JP2014527053A - がんの治療および予防のための、ｐ６２に関する方法および組成物 - Google Patents

Abstract

がんの予防および治療および関連方法のための新規なｐ６２組成物が記載される。本発明はまた、ｐ６２の抗癌活性を増加させる修飾ｐ６２組成物を提供する。
【選択図】図４

Description

［関連特許出願への相互参照］
本出願は、米国仮出願第６１／５２１，２８０号（出願日：２０１１年８
月８日、タイトル：「Ｐ６２ ａｓ ａｎ Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔ」、ロシア特許出願第２０１２１０８９２７号（出願日：２０１２年３月１１日）の恩恵を主張する。本明細書中、同文献全体をあらゆる目的のために参考のために援用する。

［発明の分野］
本発明は、がんの予防および治療の分野に関する。より詳細には、本発明は、ｐ６２組成物を用いて抗がん反応を活性化させることによるがんの予防および治療に関連する。

がんは、米国および欧州連合において第２位の一般的死因になっており（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｉｔａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．６０，Ｎｏ．４，２０１２）、また、欧州連合における４５〜６４歳の男性および女性の一般的死因の１位となっている。２００８年１月１日時点における米国における推定がん患者数は、浸潤性腫瘍の場合において男性が５，５０６，０００人であり、女性が６，４５２，０００人である。

がんワクチンが研究されており、フェーズＩＩＩ有効性試験の段階に来ているものもある（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、ＮａｔＭｅｄ．，１０：９０９（２００４年）、Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．、９：６７（２００９）３、４）。いくつかのがんワクチンは、固形腫瘍（メラノーマ、前立腺癌、肺癌、乳癌および結腸直腸癌）に用いられる。高転移能がある種類のがん（例えば、卵巣癌またはいくつかの種類の乳癌）に属する腫瘍を外科手術によって除去した患者、およびがんリスクが高いとされる既知の突然変異の保有者（例えば、乳癌および卵巣癌に関するＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子の突然変異、卵巣癌に関するＲＡＤ５１遺伝子）の２つの高リスク集団が、特に予防的抗がんワクチンからの恩恵を得る。高リスクの女性コホートに対する選択的予防ワクチン接種は、公衆衛生における重要な課題である。

ｐ６２は多機能タンパク質であり、ユビキチンに結合し、核因子カッパＢ（ＮＦ−ｋＢ）シグナル伝達経路の活性を調節する。このタンパク質は、ＴＮＦ受容体関連因子６と共に足場／アダプタータンパク質として機能して、上流シグナルに応答してＮＦ−ｋＢ活性を仲介する。この遺伝子については、同一のイソ型または異なるイソ型をコードする選択的にスプライスされた転写産物変異体が、特定されている。

ｐ６２は６２ｋＤａタンパク質であり、チロシンキナーゼＬｃｋｐ５６のｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインにホスホチロシン独立様態で結合していることが特定されている。（Ｐａｒｋｅｔら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、９２：１２３３８（１９９５））。ｐ６２の一次配列が公知であり、（Ｊｏｕｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、９３：５９９１、（１９９６））、ユビキチンに結合することも示されている（Ｖａｄｌａｍｕｄｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７１：２０２３５（１９９６））。ヒトｐ６２のＤＮＡ配列であるヒトｓｅｑｕｅｓｔｏｓｏｍｅ１（ＳＱＳＴＭ１）、転写産物変異体１、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００３９００．４において入手することができる。ヒトｐ６２のアミノ酸配列であるＳｅｑｕｅｓｔｏｓｏｍｅ１イソ型１［ヒト］は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００３８９１．１において入手することができる。ｐ６２は、ユビキチンＣ末端加水分解酵素とも、２６Ｓプロテアソーム複合体のＳ５ａサブユニットともホモロジーを有さず、ユビキチンと非共有結合することが知られる唯一のタンパク質である。これらの結果は、ｐ６２が新規のクラスのユビキチン結合タンパク質に属していることを示唆する。

ｐ６２は、脳および肝臓中のタンパク質凝集疾患中に見受けられる封入体の成分であり、ｐ６２は、細胞質内封入体中に隔離され、ｓｅｑｕｅｓｔｏｓｏｍｅと呼ばれる。これらのｐ６２含有タンパク質凝集は、オートファジーによって分解される。このｐ６２の機能は、ハンチンチンに起因する細胞死に対して保護効果を持ち得ることが示唆されている（Ｂｊoｒｋoｙら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１７１：６０３（２００５））。ｐ６２遺伝子の突然変異は、散発性および家族性のパジェット疾患に関連する（Ｊｅｎｎｙ Ｃｈｕｎｇら、Ｓｅｍｉｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、４１：６１９（２０１２））、代謝性骨疾患）。

本明細書中に記載されるのは、（ａ）ｐ６２ポリペプチドまたは（ｂ）ｐ６２をコードする核酸を有する薬剤を対象へ投与することにより、対象におけるがんの１つ以上の症状を治療、緩和、改善、軽減、発症遅延、進行抑制、重症度低減および／または発生率低減するための方法である。この薬剤は、（ａ）１つ以上のドメイン欠失、（ｂ）配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するｐ６２をコードする核酸、または（ｃ）配列番号２と少なくとも９８％の同一性を有するｐ６２ポリペプチドを含む。このドメイン欠失方法としては、以下のうち１つ以上とすることができる：ＰＢ１、ＺＺ、ＮＬＳ２、ＴＢ、ＮＬＳ１、ＮＥＳ、ＬＩＲ、ＫＩＲおよびＵＢＡ。この方法は、融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸をそれぞれ用い得る。この方法は、翻訳後修飾を受けたｐ６２ポリペプチドを用い得る。

この薬剤は、以下の経路のうちいずれかを介して投与することができる：非経口、経口、経鼻的、経直腸的、経皮的、膣内、またエアロゾルを介したは吸入。非経口経路は、以下のうちいずれかであり得る：血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、眼球内、腹腔内、皮内および皮下。あるいは、臓器または腫瘍へ投与してもよい。本発明に係る方法は、以下のうちいずれかおよび全てをさらに含み得る：アジュバントの投与、共刺激成分の投与、抑制または負の調節免疫機構を遮断する１つ以上の分子の投与、または対象への１つ以上の抗癌治療の投与。

この方法は、対象における任意のがん、例えば、乳癌、肺癌、前立腺癌、胃癌、結腸直腸癌、皮膚癌、頭部および頚部の癌、気管支癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、口腔または咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、卵巣癌、子宮癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、肉腫および血液組織のがんの治療に用いることができる。対象としては、がんと診断された対象、過去にがん治療を受けていた対象、がんの家族歴がある対象、またはがんの素因を有する対象が挙げられる。

この方法は、ｐ６２をコードする核酸である薬剤を含むことができ当該核酸は、プラスミドまたはウイルスベクターに含まれ得る。方法はまた、核酸ベースの免疫付与を向上させるための戦略を含み得る。

また、本明細書における薬剤は、対象におけるがんの１つ以上の症状を治療、緩和、改善、軽減、発症遅延、進行抑制、重症度低減および／または発生率低減のための薬剤であり、ｐ６２ポリペプチドもしくはｐ６２をコードする核酸、少なくとも１つ以上のドメイン欠失を有するもの、または、ｐ６２ポリペプチドの１つ以上のドメインまたはｐ６２の１つ以上のドメインをコードする核酸によって構成される。１つ以上のドメインは、以下のうちのいずれかであり得る：ＰＢ１、ＺＺ、ＮＬＳ２、ＴＢ、ＮＬＳ１、ＮＥＳ、ＬＩＲ、ＫＩＲ、およびＵＢＡ。

この薬剤は、融合ポリペプチドまたはコードする核酸をそれぞれ含み得る。ｐ６２ポリペプチドは、翻訳後修飾され得る。

薬剤は、１つ以上のアジュバント、１つ以上の共刺激成分、または抑制または負の調節免疫機構、１つ以上の化学療法分子または抗血管形成分子を遮断する１つ以上の分子をさらに含み得る。

薬剤は、さらにｐ６２をコードする核酸とすることができ、さらにこの核酸を含むプラスミドまたはウイルスベクターとすることができる。

また、本明細書における組成物は、対象への投与に適した薬剤を含む組成物である。

ヒトｐ６２の野生型核酸配列（配列番号１）を示す。

前記核酸配列によってコードされるヒトｐ６２の野生型アミノ酸配列（配列番号２）を示す。

ヒトｐ６２のドメイン構造を図示する。

ｐ６２もしくはＨＥＲ２（陽性対照）のＤＮＡワクチンまたはベクターのみ（陰性対照）を注射したマウスについてのマウス乳癌モデルの経時的腫瘍形成を示す。

ｐ６２免疫動物からの腫瘍のヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色の結果を示す。上パネルの矢印は、複数の壊死巣を指す。下パネルの矢印は、炎症細胞網を指す。

ＨＥＲ２免疫動物およびｐ６２免疫動物からの腫瘍の免疫組織の化学的染色を示す。左パネルはＨＥ染色を示し、中央パネルは抗ＣＤ３染色を示し、右パネルは抗ＣＤ１１ｂ染色を示す。

Ｔ５ラット乳癌モデルにおけるｐ６２ＤＮＡワクチン投与の時系列を図示する。

Ｔ５移植可能な乳癌に罹患しているラットに、ｐ６２ワクチンを接種したラットおよび対照ラットにおける腫瘍容積の経時的変化を示す。

Ｔ５移植可能な乳癌に罹患しているラットに、ｐ６２ワクチンを接種したラットおよび対照ラットにおける腫瘍成長抑制の経時的変化を示す。

Ｔ５移植可能な乳癌に罹患しているラットに、ｐ６２ワクチンを接種したラットおよび対照ラットにおけるラット生存率の経時的変化を示す。

Ｔ５移植可能な乳癌に罹患しているラットに、ｐ６２ワクチンを接種したラットおよび対照ベクターワクチンを接種したラットから得た腫瘍切片を示す。

Ｔ５移植可能な乳癌に罹患しているラットに、ｐ６２ワクチンを接種したラットおよび対照ベクターワクチンを接種したラットからの腫瘍切片のヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色の結果を示す。

ｐ６２ワクチンを接種したマウスと、対照ベクターワクチンを接種したマウスとの間のルイス肺癌転移数の比較を示す。

本明細書に記載されるのは、癌治療のためのｐ６２組成物および方法である。理論に縛られることを望まず、本発明者らは、ｐ６２をコードする核酸を対象へ投与することにより、腫瘍性細胞を攻撃するホスト免疫防御機構をが刺激されることを発見した。その結果、ｐ６２ポリペプチド（単数または複数）をコードするＤＮＡワクチンまたはｐ６２ポリペプチドを対象に投与することにより、抗がん免疫反応を刺激することができる。

