KR20210094535A - 4-1bbl (cd137l) 및/또는 cd40l를 암호화하는 재조합 mva의 종양내 및/또는 정맥내 투여에 의한 암의 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종양 부피를 감소시키고/시키거나 암 환자의 생존을 증가시키는 조성물 및 관련 방법에 관한 것이다. 상기 조성물은 종양 관련 항원("TAA") 뿐만 아니라 4-1BBL 및/또는 CD40L를 암호화하는 재조합 MVA를 포함하고, 정맥내 및/또는 종양내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방식으로 대상체에 투여될 수 있다.

Description

4-1BBL (CD137L) 및/또는 CD40L를 암호화하는 재조합 MVA의 종양내 및/또는 정맥내 투여에 의한 암의 치료 방법

본 발명은 암의 치료를 위한 치료법에 관한 것으로; 상기 치료는 정맥내 또는 종양내 투여된, 4-1BBL(CD137L)을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA: modified vaccinia Ankara) 바이러스를 포함한다. 본원에 사용된 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA) 바이러스(또한 "재조합 MVA" 또는 "rMVA")는, 종양 관련 항원(TAA)을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MVA를 지칭한다. 더욱 특별한 양태에서, 본 발명은 TAA를 암호화하는 핵산과 4-1BBL을 암호화하는 핵산을 포함하는, 정맥내 또는 종양내 투여된 재조합 MVA를 포함한다. 추가적인 양태에서, 본 발명은 TAA을 암호화하는 핵산과 CD40L을 암호화하는 핵산을 포함하는, 정맥내 또는 종양내 투여된 재조합 MVA를 포함한다. 추가적인 양태에서, 본 발명은 TAA, 4-1BBL(CD137L) 및 CD40L을 암호화하는 핵산을 포함하는, 정맥내 및/또는 종양내 투여된 재조합 MVA를 포함한다.

재조합 폭스바이러스는 감염성 유기체에 대한, 더욱 최근에는 종양에 대한 면역치료 백신으로서 사용되어 왔다(Mastrangelo 등 (2000) J Clin Invest. 105(8):1031-1034).

감염성 질병과 암에 대한 면역치료 백신으로서 유용한 것으로 판명된 하나의 폭스바이러스 균주는, 변형된 배시니아 안카라(MVA) 바이러스(때때로, 간단히 "MVA"로도 지칭됨)이다. MVA는 닭 배아 섬유아세포에서의 배시니아 바이러스(CVA)의 안카라 균주를 516회 연속 계대하여 생성되었다(검토를 위해, 문헌[Mayr 등 (1975) Infection 3: 6-14]를 참고한다). 이러한 장기 계대의 결과로서, 생성된 MVA 바이러스의 게놈은 약 31 킬로베이스의 이의 게놈 서열이 결실되었으며, 따라서, 복제를 위한 숙주 세포가 조류 세포에 크게 제한된 것으로 문헌에 기재되었다(Meyer 등 (1991) J. Gen. Virol. 72: 1031-1038). 다양한 동물 모델들에서, 생성된 MVA는 유의하게 무병원성(avirulent)인 것으로 나타났다(Mayr & Danner (1978) Dev . Biol . Stand. 41: 225-34). 더욱 안전한 생성물, 예컨대 백신 또는 약제의 개발을 위한 향상된 안전 특성을 갖는 MVA의 균주도 문헌에 기재되어 왔다(국제 PCT 공보 WO2002042480를 참고하고; 또한, 예를 들어, 미국 특허 제6,761,893호 및 제6,913,752호도 참고하며, 상기 문헌 모두는 본원에 인용되어 포함된다). 이러한 변이체는 비-인간 세포 및 세포주, 특히 닭 배아의 섬유아세포(CEF)에서 재생가능한 복제를 할 수 있으나, 특히 HeLa, HaCat 및 143B 세포주를 포함하는 인간 세포주에서는 복제할 수 없다(replication incompetent). 이러한 균주는 또한 생체 내, 예를 들어, 특정 마우스 품종, 예컨대 형질전환 마우스 모델 AGR 129에서도 재생가능하게 복제할 수 없는데, 상기 품종은 심각하게 면역-약화되며, 복제 바이러스에 매우 취약하다(미국 특허 제6,761,893호 참고). 이러한 MVA 변이체 및 "MVA-BN"라고 지칭된 재조합체를 포함하는 이의 파생물도 문헌에 기재되었다(국제 PCT 공보WO2002/042480를 참고하고; 또한, 예를 들어, 미국 특허 제6,761,893호 및 제6,913,752호도 참고한다).

종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 폭스바이러스(poxvirus) 벡터의 사용은, 종양 크기를 성공적으로 감소시킬 뿐만 아니라, 암 환자의 전체 생존을 증가시키는 것으로 나타났다(예를 들어, WO 2014/062778 참고). 암 환자가 TAA, 예컨대 HER2, CEA, MUC1, 및/또는 브라큐리(Brachyury)를 암호화하는 폭스바이러스 벡터를 투여받을 때, 환자에서 암과 싸우는 굳건하고 특이적인 T-세포 반응이 생성된다고 입증되었다(마찬가지로; 또한, 문헌[Guardino 등 ((2009) Cancer Res. 69 (24), doi 10.1158/0008-5472.SABCS-09-5089)], 문헌[Heery 등 (2015) JAMA Oncol. 1: 1087-95] 참고).

많은 암세포와 종양 세포에서 발현되는 것으로 발견된 TAA의 하나의 타입은, 내재성 레트로바이러스(ERV) 단백질이다. ERV는 숙주의 생식세포 계열에 침투하여, 그로부터 유전적 집단 전체에 수직 전파되었던 이전의 외인성 형태의 잔재물이다(문헌[Bannert 등 (2018) Frontiers in Microbiology, volume 9, Article 178] 참고). 정상적인 세포 유전자의 ERV-유도된 게놈 재조합 사례 및 조절 장애도, (마찬가지로) 종양 형성에 기여하는 효과를 갖는 것으로 문헌에 나와있다. 추가로, 특정 ERV 단백질이 (마찬가지로) 암생성 특성들을 갖는다는 증거도 있다. ERV는 예를 들어, 유방암, 난소암, 흑색종, 전립선암, 췌장암 및 림프종을 포함하는 매우 다양한 암에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. (예를 들어, 문헌[Bannert 등 (2018) Front. Microbiol. 9: 178]; 문헌[Cegolon 등 (2013) BMC Cancer 13: 4]; 문헌[Wang-Johanning 등 (2003) Oncogene 22: 1528-35]; 문헌[Wang-Johanning 등 (2007) Int . J. Cancer 120: 81-90]; 문헌[Wang-Johanning 등 (2008) Cancer Res. 68: 5869-77]; 문헌[Wang-Johanning 등 (2018) Cancer Res. 78 (13 Suppl.), AACR Annual Meeting April 2018, Abstract 1257]; 문헌[Contreras-Galindo 등 (2008) J. Virol . 82: 9329-36]; 문헌[Schiavetti 등 (2002) Cancer Res. 62: 5510-16]; 문헌[Maliniemi 등 (2013) PLoS One 8: e76281]; 문헌[Fava 등 (2017) Genes Dev . 31: 34-45, Muster 등 (2003) Cancer Res. 63: 8735-41]; 문헌[Buscher 등 (2005) Cancer Res. 65: 4172-80]; 문헌[Serafino 등 (2009) Expt ’l. Cell Res. 315: 849-62]; 문헌[Iramaneerat 등 (2011) Int . J. Gynecol . Cancer 21: 51-7]; 문헌[Ishida 등 (2006) Cancer Sci . 97: 1139-46]; 문헌[Goering 등 (2011) Carcinogenesis 32: 1484-92]; 문헌[Agoni 등 (2013) Front. Oncol . 9: 180]; 문헌[Li 등 (2017) J. Mol . Diagn . 19: 4-23] 참고).

TAA에 의한 이들의 효과 외에, 폭스바이러스, 예컨대 MVA는 CD40 작용제, 예컨대 CD40 리간드(CD40L)(WO 2014/037124 참고), 또는 4-1BB 작용제, 예컨대 4-1BB 리간드(4-1BBL)와 조합될 때, 향상된 효능을 갖는 것으로 나타났다(문헌[Spencer 등 (2014) PLoS One 9: e105520]).

CD40/CD40L은 종양 괴사 인자 수용체/종양 괴사 인자("TNFR/TNF") 슈퍼 패밀리의 일원이다. CD40가 B 세포, 대식세포 및 DC를 포함하는 많은 세포 타입에서 항시적으로 발현될 때, 이의 리간드 CD40L은 활성화된 CD4+ T-세포에서 주로 발현된다(문헌[Lee 등 (2002) J. Immunol. 171(11): 5707-5717]; 문헌[Ma 및 Clark (2009) Semin . Immunol . 21(5): 265-272]). 감염 또는 면역화 직후 DC와 CD4+ T-세포 간의 동족간(cognate) 상호작용은, DC가 CD8+ T-세포 반응을 프라이밍(prime)하도록 "허가한다"(license)(문헌[Ridge 등 (1998) Nature 393: 474-478]). DC 허가는 상호-자극성 분자를 상향 조절시키고, DC의 생존 및 더 나은 교차-제시 능력을 증가시킨다. 이 과정은 주로 CD40/CD40L 상호 작용에 의해 매개되나(문헌[Bennet 등 (1998) Nature 393: 478-480]; 문헌[Schoenberger 등 (1998) Nature 393: 480-483]), CD40/CD40L-독립적인 메커니즘도 또한 존재한다(CD70, LT.베타.R). 흥미롭게도, DC 상에 발현된 CD40L과 CD8+ T-세포 상에 발현된 CD40 간의 직접 상호작용도 또한 암시되어, 헬퍼-독립적인 CTL 반응의 생성에 대한 가능한 설명을 제공한다 (문헌[Johnson 등 (2009) Immunity 30: 218-227]).

4-1BB/4-1BBL은 TNFR/TNF 슈퍼 패밀리의 일원이다. 4-1BBL은 활성화된 B 세포, 단핵구 및 DC에서 발현되는 상호 자극성 리간드이다. 4-1BB는 자연 살해(NK) 및 자연 살해 T(NKT) 세포, Treg, 그리고 DC, 단핵구 및 호중구를 포함하는 몇몇 선천성 면역 세포 집단에 의해 항시적으로 발현된다. 흥미롭게도, 4-1BB는 활성화되었으나 휴지 상태가 아닌 T 세포에서 발현된다(문헌[Wang 등 (2009) Immunol . Rev. 229: 192-215]). 4-1BB의 라이게이션(ligation)은 인터페론 감마(IFN-γ)와 인터류킨 2(IL-2)의 증식과 생산을 유도할 뿐만 아니라, 항어팝토시스(antiapoptotic) 분자, 예컨대 Bcl-xL의 상향 조절을 통해 T 세포 생존을 향상시킨다(문헌[Snell 등 (2011) Immunol . Rev. 244: 197-217]). 중요하게는, 4-1BB 자극은 항체-의존성 세포독성의 강화를 통해, NK 세포의 증식, IFN-γ 생산, 및 세포용해성 활성(ADCC)을 향상시킨다(문헌[Kohrt 등 (2011) Blood 117: 2423-32]).

면역의 4-1BB/4-1BBL 축은 상이한 면역치료 전략에 의해 현재 탐색되고 있다. 예로서, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 자가 이동은, 거대 B 세포 림프종에서 임상적 이점을 나타내었고, 이는 2017년 FDA에서 승인되었다. 환자의 자가 T 세포는 종양-특이적인 항체로부터 유래된 세포외 도메인인 CD3ζ 세포내 신호 도메인 및 4-1BB 상호 자극성 모티프와 조합된 CAR에 의해 형질도입된다. 4-1BB의 첨가는 세포내 지속성 및 CAR T 세포의 항종양 독성에서 매우 중요하다(문헌[Song 등 (2011) Cancer Res. 71: 4617e27]). 항체 표적화 4-1BB는 현재 연구 중이다.

몇몇 연구에서는, 4-1BB/4-1BBL 경로를 표적화하는 길항적 항체(agonistic antibody)가 단일치료법으로 이용될 때 항-종양 활성을 보인다고 나타났다 (문헌[Palaz

n 등 (2012) Cancer Discovery 2: 608-23]). 4-1BB를 표적화하는 길항성 항체(우레루맙(Urelumab), BMS; 우토리무맙(Utolimumab), Pfizer)가 임상 개발 중이다. 최근 수년 동안, 4-1BBL와 다른 치료를 조합하는 연구는 다양한 성공으로 나타났다. 예를 들어, 사전에 MC38(쥣과의 선암종) 종양이 존재하였으나, B16 흑색종 종양은 갖지 않은 마우스가, CTLA-4에 의한 항체와 항-4-1BB를 투여받을 때, 이러한 종양에 대한 오래-지속되는 면역성과 함께 유의한 CD8+ T 세포-의존성 종양 퇴행이 관찰되었다. 다른 예에서, 항-4-1BB(Bristol-Myers Squibb (BMS)-469492)에 의한 치료는 단지 M109 종양의 약한 퇴행으로만 이어지나, EMT6 종양의 성장은 유의하게 지연시켰다.

종양 미세환경은, 암세포에 침윤하는 면역 세포 침윤물로부터, 세포외 기질, 상피 세포, 및 종양 진행에 영향을 미치는 다른 세포 참가자(player)까지 매우 다양한 세포 타입들로 구성된다. 이러한 복잡하고 얽혀있는 균형 상태는 환자별로, 뿐만 아니라 동일한 대상체의 병변 내에서도 달라진다(문헌[

등 (2017) Cell 170(5): 927-938]). 종양 침윤 림프구(TIL)와 프로그램화 사멸 리간드 1(PD-L1) 발현에 기초를 둔 종양의 계층화(Stratification)는, 암에 대한 객관적인 반응을 달성하기 위한 염증 환경의 중요성을 강조한다(문헌[Teng 등 (2015) Cancer Res. 75(11): 2139-45]). 유전자 발현 특성 형태의 범(pan)-암 분석인 Cancer Genome Atlas(TCGA)는, 종양 염증 징후가 면역치료에 대한 객관적인 반응과 관련된다는 사실을 뒷받침한다(Danaher 등 (2018) J. Immunother . Cancer 6(1): 63).

최근 수년 동안, 백신 투여의 암 치료 경로를 개선하려는 시도는, 피하 주사로부터 정맥내 투여 경로까지 확대되어 왔다. 예를 들어, 이종 항원을 암호화하는 MVA 백신의 정맥내 투여는, 항원에 대해 강하고 특이적인 면역 반응을 유발할 수 있다고 입증되었다(WO 2014/037124 참고). 추가로, 강화된 면역 반응은 MVA 백신이 CD40L을 포함할 때 생성되었다.

치유 반응을 얻는, 종양 병변에 대한 박테리아-유래 물질(콜리 독소(Coley's toxin))의 접종이 오랫동안 보고되어 왔는데, 이는 항종양 반응의 촉진에 대한 국소 감염의 역할을 강조한다(문헌[Coley (1906) Proc . R. Soc . Med. 3 (Surg Sect): 1-48]). 종양 병변에 대한 병원균-관련 분자 패턴(Pathogen Associated Molecular Pattern)(PAMP), 박테리아 생성물 및 바이러스의 국소 투여는, 투여 이후의 일련의 사례들을 발생시키는 항미생물성 프로그램을 유도하는데, 이는: i) 타입 I, II 및 III 인터페론으로서의 전-염증성 사이토카인과 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)의 분비; ii) 위험 신호, 예컨대 알라민(alarmin)과 열-충격 단백질; 및 iii) 종양 항원의 방출을 포함한다(문헌[Aznar 등 (2017) J. Immunol . 198: 31-39]). 종양에 대한 면역치료제의 국소 투여는, 전신 면역 반응을 유발하는데, 이는 비-처리된 종양 병변 내에서도 퇴행이 평가되기 때문이다(문헌[(2018) Cancer Discov. 8(6): 67]).

MVA 백신의 종양내 투여는 과거 수년 동안 보고되어 왔다. GM-CSF를 발현하는 MVA의 종양내 주사와 DNA 백신에 의한 면역화에 의해, HPV16 E7 종양을 갖는 마우스의 생존을 연장시킨다는 사실이 밝혀졌다(Nemeckova 등 (2007) Neoplasma 54: 4). MVA의 종양내 주사에 대한 다른 연구는, 췌장 종양 성장의 억제를 입증하지 못하였다(White 등 (2018) PLoS One 13(2): e0193131). 열-불활성화 MVA의 종양내 주사는, 위험 신호의 생성, 타입 I 인터페론, 및 수지상 세포에 의한 항원 교차-제시에 의존하는 항종양 면역 반응을 유발한다(문헌[Dai 등 (2017) Sci . Immunol . 2(11): eaal1713]).

활성 면역치료 및 암 백신을 포함하는, 추가적인 암 치료에 대한 실질적으로 만족되지 않은 의학적인 필요성이 명백히 존재한다. 또한, 환자의 면역 반응의 다수의 영역에서 강화된 면역 반응을 유도할 수 있는 치료의 필요성도 있다. 많은 양태에서, 본 기재 내용의 구현예는 현재 이용가능한 암 치료를 증가 및 개선시키는 백신, 치료, 및 조합 치료를 제공함으로써, 이러한 필요성을 해결한다.

본 발명의 개요

본 발명의 다양한 구현예들에서, 종양-관련 항원(TAA)과 4-1BB 리간드(또한 본원에서 41BBL, 4-1BBL, 또는 CD137L라고도 지칭됨)를 암호화하는 재조합 MVA는, 종양내 또는 정맥내 투여될 때, 암 환자의 치료 유효성을 증가시키고/거나, 향상시키는 것으로 결정되었다. 더욱 특히, 본 기재 내용의 다양한 구현예는 재조합 MVA 그 자체의 투여에 비해, 종양에서 염증을 증가시키고, 종양내 조절 T 세포(Treg) 및 T 세포 고갈을 감소시키고, 종양-특이적인 T 세포를 확대하고, NK 세포를 활성화시키고, 종양 부피의 감소를 증가시키고/거나, 또는 암 대상체의 생존을 증가시키는 것으로 결정되었다.

본 발명의 다양한 구현예들에서, 종양-관련 항원(TAA)과 CD40 리간드(CD40L)를 암호화하는 재조합 MVA는, 종양내 또는 정맥내 투여될 때 암 환자의 치료를 향상시킨다고 결정되었다. 더욱 특히, 본 기재 내용의 다양한 구현예는 재조합 MVA 그 자체의 투여에 비해, 종양에서 염증을 증가시키고, 종양내 조절 T 세포(Treg) 및 T 세포 고갈(exhaustion)을 감소시키고, 종양-특이적인 T 세포를 확대하고, NK 세포를 활성화시키고, 종양 부피의 감소를 증가시키고/거나, 암 대상체의 생존을 증가시킨다고 결정되었다.

추가적인 구현예에서, 본 발명은 4-1BBL (CD137L)을 암호화하는 핵산과 CD40L을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA) 바이러스를 포함하며, 이는 정맥내 및/또는 종양내로 투여될 때 암 환자의 치료를 향상시킨다.

따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 대상체에게 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 종양내 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 재조합 MVA의 종양내 투여는 TAA 항원과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-종양내 주사에 비해, 암 종양에서 염증 반응을 강화하고, 종양 감소를 증가시키고/거나, 대상체의 전체 생존을 증가시킨다.

추가적인 구현예에서, 본 발명은 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 대상체에게 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 CD40L을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 종양내 투여하는 단계를 포함하되, 재조합 MVA의 종양내 투여는 TAA와 CD40L 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-종양내 주사에 비해, 암 종양에서 염증 반응을 강화하고, 종양 감소를 증가시키고/거나, 대상체의 전체 생존을 증가시킨다.

