WO2020251014A1 - 免疫系を賦活化する細胞および当該細胞を含む医薬組成物 - Google Patents

免疫系を賦活化する細胞および当該細胞を含む医薬組成物 Download PDF

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WO2020251014A1
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眞一郎 藤井
佳奈子 清水
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国立研究開発法人理化学研究所
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    • C12N2710/20071—Demonstrated in vivo effect

Definitions

  • the present invention relates to cells that activate the immune system and pharmaceutical compositions containing the cells.
  • HPV Human papillomavirus
  • cervical cancer In addition to cervical cancer, HPV is the cause of extrinsic intraepithelial neoplasia and vaginal intraepithelial neoplasia, which, as they progress, become vulvar and vaginal cancer, respectively. In recent years, it is also known as a risk of developing oropharyngeal cancer.
  • Representatives of HPVs that cause cervical cancer are types 16 and 18, and HPVs of types 16 and 18 account for about 65% of the causes of cervical cancer. Cervical cancers caused by HPV types 16 and 18 are more cancerous than other high-risk cervical cancers. About 80% to 90% of cervical cancers in their 20s to 30s are caused by HPV types 16 and 18.
  • Non-Patent Document 1 Cells obtained by pulsed cells that co-express CD1d and the target protein with a CD1d ligand are called artificial adjuvant vector cells (aAVC) and induce innate immunity and acquired immunity to the target protein in the administered subject.
  • aAVC artificial adjuvant vector cells
  • the present invention provides cells that activate the immune system and pharmaceutical compositions containing the cells.
  • the artificial adjuvant vector cell expressing the E6 protein or the E7 protein activated NKT cells and further induced E6 and E7 antigen-specific T cells, showing an antitumor effect.
  • the fusion protein in which the E7 protein, the E6 protein, and the E7 protein were linked in this order had high intracellular protein expression.
  • the present invention is an invention based on such findings.
  • the inventions shown below are provided.
  • Early genes of human papillomavirus A mammalian cell expressing at least one protein selected from E6 protein and E7 protein and a fusion protein of E6 protein and E7 protein and CD1d protein, which is pulsed by a CD1d ligand. Protein.
  • the initial genes E6 protein and E7 protein of human papillomavirus are expressed as fusion proteins.
  • the fusion protein is a fusion protein containing E7 protein, E6 protein, and E7 protein in this order.
  • Pharmaceutical composition comprising any one of (1) to (4) above, the fusion protein according to (5) above, the nucleic acid according to (6) above, or the vector according to (7) above.
  • the pharmaceutical composition according to (8) above for administration to a human subject infected with human papillomavirus.
  • the cancer caused by human papillomavirus is a cancer selected from the group consisting of cervical cancer, anal cancer, and vaginal cancer.
  • FIG. 1 shows HEK293 cells expressing CD1d pulsed with a CD1d ligand and then transfected with mRNA encoding HPV-16 type E6 or E7 protein for E6 or E7 protein in cells cultured for a specified period of time. It shows expression (panels A and B). Panels C and D show the results of flow cytometric analysis of the expression of CD1d on the cell surface.
  • FIG. 2 shows the results of pulsing HEK293 cells expressing CD1d with a CD1d ligand and examining the amplification of NKT cells by cells expressing E6 or E7 protein. Panel A shows the scheme of the experiment. Panel B shows activation of NKT cells.
  • FIG. 1 shows HEK293 cells expressing CD1d pulsed with a CD1d ligand and then transfected with mRNA encoding HPV-16 type E6 or E7 protein for E6 or E7 protein in cells cultured for a specified period of time. It shows expression (panels A and
  • FIG. 3 shows the antitumor effect of CD1d-expressing NIH3T3 cells pulsed with a CD1d ligand and E6 or E7 protein-expressing cells in a melanoma cell transplant model.
  • FIG. 4 shows the expression level of E6 protein when the E6 protein or E7 protein or a fusion protein thereof is expressed in HEK293 cells.
  • FIG. 4 shows the results of quantifying the E6 protein expression level by Western blotting using an anti-E6 antibody.
  • FIG. 5 shows the expression level of E7 protein when the E6 protein or the E7 protein or a fusion protein thereof is expressed in HEK293 cells.
  • FIG. 5 shows the results of quantifying the E7 protein expression level by Western blotting using an anti-E7 antibody.
  • FIG. 6 shows the antitumor effect of HEK293 cells expressing CD1d and E7-E6-E7 proteins pulsed with the CD1d ligand in a melanoma cell transplant model.
  • FIG. 7 shows that HEK293 cells expressing CD1d and E7-E6-E7 proteins pulsed with a CD1d ligand were administered and reimmunization of E6 and E7 specific CD8T cells with E6 or E7 peptide-supplemented dendritic cells. It is shown as the number of IFN- ⁇ -producing cells (spot number) at the time of.
  • the "subject” can be a mammal, including, for example, humans and non-human mammals.
  • “subjects” include, for example, human subjects (particularly females) infected with HPV (eg, HPV-16 and / or HPV-18) and human subjects with an increased risk of carcinogenesis due to the infection. Includes (especially women) and human subjects (especially women) who have developed cancer due to the infection.
  • treatment is used to include therapeutic treatment and prophylactic treatment.
  • treatment is used to include delaying or stopping the progression of a disease or condition, as well as improving and curing the disease or condition.
  • prevention is used to include suppressing the onset of a disease or condition and reducing its incidence.
  • HPV human papillomavirus
  • HPV-16 is one of the viruses belonging to the papillomavirus family, and is a virus that forms warts called papilloma (or papilloma).
  • HPV-16 and HPV-18 increase the risk of carcinogenicity.
  • About 50% of cervical cancers worldwide have HPV-16 type.
  • HPV-16 has E1 to E7 as early genes and L1 and L2 as late genes. E6 and E7 may be associated with carcinogenesis.
  • the E6 protein has, for example, an HPV-16 type E6 protein, for example, an amino acid sequence corresponding to an amino acid sequence (or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1) registered under GenBank registration number: NP_041325.1. E6 protein can be mentioned.
  • Examples of the E6 protein include an HPV-18 type E6 protein, for example, an E6 protein having an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of GenBank registration number: NP_040310.1 (or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2). Be done.
  • the E7 protein has, for example, an HPV-16 type E7 protein, for example, an amino acid sequence corresponding to an amino acid sequence (or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3) registered under GenBank registration number: NP_041326.1. E7 protein can be mentioned.
  • an amino acid sequence corresponding to an HPV-18 type E7 protein for example, an amino acid sequence registered under GenBank registration number: NP_040311.1 (or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4) can be used.
  • E7 protein having As used herein, the term "corresponding to a certain amino acid sequence" refers to an ortholog of the amino acid sequence and having the same functionality as the protein having the amino acid sequence.
  • the E6 protein and E7 protein have the same sequence as the above amino acid sequence, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more, respectively.
  • E6 and E7 proteins of sex may be included.
  • aAVC artificial adjuvant vector cell
  • CD1d a cell that expresses CD1d and an antigen (eg, E6 protein and E7 protein) and is pulsed with CD1d.
  • Cells pulsed with CD1d can be obtained by culturing cells expressing CD1d with a CD1d ligand. The CD1d ligand that did not adhere to the cells can be removed by washing.
  • CD1d is a protein of the CD1 family and is an MHC class I-like glycoprotein.
  • CD1d can present glycolipids and activate, for example, NKT cells.
  • CD1d includes, for example, human CD1d, eg, a protein having an amino acid sequence registered under GenBank registration number: AAH27926.1.
  • CD1d ligand means a glycolipid that binds to CD1d.
  • the CD1d ligand include ⁇ -GalCer ( ⁇ -galactosylceramide), ⁇ -C-GalCer ( ⁇ -C-galactosylceramide), iGB3 (isoglobotolihexosylceramide), GD3 (ganglioside 3), and GSL-1. ( ⁇ -linked glucuronic acid), GSL-1'SA (galacturonic acid) can be mentioned and used as a CD1d ligand.
  • ⁇ -GalCer and ⁇ -C-GalCer can be preferably used.
  • aAVC When administered to mammals, aAVC activates NKT cells, matures dendritic cells, induces innate immunity, and induces acquired immunity. When aAVC expresses a protein, acquired immunity to the protein is also induced. aAVC induces innate and adaptive immunity using any of dendritic cells, cancer cells, and other cells (eg, somatic cells). aAVC induces innate and adaptive immunity in a subject, whether homologous or allogeneic to the subject. If the aAVC is allogeneic, after innate and adaptive immunity is induced in the subject, the aAVC itself can be eliminated as non-self by the subject's immune system.
  • aAVC By expressing the target protein in aAVC, it is possible to induce adaptive immunity specific to the target protein in the subject to which aAVC is administered.
  • the target protein can be degraded to partial peptides in aAVC, which can induce acquired immunity.
  • aAVC expresses CD1d and is pulsed by the CD1d ligand.
  • the aAVC may have an exogenous gene encoding CD1d operably linked to a control sequence.
