融合蛋白50μg,加入10ugCpG(1826)佐剂(CpG序列为:5‘TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT3’,由TaKaRa大连公司合成),肌肉注射免疫C57BL/6小鼠(C57BL/6小鼠,6-8周龄,雌性,购自中国医学科学院实验动物繁育中心,在SPF2级动物房饲养),二周后以同样免疫剂量加强,免疫结束后12-14天,取血清分别进行特异性抗体检测和假病毒中和实验检测;取脾细胞进行细胞免疫检测。
1)血清特异性抗体检测:
a)检测用的HPV18型L2、E7、E6包被抗原的具体制备方法如下:
将5’端加上起始密码子和6个组氨酸,3’端加了终止密码子的HPV18L2N基因片段插入pET9a原核表达质粒载体(Novagen公司产品,购自华美生物工程公司北京分公司)的Nde I和BamH I位点之间,将HPV18E7、E6蛋白表达基因分别插入pGEX2T原核表达质粒载体(购自Pharmacia公司)的BamH I和EcoR I位点之间,获得的含有pET9a-HPV18L2N、pGEX2T-HPV18E7、pGEX2T-HPV18E6表达质粒,分别将pET9a-HPV18L2N转入BL21(DE3)菌株,pGEX2T-HPV18E7和pGEX2T-HPV18E6转入JM109菌株,以1∶100接种于300ml 2×YT培养基,37℃振荡培养至OD600=0.8,加入IPTG至终浓度为0.8mM,25℃诱导表达6小时,收集菌体沉淀。
用镍离子亲和层析柱(Amersham Biosciences(安玛西亚)公司产品,购自北京中原公司)纯化HPV18L2N蛋白,所得纯化蛋白纯度为90%,具体的方法详见参考文献:奥斯伯FM,金斯顿RE,塞德曼JG等,精编分子生物学实验指南.2005.第四版(北京):科学出版社:第442-447页。
用介质Glutathione Sepharose(Amersham Biosciences(安玛西亚)公司产品,购自北京中原公司)按介质说明书进行HPV18E7和HPV18E6蛋白的纯化,所得纯化蛋白纯度约为90%。
b)HPV18L2NE7E6融合蛋白免疫小鼠后的血清特异性抗体检测
取血清,本例a)中制备的L2、E7、E6抗原进行用酶联免疫法(ELISA)检测免疫后小鼠产生的L2抗体、E7抗体和E6抗体水平。制备的L2、E7、E6包被抗原的包被量分别为100ng/孔、100ng/孔、100ng/孔,血清起始稀释度为1∶500(ELISA具体操作步骤参见:奥斯伯FM,金斯顿RE,塞德曼JG等,精编分子生物学实验指南.2005.第四版(北京):科学出版社:第476-477页),以试剂组PBS为阴性对照,检测的总抗体滴度结果如图8所示。从图8中可看出,HPV18L2NE7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠体内能诱导产生高滴度的抗体,具体如下:L2抗体滴度1∶640000、E7抗体滴度1∶108576和E6抗体滴度1∶101593。
2)血清中和抗体检测
取血清,用假病毒中和实验进行HPV18L2中和抗体检测。具体方法为:接种适量293FT细胞于96孔细胞培养板,37℃、5%CO2孵箱中培养,第二天将用细胞培养基(含10%胎牛血清的DMEM,购自Hyclone)稀释的血清经0.2μm滤器过滤除菌后与200-300个TCID50的HPV假病毒混合均匀(HPV假病毒由实验室自制,具体方法如下:将含有HPV18L1、L2衣壳蛋白基因的真核表达质粒瞬时转染293FT细胞后,表达HPV18L1、L2衣壳蛋白,衣壳蛋白自动包装形成病毒样颗粒,并将带有绿色荧光蛋白报告基因的质粒包裹进内部,裂解细胞后收获纯化假病毒。详细方法参考文献:Christopher B.Buck,Diana V.Pastrana,Douglas R.Lowyand John T.Schiller.Production of Papillomaviral Vectors(Pseudoviruses).2009.),置4℃放置1小时后,加入细胞中,37℃、5%CO2孵箱中培养,2天后置倒置荧光显微镜下观察,计算绿色荧光点数,各血清从1∶20开始稀释,抑制率大于50%的最大稀释倍数的倒数作为血清的中和滴度,结果表明免疫了HPV18L2NE7E6融合蛋白的C57BL/6小鼠能够产生针对HPV18型假病毒的中和抗体滴度为1∶1280。
3)细胞免疫反应检测:
取脾细胞,用酶联免疫斑点(ELISPOT)方法进行E7肽库和E667-75单肽(N>KCIDFYSRI<C)(肽库设计方案为:参照蛋白序列,以N’→C’的方向,15个氨基酸为一条肽段,相邻肽段重叠11个氨基酸,设计E7肽库,多肽全部由北京中科亚光公司合成)刺激产生的特异性分泌IFN-γ的效应T细胞的数目检测(具体方法参见Miyahira Y,Murata K,Rodriguez D,et al.,Quantification of antigenspecific CD8+T cell using anELISPOT assay.J Immunol Methods,1995,181(1):45-54.Murali-Krishna K,Altman JD,Suresh M,et al.Counting antigen-speificCD8 T cells:a reevaluation ofbystander activation during viral infection.Immunity,1998,8(2):1771-87.),具体操作参见BD公司产品ELISPOT试剂盒说明书)。