추가적인 구현예에서, 본 발명은 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 대상체에게 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산, CD40L을 암호화하는 제2 핵산, 및 4-1BBL (CD137L)을 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 종양내 및/또는 정맥내 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 재조합 MVA의 투여는 상이한 경로의 주사(즉, 비-종양내 주사 또는 비-정맥내 주사)에 의한 TAA, CD40L 항원, 및 4-1BBL 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 주사에 비해, 암 종양에서 염증 반응을 강화하고, 종양 감소를 증가시키고/거나, 대상체의 전체 생존을 증가시킨다.

추가적인 구현예에서, 본 발명은 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 대상체에게 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)을 정맥내 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 재조합 MVA의 정맥내 투여는 TAA 항원과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-정맥내 주사에 비해, 자연 살해(NK) 세포 반응을 강화시키고, TAA에 특이적인 CD8 T-세포 반응을 강화시킨다.

추가적인 구현예에서, 본 발명은 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 대상체에게 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 CD40L을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 정맥내 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 재조합 MVA의 정맥내 투여는 TAA와 CD40L 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-정맥내 주사에 비해, 자연 살해(NK) 세포 반응을 강화시키고, TAA에 특이적인 CD8 T 세포 반응을 강화시킨다.

추가적인 구현예에서, 본 발명은 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 대상체에게 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산, CD40L을 암호화하는 제2 핵산, 및 4-1BBL을 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 정맥내 및/또는 종양내 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 정맥내 및/또는 재조합 MVA의 정맥내 및/또는 종양내 투여는 TAA를 암호화하는 제1 핵산, CD40L 항원을 암호화하는 제2 핵산, 및 4-1BBL 항원을 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-정맥내 또는 비-종양내 주사에 비해, 자연 살해(NK) 세포 반응을 강화시키고, TAA에 특이적인 CD8 T 세포 반응을 강화시킨다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체의 암 종양에서 강화된 염증 반응을 유도하는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 대상체에게 제1 이종 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)을 종양내 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 재조합 MVA의 종양내 투여는 이종 종양-관련 항원과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-종양내 주사에 의해 생성되는 염증 반응에 비해, 종양에서 강화된 염증 반응을 생성한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체의 암 종양에서 강화된 염증 반응을 유도하는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 대상체에게 제1 이종 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 CD40L 항원을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 종양내 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 재조합 MVA의 종양내 투여는 이종 종양-관련 항원 및 CD40L 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-종양내 주사에 의해 생성되는 염증 반응에 비해, 종양에서 강화된 염증 반응을 생성한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체의 암 종양에서 강화된 염증 반응을 유도하는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 대상체에게 제1 이종 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산, CD40L 항원을 암호화하는 제2 핵산, 및 4-1BBL 항원을 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 종양내 및/또는 정맥내 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 재조합 MVA의 종양내 및/또는 정맥내 투여는 이종 종양-관련 항원을 암호화하는 제1 핵산, CD40L 항원을 암호화하는 제2 핵산, 및 4-1BBL 항원을 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-종양내 또는 비-정맥내 주사에 의해 생성된 염증 반응에 비해, 종양에서 강화된 염증 반응을 생성한다.

다양한 추가적인 구현예에서, 본 발명은 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 제공하는데, 상기 재조합 MVA는 a) 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산, 및 b) 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함한다.

다양한 추가적인 구현예에서, 본 발명은 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 포함하는데, 상기 재조합 MVA는 a) 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산, 및 b) CD40L을 암호화하는 제2 핵산을 포함한다.

다양한 추가적인 구현예에서, 본 발명은 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 포함하는데, 상기 재조합 MVA는: a) 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산; b) CD40L을 암호화하는 제2 핵산; 및 c) 4-1BBL을 암호화하는 제3 핵산을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 4-1BBL 항원을 암호화하는 재조합 MVA는, 면역관문 억제제 길항제의 투여와 조합하여 환자에게 종양내 투여될 때, 암 환자의 치료를 개선시키고, 특히 종양 부피의 감소를 더욱 증가시키고/시키거나, 암 환자의 생존을 증가시킨다.

또 다른 구현예에서, CD40L 항원을 암호화하는 재조합 MVA는, 면역관문 억제제 길항제의 투여와 조합하여 환자에게 종양내 투여될 때, 암 환자의 치료를 개선시키고, 특히 종양 부피의 감소를 더욱 증가시키고/시키거나, 암 환자의 생존을 증가시킨다.

또 다른 구현예에서, CD40L 및 4-1BBL 항원을 암호화하는 재조합 MVA는, 면역관문 억제제 길항제의 투여와 조합하여 환자에게 종양내 및/또는 정맥내 투여될 때, 암 환자의 치료를 개선시키며, 특히 종양 부피의 감소를 더욱 증가시키고/시키거나, 암 환자의 생존을 증가시킨다.

다른 구현예에서, 본 발명의 재조합 MVA는 항체의 투여와 동시에, 또는 항체 투여 이후에 투여된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 재조합 MVA는 항체 이후 투여된다.

다른 구현예에서, 본 발명의 재조합 MVA는 동일한 투여 경로(들)에 의해, 항체의 투여와 동시에 또는 그 후에 투여된다. 다른 구현예에서, 상기 재조합 MVA는 상이한 경로 또는 경로들의 항체의 투여에 의해, 또는 항체의 투여 이후 투여된다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 암 환자에서 항체 치료를 향상시키는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 본 발명의 약학적 조합을 암 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 약학적 조합의 투여 단계는 항체 치료의 단독 투여에 비해, 항체 치료에 의해 유발된 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 향상시킨다.

바람직한 구현예에서, 상기 제1 핵산은 내재성 레트로바이러스(ERV) 단백질인 TAA를 암호화한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 ERV 단백질은 인간의 내재성 레트로바이러스 단백질 K (HERV-K) 패밀리 유래이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 ERV 단백질은 HERV-K 외피 및 HERV-K gag 단백질로부터 선택된다.

바람직한 구현예에서, 상기 제1 핵산은 내재성 레트로바이러스(ERV) 펩티드인 TAA를 암호화한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 ERV 펩티드는 인간의 내재성 레트로바이러스 단백질 K(HERV-K) 패밀리 유래이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 ERV 펩티드는 HERV-K 외피 단백질(HERV-K-MEL)의 위유전자(pseudogene)로부터 선택된다.

다른 바람직한 구현예에서, 상기 제1 핵산은: 암배아 항원(CEA), 세포 표면 연결된 뮤신 1(MUC-1), 전립선산 포스파타제(PAP), 전립선 특이적인 항원(PSA), 인간 상피 성장인자 수용체 2 (HER-2), 서바이빈(survivin), 티로신(tyrosine) 관련 단백질 1(TRP1), 티로신 관련 단백질 1 (TRP2), 브라큐리(Brachyury), 흑색종에서 주로 발현된 항원(PRAME), 폴레이트(Folate) 수용체 1(FOLR1), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 TAA를 암호화한다.

하나 이상의 바람직한 구현예에서, 재조합 MVA는 MVA-BN 또는 이의 유도체이다.

다양한 추가적인 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 MVA 및 방법은 면역 관문 분자 길항제 또는 작용제 중 어느 하나와 조합하여, 암 대상체에 투여된다. 추가적인 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 MVA 및 방법은 TAA에 특이적인 항체와 조합하여 암 대상체에 투여되어, 암을 갖는 대상체를 치료한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 MVA 및 방법은 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3 및 ICOS로부터 선택된 면역 관문 분자 길항제 또는 작용제와 조합하여 투여된다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 면역 관문 분자 길항제 또는 작용제는 항체를 포함한다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 면역 관문 분자 길항제 또는 작용제는 PD-1 또는 PD-L1 항체를 포함한다.

본 발명의 추가적인 대상 및 장점은 이하의 상세한 설명에 부분적으로 제시될 것이며, 부분적으로는 상세한 설명으로부터 명백할 것이거나, 본 발명을 실행함으로써 습득할 수 있다. 본 발명의 대상 및 장점은 특히 첨부된 청구항에 지적된 요소들과 조합들에 의해 인식되고, 달성될 것이다.

본 명세서에 포함되어 이의 일부를 구성하는 첨부된 도면은, 본 발명의 하나 이상의 구현예를 예시하며, 본 명세서와 함께 본 발명의 원칙을 설명하는 역할을 한다.