本明細書中で用いられる「ｐ６２ポリペプチド」という用語は、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質全長のポリペプチドを意味する。この用語は、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質の全てのホモログ、アナログ、フラグメントまたは誘導体を含む。一実施形態において、単離ｐ６２ポリペプチドは、図２に示すアミノ酸配列を有する（配列番号２）。「ｐ６２をコードする核酸」とは、ｐ６２ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。

いくつかの実施形態における対象はヒトである。また、他の実施形態における対象はヒト以外の哺乳類である（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、シカ、イヌ、ネコ、ネズミまたはマウス）。

アミノ酸配列全長に加えて、本発明のポリペプチドは、ｐ６２ポリペプチドのフラグメントまたはトランケーション、アナログおよびホモログならびに本明細書中に記載のようなそのトランケーションを含む。前記フラグメントは、全長ポリペプチドの少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５または少なくとも３０のアミノ酸残基のペプチドを含み得る。

１つ以上のアミノ酸またはｐ６２／ＳＱＳＴＭ１タンパク質のアミノ酸配列から一部が欠損したものも含まれる。欠失したアミノ酸は、隣接していてもよく、隣接していなくてもよい。欠失突然変異を含むアナログの下限長さは、約１０、約２０、約５０、または約１００のアミノ酸である。

いくつかの実施形態において、ｐ６２ポリペプチドは、１つ以上の欠失ドメインを有する。理論に縛られることを望まずに、本発明者らは、ｐ６２ポリペプチドの１つ以上のドメインを欠失させることにより、免疫反応を方向付けるためのよりコンパクトかつ操作可能なポリペプチドが得られることを見出した。例えば、ｐ６２ポリペプチドのドメインのうち１つ以上を撹乱または除去することにより、よりコンパクトな分子に免疫原性を保持させることができ（当該欠失または撹乱されたドメインが免疫原性に貢献しない場合は向上させることができる）、宿主の抗体に提供されるエピトープの重量当たりの数を多くすることができる。加えて、他の細胞プロセスまたは固有の細胞内タンパク質の分解に関係するドメインの除去または並び替えを行うことにより、その抗がん効果を向上させることができる。ｐ６２ポリペプチドは、以下の表１および図３に示すようなドメイン構造を有する。

いくつかの実施形態におけるｐ６２ポリペプチドは、以下の表２に示すようにｐ６２の核酸領域に対応するコドンに欠損が設けられている（インフレーム欠失）。

例えば、ヌクレオチド１０２から１２２において開始し、ヌクレオチド１６７〜１８３において終了する核酸配列の欠失は、いずれもＺＺ欠失とみなされる。従って、例えば、１１０〜１７５はＺＺ欠失である。インフレーム欠失の作成技術は、当業者にとって周知である。

いくつかの実施形態において、ｐ６２ポリペプチド（または核酸によってコードされたｐ６２ポリペプチド）は、上記ドメインのうち１つ以上を有する。いくつかの実施形態において、ｐ６２ポリペプチド（または核酸によってコードされるｐ６２ポリペプチド）は、上記ドメインのうち２つ以上を有し、さらなる実施形態においては、野生型ｐ６２ポリペプチドとはＮ末端〜Ｃ末端の配列順序が異なるポリペプチドを有する。

本明細書中の「生物活性がある」または「免疫活性がある」という表現は、本発明に係るポリペプチドが、野生型ポリペプチドと類似の構造的機能（ただし同レベルである必要はない）、および／または類似の調節機能（ただし同レベルである必要はない）、および／または類似の生化学的機能（ただし同レベルである必要はない）、および／または免疫活性（ただし同レベルである必要はない）を有することを意味する

本明細書中の「欠失」という用語は、アミノ酸配列の変化として定義され、１つ以上のアミノ酸残基が野生型タンパク質と比較して欠失している状態を指す。

本明細書中の「挿入」または「付加」とは、野生型タンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸残基が付加されることによる変化を意味する。

本明細書中の「置換」とは、１つ以上のアミノ酸を野生型タンパク質とは異なるアミノ酸にそれぞれ置き換えることを意味する。いくつかの実施形態における置換突然変異は、Ｃ１４５ＲまたはＱ４１８Ｒである。

本明細書中の「変異体」とは、野生型タンパク質に対して、と１つ（またはそれ以上の）アミノ酸の置換、欠失または付加（またはこれらの任意の組み合わせ）を有するポリペプチドを意味する（例えば、対立遺伝子変異）、ただし、その結果得られるタンパク質が、本発明において用いられる野生型タンパク質と比較した場合に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の免疫原性活性を保持する限りである。例えば、本発明に包含されるポリペプチドの変異体としては、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する変異体が挙げられる。

配列の同一性またはホモロジーは、当該分野において公知の標準的な技術を用いて決定することができる（例えば、Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２；３８７−３９５（１９８４）またはＢＬＡＳＴＸプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３−４１０））。アライメントは、アライメントすべき配列中への隙間の導入を含み得る。加えて、本明細書中開示されるタンパク質よりも多数または少数のアミノ酸を含む配列の場合、同一性（％）は、全アミノ酸数に対する同一アミノ酸数に基づいて決定される。

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドの変異体または誘導体は、アミノ酸配列の疎水性／親水性を維持する。保存的アミノ酸置換は、例えば１、２または３〜１０、２０または３０のアミノ酸の置換であって、当該置換後の配列が、本発明に係る免疫原として機能する能力を保持する場合に行うことができる。アミノ酸置換は、例えば、血漿半減期の増加などの非自然的に発生するアナログを用いることもできる。保存的置換は、当該分野において公知である。

本明細書中アミノ酸配列に関して用いられる「誘導体」という用語は、本発明に係るポリペプチドの化学修飾を意味する。

このような修飾の非限定的な例としては、カルボキシル末端または残基含有カルボキシル側鎖の脂肪族エステルまたはアミド、ヒドロキシル基含有残基のＯ−アシル誘導体、およびアミノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基のＮ−アシル誘導体（例えば、リジンまたはアルギニン）が挙げられるが、これらに限定されない。

さらなる修飾を挙げると、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と共役されたポリペプチドの生産や、本発明に係るポリペプチドの化学合成時にＰＥＧを加えることがある。

ポリペプチドまたはその一部の修飾は、特定キャリアへの化学結合や穏やかなホルマリン処理などの還元／アルキル化も含み得る。

本明細書中の「修飾」という用語は、ポリペプチドへの翻訳後修飾の存在を意味する。「（修飾）」という表記は、当該ポリペプチドが任意選択的に修飾されていることを意味する、すなわち、当該ポリペプチドは、修飾または無修飾であり得る。

「翻訳後修飾」および「修飾」という用語は、ポリペプチド鎖の一部を形成した後のアミノ酸に対する天然または非天然によるアミノ酸の修飾を意味する。この用語に含まれるものを、例示目的のために挙げると、ｉｎ ｖｉｖｏでの翻訳と同時の修飾、ｉｎ ｖｉｖｏでの翻訳後の修飾、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳語の修飾がある。

本発明に係るポリペプチドの他の誘導体を挙げると、非天然アミノ酸残基、またはホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホスレオニン残基などのリン酸化アミノ酸残基をの取り入れたものが挙げられる。他の可能な修飾としては、スルホン化、ビオチン化、または他の成分、特に、リン酸基に類似する分子形状を有するもの、が挙げられる。

誘導体には、グリコシル化されたポリペプチドも含まれる。これらは、多様な代替的真核生物ホスト発現システムにおける合成および処理時、またはさらなる処理ステップ時におけるグリコシル化パターンの修飾により、行うことができる。グリコシル化修飾物を生産する方法としては、前記の処理を通常実行する細胞から得られたグリコシル化酵素（例えば、哺乳類グリコシル化酵素）へｐ６２ポリペプチドを曝露させることが含まれる。あるいは、脱グリコシル化酵素を用いて、真核生物発現システムでの生産時に付着した糖を除去することもできる。また、コード配列に対して、グリコシル化サイト（単数または複数）を付加、またはグリコシル化サイトを欠失または無能化させてもよい。さらに、グリコシル化が望ましくない場合、タンパク質を原核生物を宿主とする発現システムで生産してもよい。

本発明のポリペプチドの変異体および／または誘導体は、化学合成によってまたは部位特異的変異誘発によって調製することができる（Ｇｉｌｌｍａｎら、Ｇｅｎｅ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ３２８：７３１（１９８７）またはＩｎｎｉｓ（Ｅｄ．）、１９９０、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）またはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ；Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：４８７（１９８８））、例えば、本発明のｐ６２ポリペプチドをコードする核酸の修飾のためにＤａｕｇｈｅｒｔｙらによって例示されたもの（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：２４７１（１９９１））によって調整することができる。

別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、そのＮ末端に異種シグナル配列を有することができる。異種シグナル配列を用いることにより、特定のホスト細胞（例えば、哺乳類ホスト細胞）において、融合タンパク質の発現および／または分泌を増加させることができる。シグナル配列は典型的には、核となる疎水性アミノ酸残基であって、分泌工程における１以上の切断段階を有する分泌工程により成熟タンパク質からは切断されるアミノ酸残基により特徴づけられる。このようなシグナルペプチドは、分泌経路を通過させるためにシグナル配列を成熟タンパク質から切断させるプロセシングサイトを有する。よって、本発明は、シグナル配列がタンパク分解性により切断されたポリペプチド（すなわち、切断生成物）だけでなく、シグナル配列を有する前記ポリペプチドに関する。

本発明に係るポリペプチドは、安定性および／または反応性を向上させるために、自然変異により得られたアミノ酸配列における１つ以上の多様性を取り入れることができる。さらに、Ｄアミノ酸、非天然アミノ酸またはアミノ酸類似体を置換または付加することにより、本発明の範囲内の修飾ｐ６２ポリペプチドを調製することができる。

本発明のポリペプチドは、上記をコードするヌクレオチド配列を適切な発現システムにおいて発現することにより、調製することができる。

本発明に係るポリペプチドを調製する方法として、所望のアミノ酸配列の全体または一部を化学合成することによる調整が、追加的または代替的方法として挙げられる。例えば、ポリペプチドをペプチド固相合成法によって合成し、樹脂から切断し、調製用高性能液体クロマトグラフィーによって精製することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．）。この合成ポリペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列（例えば、エドマン分解手順）によって確認することができる。さらに、ｐ６２ポリペプチドまたはその任意の一部のアミノ酸配列を直接合成時に変更したり、および／または、化学的方法により他のサブユニットまたはその任意の一部からの配列と組み合わせたりすることにより、変異体ポリペプチドを調製することもできる。

本発明に係るポリペプチドの任意のホモログ、誘導体または変異体の免疫活性の測定方法は、当該分野において周知である。

本明細書中の「融合タンパク質」という用語は、２つ以上の異なるタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を意味する。典型的には、融合タンパク質は、当該分野において周知のｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え技術により得られる。

