JP7099956B2 - がんの治療のためのｍｉｃａ／ｂアルファ３ドメインによるワクチン接種 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、2015年12月4日に出願された米国仮出願第62/263,377号、および2016年11月15日に出願された同第62/422,454号の優先権および恩典を主張し、これらの各々の内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。

配列表の参照による組み入れ
2016年12月2日に作成され、サイズが30.9 KBである、「DFCI-126-001WO-Sequence Listing.txt」という名称のテキストファイルの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。

発明の分野
本発明は、概して、対象において抗腫瘍免疫反応を誘導するための組成物および方法に関する。

政府の関与
本発明は、国立衛生研究所によって付与されたR01CA173750に基づく政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

発明の背景
がん免疫療法の分野における最近の進歩によって、進行がんでさえも根絶する免疫系の能力が実証された。これらの療法はがん治療の様相を急速に変えている。腫瘍再発を予防するために抗体の反復投与を必要とするモノクローナル抗体療法とは異なり、ワクチンは内因性免疫記憶を誘導することができ、従って、長期保護を提供する可能性を有する。

ワクチン療法についての抗原の選択は、腫瘍成長における候補抗原の生物学的な役割および正常組織と比較しての腫瘍細胞によるそれらの発現レベルの包括的な理解を必要とする。MICAおよび密接に関連するMICBタンパク質(MICと略される)は、正常細胞によって非常に低いレベルで発現されるかまたは存在しないが、ゲノム損傷に続発する様々な異なるがんによって広くアップレギュレートされる抗原である。MICは、細胞傷害性リンパ球、具体的には、NK細胞、CD8 T細胞およびガンマ-デルタT細胞上のNKG2D受容体についての重要なリガンドである。MICの発現はそのような細胞を免疫系による排除に向ける。しかし、多くの腫瘍は、細胞表面からMICを脱落させること（shedding）によって、この重要な免疫監視経路を逃れることがわかり、このプロセスにおいて、MICアルファ3ドメインが、ジスルフィドイソメラーゼERp5によってアンフォールディングされ、ADAM 10およびADAM 17のようなマトリックスメタロプロテアーゼによる切断に対して敏感になる。脱落MICは、NK細胞およびCD8 T細胞上のNKG2D受容体のダウンレギュレーションを引き起こす。従って、タンパク質分解的切断は、免疫刺激タンパク質を免疫抑制物質へ変える。

従って、MICA脱落を阻害する化合物についての必要性が存在する。

様々な局面において、本発明は、免疫原性成分として、有効量のMICアルファ3-ドメインを含むペプチドを含むワクチン組成物を提供する。有効量は、MICアルファ3-ドメインに対する免疫反応を誘発するために有効な量を意味する。

MICアルファ3-ドメインはMICAまたはMICBアルファ3-ドメインである。任意で、MICアルファ3-ドメインは非グリコシル化型である。好ましくは、ペプチドは、SEQ ID NO: 3またはSEQ ID NO: 4のアミノ酸配列を含む。様々な局面において、ワクチン組成物は複数のペプチドを含む。いくつかの局面において、ペプチドは担体タンパク質へコンジュゲートされている。

別の局面において、本発明は、MICアルファ3-ドメインタンパク質へ連結された単量体フェリチンサブユニットタンパク質を有する融合タンパク質を提供する。単量体フェリチンサブユニットタンパク質は、融合タンパク質がナノ粒子へ自己組織化することを可能にするドメインを有する。好ましい態様において、単量体サブユニットはヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）フェリチンタンパク質である。任意で、融合タンパク質は、CpGオリゴヌクレオチドへさらにコンジュゲートされている。

さらに別の局面において、本発明は、本発明に従う融合タンパク質を含むナノ粒子を提供する。ナノ粒子は複数のMICアルファ3-ドメインペプチドを含む。

さらに別の局面において、本発明は、本発明に従うナノ粒子を含むワクチン組成物を提供する。ワクチン組成物はGM-CSFをさらに含み得る。

さらなる局面において、本発明は、本発明に従うワクチン組成物を対象へ投与することによって対象中のがんを治療する方法を提供する。任意で、ワクチン組成物はGM-CSFを含有する。対象は、血清中の脱落MICについての検査で陽性であった。ワクチン組成物を治療レジメンの一環として投与する。治療レジメンは、例えば、放射線療法、標的療法、免疫療法、または化学療法を含む。任意で、対象に、MICアルファ3-ドメイン抗原以外の抗原について特異的な1つまたは複数のワクチンをさらに投与する。

別の局面において、本発明は、MICアルファ-3ドメインを発現する細胞を含むワクチンを対象へ投与することによってがんを治療するための方法を提供する。さらなる局面において、本発明は、MICに対する免疫反応を、複製または非複製ウイルスの使用によって誘導する、がんを治療するための方法を提供する。

特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または等価の方法および材料が本発明の実施において使用され得るが、好適な方法および材料を下記に記載する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が明示的に組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書が優先する。さらに、本明細書に記載される材料、方法、および例は、例示にすぎず、限定することを意図したものではない。

[本発明1001]
免疫原性成分として、有効量のMICアルファ3-ドメインを含むまたはこれからなるペプチドを含むワクチン組成物であって、
有効量が、MICアルファ3-ドメインに対する免疫反応を誘発するために有効な量である、ワクチン組成物。
[本発明1002]
MICアルファ3-ドメインがMICAまたはMICBアルファ3-ドメインである、本発明1001のワクチン組成物。
[本発明1003]
MICアルファ3-ドメインが非グリコシル化型である、本発明1001または1002のワクチン組成物。
[本発明1004]
ペプチドが、SEQ ID NO: 3またはSEQ ID NO: 4のアミノ酸配列を含むまたはこれからなる、本発明1001～1003のいずれかのワクチン組成物。
[本発明1005]
複数のペプチドを含む、本発明1001～1004のいずれかのワクチン組成物。
[本発明1006]
ペプチドが担体タンパク質へコンジュゲートされている、本発明1001～1005のいずれかのワクチン組成物。
[本発明1007]
GM-CSFをさらに含む、本発明1001のワクチン組成物。
[本発明1008]
MICアルファ3-ドメインタンパク質へ連結された単量体フェリチンサブユニットタンパク質を含む融合タンパク質であって、
単量体フェリチンサブユニットタンパク質が、融合タンパク質がナノ粒子へ自己組織化することを可能にするドメインを含む、融合タンパク質。
[本発明1009]
単量体サブユニットが、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）フェリチンタンパク質の単量体サブユニットである、本発明1008の融合タンパク質。
[本発明1010]
シトシン-グアノシン(CpG)オリゴヌクレオチド配列をさらに含む、本発明1008または1009の融合タンパク質。
[本発明1011]
本発明1008～1010のいずれかの融合タンパク質を含む、ナノ粒子。
[本発明1012]
複数のMICアルファ3-ドメインペプチドを含む、ナノ粒子。
[本発明1013]
本発明1011または1012のナノ粒子を含む、ワクチン組成物。
[本発明1014]
GM-CSFをさらに含む、本発明1013のワクチン組成物。
[本発明1015]
本発明1001～1007または1013～1014のいずれかのワクチン組成物を対象へ投与する工程を含む、対象中のがんを治療する方法。
[本発明1016]
GM-CSFを投与する工程をさらに含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
ワクチン組成物を治療レジメンの一環として投与する、本発明1015または1016の方法。
[本発明1018]
治療レジメンが、放射線療法、標的療法、免疫療法、または化学療法である、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記対象が、血清中の脱落MICについての検査で陽性であった、本発明1015～1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
MICアルファ3-ドメイン抗原以外の抗原について特異的な1つまたは複数のワクチンを対象へ投与する工程を含む、本発明1015～1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
MICアルファ-3ドメインを発現する細胞を含むワクチンを前記対象へ投与する工程を含む、がんを治療するための方法。
[本発明1022]
MICに対する免疫反応を、複製または非複製ウイルスの使用によって誘導する、がんを治療するための方法。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなり、これらによって包含される。