  • the aAVC may have an exogenous gene encoding a target protein operably linked to a control sequence.
  • the "cell” is a mammalian cell, for example, a human cell.
  • cells include dendritic cells and non-dendritic cells.
  • cells include tumor cells and non-tumor cells.
  • cells include cancer cells and non-cancer cells.
  • cells include immortalized cells and primary cells.
  • the cells may be allogeneic or allogeneic to the administration subject.
  • examples of cells include human cells and human cell lines, such as human fetal kidney cell lines, such as HEK293 cells.
  • fusion protein refers to a protein containing two or more proteins or partial peptides thereof.
  • two or more proteins can be linked with or without spacers.
  • the spacer can be a peptide, eg, a peptide with a length of 1-20 amino acids, 1-10 amino acids, or 1-5 amino acids.
  • protein A-protein B when protein A and protein B are linked in this order from the N-terminal side in the fusion protein, it is referred to as "protein A-protein B".
  • protein B-protein A when protein B and protein A are linked in this order from the N-terminal side in the fusion protein, it is referred to as "protein B-protein A”.
  • Fusion proteins can be designed by in-frame ligation of genes encoding each of the constituent proteins or their partial peptides.
  • nucleic acid means deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA).
  • Nucleic acids encoding proteins include DNA and mRNA.
  • the DNA can be a cDNA having a sequence obtained by reverse transcription from mRNA.
  • the mRNA may have a nucleic acid modification for stabilization.
  • an "expression vector” comprises a control sequence and a nucleic acid encoding a protein operably linked to the control sequence, and the mRNA encoding the protein is transcribed in cells or in vitro.
  • the expression vector may include, for example, an origin of replication for replication in the cell and a nucleic acid encoding a control sequence and a protein operably linked to the control sequence.
  • the expression vector can have a selectable marker (eg, a drug resistance gene) for selecting the cell into which it has been introduced.
  • the control sequence for expression in mammalian cells is not particularly limited, and examples thereof include the promoter of RNA polymerase II, for example, CMV immediate early stage, HSV thymidine kinase, early and late SV40, retrovirus LTR, and metallotionein I. Promoters such as. Promoters for expression in E. coli include, for example, promoters such as lac, trp, lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, lambda PL, 3-phosphoglycerate kinase.
  • the promoter for expression in vitro is not particularly limited, and examples thereof include SP6, T7, and T3 promoters.
  • Expression vectors include plasmid, phage, phagemid, cosmid, fosmid, artificial chromosomes, retroviruses, lentivirus, measles virus, vaccinia virus, adenovirus, adeno-associated virus, Sendai virus and the like.
  • cancer is a benign and malignant neoplasm, including stage 0, stage 1, stage 2, stage 3, and stage 4 cancers.
  • Cancers include hematopoietic tumors such as solid tumors and hematological malignancies (eg, leukemia).
  • Solid cancers include epithelial cancers and sarcomas.
  • Cancers include leukemia, lymphoma (eg, Hodgkin's disease and non-Hodgkin's lymphoma), multiple myeloma, brain tumor, breast cancer, uterine body cancer, cervical cancer, ovarian cancer, vaginal cancer, esophageal cancer, Gastric cancer, worm drop cancer, colon cancer, liver cancer (eg, hepatocellular carcinoma), biliary cyst cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, adrenal cancer, gastrointestinal stromal tumor, mesopharyngeal tumor (eg Chest, peritoneal, and pericardial), head and neck cancers (eg, pharyngeal cancer, oral cancer, gingival cancer, tongue cancer, buccal mucosa cancer), salivary adenocarcinoma, sinus cancer (eg, upper jaw) Sidral cancer, frontal sinus cancer, sieve bone sinus cancer, butterfly type bone sinus cancer), thyroid cancer, kidney cancer, lung cancer, osteosarcoma, prostate cancer, testis
  • the target protein refers to a protein to which the antigen specificity of acquired immunity induced in a living body is directed.
  • the target protein may be an endogenous protein or an exogenous protein.
  • the target protein can be one or more HPV proteins selected from the group consisting of E6 protein, E7 protein and fusion protein of E6 protein and E7 protein.
  • the E6 and E7 proteins can be, for example, HPV proteins selected from the group consisting of HPV-16 and HPV-18 types.
  • the E6 and E7 protein moieties contained in the fusion proteins of the invention can also be, for example, HPV proteins selected from the group consisting of HPV-16 and HPV-18 types.
  • expressed means that the cell has the protein due to the production of the protein from the nucleic acid encoding the protein in the cell.
  • aAVC expressing the antigens E6 protein and / or E7 protein induces NKT cells and exerts an antitumor effect. Therefore, according to the present invention, there is provided an aAVC expressing the E6 protein and / or the E7 protein, a pharmaceutical composition containing the aAVC, and a pharmaceutical composition containing the aAVC for use in treating cancer.
  • a fusion protein of E6 protein and E7 protein is provided.
  • the fusion protein of the E6 protein and the E7 protein includes a fusion protein selected from the group consisting of E6-E7, E7-E6, E6-E7-E6, and E7-E6-E7, and a protein containing these fusion proteins.
  • the fusion protein of the E6 protein and the E7 protein includes a fusion protein selected from the group consisting of E6-E7, E7-E6, E6-E7-E6, and E7-E6-E7, and these.
  • Nucleic acids eg, DNA or mRNA
  • a fusion protein selected from the group consisting of E6-E7, E7-E6, E6-E7-E6, and E7-E6-E7, and a nucleic acid encoding a protein containing these fusion proteins, respectively.
  • Expression vectors are provided.
  • an expression vector for use in expressing the fusion protein in mammalian cells is provided.
  • an expression vector for use in expressing the fusion protein in Escherichia coli is provided.
  • an expression vector is provided for use in transcribing (and preferably translating) the gene encoding the fusion protein in vitro.
  • the present invention also provides cells having at least one of the fusion proteins.
  • the cells that can be used for aAVC can be mammalian cells, for example human cells.
  • the cells that can be used for aAVC can be dendritic or non-dendritic cells.
  • the cells can be tumor cells or non-tumor cells.
  • the cells that can be used for aAVC can be cancerous or non-cancerous cells.
  • the cells that can be used for aAVC can be immortalized cells or primary cells.
  • the cells that can be used for aAVC can be somatic cells or other cells.
  • the cells that can be used for aAVC may be allogeneic or allogeneic to the administration subject.
  • the cells that can be used for aAVC can be, for example, a human cell line, such as a human fetal kidney cell line, such as HEK293 cells.
  • a human cell line such as a human fetal kidney cell line, such as HEK293 cells.
  • an example of the amino acid sequence of the E6-E7 fusion protein is shown in any of SEQ ID NOs: 5 to 8.
  • an example of the amino acid sequence of the E7-E6 fusion protein is shown in any of SEQ ID NOs: 9 to 12.
  • an example of the amino acid sequence of the E6-E7-E6 fusion protein is shown in SEQ ID NOs: 13 to 20.
  • an example of the amino acid sequence of the E7-E6-E7 fusion protein is shown in SEQ ID NOs: 21 to 28.
  • a linker may be introduced into the protein-protein linkage portion of the fusion protein as appropriate.
  • aAVC expressing a fusion protein of E6 protein and E7 protein which are antigens, induces NKT cells and exerts an antitumor effect. Therefore, according to the present invention, aAVC expressing a fusion protein of E6 protein and E7 protein, a pharmaceutical composition containing the aAVC, and a pharmaceutical composition containing the aAVC for use in treating cancer Provided.
  • the AB fusion protein means a protein in which the A protein and the B protein are linked in this order from the N-terminal, and an example of the acid sequence number of the amino acid sequence is shown in the table.
  • the amino acid sequences in Table 1 may be linked via spacers, or may be linked without spacers.
  • the fusion protein of the present invention for example, a fusion protein which is E7-E6-E7 or a fusion protein containing E7-E6-E7, a nucleic acid encoding the fusion protein, and gene expression containing the nucleic acid.
  • a vector, a human cell or human cell line expressing the fusion protein eg, human fetal kidney cell line, eg, HEK293 cell
  • a human cell or human cell line having the nucleic acid eg, human fetal kidney cell line, eg, HEK293 cell.
  • HEK293 cells are provided ⁇ where the cells or cell lines may further express CD1d ⁇ .
  • a pharmaceutical composition containing a human cell or a human cell line expressing the fusion protein of the present invention and a pharmaceutical composition containing a human cell or a human cell line having a nucleic acid encoding the fusion protein of the present invention.
  • a fusion protein of the present invention for example, a fusion protein which is E7-E6-E7 or a fusion protein containing E7-E6-E7, a nucleic acid encoding the fusion protein, a human expressing the fusion protein.
  • AAVC and a human aAVC having a nucleic acid encoding the fusion protein are provided.
  • a pharmaceutical composition containing the human aAVC is also provided.
  • the E6 protein or E7 protein or the fusion protein of the E6 protein and the E7 protein can be expressed in the cell by introducing an expression vector into the cell.