도 1a, 1b, 1c 및 1d는, MVA-OVA-4-1BBL 감염된 종양 세포에 의한 CD8 T 세포의 4-1BBL-매개 상호 자극이 DC의 필요 없이 사이토카인 생산에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. MVA-OVA-CD40L은 반대로 DC의 존재 하에서 사이토카인 생산을 향상시킨다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, 수지상 세포(DC)는 재조합 Flt3L의 존재 하에서 14일 동안 C57BL/6 마우스 유래의 골수 세포를 배양한 후에 생성되었다. B16.F10 세포는 MVA-OVA, MVA-OVA-CD40L, 또는 MVA-OVA-4-1BBL에 의해 감염되었고, 감염된 종양 세포를 수집하여, 지시된 경우 DC의 존재 하에서 공동배양하였다. 미경험 OVA(257-264) 특이적인 CD8+ T 세포를 OT-I 마우스로부터 자기에 의해 정제하여, 공동 배양액에 첨가하였다. 세포를 배양하고, Luminex에 의한 사이토카인 농도 분석을 위해 상청액을 모았다. IL-6(도 1a), GM-CSF(도 1b), IL-2(도 1c) 및 IFN-γ(도 1d)의 상청액 농도가 나타나 있다. 데이터는 평균±SEM으로 나타나 있다.
도 2a 및 도 2b는 MVA-OVA-4-1BBL 감염된 종양 세포가 직접, 즉, DC의 필요 없이, 활성화된 효과기 T 세포로의 항원-특이적인 CD8 T 세포의 분화를 유발하는 반면, MVA-OVA-CD40L 감염된 종양 세포의 CD40L-매개 상호 자극은 DC의 존재에 의존한다는 것을 나타낸다. 실시예 3에 기재된 바와 같이, 수지상 세포(DC)는 14일 동안 재조합 Flt3L의 존재 하에서, C57BL/6 마우스 유래의 골수 세포를 배양한 후에 생성되었다. B16.F10 (흑색종 모델) 세포는 MVA-OVA, MVA-OVA-CD40L 또는 MVA-OVA-4-1BBL에 의해 감염되었다. 다음날, 감염된 종양 세포를 모아서고, (지시된 경우) DC의 존재 하에서 공동배양하였다. 미경험 OVA(257-264)-특이적인 CD8+ T 세포를 OT-I 마우스로부터 자기에 의해 정제하여, 1:5의 비로 공동배양액에 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 염색하고, 유세포 측정에 의해 분석하였다. 도 2a는 OT-I CD8+ T 세포(상기 도면에서는 "CD8+"로 나타남) 상의 T-bet의 GMFI를 나타내고; 도 2b는 OT-I CD8+ T 세포의 CD44+그랜자임 B+ IFNγ+ TNFα+의 백분율을 나타낸다. 데이터는 평균±SEM으로 나타나 있다.
도 3a, 3b, 3c, 3d 및 3e는, CD40L 또는 4-1BBL를 암호화하는 MVA에 의한 감염이, 종양 세포주 및 대식세포에서 종양 세포 사멸을 유도한다는 것을 나타낸다. 실시예 4에 기재된 바와 같이, 종양 세포주 B16.OVA(도 3a 및 3b), MC38(도 3c) 및 B16.F10(도 3d)는 20시간 동안 지정된 MOI로 벡터에 의해 감염되었다. 세포를 유세포 측정에 의해 이들의 생존능에 의해 분석되었다; 도 3a, 3c, 3d 및 3e는 사멸된 세포의 백분율을 나타낸다("생존/사멸+(Live/Dead+)"). 도 3b: 도 3a으로부터의 상청액 중 HMGB1은 ELISA에 의해 정량화되었다. 도 3e: 골수-유래 대식세포(BMDM)는 20시간 동안 지정된 MOI로 감염되었다. 세포는 유세포 측정에 의해 이들의 생존능에 대해 분석되었다. 데이터는 평균±SEM으로 제시되어 있다.
도 4a 및 4b는, rMVA-4-1BBL이 생체 내에서 NK 세포의 활성화를 유도한다는 것을 보여준다. 실시예 5에 기재된 바와 같이, C57BL/6 마우스(n=5/그룹)는 식염수, 또는 5×10⁷ TCID50의 "rMVA"(=MVA-OVA), "rMVA-4-1BBL"(=MVA-OVA-4-1BBL), 또는 5×10⁷의 TCID50의 rMVA와 200 μg의 항 4-1BBL 항체(클론 TKS-1)의 조합에 의해 정맥내 면역화되었다. 24시간 후, 마우스를 희생시키고, 비장을 유세포 측정 분석을 위해 가공하였다. CD69 (A) 및 CD70 (B)의 기하 평균 형광 강도(GMFI)가 나타나 있다. 데이터는 평균±SEM으로 나타나 있다.
도 5a 및 5b는 생체 내에서 정맥내 rMVA-4-1BBL 면역화가 혈청 IFN-γ 분비를 촉진시킨다는 것을 보여준다. 실시예 6에 기재된 바와 같이, C57BL/6 마우스(n=5/그룹)를, 식염수 또는 5×10⁷ TCID50의 "rMVA"(=MVA-OVA), "rMVA-4-1BBL"(=MVA-OVA-4-1BBL), 또는 5×10⁷ TCID50의 rMVA와 200 μg의 항 4-1BBL 항체(클론 TKS-1)의 조합으로 정맥내 면역화하였다. 도 5a: 6시간 후, 마우스를 채혈하고, 전혈로부터 혈청을 분리하고, 혈청 내 IFN-γ 농도를 Luminex에 의해 결정하였다. 도 5b: 3시간 후, 21시간 후 및 45시간 후, 마우스에 브레펠딘(Brefeldin) A를 정맥내 주사하여, 단백질 분비를 중단시켰다. 면역화 6시간 후, 24시간 후 및 48시간 후 마우스를 희생시키고, 비장 세포를 유세포 측정에 의해 분석하였다. 데이터는 평균±SEM으로 나타나 있다.
도 6은 정맥내 "rMVA-4-1BBL"(=MVA-OVA-4-1BBL) 면역화가 B16.OVA 종양-보유 마우스에서 혈청 IFN-γ 분비를 촉진시킨다는 것을 보여준다. 실시예 7에 기재된 바와 같이, B16.OVA 종양-보유 C57BL/6 마우스를 그룹으로 나누고(n=5/그룹), 종양 접종 7일 후에 PBS, 또는 5×10⁷ TCID50의 rMVA(=MVA-OVA) 또는 rMVA-4-1BBL를 i.v.(정맥내) 제공하였다. 6시간 후, 마우스를 채혈하고, 혈청을 전혈로부터 분리하고, 혈청 내 IFN-γ 농도를 Luminex에 의해 결정하였다. 데이터는 평균±SEM으로 나타나 있다.
도 7a, 7b, 7c 및 7d는 정맥내 "rMVA-4-1BBL" (=MVA-OVA-4-1BBL) 프라임 및 부스트 면역화(prime and boost immunization) 이후의 항원 및 벡터-특이적인 CD8+ T 세포 확대를 보여준다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, C57BL/6 마우스(n = 4/그룹)를 0일 차에 식염수, 또는 5×10⁷ TCID50의 "rMVA"(=MVA-OVA), rMVA-4-1BBL 또는 5×10⁷ TCID50의 rMVA와 200μg의 항 4-1BBL 항체(클론 TKS-1)의 조합으로 정맥내 1차 면역화시키고, 41일 차에 부스트 면역화시켰다. 프라임 면역화의 6일 후, 21일 후, 35일 후, 48일 후 및 64일 후에 마우스를 채혈하고, 말초혈의 유세포 분석을 실시하였다. 도 7a는 말초혈 백혈구(PBL) 중의 항원(OVA)-특이적인 CD8+ T 세포의 백분율을 나타내고; 도 7b는 PBL 중의 벡터(B8R)-특이적인 CD8+ T 세포의 백분율을 나타낸다. 마우스를 프라임 면역화 70일 이후 희생시켰다. 비장을 수집하여, 유세포 분석을 수행하였다. 도 7c는 살아있는 세포 중의 항원(OVA)-특이적인 CD8+ T 세포의 백분율을 나타내고; 도 7d는 살아있는 세포 중의 벡터(B8R)-특이적인 CD8+ T 세포의 백분율을 나타난다. 데이터는 평균±SEM으로 나타나 있다.
도 8은 4-1BBL 없는 재조합 MVA에 비해, 4-1BBL을 암호화하는 MVA 바이러스의 정맥내 주사의 증가된 항종양 효과를 보여준다. 실시예 9에 기재된 바와 같이, B16.OVA 종양-보유 C57BL/6 마우스를 그룹으로 나누고(n=5/그룹), 종양 접종 7일 후(검은색 점선)에 PBS, 또는 5×10⁷의 TCID50의 MVA-OVA (도면에서 "rMVA") 또는 MVA-OVA-4-1BBL (도면에서 "rMVA-4-1BBL")를 정맥내 투여하였다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다.
도 9a, 9b, 9c 및 9d는, 4-1BBL 또는 CD40L을 암호화하는 MVA 바이러스의 종양내 주사의 강화된 항종양 효과를 보여준다. 실시예 10에 기재된 바와 같이, B16.OVA 종양-보유 C57BL/6 마우스를 그룹으로 나누고(n=4~5/그룹), 종양 접종의 7일 후(검은색 점선), 12일 후 및 15일 후(회색 파선)에, PBS, 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-OVA(도면에서 "rMVA"로 표시됨), MVA-OVA-CD40L (도면에서 "rMVA-CD40L"로 표시됨), 또는 MVA-OVA-4-1BBL (도면에서 "rMVA-4-1BBL"로 표시됨)을 종양내 투여하였다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다.
도 10a, 10b 및 10c는 종양내 주사의 확립된 결장암에 대한 CD40L를 암호화하는 MVA 바이러스의 항종양 효과를 보여준다. 실시예 11에 기재된 바와 같이, MC38-종양-보유 C57BL/6 마우스를 그룹으로 나누고(n=5/그룹), 종양 접종의 14일 후(검은색 점선), 19일 후 및 22일 후(검은색 파선)에, PBS 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-TAA(도면에서 "rMVA"로 표시됨) 또는 MVA-TAA-CD40L(도면에서 "rMVA-CD40L"로 표시됨)를 종양내(i.t.) 투여하였다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다. 이러한 실험들에서, 재조합 MVA에 의해 암호화된 TAA는 항원 AH1A5, p15E, 및 TRP2를 포함하였다.
도 11은 면역관문 차단 및 종양-표적화 항체가 rMVA-4-1BBL(또한, 본원에서 "MVA-OVA-4-1BBL"로도 지칭됨)의 종양내(i.t.) 투여와 시너지 작용을 한다는 것을 나타낸다. 실시예 12에 기재된 바와 같이, B16.OVA 종양-보유 C57BL/6 마우스를 그룹으로 나누고(n=5/그룹), 지시된 경우 200 μg의 IgG2a, 항 TRP-1, 또는 항 PD-1 항체를 복강내 제공하였다(체크 표시). 마우스를 종양 접종의 13일 후(검은색 점선), 18일 후 및 21일 후(회색 파선)에, PBS, 또는 5×10⁷의 TCID50의 MVA-OVA-4-1BBL에 의해 종양내(i.t.) 면역화시켰다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다.
도 12는 종양내 MVA-OVA-4-1BBL 주사가 항-CD137 항체 치료에 비해, 우수한 항-종양 효과로 이어진다는 것을 입증한다. 실시예 13에 기재된 바와 같이, C57BL/6 마우스는 5×10⁵의 B16.OVA 세포를 s.c.(피하)로 제공받았다. 7일 후, 종양이 5×5㎜ 초과로 측정될 때, 마우스를 그룹으로 나누고, PBS, 5×10⁷ TCID50의 MVA-OVA-4-1BBL, 또는 10μg의 항-4-1BB (3H3) 항체를 종양내 주사하였다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다. 도 12a에는, 종양 평균 부피가 나타나 있다. 도 12b: 프라이밍 12일 후, 말초혈 림프구를 OVA-덱스트라머(dextramer)로 염색하고, FACS에 의해 분석하였다. CD8+ T 세포 중의 OVA 덱스트라머+ CD44+ T 세포의 백분율이 나타나있다.
도 13은 내재성 레트로바이러스 항원 Gp70을 암호화하는 MVA 바이러스의 정맥내 주사의 항종양 효과를 보여준다. 실시예 14에 기재된 바와 같이, Balb/c 마우스는 5×10⁵의 CT26.wt 세포를 s.c.(피하)에 제공받았다. 종양이 5×5㎜ 초과로 측정될 때, CT26.wt 종양-보유 마우스를 그룹으로 나누고(n=5/그룹), 종양 접종 12일 후에 PBS 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA, rMVA-Gp70, 또는 rMVA-Gp70-CD40L를 i.v.(정맥내)로 제공하였다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다. 종양 평균 직경(도 13a) 및 종양 평균 부피(도 13b)가 나타나 있다. 도 13c: 면역화 7일 후, 혈액 세포를 재자극시켰고, 자극 시의 혈액 내 CD8+ CD44+ IFN-γ+ 세포의 백분율이 나타나 있다.
도 14는 내재성 레트로바이러스 항원 Gp70 플러스 CD40L을 암호화하는 MVA 바이러스의 정맥내 주사의 항종양 효과를 보여준다. 실시예 15에 기재된 바와 같이, C57BL/6 마우스는 5×10⁵의 B16.F10 세포를 s.c.(피하)로 제공받았다. 종양이 5×5㎜ 초과로 측정된 지 7일 후, B16.F10 종양-보유 C57BL/6 마우스를 그룹으로 나누고(n=5/그룹), PBS 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA, rMVA-Gp70, 또는 rMVA-Gp70-CD40L를 i.v.(정맥내) 제공하였다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다. 면역화 7일 후, 종양 평균 부피(도 14a) 및 p15e 펩티드에 의한 자극 시의 혈액 중 CD8+ CD44+ IFN-γ+ 세포의 백분율(도 14b)이 나타나 있다.
도 15: IT 면역화에 대한 사이토카인/케모카인 MVA-BN 골격 반응은, 4-1BBL 어주번트화에 의해 증가될 수 있다. 본원에서 "어주번트화(adjuvantation)"는 특정 암호화된 단백질 또는 재조합 MVA의 요소가 다른 암호화된 단백질(들) 또는 재조합 MVA의 요소(들)에 의해 생성된 면역 반응을 증가시키는 것으로 의도된다. 여기에서, 5×10⁵의 B16.OVA 세포를 C57BL/6 마우스에 피하(s.c.) 이식하였다(실시예 23 참고). 10일 차에, 마우스를 PBS 또는 2×10⁸ TCID₅₀의 MVA-BN, MVA-OVA, 또는 MVA-OVA-4-1BBL(n=6 마우스/그룹)로 종양내(i.t.) 면역화시켰다. 6시간 후, 종양을 추출하고, 종양 용해물을 가공하였다. 사이토카인/케모카인 특성은 Luminex에 의해 분석하였다. 도 15는 면역화된 마우스에서 사이토카인/케모카인이 상향 조절되고 있다는 것을 보여준다.
도 16: 종양내(i.t.) 면역화에 대한 사이토카인/케모카인의 전-염증성 반응은, MVA-OVA-4-1BBL에 의해 증가한다. 5×10⁵의 B16.OVA 세포를 C57BL/6 마우스에 피하(s.c.) 이식하였다(실시예 23 및 24 참고). 마우스를 10일 차에 PBS 또는 2×10⁸ TCID50의 MVA-BN, MVA-OVA, 또는 MVA-OVA-4-1BBL(n=6 마우스/그룹)으로 종양내(i.t.) 면역화시켰다. 6시간 후, 종양을 추출하고, 종양 용해물을 가공하였다. 사이토카인/케모카인 특성은 Luminex에 의해 분석하였다. 도 16은 이들 사이토카인/케모카인이 MVA-BN에 비해 MVA-OVA-4-1BBL 면역화된 마우스에서 상향 조절된다는 것을 보여준다.
도 17: MVA-OVA-4-1BBL의 종양내 주사 이후, 종양 미세환경(TME) 및 종양-주변 림프절(TdLN)의 정량적 및 정성적인 T 세포 분석. C57BL/6 마우스에 5×10⁵의 B16.OVA 세포를 피하(s.c.)에 제공하였다. 종양이 5×5㎜ 초과로 측정된 지 9 내지 13일 후, 마우스를 그룹으로 나누고, PBS, 2x10⁸ TCID50의 MVA-OVA, 또는 MVA-OVA-4-1BBL를 종양내 주사하였다(실시예 25 참고). 면역화 1일, 3일 및 7일 후, 마우스를 희생시키고, 종양 뿐만 아니라 종양 주변 림프절(TdLN: tumor draining lymph nod)도 콜라게나제/DNase에 의해 소화시키고, 유세포 측정에 의해 분석하였다. 종양(mg) 및 TdLN당 CD45+ 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 및 OVA-특이적인 CD8+ T 세포의 수가 나타나 있다.
도 18: MVA-OVA-4-1BBL의 종양내 주사 이후, TME 및 주변(draining) LN의 정량적 및 정성적인 T 세포 분석. C57BL/6 마우스에 5×10⁵의 B16.OVA 세포를 피하(s.c.) 제공하였다. 종양이 5.5×5.5㎜ 초과로 측정된 지 9 내지 13일 후, 마우스를 그룹으로 나누고, PBS 또는 2x10⁸ TCID50의 MVA-OVA 또는 MVA-OVA-4-1BBL을 종양내 주사하였다(실시예 26 참고). 면역화 1일, 3일 및 7일 후, 마우스를 희생시키고, 종양 뿐만 아니라 TdLN(종양 주변 림프절)도 콜라게나제/DNase에 의해 소화시키고, 유세포 측정에 의해 분석하였다. 도 18a: 종양(좌측 패널) 및 TdLN(우측 패널) 내의 OVA-특이적인 CD8+ T 세포 중 Ki67+ 세포의 백분율이 나타나 있다. 도 18b: i.t. 면역화 7일 후의 종양내 OVA-특이적인 CD8+ T 세포 중 PD1의 GMFI가 나타나 있다. 도 18c: i.t. 면역화 7일 후, 종양내의 OVA-특이적인 Teff/Treg 비가 나타나 있다.
도 19: MVA-OVA-4-1BBL의 종양내 주사 이후의, TME 및 종양-주변 림프절(TdLN)의 정량적 및 정성적인 NK 세포 분석. C57BL/6 마우스는 5×10⁵의 B16.OVA 세포를 피하(s.c.)로 제공받았다. 종양이 5.5×5.5mm를 초과한 지 9 내지 13일 후, 마우스를 그룹으로 나누고, PBS, 또는 2x10⁸의 TCID50의 MVA-OVA 또는 MVA-OVA-4-1BBL 중 어느 하나를 종양내 주사하였다(실시예 27 참고). 마우스를 희생시키고, 면역화 1일, 3일, 7일 이후, 종양 뿐만 아니라 종양-주변 림프절(TdLN)도 콜라게나제/DNase로 소화시키고, 유세포 측정에 의해 분석하였다. 종양(mg) 및 TdLN 당 NK 세포의 수, 및 CD69의 GMFI, 그랜자임 B, 그리고 종양 및 TdLN 내의 NK 세포의 Ki67 표면 마커가 나타나 있다.
도 20: MVA-OVA-4-1BBL 매개 항-종양 효과의 CD8 T 세포-의존성. C57BL/6 마우스는 5×10⁵의 B16.OVA 세포를 피하(s.c.)로 제공받았다. 7일 후, 마우스를 그룹으로 나누고, PBS 또는 2×10⁸ TCID50의 MVA-OVA-4-1BBL를 종양내 주사하였다(실시예 28 참고). 이러한 제1 주사의 5일 후 및 8일 후에, 이러한 종양내(i.t.) 주사를 반복하였다(수직 파선). 추가적으로, IgG2b 동형체 대조군 항체(좌측 및 중간 패널) 또는 항-CD8 항체(2.43; 우측 패널)를 제1 면역화의 1일 전, 및 1일, 4일, 7일, 11일 이후, 복강내(i.p.) 주사하였다(100μg/마우스). 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다, 및 종양 평균 직경이 나타나 있다.
도 21: MVA-OVA 및 MVA-OVA-4-1BBL 매개 항-종양 효과의 Batf3+ DC-의존성. C57BL/6 마우스 또는 Batf3-/- 마우스는 5×10⁵의 B16.OVA 세포를 피하(s.c.)로 제공받았다. 7일 후(수직 파선), 마우스를 그룹으로 나누고, PBS, 또는 2×10⁸ TCID50의 MVA, MVA-OVA, 또는 MVA-OVA-4-1BBL를 종양내 주사하였다(실시예 29 참고). 제1 종양내 주사의 5일 및 8일 이후에, i.t. 주사를 반복하였다(수직 파선). 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다. 도 21a: 종양 평균 직경이 나타나 있다. 도 21b: 제1 면역화 11일 이후, 혈액을 채취하고, 항원-특이적인 T 세포(즉, OVA _257-264-특이적인 T 세포)의 존재에 대해 분석하였다. CD8+ T 세포 내의 OVA-특이적인 T 세포의 백분율이 나타나 있다.
도 22: B16.OVA 흑색종 보유 마우스에서의 MVA-OVA-4-1BBL의 종양내 투여에 대한 NK 세포의 역할. C57BL/6 또는 IL15Rα-/- 마우스는, 5×10⁵의 B16.OVA 세포를 피하(s.c.)로 제공받았다. 7일 후, 마우스를 그룹으로 나누고, PBS, 또는 2×10⁸ TCID50의 MVA-OVA 또는 MVA-OVA-4-1BBL를 종양내 주사하였다(실시예 30 참고). 치료는 제1 주사의 5일 및 8일 이후에 반복되었다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다. 종양 평균 직경(도 22a) 및 퍼센트 생존률(도 22b)이 나타나 있다. 제1 면역화의 11일 후, 혈액을 채취하고, 항원-특이적인 T 세포의 존재에 대해 분석하였다(도 22c). CD8+ T 세포 중 OVA _257-264-덱스트라머+ (SIINFEKL+) CD44+ T 세포의 백분율이 나타나 있다.
도 23은 MVA-OVA-4-1BBL에 의한 IT 면역화에 반응한, NK 세포-의존성 사이토카인/케모카인의 특성을 나타낸다. 5×10⁵개의 B16.OVA 세포를 C57BL/6 및 IL15Rα-/- 마우스에 피하(s.c.) 이식하였다(실시예 31 참고). 마우스를 7일 차에, PBS 또는 2×10⁸의 TCID50의 MVA-OVA 또는 MVA-OVA-4-1BBL (n=2-3 마우스/그룹)으로 종양내(i.t.) 면역화시켰다. 6시간 후, 종양을 추출하고, 종양 용해물을 가공하였다. 사이토카인/케모카인의 특성들은 Luminex에 의해 분석하였다. 도 23은 이들 사이토카인/케모카인이 MVA-OVA-4-1BBL 종양내(i.t.) 면역화 이후 IL15Rα의 부재 하에서 감소된 것을 나타낸다.
도 24는 B16.F10 흑색종 보유 마우스에서, MVA-gp70-4-1BBL에 비교된, MVA-gp70-CD40L에 의한 종양내 면역화의 항-종양 효능을 나타낸다. C57BL/6 마우스는 5×10⁵개의 B16.F10 세포를 피하(s.c.)로 제공받았다. 7일 후, 마우스를 그룹으로 나누고, PBS, 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-gp70, MVA-gp70-4-1BBL, MVA-gp70-CD40L, MVA-4-1BBL, 또는 MVA-CD40L를 종양내 주사하였다(실시예 32 참고). 치료는 제1 주사의 5일 및 8일 이후에 반복되었다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다. 도 24a는 종양 평균 직경을 나타내고, 도 24b는 MVA-gp70-4-1BBL로 처리된 마우스에서의 백반증(vitiligo)의 출현을 나타낸다. 제1 면역화 11일 후, 혈액을 채취하고, 항원-특이적인 T 세포의 존재에 대해 분석하였다. p15E 재자극 시 CD8+ T 세포 중 IFNγ를 생산하는 CD44+ T 세포의 백분율은, 도 24c에 나타나 있다.
도 25: B16.F10 흑색종 보유 마우스에서의 MVA-gp70-4-1BBL-CD40L의 종양내 투여의 항-종양 효능. C57BL/6 마우스는 5×10⁵의 B16.F10 세포를 피하(s.c.) 제공받았다. 7일 후, 마우스를 그룹으로 나누고, PBS, 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-gp70, MVA-gp70-4-1BBL, MVA-gp70-CD40L, MVA-gp70-4-1BBL-CD40L, MVA-4-1BBL, MVA-CD40L, 또는 MVA-4-1BBL-CD40L을 종양내 주사하였다(실시예 33 참고). 치료는 제1 주사의 5일 및 8일 이후에 반복되었다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다. 종양 평균 직경은 도 25a에 나타나있다. 제1 면역화 11일 후, 혈액을 채취하고, p15e 펩티드에 의해 재자극시켰다. CD8+ T 세포 내의 IFNγ+ CD44+ T 세포의 백분율은 도 25b에 나타나 있다.
도 26: CT26 종양-보유 마우스에서, CD40L 또는 4-1BBL로 어주번트화된 MVA-gp70의 항-종양 효능. Balb/c 마우스는 5×10⁵의 Ct26wt 세포를 피하(s.c.) 제공받았다. 13일 후, 마우스를 그룹으로 나누고, PBS, 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-gp70, MVA-gp70-4-1BBL, MVA-gp70-CD40L, MVA-gp70-4-1BBL-CD40L, MVA-4-1BBL, MVA-CD40L, 및 MVA-4-1BBL-CD40L을 종양내 주사하였다(실시예 34 참고). 치료는 제1 주사의 5일 및 8일 이후에 반복되었다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다. 도 26a는 종양 평균 직경을 나타내고, 도 26b는 퍼센트 생존률을 나타낸다. 도 26c: 제1 면역화 11일 후, 혈액을 채취하고, AH1 펩티드로 재자극시켰고; CD8+ T 세포 내의 IFNγ+ CD44+ T 세포의 백분율이 나타나있다.
도 27: 4-1BBL 및/또는 CD40L를 추가로 포함하는 MVA-gp70의 종양내 주사 이후, 종양 미세환경(TME) 및 종양 주변 림프절(TdLN)의 정량적 및 정성적인 T 세포 분석. C57BL/6 마우스는 5×10⁵의 B16.F10 세포를 피하(s.c.) 제공받았다. 종양이 5×5㎜를 초과한다고 측정된 지 9일 후, 마우스를 그룹으로 나누고, PBS, 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-gp70, MVA-gp70-4-1BBL, MVA-gp70-CD40L, 또는 MVA-gp70-4-1BBL-CD40L 중 어느 하나를 종양내 주사하였다(실시예 35 참고). 면역화 3일 후, 마우스를 희생시키고, 종양 뿐만 아니라 종양 주변 림프절(TdLN)을 모아서, 콜라게나제/DNase로 소화시키고, 유세포 측정에 의해 분석하였다. 도 27은 종양(mg)당, 및 TdLN당 CD8⁺ T 세포, p15E-특이적인 CD8⁺ T 세포, 및 Ki67⁺ p15E-특이적인 CD8⁺ T 세포의 수를 나타낸다. 데이터는 평균±SEM으로 제시되었다.
도 28은 4-1BBL 및/또는 CD40L을 추가로 발현하는 MVA-gp70의 종양내 주사 이후, 종양 미세환경(TME) 및 종양 주변 림프절(TdLN)의 정량적 및 정성적인 T 세포 분석을 나타낸다. C57BL/6 마우스는 5×10⁵개의 B16.F10 세포를 피하(s.c.) 제공받았다(실시예 36 참고). 종양이 5.5 x 5.5 mm를 초과하는 것으로 측정된 지 9일 후, 마우스를 그룹으로 나누고, PBS, 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-Gp70, MVA-gp70-4-1BBL, MVA-gp70-CD40L 및 MVA-gp70-4-1BBL-CD40L을 종양내 주사하였다. 면역화 3일 후, 마우스를 희생시키고, 종양 뿐만 아니라 TdLN을 모우고, 콜라게나제/DNase로 소화시키고, 생성된 개별 세포들을 유세포 측정에 의해 분석하였다. 종양(mg) 및 TdLN당 NK 세포, Ki67⁺ NK 세포 및 그랜자임 B⁺ NK 세포의 수가 나타나있다. 데이터는 평균±SEM으로 제시되어 있다.
도 29: CT26.WT 종양-보유 마우스에서 4-1BBL 및/또는 CD40L에 의해 어주번트화된 MVA-gp70의 정맥내 투여의 항-종양 효능. Balb/c 마우스는 5×10⁵의 CT26.WT 세포를 피하(s.c.) 제공받았다. 12일 후, 마우스를 그룹으로 나누고, PBS, 또는 5×10⁷ TCID₅₀의 MVA-Gp70, MVA-Gp70-4-1BBL, MVA-Gp70-CD40L, MVA-Gp70-4-1BBL-CD40L, 및 MVA-4-1BBL-CD40L을 정맥내 주사하였다(실시예 37 참고). 도 29a는 종양 평균 직경을 나타내고, 도 29b는 퍼센트 생존률을 나타낸다. 제1 면역화 7일 이후, 혈액을 채취하고, AH1 펩티드에 의해 재자극시켰다; 도 29c는 CD8⁺ T 세포 내의 IFNγ⁺ CD44⁺ T 세포의 백분율을 평균±SEM으로서 나타낸다.

본 발명의 상세한 설명

상기 발명의 개요 및 이하의 상세한 설명은 둘 다 단지 예시적이고 설명적인 것이며, 본 발명을 청구된 바와 같이 제한하지 않는다고 이해될 것이다.

본 출원에 기재되고 설명된, 본 발명의 재조합 MVA 및 방법은 다수 양태의 암 환자의 면역 반응을 강화시켰다. 다양한 양태에서, 본 발명은 종양-관련 항원(TAA)과 4-1BBL 항원을 포함하는 재조합 MVA가 암 대상체에 종양내 또는 정맥내 투여된 때, 대상체에서 증가된 항-종양 효과가 실현된다는 것을 입증한다. 본원에 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 이러한 증가된 항-종양 효과는 종양 부피의 더 큰 감소, 증가된 전체 생존률, TAA에 대한 강화된 CD8 T 세포 반응, 및 강화된 염증 반응, 예컨대 증가된 NK 세포 활성, 사이토카인 생산의 증가 등을 포함한다.

본 출원에 기재되고 설명된 본 발명의 재조합 MVA 및 방법은, 다수 양태의 암 환자의 면역 반응을 증가시켰다. 다양한 양태에서, 본 발명은 종양-관련 항원(TAA)과 CD40L 항원을 포함하는 재조합 MVA가 암 대상체에 종양내 또는 정맥내 투여된 때, 대상체에서 증가된 항-종양 효과가 실현된다는 것을 입증한다. 본원에 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 이러한 증가된 항-종양 효과는 종양 부피의 더 큰 감소, 증가된 전체 생존률, TAA에 대한 강화된 CD8 T 세포 반응, 및 강화된 염증 반응, 예컨대 증가된 NK 세포 활성, 사이토카인 생산의 증가 등을 포함한다.