NKG2Dホモ二量体およびMICA間の相互作用を示す概略図である。MICA-アルファ3ドメインが参考のために特定されている。Nat Immunol. 2001 May;2(5):443-51. Complex structure of the activating immunoreceptor NKG2D and its MHC class I-like ligand MICAより。 腫瘍が腫瘍細胞表面からのMICの脱落を通して免疫監視を逃れる一つの機構を示す概略図である。 フェリチン粒子を描写する概略図である。 ヒトおよびマウスフェリチンに対する細胞性および体液性免疫反応を示すマップを描写する概略図である。 MICAアルファ3フェリチン融合遺伝子構築物の概略図である。 XK16/60 Superdex200カラム(流速: 2ml/分; ランニングバッファー: 50mM Tris, 150mM NaCl pH 7.5)を使用してのMICAアルファ3-フェリチンのサイズ排除クロマトグラムである(左)。図2Bは、タンパク質ピークでの22～27分に採取されたサンプルを含有する還元条件下でのSDSゲルをさらに描写する(右)。 脱グリコシル化MICAアルファ3構築物の概略図である。 Superdex200カラム(流速: 1ml/分; ランニングバッファー: 50mM Tris, 150mM NaCl pH 7.5)を使用してのMICAアルファ3のサイズ排除クロマトグラムである(左)。図2Dは、ピークタンパク質での16～20分に採取されたサンプルを含有する還元条件下でのSDSゲルをさらに描写する(右)。 皮下注射のためのメソポーラスシリカロッド(MSR)ワクチンの使用、および結果として生じる強力な免疫反応の誘導を描写する概略図である。Kim, J & Aileen, W.L. et al. Nature Biotech. 2015を参照のこと。 図４Ａ～Ｂ：肺転移モデルにおけるMICα3ドメインワクチンの効能を描写する一連のグラフである。図4Aに示されるデータは以下のように得られた。スキャフォールド無しのボーラス(ボーラス)としてまたはメソポーラスシリカロッド(MSR)スキャフォールド(MSRワクチン)内のいずれかの、200μgのMICα3タンパク質、1μgのGM-CSFおよび100μgのCpG-ODNで、B6マウスを免疫化した。第28日にマウスにブースター注射を1回受容させた。3週間後、マウスを5X10⁵個のB16-MIC腫瘍細胞のi.v.注射によって負荷した。腫瘍細胞注射後、第14日に肺転移数を定量化した。図4Bにおいて得られたデータは以下のように得られた。腫瘍細胞注射後、第0日、第5日、および第13日に、脱落MICをELISAによって定量化した。以前の実験によって、MICα3ドメイン特異的抗体は、脱落MICを検出するために使用されるELISAに干渉しないことが示されていた。 図５Ａ～Ｂ：MICA-フェリチン融合タンパク質でのワクチン接種が高力価のMICA特異的抗体を誘導することを実証する一連のプロットおよびグラフである。図5Aは、B16F10マウス黒色腫細胞の表面上に発現された完全長MICAに対する免疫化マウスの血清中のMICAα3特異的抗体のFACSプロットを描写する。B16F10黒色腫細胞にヒトMICA cDNA(対立遺伝子009)をトランスフェクトし、次いで、アイソタイプ対照抗体(陰性対照)または飽和濃度のMICA特異的マウスmAb(6D4、陽性対照)で標識した。次いで、このシステムを使用し、MICAα3-フェリチンまたは対照抗原(OVA)でワクチン接種されたマウス由来の血清を試験した。PE標識抗マウスIgG二次抗体を使用し、細胞表面へ結合された抗体を検出した。蛍光をFACSによって定量化した。ワクチン接種後、第14日～第42日におけるマウス由来の血清1μlでさえ、強い染色が検出された。図5Bは、B16F10マウス黒色腫細胞の表面上に発現された完全長MICAへの免疫化マウスの血清中のMICAα3特異的抗体の結合の3つのレプリケートの+/- SDを示す平均蛍光強度(MFI)の棒グラフを描写する。 ワクチン接種で誘導されたIgGの種々のサブクラスを決定するためにELISAによってアッセイされたMICA-フェリチン免疫化マウス由来の試験された血清を描写する一連のグラフである。 MICA-フェリチン免疫化群中の血清抗体が腫瘍細胞表面からのMICA脱落を妨げることを示すグラフである。 図８Ａ～Ｂ：MICA-フェリチンワクチンの治療活性を描写する一連のグラフである。C57BL/6マウスをMICAα3-フェリチンまたはオボアルブミンで免疫化し、第28日にブースター注射を受容させた。肺転移を形成する5x10⁵個のB16-MICA腫瘍細胞の静脈内注射によってマウスに負荷した。肺転移数を第14日にカウントし(図8A)、脱落MICAを血清中において定量化した(図8B)。MICAα3ドメインワクチンは肺転移数を実質的に減少させ、一方、対照ワクチンは効果を有さなかった。さらに、脱落MICAは、MICAα3-フェリチンワクチンを受容したマウスの血清中において検出不可能となり、一方、脱落MICAレベルは両方の対照群において非常に高かった。図8Aは、MICAアルファ3-フェリチンでの免疫化が、ナイーブ対照、またはOVA-タンパク質注射を受容した動物と比較して、転移を予防することを実証している。図8Bは、ワクチン接種マウスが血清中において検出不可能なレベルのsMICA(脱落MICA)を有したことを示す、ELISAによって得られた結果を示すグラフである。 図９Ａ～Ｃ：MICA-フェリチンワクチンによって誘導された抗体の力価(図9A)、ならびに肺結節の数(図9B)およびsMICAの量(図9C)に対するワクチン投薬量の効果を描写する一連のグラフである。 フローサイトメトリーによって試験された、B16F10マウス黒色腫細胞の表面上に発現された完全長MICAへの、免疫化マウスの血清中のMICAα3特異的抗体の結合に対する、MICAα3ワクチンの脱グリコシル化型(フェリチンナノ粒子へ連結されていない)の効果を描写する一連のグラフ(図10A)である。 ワクチン接種で誘導されたIgGの種々のサブクラスを決定するために使用されたELISAアッセイからの結果を描写するグラフ(図10B)である。 図１１Ａ～Ｂ：MICAα3ワクチン単独(フェリチン融合無し)がインビボで有意な治療的有用性を有することを描写する一連のグラフである。図11Aは、MICAαワクチン単独でのワクチン接種後の肺転移数を描写するグラフである。図11Bは、MICAαワクチン単独でのワクチン接種後、第0日、第5日および第13日での血清中のsMICAの量を描写するグラフである。 図１２Ａ～Ｂ：MICA-フェリチンワクチンがB16F10皮下黒色腫モデルにおいて腫瘍成長を遅らせることを示す。図12Aにおいて、7週齢C57BL/6雌性マウス(n=8)を、MICA-フェリチンワクチンで免疫化し、第12日にブーストした。初回ワクチン接種後、第25日に、0.5x10⁶個のMICA発現性B16F10細胞の皮下注射でマウスに負荷し、腫瘍体積を一日おきに測定した。MICA-フェリチン免疫化群における腫瘍成長は、ナイーブ・未処置年齢適合対照群(黒丸)と比較して、有意により遅かった(白四角)ことがわかった。図12Bにおいて、sMICAレベルは、MICA-フェリチンワクチン(白三角)で免疫化されたマウスの血清中において検出不可能であり、一方、高レベルのsMICAが、非免疫化対照群(黒三角)の血清中において腫瘍負荷後2週間以内に検出された。 図１３Ａ～Ｂ：CD8 T細胞の除去が、MICA-フェリチンワクチン接種B16F10皮下黒色腫モデルにおいて腫瘍成長を加速することを示す。図13Aにおいて、7週齢C57BL/6雌性マウスを、MICA-フェリチンワクチン(n=16)またはOVA対照ワクチン(n=8)で免疫化し、第14日にブーストした。初回ワクチン接種後、第21日に、0.5x10⁶個のMICA発現性B16F10細胞の皮下注射で、マウスに負荷した。腫瘍負荷より2日前に、およびその後週2回、マウス1匹当たり100μgの用量で、研究エンドポイントまで、マウスに200μgの抗CD8抗体(n=8)またはアイソタイプ対照抗体(n=8)の静脈内注射を受容させた。腫瘍体積を一日おきに測定した。腫瘍が≧250mm²に達した時に、マウスを安楽死させた。腫瘍は、CD8抗体で処置されたOVAタンパク質ワクチン接種対照マウス(白三角)において第12日までに、ナイーブ・未処置・非除去対照群(黒丸)において第14日までに、最大体積に達した。CD8除去は、アイソタイプ抗体(白四角)を受容したMICA-ワクチン接種群と比較して、MICA-ワクチン接種群において腫瘍成長を加速させた(黒三角)。図13Bにおいて、年齢適合ナイーブ・未処置・非除去対照群(太い実線)、OVAタンパク質ワクチン接種群(細い点線)、MICA-フェリチンワクチン接種・CD8除去(太い点線)、およびMICA-フェリチンワクチン接種・アイソタイプ抗体注射マウス(細い実線)を示す、CD8除去実験の生存時間解析。 図１４Ａ～Ｂ：NK細胞がB16F10皮下黒色腫モデルにおけるMICA-フェリチンワクチンの治療効果に寄与することを示す。図14Aにおいて、7週齢C57BL/6雌性マウスをMICA-フェリチンワクチン(n=16)で免疫化し、第14日にブーストした。初回ワクチン接種後、第21日に、0.5x10⁶個のMICA発現性B16F10細胞の皮下注射で、マウスに負荷した。腫瘍負荷より2日前におよびその後週2回、マウス1匹当たり100μgの用量で、研究エンドポイントまで、マウスに200μgの抗NK1.1抗体(n=8)またはアイソタイプ対照抗体(n=8)の静脈内注射を受容させた。腫瘍体積を一日おきに測定した。腫瘍が≧250mm²に達した時に、マウスを安楽死させた。腫瘍は、ナイーブ・未処置・非除去対照群(黒丸)において第14日までに最大体積に達した。NK細胞除去は、アイソタイプ抗体(黒四角)を受容したMICA-ワクチン接種群と比較して、MICA-ワクチン接種群において腫瘍成長を加速させた(白三角)。図14Bにおいて、年齢適合ナイーブ・未処置・非除去対照群(太い実線)；MICA-フェリチンワクチン接種・NK細胞除去(点線)、およびMICA-フェリチンワクチン接種・アイソタイプ抗体注射マウス(細い実線)を示す、NK細胞除去実験の生存時間解析。 図１５Ａ～Ｂ：MICA-フェリチンワクチンに応答して生じた血清ポリクローナル抗体が、B16F10-MICA腫瘍細胞の肺転移を予防することを示す。図15Aにおいて、8週齢Ighmtm1Cgn/J雌性マウス(n=12)を、0.5x10⁶個のMICA発現性B16F10黒色腫細胞の静脈内注射で負荷した。マウスを3つのコホートへ無作為化し、各々は4匹のマウスを含んだ。腫瘍負荷後、第1日、第2日、第4日および第6日に、ナイーブ、OVA-タンパク質またはMICA-フェリチン免疫化C57BL/6マウス由来のエンドポイント血清100μlをマウスに注射した(腹腔内経路)。マウスを腫瘍負荷から14日後に安楽死させ；肺を摘出し、10%中性緩衝ホルマリン中に固定し、肺転移数を定量化した。MICA-フェリチンワクチン接種群(白四角)由来の血清が注射されたマウスは、未処置・年齢適合対照群(黒丸)およびOVA-タンパク質免疫化群由来の血清が注射されたマウスと比較して、有意により少ない肺転移を有した。図15Bにおいて、sMICAレベルは、ナイーブまたはOVA-タンパク質免疫化群由来の血清を受容したマウスと比較して、MICA-フェリチンワクチン接種群(白四角)由来の血清を受容したマウスにおいてより低かった。 図１６Ａ～Ｂ：MICA-フェリチンワクチンはまたB16F10-MICB005皮下腫瘍成長を制御することを示す。図16Aにおいて、7週齢C57BL/6雌性マウス(n=4)をMICA-フェリチンワクチンで免疫化し、第14日にブーストした。初回ワクチン接種後、第21日に、0.5x10⁶個のMICB発現性B16F10細胞の皮下注射で、マウスに負荷し、腫瘍体積を一日おきに測定した。MICA-フェリチン免疫化群におけるB16F10-MICB腫瘍成長は、OVA-タンパク質免疫化対照群(黒丸)と比較して、有意により遅いことがわかった(白四角)。図16Bにおいて、sMICBレベルは、MICA-フェリチンワクチン(白四角)で免疫化されたマウスの血清中においてほぼ検出不可能であり、一方、高レベルのsMICBが、OVA-タンパク質免疫化対照群(黒丸)の血清中において腫瘍負荷後、2週間以内に検出された。 メソポーラスシリカロッド(MSR)を用いて(点線)またはMSR無しでMICA-フェリチンへのCpGの直接コンジュゲーションを用いて(細い実線)製剤化されたMICA-フェリチンワクチンで免疫化されたマウス由来の血清での、MICAを発現するB16細胞株の染色を示す一連のグラフである。これらのデータは、MICA-フェリチンペプチドへ直接コンジュゲートされたCpGでのワクチン接種が、MSRスキャフォールドを用いて製剤化されたワクチンと比べて、MICAアルファ3ドメインに対するより強い免疫反応を誘導することを説明している。MSRワクチンについて、5mg MSR+200ugタンパク質+100ug CpG+1ug GM-CSF；第0日に免疫化；第14日にブースト；第28日からの血清。直接コンジュゲーションについて、約5ug CpGへコンジュゲートされた200ugタンパク質(一次免疫化)；ブースト(約5ug CpGへコンジュゲートされた100ugタンパク質 + AddaVax (100ul) + GM-CSF (1ug)；第0日に免疫化；第21日にブースト；第28日からの血清。 図18A：精製されたMICAα3-フェリチンナノ粒子の電子顕微鏡写真である。図18B：アフィニティーおよびゲル濾過クロマトグラフィー後のワクチンタンパク質のSDS-PAGEの写真である。 MICAα3ドメインワクチンによって誘導されたポリクローナル抗体が、ヒト腫瘍細胞によるMICA脱落を阻害することを示すグラフである。ヒトA375黒色腫細胞株によるMICA脱落を、サンドイッチELISAを用いて定量化した。MICAα3-フェリチンでワクチン接種されたマウス由来の少量の血清(1～10μl)の添加は脱落を強く阻害し、一方、対照マウス由来の血清の添加は効果をほとんど有さなかった。 図２０Ａ～Ｃ：MICA-フェリチンワクチンが、新生抗原に対する二次T細胞応答を誘導することを示す一連のグラフである。本発明者らは、MICBα3ドメインワクチンが腫瘍新生抗原に対する二次応答を誘導するかどうかを調べた。リンパ節T細胞をCFSEで標識し、B16F10腫瘍についてCD4 T細胞エピトープと以前同定された4つの異なる新生抗原ペプチドと共に3日間培養した。CD4 T細胞応答が、増殖細胞中の細胞内IFNγ染色に基づいて(CFSE^low)、4つのペプチドのうちの3つについて確認された。本発明者らは、MICA抗体が、樹状細胞によるアポトーシス性腫瘍断片のFc受容体媒介性取り込みを引き起し、それによって新生抗原に対するT細胞応答を促進すると仮定する。図20A～20Bにおいて、B6マウスをMICBα3-フェリチンまたはOVA(n=5/群)で免疫化し、B16F10-MICB腫瘍細胞を注射した。腫瘍移植から10日後に、T細胞を腫瘍排出リンパ節から単離し、CFSEで標識した。B16F10腫瘍について以前同定された4つの異なるCD4新生抗原ペプチド(10μg/ml)の存在下で、CD11c+脾臓細胞と共にT細胞を3日間培養した。細胞内IFNγ染色を行い、細胞内IFNγについて陽性の増殖T細胞(CFSE-low)を定量化した。新生抗原ペプチドに対するT細胞応答を、OVA対照抗原(図20A)またはMICBα3ドメイン(図20B)で免疫化されたマウス間で比較した。両方のT細胞集団を、M30新生抗原と共にインビトロでインキュベートした。図20Cにおいて、増強されたT細胞応答がMICB免疫化マウスにおいて観察された、3つの新生抗原(M30、M44およびM48)に対するT細胞応答のサマリー。 図２１Ａ～Ｂ：CpGとコンジュゲートされたMICA-フェリチンナノ粒子での免疫化が高力価抗体を誘導することを示すグラフである。図21Aにおいて、マカクMICA/B-フェリチンを、CLICK化学(タンパク質-オリゴコンジュゲーションキット、Solulink)によってCpG ODN 1826へコンジュゲートした。簡潔には、S-HyNic(スクシンイミジル-6-ヒドラジノ-ニコチンアミド)リンカーを、リジン上の第一級アミンを通してタンパク質へコンジュゲートし、S-4B(スクシンイミジル-4-ホルミルベンズアミド)リンカーをCpGオリゴへ付加した。修飾されたタンパク質およびオリゴを、触媒コンジュゲーション反応においてインキュベートした。この反応に続いて、過剰量のコンジュゲートされていないCpGをサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。形成されたタンパク質-オリゴコンジュゲート結合(安定したビス-アリールヒドラゾン結合)は、350nmでUV追跡可能である(グラフを参照のこと)。図21Bにおいて、CpGコンジュゲート化タンパク質を使用して、C57BL/6マウスを免疫化した。血清中のMICA/B特異的抗体を、B16-MICA細胞の標識化によって第14日に分析した。CpG連結タンパク質は、スキャフォールドを用いて製剤化されたMICA-フェリチンタンパク質(点線；太い実線はバックグラウンド染色レベルを示す)と比較して、より高力価の抗体を誘導した(細い実線)。

発明の詳細な説明
本発明は、がん用のワクチンを提供する。より具体的には、本発明は、MICアルファ3-ドメインに対する免疫反応を誘発することができるMICアルファ3-ドメインワクチンを提供する。重要なことには、このワクチンは、MICα3ドメインに対する抗体を誘発するが、NK細胞上のNKG2D受容体へのα1-α2ドメインの結合に干渉しないよう、MICのα1-α2ドメインに対する抗体は誘発しない。

ワクチンの目的は、MICAの膜近位Igドメインへ結合するポリクローナル抗体を誘導し、腫瘍細胞からのこのタンパク質のタンパク質分解的脱落を阻害することである。MICAアルファ3ドメインをナノ粒子の表面上に発現させた。具体的には、フェリチンは自発的にナノ粒子を形成することを考慮して、MICAアルファ3ドメインコード配列をフェリチン配列(H.ピロリ由来)へ融合させた。アジュバントとしてのCpGと注射部位へ樹状細胞をリクルートするためのGM-CSFとを使用する免疫化スキャフォールド(メソポーラスシリカロッド)を用いて、または、GM-CSFおよびMICAアルファ3ドメイン-フェリチン融合タンパク質へCpGを直接コンジュゲートすることのいずれかで、ワクチンを製剤化した。これらのワクチンの注射は、MICAアルファ3ドメインに対して向けられた高力価抗体を誘導することがわかった。驚くべきことに、CpGが直接コンジュゲートされたMICAアルファ3ドメイン-フェリチン融合タンパク質が、より高い抗体力価を達成した。

本発明のワクチン組成物によって誘導されたこれらの抗体は、複数のMICA対立遺伝子へ結合し、MICA陽性であった腫瘍細胞を染色した。重要なことには、これらのポリクローナル抗体は、腫瘍細胞によるMICAの脱落を阻害した。ワクチンのインビボ効能を、黒色腫の転移性マウスモデルにおいて試験した。B16F10黒色腫細胞を、MICAを発現するように遺伝子改変し、マウスに2回ワクチン接種した後に、静脈内注射した。ワクチンは高レベルの保護を提供し、一方、対照マウスは多数の肺転移(約150～200)を有した。