  • the E6 protein or the E7 protein or the fusion protein of the E6 protein and the E7 protein can also be expressed in the cell by introducing mRNA encoding any one or more of these into the cell.
  • Expression vectors and mRNA can be introduced into cells using methods well known to those skilled in the art. Examples of the introduction method include lipofection, electroporation, and calcium phosphate method.
  • Methods are provided, including introducing the protein into cells.
  • a method for producing aAVC expressing a fusion protein which is E7-E6-E7 or a fusion protein containing E7-E6-E7.
  • a method for producing an aAVC expressing a fusion protein which is E7-E6-E7 or a fusion protein containing E7-E6-E7 includes introducing mRNA encoding the fusion protein into a cell. ..
  • the method for producing aAVC of the present invention may include expressing CD1d in cells and culturing cells expressing CD1d in the presence of a CD1d ligand.
  • the method for producing aAVC of the present invention does not have to include artificial expression of CD1d when the cells express CD1d.
  • the method for producing aAVC of the present invention may include culturing cells expressing CD1d in the presence of a CD1d ligand.
  • a method comprising administering aAVC expressing the human papillomavirus E6 protein and / or E7 protein to a subject in need thereof.
  • a method of treating cancer in a subject in need thereof wherein a therapeutically effective amount of aAVC expressing the human papillomavirus E6 protein and / or E7 protein is administered to the subject.
  • Methods of treating cancer are provided, including.
  • the cancer can be a cancer associated with infection with human papillomavirus.
  • a method comprising administering to a subject in need thereof an aAVC expressing a fusion protein which is E7-E6-E7 or a fusion protein containing E7-E6-E7.
  • a therapeutically effective amount of aAVC that is a method of treating cancer in a subject in need thereof and expresses a fusion protein of E7-E6-E7 or a fusion protein containing E7-E6-E7.
  • a method of treating cancer is provided, including administration of the subject.
  • the use of aAVC expressing the E6 protein and / or E7 protein of human papillomavirus is provided in the manufacture of a medicament for use in treating cancer.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY the use of aAVC expressing the E6 protein and / or E7 protein of human papillomavirus for use in a method for treating cancer is provided.
  • a fusion protein of the invention eg, a fusion protein of E7-E6-E7 or a fusion protein containing E7-E6-E7
  • aAVC that expresses a fusion protein of the present invention for use in a method of treating cancer, for example, a fusion protein that is E7-E6-E7 or a fusion protein containing E7-E6-E7. Will be done.
  • the pharmaceutical composition may contain the aAVC of the present invention and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutical composition can be administered parenterally (eg, intravenous administration, intratumoral administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, intracerebroventricular administration, and cerebrospinal fluid administration).
  • Pharmaceutically acceptable excipients include, for example, buffering agents, tonicity agents, dispersants, thickeners, gelling agents, antioxidants, preservatives, and soothing agents.
  • the aAVC of the present invention can be expected to exert an antiviral effect in a human subject infected with human papillomavirus. Therefore, the medicament or pharmaceutical composition of the present invention is a human subject infected with human papillomavirus (especially female), a human subject having an increased cancer risk due to the infection (especially female), and a human subject (especially female) who has carcinogenic due to the infection. It can be used to treat women).
  • the method of the present invention is a method for treating a human subject (particularly female) infected with human papillomavirus, a human subject (particularly female) having an increased cancer risk due to the infection, and a human subject (particularly female) who has developed cancer due to the infection. Can be.
  • the medicament or pharmaceutical composition of the present invention can be used for treating human papillomavirus infection in a human subject infected with human papillomavirus.
  • Example 1 Preparation of cells expressing various viral proteins of human papillomavirus (HPV) A HEK293 strain expressing various viral proteins of human papillomavirus (HPV) was prepared and pulsed using ⁇ -GalCer.
  • the fusion protein is a fusion protein in which E6 and E7 are linked in this order (E6-E7; having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5), and a fusion protein in which E7 and E6 are linked in this order (E7-).
  • E6 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6
  • E6-E7-E6 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7
  • E7-E6-E7 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7
  • E6, E7, and each of the designed fusion proteins were cloned into the HindIII-EcoRI cleavage site of the pGEM4Z-hPV vector (Promega, Cat # P2161).
  • the Kozak sequence (CCACC) was introduced upstream of the first codon of the gene encoding each protein, the HindIII restriction enzyme recognition site was introduced upstream, and the EcoRI restriction enzyme recognition site was introduced downstream of the stop codon. And incorporated into the vector. In this way, the insertion direction was set to the direction in which transcription was performed by the T7 promoter.
  • In vitro transcription systems using the T7 promoter prepared mRNAs encoding E6, E7 and various fusion proteins.
  • HEK293 cells or NIH3T3 cells expressing CD1d were used (see, for example, J Immunol. 2007; 178: 2853-2861).
  • the medium was AIM-V or RPMI1640 containing 10% FCS and was cultured under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions.
  • the cells were pulsed with ⁇ -GalCer by adding ⁇ -GalCer (500 ng / mL), which is a CD1d ligand, to the medium and further culturing.
  • the medium was changed and the mRNA obtained by the in vitro transcription system was introduced into HEK293 cells or NIH3T3 cells by the electroporation method.
  • E6 and E7 cells were harvested 4 hours, 8 hours, and 16 hours after introduction and the expression levels of E6 and E7 proteins were confirmed by Western blotting. The results were as shown in panels A and B of FIG.
  • Example 2 Immune Response of Cells Expressing CD1d and E6 or E7 Pulsed with CD1d Ligand As shown in Panel A of FIG. 2, mice were intravenously administered with the cells obtained in Example 1. After 3 days, the immune response in the mouse was examined.
  • mRNA encoding E6 or E7 was introduced into cells expressing CD1d pulsed with ⁇ -GalCer, and cells 4 to 12 hours after introduction were collected.
  • the resulting cells (5 ⁇ 10 5 cells) mice (C57BLZ6,6 ⁇ 8 weeks, female) were intravenously administered through the tail vein.
  • the spleen was isolated from the mouse, filtered with a cell strainer, and the erythrocytes were further hemolyzed with ACK lysing buffer to prepare spleen with RPMI containing 5% FCS.
  • Spleen cells were stained with anti-CD19 antibody and CD1d-dimer / Gal and analyzed by flow cytometry. (Results were as shown in panel B of FIG.
  • Example 3 Examination of antitumor effect using lung metastasis model animal
  • the cells prepared in Example 2 were transplanted into a lung metastasis model animal, and the antitumor effect was examined.
  • the B16 melanoma cells were prepared to 3 ⁇ 10 5 / 200 ⁇ l with PBS, and mouse (C57BL / 6,6 ⁇ 8 weeks, female) were intravenously administered through the tail vein.
  • the cells prepared in Example 2 were intravenously administered 3 to 6 hours after the administration of the melanoma cells.
  • PBS was administered.
  • E6-expressing cells prepared using NIH3T3 cells according to Example 2 were administered to the administration group 1.
  • the E7-expressing cells prepared in Example 2 were administered to the administration group 2. Two weeks later, the lungs were removed from the mice and B16 lung metastases were observed. The results were as shown in FIG.
  • Example 4 Preparation of fusion protein of E6 and E7
  • the fusion protein of E6 and E7 was prepared and expressed in HEK293 cells.
  • the fusion protein was introduced into cells as mRNA as described in Example 1.
  • the cells were collected 4 hours after the introduction to obtain a cell lysate, and the expression level of the protein was confirmed by Western blotting.
  • an anti-E6 antibody was used in FIG. 4, and an anti-E7 antibody was used in FIG.
  • each protein was detected by Western blotting, imported into a computer as an image, and analyzed using image analysis software Image Reader LAS-1000 pro.
  • the expression level was determined by preparing a calibration curve from the band density of the specified amount of the E6 standard or E7 standard and evaluating the density of each band to be evaluated. The results were shown in FIGS. 4 and 5 as a ratio to which the expression level of each single-expressing cell was set to 1.
  • # 1 to # 6 correspond to cell lysates below.
  • # 3 E6-E7-expressing HEK293 cells
  • # 6 E7- E6-expressing HEK293 cells
  • the E6-E7 fusion protein showed an E6 expression efficiency about half that of the E6 protein, but the E7-E6-E7 fusion protein showed an E6 expression efficiency equivalent to that of E6.
  • the E6-E7 fusion protein and the E6-E7-E6 fusion protein showed an E7 expression efficiency of one-fifth to one-fourth that of the E7 protein, whereas the E7-E6 The -E7 fusion protein showed more than double the E7 expression efficiency.
  • Example 5 Antitumor effect of fusion protein of E6 and E7
  • a lung metastasis model animal (n ) prepared by transplanting B16 melanoma cells (3 ⁇ 10 5 cells) using the same method as in Example 3.
  • the E7-E6-E7 expressing HEK293 cells (5 ⁇ 10 5 cells) prepared in Example 4 were transplanted into 5 ), and the antitumor effect thereof was examined.
  • the results were as shown in FIG.