HPV18E7肽库和HPV18E667-75多肽刺激免疫HPV18L2NE7E6融合蛋白的C57BL/6小鼠后产生分泌IFN-γ的效应T细胞数斑点数分别为:1和323,而生理盐水对照组斑点数分别为1和10,说明HPV18L2NE7E6融合蛋白能够诱发C57BL/6小鼠产生针对HPV18E6蛋白的特异性T细胞免疫应答,但没能刺激E7蛋白产生相应的细胞免疫反应,结果如图9所示。
(2)HPV18L2NE7E6对C57小鼠肿瘤生长的抑制作用:
先用1.5x103个B16/HPV18E7肿瘤细胞(B16/HPV18E7肿瘤细胞系pcDNA3-HPV18E7质粒转染C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞B16,经G418传代筛选后可稳定表达和递呈E7蛋白,由中国医学科学院肿瘤所郭素娟博士构建,张叔人教授馈赠。)腹股沟皮下注射(注射剂量为100μl)C57BL/6小鼠(C57BL/6小鼠,6-8周龄,雌性,购自中国医学科学院实验动物繁育中心,在SPF2级动物房饲养),第二天肌肉注射50μg的HPV18L2NE7E6融合蛋白(由前述实施例6制备得到的HPV18L2NE7E6融合蛋白)+10ugCpG(1826)佐剂(CpG序列为:5‘TCC ATG ACG TTCCTG ACG TT 3’,由TaKaRa大连公司合成),10天后以同样免疫剂量加强,观察肿瘤生长情况(每周2次)。
实验结果如图10所示,表明经蛋白免疫后对肿瘤的生长具有一定的抑制作用,小鼠成瘤时间明显推迟,并且有20%的小鼠能完全抑制肿瘤的生长。
综前所述,HPV18L2NE7E6融合蛋白能诱发小鼠产生强的抗体水平,所产生的抗体能够中和HPV18型假病毒,同时的能诱发C57BL/6小鼠产生针对HPV18E6蛋白的特异性T细胞免疫应答,且能明显推迟小鼠肿瘤形成时间,有20%的小鼠肿瘤生长受到完全抑制。因此能作为预防和治疗HPV18型感染及相关疾病(如宫颈癌)的疫苗。
Claims (14)
1.一种人乳头瘤病毒(HPV)18L2NE7E6融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ.ID.NO.1所示的序列。
2.一种用于编码权利要求1所述的人乳头瘤病(HPV)18L2NE7E6融合蛋白的DNA序列,其特征在于,所述DNA序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列。
3.一种用于表达权利要求1所述融合蛋白的表达载体,其特征在于,所述表达载体含有权利要求2所述的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体为原核或真核表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体为大肠杆菌质粒载体。
6.根据权利要求5所述的表达载体,其特征在于,所述大肠杆菌质粒载体是由权利要求2所述的DNA序列插入至质粒pET9a的NdeI和BamH I位点间来构建的。
7.根据权利要求6所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体的宿主菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
8.一种用于生产权利要求1所述融合蛋白的菌株,其特征在于,所述菌株含有权利要求3至7中任一项所述的表达载体。
9.根据权利要求8所述的菌株,其特征在于所述菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
10.一种制备权利要求1所述融合蛋白的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
1)将权利要求2所述的DNA序列插入至质粒pET9a的Nde I和BamHI,构建出重组表达质粒pET9a-HPV18L2NE7E6;
2)用步骤1)所构建的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得含有该重组表达质粒的菌株,接种培养,IPTG诱导表达;
3)将步骤2)所得到的大肠杆菌离心裂解后,收获包涵体,用8M尿素悬起,离心,取上清用镍离子亲和层析柱纯化表达蛋白。
11.一种制备用于预防和治疗人乳头瘤病毒18型感染及其相关疾病药物的方法,其特征在于,该方法包括将权利要求2所述的DNA序列、权利要求3至7中任一项所述的表达载体、权利要求8至9任一项所述的菌株用于表达权利要求1所述的人乳头瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白。
12.权利要求1所述的人乳头瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白、权利要求2所述的人乳头瘤病毒(HPV)18型L2NE7E6融合蛋白的DNA序列、权利要求3至7任一项所述的表达载体、或权利要求8-9任一项所述的菌株在制备用于预防和治疗人乳头瘤病毒18型感染及其宫颈癌的药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用,所述药物为疫苗。
14.一种用于预防和治疗宫颈癌的疫苗,其特征在于,所述疫苗包括权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2所述的DNA序列、权利要求3至7任一项所述的表达载体、或权利要求8-9任一项所述的菌株。
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