本発明のワクチンは、特定の抗原を発現している全てのがん細胞を排除する免疫反応を誘導しようとする従来のがんワクチンとは概念的に異なる。対照的に、本発明のワクチンの目的は、腫瘍が重要な免疫監視経路から逃れるのを妨げることである。本ワクチンは、MICA抗体を用いた患者の研究、およびMIC発現は細胞傷害性リンパ球による排除に対して細胞にフラグを立てるという事実に基づいて、安全であると考えられる。ワクチンアプローチの利点は以下である：低コストのワクチン、免疫監視からの逃れに対する長期保護、免疫複合体の形成によって脱落を阻害しかつ脱落MICを迅速に取り除くポリクローナル抗体の誘導、ならびに樹状細胞によるアポトーシス性腫瘍断片の増強された取り込みによる他の腫瘍抗原に対するT細胞応答の誘導。

本発明によってさらに提供されるのは、それらの表面上にMICAアルファ3ドメインの免疫原性部分をディスプレイする、自己組織化性フェリチン系ナノ粒子である。任意で、ナノ粒子はCpGオリゴヌクレオチドをさらに含む。例えば、CpGオリゴヌクレオチドは、MICAアルファ3ドメイン-フェリチン融合タンパク質へ共有結合されている。そのようなナノ粒子は、個体にワクチン接種するために有用である。従って、本発明はまた、そのようなナノ粒子を製造するための融合タンパク質、およびそのようなタンパク質をコードする核酸分子に関する。さらに、本発明は、本発明のナノ粒子を製造する方法、および個体にワクチン接種するためにそのようなナノ粒子を使用する方法に関する。

本発明によってさらに提供されるのは、CpGオリゴヌクレオチドへ連結されたMICアルファ3-ドメインペプチドを含むワクチン組成物である。

MICアルファ3ドメインタンパク質に対するワクチン
本発明は、免疫原性成分として、少なくとも1つのMICアルファ3-ドメインペプチドを含む、ヒトへの投与に適したワクチン組成物を提供する。MICアルファ3-ドメインペプチドは、MICAまたはMICBの完全長アルファ3ドメインを含むまたはこれからなり、このドメインは、SEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 2のアミノ酸181～274に対応する。任意で、ペプチドは、1つまたは複数のフランキングアミノ酸を含む。本文脈において、用語「フランキングアミノ酸」は、完全長参照配列［MICAについてはSEQ ID NO: 1またはMICBについてはSEQ ID NO: 2］中のMICアルファ3-ドメイン配列に隣接するアミノ酸を指す。ある態様において、ペプチドは、そのN末端もしくはC末端のいずれか、または両末端上に2、4、6、8、または10個のフランキングアミノ酸を含む。いくつかの態様において、ワクチンペプチドは非グリコシル化型である。

好ましい態様において、ワクチンは、以下のアミノ酸配列を有するペプチドを含む：

。

別の態様において、ワクチン組成物は、MICアルファ3-ドメイン配列をコードする核酸を含む。核酸は、発現ベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクターの形態であってもよく、または核酸はナノ粒子中へパッケージされていてもよい。一態様において、核酸は注射によって対象へ送達される。一態様において、核酸は精製DNAとしてまたはナノ粒子の形態で注射される。一態様において、核酸を発現するように改変された、改変免疫細胞が注射される。一態様において、免疫細胞は、核酸を含むベクターでのインビトロでの感染またはトランスフェクションによって改変される。

本発明のワクチン組成物を形成するまたはこれらに組み込まれるペプチドは、化学合成される場合は、混在する化学的前駆体から精製されるか、または、それらが由来する細胞もしくは組織供給源からの細胞性物質を実質的に含まないことが好ましい。具体的な態様において、ペプチドは、混在する化学的前駆体、タンパク質、脂質または核酸が、60%、好ましくは65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または99%除かれている。好ましい態様において、ペプチドは、汚染ウイルスを実質的に含まない。好ましくは、対象への投与用の各組成物は、汚染ウイルスが少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%除かれている。

一態様において、本発明のワクチン組成物のMICアルファ3-ドメインペプチドは、SEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 2のアミノ酸181～274を含むペプチドと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一である1つまたは複数のペプチドを含むまたはこれ（ら）からなる。本文脈において、用語「類似している」は、参照配列と比べての問い合わせ配列における保存的および非保存的アミノ酸変化の数に従って定義されるアミノ酸配列類似性を指す。保存的および非保存的アミノ酸変化は当技術分野において公知である。例えば、W. R. Taylor, The Classification of Amino Acid Conservation, J. Theor. Biol. 1986 119:205-218、およびD. Bordo and P. Argos, Suggestions for "Safe" Residue Substitutions in Site-Directed Mutagensis, 1991 J. Mol. Biol. 217:721-729を参照のこと。一般に、保存的アミノ酸変化は、あるアミノ酸を、具体的にはアミノ酸側鎖に関して、実質的に類似している化学的特性を有する別のアミノ酸で置換することを指す。非保存的変化は、あるアミノ酸を、実質的に異なる化学的特性を有する別のアミノ酸で置換することを指す。一般に、保存的置換は、ポリペプチドの全体的な構造または生物学的機能に影響を与える可能性が低いと当技術分野において認識されるものであり、一方、非保存的変化は、構造および機能に影響を与える可能性がより高いと認識される。

保存的アミノ酸変化の非限定的な例としては、以下のグループ内でのアミノ酸の置換が挙げられる：脂肪族、芳香族、極性、非極性、酸性、塩基性、リン酸化可能な疎水性、親水性、わずかに非極性、わずかに極性、高い非極性、および高い極性。非保存的アミノ酸変化の非限定的な例としては、前述のグループ間でのアミノ酸の置換が挙げられる。

一態様において、保存的アミノ酸変化は、残基対についての置換マトリックスが正の値を有する置換である。アミノ酸置換マトリックスの例は、当技術分野において公知であり、例えば、BLOSUM50マトリックスまたはPAM250マトリックスである(W. A. Pearson, Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, Meth. Enzymology, 1990 183:63-98, ed. R. Doolittle, Academic Press, San Diegoを参照のこと)。スコアリングマトリックスのさらなる例およびそれらの間の比較については、M. S. Johnson and J. P. Overington, 1993, A Structural Basis for Sequence Comparisons: An Evaluation of Scoring Methodologies, J. Mol. Biol. 233:716-738を参照のこと。

好ましい態様において、保存的アミノ酸変化は、あるアミノ酸を、同じ化学的グループ内の別のアミノ酸で置換することであり、ここで、グループは、中性の極性アミノ酸(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly、Asn、Gln)、負に荷電した極性アミノ酸(Asp、Glu)、正に荷電した極性アミノ酸(His、Arg、Lys)、環構造を欠く非極性アミノ酸(Met、Ile、Leu、Val)、環構造を有する非極性アミノ酸(Phe、Tyr、Trp)、およびシステインより選択される。

様々な態様において、ペプチドはCpGオリゴヌクレオチド配列へコンジュゲートされている。

他の態様において、ペプチドは担体タンパク質へコンジュゲートされている。用語「担体タンパク質」は、小さなペプチドおよび大きなポリペプチド(>10 kDa)の両方を包含するように意図される。担体タンパク質は任意のペプチドまたはタンパク質であり得る。それは1つまたは複数のT-ヘルパーエピトープを含み得る。担体タンパク質は以下であり得る：破傷風トキソイド(TT)、破傷風トキソイドフラグメントC、破傷風毒素の非毒性突然変異体［TTの全てのそのような変異体は、本発明の目的について同じタイプの担体タンパクであると見なされることに注意のこと］、破傷風毒素T細胞エピトープを含むポリペプチド、例えば、N19(WO2006/067632)、ジフテリアトキソイド(DT)、CRM197、ジフテリア毒素の他の非毒性突然変異体、例えば、CRM176、CRM 197、CRM228、CRM 45(Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973)；Nicholls and Youle, Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992に記載される、CRM 9、CRM 45、CRM102、CRM 103およびCRM107ならびに他の突然変異；米国特許第4,709,017号または同第4,950,740号に開示される、Glu-148からAsp、GlnもしくはSerへのおよび／またはAla 158からGlyへの欠失または突然変異ならびに他の突然変異；米国特許第5,917,017号または同第6,455,673号に開示される、少なくとも1つまたは複数の残基Lys 516、Lys 526、Phe 530および／またはLys 534の突然変異ならびに他の突然変異；または米国特許第5,843,711号に開示されるフラグメント]（DTの全てのそのような変異体は、本発明の目的について同じタイプの担体タンパクであると見なされることに注意のこと）、肺炎球菌ニューモリシン(Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13)、OMPC(髄膜炎菌外膜タンパク質 － 通常、髄膜炎菌血清群B（N. meningitidis serogroup B）から抽出される － EP0372501)、合成ペプチド(EP0378881、EP0427347)、熱ショックタンパク質(WO 93/17712、WO 94/03208)、百日咳タンパク質(WO 98/58668、EP0471177)、サイトカイン、リンホカイン、成長因子もしくはホルモン(WO 91/01146)、様々な病原体由来抗原からの複数のヒトCD4+ T細胞エピトープを含む人工タンパク質(Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824)、例えば、N19タンパク質(Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72; 4884-7) 肺炎球菌表面タンパク質PspA(WO 02/091998)、鉄取り込みタンパク質(WO 01/72337)、C.ディフィシル（C. difficile）の毒素AまたはB(WO 00/61761)、インフルエンザ菌（H. influenzae）プロテインD(EP594610およびWO 00/56360)、肺炎球菌PhtA(WO 98/18930、Sp36とも呼ばれる)、肺炎球菌PhtD(WO 00/37105に開示されており、Sp036Dとも呼ばれる)、肺炎球菌PhtB(WO 00/37105に開示されており、Sp036Bとも呼ばれる)、またはPhtE(WO00/30299に開示されており、BVH-3と呼ばれる)。

一態様において、担体タンパク質は：破傷風トキソイド(TT)、破傷風トキソイドのフラグメントC、ジフテリアトキソイド(DT)、CRM197、ニューモリシン(Ply)、プロテインD、PhtD、PhtDEおよびN19からなる群より選択され得る。一態様において、担体タンパク質はCRM197である。

HA-フェリチン融合タンパク質を含むワクチン
本発明者らはまた、MICアルファ3-ドメインペプチドとフェリチンタンパク質との融合体（MICアルファ3-フェリチン融合タンパク質)が、がんに対してロバストな免疫反応を誘発するワクチンを生じさせることを発見した。そのようなMICアルファ3-フェリチン融合タンパク質は、それらの表面上にMICアルファ3-ドメインペプチドの免疫原性部分をディスプレイするナノ粒子へ自己組織化する。これらのナノ粒子は、個体にMICアルファ3-ドメインのワクチン接種をするために有用である。従って、本発明の一態様は、本明細書に開示されるMICアルファ3-ドメインペプチドへ連結された本明細書に開示される単量体フェリチンサブユニットを含むMICアルファ3-フェリチン融合タンパク質である。MICアルファ3-フェリチン融合タンパク質はナノ粒子へ自己組織化することができる。様々な局面において、融合タンパク質はCpGオリゴヌクレオチド配列をさらに含む。CpGオリゴヌクレオチド配列は、MICアルファ3-フェリチン融合タンパク質へ共有結合され得る。

フェリチンは、鉱化コアへのおよび鉱化コアからの水和鉄イオンおよびプロトンの輸送を通して多核性Fe(III)₂O₃形成の速度および位置を制御するように主に作用する、全ての動物、細菌および植物中に見られる球状タンパク質である。フェリチンの球状形態は、およそ17～20 kDaの分子量を有するポリペプチドである、単量体サブユニットタンパク質(単量体フェリチンサブユニットとも呼ばれる)で構成されている。各単量体フェリチンサブユニットは、ヘリックスバンドルのトポロジーを有し、これは4つの逆平行のヘリックスモチーフを含み、5番目のより短いヘリックス(c末端ヘリックス)は、4つのヘリックスバンドルの長軸に対してほぼ垂直に横たわっている。慣習に従って、ヘリックスは、N末端からそれぞれ、`A、B、CおよびDならびにE`と呼ばれる。N末端配列は、カプシド3回転軸に隣接して横たわり、表面へ伸びており、一方、Eヘリックスは、4回転軸で一緒にパッキングされ、C末端は粒子コア中へ伸びている。このパッキングの結果、カプシド表面上に2つの細孔が作られる。これらの細孔のうちの一方または両方は、水和鉄がカプシド中へおよびカプシド外へ拡散するポイントを示すことが予想される。産生に続いて、これらの単量体フェリチンサブユニットタンパク質は、球状フェリチンタンパク質へ自己組織化する。従って、フェリチンの球状形態は、24個の単量体フェリチンサブユニットタンパク質を含み、432対称性を有するカプシド様構造を有する。

本発明によれば、本発明の単量体フェリチンサブユニットは、タンパク質の球状形態への単量体フェリチンサブユニットの自己組織化を指示することができる、フェリチンタンパク質の完全長の単一ポリペプチド、またはその任意の部分である。単量体フェリチンサブユニットがその表面上にMICアルファ3-ドメインをディスプレイするナノ粒子へ自己組織化することができる限り、任意の公知のフェリチンタンパク質の単量体フェリチンサブユニット由来のアミノ酸配列が、本発明の融合タンパク質を生成するために使用することができる。一態様において、単量体サブユニットは、細菌フェリチンタンパク質、植物フェリチンタンパク質、藻類フェリチンタンパク質、昆虫フェリチンタンパク質、真菌フェリチンタンパク質および哺乳動物フェリチンタンパク質からなる群より選択されるフェリチンタンパク質に由来する。一態様において、フェリチンタンパク質はヘリコバクター・ピロリに由来する。