  • lung metastasis of melanoma cells was strongly observed in the control group, and the entire lung became black due to melanoma cells, whereas in the E7-E6-E7 administration group, it was caused by melanoma cells. Almost no black color was observed. From this, it was clarified that the E7-E6-E7 expressing cells prepared in the examples can activate the innate immune system and exert an antitumor effect.
  • Example 6 Activation of killer T cells by aAVC E7-E6-E7-expressing HEK293 cells (5 ⁇ 10 5 cells; aAVC-E7-6-7) prepared in Example 4 were administered to mice, and 7 days later. Remove the CD8 alone positive T cells (5 ⁇ 10 5 cells) from the spleen, IFN-gamma from cells when the cells were stimulated for 24 hours with dendritic cells by adding E6 or E7 peptide (1 ⁇ 10 5 cells) The number of produced CD8T cells (number of spots) was examined using the ELISPOT assay. The production of IFN- ⁇ is usually considered to correlate with the killing effect function of killer T cells, and this cytocan production measurement is widely used. The results were as shown in FIG.
  • E7-E6-E7 fusion protein is a fusion protein suitable for fusing and expressing E6 and E7.
  • E7-E6-E7 expressing cells can activate the innate immune system to exert an antitumor effect
  • CD8T cells that react E6-specifically and E7-specifically to produce IFN- ⁇ .
  • the E7-E6-E7 expressing cells activate the innate immune system and react E6-specifically and E7-specifically, and CD8T cells producing IFN- ⁇ are induced, thereby having an antitumor effect. It is thought that it will exert.
  • E7-E6-E7 fusion protein When the E7-E6-E7 fusion protein is expressed in aAVC, E6 and E7 are decomposed intracellularly to produce small partial peptides derived from E6 and E7, respectively. Therefore, it can be seen that aAVC expressing the E7-E6-E7 fusion protein exerts an antitumor effect in the same manner as aAVC expressing E6 and aAVC expressing E7.

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Abstract

本発明は、免疫系を賦活化する細胞および当該細胞を含む医薬組成物を提供する。本発明によれば、ヒトパピローマウイルスの初期遺伝子Ｅ６タンパク質およびＥ７タンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質とＣＤ１ｄタンパク質を有する哺乳動物細胞であって、ＣＤ１ｄリガンドによってパルスされた細胞が提供される。本発明によればまた、Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質、当該タンパク質をコードする核酸、およびその遺伝子発現ベクターが提供される。

Description

免疫系を賦活化する細胞および当該細胞を含む医薬組成物
　本発明は、免疫系を賦活化する細胞および当該細胞を含む医薬組成物に関する。
　ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、子宮頸がんの原因として知られるウイルスである。ＨＰＶは、子宮頸がんの他には、外因上皮内腫瘍および膣上皮内腫瘍の原因であり、これらは進行するとそれぞれ外陰がんおよび膣がんとなる。また、近年では中咽頭癌の発症リスクとしても知られている。子宮頸がんの原因となるＨＰＶの代表は、１６型および１８型であり、子宮頸がんの原因の約６５％を１６型および１８型のＨＰＶが占める。１６型および１８型のＨＰＶによる子宮頸がんは、他の高リスク型の子宮頸がんに比べて、がん化が早い。２０代から３０代の子宮頸がんでは、約８割から９割が、１６型および１８型のＨＰＶを原因とする。
　ＣＤ１ｄと標的タンパク質を共発現する細胞をＣＤ１ｄリガンドでパルスして得られる細胞は、人工アジュバントベクター細胞（ａＡＶＣ）と呼ばれ、投与された対象において自然免疫と、当該標的タンパク質に対する獲得免疫を誘発する（特許文献１～３および非特許文献１）。
ＷＯ２００７／０９７３７０ ＷＯ２０１０／０６１９３０ ＷＯ２０１３／０１８７７８
Ｓｈｉｍｉｚｕ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　２００７，　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　Ｖｏｌ．　１７８，　ｐｐ２８５３－２８６１
　本発明は、免疫系を賦活化する細胞および当該細胞を含む医薬組成物を提供する。
　本発明によれば、Ｅ６タンパク質またはＥ７タンパク質を発現する人工アジュバントベクター細胞（ａＡＶＣ）は、ＮＫＴ細胞を活性化し、さらにＥ６およびＥ７抗原特異的Ｔ細胞を誘導し、抗腫瘍効果を示した。本発明によればまた、Ｅ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質のうち、Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質がこの順番で連結した融合タンパク質は、細胞内におけるタンパク質発現が高かった。本発明はこのような知見に基づく発明である。
　従って、本発明によれば、例えば、以下に示される発明（例えば、産業上利用可能な発明）が提供される。
（１）ヒトパピローマウイルスの初期遺伝子Ｅ６タンパク質およびＥ７タンパク質並びにＥ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質とＣＤ１ｄタンパク質を発現させた哺乳動物細胞であって、ＣＤ１ｄリガンドによってパルスされた細胞。
（２）ヒトパピローマウイルスの初期遺伝子Ｅ６タンパク質およびＥ７タンパク質を別々のタンパク質として発現させた、上記（１）に記載の細胞。
（３）ヒトパピローマウイルスの初期遺伝子Ｅ６タンパク質およびＥ７タンパク質を融合タンパク質として発現させた、上記（２）に記載の細胞。
（４）融合タンパク質が、Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質である、上記（３）に記載の細胞。
（５）Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質。
（６）Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質をコードする核酸。
（７）Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質をコードする核酸を含む、当該融合タンパク質の発現ベクター。
（８）上記（１）～（４）のいずれかに記載の細胞、上記（５）に記載の融合タンパク質、上記（６）に記載の核酸、または上記（７）に記載のベクターを含む、医薬組成物。
（９）ヒトパピローマウイルスに感染したヒト対象に投与するための、上記（８）に記載の医薬組成物。
（１０）ヒト対象が、ヒトパピローマウイルスに起因するがんを有する、上記（９）に記載の医薬組成物。
（１１）ヒトパピローマウイルスに起因するがんが、子宮頸がん、肛門がん、および膣がんからなる群から選択されるがんである、上記（１０）に記載の医薬組成物。