さらなる実施形態において、本発明の融合タンパク質は、タンパク質精製の促進、組換えタンパク質の発現の増加、または組換えタンパク質の溶解性の増加を可能にするために、さらにポリペプチドドメインを追加することができる。このような精製／発現／溶解性を促進するドメインとしては、固定化金属上の精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレート化ペプチド（ＰｏｒａｔｈＪ（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ３−．２６３２８ １）、固定免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、およびＦＬＡＧＳ延長／親和性精製システムにおいて用いられるドメイン（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。精製ドメインとｐ６２ポリペプチドとの間に、因子Ｘａまたはエンテロキナーゼの包含（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）などの切断可能なリンカー配列を挿入することは、精製促進において有用である。

さらなる融合発現ベクターとして、ｐＧＥＸが（Ｐｈａｒｍａｃｉ、ａ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ Ｊ ）があり、これらは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＢ結合タンパク質、またはタンパク質Ａそれぞれを標的組換えタンパク質へと融合させる。ＥＢＶ、ＢＫＶ、および他のエピソーム発現ベクター（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ）も利用可能である。

特定の実施形態において、ｐ６２ポリペプチドをコードする核酸分子が用いられる。核酸分子は、１つ以上のｐ６２ポリペプチドもしくは、その一部（例えば、ドメインを任意の順序でコードするフラグメントまたは１つ以上のドメインが欠失または撹乱されたポリペプチド）、またはこれらの誘導体をコードするヌクレオチド配列を含み得る、またはそのようなヌクレオチド配列からなり、例えばＡＴＣＣに寄託したもの挿入したＤＮＡに含まれるものが挙げられる。「核酸配列」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を意味する。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知のベースアナログのうち任意のものから形成された分子を含む（例を非限定的に挙げると、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプセウドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２、２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケウオシン、５’メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プセウドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プセウドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、および２、６−ジアミノプリンなどがある）。

本発明の特定の実施形態では、ベクターを用いてポリペプチドをコードする核酸配列を細胞へ伝達する。ベクターは任意の分子であり、ホスト細胞への核酸配列の伝達に用いられる。特定の場合において、発現ベクターが用いられる。発現ベクターは核酸分子であり、ホスト細胞の導入および／または伝搬に適しており、伝達された核酸配列の発現および／または制御を行う核酸配列を有する。発現には、転写、翻訳およびスプライシング（イントロンが存在する場合）が含まれるが、これらに限定されるものではない。。典型的な発現ベクターは、ポリペプチドをコードする異種核酸配列へ動作可能に連結された１つ以上のフランキング配列を有する。フランキング配列は、例えば、相同（すなわち、ホスト細胞と同じ種および／または系統）、異種（すなわち、ホスト細胞の種または系統以外の種からのもの）、ハイブリッド（すなわち、１つよりも多くのソースからのフランキング配列の組み合わせ）、または合成とすることができる。

フランキング配列は、コード配列の複製、転写および／または翻訳を発生させることができ、コード配列へ動作可能に連結されることが好ましい。本明細書中の「動作可能に連結される」という表現は、ポリヌクレオチド要素が機能的な関係を以て連結される様子を意味する。例えば、コード配列の発言に影響するプロモーターまたはエンハンサーは、コード配列へと動作可能に連結される。しかし、フランキング配列は、正常に機能している限り、必ずしもコード配列と隣接していなくてもよい。よって、例えば、プロモーター配列とコード配列との間に介在する未翻訳でありかつ転写された配列が存在することができ、プロモーター配列をコード配列へ動作可能に連結されたものとみなすことができる。同様に、エンハンサー配列をコード配列からの上流または下流に配置して、配列の転写に影響を与えることができる。

特定の実施形態において、フランキング配列を転写調節領域とし、標的細胞における遺伝子発現を高レベルにすることが好ましい。転写調節領域は、例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、リプレッサー、またはこれらの組み合わせを含み得る。転写調節領域は、構成的、組織特異的、細胞型特異的（すなわち、別の種と比較して１種の組織または細胞において、より高レベルの転写を行うもの）または調節可能（すなわち、分子との相互作用に応答する）なものであってもよい。転写調節領域の起源は、任意の原核または真核生物生物、任意の脊椎動物または無脊椎動物生物、または任意の植物であり得る（ただし、フランキング配列が、細胞内の核酸の転写を発生させることにより当該細胞中において機能する場合）。多種多様な転写調節領域を、本発明の実施に用いることができる。

適切な転写調節領域としては、例えば、ＣＭＶプロモーター（すなわち、ＣＭＶ前初期プロモーター）、真核生物遺伝子（すなわち、エストロゲン誘導トリ卵白遺伝子、インターフェロン遺伝子、グルコ−コルチコイド誘導チロシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子、およびチミジンキナーゼ遺伝子）由来のプロモーター、主要な初期および後期アデノウイルス遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ２９０：３０４−１０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’長末端反復（ＬＴＲ）に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−９７）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ２９６：３９−４２）、原核生物の発現ベクター（例えば、ベータラクタマーゼプロモーター（ＶＩＩＩａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７５：３７２７−３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：２１−２５）が挙げられる。組織および／または細胞型特異的転写制御領域としては、例えば、膵臓腺房細胞中において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４、Ｃｅｌｌ３８：６３９−４６、Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）、ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７、Ｈｅｐａｌｏｌｏｇｙ７：４２５−５１５）、膵臓ベータ細胞中において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ３１５：１１５−２２）、リンパ細胞中において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４、Ｃｅｌｌ、３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７：１４３６−４４）、精巣、乳、リンパおよびマスト細胞中のマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６、Ｃｅｌｌ４５：４８５−９５）、肝臓中のアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、ＧｅｎｅｓおよびＤｅｖｅｌ．１：２６８−７６）、肝臓中のα−フェトタンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５：５３−５８）、肝臓中のα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）、ミエロイド細胞中のβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ４６：８９−９４）、脳中のオリゴデンドロサイト細胞中のミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ４８：７０３−１２）、骨格筋中のミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−８６）、視床下部中の性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−７８）、およびメラノーマ細胞中のチロシナーゼプロモーター（Ｈａｒｔ、Ｉ．Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９９６ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；２３（１）：１５４−８；Ｓｉｄｅｒｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ１９９８Ｓｅｐ−Ｏｃｔ、５（５）：２８１−９１）などが挙げられる。例えば、特定の分子、または条件（例えば、光、熱、放射、テトラサイクリンまたはヒートショックタンパク質）の存在において活性化される誘導プロモーターも利用することができる（例えば、ＷＯ００／１０６１２を参照）。他の適切なプロモーターが、当該分野において公知である。

上述したように、エンハンサーは、適切なフランキング配列であってもよい。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は長さ約１０〜３００ｂｐであり、プロモーターに作用し、転写を増加させる。エンハンサーは典型的には、配向独立型および位置独立型であり、５’および３’から制御するコード配列に対して作用するものが認められる。哺乳類遺伝子から利用することが可能ないくつかのエンハンサー配列（すなわち、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質およびインスリン）が公知である。同様に、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが、真核生物プロモーター配列と共に有用に用いられる。エンハンサーは、核酸コード配列の５’側または３’側に挿入することができるが、典型的にはプロモーターのサイト５’側に配置される。他の適切なエンハンサーが当該分野において公知であり、本発明において適用することができる。

特定の実施形態において、ｐ６２ポリペプチドまたはｐ６２ポリペプチドをコードする核酸配列あるいはその誘導体を１つ以上の共刺激成分、例えば、細胞表面タンパク質、サイトカイン、ケモカインまたは本発明の組成中のシグナル伝達分子と組み合わせることが好ましい。共刺激成分は、例えばポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸として組成物中に含有するることができる。適切な共刺激分子としては、例えば、ＣＤ２８ファミリーのメンバー（すなわち、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ；Ｈｕｔｌｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ １９９９、３９７：２６３−２６５；Ｐｅａｃｈら、ＪＥｘｐＭｅｄ１９９４、１８０：２０４９−２０５８）に結合するポリペプチド、例えば、ＣＤ２８結合ポリペプチドＢ７．１（ＣＤ８０；Ｓｃｈｗａｒｔｚ、１９９２；Ｃｈｅｎら、１９９２；Ｅｌｌｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５６（８）：２７００−９）およびＢ７．２（ＣＤ８６；Ｅｌｌｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５６（８）：２７００−９）；インテグリンファミリー（すなわち、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）；Ｓｅｄｗｉｃｋら、ＪＩｍｍｕｎｏｌ１９９９、１６２：１３６７−１３７５；Ｗｕｌｆｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９８、２８２：２２６６−２２６９；Ｌｕｂｅｔａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ１９９５、１６：４７９−４８３）のメンバーに結合するポリペプチド、例えば、ＩＣＡＭファミリーのメンバー（すなわち、ＩＣＡＭ−１、−２または−３）；ＣＤ２ファミリーメンバー（すなわち、ＣＤ２、信号伝達リンパ球活性分子（ＣＤｗ１５０または「ＳＬＡＭ」；Ａｖｅｒｓａら、ＪＩｍｍｕｎｏｌ１９９７、１５８：４０３６−４０４４））に結合するポリペプチド、例えば、ＣＤ５８（ＬＦＡ−３；ＣＤ２リガンド；Ｄａｖｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ１９９６、１７：１７７−１８７）またはＳＬＡＭリガンド（Ｓａｙｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ１９９８、３９５：４６２−４６９）；熱安定抗原（ＨＳＡまたはＣＤ２４；Ｚｈｏｕら、ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ１９９７、２７：２５２４−２５２８）に結合するポリペプチド；ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバー（すなわち、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７；Ｖｉｎａｙら、Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ１９９８、１０：４８１−４８９）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８、１０：４７１−４８０；Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＪＩｍｍｕｎｏｌ１９９９、１６２：４８６−４９３）、およびＣＤ２７（Ｌｅｎｓら、ＳｅｍｉｎＩｍｍｕｎｏｌ１９９８、１０：４９１−４９９））に結合するポリペプチド、例えば、４−１ＢＢＬ（４−１ＢＢリガンド；Ｖｉｎａｙら、Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８、１０：４８１−４８；ＤｅＢｅｎｅｄｅｔｔｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１９９７、１５８：５５１−５５９）、ＴＮＦＲ関連因子−１（ＴＲＡＦ−１；４−１ＢＢリガンド；Ｓａｏｕｌｌｉら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９８、１８７：１８４９−１８６２、Ａｒｃｈら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１９９８、１８：５５８−５６５）、ＴＲＡＦ−２（４−１ＢＢおよびＯＸ４０リガンド；Ｓａｏｕｌｌｉら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９８、１８７：１８４９−１８６２；Ｏｓｈｉｍａら、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８、１０：５１７−５２６、Ｋａｗａｍａｔａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９８、２７３：５８０８−５８１４）、ＴＲＡＦ−３（４−１ＢＢおよびＯＸ４０リガンド；Ａｒｃｈら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１９９８、１８：５５８−５６５；Ｊａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ＲｅｓＣｏｍｍｕｎ １９９８、２４２：６１３−６２０；Ｋａｗａｍａｔａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９８、２７３：５８０８−５８１４）、ＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０リガンド；Ｇｒａｍａｇｌｉａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８、１６１：６５１０−６５１７）、ＴＲＡＦ−５（ＯＸ４０リガンド；Ａｒｃｈら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９８、１８：５５８−５６５；Ｋａｗａｍａｔａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９８、２７３：５８０８−５８１４）、およびＣＤ７０（ＣＤ２７、リガンド；Ｃｏｕｄｅｒｃら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５（３）：１６３−７５）などが挙げられる。ＣＤ１５４（ＣＤ４０ｌｉｇおよび／または「ＣＤ４０Ｌ」；Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ。、１９９８、１６１：４５６３−４５７１；Ｓｉｎｅら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２００１、１２：１０９１−１１０２）も適切である。