本発明のMICアルファ3-フェリチン融合タンパク質は、フェリチンタンパク質の単量体サブユニットポリペプチドの完全長配列を含む必要はない。部分がタンパク質の球状形態への単量体フェリチンサブユニットの自己組織化を指示するアミノ酸配列を含む限り、単量体フェリチンサブユニットタンパク質の部分または領域を利用することができる。そのような領域の一例は、ヘリコバクター・ピロリフェリチンタンパク質のアミノ酸5～167に位置する。より具体的な領域は、Zhang, Y. Self-Assembly in the Ferritin Nano-Cage Protein Super Family. 2011, Int. J. Mol. Sci., 12, 5406-5421に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

本発明の一態様は、単量体フェリチンサブユニット由来の少なくとも25連続アミノ酸、少なくとも50連続アミノ酸、少なくとも75連続アミノ酸、少なくとも100連続アミノ酸、または少なくとも150連続アミノ酸へ連結された、本発明のMICアルファ3-ドメインタンパク質を含むMICアルファ3-フェリチン融合タンパク質であり、ここで、MICアルファ3-フェリチン融合タンパク質はナノ粒子へ自己組織化することができる。本発明の一態様は、フェリチンタンパク質の球状形態への単量体サブユニットの自己組織化を指示するヘリコバクター・ピロリフェリチン単量体サブユニットのアミノ酸配列に対応するフェリチンタンパク質の領域由来の少なくとも25連続アミノ酸、少なくとも50連続アミノ酸、少なくとも75連続アミノ酸、少なくとも100連続アミノ酸、または少なくとも150連続アミノ酸へ連結された、本発明のMICアルファ3-ドメインタンパク質を含むMICアルファ3-フェリチン融合タンパク質であり、ここで、MICアルファ3-フェリチン融合タンパク質はナノ粒子へ自己組織化することができる。

タンパク質の活性に影響を与えることなく、タンパク質のアミノ酸配列中においていくつかの変異を作ることができることが、当技術分野において周知である。そのような変異としては、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失、およびアミノ酸残基の置換が挙げられる。従って、一態様において、単量体フェリチンサブユニットの配列は、哺乳動物中に天然に見られるフェリチンサブユニットの配列とは十分に相違しており、その結果、変異単量体フェリチンサブユニットが哺乳動物中へ導入される場合に、それは、哺乳動物の天然フェリチンタンパク質と反応する抗体の産生を生じさせない。本発明によれば、そのような単量体サブユニットは、免疫原性的に中性と呼ばれる。本発明の一態様は、タンパク質の球状形態への単量体フェリチンサブユニットの自己組織化を指示することを担う単量体フェリチンサブユニットのアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、および少なくとも97%同一であるアミノ酸配列へ連結された、本発明のMICアルファ3-ドメインタンパク質を含むMICアルファ3-フェリチン融合タンパク質であり、ここで、MICアルファ3-フェリチン融合タンパク質はナノ粒子へ自己組織化することができる。一態様において、HA-フェリチン融合タンパク質は、単量体フェリチンサブユニットと配列が同一であるポリペプチド配列を含む。本発明の一態様は、ヘリコバクター・ピロリ由来の単量体フェリチンサブユニットのアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、および少なくとも97%同一であるアミノ酸配列へ連結された、本発明のMICアルファ3-ドメインタンパク質を含むMICアルファ3-フェリチン融合タンパク質であり、ここで、MICアルファ3-フェリチン融合タンパク質はナノ粒子へ自己組織化することができる。

いくつかの態様において、本発明のタンパク質のアミノ酸配列中へ突然変異を操作することが有用であり得る。例えば、融合タンパク質に有利な特性（例えば、可溶性、半減期、免疫監視からのタンパク質のマスク部分）を与えるために、単量体フェリチンサブユニット、三量体化ドメインまたはリンカー配列中の酵素認識部位またはグリコシル化部位などの部位を変更することが有用であり得る。この点に関して、フェリチンの単量体サブユニットは、天然にはグリコシル化されないことが公知である。しかし、哺乳動物細胞または酵母細胞中において分泌タンパク質として発現される場合、それはグリコシル化され得る。従って、一態様において、突然変異フェリチンサブユニット配列が突然変異部位においてもはやグリコシル化されないように、単量体フェリチンサブユニット由来のアミノ酸配列中の潜在的なN-連結グリコシル化部位を突然変異させる。

本発明のタンパク質は本発明の核酸分子によってコードされる。さらに、それらは本発明の核酸構築物によって発現される。本明細書において使用される場合、核酸構築物は、組換え発現ベクター、即ち、タンパク質をコードする核酸分子へ連結されたベクターであり、その結果、核酸構築物が例えば対象または器官、組織もしくは細胞へ投与されると、核酸分子はタンパク質を発現させることができる。ベクターはまた、環境（例えば、非限定的に、生物、組織、または細胞培養物）内の細胞への核酸分子の輸送を可能にする。本開示の核酸構築物は、人の介入によって生成される。核酸構築物はDNA、RNAまたはそのバリアントであり得る。ベクターは、DNAプラスミド、ウイルスベクター、または他のベクターであり得る。一態様において、ベクターは、サイトメガロウイルス(CMV)、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、または任意の他のDNAもしくはRNAウイルスベクターであり得る。一態様において、ベクターは、偽型レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターであり得る。一態様において、ベクターはDNAプラスミドであり得る。一態様において、ベクターは、核酸分子送達および発現を可能にするためのプラスミドコンポーネントおよびウイルスコンポーネントを含むDNAプラスミドであり得る。本開示の核酸構築物の構築のための方法は周知である。例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3.sup.rd edition, Sambrook et al. 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press, and Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1994を参照のこと。一態様において、ベクターは、DNAプラスミド、例えばCMV/Rプラスミド、例えばCMV/RまたはCMV/R 8 KB(本明細書においてCMV/R 8 kbとも呼ばれる)である。CMV/RおよびCMV/R 8 kbの例は本明細書に提供される。CMV/Rはまた、2006年8月22日に発行された米国特許第7,094,598 B2号に記載されている。

本明細書において使用される場合、核酸分子は、MICアルファ3-ドメインペプチド免疫原、フェリチン単量体サブユニット、および／または本発明のMICアルファ3-フェリチン融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。核酸分子は、組換え的に、合成的に、または組換えおよび合成手順の組み合わせによって、生成され得る。本開示の核酸分子は、野生型核酸配列、または、例えば、ヒト翻訳系によってよりよく認識されるコドンを組み込むために、コドン改変核酸配列を有し得る。一態様において、核酸分子は、異なるアミノ酸をコードするコドンを導入または排除するように、例えば、N-連結グリコシル化部位をコードするコドンを導入するように、遺伝子操作され得る。本開示の核酸分子を生成する方法は、特にいったん核酸配列が知られると、当技術分野において公知である。核酸構築物が1つの核酸分子または1つを超える核酸分子を含み得ることが、認識されるべきである。核酸分子が1つのタンパク質または1つを超えるタンパク質をコードし得ることも、認識されるべきである。

一態様において、フェリチンの単量体サブユニットは、ヘリコバクター・ピロリのフェリチンタンパク質に由来する。

本発明においてさらに具体化されるのは、本発明のタンパク質をコードする核酸配列のバリアントである核酸配列である。そのようなバリアントは、それらが、ナノ粒子へ自己組織化する本発明の融合タンパク質の能力に影響を与えない限り、またはMICアルファ3-ドメインタンパク質に対する免疫反応を誘発する融合タンパク質のMICアルファ3-ドメイン部分の能力に有意に影響を与えない限り、ヌクレオチド挿入、欠失、および置換を含む。

本発明によってさらに包含されるのは、本発明の融合タンパク質を産生するための発現系である。一態様において、本発明の核酸分子は、プロモーターへ機能的に連結される。本明細書において使用される場合、「機能的に連結される」は、連結された核酸分子によってコードされるタンパク質が、連結されたプロモーターが活性化される場合に発現され得ることを意味する。本発明を実施するために有用なプロモーターは、当業者に公知である。本発明の一態様は、本発明の核酸分子を含む組換え細胞である。本発明の一態様は、本発明の核酸分子を含む組換えウイルスである。

上記に示したように、本発明のフェリチン融合タンパク質の組換え産生は、当技術分野において現在公知の任意の好適な従来の組換え技術を使用して行われ得る。例えば、フェリチンと好適なタンパク質（例えば、組換えMICアルファ3-ドメインタンパク質）とのような、融合タンパク質の分子クローニングは、好適な単量体サブユニットタンパク質、例えば、ヘリコバクター・ピロリフェリチン単量体サブユニットを用いての大腸菌（E. coli）中における発現によって行われ得る。次いで、構築物はタンパク質発現細胞中へ形質転換され、好適なサイズへ成長させられ、そして融合タンパク質を産生するように誘導され得る。

記載したように、本発明のMICアルファ3-フェリチン融合タンパク質はフェリチンの単量体サブユニットを含むため、それらは自己組織化することができる。本発明によれば、そのような自己組織化から生じる超分子は、MICアルファ3発現フェリチン系ナノ粒子と呼ばれる。議論を容易にするために、MICアルファ3発現フェリチン系ナノ粒子を、単に、ナノ粒子(np)と呼ぶ。本発明のナノ粒子は、前述のフェリチンタンパク質と同じ構造的特徴を有する。即ち、それらは、24個のサブユニットを含有し、432対称性を有する。本発明のナノ粒子の場合、サブユニットは、MICアルファ3-ドメインタンパク質へ連結されたフェリチン単量体サブユニットを含む融合タンパク質である。そのようなナノ粒子は、それらの表面上のMICアルファ3-ドメインタンパク質の少なくとも一部分をディスプレイする。従って、本発明の一態様は、MICアルファ3-フェリチン融合タンパク質を含むナノ粒子であり、ここで、融合タンパク質は、MICアルファ3-ドメインタンパク質へ連結された単量体フェリチンサブユニットを含む。一態様において、ナノ粒子は八面体である。

本発明のMICアルファ3-フェリチン融合タンパク質およびナノ粒子はMICアルファ3-ドメインタンパク質に対する免疫反応を誘発することができるため、それらは、がんを治療するためのワクチンとして使用され得る。本発明によれば、ワクチンは、MICアルファ3-ドメインペプチド免疫原、MICアルファ3-フェリチン融合タンパク質、または本発明のナノ粒子であり得る。本発明のワクチンはまた、他の成分、例えば、アジュバント、緩衝液などを含有することができる。任意のアジュバントを使用することができるが、好ましい態様は以下を含有し得る：化学的アジュバント、例えば、リン酸アルミニウム、塩化ベンザルコニウム、ウベニメクス、およびQS21；遺伝的アジュバント、例えば、IL-2遺伝子もしくはその断片、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)遺伝子もしくはその断片、IL-18遺伝子もしくはその断片、ケモカイン(C--Cモチーフ)リガンド21(CCL21)遺伝子もしくはその断片、IL-6遺伝子もしくはその断片、CpG、LPS、TLRアゴニスト、および他の免疫刺激遺伝子；タンパク質アジュバント、例えば、IL-2もしくはその断片、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)もしくはその断片、IL-18もしくはその断片、ケモカイン(C--Cモチーフ)リガンド21(CCL21)もしくはその断片、IL-6もしくはその断片、CpG、LPS、TLRアゴニスト、および他の免疫刺激サイトカインもしくはその断片；脂質アジュバント、例えば、カチオン性リポソーム、N3(カチオン性脂質)、モノホスホリルリピドA(MPL1)；他のアジュバント、例えば、コレラ毒素、エンテロトキシン、Fms様チロシンキナーゼ-3リガンド(Flt-3L)、ブピバカイン、マーカイン、およびレバミゾール。

メソポーラスシリカ
本発明に従うワクチン組成物は、免疫化スキャフォールドをさらに含み得る。一態様において、免疫化スキャフォールドはメソポーラスシリカナノ粒子(MSR)である。MSRは、任意の形状または形態、例えば、ロッド、球体、ワイヤー、立方体、または多面体であり得る。MSRの形状または形態は、典型的に、具体的な反応条件の結果である。例えば、メソポーラスシリカナノ粒子は、当技術分野において公知の任意の方法によって、例えば、オルトケイ酸テトラエチルとミセルロッドで作製された鋳型とを反応させることによって、合成することができる。その結果、規則的な配置の細孔で満たされているナノサイズの球体またはロッドが収集される。次いで、鋳型は、適切なpHに調整された溶媒で洗浄することによって除去され得る。別の技術において、メソポーラス粒子は、単純なゾルゲル法または噴霧乾燥法を用いて合成することができた。オルトケイ酸テトラエチルはまた、追加のポリマー単量体（鋳型として）と共に使用される。他の方法としては、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第20150072009号、同第20120264599号および同第20120256336号に記載されているものが挙げられる。

顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)は、マクロファージ、T細胞、肥満細胞、内皮細胞および線維芽細胞によって分泌されるタンパク質である。具体的には、GM-CSFは、白血球成長因子として機能するサイトカインである。GM-CSFは、顆粒球および単球を産生するように幹細胞を刺激する。単球は、血流を出て、組織中へ移動し、その後、マクロファージへと成熟する。

本明細書に記載されるスキャフォールドデバイスは、GM-CSFポリペプチドを含み、これらを放出し、デバイスへホストDCを誘引する。意図されるGM-CSFポリペプチドは、内因性供給源から単離されるか、またはインビボもしくはインビトロで合成される。内因性GM-CSFポリペプチドは、健常なヒト組織から単離される。合成GM-CSFポリペプチドは、例えば哺乳動物または培養されたヒト細胞株などの宿主生物または宿主細胞に鋳型DNAをトランスフェクションまたは形質転換した後に、インビボで合成される。あるいは、合成GM-CSFポリペプチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または他の当技術分野で認識されている方法(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989))によって、インビトロで合成される。