図１は、ＣＤ１ｄを発現するＨＥＫ２９３細胞をＣＤ１ｄリガンドでパルスし、その後、ＨＰＶ－１６型のＥ６またはＥ７タンパク質をコードするｍＲＮＡをトランスフェクションして、指定した時間培養した細胞におけるＥ６またはＥ７タンパク質の発現を示す（パネルＡおよびＢ）。パネルＣおよびＤは、ＣＤ１ｄの細胞表面上の発現をフローサイトメトリーによって分析した結果を示す。 図２は、ＣＤ１ｄを発現するＨＥＫ２９３細胞をＣＤ１ｄリガンドでパルスし、Ｅ６またはＥ７タンパク質を発現する細胞によるＮＫＴ細胞の増幅を調べた結果を示す。パネルＡは、実験のスキームを示す。パネルＢは、ＮＫＴ細胞の活性化を示す。 図３は、ＣＤ１ｄを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞をＣＤ１ｄリガンドでパルスし、Ｅ６またはＥ７タンパク質を発現する細胞の、メラノーマ細胞移植モデルにおける抗腫瘍効果を示す。 図４は、Ｅ６タンパク質もしくはＥ７タンパク質またはこれらの融合タンパク質をＨＥＫ２９３細胞に発現させたときのＥ６タンパク発現量を示す。図４は、Ｅ６タンパク発現量を抗Ｅ６抗体を用いたウェスタンブロット法によって定量した結果である。図中において、＃１：Ｅ６発現ＨＥＫ２９３細胞、＃２：Ｅ７発現ＨＥＫ２９３細胞、＃３：Ｅ６－Ｅ７発現ＨＥＫ２９３細胞、＃４：Ｅ６－Ｅ７－Ｅ６発現ＨＥＫ２９３細胞、＃５：Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７発現ＨＥＫ２９３細胞、および＃６：Ｅ７－Ｅ６発現ＨＥＫ２９３細胞である。発現量は＃１を１とした場合の比率（Ｅ６蛋白質発現比）として表示している。 図５は、Ｅ６タンパク質もしくはＥ７タンパク質またはこれらの融合タンパク質をＨＥＫ２９３細胞に発現させたときのＥ７タンパク発現量を示す。図５は、Ｅ７タンパク発現量を抗Ｅ７抗体を用いたウェスタンブロット法によって定量した結果である。図中において、＃１：Ｅ６発現ＨＥＫ２９３細胞、＃２：Ｅ７発現ＨＥＫ２９３細胞、＃３：Ｅ６－Ｅ７発現ＨＥＫ２９３細胞、＃４：Ｅ６－Ｅ７－Ｅ６発現ＨＥＫ２９３細胞、＃５：Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７発現ＨＥＫ２９３細胞、および＃６：Ｅ７－Ｅ６発現ＨＥＫ２９３細胞である。発現量は＃２を１とした場合の比率（Ｅ７蛋白質発現比）として表示している。 図６は、ＣＤ１ｄリガンドでパルスされたＣＤ１ｄおよびＥ７－Ｅ６－Ｅ７タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞の、メラノーマ細胞移植モデルにおける抗腫瘍効果を示す。 図７は、ＣＤ１ｄリガンドでパルスされたＣＤ１ｄおよびＥ７－Ｅ６－Ｅ７タンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞を投与し、Ｅ６およびＥ７特異的ＣＤ８Ｔ細胞の誘導をＥ６又はＥ７ペプチドを添加した樹状細胞で再免疫した際のＩＦＮ－γ産生細胞数（ｓｐｏｔ数）として示す。
発明の具体的な説明
　本明細書では、「対象」とは、哺乳動物であり得、例えば、ヒトおよび非ヒト哺乳動物が含まれる。本明細書では、「対象」には、例えば、ＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ－１６型および／またはＨＰＶ－１８型）に感染したヒト対象（特に女性）および当該感染により上昇した発がんリスクを有するヒト対象（特に女性）、並びに当該感染により発がんしたヒト対象（特に女性）が含まれる。
　本明細書では、「処置」とは、治療的処置および予防的処置を含む意味で用いられる。本明細書では、「治療」とは、疾患もしくは状態の進行の遅延または停止、並びに疾患もしくは状態の改善および治癒を含む意味で用いられる。本明細書では「予防」とは、疾患または状態の発症を抑制すること、および、その発症率を低下させることを含む意味で用いられる。
　本明細書では、「ヒトパピローマウイルス」（ＨＰＶ）とは、パピローマウイルス科に属するウイルスの一つであり、パピローマ（または乳頭腫）と呼ばれるイボを形成させるウイルスである。ＨＰＶとしては、１８０以上の遺伝子型が存在するが、中でもＨＰＶ－１６型とＨＰＶ－１８型が発がん性リスクを高める。全世界の子宮頸がんの約５０％がＨＰＶ－１６型を有する。ＨＰＶ－１６型は、初期遺伝子としてＥ１～Ｅ７を有し、後期遺伝子としてＬ１およびＬ２を有する。Ｅ６およびＥ７が発がんと関連し得る。Ｅ６タンパク質としては、例えば、ＨＰＶ－１６型のＥ６タンパク質、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿０４１３２５．１の下で登録されたアミノ酸配列（または配列番号１に記載のアミノ酸配列）に対応するアミノ酸配列を有するＥ６タンパク質が挙げられる。Ｅ６タンパク質としてはまた、例えば、ＨＰＶ－１８型のＥ６タンパク質、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿０４０３１０．１のアミノ酸配列（または配列番号２に記載のアミノ酸配列）に対応するアミノ酸配列を有するＥ６タンパク質が挙げられる。Ｅ７タンパク質としては、例えば、ＨＰＶ－１６型のＥ７タンパク質、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿０４１３２６．１の下で登録されたアミノ酸配列（または配列番号３に記載のアミノ酸配列）に対応するアミノ酸配列を有するＥ７タンパク質が挙げられる。Ｅ７タンパク質としてはまた、例えば、ＨＰＶ－１８型のＥ７タンパク質、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿０４０３１１．１の下で登録されたアミノ酸配列（または配列番号４に記載のアミノ酸配列）に対応するアミノ酸配列を有するＥ７タンパク質が挙げられる。本明細書では、「あるアミノ酸配列に対応する」とは、当該アミノ酸配列のオーソログであって、当該アミノ酸配列を有するタンパク質と同質の機能性を有するタンパク質をいう。Ｅ６タンパク質およびＥ７タンパク質としてはそれぞれ、例えば、上記アミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有するＥ６タンパク質およびＥ７タンパク質が含まれ得る。配列同一性は、例えば、ＮＥＥＤＬＥ　ｐｒｏｇｒａｍ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９７０、Ｖｏｌ．４８、ｐ．４４３－４５３）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味し得る。前記のパラメータは以下の通りであり得る。Ｇａｐ　ｐｅｎａｌｔｙ　＝　１０、Ｅｘｔｅｎｄ　ｐｅｎａｌｔｙ　＝　０．５、およびＭａｔｒｉｘ　＝　ＥＢＬＯＳＵＭ６２。
　本明細書では、「人工アジュバントベクター細胞」（ａＡＶＣ）とは、ＣＤ１ｄと抗原（例えば、Ｅ６タンパク質およびＥ７タンパク質）を発現する細胞であって、ＣＤ１ｄでパルスされた細胞を意味する。ＣＤ１ｄでパルスされた細胞は、ＣＤ１ｄを発現する細胞をＣＤ１ｄリガンドと共に培養することによって得られ得る。細胞に付着しなかったＣＤ１ｄリガンドは、洗浄によって除去することができる。ＣＤ１ｄは、ＣＤ１ファミリーのタンパク質であり、ＭＨＣクラスＩ様の糖タンパク質である。ＣＤ１ｄは、糖脂質を提示して、例えば、ＮＫＴ細胞を活性化さ得る。ＣＤ１ｄとしては、例えば、ヒトのＣＤ１ｄ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＡＨ２７９２６．１の下で登録されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＣＤ１ｄリガンドは、ＣＤ１ｄに結合する糖脂質を意味する。ＣＤ１ｄリガンドとしては、例えば、α－ＧａｌＣｅｒ（α－ガラクトシルセラミド）、α－Ｃ－ＧａｌＣｅｒ（α－Ｃ－ガラクトシルセラミド）、ｉＧＢ３（イソグロボトリヘキソシルセラミド）、ＧＤ３（ガングリオシド３）、ＧＳＬ－１（α－結合型グルクロン酸）、ＧＳＬ－１′ＳＡ（ガラクツロン酸）が挙げられ、ＣＤ１ｄリガンドとして用いられ得る。ＣＤ１ｄリガンドとしては、例えば、α－ＧａｌＣｅｒ、α－Ｃ－ＧａｌＣｅｒが好ましく用いられ得る。
　ａＡＶＣは、哺乳動物に投与されると、ＮＫＴ細胞を活性化し、樹状細胞を成熟化させ、自然免疫を誘導すると共に獲得免疫を誘導する。ａＡＶＣがタンパク質を発現する場合、当該タンパク質に対する獲得免疫も誘導される。ａＡＶＣは、樹状細胞、がん細胞、およびそれ以外の細胞（例えば、体細胞）のいずれを用いても、自然免疫および獲得免疫を誘導する。ａＡＶＣは、投与対象と同種同系であっても同種異系であっても、対象において自然免疫および獲得免疫を誘導する。ａＡＶＣが同種異系の場合、対象において自然免疫および獲得免疫を誘導した後に、ａＡＶＣ自体は、対象の免疫系により非自己として排除され得る。標的タンパク質をａＡＶＣに発現させることによって、ａＡＶＣを投与された対象において、当該標的タンパク質特異的な獲得免疫を誘導させることができる。標的タンパク質は、ａＡＶＣにおいては、部分ペプチドに分解され得、部分ペプチドが獲得免疫を誘発し得る。ａＡＶＣは、ＣＤ１ｄを発現し、かつＣＤ１ｄリガンドによってパルスされている。ａＡＶＣは、制御配列に作動可能に連結したＣＤ１ｄをコードする外来性の遺伝子を有し得る。ａＡＶＣは、制御配列に作動可能に連結した標的タンパク質をコードする外来性の遺伝子を有し得る。
　本明細書では、「細胞」は、哺乳動物の細胞であり、例えば、ヒト細胞であり得る。細胞としては、樹状細胞および非樹状細胞が挙げられる。細胞としては、腫瘍細胞および非腫瘍細胞が挙げられる。細胞としては、がん細胞および非がん細胞が挙げられる。細胞としては、不死化細胞および初代細胞が挙げられる。細胞としては、体細胞およびそれ以外の細胞が挙げられる。細胞は、投与対象に対して、同種同系であってもよく、同種異系であってもよい。細胞としては、例えば、ヒト細胞およびヒト細胞株、例えば、ヒト胎児腎細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。
　本明細書では、「融合タンパク質」とは、２つ以上のタンパク質またはその部分ペプチドを含むタンパク質を言う。融合タンパク質において、２つ以上のタンパク質は、スペーサーを挟んで、またはスペーサーを挟まずに連結され得る。スペーサーは、ペプチド、例えば、１～２０アミノ酸長、１～１０アミノ酸長、または１～５アミノ酸長のペプチドであり得る。本明細書では、融合タンパク質において、タンパク質Ａとタンパク質ＢがＮ末端側からこの順番で連結する場合、「タンパク質Ａ－タンパク質Ｂ」と表記する。本明細書では、融合タンパク質において、タンパク質Ｂとタンパク質ＡがＮ末端側からこの順番で連結する場合、「タンパク質Ｂ－タンパク質Ａ」と表記する。融合タンパク質は、これを構成する各タンパク質またはその部分ペプチドをコードする遺伝子をインフレームで連結することによって設計することができる。
　本明細書では、「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を意味する。タンパク質をコードする核酸としては、ＤＮＡおよびｍＲＮＡが挙げられる。ＤＮＡは、ｍＲＮＡから逆転写して得られる配列を有するｃＤＮＡであり得る。ｍＲＮＡは、安定化のための核酸修飾を有していてもよい。