추가적인 양태에서, 본 발명의 다양한 구현예들은 종양-관련 항원(TAA)과 4-1BBL 항원을 포함하는 재조합 MVA가 적어도 하나의 면역 관문 분자 길항제/작용제와 조합하여 종양내 투여될 때, 암 대상체에서 종양 감소의 증가 및 전체 생존률의 증가가 있다는 사실을 입증하였다.

다른 추가적인 양태에서, 본 발명의 다양한 구현예들은 종양-관련 항원(TAA)과 4-1BBL 항원을 포함하는 재조합 MVA가 종양 특이적인 항체와 조합하여 종양내 투여될 때, 암 대상체에서 종양 감소의 증가 및 전체 생존률의 증가가 있다는 사실을 입증하였다.

이전에 재조합 MVA 바이러스가 4-1BBL 항원을 암호화했으나, 4-1BBL을 암호화하는 MVA의 면역원성 이점은 불명확하였다(예를 들어, 문헌[Spencer 등 (2014) PLoS One 9(8): e105520] 참고). 상기 문헌[Spencer]에서, MVA 벡터 또는 아데노바이러스 벡터 내의 4-1BBL 및 전달 유전자 항원의 공동-발현은 CD8 T 세포 반응을 증가시켰으나; 4-1BBL를 암호화하는 아데노바이러스 벡터를 근육-내 투여한 후에는, 비-인간 영장류에서 IFN-γ 반응의 어떠한 증가도 없었다(마찬가지로 페이지 2, 6). 나아가, 4-1BBL을 암호화하는 MVA를 암을 치료하고 종양 및/또는 종양 세포를 파괴하는 부분으로서 이용하는 면역원성 이점은 알려지지 않았다.

본 기재 내용의 다양한 구현예는 4-1BBL을 암호화하는 MVA 및 TAA(본원에서 MVA-TAA-4-1BBL로 지칭됨)이 대상체, 예컨대 인간에서 암을 치료하는데 효과적일 수 있다는 것을 입증한다. 본원에 도시되고 기재된 MVA-TAA-4-1BBL의 투여는, 다수 양태의 암 대상체의 면역 반응을 강화시킬 수 있고, 종양 세포를 효과적으로 감소 및 사멸시킬 수 있다. 본 기재 내용의 다양한 구현예의 하나 이상의 강화된 항-종양 효과는, 이하와 같이 요약되어 있다.

재조합 4-1BBL을 암호화하는 재조합 MVA의 정맥내 투여는, 강화된 항종양 효과를 생성한다. 적어도 하나의 양태에서, 본 발명은 정맥내 투여된, TAA 및 4-1BBL 항원을 암호화하는 재조합 MVA 항원(rMVA-TAA-4-1BBL)을 포함하는데, 여기에서 정맥내 투여는 4-1BBL 없는 재조합 MVA의 정맥내 투여, 또는 4-1BBL을 암호화하는 재조합 MVA의 비-정맥내 투여(예를 들어, 4-1BBL을 암호화하는 재조합 MVA의 피하 투여)에 비해, 항-종양 효과를 강화시킨다. 이러한 강화된 항종양 효과는 강화된 NK 세포 반응(도 4), IFN-γ 분비의 증가에 의해 나타난 강화된 염증 반응(도 5 및 6), 증가된 항원 및 벡터-특이적인 CD8 T 세포 확대(도 7), 및 증가된 종양 감소(도 8)를 포함한다.

4-1BBL을 암호화하는 재조합 MVA의 종양내 투여는, 종양에서 염증을 강화시킨다. 본 발명의 다른 양태에서, MVA-OVA-CD40L이 아니라 MVA-OVA-4-1BBL에 의한 종양 세포의 감염은, 항원-특이적인 CD8+ T 세포를 활성화시켜, 항원 교차-제시 DC의 부재 하에 T 세포-유래 사이토카인, 예컨대 GM-CSF, IL-2 및 IFN-γ를 생성한다고 결정되었다(도 1a~1d). 이것은 수지상 세포와 골수 세포 서브세트의 성숙을 유도하는 활성화 시, 미경험 T 세포에 의해 생산된 성장 인자인 GM-CSF의 경우에서는 예측하지 못한 것이었다(문헌[Min 등 (2010) J. Immunol. 184: 4625-4629]). 항원-교차-제시 DC의 존재 하에, rMVA-CD40L에 의해 감염된 종양 세포로 자극된 항원-특이적인 CD8+ T 세포는 IFN-γ는 생산하나, IL-2 또는 GM-CSF는 생산하지 않았고, 이는 rMVA-4-1BBL에서도 마찬가지이다(도 1a~1d). 흥미롭게도, DC에 의해 생산된 핵심 사이토카인인 IL-6이 다량으로 검출되었다(도 1a).

하나의 유리한 양태에서, 종양내의 강화된 염증은 종양 부위에서 종양 세포를 사멸하는 다수의 TIL(종양 침윤 림프구)를 생성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Lanitis 등 (2017) Annals Oncol. 28 (suppl 12): xii18-xii32] 참고). 이러한 염증이 발생한 종양은, 또한 "뜨거운(hot)" 종양이라고도 알려져 있는데, 증가된 수의 TIL, 사이토카인, 및 다른 염증 분자의 관점에서 강화된 종양 세포 파괴를 가능하게 한다.

4-1BBL을 암호화하는 재조합 MVA의 종양내 투여는, 종양 부피를 감소시키고, 전체 생존률을 증가시킨다. 일 양태에서, 본 발명은 종양내 투여된 4-1BBL 항원(MVA-4-1BBL)을 암호화하는 재조합 MVA를 포함하며, 여기에서 종양내 투여는 4-1BBL 없는 재조합 MVA의 종양내 투여에 비해 암 대상체에서 항-종양 효과를 향상시킨다.

재조합 MVA 바이러스는 이전에도 종양내 투여되었었지만(예를 들어, 문헌[White 등 (2018) PLoS One 13: e0193131], 및 문헌[Nemeckova 등 (2007) Neoplasma 54: 326-33] 참고), 상기 연구는 다양한 결과들을 가져왔다. 예를 들어, 문헌[Nemeckova 등]에서, GM-CSF를 발현하는 배시니아 바이러스 MVA의 종양내 주사와 DNA 백신에 의한 면역화가, HPV16 유도된 종양을 갖는 마우스의 생존을 연장시킨다는 사실이 밝혀졌다(문헌[Nemeckova, 요약서] 참고). 대안적으로, 문헌[White 등]은 MVA의 종양내 주사 이후 췌장 종양 성장의 억제를 입증할 수 없었다(문헌[White, 요약서] 참고).

본 기재 내용의 일부로서, TAA 및 4-1BBL을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 재조합 MVA가 대상체에 종양내 투여되었다. 도 9에 나타난 바와 같이, MVA-TAA-4-1BBL의 종양내 주사는 재조합 MVA TAA에 비해 종양 부피에서 유의한 감소를 나타내었다.

면역 관문 분자 길항제 또는 작용제와 조합하여 투여된, 4-1BBL을 암호화하는 재조합 MVA의 종양내 투여는, 증가된 항-종양 효과를 생성한다. 다양한 구현예에서, 본 발명은 면역관문 길항제 또는 작용제와 조합한, MVA-TAA-4-1BBL의 투여를 포함한다. 바람직하게는, MVA-TAA-4-1BBL의 투여는 정맥내 또는 종양내 투여이다. 본 발명의 MVA와 면역관문 길항제 또는 작용제의 조합은, 상기 조합이 더욱 효과적인 암 치료를 제공하므로 유리하다. 예를 들어, 본 발명의 조합 및/또는 조합 치료는 다수 양태의 암 환자의 면역 반응을 강화시켰다. 적어도 하나의 양태에서, 상기 조합은 선천성 면역 반응과 적응성 면역 반응 모두를 시너지 작용으로 향상시켰고, 면역 관문 분자의 길항제 또는 작용제와 조합될 때, 종양 부피를 감소시키고, 암 환자의 생존을 증가시켰다.

본 출원에 제시된 데이터는, MVA-TAA-4-1BBL이 면역관문 길항제 또는 작용제와 조합될 때 증가된 항-종양 효과를 생성한다는 사실을 입증한다. 사실, 도 11에 나타난 바와 같이, MVA-OVA-4-1BBL의 종양내 투여가 복강 내에서 PD-1 항체와 조합될 때, PD-1 그 자체에 비해 종양 부피가 감소되었다.

종양 관련 항원(TAA)에 특이적인 항체와 조합하여 투여된, 4-1BBL을 암호화하는 재조합 MVA의 종양내 투여는, 증가된 항-종양 효과를 생성한다. 다양한 구현예에서, 본 발명은 TAA에 특이적인 항체와 조합된 MVA-TAA-4-1BBL의 투여를 포함한다. 바람직하게는, MVA-TAA-4-1BBL의 투여는 정맥내 또는 종양내 투여이다. TAA 특이적인 항체와 조합된 본 발명의 MVA는 유리하며, 함께 작용하여 더욱 효과적인 암 치료를 제공할 수 있다.

하나의 예시적인 양태에서, MVA-TAA-4-1BBL의 투여에 의해 유도된 강화된 NK 세포 반응은, TAA 특이적인 항체와 시너지 작용을 하여, 대상체에서 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 강화시킨다. 암 대상체에서의 이러한 강화된 ADCC는, 종양 세포 사멸 및 종양 파괴의 증가로 이어진다.

본 출원에 제시된 데이터는, MVA-TAA-4-1BBL이 TAA 특이적인 항체와 조합될 때 증가된 항-종양 효과를 생성한다는 사실을 입증한다. 사실, 도 11에 나타난 바와 같이, MVA-OVA-4-1BBL의 종양내 투여는 복강내 TRP-1 항체와 조합될 때, TRP-1 항체 그 자체에 비해 종양 부피가 감소한다.

본 발명에 의한 프라임 및 부스트 면역화의 일부로서의 MVA-TAA-4-1BBL의 투여는, 항원 및 벡터-특이적인 CD8+ T 세포 확대를 증가시켰다. 다른 양태에서, 본 발명은 MVA-TAA-4-1BBL이 상동성 및/또는 이종성 프라임-부스트 요법의 일부로서 투여되는 방법을 제공한다. 바람직하게는, MVA-TAA-4-1BBL의 투여는 정맥내 또는 종양내 투여이다. 도 7에서 예시된, 항원 및 벡터-특이적인 CD8+ T 세포 확대는 MVA-TAA-4-1BBL의 정맥내 투여에 의한 프라이밍 및 부스팅 동안 증가되었다.

정의

본원에 사용된 단수 형태 ["a", "an" 및 "the"]는, 달리 명백히 지시된 바 없는 경우, 복수의 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 핵산(a nucleic acid)"에 대한 언급은 하나 이상의 핵산을 포함하며, "방법(the method)"에 대한 언급은 본원에 기재된 방법으로 변형되거나 치환될 수 있는, 당업계의 통상의 숙련자에게 알려진 균등한 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.

달리 지시된 바 없는 경우, 일련의 요소들 앞에 오는 용어 "적어도(at least)"는, 일련의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 당업계의 숙련자는 통상적인 실험들만을 사용하여, 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 구현예들에 대한 많은 균등물을 인지하거나, 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 발명에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

본 명세서 및 이하의 청구항 전반에서, 문맥이 달리 요구하지 않는 이상, 단어 "포함하다(comprise)" 및 변형어, 예컨대 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은, 기술된 정수 또는 단계, 또는 정수들 또는 단계들의 그룹은 포함하나, 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 임의의 정수들 또는 단계들의 그룹은 배제하는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용될 때, 용어 "포함하는(comprising)"는 용어 "함유하는(containing)" 또는 "포함하는(including)"으로 대체되거나, 때때로 본원에서 사용될 때, 용어 "갖는(having)"으로 대체될 수 있다. 임의의 상기 언급된 용어들[포함하는(comprising), 함유하는(containing), 포함하는(including), 갖는(having)]은, 덜 바람직하기는 하지만, 본 발명의 양태 또는 구현예의 맥락에서 본원에 사용될 때, 용어 "로서 이루어지는(consisting of)으로 대체될 수 있다. 본원에서 사용될 때, "로서 이루어지는(consisting of)"은, 청구항 구성 요소로 특정되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분은 배제한다. 본원에서 사용될 때, "을 필수적으로 포함하는(consisting essentially of)"은, 청구항의 기본적이고 신규한 특징들에 실질적으로 영향을 주지 않는 물질 또는 단계는 배제하지 않는다.

본원에서 사용된 다수의 나열된 요소들 사이의 병합 용어 "및/또는(and/or)"는, 개별 및 조합된 선택 사항을 모두 포괄하는 것으로 이해된다. 에를 들어, 2개의 요소가 "및/또는"에 의해 연결될 경우, 제1 선택 사항은 제2 요소 없는 제1 요소의 적용가능성을 지칭한다. 제2 선택 사항은 제2 요소 없는 제2 요소의 적용가능성을 지칭한다. 제3 선택 사항은 제1 요소와 제2 요소 함께의 적용가능성을 지칭한다. 이들 선택 사항 중 어느 것도 상기 의미 내에 속하며, 따라서 본원에 사용된 용어 "및/또는"의 요건을 만족하는 것으로 이해될 것이다. 선택 사항들 중 하나 초과의 동시의 적용가능성도 또한 상기 의미 내에 속하며, 따라서 본원에 사용된 용어 "및/또는"의 요건을 만족하는 것으로 이해될 것이다.

본원에 기재된 "돌연변이화된(Mutated)" 또는 "변형된(modified)" 단백질 또는 항원은, 본원에서 핵산 또는 아미노산에 대한 임의의 변형, 예컨대 결실, 첨가, 삽입, 및/또는 치환으로 정의된다.

핵산 서열에 대해 본원에 기재된 "퍼센트(%) 서열 동일성 또는 동일성(Percent(%) sequence homology or identity)"은, 서열을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여, 최대 퍼센트의 서열 동일성을 달성하고, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환은 고려하지 않은 후에, 참고 서열(즉, 이것이 유래한 핵산 서열)의 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 뉴클레오티드 서열 동일성 또는 상동성을 결정하려는 목적을 위한 정렬은, 당업계의 숙련 기술 내에 속하는 다양한 방식들, 예를 들어, 대중적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, ALIGN, 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업계의 숙련자들은 정렬을 측정하기에 적절한 변수를 결정할 수 있고, 이는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대한의 정렬을 얻기에 필요한 임의의 알고리즘을 포함한다.

예를 들어, 핵산 서열의 적절한 정렬은 [Smith 및 Waterman]의 국재적 상동성 알고리즘에 의해 제공된다((1981) Advances in Applied Mathematics 2: 482-489). 이 알고리즘은 문헌[Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3: 353-358, 미국 워싱턴 D.C. 소재의 미국 생체의학 연구 재단(National Biomedical Research Foundation)]에 의해 개발되고, 문헌[Gribskov ((1986) Nucl . Acids Res. 14(6): 6745-6763])에 의해 정규화된 스코어링 메트릭스(scoring matrix)를 사용하여, 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위한 이 알고리즘의 예시적인 실행은, "BestFit" 유틸리티 응용에서의 Genetics Computer Group(미국 위스콘신 매디슨 소재)에 의해 제공되었다. 이 방법에 대한 디폴트 변수는, 위스콘신 서열 분석 패키지 프로그램 매뉴얼, 버전 8 (1995)(미국 위스콘신 매디슨 소재의 Genetics Computer Group으로부터 이용가능함)에 기재되어 있다. 본 발명의 맥락에서 퍼센트 동일성을 확립하는 바람직한 방법은, 애던버러(Edinburgh) 대학에 저작권이 있고, Collins 및 Sturrok이 개발했으며, IntelliGenetics, Inc.(미국 캘리포니아 마운튼 뷰 소재)가 배급한 프로그램의 MPSRCH 패키지를 사용하는 것이다. 이러한 패키지 묶음으로부터의 Smith-Waterman 알고리즘은, 디폴트 변수가 스코어링 표에 사용될 경우 이용될 수 있다(예를 들어, 12개의 갭 개방 패널티(gap open penalty), 1개의 갭 확대 패널티(gap extension penalty), 및 6개의 갭). 생성된 데이터로부터, "Match" 값이 "서열 동일성"에 반영된다. 서열들 간의 퍼센트 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램은 일반적으로 당업계에 잘 알려져 있는데, 예를 들어, 다른 정렬 프로그램은 디폴트 변수와 함께 사용되는 BLAST이다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP는 이하의 디폴트 변수들을 사용하여 사용될 수 있다: genetic code=standard; filter=none; strand=both; cutoff=60; expect=10; Matrix=BLOSUM62; Descriptions=50 sequences; sort by=HIGH SCORE; Databases=non- redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+ GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. 이러한 프로그램의 상세는 이하의 인터넷 주소: blast.ncbi.nlm.nih.gov/에서 찾아볼 수 있다.

용어 "프라임-부스트 백신화(prime-boost vaccination)" 또는 "프라임-부스트 요법(prime-boost regimen)"은, 특이적인 항원을 표적화하는 백신의 제1 프라이밍 주사, 이후 간격을 두고 동일한 백신의 하나 이상의 부스팅 주사를 사용하는 백신화 전략 또는 요법을 지칭한다. 프라임-부스트 백신화는 상동성 또는 이종성일 수 있다. 상동성 프라임-부스트 백신화는 프라이밍 주사와 하나 이상의 부스팅 주사 둘 다를 위한 동일한 항원 및 벡터를 포함하는 백신을 사용한다. 이종 프라임-부스트 백신화는 프라이밍 주사와 하나 이상의 부스팅 주사 둘 다를 위한 동일한 항원을 포함하나, 프라이밍 주사와 하나 이상의 부스팅 주사를 위한 상이한 벡터를 포함하는 백신을 사용한다. 예를 들어, 상동성 프라임-부스트 백신화는 프라이밍 주사를 위한 하나 이상의 항원을 발현하는 핵산을 포함하는 재조합 폭스바이러스와, 하나 이상의 부스팅 주사를 위한 하나 이상의 항원을 발현하는 동일한 재조합 폭스바이러스를 사용할 수 있다. 반대로, 이종 프라임-부스트 백신화는 프라이밍 주사를 위한 하나 이상의 항원을 발현하는 핵산을 포함하는 재조합 폭스바이러스와, 하나 이상의 부스팅 주사를 위한 하나 이상의 항원을 발현하는 상이한 재조합 폭스바이러스를 사용할 수 있다.

용어 "재조합체(recombinant)"는, 자연에서 발생하지 않거나, 자연에서 발견되지 않은 배열로 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 반합성 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드, 바이러스 또는 벡터를 의미한다. 본원에 사용된 "재조합 MVA" 또는 "rMVA"는, 일반적으로 종양 관련 항원(TAA)을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 변형된 배시니아 안카라(MVA)인 것으로 의도된다.