１つ以上のサイトカインもまた、本発明の組成物におけるポリペプチドまたは核酸によってコードされたものの適切な共刺激成分または「アジュバント」となり得る（Ｐａｒｍｉａｎｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ２０００ Ｓｅｐ．１５；７４（１）：４１−４；Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２０９−２１９）。適切なサイトカインとしては、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．４：３２１−３２７（１９９８））、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（Ｐａｒｄｏｌｌによりレビュー、１９９２；Ｈａｒｒｉｅｓら、Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２０００ Ｊｕｌ−Ａｕｇ；２（４）：２４３−９；Ｒａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３３５７−３３６５（１９９６））、ＩＬ−１５（Ｘｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１７：８５８−８６６、１９９９）、ＩＬ−１６（Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋら、Ｊ．ＬｅｕｋＢｉｏｌ．６７（６）：７５７−６６、２０００）、ＩＬ−１８（Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００１．１２７（１２）：７１８−７２６）、ＧＭ−ＣＳＦ（ＣＳＦ（Ｄｉｓｉｓら、Ｂｌｏｏｄ、８８：２０２−２１０（１９９６））、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、またはＩＦＮ−αまたはＩＮＦ−γなどのインターフェロンが挙げられる。他のサイトカインも、当該分野において公知であるように、本発明の実施に適している。

ケモカインも利用することができる。例えば、腫瘍自己抗原へ融合したＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）およびＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）を含む融合タンパク質が抗腫瘍免疫を誘発することが示されている（Ｂｉｒａｇｙｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９９、１７：２５３−２５８）。ケモカインＣＣＬ３（ＭＩＰ−１．アルファ．）およびＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）（Ｂｏｙｅｒら、ワクチン、１９９９、１７（Ｓｕｐｐ．２）：Ｓ５３−Ｓ６４）もまた、本発明の実施に有用であり得る。他の適切なケモカインは、当該分野において公知である。

「シグナル伝達分子」は、化学生物化合物であり、細胞間の情報伝達に用いられる。このような分子は、シグナルの送信元である細胞から放出され、細胞間の隙間を拡散によって通過し、別の細胞中の特異的な受容体と作用し、細胞中に変化を発生させる一連の酵素制御反応を活性化させることにより当該細胞中の反応のトリガーとなる。例えば、人体のいくつかの細胞によって少量だけ生成される硫化水素は複数の生物シグナル伝達機能を有する。ひとえに例示として、酸化窒素および一酸化炭素がある。

抑制または負の免疫調節機構も遮断することができ、その結果、免疫反応が向上することが、当該分野において公知である。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体（Ｓｈｒｉｋａｎｔら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９６、１４：１４５−１５５；Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００１、１９４：８２３−８３２）、抗ＣＤ２５抗体（Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒ、上記）、抗ＣＤ４抗体（Ｍａｔｓｕｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、１６３：１８４−１９３）、融合タンパク質ＩＬ１３Ｒａ２−Ｆｃ（Ｔｅｒａｂｅら、ＮａｔｕｒｅＩｍｍｕｎｏｌ．、２０００、１：５１５−５２０）、およびこれらの組み合わせ（すなわち、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＣＤ２５抗体、Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒ、上記）を用いた治療により、抗腫瘍免疫反応を上方制御できることが分かっており、本発明の実行に適している。

これらの成分は、任意のものを単独で用いることも、他の薬剤と組み合わせて用いることもできる。例えば、ＣＤ８０、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３の組み合わせ（「ＴＲＩＣＯＭ」）は、抗がん免疫反応を促進することができる（Ｈｏｄｇｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：５８００−５８０７（１９９９）。他の有効な組み合わせとしては、例えば、ＩＬ−１２＋ＧＭ−ＣＳＦ（Ａｈｌｅｒｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：３９４７−３９５８（１９９７）；Ｉｗａｓａｋｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：４５９１−４６０１（１９９７））、ＩＬ−１２＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＴＮＦ−α（Ａｈｌｅｒｓら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ。１３：８９７−９０８（２００１））、ＣＤ８０＋ＩＬ−１２（Ｆｒｕｅｎｄら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８５：５０８−５１７（２０００）；Ｒａｏら、上記）およびＣＤ８６＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−１２（Ｉｗａｓａｋｉ、上記）が挙げられる。当業者であれば、本発明の実施において有用なさらなる組み合わせを認識することができる。加えて、当業者であれば、さらなる試薬または方法をこのような機構の調整に用いることが可能であることを認識することができる。これらの試薬および方法ならびに当業者に公知の他のものを、本発明の実施において用いることができる。

核酸を用いた免疫付与効率を向上させるためには、例えば、自己複製ウイルスレプリコンの利用（Ｃａｌｅｙら、１９９９．Ｖａｃｃｉｎｅ、１７：３１２４−２１３５；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、２０００．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：７２３−７３２；Ｌｅｉｔｎｅｒら、２０００．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：５１−５５）、コドンの最適化（Ｌｉｕら、２０００．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１：４９７−５００；Ｄｕｂｅｎｓｋｙ、上記；Ｈｕａｎｇら、２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：４９４７−４９５１）、ｉｎ ｖｉｖｏでのエレクトロポレーション（Ｗｉｄｅｒａら、２０００．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４６３５−３６４０）、ＣｐＧ刺激モチーフの採用（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、１８：９２７−９７４；Ｌｅｉｔｎｅｒ、上記；Ｃｈｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８（１０）：４９０７−１３）、エンドサイトーシスまたはユビキチン処理経路の標的のための配列（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２４６−２２５２；Ｖｅｌｄｅｒｓら、２００１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５３６６−５３７３）、マレック病ウイルス型１ＶＰ２２配列（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（６）：２６７６−８２、２００２）、プライムブーストレジメン（Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ、上記；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、２０００．Ｎａｔｕｒｅ、４０８：６０５−６０９；Ｈａｎｋｅら、１９９８．ワクチン、１６：４３９−４４５；Ａｍａｒａら、２００１．Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２：６９−７４）、および粘膜送達ベクター（例えば、サルモネラ菌）の使用（Ｄａｒｊｉら、１９９７．Ｃｅｌｌ、９１：７６５−７７５；Ｗｏｏら、２００１．Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：２９４５−２９５４）などのさらなる戦略も利用可能である。他の方法も当該分野において公知であり、そのうちいくつかについて下記に説明する。

化学療法薬剤、放射線療法、抗血管形成分子または他の薬剤も、ｐ６２ポリペプチドまたはｐ６２をコードする核酸を用いたがんの治療および／または予防において用いることができる（Ｓｅｂｔｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２０００Ｄｅｃ．２７；１９（５６）：６５６６−７３）。例えば、転移性乳癌の治療において有用な化学療法薬剤としては、シクロホスファミド、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ナベルビン、カペシタビンおよびマイトマイシンＣなどが挙げられる。例えば、シクロホスファミド＋メトトレキサート＋５−フルオロウラシル、シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋５−フルオロウラシルまたはシクロホスファミド＋ドキソルビシンなどを用いた組み合わせ化学療法レジメンの有効性が分かっている。例えば、プレドニゾン、タキサン、ナベルビン、マイトマイシンＣまたはビンブラスチンなどの他の化合物が、多様な理由のために用いられている。大半の乳癌患者は、エストロゲン受容体が陽性（ＥＲ＋）の腫瘍を有し、これらの患者には、内分泌治療（すなわち、タモキシフェン）が化学療法よりも好ましい。このような患者の場合、タモキシフェンまたは第２のライン治療としてプロゲスチン（メドロキシプロゲステロン酢酸エステルまたはメゲストロール酢酸エステル）が好適である。アロマターゼ阻害薬（すなわち、アミノグルテチミドおよびそのアナログ（例えば、レトロゾール））を用いた場合、腫瘍成長の維持に必要なエストロゲンの利用可能性が低減するため、アロマターゼ阻害薬を第２または第３のラインの内分泌治療として特定の患者において用いることができる。

他のがんの場合、異なる化学療法レジメンが必要となり得る。例えば、転移性結腸直腸癌の治療は典型的には、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（イリノテカンまたはＣＰＴ−１１）、５−フルオロウラシルまたはロイコボリンを単独でまたは組み合わせて行われることが多い。ＭＭＰ阻害薬ｍａｒｉｍａｓｔａｔｅ（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＣＯＬ−３（Ｃｏｌｌａｇｅｎｅｘ）、Ｎｅｏｖａｓｔａｔ（Ａｅｔｅｒｎａ）、ＡＧ３３４０（Ａｇｏｕｒｏｎ）、ＢＭＳ−２７５２９１（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＣＧＳ２７０２３Ａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）もしくはインテグリン阻害薬Ｖｉｔａｘｉｎ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅなどのプロテイナーゼおよびインテグリン阻害薬、またはＭＥＤ１５２２（ＭｅｒｃｋＫｇａＡ）も適切に使用することができる。そのため、結腸直腸癌に関連する免疫原性標的の免疫標的化は、これらの化学療法薬剤を用いた治療と組み合わせて行うことができる。同様に、他の種類のがんの治療に用いられる化学療法薬剤は当該分野において周知であるから、本明細書中に記載の免疫原性標的と組み合わせることができる。