GM-CSFポリペプチドは、インビボでのタンパク質安定性を増加させるために修飾される。あるいは、GM-CSFポリペプチドは、程度の差はあるが免疫原性とするために操作される。内因性成熟ヒトGM-CSFポリペプチドは、報告によれば、23位のアミノ酸残基（ロイシン）、27位のアミノ酸残基（アスパラギン）、および39位のアミノ酸残基（グルタミン酸）でグリコシル化される（米国特許第5,073,627号を参照のこと）。本発明のGM-CSFポリペプチドは、グリコシル化状態に関してこれらのアミノ酸残基の1つまたは複数で修飾される。

GM-CSFポリペプチドは組換え体である。あるいは、GM-CSFポリペプチドは哺乳動物GM-CSFポリペプチドのヒト化誘導体である。GM-CSFポリペプチドが由来する例示的な哺乳動物種としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、サル、または霊長動物が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様において、GM-CSFは組換えヒトタンパク質(PeproTech、カタログ番号300-03)である。あるいは、GM-CSFは組換えネズミ(マウス)タンパク質(PeproTech、カタログ番号315-03)である。最後に、GM-CSFは組換えマウスタンパク質のヒト化誘導体である。

ヒト組換えGM-CSF(PeproTech、カタログ番号300-03)は、以下のポリペプチド配列によってコードされる：

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マウス組換えGM-CSF(PeproTech、カタログ番号315-03)は、以下のポリペプチド配列によってコードされる：

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ヒト内因性GM-CSFは、以下のmRNA配列(NCBIアクセッション番号NM 000758およびSEQ ID NO: 28)によってコードされる：

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ヒト内因性GM-CSFは、以下のアミノ酸配列(NCBIアクセッション番号NP000749.2およびSEQ ID NO: 29)によってコードされる：

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シトシン-グアノシン(CpG)オリゴヌクレオチド(CpG-ODN)配列
CpG部位は、その長さに沿って直鎖状配列の塩基においてグアニンヌクレオチドの次にシステインヌクレオチドが生じるデオキシリボ核酸（DNA）の領域である（「p」はそれらの間のリン酸結合を示し、それらをシトシン-グアニン相補塩基対形成から区別する）。CpG部位は、遺伝子発現をサイレンシングするために細胞が使用する幾つかの内因性メカニズムの一つであるDNAメチル化において、極めて重要な役割を有する。プロモーター要素におけるCpG部位のメチル化は、遺伝子サイレンシングを引き起こし得る。がんの場合に、腫瘍抑制遺伝子がしばしばサイレンシングされ、がん遺伝子またはがん誘発遺伝子が発現されることが知られている。腫瘍抑制遺伝子（これはがん形成を阻害する）のプロモーター領域におけるCpG部位は、メチル化されることが示されているが、がん遺伝子のプロモーター領域におけるCpG部位は、特定のがんにおいて低メチル化または非メチル化される。TLR-9受容体は、DNAにおいて非メチル化CpG部位に結合する。

本明細書に記載されるワクチン組成物は、CpGオリゴヌクレオチドを含む。CpGオリゴヌクレオチドは、内因性供給源から単離されるか、またはインビボもしくはインビトロで合成される。内因性CpGオリゴヌクレオチドの例示的な供給源は、微生物、細菌、真菌、原虫、ウイルス、カビ、または寄生虫を含むが、これらに限定されない。あるいは、内因性CpGオリゴヌクレオチドは、哺乳動物の良性または悪性新生物腫瘍から単離される。合成CpGオリゴヌクレオチドは、宿主生物に鋳型DNAをトランスフェクションまたは形質転換した後に、インビボで合成される。あるいは、合成CpGオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または他の当技術分野で認識されている方法(参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989))によって、インビトロで合成される。

CpGオリゴヌクレオチドは、樹状細胞による細胞取り込みのために提示される。例えば、裸のCpGオリゴヌクレオチドが使用される。「裸の」との用語は、追加の置換基を有さない、単離された内因性または合成ポリヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチド）を記載するために使用される。別の態様において、CpGオリゴヌクレオチドは、細胞取り込み効率を増加させるために、1つまたは複数の化合物へ結合される。代替としてまたは追加で、CpGオリゴヌクレオチドは、スキャフォールドおよび／または樹状細胞内でのオリゴヌクレオチドの安定性を増加させるために、1つまたは複数の化合物へ結合される。CpGオリゴヌクレオチドは、任意で、細胞取り込みの前に濃縮される。例えば、CpGオリゴヌクレオチドは、樹状細胞への細胞取り込み効率を増加させる陽イオンポリマー、ポリエチルイミン（PEI）を用いて濃縮される。

CpGオリゴヌクレオチドは、複数のクラスに分けることができる。例えば、本発明の組成物、方法およびデバイスによって包含される例示的なCpG-ODNは、刺激性、中性、または抑制性である。用語「刺激性の」は、TLR9を活性化するCpG-ODN配列のクラスを記載する。用語「中性の」は、TLR9を活性化しないCpG-ODN配列のクラスを記載する。用語「抑制性の」は、TLR9を阻害するCpG-ODN配列のクラスを記載する。用語「TLR9を活性化する」は、TLR9が細胞内シグナル伝達を開始するプロセスを記載する。

刺激性CpG-ODNは、免疫刺激性活性において相違する3つの型、A、B、およびCにさらに分けることができる。A型刺激性CpG ODNは、ホスホジエステル中心CpG含有パリンドロームモチーフおよびホスホロチオエート3'ポリ-Gストリングによって特徴付けられる。TLR9の活性化の後、これらのCpG ODNは、形質細胞様樹状細胞（pDC）から高レベルのIFNアルファ産生を誘導する。A型CpG ODNは、TLR9依存性NF-カッパBシグナル伝達を弱く刺激する。

B型刺激性CpG ODNは、1つまたは複数のCpGジヌクレオチドを有する完全なホスホロチオエート骨格を含む。TLR9の活性化の後、これらのCpG-ODNは、B細胞を強力に活性化する。A型CpG-ODNとは対照的に、B型CpG-ODNは、IFNアルファ分泌を弱く刺激する。

C型刺激性CpG ODNは、A型およびB型の特徴を含む。C型CpG-ODNは、完全なホスホロチオエート骨格およびCpG含有パリンドロームモチーフを含む。A型CpG ODNと同様に、C型CpG ODNは、pDCから強力なIFNアルファ産生を誘導する。B型CpG ODNと同様に、C型CpG ODNは、強力なB細胞刺激を誘導する。

例示的な刺激性CpG ODNは、ODN 1585、ODN 1668、ODN 1826、ODN 2006、ODN 2006-G5、ODN 2216、ODN 2336、ODN 2395、ODN M362(全てInvivoGen)を含むが、これらに限定されない。本発明はまた、前述のCpG ODNの任意のヒト化バージョンを包含する。一つの好ましい態様において、本発明の組成物、方法、およびデバイスは、ODN 1826(5'から3'の配列がtccatgacgttcctgacgtt（SEQ ID NO: 30）であり、ここでCpG要素は太字である)を含む。

TLR9を刺激しない中性または対照CpG ODNは、本発明によって包含される。これらのODNは、それらの刺激性相当物と同じ配列を含むが、CpGジヌクレオチドの代わりにGpCジヌクレオチドを含有する。

本発明によって包含される例示的な中性または対照CpG ODNは、ODN 1585対照、ODN 1668対照、ODN 1826対照、ODN 2006対照、ODN 2216対照、ODN 2336対照、ODN 2395対照、ODN M362対照(全てInvivoGen)を含むが、これらに限定されない。本発明はまた、前述のCpG ODNの任意のヒト化バージョンを包含する。

治療および投与方法
本発明のワクチン組成物は、がんの予防および治療に有用である。従って、本発明は、がんを発症する危険性がある対象におけるがんの予防方法、およびそのような治療の必要がある対象におけるがんの治療方法を提供する。一態様において、がんは、前立腺がん、多発性骨髄腫、多形性膠芽腫（gliobastoma multiforme）、および黒色腫からなる群より選択される。一態様において、がんは黒色腫である。

一態様において、本発明のワクチン組成物は、MICAの過剰発現と関連するがんを有する対象へ投与される。MICAの過剰発現は、タンパク質または対応する核酸の発現レベルを測定するための当技術分野における任意の公知の方法を使用して、決定することができる。そのような方法としては、ウエスタンブロット、ノザンブロット、サザンブロット、ELISA、免疫沈降、免疫蛍光、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、核酸ハイブリダイゼーション技術、核酸逆転写法、および核酸増幅法が挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、がんは、黒色腫、肺がん、乳がん、腎臓がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、および結腸がん、リンパ腫または白血病からなる群より選択される。一態様において、がんは黒色腫である。一態様において、がんは、形質細胞悪性腫瘍、例えば、多発性骨髄腫(MM)または形質細胞の前悪性状態である。いくつかの態様において、対象は、がんを有すると診断されているか、またはがんを発症する素因があると診断されている。

本発明のワクチン組成物は、下記のように、別々に、または治療レジメンもしくは併用療法の一環として投与され得る。本発明のワクチン組成物はまた、単独で、または複数回投与で、例えば、プライム-ブースト戦略で、投与され得る。本文脈において、用語「プライム-ブースト」は、連続しての2つの異なる免疫原の使用を指す。2つの異なる免疫原は、典型的に、10～30日間または10～60日間などの一定の期間後に、連続的に投与される。一態様において、一定の期間は2～4週間である。従って、例えば、一態様において、本発明のワクチン組成物は、時間ゼロで投与され、本発明の第2のワクチン組成物（異なる免疫原を含む）は、一定の期間後に、例えば、10～30日、10～60日、または2～4週間後に、投与される。

第1および第2のワクチン組成物は、同じ組成物であり得るが、同じ組成物である必要はない。従って、本発明の一態様において、ワクチンを投与する工程は、第1のワクチン組成物を投与すること、および、次いで後で、第2のワクチン組成物を投与することを含む。

一態様において、本発明の1つまたは複数の異なるワクチン組成物は、米国特許第8,110,196号に記載されるように、対象に複数の部位で投与される。好ましくは、各部位はリンパ節またはリンパ節の群へ排液する（drain）。一態様において、本発明のワクチン組成物は、頭頸部リンパ節、腋窩リンパ節、気管気管支リンパ節、腹壁リンパ節、胃リンパ節、回結腸リンパ節、ならびに鼠径および鼠径下リンパ節からなる群より選択される2つ以上のリンパ節へ排液する複数の部位に投与される。別の態様において、部位は、右腕、左腕、右大腿部、左大腿部、右肩、左肩、右胸、左胸、腹部、右臀部、および左臀部からなる群より選択される。一態様において、部位は、扁桃、アデノイド、虫垂、およびパイエル板からなる群より選択されるリンパ系組織の非被包化クラスター（nonencapsulated cluster）であるか、または該リンパ系組織の非被包化クラスターへ排液する。一態様において、本発明のワクチン組成物は、脾臓へ排液する部位に投与される。

一態様において、各ワクチン組成物は、皮内、皮下、経皮、筋肉内、経口、直腸、膣、吸入、およびそれらの組み合わせからなる群より独立して選択される経路により投与される。一態様において、少なくとも1つの組成物は、解剖学的に異なるリンパ節、リンパ節クラスター、またはリンパ系組織の非被包化クラスターに直接注入される。

任意の好適な投与経路、例えば、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、または粘膜は、本発明の方法によって包含される。粘膜投与経路としては、経口、直腸、膣、および鼻腔内投与が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様において、少なくとも1つの組成物は、経皮的に、皮内に、皮下に、経口的に、直腸に、経膣的にまたは吸入によって、投与される。食品医薬品局(FDA)によって承認される任意の経路が、本発明のワクチン組成物のために使用され得る。例示的な投与方法は、FDAのCDER Data Standards Manual、バージョン番号004(fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htmで入手可能である)に記載されている。

好ましくは、投与経路は、組成物を特定の部位に標的化するために選択され、例えば、リンパ節またはリンパ節クラスターへの直接注入により、胃のリンパ節を標的にするための経口投与により、直腸のリンパ節を標的にするための経肛門投与により、肺のリンパ節を標的にするための吸入もしくはエアロゾルにより、または他の任意の好適な投与経路により標的化される。

本発明の方法がワクチン組成物を複数の部位に投与することを含む場合、各組成物は、好ましくは、実質的に同時に、例えば、1～8時間以内にまたは同じ医師の診察中に、投与される。一態様において、各組成物は1～2時間以内、1～3時間以内、1～4時間以内、または1～5時間以内に投与される。

ワクチン組成物がスキャフォールドの形態である場合、対象にワクチン接種する方法は、スキャフォールド組成物を対象に移植すること、好ましくは皮下移植、を含む。ある態様において、対象にワクチン接種する方法は、スキャフォールドワクチン組成物を対象の解剖学的構造の2つ以上の領域に移植または注入することを含むことができる。

一態様において、本発明の方法は、少なくとも1つのMICペプチドで感作された抗原提示細胞を対象へ投与する工程をさらに含む。好ましい態様において、抗原提示細胞は樹状細胞である。

一態様において、方法は、1つまたは複数のアジュバントを対象へ投与する工程をさらに含む。一態様において、1つまたは複数のアジュバントは、油性アジュバント、CpG DNAアジュバント、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸(通常はポリ(I:C)と略される)、無機塩アジュバント、無機塩ゲルアジュバント、粒子状アジュバント、マイクロ粒子状アジュバント、粘膜アジュバント、およびサイトカインからなる群より選択される。そのようなアジュバントは、本発明の組成物と共に製剤化され得るか、または、組成物とは別に、例えば、組成物が対象へ投与される前に、組成物が対象へ投与されると同時に、もしくは組成物が対象へ投与された後に、投与され得る。1つまたは複数のアジュバントを本発明のペプチドまたは融合タンパク質へ共有結合することができる。例えば、CpG DNAアジュバントを本発明のペプチドまたは融合タンパク質へ共有結合する。