본원에 사용된 [종양 부피를 감소시키거나, 또는 종양 부피의 감소(reducing tumor volume or a reduction in tumor volume)]는 종양 부피 및/또는 크기의 감소를 특징으로 할 수 있으나, 또한 당업계에 이해되어 있는 임상 실험 목표(endpoint)의 관점에서 특징화될 수도 있다. 종양 부피 및/또는 크기의 감소와 관련된 일부 예시적인 임상 실험의 목표는, 반응율(RR), 객관적인 반응율(ORR) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 생존률의 증가는, 암 환자의 생존의 증가로서 특성화될 수 있으나, 또한 당업계에 이해되어 있는 임상 실험 목표에 대하여 특성화될 수도 있다. 생존률 증가와 관련된 일부 예시적인 임상 실험의 목표는, 전체 생존률(OS), 무진행 생존(PFS) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 "전달유전자(transgene)" 또는 "이종(heterologous)" 유전자는, 야생-형 폭스바이러스 게놈 (예를 들어, 배시니아, Fowlpox, 또는 MVA)에 존재하지 않는 핵산 또는 아미노산 서열인 것으로 이해된다. 당업계의 숙련자는, "전달유전자" 또는 "이종 유전자"가 폭스바이러스, 예컨대 배시니아 바이러스 내에 존재할 때, 재조합 폭스바이러스가 숙주 세포로 투여된 후, 이것이 상응하는 이종 유전자 산물로서, 즉, "이종 항원(heterologous antigen)" 및/또는 "이종 단백질(heterologous protein)"로서 발현되는 방식으로 폭스바이러스 게놈 내에 포함될 것으로 이해한다. 발현은 통상 이종 유전자를 폭스바이러스-감염된 세포에서 발현시킬 수 있는 조절 요소에 작용가능하게 연결시킴으로써 달성된다. 바람직하게는, 상기 조절 요소는 천연 또는 합성 폭스바이러스 프로모터를 포함한다.

"벡터(vector)"는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는 재조합 DNA 또는 RNA 플라스미드 또는 바이러스를 지칭한다. 이종 폴리뉴클레오티드는 예방 또는 치료의 목적을 위한 관심 대상의 서열을 포함할 수 있고, 선택적으로 발현 카세트(expression cassette)의 형태일 수 있다. 본원에 사용된 벡터는 궁극적인 표적 세포 또는 대상체에서 복제가능할 필요가 없다. 상기 용어는 클로닝 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한다.

조합 및 방법

다양한 구현예에서, 본 발명은 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA를 포함하는데, 여기에서 종양내 투여는 TAA를 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-종양내 투여에 의해 유도된 염증 반응 및 T 세포 반응에 비해, 염증 반응과 강화된 T 세포 반응를 둘 다 유도한다.

다양한 추가적인 구현예에서, 본 발명은 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는데, 여기에서 종양내 투여는 TAA를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 종양내 투여에 의해 유발되는 종양내 염증 반응과 T 세포 반응에 비해, 강화된 종양내 염증 반응과 강화된 T 세포 반응을 둘 다 유도한다.

종양에서의 강화된 염증 반응

본 기재 내용의 다양한 양태에서, TAA 및 4-1BBL을 암호화하는 재조합 MVA의 종양내 투여는 재조합 MVA 그 자체의 투여에 비해, 종양에서 강화된 염증 반응을 유발하는 것으로 결정되었다. 적어도 하나의 양태에서, 본 기재 내용에 의한 종양에서의 "강화된 염증 반응(enhanced inflammation response)"은 이하의 것들 중 하나 이상인 것을 특징으로 한다: 1) IFN-γ의 발현 증가, 및/또는 2) 종양 및/또는 종양 세포에서의 그랜자임 B(GraB)의 발현 증가. 따라서, 본 기재 내용에 따라 종양 및/또는 종양 세포에서 염증 반응이 강화되는지 여부는, 당업계에 알려져 있는 바와 같이, 증가된 염증 반응의 표시인 케모카인 및 사이토카인의 분비를 포함하는 하나 이상의 분자의 발현이 증가하는지를 결정하기 위한 측정에 의해 결정될 수 있다. 예시적인 염증 반응 마커는 NK 세포의 빈도를 측정하는데 유용한 하나 이상의 마커를 포함하고/거나, 상기 활성은: IFN-γ 및/또는 그랜자임 B (GraB) 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 분자 및 이의 측정은 당업계에 이해되어 있고, 공지의 기술에 따라 수행될 수 있는 검증된 검정법이다. 예를 들어, 문헌[Borrego 등 ((1999) Immunology 7(1): 159-165)]를 참고한다.

강화된 NK 세포 반응. 본 기재 내용의 다양한 추가적인 양태에서, TAA 및 4-1BBL를 암호화하는 재조합 MVA의 종양내 투여 또는 정맥내 투여는, 재조합 MVA 그 자체의 투여에 비해, 종양 또는 종양 환경에서 강화된 NK 세포 반응을 유발한다고 결정되었다. 일 양태에서, 본 기재 내용에 의한 "강화된 NK 세포 반응(enhanced NK cell response)"은, 이하의 것들 중 하나 이상을 특징으로 한다: 1) NK 세포의 빈도의 증가, 2) NK 세포의 활성화의 증가, 및/또는 3) NK 세포의 증식의 증가. 따라서, NK 세포 반응이 본 기재 내용에 의해 강화되는지 여부는, 증가된 NK 세포의 빈도, 증가된 NK 세포의 활성화, 및/또는 증가된 NK 세포의 증식의 표시인 하나 이상의 분자의 발현을 측정함으로써 결정될 수 있다. NK 세포의 빈도 및/또는 활성을 측정하는데 유용한 예시적인 마커는, 이하의 것들 중 하나 이상을 포함한다: NKp46, IFN-γ, CD69, CD70, NKG2D, FasL, 그랜자임 B, CD56, 및/또는 Bcl-XL. NK 세포의 활성화를 측정하는데 유용한 예시적인 마커는, IFN-γ, CD69, CD70, NKG2D, FasL, 그랜자임 B 및/또는 Bcl-XL 중 하나 이상을 포함한다. NK 세포의 증식을 측정하는데 유용한 예시적인 마커는, Ki67을 포함한다. 이러한 분자 및 이의 측정은 당업계에서 이해되고 공지의 기술에 의해 수행될 수 있는 검증된 검정법이다(예를 들어, 문헌[Borrego 등 (1999) Immunology 7(1): 159-165 참고). 추가적으로, 상기 분자를 측정하는 검정법은 본 기재 내용의 실시예 5 및 6에서 찾아볼 수 있다. 적어도 일 양태에서, 1) NK 세포의 빈도의 증가는 사전-치료/기준에 비해 CD3-NKp46+ 세포에서의 적어도 2-배 증가로 정의될 수 있고; 2) NK 세포의 활성화의 증가는 사전-치료/기준 발현에 비해 IFN-γ, CD69, CD70, NKG2D, FasL, 그랜자임 B 및/또는 Bcl-XL 발현에서의 적어도 2-배 증가로 정의될 수 있고/있거나; 3) NK 세포 증식의 증가는 사전-치료/기준 발현에 비해 Ki67 발현에서 적어도 1.5 배 증가된 것을 정의된다.

강화된 T 세포 반응. 본 출원에 의하면, "강화된 T 세포 반응(enhanced T cell response)"은 이하의 것들 중 하나 이상을 특징으로 한다: 1) CD8 T 세포의 빈도 증가; 2) CD8 T 세포 활성화의 증가; 및/또는 3) CD8 T 세포 증식의 증가. 따라서, 본 출원에 따라서 T 세포 반응이 강화되는지 여부는, 1) CD8 T 세포 빈도의 증가, 2) CD8 T 세포 활성화의 증가; 및/또는 3) CD8 T 세포 증식의 증가를 나타내는 하나 이상의 분자의 발현을 측정함으로써 결정할 수 있다. CD8 T 세포 빈도, 활성화 및 증식을 측정하는데 유용한 예시적인 마커는, 각각 CD3, CD8, IFN-γ, TNF-α, IL-2, CD69 및/또는 CD44, 및 Ki67을 포함한다. 항원 특이적인 T 세포 빈도의 측정은, 또한 본 출원에 나타난 바와 같은 MHC 다량체, 예컨대 5량체 또는 덱스트라머에 의해서도 측정될 수 있다. 이러한 측정과 검정법 뿐만 아니라 본 발명의 방법과 조성물을 평가하는데 사용된 다른 적합한 것들도 당업계에서 인증되고 이해되어 있다.

일 양태에서, CD8 T 세포 빈도의 증가는 사전-치료/기준에 비해, IFN-γ 및/또는 덱스트라머+ CD8 T 세포에서 적어도 2-배 증가된 것을 특징으로 한다. CD8 T 세포 활성화의 증가는 사전-치료/기준 발현에 비해 CD69 및/또는 CD44 발현에서 적어도 2-배 증가된 것을 특징으로 한다. CD8 T 세포 증식의 증가는, 사전-치료/기준 발현에 비해 Ki67 발현에서 적어도 2-배 증가된 것을 특징으로 한다.

대안적인 양태에서, 강화된 T 세포 반응은 효과기 사이토카인의 CD8 T 세포 발현 증가 및/또는 세포독성 효과기 기능의 증가를 특징으로 한다. 효과기 사이토카인의 발현 증가는, 사전-치료/기준에 대비된 IFN-γ, TNF-α, 및/또는 IL-2 중 하나 이상의 발현에 의해 측정될 수 있다. 세포독성 효과기 기능의 증가는 CD107a, 그랜자임 B 및/또는 퍼포린(perforin) 중 하나 이상의 발현, 및/또는 표적 세포의 항원-특이적인 사멸에 의해 측정될 수 있다.

본원에 기재된 검정법, 사이토카인, 마커 및 분자와 이들의 측정은, 당업계에서 인증 및 이해되어 있고, 공지의 기술에 따라 실시될 수 있다. 추가적으로, T 세포 반응을 측정하기 위한 검정법은, 실시예 2, 3, 8, 13 및 14를 포함하나 이에 제한되지 않는, T 세포 반응이 분석되는 작용예에서 발견될 수 있다.

본 발명에 의해 실현되는 강화된 T 세포 반응은, 특히 강화된 NK 세포 반응과 강화된 염증 반응의 조합에서 유리한데, 그 이유는 강화된 T 세포가 암 환자에서 초기의 선천성 면역 반응을 피하고/하거나, 이에서 살아남았던 이들 종양 세포를 효과적으로 표적화하여, 이들을 사멸하기 때문이다.

다른 추가적인 구현예에서, 본원에 기재된 조합 및 방법은 인간 암 환자를 치료하기 위해 사용된다. 바람직한 구현예에서, 상기 암 환자는 유방암, 폐암, 두경부암, 갑상선암, 흑색종, 위암, 방광암, 신장암, 간암, 흑색종, 췌장암, 전립선암, 난소암, 요로상피세포암, 자궁경부암 또는 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 앓고/앓거나, 이로서 진단을 받는다. 다른 추가적인 구현예에서, 본원에 기재된 조합 및 방법은 유방암, 결장직장암 또는 흑색종, 바람직하게는 흑색종, 더욱 바람직하게는 결장직장암, 또는 가장 바람직하게는 결장직장암을 앓고/앓거나, 이로 진단을 받은 인간 암 환자를 치료하는데 사용된다.

특정한 예시적인 종양-관련 항원. 특정 구현예에서, 면역 반응은 대상체에서, 세포-관련 폴리펩티드 항원에 대해 생성된다. 이러한 특정 구현예에서, 세포-관련 폴리펩티드 항원은 종양-관련 항원(TAA)이다.

용어 "폴리펩티드(polypeptide)"는, 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 둘 이상의 아미노산들의 중합체를 지칭한다. 아미노산들은 자연 발생적인 아미노산 뿐만 아니라 비-자연 발생적인 아미노산, 또는 자연 발생적인 아미노산의 화학적 유사체일 수도 있다. 상기 용어는 또한 단백질, 즉 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 기능성 생체분자도 지칭하며; 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함할 때, 이들은 복합체를 형성할 수 있고, 공유 결합되거나 비-공유 결합될 수 있다. 단백질 내의 폴리펩티드(들)은, 글리코실화되고/되거나, 지질화되고/되거나, 보결단(prosthetic group)을 포함할 수 있다.

내재성 레트로바이러스 단백질( ERV ). 바람직하게는, TAA는 내재성 레트로바이러스 단백질(ERV)에서 구현된다. 더욱 바람직하게는, ERV는 인간 HERV-K 단백질 패밀리 유래의 ERV이다. 가장 바람직하게는, HERV-K 단백질은 HERV-K 외피 (env) 단백질, HERV-K 그룹 특이적인 항원(gag) 단백질, 및 HERV-K "흑색종 위험 마커(marker of melanoma risk)" (mel) 단백질로부터 선택된다(예를 들어, 문헌[Cegolon 등 (2013) BMC Cancer 13:4] 참고).

ERV는 인간 게놈의 8%를 구성하며, 수백만년전 생식 계열 감염으로부터 유래한다. 우리의 게놈에 삽입된 이러한 요소들의 대부분은 심하게 돌연변이화되어, 전사 또는 번역되지 않는다. 그러나, ERV의 비교적 최근에 획득된 적은 부분은 여전히 기능성을 갖고, 번역되고, 일부 경우 심지어 바이러스 입자도 생산한다. ERV의 전사는 좌위가 통상 심하게 메틸화되어 추후 체세포에서 전사되지 않으므로, 매우 제한된다 (Kassiotis (2016) Nat. Rev. Immunol. 16: 207-19). 단지 일부 상황, 예컨대 세포성 스트레스(화학물질, UV 방사선, 호르몬, 사이토카인)에서만, ERV는 재활성화될 수 있다. 중요하게는, ERV는 또한 많은 상이한 타입의 암에서도 발현되나, 정상 조직에서는 발현되지 않는다(문헌[Cegolon 등 (2013) BMC Cancer 13: 4]; 문헌[Wang-Johanning 등 (2003) Oncogene 22: 1528-35]). 이러한 매우 제한된 발현 패턴은, ERV가 아마도 컴피턴트(competent) ERV-특이적인 T 세포 레퍼토리를 생성하는 면역 관용(immunological tolerance) 메커니즘에 노출되지 않거나, 거의 노출되지 않도록 보장한다. 이러한 방식으로, ERV는 종양 항원("TAA")으로서 MVA에서 사용될 수 있다.

다양한 추가적인 구현예에서, TAA는 HER2, PSA, PAP, CEA, MUC-1, FOLR1, PRAME, 서바이빈, TRP1, TRP2, 또는 브라큐리를 단독으로 또는 조합하여 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 예시적인 조합은 예를 들어 MVA에서 또한 CV301로도 알려진 CEA 및 MUC-1을 포함할 수 있다. 다른 예시적인 조합은 PAP 및 PSA를 포함할 수 있다.

다른 추가적인 구현예에서, 추가적인 TAA는 5 알파 환원효소, 알파-태아단백질, AM-1, APC, 에이프릴(April), BAGE, 베타-카테닌, Bcl12, bcr-abl, CA-125, CASP-8/FLICE, 카텝신, CD19, CD20, CD21, CD23, CD22, CD33 CD35, CD44, CD45, CD46, CD5, CD52, CD55, CD59, CDC27, CDK4, CEA, c-myc, Cox-2, DCC, DcR3, E6/E7, CGFR, EMBP, Dna78, 파르네실 트랜스퍼라제, FGF8b, FGF8a, FLK-1/KDR, 엽산 수용체, G250, GAGE-패밀리, 가스트린 17, 가스트린-방출 호르몬, GD2/GD3/GM2, GnRH, GnTV, GP1, gp100/Pmel17, gp-100-in4, gp15, gp75/TRP1, hCG, 헤파라나제, Her2/neu, HMTV, Hsp70, hTERT, IGFR1, IL-13R, iNOS, Ki67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA, LKLR-FUT, MAGE-패밀리, 마마글로빈(mammaglobin), MAP17, 멜란-A/MART-1, 메포텔린, MIC A/B, MT-MMPs, 뮤신, NY-ESO-1, 오스테오넥틴, p15, P170/MDR1, p53, p97/멜라노트랜스페린(melanotransferrin), PAI-1, PDGF, uPA, PRAME, 프로바신(probasin), 프로게니포이에틴(progenipoietin), PSA, PSM, RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, SSX-패밀리, STAT3, STn, TAG-72, TGF-알파, TGF-베타, 티모신(Thymosin)-베타-15, TNF-알파, TRP1, TRP2, 티로시나제(tyrosinase), VEGF, ZAG, p16INK4, 및 글루타티온(glutathione)-S-트랜스퍼라제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

바람직한 PSA 항원은 위치 155에서의 이소류신에서 류신으로의 아미노산 변화를 포함한다(본원에 인용되어 포함된 미국 특허 제 7,247,615호 참고).

본 발명의 하나 이상의 바람직한 구현예에서, 이종 TAA는 HER2 및/또는 브라큐리으로부터 선택된다.

본 발명의 적어도 하나의 객관적인 또는 원하는 목표를 달성할 수 있는 한, 임의의 TAA는 예컨대, 이를 함유하는 MVA의 투여 이후 면역 반응을 자극시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 언급된 TAA를 포함하는 TAA의 예시적인 서열은, 당업계에 알려져 있고, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 적합하다. 본 발명의 조성물 또는 방법에 사용하기 위한 TAA의 서열은, 당업계에 알려져 있거나 본원에 개시된 서열과 동일할 수 있거나, 또는 이들은 당업계에 알려져 있거나 본원에 개시된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 100% 미만의 동일성, 예컨대 적어도 90%, 91%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 공유할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물 또는 방법에 사용하기 위한 TAA의 서열은, 이것이 본 발명의 적어도 하나의 객관적인 또는 원하는 목표를 달성할 수 있는 한, 당업계에 알려져 있고/있거나 본원에 개시된 참고 서열과 20개 미만, 또는 19개 미만, 18개 미만, 15개 미만, 14개 미만, 13, 12개 미만, 11개 미만, 10개 미만, 9개 미만, 8개 미만, 7개 미만, 6개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 2개 미만, 또는 1개 미만의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 상이할 수 있다. 당업계의 숙련자는 본 발명의 MVA 또는 방법에 대한 이의 적합성을 보장하기 위해 TAA를 평가하는 기술 및 검정법에 익숙하다.

변형된 종양-관련 항원. 특정 구현예에서, 세포-관련 폴리펩티드 항원은 변형되어 APC의 표면 상의 MHC 클래스 I 분자에 결합되어 제시될 때, 이의 표면 상의 폴리펩티드 항원으로부터 유래한 에피토프를 제시하는 세포에 대해 CTL 반응이 유도된다. 이러한 특정 구현예에서, 적어도 하나의 제1 외부 TH 에피토프는, 제시될 때, APC의 표면 상의 MHC 클래스 II 분자에 결합한다. 이러한 특정 구현예에서, 세포-관련 항원은 종양-관련 항원이다.

에피토프를 제시할 수 있는 예시적인 APC는, 수지상 세포와 대식세포를 포함한다. 추가적인 예시적인 APC는 임의의 음세포 작용- 또는 식세포 작용을 하는 APC을 포함하며, 이는 1) MHC 클래스 I 분자에 결합된 CTL 에피토프; 및 2) MHC 클래스 II 분자에 결합된 TH 에피토프를 동시에 제시할 수 있다.

특정 구현예에서, 예컨대, HERV-K env, HERV-K gag, HERV-K mel, CEA, MUC-1, PAP, PSA, PRAME, FOLR1, HER2, 서바이빈, TRP1, TRP2, 또는 브라큐리에 제한되지 않는 하나 이상의 TAA에 대한 변형은, 대상체에 투여된 후, 주로 본원에 기재된 하나 이상의 TAA와 반응하는 다중 클론 항체가 생성되도록 이루어진다. 이러한 항체는 종양 세포를 공격하여 이를 제거할 뿐만 아니라, 전이성 세포가 전이로 발전하는 것을 예방할 수 있다. 이 항-종양 효과의 효과기 메커니즘은, 보체 및 항체 의존성 세포내 세포독성을 통해 매개될 것이다. 추가로, 유도된 항체는 또한 성장인자 의존성 올리고-이량체화와 수용체의 내재화의 억제를 통해서도 암세포 성장을 억제할 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 변형된 TAA는 종양 세포가 제시한 공지되고/되거나 예측된 TAA 에피토프에 대해 CTL 반응을 유도할 수 있다.