多数の抗血管形成薬剤が当該分野において公知であり、ｐ６２核酸またはポリペプチドワクチンとの同時投与に適している（例えば、Ｔｉｍａｒら、２００１．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．、７（２）：８５−９４を参照）。このような薬剤としては、例えば、生理的薬剤（例えば、成長因子（すなわち、ＡＮＧ−２、ＮＫ１、２、４（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β））、サイトカイン（すなわち、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、−β、−γ、血小板因子４（ＰＦ−４）、ＰＲ−３９）、プロテアーゼ（すなわち、切断ＡＴ−ＩＩＩ、コラーゲンＸＶＩＩＩフラグメント（エンドスタチン））、ＨｍｗＫａｌｌｉｋｒｅｉｎ−ｄ５プラスミンフラグメント（アンジオスタチン）、プロトロンビン−Ｆ１−２、ＴＳＰ−１）、プロテアーゼ阻害薬（すなわち、メタロプロテアーゼの組織阻害薬（例えば、ＴＩＭＰ−１、−２、または−３；マスピン；プラスミノーゲン活性化剤阻害薬（例えば、ＰＡＩ−１）；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ））、タムスタチン（ＩＬＥＸ、Ｉｎｃ．から入手可能）、抗体生成物（すなわち、コラーゲン結合抗体ＨＵＩＶ２６、ＨＵＩ７７、ＸＬ３１３；抗ＶＥＧＦ；抗インテグリン（すなわち、Ｖｉｔａｘｉｎ、（Ｌｘｓｙｓ）））、およびグリコシダーゼ（すなわち、ヘパリナーゼ−Ｉ、−ＩＩＩ）が挙げられる。血管新生関連抗原に対するアンタゴニストである分子（タンパク質およびポリペプチドなど）も適しており、例えば、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＥＧＦＲ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＴＧＦ−αを含むＴＧＦ、エンドグリン、Ｉｄタンパク質、多様なプロテアーゼ、酸化窒素シンターゼ、アミノペプチダーゼ、トロンボスポンジン、ｋ−ｒａｓ、Ｗｎｔ、サイクリン依存型キナーゼ、微小管、ヒートショックタンパク質、ヘパリン結合因子、シンターゼ、コラーゲン受容体、インテグリン、および表面プロテオグリカンＮＧ２に対する分子が挙げられるが、これらに限定されない。抗血管形成の可能性を持つと考えられる「化学的」または修飾生理的薬剤としては、例えば、ビンブラスチン、タキソール、ケトコナゾール、サリドマイド、ドラスタチン、コンブレタスタチンＡ、ラパマイシン（Ｇｕｂａら、２００２、ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．、８：１２８−１３５）、ＣＥＰ−７０５５（Ｃｅｐｈａｌｏｎ、Ｉｎｃ．から入手可能）、フラボン酢酸、Ｂａｙ １２−９５６６（ＢａｙｅｒＣｏｒｐ．）、ＡＧ３３４０（Ａｇｏｕｒｏｎ、Ｉｎｃ．）、ＣＧＳ．２７０２３Ａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、テトラサイクリン誘導体（すなわち、ＣＯＬ−３（Ｃｏｌｌａｇｅｎｉｘ、Ｉｎｃ。））、Ｎｅｏｖａｓｔａｔ（Ａｅｔｅｒｎａ）、ＢＭＳ−２７５２９１（Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ）、低用量５−ＦＵ、低用量メトトレキサート（ＭＴＸ）、イルソグラジン、ラディシコール、シクロスポリン、カプトプリル、セレコキシブ、Ｄ４５１５２−硫酸ポリサッカライド、カチオン性タンパク質（Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）、カチオン性ペプチド−ＶＥＧＦ、Ｓｕｒａｍｉｎ（ｐｏｌｙｓｕｌｐｈｏｎａｔｅｄ ｎａｐｔｈｙｌｕｒｅａ）、ＶＥＧＦの機能または生成と干渉する化合物（すなわち、ＳＵ５４１６またはＳＵ６６６８（Ｓｕｇｅｎ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、ＤｉｓｔａｍｙｃｉｎＡ、Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ（リボザイム）、ｉｓｏｆｌａｖｉｎｏｉｄ、スタウロスポリン誘導体、ゲニステイン、ＥＭＤ１２１９７４（Ｍｅｒｃｋ ＫｃｇａＡ）、チロホスチン、ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ、レチノイン酸、カルボキシアミノトリアゾール、ＴＮＰ−４７０、オクトレオチド、２−メトキシエストラジオール、アミノステロール（すなわち、スクアラミン）、グルタチオンアナログ（すなわち、Ｎ−ａｃｔｅｙｌ−Ｌ−システイン）、コンブレタスタチンＡ−４（Ｏｘｉｇｅｎｅ）、Ｅｐｈ受容体遮断薬（Ｎａｔｕｒｅ、４１４：９３３−９３８、２００１）、Ｒｈ−アンジオスタチン、Ｒｈ−エンドスタチン（ＷＯ０１／９３８９７）、サイクリック−ＲＧＤペプチド、ａｃｃｕｔｉｎ−ディスインテグリン、ベンゾジゼピン、ヒト化抗ａｖｂ３Ａｂ、Ｒｈ−ＰＡＩ−２、アミロライド、ｐ−アミノベンザミジン、抗ｕＰＡａｂ、抗ｕＰＡＲＡｂ、Ｌ−フェニルアラニン−Ｎ−メチルアミド（すなわち、Ｂａｔｉｍｉｓｔａｔ、Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）、ＡＧ３３４０およびミノサイクリンが挙げられる。他にも多数の適切な薬剤が当該分野において公知であり、本発明の実施において十分である。

本発明は、従来と異なるがん治療方法とも組み合わせて用いることが可能である。例えば、特定の嫌気性菌を投与すると、腫瘍成長の遅延を支援できることが知られている。１つの研究において、ファージエピソーム上において実行される毒素遺伝子を除去したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉを、結腸直腸腫瘍のあるマウスへと投与する（Ｄａｎｇら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ、９８（２６）：１５１５５−１５１６０、２００１）。化学療法と組み合わせると、この治療は、動物中の腫瘍の壊死を発生させることが分かっている。本出願中に記載される試薬および方法は、このような治療方法と組み合わせることができる。

いくつかの利用可能な技術のうちの任意のものを用いて、ｐ６２ポリペプチドをコードする核酸を患者へ投与することができる。核酸をホストへ導入するために成功裏に用いられている多様なウイルスベクターを挙げると、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルスなどがある。当該分野において、多数のこのようなウイルスベクターが利用可能であることが理解されている。本発明に係るベクターは、当業者が広く利用可能な標準的組換え技術を用いて構築することができる。このような技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ら、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１８５、ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ、１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）およびＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら、１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．などの一般的な分子生物学の参照文献に記載されている。

適切なレトロウイルスベクターとしては、レンチウイルスの誘導体ならびにマウスまたはトリレトロウイルスの誘導体が挙げられる。適切なレトロウイルスベクターとしては、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられる。多くのレトロウイルスベクターにおいて、複数の外来性核酸配列を挿入することができる。組換えレトロウイルスは欠陥があるため、感染性ベクター粒子を生成するための助けが必要である。この助けは、例えば、レトロウイルス構造遺伝子をコードするヘルパー細胞株によって得ることができる。適切なヘルパー細胞株としては、例えば、ＰＳＩ．２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２などが挙げられる。このような株化細胞を用いて生成されるベクタービリオンを用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などの組織細胞株を感染させ、大量のキメラレトロウイルスビリオンを生成することができる。レトロウイルスベクターの投与は、従来の方法（すなわち、注射）によって行ってもよいし、あるいは、「産生細胞株」を標的細胞集団の近隣に移植することによって行ってもよい（Ｃｕｌｖｅｒ、Ｋ．、ら、１９９４、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５（３）：３４３−７９；Ｃｕｌｖｅｒ、Ｋ．、ら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ；Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５９：６８５−９０）；Ｏｌｄｆｉｅｌｄ、Ｅ．、１９９３、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、４（１）：３９−６９）。産生細胞株は、ウイルスベクターを生成し、標的細胞の近隣にウイルス粒子を放出するように調節されている。放出されたウイルス粒子のうち一部は標的細胞と接触し、これらの細胞を感染させ、その結果、本発明の核酸を標的細胞へと送達させる。標的細胞を感染させた後、ベクター発現が発生する。

アデノウイルスベクターは、真核生物細胞中への遺伝子導入に特に有用であることが実証されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｍ．ら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２（５００４）：４３１−４；Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｒ．ら、１９９４、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、８（１）：４２−５１）、真核生物遺伝子発現の研究（Ｌｅｖｒｅｒｏ、Ｍ．、ら、１９９１、Ｇｅｎｅ、１０１（２）：１９５−２０２）、ワクチン開発（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ．ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｃ、Ｌ．、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０：３６３−９０）、および動物モデル（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｌ．、ら、１９９２、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、９（Ｓｕｐｐｌ．１）：１５１−２；Ｒｉｃｈ、Ｄ．、ら、１９９３、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、４（４）：４６１−７６）。ｉｎ ｖｉｖｏで組換えアデノウイルスを異なる組織へ投与するための実験経路としては、気管内投与（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｍ．、ら、１９９２、Ｃｅｌｌ、６８（１）：１４３−５５）筋肉注射（Ｑｕａｎｔｉｎ、Ｂ．、ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９（７）：２５８１−４）、末梢静脈内注射（Ｈｅｒｚ、Ｊ．、およびＧｅｒａｒｄ、Ｒ．、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０（７）：２８１２−６）および脳への定位的接種（ＬｅＧａｌＬａＳａｌｌｅ、Ｇ．ら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９（５０９７）：９８８−９０）などが挙げられる。

アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、ホスト細胞ゲノムへの統合において、高レベルの感染力、広範な宿主範囲および特異性を示す（Ｈｅｒｍｏｎａｔ、Ｐ．ら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１（２０）：６４６６−７０）。単純ヘルペスウイルス型１（ＨＳＶ−１）も、別の魅力的なベクターシステムであり、向神経性があるため、特に神経系用途に適している（Ｇｅｌｌｅｒ、Ａ．ら、１９９１、Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１４（１０）：４２８−３２；Ｇｌｏｒｉｏｓｏら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４（１）：８７−９９；Ｇｌｏｒｉｏｓｏら、１９９５、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４９：６７５−７１０）。

ポックスウイルスは、別の有用な発現ベクターである（Ｓｍｉｔｈら、１９８３、Ｇｅｎｅ、２５（１）：２１−８；Ｍｏｓｓら、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０：３４５−６２；Ｍｏｓｓら、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：２５−３８；Ｍｏｓｓら、１９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：１６６２−１６６７）。ポックスウイルスは、牛痘、ＮＹＶＡＣ、アビポックス、鶏痘、カナリア痘、ＡＬＶＡＣ、およびＡＬＶＡＣ（２）などを含むことが分かっている。

ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）は、コペンハーゲンワクチン系統の牛痘ウイルスから、既知または可能性のある病原性因子をコードするゲノムの６個の非必須領域を除去することにより、調製された（例えば、米国特許第５，３６４，７７３号および第５，４９４，８０７号を参照）。欠失座位も、外来遺伝子の挿入のためのレシピエント座位として操作した。欠失領域を以下に示す：チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）；出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）；Ａ型封入体領域（ＡＴＩ；Ａ２６Ｌ）；ヘマグルチニン遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）；ホスト範囲遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）；および、大型サブユニット、リボヌクレオチドリダクターゼ（Ｉ４Ｌ）。ＮＹＶＡＣは、遺伝子操作された牛痘ウイルス系統であり、病原性およびホスト範囲に関連する遺伝子生成物をコードする１８個のオープンリーディングフレームを特異的に欠失させることにより調製された。ＮＹＶＡＣは、ＴＡ発現に有用であることがわかっている（例えば、米国特許第６，２６５，１８９号を参照）。ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）、ｖＰ９９４、ｖＣＰ２０５、ｖＣＰ１４３３、ｐｌａｃＺＨ６Ｈ４Ｌリバース、ｐＭＰＣ６Ｈ６Ｋ３Ｅ３およびｐＣ３Ｈ６ＦＨＶＢは、ブタペスト条約に基づくＡＴＣＣに、それぞれ、受入番号ＶＲ−２５５９、ＶＲ−２５５８、ＶＲ−２５５７、ＶＲ−２５５６、ＡＴＣＣ−９７９１３、ＡＴＣＣ−９７９１２およびＡＴＣＣ−９７９１４として寄託されている。

ＡＬＶＡＣ組換えウイルス（すなわち、ＡＬＶＡＣ−１およびＡＬＶＡＣ−２）も、本発明の実行において適している（例えば、米国特許第５，７５６，１０３を参照し）。ＡＬＶＡＣ（２）は、ゲノムが牛痘プロモーターの制御下において牛痘Ｅ３ＬおよびＫ３Ｌ遺伝子を含む点を除いて、ＡＬＶＡＣ（１）と同一である（米国特許第６，１３０，０６６号；Ｂｅａｔｔｉｅら、１９９５ａ、１９９５ｂ、１９９１；Ｃｈａｎｇら、１９９２；Ｄａｖｉｅｓら、１９９３）。ＡＬＶＡＣ（１）およびＡＬＶＡＣ（２）はどちらとも、ＴＡｓなどの外来ＤＮＡ配列の発現に有用であることが分かっている（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９３ａ、ｂ；米国特許第５，８３３，９７５号）。ＡＬＶＡＣは、ブタペスト条約に基づくＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９、ＵＳＡ）にＡＴＣＣ受入番号ＶＲ−２５４７として寄託されている。

別の有用なポックスウイルスベクターとして、ＴＲＯＶＡＣがある。ＴＲＯＶＡＣは弱毒鶏痘であって、初生びなのワクチン接種のためにライセンスされた鶏痘ウイルスのＦＰ−１ワクチン系統からプラーククローンによる単一株である。ＴＲＯＶＡＣも、ブタペスト条約に基づくＡＴＣＣに、受入番号２５５３として寄託されている。

「非ウイルス」であるプラスミドベクターも、本発明の実施に適している。適切なプラスミドベクターは、バクテリア、昆虫および／または哺乳類ホスト細胞と適合することができる。このようなベクターとしては、例えば、ＰＣＲ−ＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ、Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−アルファ（ＰＣＴｐｕｂ．Ｎｏ．ＷＯ９０／１４３６３）およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ．ＲＴＭ．プラスミド誘導体（多コピーＣＯＬＥ１に基づくファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ生成物のクローニングのために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯ．ＴＭ．ＴＡＣｌｏｎｉｎｇ．ＲＴＭ．ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１．ＲＴＭ．．ＲＴＭ．プラスミド誘導体、Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）などが挙げられる。バクテリアベクターも、本発明において用いることができる。これらのベクターとしては、例えば、シゲラ、サルモネラ菌、コレラ菌、乳酸菌、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、およびレンサ球菌がある（例えば、ＷＯ８８／６６２６；ＷＯ９０／０５９４；ＷＯ９１／１３１５７；ＷＯ９２／１７９６；およびＷＯ９２／２１３７６を参照）。多数の他の非ウイルスプラスミド発現ベクターおよびシステムが当該分野において公知であり、本発明において用いることが可能である。

適切な核酸送達技術を挙げると、ＤＮＡリガンド複合体、アデノウイルスリガンドＤＮＡ複合体、ＤＮＡの直接射、ＣａＰＯ．ｓｕｂ．４沈殿、遺伝子銃技術、エレクトロポレーション、およびコロイド分散系などが挙げられる。コロイド分散系としては、マクロ分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビード、ならびに水中油型乳剤、ミセル、混合ミセルおよびリポソームなどの脂質ベースのシステムが挙げられる。本発明に好適なコロイド系はリポソームである。リポソームは、人工膜ベジクルであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの送達溶媒として有用である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷なビリオンを水性内部へ封入し、生物活性を有する様態で細胞へと送ることができる（Ｆｒａｌｅｙ、Ｒ．、ら、１９８１、ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、６：７７）。リポソームの組成は、リン脂質（特に、相転移温度が高いリン脂質）、ステロイド（特に、コレステロール）と組み合わされることが多い。他のリン脂質または他の脂質も利用可能である。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。リポソーム生産に有用な脂質としては、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドなどのホスファチジル化合物が挙げられる。特に有用なものとして、脂質部分に１４〜１８の炭素原子、好ましくは１６〜１８の炭素原子を含み、飽和したジアシルホスファチジルグリセロールが挙げられる。例示的なリン脂質を挙げると、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンがある。

免疫原性標的が１つ以上のアジュバントと組み合わせて投与することにより、免疫反応を向上させることも可能である。例示的アジュバントを以下の表３中に示す。

いくつかの実施形態において、本発明によるｐ６２ポリペプチドまたはｐ６２をコードする核酸は、疾患、障害および／または状態の１つ以上の症状または特徴の治療、緩和、改善、軽減、遅延発病（予防）、進行抑制、重症度低減および／または発生低減のために用いることができる。いくつかの実施形態において、ｐ６２ポリペプチドまたはｐ６２をコードする核酸は、癌および／または癌細胞などの固形腫瘍の治療に用いることができる。「癌」という用語は、前悪性がんおよび悪性がんを含む。がんの例を非限定的に挙げると、前立腺癌、胃癌、結腸直腸癌、メラノーマまたは基底細胞カルチノーマなどの皮膚癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、頭部および頚部、気管支癌、膵臓癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、口腔または咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、肉腫、血液組織の癌などがある。「がん細胞」は、腫瘍の形態をとり得、対象（例えば、白血病細胞または腹水）内に存在し得るか、またはがんから得られた株化細胞であり得る。

がんは、多様な身体的症状と関連付けられる。がんの症状は一般的には、がんの種類および位置によって異なる。例えば、肺癌の場合、咳、息切れおよび胸痛が発生し得、結腸癌の場合、下痢、便秘および血便が発生することが多い。しかし、多数のがんにおいて以下の症状が発症することが多い熱、悪寒、寝汗、咳、呼吸困難、体重減少、食欲減退、食欲不振、吐き気、嘔吐、下痢、貧血、黄疸、肝腫、喀血、疲労、倦怠感、認知障害、鬱、ホルモン障害、好中球減少症、痛み、非治癒性の痛み、リンパ節膨張、末梢神経障害、および性機能障害。

本発明の一面として、がん（例えば、前立腺癌や乳癌）の治療方法が提供される。いくつかの実施形態において、がんの治療は、治療的に有効な量のｐ６２ポリペプチドまたはｐ６２をコードする核酸を必要としている対象へ相当量だけ、かつ所望の結果を達成するために必要なタイミングで投与することを含む。本発明の特定の実施形態において、本発明の標的粒子の「治療に有効な量」とは、がんの１つ以上の症状または特徴の治療、緩和、改善、軽減、遅延発病、進行抑制、重症度低減および／または発生低減のために有効な量である。

本発明の一面として、ｐ６２ポリペプチドまたｐ６２をコードする核酸ｐ６２を、がん（例えば、乳癌）に罹患しているまたは再発している対象に投与する方法が提供される。いくつかの実施形態において、ｐ６２ポリペプチドまたはｐ６２をコードする核酸は、所望の結果（すなわち、がんの治療）を達成するために、必要な量および必要な時間、対象へ投与される。本発明の特定の実施形態において、ｐ６２ポリペプチドおよびｐ６２をコードする核酸の「治療に有効な量」とは、がんの１つ以上の症状または特徴発生の治療、緩和、改善、軽減、遅延発病、進行抑制、重症度低減および／または発生低減のために有効な量である。いくつかの実施形態において、本発明のｐ６２ポリペプチドまたはｐ６２をコードする核酸は、過去にがん治療を受けていた対象へ投与される。いくつかの実施形態において、本発明のｐ６２ポリペプチドまたはｐ６２をコードする核酸は、がんの家族歴がある対象へ投与される。いくつかの実施形態において、本発明のｐ６２ポリペプチドまたはｐ６２をコードする核酸は、がんの素因を有する対象へ投与される。例えば、ＢＲＣＡ陽性の対象は一般的には、特定の形態の乳癌素因を有する。

本発明の治療プロトコルは、治療に有効な量のｐ６２ポリペプチドまたはｐ６２をコードする核酸を健康な個人（すなわち、がんの任意の症状を示していない対象および／またはがんと診断されていない個人）へ投与することを含む。例えば、健康な個人に対し、がん進行および／またはがん症状が発症する前に、ｐ６２ポリペプチドまたはｐ６２をコードする核酸によって「免疫化」したり、リスクのある個人（例えば、がんの家族歴を持つ患者、がん進行に関連する１つ以上の遺伝子変異を有する患者、がん進行に関連する遺伝的多型を有する患者、がん進行に関連するウイルスに感染している患者、がん進行に関連する習慣および／またはライフスタイルを有する患者など）に対し、がんの症状の発病と実質的に同時に（例えば、４８時間以内、２４時間以内または１２時間以内）に治療したりすることができる。もちろん、がんであることが分かっている個人に対しては、本発明による治療を任意のタイミングで行ってもよい。

他の実施形態において、本発明のｐ６２ポリペプチドまたはｐ６２をコードする核酸は、がん細胞（例えば、乳癌細胞）の成長抑制に用いることができる。本明細書中の「がん細胞の成長抑制」または「がん細胞の成長を抑制する」という表現は、
癌細胞増殖および／または遊走の速度を遅らせること、
癌細胞増殖および／または遊走の抑止すること、
癌細胞を死滅させることのうちのいずれかであって、処理していない対照癌細胞において予測される成長速度と比較して、がん細胞成長速度がおそくなることを意味する。「成長抑制」という表現も、癌細胞または腫瘍のサイズ低減または消滅ならびにその転移能の低減を指す。好適には、このような細胞レベルにおける抑制により、サイズ低減、成長阻止、攻撃性低減、または患者中の癌転移の回避または抑制が可能となる。当業者であれば、多様な適切な兆候のうち任意のものを用いて、がん細胞の成長を抑制すべきかを容易に決定することができる。

がん細胞の成長抑制は、例えば、細胞サイクルの特定フェーズにおける癌細胞の抑止（例えば、細胞サイクルのＧ２／Ｍフェーズにおける抑止）によって証明することができる。がん細胞の成長抑制は、癌細胞または腫瘍のサイズを直接測定または間接測定することによって証明することっもできる。ヒト癌患者においては、このような測定は一般的には、磁気共鳴画像、コンピュータ断層撮影およびＸ線などの周知の画像化方法を用いて行われる。癌細胞成長はまた、間接的に決定することもできる（例えば、がん胎児性抗原、前立腺特異的抗原またはがん細胞成長に関連する他のがん特異的抗原の循環レベルを決定すること）。がん成長の抑制は一般的には、対象の生存期間の延長および／または健康増進とも関連する。