本明細書に開示される方法は、広範囲の種、例えば、ヒト、非ヒト霊長動物(例えば、サル)、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、シカ、ヘラジカ、ヤギ、イヌ、ネコ、イタチ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、およびマウスへ適用することができる。

用語「治療する」または「治療すること」は、本明細書において使用される場合、対象が罹患している疾患または状態を部分的にまたは完全に緩和する、抑制する、改善する、および／または軽減することを指す。いくつかの場合において、治療は、対象が罹患している疾患または状態の継続的な消失をもたらすことができる。

一般に、方法は、状態または疾患のリスクがあるか、罹患している対象を選択することを含む。いくつかの場合において、対象の疾患または状態は、本明細書に開示される薬学的組成物で治療することができる。例えば、いくつかの場合において、方法はがんを有する対象を選択することを含み、例えば、ここで、対象のがんは、MICAの一方または両方を標的にすることによって治療することができる。

いくつかの場合において、治療方法は、対象が罹患している疾患もしくは状態の予防または治療のために、必要に応じて、単回投与、複数回投与、および反復投与を含むことができる。いくつかの場合において、治療方法は、治療前、治療中、および／または治療後に、対象における疾患のレベルを評価することを含むことができる。いくつかの場合において、対象における疾患のレベルの低下が検出されるまで、治療を継続することができる。

用語「投与する」、「投与すること」、または「投与」は、本明細書において使用される場合、本発明のペプチドを、形態にかかわらず、移植する、吸収する、摂取する、注入する、または吸入することを指す。いくつかの場合において、本明細書に開示される1つまたは複数のペプチドを、対象へ局所的に（例えば、経鼻的に）および／または経口的に投与することができる。例えば、本明細書に記載の方法は、所望の効果または表明した効果を達成するのに有効な量の化合物または化合物の組成物を投与することを含む。特定の患者に対する具体的な投薬量および治療レジメンは、さまざまな要因に依存しており、例えば、利用する特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、疾患、状態または症状の重症度および経過、疾患に対する患者の体質、ならびに治療する医師の判断に依存する。

投与後、対象は、疾患のレベルを検出し、評価し、または決定するために判断され得る。いくつかの場合において、対象における疾患のレベルの変化(例えば、低下)が検出されるまで、治療を継続することができる。

患者の状態の改善(例えば、対象における疾患のレベルの変化(例えば、低下))の際には、本発明の化合物、組成物または組み合わせの維持用量を、必要に応じて、投与することができる。その後、改善された状態が保持されるレベルまで、症状に応じて、投薬量もしくは投与頻度、またはその両方を低減させることができる。しかしながら、患者は、疾患症状の再発時に、間欠的治療を長期的に必要とするかもしれない。

いくつかの場合において、本開示は、ヒト対象からの免疫細胞、例えばB細胞および／または記憶B細胞、を検出するための方法を提供する。そのような方法を使用して、例えば、イベント後に、ヒト対象における免疫細胞、例えばB細胞および／または記憶B細胞、のレベルをモニターすることができる。例示的なイベントとしては、限定するものではないが、疾患、感染の検出；本明細書に開示される治療用組成物の投与、治療薬または治療レジメンの投与、ワクチンの投与、免疫応答の誘導などが挙げられる。そのような方法は、臨床的におよび／または研究のために使用することができる。

有効量および投薬量
一態様において、本発明のワクチン組成物の有効量は、がんを有する患者におけるがんの重症度を軽減するのに十分な量、またはその1つまたは複数の症状の重症度を軽減もしくは改善するのに十分な量、がんの進行を予防するのに十分な量、がんのさらなる転移を防止するのに十分な量、がんの臨床的退行を引き起こすのに十分な量、あるいは本発明のワクチン組成物と同時に、該組成物の前または後に投与される別の治療法または治療薬の治療効果を増強または改善するのに十分な量である。

がんの症状は当業者に周知であり、限定するものではないが、以下が挙げられる：普通ではないほくろ(mole)の形状、非対称、境界、色、および／または直径を含む、ほくろの外観の変化、新たに色素沈着した皮膚領域、異常なほくろ、爪の下の黒ずんだ領域、乳房のしこり、乳頭の変化、乳房嚢胞、乳房の痛み、死、体重減少、虚弱、過度の疲労、摂食困難、食欲不振、慢性咳、息切れの悪化、喀血、血尿、血便、吐き気、嘔吐、肝転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、腫脹、腹腔内の体液、膣出血、便秘、腹部膨張、結腸穿孔、急性腹膜炎(感染、発熱、痛み)、疼痛、吐血、大量の発汗、発熱、高血圧、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋痙攣、大腸転移、肺転移、膀胱転移、肝転移、骨転移、腎臓転移、および膵臓転移、嚥下困難など。

一態様において、本発明のワクチン組成物の有効量は、本発明のワクチン組成物の1つまたは複数のペプチドに対して向けられた、抗体分泌B細胞または細胞傷害性T細胞媒介性免疫反応をもたらすために十分な量である。一態様において、本発明のワクチン組成物の有効量は、がん細胞に対して向けられた、抗体分泌B細胞または細胞傷害性T細胞媒介性免疫反応をもたらすために十分な量である。免疫反応を誘発する本発明のワクチン組成物の能力は、当業者に利用可能な任意の常法を使用して決定することができる。一態様において、各組成物の有効量は、例えば、混合リンパ球T細胞アッセイによって測定されるような、対象において細胞傷害性T細胞応答をもたらすために十分な量である。

一態様において、対象へまたは対象の特定の部位に投与されるワクチン組成物の有効量は、組成物の1つまたは複数のペプチドの1～1000マイクログラムを送達する量である。一態様において、ペプチドの量は、1～100マイクログラム、1～200マイクログラム、1～300マイクログラム、1～400マイクログラム、1～500マイクログラム、1～600マイクログラム、1～700マイクログラム、1～800マイクログラム、または1～900マイクログラムである。別の態様において、ペプチドの量は、1～10マイクログラム、1～20マイクログラム、1～30マイクログラム、1～40マイクログラム、1～50マイクログラム、1～60マイクログラム、1～70マイクログラム、1～80マイクログラム、または1～90マイクログラムである。一態様において、対象へ投与されるペプチドの総量は、5ミリグラムを超えない。一態様において、対象へ投与されるペプチドの総量は、2ミリグラムを超えない。

併用療法
本発明はまた、がんの治療または予防方法を提供し、該方法は、本発明のワクチン組成物を、1つまたは複数の追加の治療薬または治療レジメンと共に、それを必要とする対象に投与することを含む。一態様において、本発明のワクチン組成物は、手術、化学療法剤、もしくは放射線療法、免疫療法、またはこれらの任意の組み合わせを含む治療レジメンの一環として投与される。

一態様において、治療レジメンは、1つまたは複数の免疫刺激剤を含むかまたはさらに含む。一態様において、1つまたは複数の免疫刺激剤は、抗CTLA-4抗体もしくはペプチド、抗PD-1抗体もしくはペプチド、抗PDL-1抗体もしくはペプチド、抗OX40(CD134、TNFRSF4、ACT35および／もしくはTXGP1Lとしても公知)抗体もしくはペプチド、抗GITR(TNFRSF18、AITRおよび／もしくはCD357としても公知)抗体もしくはペプチド、抗LAG-3抗体もしくはペプチド、ならびに／または抗TIM-3抗体もしくはペプチドからなる群より選択される。

一態様において、1つまたは複数の免疫刺激剤は、WO 2013/049517またはWO 2008/036981に記載される抗MICA抗体より選択される。一態様において、1つまたは複数の免疫刺激剤は、CM33322 Ab4、CM33322 Ab28、およびCM33322 Ab29より選択され、これらは、米国仮出願第61/792,034号および同第61/913,198号、ならびに米国出願第14/025,573号に記載されている。

一態様において、治療レジメンは、1つまたは複数のサイトカインを含むまたはさらに含む。一態様において、本発明のワクチン組成物は、1つまたは複数のサイトカインを含む。一態様において、少なくとも1つのサイトカインは、インターロイキンまたはインターフェロンである。一態様において、少なくとも1つのサイトカインは、IL-1アルファ、IL-1ベータ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、およびIL-18からなる群より選択されるインターロイキンである。別の態様において、少なくとも1つのサイトカインは、IFNアルファ、IFNベータ、およびIFNガンマより選択されるインターフェロンである。

一態様において、本発明のワクチン組成物は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(「HDAC」)阻害剤、プロテアソーム阻害剤、アルキル化剤、およびトポイソメラーゼ阻害剤からなる群より選択される少なくとも1つの化学療法剤を対象へ投与することを含む治療レジメンの一環として投与される。

一態様において、化学療法剤は、以下からなる群より選択されるHDAC阻害剤である：ヒドロキサム酸、ボリノスタット(ゾリンザ)、スベロイルアニリドヒドロキサム酸(SAHA)(Merck)、トリコスタチンA(TSA)、LAQ824(Novartis)、パノビノスタット(LBH589)(Novartis)、ベリノスタット(PXD101)(CuraGen)、ITF2357 Italfarmaco SpA(Cinisello)、環状テトラペプチド、デプシペプチド(ロミデプシン、FK228)(Gloucester Pharmaceuticals)、ベンズアミド、エンチノスタット(SNDX-275/MS-275)(Syndax Pharmaceuticals)、MGCD0103(Celgene)、短鎖脂肪族系酸、バルプロ酸、フェニル酪酸、AN-9、ピバネクス(pivanex)(Titan Pharmaceutical)、CHR-3996(Chroma Therapeutics)、およびCHR-2845(Chroma Therapeutics)。

一態様において、化学療法剤は、ボルテゾミブ(Millennium Pharmaceuticals)、NPI-0052(Nereus Pharmaceuticals)、カルフィルゾミブ(PR-171)(Onyx Pharmaceuticals)、CEP 18770、およびMLN9708からなる群より選択されるプロテアソーム阻害剤である。

一態様において、化学療法剤は、メルファラン（mephalan）などのアルキル化剤である。

一態様において、化学療法剤は、アドリアマイシン(ドキソルビシン)などのトポイソメラーゼ阻害剤である。

一態様において、治療レジメンは、化学療法、放射線療法、サイトカイン、ケモカインおよび他の生物学的シグナル伝達分子、腫瘍特異的ワクチン、細胞がんワクチン(例えば、GM-CSF形質導入がん細胞)、腫瘍特異的モノクローナル抗体、自己および同種幹細胞による救済(例えば、移植片対腫瘍効果を増強するため)、他の治療用抗体、分子標的療法、抗血管新生療法、治療目的での感染性因子(例えば、腫瘍局在化細菌)および遺伝子療法の1つまたは複数を含むまたはさらに含む。

キット
本発明は、本発明の方法または治療レジメンを行うための薬学的パックまたはキットを提供する。一態様において、キットは、本発明のワクチン組成物を凍結乾燥形態で含む。一態様において、キットは、本発明のワクチン組成物をタンパク質スキャフォールドの形態で含む。

別の態様において、キットは、1つまたは複数の追加の容器中にサイトカインまたはアジュバントをさらに含む。

各容器内の組成物は、例えば、滅菌生理食塩水、デキストロース溶液、もしくは緩衝液、または他の薬学的に許容される無菌の液体と組み合わせた、薬学的に許容される溶液の形態であり得る。あるいは、組成物は凍結乾燥または脱水乾燥させてもよい；この場合に、キットは、任意で、別の容器内に、注射用の溶液を作るために組成物を再構成するための、好ましくは無菌の、薬学的に許容される溶液(例えば、生理食塩水、デキストロース溶液など)をさらに含む。

別の態様において、キットは、好ましくは無菌形態で包装された、1つまたは複数の再利用可能なまたは使い捨ての投与デバイス(例えば、注射器、針、分注ペン）、および／または包装されたアルコールパッドをさらに含む。臨床医によるまたは患者による組成物の投与のために、任意で、説明書を含めてもよい。キットはまた、他の材料、例えば、ブリスターパックのような、金属またはプラスチックフォイルを含むことができる。

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示されるワクチン組成物(「X」として以下に示される)のうちいずれか1つまたは複数を、以下の方法で使用するための方法を提供する。

本明細書に開示される1つまたは複数の疾患または状態(例えば、がん、以下の例では「Y」と呼ばれる)を治療する際の医薬として使用するための物質X。Yの治療用医薬を製造するための物質Xの使用；およびYの治療に使用するための物質X。

いくつかの場合において、本明細書に開示される治療用組成物は、米国での販売、米国への輸入、および／または米国からの輸出のために製剤化され得る。

特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明で使用するために本明細書に記載され；当技術分野において公知の他の好適な方法および材料を使用することもできる。材料、方法、および例は、例示にすぎず、限定することを意図したものではない。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み入られる。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書が優先する。