특정 구현예에서, 변형된 TAA 폴리펩티드 항원은 세포-관련 폴리펩티드 항원의 CTL 에피토프(epitope) 및 변형체를 포함하며, 상기 변형체는 적어도 하나의 CTL 에피토프 또는 외부 TH 에피토프를 포함한다. 이러한 특정 변형된 TAA는 하나의 비-제한적인 예에서, 적어도 하나의 CTL 에피토프를 포함하는 하나 이상의 HER2 폴리펩티드 항원, 및 외부 TH 에피토프와 CTL 에피토프 중 적어도 하나를 포함하는 변형체, 및 이의 생산 방법을 포함할 수 있으며, 이들은 미국 특허 제7,005,498호 및 미국 특허 공개 제2004/0141958호 및 제2006/0008465호에 기재되어 있다.

이러한 특정 변형된 TAA는, 하나의 비-제한적인 예에서, 적어도 하나의 CTL 에피토프를 포함하는 하나 이상의 MUC-1 폴리펩티드 항원, 및 외부 에피토프의 적어도 하나의 CTL 에피토프를 포함하는 변형체, 및 이들의 생산 방법을 포함할 수 있고, 미국 특허 공개 제 2014/0363495에 기재되어 있다.

추가적인 혼성(promiscuous) T-세포 에피토프는, 상이한 HLA-DR에 의해 암호화된 대부분의 HLA-DR 분자에 결합할 수 있는 펩티드를 포함한다. 예를 들어, WO 98/23635(Frazer IH 등, 퀸스랜드 대학에 양도됨); 문헌[Southwood 등 (1998) J. Immunol. 160: 3363 3373]; 문헌[Sinigaglia 등 (1988) Nature 336: 778 780]; 문헌[Rammensee 등 (1995) Immunogenetics 41: 178 228]; 문헌[Chicz 등 (1993) J. Exp. Med . 178: 27 47]; 문헌[Hammer 등 (1993) Cell 74: 197 203]; 및 문헌[Falk 등 (1994) Immunogenetics 39: 230 242]을 참고한다. 후자의 참고 문헌은 또한 HLA-DQ 및 -DP 리간드를 다룬다. 이러한 참고 문헌에 나열된 모든 에피토프들은 본원에 기재된 바와 같은 후보 천연 에피토프와 관련있으며, 그 이유는 공통의 모티프를 공유하는 에피토프들이기 때문이다.

특정 다른 구현예에서, 여러가지가 혼잡한(promiscuous) T-세포 에피토프는 대부분의 하플로타입(haplotype)과 결합할 수 있는 인공 T-세포 에피토프이다. 이러한 특정 구현예에서, 인공 T-세포 에피토프는 WO 95/07707 및 상응하는 논문[Alexander 등 (1994) Immunity 1: 751 761]에 기재된 바와 같은 범 DR 에피토프 펩티드("PADRE")이다.

4- 1BBL (또한, 본원에서 "41BBL" 또는 "4-1BB 리간드(ligand)"로도 지칭됨). 본 기재 내용에 의해 예시된 바와 같이, 재조합 MVA의 일부로서의 4-1BBL 및 관련 방법의 포함은, 암 대상체에 종양내 또는 정맥내 투여 시, 증가되고 강화된 항-종양 효과를 유도한다. 따라서, 다양한 구현예에서는, TAA를 암호화하는 것에 추가하여, 4-1BBL 항원을 암호화하는 재조합체 MVA가 있다.

4-1BB/4-1BBL는 TNFR/TNF 슈퍼패밀리의 일원이다. 4-1BBL은 활성화된 B 세포, 단핵구 및 DC에서 발현되는 상호 자극성(costimulatory) 리간드이다. 4-1BB는 자연 살해(NK) 및 자연 살해 T(NKT) 세포, Treg, 및 DC, 단핵구 및 호중구를 포함하는 몇몇 선천성 면역 세포 집단에 의해 항시적으로 발현된다. 흥미롭게도, 4-1BB는 활성화되었으나 휴지 상태가 아닌 T 세포 상에서 발현된다(Wang 등 (2009) Immunol. Rev. 229: 192-215). 4-1BB 라이게이션(ligation)은 인터페론 감마(IFN-γ) 및 인터류킨 2(IL-2)의 증식 및 생산을 유도할 뿐만 아니라, 항어팝토시스(antiapoptotic) 분자, 예컨대 Bcl-xL의 상향 조절을 통해 T 세포 생존을 향상시킨다(Snell 등 (2011) Immunol . Rev. 244: 197-217). 중요하기로는, 4-1BB 자극은 항체-의존성 세포독성(ADCC)의 증가를 통해 NK 세포의 증식, IFN-γ 생산 및 세포용해성 활성을 향상시킨다(Kohrt 등 (2011) Blood 117: 2423-32).

하나 이상의 바람직한 구현예에서, 4-1BBL은 본 발명의 MVA에 의해 암호화된다. 하나 이상의 다른 바람직한 구현예에서, 4-1BBL은 인간 4-1BBL이다. 더욱 더 바람직한 구현예에서, 4-1BBL은 서열번호 3과 적어도 90%, 95%, 97% 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는, 즉 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열과 10개 미만, 9개 미만, 8개 미만, 7개 미만, 6개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 2개 미만, 또는 1개 미만의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함한다. 더욱 더 바람직한 구현예에서, 4-1BBL은 서열번호 3을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함한다. 추가적인 구현예에서, 4-1BBL을 암호화하는 핵산은 서열번호 4와 적어도 90%, 95%, 97% 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는, 즉 서열 내의 20개 미만, 10개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 2개 미만, 또는 1개 미만의 핵산이 서열번호 4에 제시된 핵산 서열과 상이한 핵산 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 4-1BBL은 서열번호 4를 포함하는 핵산을 포함한다.

CD40L. 본 기재 내용에서 예시된 바와 같이, 조합의 일부로서의 CD40L과 관련 방법의 포함은, 추가로 종양 부피의 감소를 향상시키고, 무진행 생존을 연장시키고, 본 발명에 의해 실현된 생존률을 증가시킨다. 따라서, 다양한 구현예에서, 상기 조합은 CD40L를 암 환자에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, CD40L은 본원에 기재된 바와 같이, 재조합 MVA의 일부로서 암호화된다.

CD40은 B 세포, 대식세포 및 수지상 세포를 포함하는 많은 세포 타입에서 항시적으로 발현되는 반면, 이의 리간드 CD40L은 활성화된 T 헬퍼 세포에서 주로 발현된다. 수지상 세포와 T 헬퍼 세포 사이의 동족간 상호작용은, 감염 또는 면역화 직후, 수지상 세포가 CTL 반응을 프라이밍하도록 '허가한다(liscence)'. 수지상 세포의 허가는 상호-자극성 분자의 상향-조절, 증가된 생존 및 더 나은 교차-제시 능력을 발생시킨다. 이 과정은 주로 CD40/CD40L 상호작용에 의해 매개된다. 그러나, 용해성 (단량체 내지 삼량체)에 결합된 막으로부터의 CD40L의 다양한 배치가 문헌에 기재되어 있으며, 이는 APC의 활성화, 증식 및 분화를 유도 또는 재억제하는 다양한 자극제를 유도한다.

하나 이상의 바람직한 구현예에서, CD40L은 본 발명의 MVA에 의해 암호화된다. 하나 이상의 다른 바람직한 구현예에서, CD40L은 인간 CD40L이다. 더욱 더 바람직한 구현예에서, CD40L은 서열번호 1과 적어도 90%, 95%, 97% 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는, 즉 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열과 10개 미만, 9개 미만, 8개 미만, 7개 미만, 6개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 2개 미만, 또는 1개 미만의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함한다. 더욱 더 바람직한 구현예에서, CD40L은 서열번호 1을 포함하는 아미노산을 암호화하는 핵산을 포함한다.

추가적인 구현예에서, CD40L을 암호화하는 핵산은 서열번호 2와 적어도 90%, 95%, 97% 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는, 즉 서열 내에서 20개 미만, 10개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 2개 미만, 또는 1개 미만의 핵산이 서열번호 2에 제시된 핵산 서열과 상이한 핵산 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 구현예에서, CD40L은 서열번호: 2를 포함하는 핵산을 포함한다

면역 관문 분자들의 길항제 본원에 기재된 바와 같이, 적어도 일 양태에서, 본 발명은 면역관문 길항제의 사용을 포괄한다. 이러한 면역관문 길항제는 면역 관문 분자의 기능을 방해하고/하거나 차단하는 기능을 한다. 일부 바람직한 면역관문 길항제는, 세포독성 T-림프구 항원 4 (CTLA-4), 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1), 프로그램화된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 림프구-활성화 유전자 3 (LAG-3), 및 T-세포 이뮤노글로불린 및 뮤신 도메인 3 (TIM-3)를 포함한다.

추가적으로, 예시적인 면역관문 길항제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, Ig와 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT), 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

면역 관문 분자의 이러한 길항제들은, 면역 관문 분자에 특이적으로 결합하여, 면역 관문 분자의 생물학적 활성과 기능을 억제하고/하거나 차단하는 항체를 포함할 수 있다.

면역 관문 분자의 다른 길항제는, 면역 관문 분자의 발현을 방해하는 안티센스 핵산 RNA; 및 면역 관문 분자들의 발현을 방해하는 작은 방해 RNA(small-interfering RNA)를 포함할 수 있다.

길항제는 추가로 면역관문의 기능을 억제 또는 차단하는 소분자의 형태일 수 있다. 이들의 일부 비-제한적인 예는, NP12(Aurigene), (D) 청화 대학(Tsinghua Univ)에 의한 PPA-1, 고친화성 PD-1(Stanford); BMS-202 및 BMS-8(Bristol Myers Squibb(BMS), 및 CA170/ CA327(Curis/Aurigene); 및 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, 및 TIM-3의 소분자 억제제를 포함한다.

길항제는 추가로 면역 관문 분자의 기능을 억제 또는 차단하는 Anticalins®의 형태일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Rothe 등 ((2018) BioDrugs 32(3): 233-243)]를 참고한다.

길항제는 추가로 Affimers®의 형태일 수 있는 것으로 고려된다. Affimer는 면역 관문 분자의 기능을 억제하거나 차단하는 Fc 융합 단백질이다. 면역관문의 길항제로 작용할 수 있는 다른 융합 단백질은, 면역관문 융합 단백질(예를 들어, 항-PD-1 단백질 AMP-224) 및 항-PD-L1 단백질, 예컨대 US2017/0189476에 기재된 것들이다.

면역 관문 분자의 길항제 후보는 당업계에 알려지고/지거나 본 출원 내에 개시된 다양한 기술들에 의해, 시험관 내 또는 마우스 모델에서 면역 관문 분자의 기능을 방해하는 능력과 같은 기능에 대해 스크리닝될 수 있다.

ICOS의 작용제 본 발명은 추가로 ICOS의 작용제를 포괄한다. ICOS의 작용제는 ICOS를 활성화한다. ICOS는 활성화된 T 세포 상에 발현되는 양성 상호-자극성 분자이고, 리간드에 대한 이의 결합은 이들의 증식을 촉진시킨다(문헌[Dong (2001) Nature 409: 97-101]).

일 구현예에서, 작용제는 ICOS 천연 리간드인 ICOS-L이다. 작용제는 결합 및 활성화 특성을 보유하는 ICOS-L의 돌연변이화 형태일 수 있다. ICOS-L의 돌연변이화 형태는 ICOS를 자극하는 활성에 대해 시험관내에서 스크리닝될 수 있다.

면역관문 길항제 또는 작용제에 대한 항체. 바람직한 구현예에서, 면역 관문 분자의 길항제 및/또는 작용제는 각각 항체를 포함한다. 본원에 기재된 다양한 구현예에서, 항체는 합성, 단일클론 또는 다중클론 항체일 수 있으며, 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 만들어질 수 있다. 이러한 항체는 (비-특이적인 결합과는 반대로) 특히 항체의 항원-결합 영역을 통해 면역 관문 분자에 결합한다. 예를 들어, 면역관문 펩티드, 절편, 변이체, 융합 단백질 등은, 이에 의해 면역반응성을 갖는 항체의 생산에서 면역원으로 이용될 수 있다. 더욱 특히, 폴리펩티드, 절편, 변이체, 융합 단백질 등은 항체의 형성을 유발하는 항원 결정기 또는 에피토프를 함유한다.

더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 주권 국가의 정부에 의해 인간 암 환자의 치료에 대해 승인되거나, 승인 진행 중인 것들이다. 이미 승인되거나 승인 진행에 있는 이러한 항체의 일부 비-제한적인 예는 이하의 것들을 포함한다: CTLA-4 (이필리무맙(Ipilimumab)® 및 트레멜리무맙(Tremelimumab)); PD-1 (펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 람브롤리주맙(Lambrolizumab), 앰플리이뮨(Amplimmune)-224(AMP-224)), 앰플리이뮨-514(AMP-514), 니볼루맙(Nivolumab), MK-3475(Merck), BI 754091(Boehringer Ingelheim)), 및 PD-L1(아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨룰맙(Avelulmab), 더발루맙(Durvalumab), MPDL3280A(Roche), MED14736(AZN), MSB0010718C(Merck)); LAG-3(IMP321, BMS-986016, BI754111(Boehringer Ingelheim), LAG525(Novartis), MK-4289 (Merck), TSR-033(Tesaro).

하나의 예시적인 양태에서, 면역 관문 분자 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3; 및 ICOS, 및 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 및 ICOS의 아미노산 서열에 기초한 펩티드는, CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 또는 ICOS에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는데 이용될 수 있다. 용어 "항체(antibody)"는, 다중 클론 항체, 단일클론 항체, 이들의 절편, 예컨대 F(ab')2 및 Fab 절편, 단쇄 가변 절편(scFv), 단일-도메인 항체 절편(VHH 또는 나노바디), 2가 항체 절편(디아바디), 뿐만 아니라 재조합 및 합성에 의해 생산된 임의의 결합 파트너를 포함하는 것을 의미한다.

종양 관련 항원( TAA )에 특이적인 항원. 본 발명의 다양한 구현예들에서, 본원에 기재된 재조합 MVA 및 방법은 TAA에 특이적인 항체와 조합되거나, 이와 조합하여 투여된다. 더욱 특별한 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 MVA 및 방법은 종양 세포의 세포막에 발현되는 항원에 특이적인 항체와 조합되거나, 이와 조합되어 투여된다. 많은 암에서, 하나 이상의 항원은 종양 세포의 막에 발현되거나, 과다발현되는 것으로 당업계에 이해되어 있다. 예를 들어 문헌[Durig 등 (2002) Leukemia 16: 30-5]; 문헌[Mocellin 등 (2013) Biochim . Biophys . Acta 1836: 187-96]; 문헌[Arteaga (2011) Nat. Rev. Clin . Oncol ., doi:10 .1038/ nrclinonc .2011.177]; 문헌[Finn (2017) Cancer Immunol . Res. 5: 347-54]; 문헌[Ginaldi 등 (1998) J. Clin. Pathol . 51: 364-9]을 참고한다. 항원이 종양 세포에 발현되거나 과다발현되는지를 결정하기 위한 검정법, 뿐만 아니라 특정 항원에 대한 항체를 생산하기 위한 방법도, (마찬가지로) 당업계에 용이하게 이해되어 있다.

더욱 특이적인 구현예에서, 약학적 조합 및 관련 방법은 항체를 포함하는데, 여기에서 상기 항체는 a) 종양의 세포막에 발현되는 항원에 특이적이며, b) Fc 도메인을 포함한다. 적어도 하나의 양태에서, 항체 (예를 들어, a) 및 b))의 특징은, 효과기 세포, 예컨대 NK 세포, 대식세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 비만 세포, 및/또는 수지상 세포에 상기 항체가 결합하여 이와 상호작용을 할 수 있게 하고, 상기 항체가 종양 세포에 발현되는 종양 항원에 결합할 수 있게 한다. 바람직한 구현예에서, 상기 항체는 Fc 도메인을 포함한다. 추가적인 바람직한 구현예에서, 상기 항체는 NK 세포에 결합하여, 이와 상호작용을 한다.

본 기재 내용에서 고려된, 종양 세포에서 발현된 항원에 대한 일부 예시적인 항체는, 항-CD20(예를 들어, 리툭시맙(rituximab); 오파투무맙(ofatumumab); 토시투모맙(tositumomab), 항-CD52(예를 들어, 알렘투주맙(alemtuzumab)Campath®), 항-EGFR(예를 들어, 세툭시맙 에비툭스(cetuximab Erbitux)®¸ 파니투무맙(panitumumab)), 항-CD2(예를 들어, 시플리주맙(Siplizumab)), 항-CD37(예를 들어, BI836826), 항-CD123(예를 들어, JNJ-56022473), 항-CD30(예를 들어, XmAb2513), 항-CD38 (예를 들어, 다라투무맙 다자렉스(daratumumab Darzalex)®), 항-PDL1(예를 들어, 아벨루맙(avelumab), 아테졸리주맙(atezolilzumab), 두발루맙), 항-GD2(예를 들어, 3F8, ch14.18, KW-2871, 디누툭시맙(dinutuximab)), 항-CEA, 항-MUC1, 항-FLT3, 항-CD19, 항-CD40, 항-SLAMF7, 항-CCR4, 항-B7-H3, 항-ICAM1, 항-CSF1R, 항-CA125(예를 들어, 오레고보맙(Oregovomab)), 항-FRα (예를 들어 MOv18-IgG1, 미베툭시맙 소라브탄신(Mirvetuximab soravtansine)(IMGN853), MORAb-202), 항-메소텔린(예를 들어, MORAb-009), 항-TRP2, 및 항-HER2(예를 들어, 트라스투주맙(trastuzumab), 허주마(Herzuma), ABP 980, 및/또는 퍼투주맙(Pertuzumab))을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명의 일부로서 포함된 항체는, 환자에 투여될 때 종양 세포 상의 상응하는 항원에 결합하여, 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 유도하는 항체를 포함한다. 더욱 더 바람직한 구현예에서, 항체는 암의 치료를 대해 승인되거나, 사전-승인을 받은 항체를 포함한다.

더욱 더 바람직한 구현예에서, 항체는 항-HER2 항체, 항-EGFR 항체, 및/또는 항-CD20 항체이다.

가장 바람직한 구현예에서, 항-HER2 항체는 퍼투주맙, 트라스투주맙, 허주마, ABP 980, 및 아도-트라스투주맙 엠탄신(emtansine)으로부터 선택된다.

가장 바람직한 구현예에서, 항-EGFR 항체 및 항-CD20은 각각 세툭시맙 및 리툭시맙이다.

본원에 기재된 다양한 구현예에서, 항체는 합성, 단일클론 또는 다중클론 항체일 수 있고, 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 만들어질 수 있다. 이러한 항체는 (비-특이적인 결합과는 반대로) 항체의 항원-결합 영역을 통해 TAA에 특이적으로 결합한다. TAA 펩티드, 절편, 변이체, 융합 단백질 등은, 이와 면역반응을 하는 항체를 생산하는 면역원으로 이용될 수 있다. 더욱 특히, 폴리펩티드, 절편, 변이체, 융합 단백질 등은 항체의 형성을 유발하는 항원 결정기 또는 에피토프를 함유한다.

항체. 본 발명의 다양한 구현예들에서, 본원에 기재된 재조합 MVA 및 방법은 1) 면역관문 길항제 또는 작용성 항체, 또는 2) TAA-특이적인 항체와 조합되고/되거나, 조합하여 투여된다.