　本明細書では、「発現ベクター」とは、制御配列と制御配列に作動可能に連結したタンパク質をコードする核酸を含み、細胞中で、または、試験管内で、当該タンパク質をコードするｍＲＮＡを転写させることができるベクターを意味する。発現ベクターは、例えば、細胞中で複製するための複製起点、および制御配列と制御配列に作動可能に連結したタンパク質をコードする核酸を含み得る。発現ベクターは、これを導入された細胞を選択するための選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子）を有することができる。哺乳動物細胞で発現させるための制御配列としては、特に限定されないが例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのプロモーターが挙げられ、例えば、ＣＭＶ即時早期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、早期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスのＬＴＲ、メタロチオネインＩなどのプロモーターが挙げられる。大腸菌で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ラムダＰＬ、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、などのプロモーターが挙げられる。試験管内で発現させるためのプロモーターとしては、特に限定されないが例えば、ＳＰ６、Ｔ７、およびＴ３プロモーターが挙げられる。発現ベクターとしては、プラズミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、人工染色体、レトロウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびセンダイウイルスなどが挙げられる。
　本明細書では、「がん」とは、良性および悪性の新生物であり、ステージ０、ステージ１、ステージ２、ステージ３、およびステージ４のがんを含む。がんとしては、固形がんおよび血液がん（例えば、白血病）などの造血器腫瘍が挙げられる。固形がんとしては、上皮がんおよび肉腫が挙げられる。がんとしては、白血病、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキンリンパ腫）、多発性骨髄腫、脳腫瘍、乳がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、膣がん、食道がん、胃がん、虫垂がん、大腸がん、肝がん（例えば、肝細胞がん）、胆のうがん、胆管がん、膵臓がん、副腎がん、消化管間質腫瘍、中皮腫（例えば、胸膜、腹膜、および心膜）、頭頸部がん（例えば、咽頭がん、口腔がん、歯肉がん、舌がん、頬粘膜がん）、唾液腺がん、副鼻腔がん（例えば、上顎洞がん、前頭洞がん、篩骨洞がん、蝶型骨洞がん）、甲状腺がん、腎臓がん、肺がん、骨肉腫、前立腺がん、精巣腫瘍、腎細胞がん、膀胱がん、横紋筋肉腫、皮膚がん、肛門がん、神経芽細胞腫、中枢神経がん、ウィルムス腫瘍、生殖細胞がん、軟組織肉腫、グリオーマ、およびグリオブラストーマが挙げられる。ヒトパピローマウイルスに起因するがんとしては、例えば、子宮頸がん、肛門がん、および膣がんが挙げられる。
　本発明によれば、「標的タンパク質」とは、生体において誘発される獲得免疫の抗原特異性が向けられるタンパク質をいう。標的タンパク質は、内因性のタンパク質であってもよく、外因性のタンパク質であってもよい。本明細書では、標的タンパク質は、Ｅ６タンパク質、Ｅ７タンパク質およびＥ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質からなる群から選択される１以上のＨＰＶのタンパク質であり得る。Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質は、例えば、ＨＰＶ－１６型およびＨＰＶ－１８型からなる群から選択されるＨＰＶのタンパク質であり得る。本発明の融合タンパク質に含まれるＥ６タンパク質部分およびＥ７タンパク質部分もまた、例えば、ＨＰＶ－１６型およびＨＰＶ－１８型からなる群から選択されるＨＰＶのタンパク質であり得る。
　本明細書では、「発現する」とは、細胞内でタンパク質をコードする核酸から当該タンパク質が産生したことによって当該細胞が当該タンパク質を有することを意味する。
　本発明によれば、抗原であるＥ６タンパク質および／またはＥ７タンパク質を発現するａＡＶＣは、ＮＫＴ細胞を誘導し、抗腫瘍効果を奏する。従って、本発明によれば、Ｅ６タンパク質および／またはＥ７タンパク質を発現するａＡＶＣ、当該ａＡＶＣを含む医薬組成物、および当該ａＡＶＣを含む、がんを処置することに用いるための医薬組成物が提供される。
　本発明によれば、Ｅ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質が提供される。Ｅ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質としては、Ｅ６－Ｅ７、Ｅ７－Ｅ６、Ｅ６－Ｅ７－Ｅ６、およびＥ７－Ｅ６－Ｅ７からなる群から選択される融合タンパク質、並びにこれらの融合タンパク質を含むタンパク質が挙げられる。本発明によれば、Ｅ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質としては、Ｅ６－Ｅ７、Ｅ７－Ｅ６、Ｅ６－Ｅ７－Ｅ６、およびＥ７－Ｅ６－Ｅ７からなる群から選択される融合タンパク質、並びにこれらの融合タンパク質を含むタンパク質をそれぞれコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）が提供される。本発明によれば、Ｅ６－Ｅ７、Ｅ７－Ｅ６、Ｅ６－Ｅ７－Ｅ６、およびＥ７－Ｅ６－Ｅ７からなる群から選択される融合タンパク質、並びにこれらの融合タンパク質を含むタンパク質をそれぞれコードする核酸を含む、発現ベクターが提供される。本発明によれば、哺乳動物細胞において上記融合タンパク質を発現させることに用いるための、発現ベクターが提供される。本発明によれば、大腸菌において上記融合タンパク質を発現させることに用いるための、発現ベクターが提供される。本発明によれば、インビトロにおいて上記融合タンパク質をコードする遺伝子を転写させること（および好ましくは翻訳させること）に用いるための、発現ベクターが提供される。本発明によればまた、上記融合タンパク質の少なくとも１以上を有する細胞が提供される。ａＡＶＣに用いられ得る細胞は、哺乳動物の細胞であり、例えば、ヒト細胞であり得る。ａＡＶＣに用いられ得る細胞は、樹状細胞または非樹状細胞であり得る。細胞は、腫瘍細胞または非腫瘍細胞であり得る。ａＡＶＣに用いられ得る細胞は、がん細胞または非がん細胞であり得る。ａＡＶＣに用いられ得る細胞は、不死化細胞または初代細胞であり得る。ａＡＶＣに用いられ得る細胞は、体細胞またはそれ以外の細胞であり得る。ａＡＶＣに用いられ得る細胞は、投与対象に対して、同種同系であってもよく、同種異系であってもよい。ａＡＶＣに用いられ得る細胞は、例えば、ヒト細胞株、例えば、ヒト胎児腎細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞であり得る。
　ここで、Ｅ６－Ｅ７融合タンパク質のアミノ酸配列の一例は、配列番号５～８のいずれかに示される。また、Ｅ７－Ｅ６融合タンパク質のアミノ酸配列の一例は、配列番号９～１２のいずれかに示される。また、Ｅ６－Ｅ７－Ｅ６融合タンパク質のアミノ酸配列の一例は、配列番号１３～２０に示される。また、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７融合タンパク質のアミノ酸配列の一例は、配列番号２１～２８に示される。これらの融合タンパク質は、細胞内で発現しさえすれば、樹状細胞に貪食された際に樹状細胞内で小さなペプチドに分解され、これによりＨＰＶに対する免疫系が誘導されると考えられる。したがって、適宜、融合タンパク質におけるタンパク質間の連結部にはリンカーが導入されていてもよい。
　本発明によれば、抗原であるＥ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質を発現するａＡＶＣは、ＮＫＴ細胞を誘導し、抗腫瘍効果を奏する。従って、本発明によれば、Ｅ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質を発現するａＡＶＣ、当該ａＡＶＣを含む医薬組成物、および当該ａＡＶＣを含む、がんを処置することに用いるための医薬組成物が提供される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記表１において、Ａ－Ｂ融合タンパク質は、Ｎ末端から、Ａタンパク質およびＢタンパク質がこの順番で連結したタンパク質を意味し、そのアミノ酸配列の酸配列番号の一例が表中に記載されている。上記表１のアミノ酸配列は、スペーサーを介して連結されていてもよく、スペーサーを介さずに連結されていてもよい。
　従って、本発明によれば、本発明の融合タンパク質、例えば、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７である融合タンパク質もしくはＥ７－Ｅ６－Ｅ７を含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をコードする核酸、当該核酸を含む遺伝子発現ベクター、当該融合タンパク質を発現するヒト細胞またはヒト細胞株（例えば、ヒト胎児腎細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞）、当該核酸を有するヒト細胞またはヒト細胞株（例えば、ヒト胎児腎細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞）が提供される｛ここで、当該細胞または細胞株は、さらにＣＤ１ｄを発現していてもよい｝。本発明によればまた、本発明の融合タンパク質を発現するヒト細胞またはヒト細胞株を含む医薬組成物、および本発明の融合タンパク質をコードする核酸を有するヒト細胞またはヒト細胞株を含む医薬組成物が提供される。本発明によればさらに、本発明の融合タンパク質、例えば、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７である融合タンパク質もしくはＥ７－Ｅ６－Ｅ７を含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をコードする核酸、当該融合タンパク質を発現するヒトａＡＶＣ、および当該融合タンパク質をコードする核酸を有するヒトａＡＶＣが提供される。本発明によればさらにまた、当該ヒトａＡＶＣを含む医薬組成物もまた、提供される。