実施例1：一般法
ベクター構築
多価ワクチンは、一価タンパク質と比べて実質的により高い力価の抗体応答を誘導する。ここにおいて多価ディスプレイを使用し、ここで、MICAアルファ3ドメインはヘリコバクター・ピロリ(H.ピロリ)フェリチンへ融合されている。フェリチン系ナノ粒子は、インフルエンザおよびEBVワクチンについて高力価抗体を誘導することが最近示された。フェリチンは、鉄貯蔵タンパク質として大抵の生物中に見られる。フェリチンは、24個のサブユニットからなる、八面体対称性を有する球状の粒子を形成する自己組織化性粒子である。フェリチン粒子ならびにヒトおよびマウスフェリチンに対する細胞性および体液性免疫反応を示すマップの概略図については、図1Cおよび1Dを参照のこと。Gly-Ser-Glyリンカーを使用してH.ピロリフェリチンへMICAのα3ドメインをコードする遺伝子を融合させることによって、MICAアルファ3フェリチン融合遺伝子(MICA-フェリチンと略される)を作製した(図2A)。点突然変異(Asn19Gln)をH.ピロリフェリチン中に導入し、潜在的なN-グリコシル化部位を取り除いた。MICAα3単独(フェリチン無し)の抗体応答を決定するために、MICAα3遺伝子の脱グリコシル化型を、8個の潜在的なN-グリコシル化部位のうちの7個をAspまたはGlnへ突然変異させることによって作製した。C末端HAタグを下流のタンパク質精製目的のために導入した。遺伝子を、GeneArt（登録商標）Gene Synthesisプラットフォームを使用して合成し、昆虫細胞発現についてコドン最適化した。合成された遺伝子をpAcDB3バキュロウイルス発現ベクター中へクローニングした。(図2Cを参照のこと)。

MICアルファ3ドメインワクチンの作製および脱グリコシル化MICAアルファ3ワクチンの作製を示すアッセイを、それぞれ、図2Bおよび2Dに示す。

タンパク質生合成および精製
MICAα3およびMICA-フェリチン融合タンパク質を、Sf9(スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）)昆虫細胞中において、感染多重度10でこれらの細胞を組換えバキュロウイルスに感染させることによって、発現させた。細胞をSf900無血清発現培地(Life Technologies)中において増殖させ、培養上澄みをトランスフェクション後3日に採取した。上澄みを濃縮し、次いで、Tris緩衝液(50mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.5緩衝液)へ交換した。タンパク質をHAアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、Superose 6カラム(GE Healthcare)を使用してサイズ排除クロマトグラフィーを行うことによって凝集物を除去した。精製タンパク質を、PD-10脱塩カラム(GE)を使用してPBSへ緩衝液交換し、Amicon Ultra 4ml遠心濾過機を使用して1mg/mlへ濃縮した。タンパク質純度およびサイズをSDS-PAGEによって確認した。

MPSワクチンの調製および免疫化
本明細書に記載されるスキャフォールドワクチンは、最近報告された(Kim et al Nat. Biotechnol. 2015, 33, 64-72)。注射針で注射されるメソポーラスシリカロッド(MSR)は、インビボで自発的に組織化し、干し草の山に似ているマクロポーラス構造体を形成し、これは、樹状細胞に3D細胞微小環境を提供する。この生分解性スキャフォールドは、樹状細胞をリクルートおよび教育し、これらは次いでリンパ節へ移動し、ここで、それらは免疫反応を誘導する。5mgのMSRに、室温で12時間、1μgのGM-CSF(樹状細胞をリクルートするため)、100μgのCpGオリゴヌクレオチド(樹状細胞活性化を誘導するため)および200μgのMICA-フェリチン融合体または対照タンパク質(オボアルブミン)をロードした。粒子を凍結乾燥し、PBS中に再懸濁し、C57BL/6マウスの側腹部へ皮下注射した。初回免疫化後、第14日または第21日に、マウスにブーストを受容させる。年齢適合非免疫化マウス(ナイーブ)およびオボアルブミンで免疫化されたマウスを、MICA-フェリチン免疫化実験についての対照群として使用した。MICAα3実験における追加の対照として、全てのワクチン成分を用いてしかしMSRスキャフォールドを用いずに(ボーラス)、マウスを免疫化した。

MICAα3およびMICA-フェリチン免疫化マウスにおける肺転移実験
C57Bl/6Jマウスを、MICAα3またはMICAα-フェリチンワクチンで免疫化した。ブーストから3週間後、0.5x10⁶個のMICA発現性B16F10黒色腫細胞の静脈内(i.v)注射でマウスに負荷した。腫瘍負荷の前および週1回の間隔で血清を採取し、脱落MICAレベルを分析した。マウスを腫瘍負荷から14日後に安楽死させ；肺を摘出し、10%中性緩衝ホルマリン中に固定し、肺転移数を定量化した。

免疫化マウス中のMICA抗体力価を決定するためのフローサイトメトリー分析およびELISA
MICA特異的抗体力価を、MICAの完全長細胞外ドメインを使用してELISAによって試験した。完全長MICAタンパク質(0.2μg)を、4℃で、一晩、96ウェルELISAプレート上にコーティングした。プレートをPBS/2% BSAで室温にて1時間ブロッキングした。プレートを洗浄し、各実験群から週1回の間隔で採取された血清の系列希釈物と共にインキュベートした。ヤギ抗マウスHRPを検出抗体として使用した。フローサイトメトリー分析を使用し、腫瘍細胞の表面上に発現された完全長への血清抗体の結合を評価した。簡潔には、1x10⁵個の腫瘍細胞を、4℃で2時間、1μlの血清と共にインキュベートした。1x10⁵個の細胞を、2時間、PBS 100μl中の、非免疫化マウス(ナイーブ)、MSRスキャフォールド無しのワクチン成分(ボーラス)またはMICA-フェリチンワクチン(ワクチン接種)で免疫化されたマウス由来の血清1μlで染色した。MICAのアルファ1-アルファ2ドメインへ結合する市販のモノクローナル抗体6D4を陽性対照として使用した(10μg)。PEコンジュゲート化抗マウスIgGを二次抗体として使用した。

実施例2：強力な免疫反応の誘導のためのスキャフォールドワクチン
MICα3ドメインをバキュロウイルス系中において組換えタンパク質として発現させ；タンパク質を、24個の同一のサブユニットを有する鉄貯蔵タンパク質であるH.ピロリフェリチン上に多価形態でディスプレイさせた。Kim et al Nat. Biotechnol. 2015, 33, 64-72に初めて記載されたメソポーラスシリカロッド(MSR)を使用してアプローチされるワクチン接種を本明細書において使用し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる(図3を参照のこと)。注射針で皮下注射されるMSRは、インビボでマクロポーラス構造体へ自発的に組織化し、これは、ホスト免疫細胞に3D細胞微小環境を提供する。このシステムは、多数の免疫細胞をリクルートし、それらを関連抗原へ曝露し、さらに、強力な免疫反応の誘導のための適切な分子キューを提供する。MICα3ドメインタンパク質を、GM-CSF(樹状細胞のリクルートメントのため)およびCpGオリゴヌクレオチド(樹状細胞を活性化するアジュバント)と一緒に、MSRへ吸収させた。このワクチン接種アプローチは、MICα3ドメインに特異的な高力価抗体の誘導を可能にした。これらの抗体は、MICを発現する腫瘍細胞を染色し、腫瘍細胞によるMICの脱落を阻害した。

このワクチンの抗腫瘍活性を試験するために、本発明者らは、ヒトMICがトランスフェクトされたB16黒色腫細胞を利用した。これらの腫瘍細胞を非免疫化マウス中へ静脈内注射すると、それらは多数の肺転移(約200転移/マウス)を形成する。MSRスキャフォールドワクチンは、そのような転移の結果からの強力な保護を提供した。ワクチン成分をMSRスキャフォールド無しのボーラスとして注射した場合、部分的な保護が観察されたが、生物学的効果は有意により弱かった。この結果は、MSRスキャフォールドへの免疫細胞の局所リクルートメントがこのワクチンの活性を大幅に増強することを示している。(図4を参照のこと)。

実施例3：MICA-フェリチン融合タンパク質でのワクチン接種は高力価のMICA特異的抗体を誘導する
B16F10マウス黒色腫細胞の表面上に発現された完全長MICAへの免疫化マウスの血清中のMICAα3特異的抗体の結合をフローサイトメトリーによって試験した。簡潔には、1x10⁵個の細胞を、2時間、PBS 100μl中の、第14日、第28日および第42日からの、非免疫化マウス(ナイーブ)、対照ワクチン(OVA-タンパク質)またはMICA-フェリチンワクチン(ワクチン接種)で免疫化されたマウス由来の血清1μlで染色した。MICAのα1-α2ドメインへ結合する市販のモノクローナル抗体6D4を陽性対照として使用した(10μg)。PEコンジュゲート化抗マウスIgGを二次抗体として使用した。ワクチン接種マウスの血清中のMICAα3特異的抗体(ヒストグラム － 緑色(d14)、青色(d28)、赤色(d42))は、腫瘍細胞表面上に発現されたMICAへの有意な結合を示した(図5Aおよび5B)。これらのアッセイの結果は、MICA-フェリチン融合タンパク質ワクチン接種が高力価のMICA特異的抗体を誘導することを実証する。

実施例4：MICA-フェリチン融合タンパク質でのワクチン接種は高レベルのIGG1、IGG2AおよびIGG3 MICAA3特異的ポリクローナル抗体応答を生じさせる
MICA-フェリチン免疫化マウス由来の血清をELISAにおいて試験し、ワクチン接種で誘導されたIgGの種々のサブクラスを決定した。OVA-タンパク質(ボーラス)または非免疫化マウス(ナイーブ)で免疫化されたマウス由来の血清を、対照群として使用した。完全長MICAを捕捉抗原として使用し、1/1000の血清希釈物を各ウェル中において使用した。HRPコンジュゲート化抗マウスIgG1、IgG2a、IgG2bまたはIgG3を検出のために使用した。MICA-フェリチンでの免疫化(ワクチン接種)は、高レベルの試験した全てのIgGサブクラスを誘導することがわかった(図6を参照のこと)。

実施例5：MICA-フェリチンワクチンに応答して生じたポリクローナル抗体はヒト転移性黒色腫細胞株の表面からのMICA脱落を妨げる
自己腫瘍ワクチン(GVAX)およびイピリムマブで治療された黒色腫患者中のMICA抗体の誘導は、減少した血清可溶性MICA(sMICA)レベルと相関した。MICA/Bの細胞外部分は2つのMHCクラスI様ドメイン(α1およびα2)ならびに膜近位免疫グロブリンドメイン(α3)を含有する。ジスルフィドイソメラーゼERp5がMICAα3ドメイン中の構造的ジスルフィド結合を切断し、結果として生じるこのドメインのアンフォールディングが、ADAM 10、ADAM 17およびMMP-14によるタンパク質分解的切断を可能にすることが示された。このアッセイの目的は、MICA-フェリチンワクチンに応答して生じたポリクローナル抗体がヒト黒色腫腫瘍細胞株A375からのMICA脱落を妨げるかどうかを決定することであった。

これらのアッセイのために、4x10⁵個のA375悪性黒色腫細胞を、200μlの培地を有する96ウェルプレート中に平板培養した。細胞を、血清無しで、またはナイーブ、OVA-タンパク質免疫化もしくはMICA-フェリチンワクチン接種マウス(図7、逆三角形を有するバー)由来の血清と共に、24時間インキュベートした。捕捉および検出のためにMICAα1-α2ドメイン抗体を利用するMICA ELISAキットを使用して、上澄み中のsMICAを分析した。血清無しで、ナイーブ(図7、丸および四角を有するバー)またはOVA-タンパク質免疫化マウス(図7、三角形を有するバー)由来の血清と共にインキュベートされた細胞と比較して、MICA-フェリチンワクチン接種マウス(図7、逆三角形を有するバー)由来の血清と共にインキュベートされた細胞の上澄み中において、より低いレベルのsMICAが検出され、従って、これは、MICAα3特異的抗体が腫瘍細胞表面からのMICAの脱落を阻害することができることを示している。

実施例6：MICA-フェリチンワクチンの治療活性
MICA-フェリチンワクチンの治療活性を、高悪性度B16F10黒色腫腫瘍モデルを使用して試験した。B16F10黒色腫腫瘍細胞を、ヒトMICAを発現するように遺伝子改変した。MICAはマウスNKG2D受容体によって結合され、このため、これは好適なモデル系である。MICA-フェリチンワクチン、OVA-タンパク質ワクチン(対照抗原)で免疫化されたC57BL/6マウス、および非免疫化対照マウス(年齢および性別適合)を、B16F10-MICA腫瘍細胞のi.v.注射で負荷した。血清を、腫瘍負荷前、第7日および第13日に採取した。マウスを腫瘍負荷から14日後に安楽死させ、肺転移数を定量化した(図8Aを参照のこと)。

これらのアッセイのために、8週齢C57BL/6雌性マウスを、MICAアルファ3-フェリチンまたはova-タンパク質で免疫化し、続いて第28日にブーストを行った。3週間後、5x10⁵個のMICA発現性B16F10黒色腫細胞のi.v.によって、マウスに負荷した。マウスを腫瘍負荷から14日後に安楽死させ、肺転移数を定量化した。血清中の脱落MICA(sMICA)レベルをELISAによってモニタリングした。これらの実験は、MICA-フェリチンワクチン接種マウスはほぼ腫瘍を含まなかったことを実証した。対照的に、非免疫化年齢適合対照群(ナイーブ)、および対照抗原 - オボアルブミンでワクチン接種されたマウスは、多数の肺転移(平均約150肺転移（lung met）/マウス)を有した(図8A)。重要なことには、sMICAは、MICA-フェリチンワクチン(三角)で免疫化されたマウスの血清中において検出不可能であり、一方、高レベルのsMICAが、オボアルブミンで免疫化されたマウス(四角)および非免疫化対照群(丸)の血清中において腫瘍負荷後、2週間以内に検出された(図8B)。