本明細書中に記載される化合物および組成物は、薬学的に許容できるキャリアとともに、医薬品または薬物として処方されたものとして投与することができる。そのため、これらの化合物および組成物は、薬物または医薬品組成物の製造において用いることができる。本発明の医薬品組成物は、溶液として処方してもよいし、あるいは非経口投与のために凍結乾燥粉末として処方してもよい。粉末は、適切な希釈剤または他の薬学的に許容可能なキャリアを加えて再構成した後、使用することができる。液体処方は、緩衝溶液、等張溶液、水溶液であり得る。粉末を乾燥形態で噴霧してもよい。適切な希釈剤の例として、通常の等張食塩水溶液、標準的な５％デキストロース水溶液、またはナトリウムまたは酢酸アンモニウム緩衝液がある。このような処方は、非経口投与に特に適しているが、経口投与、あるいは、定量吸入器または噴霧器に入れて吸入することも可能である。ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシア、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどの賦形剤を付加することが望ましい場合がある。

あるいは、化合物および組成物を経口投与のためにカプセル化、錠剤化エマルジョンまたはシロップとすることも可能である。医薬的に受容可能な固体または液体のキャリアを、組成物の向上または安定のため、あるいは組成物調製の容易化のために付加することができる。固体キャリアとしては、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天またはゼラチンが挙げられる。液体キャリアとしては、シロップ、ピーナツオイル、オリーブオイル、生理食塩水および水が挙げられる。キャリアは、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルなどの徐放性材料も単独でまたはワックスと共に含み得る。固体キャリアの好適な含有量は、投与単位あたり約２０ｍｇ〜約１ｇである。医薬品の調製は、錠剤形態または硬質のゼラチンカプセル形態のための製粉、混合および充填のために、従来の医薬技術に従って必要に応じて行われる（例えば、製粉、混合、顆粒化および圧縮）。液体キャリアが用いられる場合、調製は、シロップ、エリキシル剤、エマルジョンまたは水溶性懸濁液または非水溶性懸濁液の形態をとり得る。直腸投与の場合、本発明の化合物を、ココアバター、グリセリン、ゼラチンまたはポリエチレングリコールなどの賦形剤と組み合わせ、坐薬に成型することができる。

化合物および組成物は、他の医学的に有用な薬剤または生物薬剤を含むように処方することができる。化合物および組成物はまた、本発明の化合物および組成物が適用される疾患または状態のために有用な他の薬剤または生物薬剤の投与と共に投与することもできる。

本明細書中の「有効な量」とは、レシピエントに対して有用な効果を付与できるだけの十分な濃度が得られる投与量を指す。特定の対象に対する特異的な治療的に有効な投与量は、治療対象障害、障害の重症度、特異的化合物または組成の活性、投与経路、化合物または組成のクリアランス率、治療期間、化合物または組成と共に用いられる薬剤、年齢、体重、性別、ダイエット、対象の一般的健康などの医学分野および科学分野において公知の因子に応じて異なる。「治療的に有効な量」を決定する際に考慮される多様な一般的考慮事項は当業者にとって公知であり、例えば、Ｇｉｌｍａｎら、ｅｄｓ．、Ｇｏｏｄｍａｎ Ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８ｔｈ ｅｄ．、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃａｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７ｔｈ ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９０中に記載がある。典型的な投与量レベルは、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／１日であり、約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ／１日の範囲であれば一般的に許容可能である。化合物または組成物は、血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、眼球内、皮内および皮下などに非経口で投与することができる。また、経口、経鼻、経直腸、経皮的、膣内またはエアロゾル吸入によって投与することもできる。化合物または組成ぶつは、腫瘍を有する（または腫瘍の標的となる可能性のある）臓器あるいは腫瘍そのものへと投与され得る。化合物または組成物は、急速静注として投与してもよいし、またはゆっくり注入してもよいし、あるいは皮内、皮下、筋肉内または腹腔内注射によって投与してもよい。

治療に有効な投与量を推定するには、まずｐ６２ポリペプチドをコードする核酸の導入によるｐ６２の発現レベルを細胞培養アッセイにより決定する。その後、動物モデルにおける適切な免疫反応および／または腫瘍成長の抑制が得られる服用量が決定される。このような情報を用いて、ヒトへの有用な初期用量をより高精度に決定することができる。正確な処方、投与経路および投与量は、個々の医師が患者の状態を鑑みて決定することができる。

実施例１．株化細胞ｓおよびベクター構成
ラットＨＥＲ／２ｎｅｕがん遺伝子が過剰発現しているＡ２３３−ＶＳＧＡ１乳癌株化細胞を、ＦＶＢ／ｎｅｕＮＴトランスジェニックマウスに発生したマウス乳癌から得た。この株化細胞を上記したように維持した（ＮａｎｎｉＰ、ＰｕｐａＳＭ、ＮｉｃｏｌｅｔｔｉＧら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０００；８７：１８６）。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２．２（登録商標））を、ＡＴＣＣ完全成長媒体（ＡＴＣＣＭＤ−６１０８）中で培養した。

ラットＨＥＲ２／ｎｅｕの細胞外ドメインをＰＣＲによって増幅させ、前記のようにｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化した（ＦＭ Ｖｅｎａｎｚｉ、Ａ Ｂａｒｕｃｃａ、Ｋ Ｈａｖａｓ、Ｍ Ｃａｐｉｔａｎｉ、Ｍ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉ Ｓ Ｓｃｏｔｔｉ、Ａ Ｃｏｎｃｅｔｔｉ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１０（２２）；３８４１−７）。

ｐ６２をコードするｃＤＮＡのソースとして、全ＲＮＡをＨｅＬａ細胞から調製した。全長ｃＤＮＡは、ｐ６２のより長いイソ型（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｖａｒｉａｎｔ １、ＧｅｎＢａｎｋ ＲｅｆｅｒｅｃｅＮｏ．ＮＰ＿００３８９１）をコードする以下のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅させた（ＨｏｔＳｔａｒ ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｋｉｔ Ｑｉａｇｅｎ）：ＦＷ：５−ＣＣＣＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＣＧＴＣＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧ−３、およびＲＥＶ：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＡＡＣＧＧＣＧＧＧＧＧＡＴＧＣＴＴＴＧ−３’。ＰＣＲ生成物を精製し、ＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化フラグメントをｐｃＤＮＡ３．１にクローン化した。

挿入されたｐ６２ＤＮＡの配列を、シークエンシング（ＭＧＷＢｉｏｔｅｃｈ／Ｍ−ｍｅｄｉｃａｌ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、ドイツ）によって確認した。コードされたポリペプチドは、野生型アミノ酸配列と２つの置換変異（すなわち、Ｃ１４５ＲおよびＱ４１８Ｒ）において異なることが分かった。
実施例２．マウス乳癌モデルにおけるｐ６２免疫付与の予防的抗腫瘍効果

ＦＶＢ／Ｎマウスを３つのグループに分けて（１グループあたり１５匹のマウス）、下記のうちいずれかによって免疫化した。
１．ｐｃＤＮＡ．３．１（空プラスミドベクター、陰性対照）；
２．ｐＨＥＲ２（陽性対照）のｐｃＤＮＡ．３．１、
３．ｐ６２のｐｃＤＮＡ．３．１（実験）。

ＦＶＢ／Ｎ雌を麻酔し、大腿四頭筋を露出させた後、生理食塩水中の１００μｇＤＮＡ（１ｍｇ／ｍＬ）をインスリン注射器によって注射した。マウスを２回免疫化した（腫瘍細胞接種の４週間前および２週間前）。マウス脇腹の皮内に、２３３−ＶＳＧＡ１腫瘍細胞３×１０^５個／１００μｌのＰＢＳ緩衝液を接種させた。全ての場合において、２つの垂直方向直径をノギスによって１週間に３回決定することにより、腫瘍の測定を行った。腫瘍の潰瘍形成時点または直径が１ｃｍに到達したとき、マウスを屠殺した。

空プラスミドベクター（陰性対照）をワクチン接種したマウスのうち１００％が、腫瘍細胞接種後１３日目に腫瘍を形成していた。ＨＥＲ２をコードするプラスミドによってワクチン接種したマウスのうち４０％が保護を示した（図４）。同時に、ｐ６２をコードするプラスミドの場合、１３日目に１００％保護を示し、その後徐々に７０％まで低下した。その結果、移植可能な乳癌マウスモデルにおける、ｐ６２をコードするプラスミドによる保護効果が示された。よって、ｐ６２ワクチンの予防的効果が、マウスモデル中の乳癌において証明された。本発明者らによれば、ワクチン接種を継続すれば、１００％の保護を維持することが可能であると仮定する。

ＨＥＲ２またはｐ６２をコードするプラスミドベクターによって免疫化され、初回の癌細胞接種後に癌が進行しなかった動物に対し、同量の癌細胞を５０日目に接種した。ＨＥＲ２をコードするプラスミドによってワクチン接種された全ての動物では腫瘍進行がみられ、ｐ６２ワクチン接種した動物の場合、腫瘍発現は無かった。その結果、ｐ６２による免疫付与では、免疫記憶が維持されたが一方、ＨＥＲ２では免疫記憶は維持されなかった。
実施例３：ｐ６２ワクチンによる自然免疫刺激

ｐ６２ワクチンを付与したマウス中の腫瘍においては、大きな壊死領域が含まれていた（図５）。この壊死領域内には、炎症関連の免疫細胞が豊富に存在する。

ＨＥＲ２ワクチンは、抗原特異的適合免疫反応と、リンパ球の大規模遊走（ＣＤ３＋細胞、腫瘍浸潤リンパ球）とを腫瘍細胞内で発生させる（図６）。同時に、ｐ６２プラスミドによるワクチン接種の場合、腫瘍浸潤リンパ球のレベルは有意に増加しなかった。逆に、ＨＥＲ２ワクチンではなくｐ６２プラスミドを注射した場合、腫瘍中におけるＣＤ１１Ｂ＋細胞のレベルがが増加した（図６）。その結果、ＨＥＲ２ワクチンと異なり、ｐ６２ワクチンは自然免疫刺激を通じて機能する。
実施例４：Ｔ５ラット乳癌モデル中のｐ６２ＤＮＡワクチンの抗腫瘍活性の証明