　Ｅ６タンパク質もしくはＥ７タンパク質またはＥ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質は、細胞に発現ベクターを導入することによって当該細胞に発現させることができる。Ｅ６タンパク質もしくはＥ７タンパク質またはＥ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質はまた、細胞にこれらのいずれか１以上をコードするｍＲＮＡを導入することによって当該細胞に発現させることができる。発現ベクターやｍＲＮＡは当業者に周知の方法を用いて細胞に導入することができる。導入方法としては、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法などが挙げられる。
　本発明によれば、Ｅ６タンパク質もしくはＥ７タンパク質またはＥ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質を発現するａＡＶＣまたは当該ａＡＶＣを含む医薬組成物を製造する方法であって、当該タンパク質または融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞に導入することを含む、方法が提供される。本発明によれば、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７である融合タンパク質もしくはＥ７－Ｅ６－Ｅ７を含む融合タンパク質を発現するａＡＶＣを製造する方法が提供される。本発明によれば、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７である融合タンパク質もしくはＥ７－Ｅ６－Ｅ７を含む融合タンパク質を発現するａＡＶＣを製造する方法は、当該融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞に導入することを含む。本発明のａＡＶＣを製造する方法は、細胞にＣＤ１ｄを発現させることと、ＣＤ１ｄを発現する細胞をＣＤ１ｄリガンド存在下で培養することとを含み得る。本発明のａＡＶＣを製造する方法は、細胞がＣＤ１ｄを発現している場合には、ＣＤ１ｄを人為的に発現させることを含まなくてもよい。本発明のａＡＶＣを製造する方法は、ＣＤ１ｄを発現する細胞をＣＤ１ｄリガンド存在下で培養することを含み得る。
　本発明によれば、ヒトパピローマウイルスのＥ６タンパク質もしくはＥ７タンパク質またはその両方を発現するａＡＶＣを、その必要のある対象に投与することを含む、方法が提供される。本発明によれば、がんをその必要のある対象において処置する方法であって、ヒトパピローマウイルスのＥ６タンパク質もしくはＥ７タンパク質またはその両方を発現するａＡＶＣの治療上有効量を当該対象に投与することを含む、がんを処置する方法が提供される。本発明によれば、がんは、ヒトパピローマウイルスの感染を伴うがんであり得る。
　本発明によれば、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７である融合タンパク質もしくはＥ７－Ｅ６－Ｅ７を含む融合タンパク質を発現するａＡＶＣを、その必要のある対象に投与することを含む、方法が提供される。本発明によれば、がんをその必要のある対象において処置する方法であって、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７である融合タンパク質もしくはＥ７－Ｅ６－Ｅ７を含む融合タンパク質を発現するａＡＶＣの治療上有効量を当該対象に投与することを含む、がんを処置する方法が提供される。
　本発明によれば、がんを処置することに用いるための医薬の製造における、ヒトパピローマウイルスのＥ６タンパク質もしくはＥ７タンパク質またはその両方を発現するａＡＶＣの使用が提供される。本発明によれば、がんを処置する方法に用いるための、ヒトパピローマウイルスのＥ６タンパク質もしくはＥ７タンパク質またはその両方を発現するａＡＶＣの使用が提供される。
　本発明によれば、がんを処置することに用いるための医薬の製造における、本発明の融合タンパク質、例えば、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７である融合タンパク質もしくはＥ７－Ｅ６－Ｅ７を含む融合タンパク質を発現するａＡＶＣの使用が提供される。本発明によれば、がんを処置する方法に用いるための、本発明の融合タンパク質、例えば、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７である融合タンパク質もしくはＥ７－Ｅ６－Ｅ７を含む融合タンパク質を発現するａＡＶＣが提供される。
　本発明によれば、医薬組成物は、本発明のａＡＶＣと薬学的に許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。本発明によれば、医薬組成物は、非経口投与（例えば、静脈内投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、脳室内投与、および髄液内投与）され得る。薬学的に許容可能な賦形剤としては、例えば、緩衝剤、等張化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、抗酸化剤、保存剤、および無痛化剤が挙げられる。
　本発明によれば、ヒトパピローマウイルスに感染したヒト対象において、本発明のａＡＶＣは、抗ウイルス作用を発揮すると期待できる。したがって、本発明の医薬または医薬組成物は、ヒトパピローマウイルスに感染したヒト対象（特に女性）および当該感染により上昇した発がんリスクを有するヒト対象（特に女性）、並びに当該感染により発がんしたヒト対象（特に女性）を処置することに用いることができる。本発明の方法は、ヒトパピローマウイルスに感染したヒト対象（特に女性）および当該感染により上昇した発がんリスクを有するヒト対象（特に女性）、並びに当該感染により発がんしたヒト対象（特に女性）を処置する方法であり得る。また、本発明の医薬または医薬組成物は、ヒトパピローマウイルスに感染したヒト対象において、ヒトパピローマウイルス感染を処置することに用いることができる。
実施例１：ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の各種ウイルスタンパク質を発現した細胞の調製
　ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の各種ウイルスタンパク質を発現したＨＥＫ２９３株を調製し、α－ＧａｌＣｅｒを用いてパルスした。
　ＨＰＶの各種ウイルスタンパク質として、ＨＰＶ１６型の初期遺伝子Ｅ６およびＥ７によりそれぞれコードされるＥ６およびＥ７タンパク質を用い、加えて、これらの融合タンパク質を設計して用いた。融合タンパク質は、Ｅ６とＥ７とをこの順番で連結させた融合タンパク質（Ｅ６－Ｅ７；配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する）、Ｅ７とＥ６とをこの順番で連結させた融合タンパク質（Ｅ７－Ｅ６；配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する）、Ｅ６とＥ７とＥ６とをこの順番で連結させた融合タンパク質（Ｅ６－Ｅ７－Ｅ６；配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する）、およびＥ７とＥ６とＥ７とをこの順番で連結させた融合タンパク質（Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７；配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する）を設計して用いた。
　Ｅ６、Ｅ７、および設計した融合タンパク質それぞれをｐＧＥＭ４Ｚ－ｈＰＶベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｃａｔ＃Ｐ２１６１）のＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＩ切断部位にクローニングした。クローニングに際しては、各タンパク質をコードする遺伝子の最初のコドンの上流にＫｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣ）を導入し、その上流にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位を導入し、終止コドンの下流にＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を導入して、ベクターに組み込んだ。このようにして、挿入方向は、Ｔ７プロモーターにより転写がなされる方向とした。Ｔ７プロモーターを用いたインビトロ転写系によって、Ｅ６、Ｅ７および各種融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを調製した。
　タンパク質発現細胞としては、ＣＤ１ｄを発現するＨＥＫ２９３細胞またはＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた（例えば、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２００７；１７８：２８５３－２８６１参照）。培地はＡＩＭ－Ｖまたは１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を用い、３７℃、５％　ＣＯ２条件下で培養した。ＣＤ１ｄリガンドであるα－ＧａｌＣｅｒ（５００　ｎｇ／ｍＬ）を培地に添加し、さらに培養を行うことによって、細胞にα－ＧａｌＣｅｒをパルスした。培地を交換し、インビトロ転写系によって得られたｍＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞またはＮＩＨ３Ｔ３細胞にエレクトロポレーション法によって導入した。Ｅ６およびＥ７に関しては、導入４時間後、８時間後、および１６時間後に、細胞を回収して、Ｅ６、およびＥ７タンパク質の発現量をウェスタンブロット法によって確認した。結果は、図１のパネルＡおよびＢに示される通りであった。
　図１のパネルＡおよびＢに示されるように、ＨＥＫ２９３細胞におけるＨＰＶのＥ６タンパク質およびＥ７タンパクの質がそれぞれ確認された。得られたＨＥＫ２９３細胞のＣＤ１ｄの発現をＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗ＣＤ１ｄ抗体をＦＡＣＳ　Ｃａｒｉｂｕｒを用いてフローサイトメトリー法により確認した。結果は、図１のパネルＣおよびＤに示される通りであった。いずれのＨＥＫ２９３細胞においてもＣＤ１ｄの発現が確認された。