実施例7：MICA-フェリチンワクチンの有効投薬量およびインビボでのポリクローナル抗体応答の動態の決定
これらの研究のために、腫瘍細胞負荷の前に、マウスにワクチンの2回の注射を受容させた。しかし、ほぼ最高の抗体レベルが初回免疫化後2週間で既に達成される。最適なワクチン接種投薬量、および種々の用量でのポリクローナル抗体応答の動態を決定するために、MSRへ吸収された種々の用量のMICA-フェリチンタンパク質(50～200μg)で、C57Bl/6Jマウスを免疫化した。第17日に、マウスにブーストを受容させた。後眼窩採血によって週1回の間隔で血清を採取し、ELISAによってMICA抗体力価を決定した。初回免疫化後、第25日に、MICA発現性B16F10黒色腫細胞のi.v.注射で、マウスに負荷した。腫瘍負荷の前および週1回の間隔で血清を採取し、脱落MICAレベルを分析した。マウスを腫瘍負荷から14日後に安楽死させ；肺を摘出し、10%中性緩衝ホルマリン中に固定し、肺転移数を定量化した。

これらの研究のために、8週齢C57BL/6雌性マウスを、種々の用量(50μg、100μgまたは200μg)でのMICAアルファ3-フェリチンワクチンによって免疫化し、第17日にブーストした。血清を系列希釈し、そして完全長MICAタンパク質へのその結合をELISAにより試験することによって、エンドポイント抗体力価を決定した。MICA-フェリチン免疫化マウスは、試験した全ての用量で第14日までに高レベルの抗体力価を誘発し(10⁵のELISAエンドポイント力価)、第17日におけるブースト後に力価は約1000倍増加した。ナイーブな未処置年齢適合マウスを、対照群として使用した(図9Aを参照のこと)。

初回免疫化後、第25日に、0.5x10⁶個のMICA発現性B16F10黒色腫細胞のi.v.注射で、マウスに負荷した。腫瘍負荷の前および週1回の間隔で血清を採取し、脱落MICAレベルを分析した。マウスを腫瘍負荷から14日後に安楽死させ；肺を摘出し、10%中性緩衝ホルマリン中に固定し、肺転移数を定量化した。100μgおよび200μgで免疫化されたマウスは、50μgのワクチンで免疫化されたマウス(約2～12肺転移)と比較して、ほぼ腫瘍を含まなかった。sMICAは、種々の用量のMICA-フェリチンワクチン(50μg - 四角、100μg - 上向きの三角形、200μg - 下向きの三角形)で免疫化されたマウスの血清中において検出不可能であり、一方、高レベルのsMICAが、非免疫化対照群(白丸)の血清中において腫瘍負荷後2週間以内に検出された(図9Bおよび9Cを参照のこと)。

実施例8：MICAA3ワクチン単独は高力価のMICA特異的抗体を誘導する
MICA特異的ポリクローナル抗体応答を生じさせることにおけるMICAα3ワクチン単独(フェリチン無し)の効果を決定するために、MICAα3遺伝子の脱グリコシル化型を、8個の潜在的なN-グリコシル化部位のうちの7個をAspまたはGlnへ突然変異させることによって作製した。方法セクションに記載されるようなタンパク質産生および精製に続いて、5mgのMSRに1μg GM-CSF、100μg CpG-ODNおよび150μgの脱グリコシル化MICAα3タンパク質をロードすることによって、MICAα3ワクチンを調製した(MICAα3ワクチンと略される)。次いで、粒子を凍結乾燥し、冷PBS(150μl)中に再懸濁し、雌性C57Bl/6Jマウスの側腹部へ皮下注射した。MSRスキャフォールドを含まないことを除いて全てのワクチン成分(ボーラス)で免疫化されたマウス、および未処置の年齢適合マウスを、対照群として使用した。後眼窩採血によって週1回の間隔で血清を採取した。初回免疫化後、第28日に、マウスにブーストを受容させた。

これらの研究のために、1x10⁵個のMICA009発現性B16F10黒色腫細胞を、2時間、PBS 100μl中の、非免疫化マウス(ナイーブ)、MSR無しのMICAα3(ボーラス)またはMICAα3ワクチン(ワクチン接種)で免疫化されたマウス由来の血清1μlで染色した。MICAのα1-α2ドメインへ結合する市販のモノクローナル抗体6D4を陽性対照として使用した(10μg)。PEコンジュゲート化抗マウスIgGを二次抗体として使用した。ワクチン接種マウスおよびボーラス群の血清中のMICAα3特異的抗体は、ブースト後、陽性対照群と同様のレベルで、腫瘍細胞表面上に発現されたMICAへの有意な結合を示した(図10Aを参照のこと)。

MICAα3免疫化マウス由来の血清をELISAにおいて試験し、ワクチン接種で誘導されたIgGの種々のサブクラスを決定した。非免疫化マウス由来の血清を対照群として使用した。完全長MICAを捕捉抗原として使用し、1/1000の血清希釈物を各ウェル中において使用した。HRPコンジュゲート化抗マウスIgG1、IgG2a、IgG2bまたはIgG3を検出のために使用した。MICAα3ワクチンおよびボーラスワクチンでの免疫化は、試験した全てのIgGサブクラスの産生を誘導し、IgG1レベルはMICA-フェリチンワクチンよりも高かったことがわかった(図10Bを参照のこと)。

実施例8：MICAA3ワクチン単独(フェリチン融合無し)はインビボで有意な治療的有用性を示す
これらの研究のために、8週齢C57Bl/6J雌性マウスを、MICAα3ワクチン、またはMSRスキャフォールドを含まないことを除いて全てのワクチン成分からなるボーラスで免疫化した。未処置・年齢適合C57Bl/6J雌性マウスを対照群として使用した。ブーストから3週間後、0.5x10⁶個のMICA発現性B16F10黒色腫細胞のi.v.注射で、マウスに負荷した。マウスを腫瘍負荷から14日後に安楽死させ；肺を摘出し、10%中性緩衝ホルマリン中に固定し、肺転移数を定量化した。MICAα3ワクチン接種マウスは、未処置・年齢適合対照群と比較して、ほぼ腫瘍を含まなかった。肺転移数は、非免疫化群(約200～250)と比較してボーラス群(約100～125)において有意により低かった(図11Aを参照のこと)。

sMICAは、MICAα3ワクチン(三角)で免疫化されたマウスの血清中において検出不可能であり、一方、上昇したレベルのsMICAが、腫瘍負荷後、2週間以内に未処置対照群(丸)において見られた。ボーラス群は、対照群と比較して、血清中の比較的より低いレベルのsMICAを有した(四角)。(図11Bを参照のこと)。ワクチン接種群と比較して、MICAα3ボーラスで免疫化されたマウスにおける増加した肺転移数およびsMICAレベルは、ワクチン接種群と比較して、初回免疫化後、第62日までに観察されるMICA特異的抗体力価のレベルの減少に起因する可能性が最も高い(データを示さず)。

実施例9：ワクチン効能のために必要とされる細胞傷害性リンパ球集団の決定
CD8 T細胞またはNK細胞をmAbで除去することによって、CD8 T細胞およびNK細胞の両方がワクチンの治療効果に寄与することがわかった(図13A～13Bおよび14A～14B)。

実施例10：MIC抗体の定量化のためのELISAアッセイ
ワクチンによって誘導されたMIC抗体の定量化のためにELISAアッセイを使用する(図6)。

実施例11：今後の研究
以下は、ワクチン性能をさらに評価するために行われる予定の今後の研究である。
1．最適な量の抗原を試験し、2つのアジュバント、CpGオリゴヌクレオチドおよびポリ(I:C)を比較することによって、ワクチン製剤を最適化する。
2．ワクチンの効能を、複数の腫瘍モデル、具体的には、B16-MIC黒色腫モデル(皮下および転移モデルの両方)ならびに前立腺がんの同所性TRAMP-MICモデルにおいて試験する。これらの研究は、腫瘍成長の阻害および血清中の脱落MICの減少を評価することによるワクチン効能の測定を伴う。
3．血清を免疫化マウスから非免疫化レシピエントへ移し、誘導されたMIC-特異的抗体が、ワクチンによって与えられる保護のために十分であるかどうかを調べる。
4．他の腫瘍抗原に対するCD8 T細胞応答の誘導に起因してMIC発現を欠いている腫瘍細胞による二次負荷に対する保護をワクチンが提供するかどうかの決定。B16-MIC転移モデルから生き延びるマウスを、MICを発現するまたはMICを発現しない高用量のB16腫瘍細胞のi.v.注射によって負荷する。

誘導された抗体の機構的活性を反映するバイオマーカーのさらなる調査を行う。これらは以下のアプローチを含む。
1．血清中の脱落MICについてのELISAアッセイ；アッセイは利用可能であり、進行がんを有する患者由来の血清サンプルで厳格に試験する。
2．誘導されたMICα3ドメイン抗体の機能的活性の試験。どのヒト腫瘍細胞株が、MIC脱落の抗体媒介性阻害を評価するアッセイのために最適であるかを、研究する(細胞株の一団が利用可能である)。
3．末梢血および腫瘍バイオプシー中の免疫細胞のフローサイトメトリー分析。特に重要であるのは、CD8 T細胞およびNK細胞による表面NKG2Dレベルの定量化であり；抗体は利用可能であり、一団を最適化する。

実施例12：フェリチン(H.ピロリ)へ融合されたMICA002アルファ3のバキュロウイルス発現
目的：フェリチンナノ粒子へ融合されたMICA(002)アルファ3の昆虫細胞発現
一般的な設計：
シグナルペプチド、6 hisタグ、リンカー、N末端HAペプチド、MICAアルファ3ドメイン(*002:01)、GSGリンカー、H.ピロリフェリチン、終止コドン

戦略：SmaIおよびBamHI部位間でのpacDB3ベクター中へのクローン化
戦略：pacDB3ベクター中へのクローン化
DNAMAN18(1-945)の翻訳
普遍遺伝暗号
総アミノ酸数：314、MW=35668
Max ORF：1-942, 314 AA, MW=35668

SEQ DNAMAN：945 bp；
組成 254 A; 252 C; 241 G; 198 T; 0 その他
パーセンテージ：26.9% A; 26.7% C; 25.5% G; 21.0% T; 0.0% その他
分子量(kDa)：ssDNA: 291.81 dsDNA: 582.6
起源

ステップ1．以下のプライマーを使用してC1347構築物からPCR 1(シグナルペプチド、6 his、リンカー、HA、MICAアルファ3)についての鋳型を増幅する。
順方向プライマー# フェリチン_baculo_SmaIfor

内部逆方向プライマー：# フェリチンbaculo_IRev

ステップ2．以下を使用してC1347からPCR 2(フェリチン)についての鋳型を増幅する。
内部順方向プライマー：# フェリチン baculo_IF

逆方向プライマー：# フェリチン baculo_BamHIRev

ステップ3：プライマーを使用しての融合PCR。
# フェリチン_baculo_SmaIfor
および
# フェリチン baculo_BamHIRev

DNAMAN18についての制限分析
メチル化：dam-No dcm-No
117個の酵素でスクリーニングし、18個の部位が見つかった。

部位順によるリスト

非切断酵素

H.ピロリ由来のフェリチン

N19位がQへ変更されている(N-連結グリコシル化部位を排除するため)、5位(下線)で開始。

フェリチン[ヘリコバクター・ピロリ]

実施例11：昆虫細胞中における脱グリコシル化MICA 002タンパク質発現
目的：脱グリコシル化MICAアルファ3(*002:01)のバキュロウイルス発現
一般的な設計：
シグナルペプチド、N末端HAペプチド、MICAアルファ3ドメイン(*002:01)、終止コドン

戦略：pAcDB3 BglII-EcoRI部位中へのクローン化
SEQ DNAMAN1：432 bp；
組成 96 A; 125 C; 122 G; 89 T; 0 その他
パーセンテージ：22.2% A; 28.9% C; 28.2% G; 20.6% T; 0.0% その他
分子量(kDa)：ssDNA: 133.37 dsDNA: 266.4
起源

DNAMAN1(1-432)の翻訳
普遍遺伝暗号
総アミノ酸数：143、MW=15928
Max ORF：1-429, 143 AA, MW=15928

DNAMAN1についての制限分析
メチル化：dam-No dcm-No
117個の酵素でスクリーニングし、5個の部位が見つかった。

部位順によるリスト

非切断酵素

4099: MICA002_baculo_BglIIfor

4100: MICA002_baculo_EcoRIRev

他の態様
本発明は、その詳細な説明と共に説明されているが、前述の説明は、本発明を例示するためのものであり、添付の特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の範囲を限定することを意図したものではない。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。

Claims (11)

1. MICアルファ3-ドメインタンパク質へ融合された単量体フェリチンサブユニットタンパク質を含む融合タンパク質であって、
   単量体フェリチンサブユニットタンパク質が、融合タンパク質がナノ粒子へ自己組織化することを可能にするドメインを含み、
   該MICアルファ3-ドメインタンパク質が、免疫原性成分として、SEQ ID NO: 3またはSEQ ID NO: 4のアミノ酸配列、または、これらに少なくとも90％同一である配列を含む、融合タンパク質。
2. 単量体サブユニットが、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）フェリチンタンパク質の単量体サブユニットである、請求項1記載の融合タンパク質。
3. シトシン-グアノシン(CpG)オリゴヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1または2記載の融合タンパク質。
4. 請求項1～3のいずれか一項記載の融合タンパク質を含む、ナノ粒子。
5. 請求項4記載のナノ粒子を含む、ワクチン組成物。
6. GM-CSFをさらに含む、請求項5記載のワクチン組成物。
7. 対象中のがんの治療のためのワクチン組成物を製造するための、有効量の請求項１～3のいずれか一項記載の融合タンパク質の使用。
8. ワクチン組成物が、治療レジメンの一環として投与可能なように適合される、請求項7記載の使用。
9. 治療レジメンが、放射線療法、標的療法、免疫療法、または化学療法である、請求項8記載の使用。
10. 前記対象が、血清中の脱落MICについての検査で陽性であった、請求項7～9のいずれか一項記載の使用。
11. ワクチン組成物が、MICアルファ3-ドメイン抗原以外の抗原について特異的な1つまたは複数のワクチンと共に使用されるように適合される、請求項7～10のいずれか一項記載の使用。

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