상기 항체는 합성, 단일클론, 또는 다중클론 항체일 수 있으며, 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 만들어질 수 있다고 고려된다. 이러한 항체는 (비-특이적인 결합과는 반대로) 항체의 항원-결합 영역을 통해 면역 관문 분자 또는 TAA에 특이적으로 결합한다. 면역관문 및/또는 TAA 펩티드, 절편, 변이체, 융합 단백질 등은, 이와 항원반응을 하는 항체를 생산할 때, 면역원으로 이용될 수 있다. 더욱 특히, 폴리펩티드, 절편, 변이체, 융합 단백질 등은 항체의 형성을 유발할 수 있는 항원 결정기 또는 에피토프를 함유한다.

이러한 항원 결정기 또는 에피토프는, 선형이거나 또는 입체적(불연속)일 수 있다. 선형 에피토프는 폴리펩티드의 아미노산들의 단일 섹션으로 구성되나, 입체적 또는 불연속적 에피토프는 단백질 폴딩 시 근접하게 되는 폴리펩티드 사슬의 상이한 영역들로부터의 아미노산 섹션으로 구성된다(문헌[Janeway, Jr. 및 Travers, Immuno Biology 3:9 (Garland Publishing Inc., 2판. 1996)]). 폴딩된 단백질이 복잡한 표면들을 가지므로, 이용가능한 에피토프의 수는 꽤 많다; 그러나, 단백질의 형태와 입체적 방해 때문에, 실제로 에피토프에 결합하는 항체의 수는 이용가능한 에피토프의 수보다 더 적다(문헌[Janeway, Jr. 및 Travers, Immuno Biology 2:14 (Garland Publishing Inc., 2판. 1996)]). 에피토프는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 식별될 수 있다.

TAA 또는 면역 관문 분자, 예컨대 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 또는 ICOS에 특이적으로 결합하여, 이의 기능을 차단하거나("길항성 항체(antagonistic antibody)"), 이의 기능을 향상/활성화시키는("작용성 항체(agonistic antibody)") scFV 절편을 포함하는 항체는 본원에 포함된다. 이러한 항체는 종래의 수단에 의해 생성될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은 면역 관문 분자 또는 TAA의 기능을 차단하거나("길항성 항체"), 향상/활성화시키는("작용성 항체") TAA 또는 면역 관문 분자에 대한 단일클론 항체를 포괄한다.

항체는 이들의 표적과 높은 결합능 및 특이성을 둘 다 갖도록 결합할 수 있다. 이들은 비교적 큰 분자 (~150 kDa)이며, 항체 결합 영역이 단백질-단백질 상호작용 영역의 근접 지역 내에 있을 때, 두 단백질(예를 들어, PD-1과 이의 표적 리간드) 사이의 상호작용을 입체적으로 억제할 수 있다. 본 발명은 면역 관문 분자 리간드 결합 영역에 밀접하게 근접한 에피토프에 결합하는 항체를 추가로 포함한다.

다양한 구현예에서, 본 발명은 분자간 상호작용(예를 들어, 단백질-단백질 상호작용)을 방해하는 항체, 뿐만 아니라 분자간 상호작용(예를 들어, 분자 내의 형태 변화)을 방해하는 항체를 포함한다. 항체는 면역 관문 분자의 생물학적 활성을 차단 또는 향상/활성화시키는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 다중클론 및 단일클론 항체는 둘 다 종래의 기술에 의해 제조될 수 있다.

하나의 예시적인 양태에서, TAA 또는 면역 관문 분자 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 및 ICOS; 및 TAA 또는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 및 ICOS의 아미노산 서열을 기초로 한 펩티드는, TAA 또는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 또는 ICOS에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는데 이용될 수 있다. 용어 "항체"는 다중 클론 항체, 단일클론 항체, 이들의 절편, 예컨대 F(ab')2 및 Fab 절편, 단쇄 가변 절편(scFvs), 단일-도메인 항체 절편(VHH 또는 나노바디), 2가 항체 절편(디아바디), 뿐만 아니라 재조합 및 합성에 의해 생산된 임의의 결합 파트너를 포함하는 것으로 의도된다. 다른 예시적인 양태에서, 항체는 이들이 면역 관문 분자와 약 10⁷ M^-1 이상의 Kd로 결합하는 경우, 특이적인 결합으로 정의된다. 결합 파트너 또는 항체의 친화성은, 종래의 기술, 예를 들어 문헌[Scatchard 등 ((1949) Ann. N.Y . Acad . Sci . 51: 660)]에 기재된 것들을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다.

다중 클론 항체는 당업계에 잘 알려진 과정을 사용하여, 다양한 공급원들, 예를 들어, 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 토끼, 마우스, 또는 래트로부터 용이하게 생성될 수 있다. 일반적으로, 정제된 TAA 또는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 및 ICOS, 또는 적절히 컨쥬게이션된 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 및 ICOS의 아미노산 서열에 기초한 펩티드는, 전형적으로 비경구 주사를 통해 숙주 동물에게 투여된다. 부스터 면역화 이후, 작은 혈청 샘플들을 모아서, CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 및 ICOS 폴리펩티드에 대한 반응성에 대해 시험하였다. 이러한 결정에 유용한 다양한 검정법의 예는, 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow 및 Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988]에 기재된 것들; 뿐만 아니라 역전류 면역-전기영동(CIEP: countercurrent immuno-electrophoresis), 방사능면역검정법, 방사능-면역침전법(radio-immunoprecipitation), 효소-연결된 면역흡착(enzyme-linked immunosorbent) 검정법 (ELISA), 닷 블롯(dot blot) 검정법, 및 샌드위치 검정법와 같은 과정을 포함한다. 미국 특허 제4,376,110호 및 제4,486,530호를 참고한다.

단일클론 항체는 잘 알려진 과정들을 사용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 RE 32,011, 제4,902,614호, 제4,543,439호 및 제4,411,993호; 문헌[Monoclonal Antibodies, Hybridomas : A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKeam, 및 Bechtol (eds.) (1980)]에 기재된 과정을 참고한다.

예를 들어, 숙주 동물, 예컨대 마우스에, 분리 및 정제된 면역 관문 분자를 적어도 1회, 바람직하게는 3주 간격으로 적어도 2회 복강내 주사할 수 있다. 이후, 마우스 혈청을 종래의 닷 블롯 기술 또는 항체 포획(ABC)에 의해 검정하여, 어느 동물이 융합에 최적인지를 결정하였다. 대략 2 내지 3주 후, 마우스에 면역 관문 분자를 정맥내 부스팅시킨다. 이후, 마우스를 희생시키고, 확립된 프로토콜을 따라 비장 세포를 상업적으로 이용가능한 골수종 세포, 예컨대 Ag8.653(ATCC)와 융합시켰다. 간략히, 골수종 세포를 배지에 몇 회 세척하고, 약 3개의 비장 세포 대 하나의 골수종 세포의 비로 마우스 비장 세포에 융합한다. 융합제는 당업계에 사용된 임의의 적합한 제제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 융합체를 융합된 세포의 선택적인 성장이 가능한 배지를 함유하는 플레이트에 분주한다. 융합된 세포는 이후 대략 8일 동안 성장될 수 있다. 생성된 하이브로도마로부터의 상청액을 모아서, 염소 항-마우스 Ig로 먼저 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 세척 후, 표시된 면역관문 분자 폴리펩티드와 같은 라벨을 각 웰에 붙인 후, 배양한다. 양성 웰이 추후 탐지될 수 있다. 양성 클론은 벌크 배양액 중에서 성장할 수 있고, 이후 상청액을 단백질 A 컬럼(Pharmacia)에서 정제하였다.

본 발명의 단일클론 항체는 대안적인 기술, 예컨대 문헌[Alting-Mees 등 ((1990) Strategies in Mol . Biol . 3: 1-9, "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas")]에 기재된 것들을 사용하여 생산될 수 있고, 상기 문헌은 본원에 인용되어 포함된다. 유사하게, 결합 파트너는 재조합 DNA 기술을 사용하여, 특이적인 결합 항체를 암호화하는 유전자의 가변 부위를 포함하도록 제작될 수 있다. 이러한 기술은 문헌[Larrick 등 ((1989) Biotechnology 7: 394)]에 기재되어 있다.

종래의 기술에 의해 생산될 수 있는 이러한 항체의 항원-결합 절편도, 또한 본 발명에 의해 포괄된다. 이러한 절편의 예는, Fab 및 F(ab')2 절편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 유전자 조작 기술에 의해 생산된 항체 절편 및 파생물도 또한 제공된다.

본 발명의 단일클론 항체는 키메라 항체, 예를 들어, 쥣과의 단일클론 항체의 인간화 버전을 포함한다. 이러한 인간화 항체는 공지의 기술에 의해 제조되며, 항체가 인간에게 투여될 때 면역원성이 감소되는 장점을 제공한다. 일 구현예에서, 인간화 단일클론 항체는 쥣과 항체의 가변 부위 (또는 단지 이의 항원 결합 영역), 및 인간 항체로부터 유래된 불변 영역을 포함한다. 대안적으로, 인간화 항체 절편은 쥣과의 단일클론 항체의 항원 결합 영역과 인간 항체로부터 유래한 (항원-결합 영역이 결여된) 가변 부위 절편을 포함할 수 있다. 키메라 및 추가로 조작된 단일클론 항체의 생산을 위한 과정은, 문헌[Riechmann 등 ((1988) Nature 332: 323), 문헌[Liu 등 ((1987) Proc . Nat’l. Acad . Sci . 84: 3439)], 문헌[Larrick 등 ((1989) Bio/Technology 7: 934)], 및 문헌[Winter 및 Harris ((1993) TIPS 14: 139)]에 기재된 것들을 포함한다. 항체를 형질전환에 의해 생성하는 과정은, GB 2,272,440, 미국 특허 제5,569,825호 및 제5,545,806호에서 찾아볼 수 있으며, 상기 문헌은 둘 다 본원에 인용되어 포함된다.

유전자 조작 방법에 의해 생산된 항체, 예컨대 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있는 인간 및 비-인간 부분을 모두 포함하는 키메라 및 인간화 단일클론 항체가 사용될 수 있다. 이러한 키메라 및 인간화 단일클론 항체는, 당업계에 알려진 표준 DNA 기술, 예를 들어 Robinson 등의 국제 공보 WO 87/02671; Akira 등의 유럽 특허 출원 제0184187호; Taniguchi, M.의 유럽 특허 출원 제0171496호; Morrison 등의 유럽 특허 출원 제0173494호; Neuberger 등의 PCT 국제 공보 WO 86/01533; Cabilly 등의 미국 특허 제4,816,567호; Cabilly 등의 유럽 특허 출원 제0125023호; 문헌[Better 등, (1988) Science 240: 1041-1043]; 문헌[Liu 등 (1987) Proc . Nat’l. Acad . Sci . 84: 3439-3443]; 문헌[Liu 등 (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526]; 문헌[Sun 등 (1987) Proc . Nat’l. Acad . Sci . 84: 214-218]; 문헌[Nishimura 등 (1987) Cancer Res. 47: 999-1005]; 문헌[Wood 등 (1985) Nature 314: 446-449]; 및 문헌[Shaw 등 (1988) J. Natl . Cancer Inst . 80: 1553-1559)]; 문헌[Morrison (1985) Science 229: 1202-1207]; 문헌[Oi 등 (1986) BioTechniques 4: 214]; Winter의 미국 특허 제5,225,539호; 문헌[Jones 등 (1986) Nature 321: 552 525]; 문헌[Verhoeyan 등 (1988) Science 239: 1534]; 및 문헌[Beidler 등 (1988) J. Immunol. 141: 4053-4060]에 기재된 방법을 사용하여, 유전자 조작에 의해 생산될 수 있다.

합성 항체 및 반-합성 항체에 대해, 이러한 용어는 항체 절편, 동형체로 전환된 항체, 인간화 항체(예를 들어, 마우스-인간, 인간-마우스), 혼성체, 복수의 특이성을 갖는 항체, 및 완전한 합성 항체-유사 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는 것으로 의도된다.

치료적 응용을 위해, 종종 인간의 불변 부위와 가변 부위를 갖는 "인간" 단일클론 항체가 선호되어, 항체에 대한 환자의 면역 반응을 최소화한다. 이러한 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자를 함유한 형질전환 동물을 면역화시킴으로써 생성될 수 있다. 문헌[Jakobovits 등 Ann NY Acad Sci 764:525-535 (1995)]를 참고한다.

TAA 또는 면역 관문 분자에 대한 인간의 단일클론 항체는, 또한 대상체의 림프구로부터 유래한 mRNA로부터 생산된 이뮤노글로불린 경쇄 및 중쇄 cDNA를 사용하여, 조합(combinatorial) 이뮤노글로불린 라이브러리(phage display library), 예컨대 Fab 파지 디스플레이 라이브러리 또는 scFv 파지 디스플레이 라이브러리를 제작함으로써 제조될 수도 있다. 예를 들어, McCafferty 등의 PCT 공보 WO 92/01047; 문헌[Marks 등 (1991) J. Mol . Biol. 222: 581-597]; 및 문헌[Griffths 등 (1993) EMBO J. 12: 725-734]를 참고한다. 추가로, 항체 가변 부위의 조합 라이브러리는 공지의 인간 항체를 돌연변이시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역 관문 분자에 결합하는 것으로 알려진 인간 항체의 가변 부위는, 예를 들어 랜덤하게 변화된 돌연변이화 올리고뉴클레오티드를 사용하여 돌연변이화되어, 돌연변이화된 가변 부위의 라이브러리를 생성할 수 있고, 이는 이후 면역 관문 분자에 결합하는지 스크리닝될 수 있다. 이뮤노글로빈 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 영역 내에 랜덤 돌연변이화를 유도하는 방법, 랜덤화된 중쇄 및 경쇄를 교차하여 페어링(pairing) 및 스크리닝 방법을 형성하는 방법은, 예를 들어, Barbas 등의 PCT 공보 WO 96/07754; 문헌[Barbas 등 (1992) Proc . Nat'l Acad . Sci. USA 89: 4457-4461]에서 찾아볼 수 있다.

이뮤노글로불린 라이브러리는 바람직하게는 사상 파지(filamentous phage)로부터 유래된 디스플레이 패키지의 집단에 의해 발현되어, 항체 디스플레이 라이브러리를 형성할 수 있다. 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하는데 사용하기에 적합한(amenable) 방법 및 시약의 예는, 예를 들어, Ladner 등의 미국 특허 제5,223,409호; Kang 등의 PCT 공보 WO 92/18619; Dower 등의 PCT 공보 WO 91/17271; Winter 등의 PCT 공보 WO 92/20791; Markland 등의 PCT 공보 WO 92/15679; Breitling 등의 PCT 공보 WO 93/01288; McCafferty 등의 PCT 공보 WO 92/01047; Garrard 등의 PCT 공보 WO 92/09690; Ladner 등의 PCT 공보 WO 90/02809; 문헌[Fuchs 등의 (1991) Bio/Technology 9: 1370 1372]; 문헌[Hay 등 (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85]; 문헌[Huse 등 (1989) Science 246: 1275-1281]; 상기 문헌[Griffths 등 (1993)]; 문헌[Hawkins 등 (1992) J. Mol . Biol . 226: 889-896]; 문헌[Clackson 등 (1991) Nature 352: 624-628]; 문헌[Gram 등 (1992) Proc . Nat’l. Acad . Sci . 89: 3576-3580]; 문헌[Garrad 등 (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377]; 문헌[Hoogenboom 등 (1991) Nucl . Acid Res. 19: 4133-4137]; 및 문헌[Barbas 등 (1991) Proc. Nat’l. Acad . Sci . 88: 7978-7982]에서 찾아볼 수 있다. 일단 디스플레이 패키지(예를 들어, 사상 파지)의 표면 상에 나타나면, 항체 라이브러리를 스크리닝하여, TAA 또는 면역 관문 분자에 결합하는 항체를 발현하는 패키지를 식별 및 분리한다.

재조합 MVA. 본 발명의 더욱 바람직한 구현예에서, 본원에 개시된 하나 이상의 단백질 및 뉴클레오티드는 재조합 MVA 내에 포함된다. 본 기재 내용에 기재 및 예시된 바와 같이, 본 기재 내용의 재조합 MVA의 정맥내 투여는 암 환자에서 다양한 양태로 강화된 면역 반응을 유도한다. 따라서, 하나 이상의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의 TAA를 암호화하는 제1 핵산과 CD40L을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA를 포함한다.

본 발명의 실행에 유용하며, 부다페스트 조약의 요건에 따라 기탁된 MVA 바이러스 균주의 예는, 1994년 1월 27일자로 영국 윌트셔 SP4 0JG 솔즈베리 포톤 다운 소재의 European Collection of Cell Cultures(ECACC), 응용 미생물 연구 센터(Centre for Applied Microbiology and Research), 공중 보건 연구소(Public Health Laboratory Service), 백신 연구 및 생산 실험실(Vaccine Research and Production Laboratory)에 수탁 번호 ECACC 94012707로 기탁된 균주 MVA 572, 및 2000년 12월 7일자로 ECACC 00120707로 기탁된 균주 MVA 575이며, 2000년 8월 30일자로 European Collection of Cell Cultures(ECACC)에 수탁 번호 V00083008로 기탁된 MVA-BN과 이의 파생물은, 추가적인 예시적인 균주이다.

MVA-BN의 "파생물(Derivative)"은, 본원에 기재된 MVA-BN와 동일한 복제 특징을 필수적으로 나타내나, 이들의 게놈의 하나 이상의 부분에서 차이를 나타내는 바이러스를 지칭한다. MVA-BN, 뿐만 아니라 이의 파생물은, 복제 비경쟁적이며(replication incompetent), 이는 생체내 및 시험관내에서 재생적으로 복제하는데 실패한 것을 의미한다. 더욱 특히 시험관내에서, MVA-BN 또는 이의 파생물은 닭 배아 섬유아세포(CEF)에서는 재생적 복제를 할 수 있으나, 인간 각질세포 세포주 HaCat(문헌[Boukamp 등 (1988) J. Cell Biol. 106: 761-771]), 인간의 뼈 골육종 세포주 143B(ECACC 수탁 번호 91112502), 인간 배아 신장 세포주 293(ECACC 수탁 번호 85120602), 및 인간 자궁경부 선암종 세포주 HeLa(ATCC 수탁 번호 CCL-2)에서는 재생적 복제를 할 수 없는 것으로 문헌에 기재되어 왔다. 추가적으로, MVA-BN 또는 이의 파생물은 Hela 세포 및 HaCaT 세포주에서 MVA-575보다 적어도 2-배, 더욱 바람직하게는 3-배 더 적은 바이러스 증폭 비를 갖는다. MVA-BN 및 이의 파생물의 이러한 특성들에 대한 시험 및 검정법은, WO 02/42480 (미국 특허 출원 제2003/0206926호) 및 WO 03/048184 (미국 특허 출원 제2006/0159699호)에 기재되어 있다.

시험관내 인간 세포주에서 이전 단락에 기재된 용어 "재생적 복제를 할 수 없는(not capable of reproductive replication)" 또는 "재생적 복제의 능력이 없는(no capability of reproductive replication)"은, 예를 들어, WO 02/42480에 기재되어 있는데, 이는 또한 상기 언급된 바와 같은 원하는 특성들을 갖는 MVA를 어떻게 얻는지도 교시한다. 상기 용어는 WO 02/42480 또는 미국 특허 제6,761,893호에 기재된 검정법을 사용할 때, 감염 4일 후 시험관 내에서 1 미만의 바이러스 증폭 비를 갖는 바이러스에 적용된다.

용어 "재생적으로 복제하는데 실패함(failure to reproductively replicate)"은, 이전 단락에 기재된 바와 같이, 감염 4일 후 시험관 내의 인간 세포주에서, 1 미만의 바이러스 증폭 비를 갖는 바이러스를 지칭한다. WO 02/42480 또는 미국 특허 제6,761,893호에 기재된 검정법은, 바이러스 증폭 비의 결정에 적용가능하다.