実施例２：ＣＤ１ｄリガンドでパルスしたＣＤ１ｄとＥ６またはＥ７とを発現する細胞の免疫応答
　図２のパネルＡに示されるように、マウスに対して実施例１で得られた細胞を静脈内投与し、３日後に当該マウス体内における免疫応答を調べた。
　実施例１と同様に、α－ＧａｌＣｅｒをパルスした、ＣＤ１ｄを発現する細胞にＥ６またはＥ７をコードするｍＲＮＡを導入し、導入４～１２時間後の細胞を回収した。得られた細胞（５×１０５細胞）をマウス（Ｃ５７ＢＬＺ６、６～８週、雌）に尾静脈より静脈内投与した。投与３日後にマウスから脾臓を単離して、セルストレイナーで濾し、さらに赤血球をＡＣＫ　ｌｙｓｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒで溶血し、５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩで脾細胞を調製した。抗ＣＤ１９抗体およびＣＤ１ｄ－ｄｉｍｅｒ／Ｇａｌを用いて脾細胞を染色し、フローサイトメトリーにより分析した。（結果は、図２のパネルＢに示される通りであった。
　図２のパネルＢに示されるように、細胞投与群においてＣＤ１９陰性ＣＤ１ｄ－ｄｉｍｅｒ／Ｇａｌ陽性のＮＫＴ細胞群の増加が認められた。このことから、投与した細胞は、ＮＫＴ細胞の賦活化能を有することが明らかとなった。
実施例３：肺転移モデル動物を用いた抗腫瘍効果の検討
　本実施例では、実施例２で調製した細胞を肺転移モデル動物に移植して、その抗腫瘍効果を検討した。
（肺転移モデル動物の作製、評価）
　Ｂ１６メラノーマ細胞をＰＢＳで３×１０５／２００μｌに調製し、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６，６～８週，雌）に尾静脈より静脈内投与した。これに対して、メラノーマ細胞の投与後３～６時間後に実施例２で調製した細胞を静脈内投与した。対照群としては、ＰＢＳを投与した。投与群１には、実施例２に準じてＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて調製したＥ６発現細胞を投与した。投与群２には、実施例２で調製したＥ７発現細胞を投与した。２週間後にマウスから肺を取り出し、Ｂ１６の肺転移を観察した。結果は、図３に示される通りであった。
　図３に示されるように、対照群では、メラノーマ細胞の肺転移が強く観察され、肺全体がメラノーマ細胞により黒色を呈するのに対して、投与群１（Ｅ６発現細胞投与群）および投与群２（Ｅ７発現細胞投与群）では、メラノーマ細胞に起因する黒色がほとんど認められなかった。このことから、実施例で作製したＥ６発現細胞およびＥ７発現細胞はそれぞれ、抗腫瘍効果を有することが明らかとなった。実施例２および３の結果から、Ｅ６を発現する、α－ＧａｌＣｅｒでパルスしたＣＤ１ｄ発現細胞は、ＮＫＴ細胞をインビボで活性化し、自然免疫を活性化すると共に、抗腫瘍効果を奏することが明らかとなった。
実施例４：Ｅ６とＥ７との融合タンパク質の調製
　本発明では、Ｅ６とＥ７との融合タンパク質を調整し、ＨＥＫ２９３細胞において発現させた。融合タンパク質は、実施例１に記載された通りにｍＲＮＡとして細胞に導入した。導入４時間後に細胞を回収し、細胞溶解物を得て、ウェスタンブロット法によってタンパク質の発現量を確認した。抗体は、図４では、抗Ｅ６抗体を用い、図５では、抗Ｅ７抗体を用いた。図１と同様に、ウェスタンブロット法で各々のタンパクを検出し、画像としてコンピュータに取り込み、画像解析ソフトＩｍａｇｅ　Ｒｅａｄｅｒ　ＬＡＳ－１０００　ｐｒｏを用いて分析した。発現量は、指定された量のＥ６標品またはＥ７標品のバンドの濃さから検量線を作製し、評価したい各バンドの濃さを評価することによって求めた。結果は、各々の単独発現細胞の発現量を１とし、それに対する比として図４および５に示した。
　図４および５において、＃１～＃６は以下細胞の溶解物に対応する。
＃１：Ｅ６発現ＨＥＫ２９３細胞
＃２：Ｅ７発現ＨＥＫ２９３細胞
＃３：Ｅ６－Ｅ７発現ＨＥＫ２９３細胞
＃４：Ｅ６－Ｅ７－Ｅ６発現ＨＥＫ２９３細胞
＃５：Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７発現ＨＥＫ２９３細胞
＃６：Ｅ７－Ｅ６発現ＨＥＫ２９３細胞
　図４に示されるように、Ｅ６－Ｅ７融合タンパク質は、Ｅ６タンパク質の半分程度のＥ６発現効率を示したが、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７融合タンパク質は、Ｅ６と同等のＥ６発現効率を示した。
　図５に示されるように、Ｅ６－Ｅ７融合タンパク質およびＥ６－Ｅ７－Ｅ６融合タンパク質は、Ｅ７タンパク質の５分の１から４分の１のＥ７発現効率を示したのに対して、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７融合タンパク質は、その倍以上のＥ７発現効率を示した。
実施例５：Ｅ６とＥ７との融合タンパク質の抗腫瘍効果
　実施例３と同様の方法を用いて、Ｂ１６メラノーマ細胞（３×１０５細胞）を移植することによって作製した肺転移モデル動物（ｎ＝５）に実施例４で調製したＥ７－Ｅ６－Ｅ７発現ＨＥＫ２９３細胞（５×１０５細胞）を移植して、その抗腫瘍効果を検討した。結果は図６に示される通りであった。図６に示されるように、対照群では、メラノーマ細胞の肺転移が強く観察され、肺全体がメラノーマ細胞により黒色を呈するのに対して、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７投与群では、メラノーマ細胞に起因する黒色がほとんど認められなかった。このことから、実施例で作製したＥ７－Ｅ６－Ｅ７発現細胞は、自然免疫系を賦活化して抗腫瘍効果を発揮することができることが明らかとなった。
実施例６：ａＡＶＣによるキラーＴ細胞の活性化
　マウスに実施例４で調製したＥ７－Ｅ６－Ｅ７発現ＨＥＫ２９３細胞（５×１０５細胞；ａＡＶＣ－Ｅ７－６－７）を投与し、７日後に脾臓からＣＤ８単独陽性Ｔ細胞（５×１０５細胞）を取りだし、当該細胞をＥ６又はＥ７ペプチドを添加した樹状細胞（１×１０５細胞）で２４時間刺激した際の細胞からのＩＦＮ－γ産生ＣＤ８Ｔ細胞数（スポット数）をＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて調べた。このＩＦＮ－γの産生は、通常キラーＴ細胞の殺傷効果機能と相関するとされ、このサイトカン産生測定が広く用いられている。結果は図７に示される通りであった。図７に示されるように、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７投与群では、Ｅ６特異的およびＥ７特異的に反応し、ＩＦＮ－γを産生するＣＤ８Ｔ細胞が検出された。このことから、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７を発現するａＡＶＣは、Ｅ６及びＥ７特異的キラーＴ細胞を誘導することが明らかとなった。
　以上から、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７融合タンパク質は、Ｅ６とＥ７とを融合させて発現させるのに適した融合タンパク質であることが明らかとなった。また、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７発現細胞は、自然免疫系を賦活化して抗腫瘍効果を発揮することができることに加えて、Ｅ６特異的およびＥ７特異的に反応し、ＩＦＮ－γを産生するＣＤ８Ｔ細胞が誘導されることも明らかとなった。このことから、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７発現細胞は、自然免疫系を賦活化すると共に、Ｅ６特異的およびＥ７特異的に反応し、ＩＦＮ－γを産生するＣＤ８Ｔ細胞が誘導し、これによって抗腫瘍効果を発揮すると考えられる。なお、ａＡＶＣにおいて、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７融合タンパク質を発現させると、細胞内でＥ６とＥ７が分解されてＥ６およびＥ７にそれぞれ由来する小さな部分ペプチドが生じる。従って、Ｅ７－Ｅ６－Ｅ７融合タンパク質を発現するａＡＶＣは、Ｅ６を発現するａＡＶＣやＥ７を発現するａＡＶＣと同様に抗腫瘍効果を発揮すると分かる。

Claims (11)

  1. 　ヒトパピローマウイルスの初期遺伝子Ｅ６タンパク質およびＥ７タンパク質並びにＥ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質とＣＤ１ｄタンパク質を発現する哺乳動物細胞であって、ＣＤ１ｄリガンドによってパルスされた細胞。
  2. 　ヒトパピローマウイルスの初期遺伝子Ｅ６タンパク質およびＥ７タンパク質を別々のタンパク質として発現する、請求項１に記載の細胞。
  3. 　Ｅ６タンパク質とＥ７タンパク質との融合タンパク質を発現する、請求項２に記載の細胞。
  4. 　融合タンパク質が、Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質である、請求項３に記載の細胞。
  5. 　Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質。
  6. 　Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質をコードする核酸。
  7. 　Ｅ７タンパク質、Ｅ６タンパク質、およびＥ７タンパク質をこの順番で含む融合タンパク質をコードする核酸を含む、当該融合タンパク質の発現ベクター。
  8. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞、請求項５に記載の融合タンパク質、請求項６に記載の核酸、または請求項７に記載のベクターを含む、医薬組成物。
  9. 　ヒトパピローマウイルスに感染したヒト対象に投与するための、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 　ヒト対象がが、ヒトパピローマウイルスに起因するがんを有する、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 　ヒトパピローマウイルスに起因するがんが、子宮頸がん、肛門がん、および膣がんからなる群から選択されるがんである、請求項１０に記載の医薬組成物。

     
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