Ｔ５移植可能なラット乳癌を、Ｗｉｓｔａｒラット（Ｒ．Ｅ．Ｋａｖｅｔｓｋｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｕｋｒａｉｎｅ）の自発乳腺がんから得た。２月齢の雌のＷｉｓｔａｒラット（体重１３０〜１５０ｇｍ、１グループあたり１０匹）に対し、腫瘍細胞２．５х１０^６個／ラットとなるようように０．４ｍＬのＰＢＳを皮下注射することで癌誘発を行った。癌移植の翌日から、ラットに対して週１回のワクチン接種を３回行った（図７）。各注射は、７８μｇのｐｃＤＮＡ．３．１（空プラスミドベクター、陰性対照）またはｐ６２を有するｐｃＤＮＡ．３．１（実験）を含む。

ｐ６２ワクチン接種したラットにおいては、ベクター注射した対照ラット（ｐ＜０．００４）（図９）と比較して、腫瘍成長がｐ６２免疫付与（図８）によって７０％腫瘍成長が抑制されていた。

腫瘍移植されたラット（ベクター免疫８匹およびｐ６２免疫８匹）の生存率を７５日間観察した。対照グループの動物のうち５０％が死亡したのに対し、ｐ６２ワクチン接種したグループにおいては、死亡は１匹もみられなかった（図１０）。

腫瘍の組織学的分析を行ったところ、壊死ゾーンが明らかとなった（図１１）。ｐ６２ＤＮＡワクチンを受けたラット中の腫瘍内壊死は、ｐ６２ＤＮＡワクチンを受けたマウスの腫瘍中にみられるものと類似していた（図１２）。

その結果、ｐ６２ＤＮＡワクチンの抗腫瘍効果が第２の動物（ラット）モデルにおいて証明され、これにより、乳癌治療にｐ６２ＤＮＡワクチンを用いることが可能であることが分かった。実施例５．ｐ６２ＤＮＡワクチンの抗転移性効力

ルイス肺癌は、「ロシア版ＦＤＡ」であるロシア連邦薬理学委員会によって公認されているモデルであり、抗転移性効果について薬剤を試験するために用いられる。腫瘍移植による腫瘍誘発の４週間前および２週間前と、腫瘍誘発の１日後、８日後および１５日後とに、１００μｇのプラスミドを各マウスに筋肉内注射した。１グループあたり１５匹の動物を用いた。図１３は、ｐ６２ワクチン接種により、肺における転移が対照と比較して５０％低減していることを示す。

他に明記無き限り、本明細書中の全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する分野の当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。

本明細書中に例示的に記載された本発明は、任意の要素または要素、制限（単数または複数）が本明細書中に具体的に開示されていなくとも、適切に実行することができる。よって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は拡張的かつ非限定的に理解されるべきである。さらに、本明細書中において用いられる用語および表現は、詳細を示すために用いたものであり、制限的なものではない。また、このような用語および表現の使用において、図示および記載された特徴またはその一部の任意の均等物を排除することは意図されておらず、特許請求の範囲内において多様な変更が可能であることが認識される。

よって、本発明について好適な実施形態および選択的特徴を具体的に開示してきたが、当業者であれば、本明細書中において具現化および開示された発明において変更、向上および改変が可能であり、このような変更、向上および改変は、本発明の範囲内にあることが理解される。本明細書中に記載される材料、方法および例は、好適な実施形態を示すものであり、本発明の範囲を制限するものではない。

本発明について、本明細書中において広範かつ一般的に記載してきた。一般的開示内より狭い種および下位グループ分けは、いずれも本発明の一部を形成する。これは、用いられる材料が本明細書中に具体的に記載されているか否かに関わらず、任意の対象を属から除去する条件または負の制限と共に、本発明の一般的な詳細を含む。

加えて、本発明の特徴または局面をマーカッシュグループに基づいて記述する場合、当業者であれば、本発明が任意の個々の部材またはマーカッシュグループの部材の下位概念に基づいて記載されることを理解する。

本明細書中の全ての公開文献、特許出願および他の参照文献全体を、あたかも個々の文献を援用しているかのように、明示的に援用する。矛盾が発生した場合、本明細書（定義を含む）が優先される。

上記の開示は、本発明を当業者に理解してもらうことのみを意図したものであり、限定的なものではない。特許請求の範囲から逸脱することなく、開示の実施形態において多様な変更が可能であることが理解される。従って、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって解釈されるべきである。

Claims (38)

1. 対象におけるがんの１つ以上の症状の治療、緩和、改善、軽減、遅延発病、進行抑制、重症度低減および／または発生低減のための治療方法であって、
   ａ．ｐ６２ポリペプチドまたは
   ｂ．ｐ６２をコードする核酸、
   を含む薬剤を前記対象へ投与することを含む方法。
2. 前記薬剤が、
   ａ．１つ以上のドメイン欠失、
   ｂ．前記ｐ６２をコードする核酸は、配列番号１と少なくとも９５％同一である、または
   ｃ．前記ｐ６２ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも９８％同一である、
   を含む請求項１記載の方法。
3. 前記１つ以上のドメイン欠失が、ＰＢ１、ＺＺ、ＮＬＳ２、ＴＢ、ＮＬＳ１、ＮＥＳ、ＬＩＲ、ＫＩＲ、およびＵＢＡからなる群から選択される１以上における欠損である請求項２記載の方法。
4. 前記ｐ６２ポリペプチドまたはｐ６２をコードする核酸が、融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸をそれぞれさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記ｐ６２ポリペプチドが、翻訳後修飾されている請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記ｐ６２ポリペプチドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳後修飾されている請求項５記載の方法。
7. 前記薬剤が、非経口、経口、経鼻的、経直腸的、経皮的、膣内、またはエアロゾルを介した吸入からなる群から選択される経路のいずれかによって投与される請求項１〜６のうちいずれかの方法。
8. 前記薬剤が、血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、眼球内、皮内および皮下からなる群から選択される経路のいずれかによって投与される請求項７記載の方法。
9. 前記薬剤が、臓器または腫瘍へ投与される請求項７記載の方法。
10. 前記対象に、アジュバントを投与することをさらに含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記アジュバントが、ゲル型、微生物、粒子性、油エマルジョン、サーファクタントベース、および合成アジュバントからなる群から選択される請求項１０記載の方法。
12. １つ以上の共刺激成分を投与することをさらに含む請求項１〜１１記載のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記１つ以上の共刺激成分が、細胞表面タンパク質、サイトカイン、ケモカインおよびシグナル伝達分子からなる群から選択される請求項１２記載の方法。
14. 抑制または負の調節免疫機構を遮断する１つ以上の分子を投与することをさらに含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 抑制または負の調節免疫機構を遮断する前記１つ以上の分子が、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ４抗体、および前記融合タンパク質ＩＬ１３Ｒａ２−Ｆｃからなる群から選択される請求項１４記載の方法。
16. 前記対象へ１つ以上の抗がん治療を投与することをさらに含む、請求項１〜１５のうちいずれか１項に記載の方法。
17. 前記１つ以上の抗がん治療が、化学療法分子、放射、および抗血管形成分子からなる群から選択される請求項１６記載の方法。
18. 前記化学療法分子が、シクロホスファミド、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ナベルビン、カペシタビン、およびマイトマイシンＣからなる群から選択される請求項１７記載の方法。
19. 前記がんが、乳癌、肺癌、前立腺癌、胃癌、結腸直腸癌、皮膚癌、頭部および頚部の癌、気管支癌、膵臓癌、膀胱癌、脳癌、中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、口腔または咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、卵巣癌、子宮癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、肉腫および血液組織の癌からなる群から選択される請求項１〜１８のいずれか１項に記載方法。
20. 前記対象が、過去に癌治療を受けていた対象、がんの家族歴がある対象、およびがんの素因を有する対象からなる群から選択される請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記薬剤が、ｐ６２をコードする核酸を含み、
    前記ｐ６２をコードする核酸が、配列番号１と少なくとも９５％同一であり、
    前記ｐ６２をコードする核酸が、プラスミドまたはウイルスベクターをさらに含む請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 核酸ベースの免疫付与の効率を向上させるための戦略をさらに含む請求項２１記載の方法。
23. 前記戦略が、自己複製ウイルスレプリコン、コドン最適化、ｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーション、ＣｐＧ刺激モチーフの採用、前記エンドサイトーシスまたはユビキチン処理経路の標的化のための配列、マレック病ウイルス型１ＶＰ２２配列、プライムブーストレジメン、および粘膜送達ベクターの使用からなる群から選択される請求項２２記載の方法。
24. 対象におけるがんの１つ以上の症状の治療、緩和、改善、軽減、遅延発病、進行抑制、重症度低減および／または発生低減させる薬剤であって、
    ａ．少なくとも１つ以上のドメイン欠失を含むｐ６２ポリペプチドまたはｐ６２をコードする核酸、または、
    ｂ．ｐ６２ポリペプチドの１つ以上のドメインまたはｐ６２の１つ以上のドメインをコードする核酸、
    を含む薬剤。
25. 前記１つ以上のドメイン欠失またはドメインが、それぞれＰＢ１、ＺＺ、ＮＬＳ２、ＴＢ、ＮＬＳ１、ＮＥＳ、ＬＩＲ、ＫＩＲおよびＵＢＡからなる群から選択される請求項２４記載の薬剤。
26. 前記ｐ６２ポリペプチドまたはｐ６２をコードする核酸が、融合ポリペプチドまたはコードする核酸をそれぞれさらに含む請求項２４または２５記載の薬剤。
27. 前記ｐ６２ポリペプチドが、翻訳後修飾されている請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の薬剤。
28. 前記ｐ６２ポリペプチドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳後修飾されている請求項２７記載の薬剤。
29. アジュバントをさらに含む請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の薬剤。
30. 前記アジュバントは、ゲル型、微生物、粒子性、油エマルジョン、サーファクタントベース、および合成アジュバントからなる群から選択される請求項２９に記載の薬剤。
31. １つ以上の共刺激成分を投与することをさらに含む請求項２４〜３０のいずれか１項に記載の薬剤。
32. 前記１つ以上の共刺激成分が、細胞表面タンパク質、サイトカイン、ケモカインおよびシグナル伝達分子からなる群から選択される請求項３１記載の薬剤。
33. 抑制または負の調節免疫機構を遮断する１つ以上の分子を投与することをさらに含む、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の薬剤。
34. 前記抑制または負の調節免疫機構を遮断する１つ以上の分子が、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ４抗体、および前記融合タンパク質ＩＬ１３Ｒａ２−Ｆｃからなる群から選択される請求項３３記載の薬剤。
35. 化学療法分子または抗血管形成分子をさらに含む請求項２４〜３４のいずれか１項に記載の薬剤。
36. 前記化学療法分子が、シクロホスファミド、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ナベルビン、カペシタビン、およびマイトマイシンＣからなる群から選択される請求項３５記載の薬剤。
37. 前記ｐ６２をコードする核酸が、プラスミドまたはａウイルスベクターをさらに含む請求項２４〜３６のうちいずれかの薬剤。
38. 対象への投与に適した請求項２４〜３７のいずれかの薬剤を含む組成物。