이전 단락에 기재된 바와 같은 시험관 내 인간 세포주에서의 바이러스의 증폭 또는 복제는, 통상 감염된 세포로부터 생산된 바이러스(유출) 대 제1 장소에서 그 세포를 감염시키는데 원래 사용되었던 양(유입)의 비로서 표현되며, "증폭 비(amplification ratio)"로도 지칭된다. "1"의 증폭 비는, 감염된 세포로부터 생산된 바이러스의 양이 초기에 세포를 감염시키는데 사용된 양과 동일한 증폭 상태를 정의하는데, 이는 감염된 세포가 바이러스 감염 및 재생을 허용한다는 것을 의미한다. 반대로, 1 미만의 증폭 비, 즉, 유입 수준 대비 유출의 감소는, 재생적 복제가 결핍되어, 바이러스의 약독화가 일어난 것을 가리킨다.

본원에서 "어주번트화(adjuvantation)"는, 특정 암호화된 단백질 또는 재조합 MVA의 구성 요소가 다른 암호화된 단백질(들) 또는 재조합 MVA의 구성요소(들)에 의해 생성된 면역 반응을 증가시키도록 의도된다.

발현 카세트/조절 서열. 다양한 양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 핵산은 하나 이상의 핵산은, 발현 조절 서열에 작용가능하게 연결된 하나 이상의 발현 카세트에서 구현된다. "작용가능하게 연결된(Operably linked)"은, 기재된 구성 요소들이 이들이 의도된 방식으로 기능을 하도록 허용하는, 예를 들어, 프로모터가 발현될 핵산을 전사하게 하는 관계인 것을 의미한다. 암호화 서열에 작용가능하게 연결된 발현 조절 서열은, 암호화 서열의 발현이 발현 조절 서열과 양립 가능한 조건 하에서 달성되도록 연결된다. 발현 조절 서열은 적절한 프로모터, 인핸서, 전사 종결자, 단백질-암호화 오픈 리딩 프레임을 시작하는 개시 코돈, 인트론을 위한 스플라이싱 신호, 및 프레임에 맞는(in-frame) 정지 코돈을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 프로모터는, SV40 초기 프로모터, RSV 프로모터, 레트로바이러스 LTR, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 인간 CMV 극 초기 I 프로모터; 및 이하의 배시니아 바이러스 또는 MVA-유래 및 FPV-유래 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 폭스바이러스 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다: 30K 프로모터, I3 프로모터, PrS 프로모터, PrS5E 프로모터, Pr7.5K, PrHyb 프로모터, Pr13.5 긴 프로모터, 40K 프로모터, MVA-40K 프로모터, FPV 40K 프로모터, 30k 프로모터, PrSynIIm 프로모터, PrLE1 프로모터, 및 PR1238 프로모터. 추가적인 프로모터는 WO 2010/060632, WO 2010/102822, WO 2013/189611,WO 2014/063832, 및 WO 2017/021776에 추가로 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 전체가 본원에 인용되어 포함된다.

추가적인 발현 조절 서열은, 리더 서열, 종결 코돈, 폴리아데닐화 신호, 및 원하는 숙주 시스템에서 원하는 재조합 단백질 (예를 들어, HER2, 브라큐리, 및/또는 CD40L)을 암호화하는 핵산 서열의 적절한 전사 및 추후 번역에 필요한 임의의 다른 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 폭스바이러스 벡터는 또한 원하는 숙주 시스템 내에서 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터의 전달 및 추후 복제에 필요한 추가적인 요소들도 함유할 수 있다. 당업계의 숙련자는, 이러한 벡터가 종래의 방법을 사용하여 용이하게 제작되고(문헌[Ausubel 등, (1987) in "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley 및 Sons, New York, N.Y.]), 상업적으로 이용가능하다고 추가로 이해할 것이다.

상기 조합을 투여하기 위한 방법 및 투여 요법. 하나 이상의 양태에서, 본 발명의 조합은 상동성 및/또는 이종성 프라임-부스트 요법의 일부로서 투여될 수 있다. 도 7에 나타난 데이터에 의해 부분적으로 예시된, 상동성 프라임 부스트 요법은 대상체의 특이적인 CD8 및 CD4 T 세포 반응을 증가시킨다. 따라서, 하나 이상의 구현예에서, 종양 크기를 감소시키고/거나, 암 환자에서 생존을 증가시키는 조합 및/또는 방법이 있는데, 이는 암 환자에게 본 기재 내용의 조합을 투여하되, 상기 조합은 상동성 또는 이종성 프라임-부스트 요법의 일부로서 투여되는 단계를 포함한다.

전달유전자를 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 생성

본원에서 제공된 재조합 MVA 바이러스는, 당업계에 알려진 일상적인 방법에 의해 생성될 수 있다. 재조합 폭스바이러스를 얻거나, 외인성 암호화 서열들을 폭스바이러스 게놈에 삽입하기 위한 방법은, 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 표준 분자생물학 기술, 예컨대 DNA의 클로닝, DNA 및 RNA 분리, 웨스턴 블롯(western blot) 분석, RT-PCR 및 PCR 증폭 기술을 위한 방법은, 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2판, Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))]에 기재되어 있고, 바이러스의 취급 및 조작을 위한 기술은, 문헌[Virology Methods Manual (Mahy 등 (eds.), Academic Press (1996))]에 기재되어 있다. 유사하게, MVA의 취급, 조작 및 유전자 조작을 위한 기술 및 노-하우는, 문헌[Molecular Virology: A Practical Approach (Davison & Elliott (eds.)], The Practical Approach Series, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UK (1993])(예를 들어, "챕터 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors")) 참고] 및 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Son, Inc. (1998) (예를 들어, 챕터 16, 섹션 IV: "Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector")) 참고]에 기재되어 있다.

본원에 개시된 다양한 재조합 MVA 바이러스의 생성을 위하여, 상이한 방법들이 적용가능하다. 바이러스로 삽입될 DNA 서열은, 폭스바이러스의 DNA의 섹션과 상동성을 갖는 DNA가 삽입된 E. coli 플라스미드 제작물(construct) 내에 위치할 수 있다. 별도로, 삽입될 DNA 서열은 프로모터에 라이게이션될 수 있다. 프로모터-유전자 연결부는 플라스미드 제작물 내에 위치할 수 있어서, 프로모터-유전자 연결부는 비-필수적 좌위를 함유하는 폭스바이러스 DNA의 부위에 측접하는 DNA 서열과 상동성을 갖는 DNA와 양 말단이 측접한다. 생성된 플라스미드 제작물은 E. coli 박테리아 내에서 증식에 의해 증폭되고, 분리될 수 있다. 삽입될 DNA 유전자 서열을 함유하는 분리된 플라스미드는 예를 들어, 닭 배아 섬유아세포(CEF)의 세포 배양액에 형질감염될 수 있고, 동시에 상기 배양액은 MVA 바이러스에 의해 감염된다. 플라스미드 내의 상동 MVA 바이러스 DNA와 바이러스 게놈 사이의 재조합은, 각각 외부 DNA 서열의 존재에 의해 변형된 폭스바이러스를 생성할 수 있다.

바람직한 구현예에 의하면, 예를 들어, CEF 세포와 같은 적합한 세포 배양의 세포는, MVA 바이러스에 의해 감염될 수 있다. 감염된 세포는 이후 바람직하게는 폭스바이러스 발현 조절 요소의 전사 조절 하에서, 외부 또는 이종 유전자 또는 유전자들, 예컨대 본 기재 내용에서 제공된 핵산들 중 하나 이상을 포함하는 제1 플라스미드 벡터에 의해 형질감염될 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, 플라스미드 벡터는 또한 외인성 서열을 MVA 바이러스 게놈의 선택된 부위로 삽입되도록 이끌 수 있는 서열도 포함한다. 선택적으로, 플라스미드 벡터는 또한 폭스바이러스 프로모터에 작용가능하게 연결된 마커 및/또는 선별 유전자를 포함하는 카세트도 함유한다. 적합한 마커 또는 선별 유전자는, 예를 들어, 녹색 형광 단백질, β-갈락토시다제(galactosidase), 네오마이신(neomycin)-포스포리보실트랜스퍼라제(phosphoribosyltransferase) 또는 다른 마커를 암호화하는 유전자이다. 선별 또는 마커 카세트의 사용은 생성된 재조합 폭스바이러스의 식별과 분리를 단순화시킨다. 그러나, 재조합 폭스바이러스는 또한 PCR 기술에 의해 식별될 수도 있다. 이후, 추가적인 세포가 상기 기재된 바와 같이 얻은 재조합 폭스바이러스에 의해 감염되고, 제2 외부 또는 이종 유전자 또는 유전자들을 포함하는 제2 벡터에 의해 형질감염될 수 있다. 이 때, 이 유전자는 폭스바이러스 게놈의 상이한 삽입 영역에 삽입되어야 하고, 제2 벡터도 또한 제2 외부 유전자 또는 유전자들을 폭스바이러스의 게놈에 통합되게 하는 폭스바이러스-상동 서열이 다르다. 상동 재조합이 일어난 후, 둘 이상의 외부 또는 이종 유전자를 포함하는 재조합 바이러스가 분리될 수 있다. 추가적인 외부 유전자를 재조합 바이러스에 도입하기 위해, 감염 및 형질감염의 단계들은, 감염을 위해 이전 단계들에서 분리된 재조합 바이러스를 사용하고, 형질감염을 위해 추가적인 외부 유전자 또는 유전자들을 포함하는 벡터를 사용함으로써 반복될 수 있다.

대안적으로, 상기 기재된 감염 및 형질감염의 단계들은 상호 교환가능한데, 즉, 적합한 세포는 외부 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터에 의해 먼저 형질감염된 후, 폭스바이러스에 의해 감염된다. 추가적인 대안으로, 각각의 외부 유전자를 상이한 바이러스들에 도입하고, 모든 얻어진 재조합 바이러스들을 세포에 공동-감염시키고, 외부 유전자를 포함하는 재조합체에 대해 스크리닝하는 것도 또한 가능하다. 제3 대안은 DNA 게놈과 외부 서열들을 시험관내에서 라이게이션하고, 헬퍼 바이러스를 사용하여 재조합된 배시니아 바이러스 DNA 게놈을 재구성하는 것이다. 제4 대안은 E.coli 또는 다른 박테리아 종에서의, 박테리아 인공 염색체(BAC)로서 클로닝된 MVA 바이러스 게놈과, MVA 바이러스 게놈 내의 원하는 통합 부위에 측접한 서열과 상동성을 갖는 DNA 서열에 측접한 선형의 외부 서열 간의 상동 재조합이다.

본 기재 내용의 하나 이상의 핵산은, MVA 바이러스 또는 MVA 바이러스 벡터의 임의의 적합한 부분에 삽입될 수 있다. MVA 바이러스의 적합한 부분은, MVA 게놈의 비-필수 부분이다. MVA 게놈의 비-필수 부분은 유전자간 영역, 또는 MVA 게놈의 공지된 결실 영역 1-6일 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 재조합 MVA의 비-필수 부분은 바이러스 성장에 필수적이지 않은 MVA 게놈의 암호화 부위일 수 있다. 그러나, 상기 삽입 영역은 MVA 게놈 내의 이러한 바람직한 삽입 영역에 제한되지 않는데, 그 이유는 본 발명의 핵산(예를 들어, HER2, 브라큐리, HERV-K-env, HERV-K-gag, PRAME, FOLR1, 및 CD40L 및/또는 4-1BBL) 및 본원에 기재된 바 있는 임의의 수반되는 프로모터는, 적어도 하나의 세포 배양 시스템, 예컨대 닭 배아 섬유아세포(CEF 세포) 내에서 증폭 및 전파될 수 있는 제조합을 얻는 것이 가능한 이상, 바이러스 게놈의 어느 곳에도 삽입될 수 있다는 사실은 본 발명의 범주 내에 있기 때문이다.

바람직하게는, 본 발명의 핵산은 MVA 바이러스의 하나 이상의 유전자간 영역(IGR)으로 삽입될 수 있다. 용어 "유전자간 영역(intergenic region)"은, 바람직하게는 MVA 바이러스 게놈 내의 2개의 인접한 오픈 리딩 프레임(ORF)들 사이에, 바람직하게는 MVA 바이러스 게놈 내의 2개의 필수 ORF들 사이에 위치한 바이러스 게놈의 일부를 지칭한다. MVA에 대하여, 특정 구현예에서는, IGR이 IGR 07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137, 및 IGR 148/149로부터 선택된다.

MVA 바이러스에 대해서는, 뉴클레오티드 서열은 추가적으로 또는 대안적으로 MVA 게놈의 하나 이상의 공지된 결실 부위, 즉, 결실 부위 I, II, III, IV, V, 또는 VI로 삽입된다. 용어 "공지의 결실 부위(known deletion site)"는, 예를 들어, 문헌[Meisinger-Henschel 등 ((2007) J. Gen. Virol. 88: 3249-3259)]에 기재된 바와 같이, 상기 MVA가 유래된 모 바이러스, 특히 모 융모요막(chorioallantois) 배시니아 바이러스 안카라(CVA)의 게놈에 대해, 516차 계대에서 특성화된 CEF 세포의 연속 계대를 통해 결실된 MVA 게놈의 일부를 지칭한다.

백신

특정 구현예에서, 본 기재 내용의 재조합 MVA는 백신의 일부로서 제제화될 수 있다. 백신의 제조를 위해, MVA 바이러스는 생리학적으로 허용가능한 형태로 변환될 수 있다.

예시적인 제법은 이하와 같다. 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4 중에 제제화된 정제된 바이러스는, 5×10⁸ TCID50/ml의 역가를 갖고, -80℃에서 저장된다. 백신 주사(shot)의 제조를 위해, 예를 들어, 1×10⁸~1×10⁹개의 바이러스 입자가 앰플, 바람직하게는 유리 앰플 내에서 2% 펩톤 및 1% 인간 알부민의 존재 하에, 인산염-완충 식염수(PBS) 중에서 동결건조될 수 있다. 대안적으로, 백신 주사는 제제 중의 바이러스의 동결 건조에 의해 단계별로 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 제제는 추가적인 첨가제, 예컨대 만니톨, 덱스트란, 당, 글리신, 락토스, 폴리비닐피롤리돈, 또는 항산화제 또는 불활성 기체, 생체 내 투여에 적합한 안정화제 또는 재조합 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민)을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 첨가제를 함유한다. 이후, 상기 앰플은 밀봉되어, 적합한 온도, 예를 들어, 4℃ 내지 실온에서 수 개월 동안 저장될 수 있다. 그러나, 필요하다면, 상기 앰플은 바람직하게는 -20℃ 미만의 온도, 가장 바람직하게는 약 -80℃에서 저장된다.

백신화 또는 치료에 관계되는 다양한 구현예에서, 상기 동결건조물은 0.1 내지 0.5 ml의 수용액, 바람직하게는 생리학적 식염수 또는 Tris 완충액, 예컨대 10mM Tris, 140mM NaCl pH 7.7에 용해된다. 본 기재 내용의 재조합 MVA, 백신 또는 약학적 조성물은 10⁴ 내지 10¹⁰의 TCID50/ml, 10⁵ 내지 5×10⁹의 TCID50/ml, 10⁶ 내지 5×10⁹의 TCID50/ml, 또는 10⁷ 내지 5×10⁹의 TCID50/ml의 농도 범위로 용액 중에 제제화될 수 있다고 고려된다. 인간에 대한 바람직한 용량은, 10⁶의 TCID50, 10⁷의 TCID50, 10⁸의 TCID50, 5×10⁸의 TCID50, 10⁹의 TCID50, 5×10⁹의 TCID50, 또는 10¹⁰의 TCID50의 용량을 포함하는 10⁶ 내지 10¹⁰의 TCID50를 포함한다. 투여의 용량 및 횟수의 최적화는 당업계의 숙련자의 기술과 지식의 범위 내에 있다.

본원에 제시된 하나 이상의 바람직한 구현예에서, 재조합 MVA는 암 환자에게 정맥내 투여된다. 다른 구현예에서, 재조합 MVA는 암 환자에게 종양내 투여된다. 다른 구현예에서, 재조합 MVA는 암 환자에게 동시에 또는 상이한 시간에 정맥내 및 종양내로 둘 다 투여된다.

추가적인 구현예에서, 면역관문 길항제 또는 작용제, 또는 바람직하게는 항체는 전신으로 또는 국소로, 즉, 복강내, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 비강내, 피내, 또는 숙련된 전문가(practitioner)에게 알려진 임의의 다른 투여 경로로 투여될 수 있다.

키트 , 조성물, 및 사용 방법. 다양한 구현예에서, 본 발명은 a) 본원에 기재된 핵산을 포함하는 재조합 MVA, 및/또는 b) 본원에 기재된 하나 이상의 항체를 포함하는 키트, 약학적 조합, 약학적 조성물, 및/또는 면역원성 조합을 포괄한다.

상기 키트 및/또는 조성물은 상기 재조합 MVA의 투여 및 항체의 투여를 위한 설명서와 함께, 하나 또는 다수의 용기 또는 바이알의 본 기재 내용의 재조합 폭스바이러스, 하나 이상의 용기 또는 바이알의 본 기재 내용의 항체를 포함할 수 있다고 고려된다. 더욱 특별한 구현예에서, 상기 키트는 제1 프라이밍 투여 시의 재조합 MVA와 항체의 투여, 및 이후 재조합 MVA와 항체의 하나 이상의 추후 부스팅 투여의 투여를 위한 설명서를 포함할 수 있다고 고려된다.

본원에 기재된 키트 및/또는 조성물은, 일반적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 및/또는 승인된 담체, 첨가제, 항생제, 방부제, 희석제 및/또는 안정화제를 포함할 수 있다. 이러한 보조 물질은 물, 식염수, 글리세롤, 에탄올, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등일 수 있다. 적합한 담체는 전형적으로 크고 서서히 대사되는 분자, 예컨대 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체 등이다.

특정 예시적인 구현예

구현예 1은 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법인데, 상기 방법은 대상체에게 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 종양내 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 재조합 MVA의 종양내 투여는 TAA 항원과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-종양내 주사에 비해, 암 종양에서 염증 반응을 강화하고, 종양 감소를 증가시키고/거나, 대상체의 전체 생존을 증가시킨다.

구현예 2는 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법인데, 상기 방법은 대상체에게 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 정맥내 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 재조합 MVA의 정맥내 투여는 TAA 항원과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-종양내 주사에 비해, 자연 살해(NK) 세포 반응을 강화시키고, TAA에 특이적인 CD8 T 세포 반응을 강화시킨다.

구현예 3은 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법인데, 상기 방법은 대상체에게 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 재조합 MVA의 투여는 재조합 MVA와 4-1BBL 항원 그 자체의 투여에 비해, 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 전체 생존을 증가시킨다.

구현예 4는 대상체의 암 종양에서 강화된 염증 반응을 유도하는 방법인데, 상기 방법은 대상체에게 제1 이종 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 종양내 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 재조합 MVA의 종양내 투여는 이종 종양-관련 항원과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-종양내 주사에 의해 생성된 염증 반응에 비해, 종양내에서 강화된 염증 반응을 생성한다. 이러한 강화된 염증 반응은 본원의 다른 곳에서 논의되며, 예를 들어, NK 세포와 T 세포의 도입을 포함할 수 있다.

구현예 5는 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법인데, 상기 방법은 내재성 레트로바이러스 항원(ERV)을 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 재조합 MVA의 투여는 재조합 MVA와 4-1BBL 항원 그 자체의 투여에 비해, 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 전체 생존을 증가시킨다.

구현예 6은 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 의한 방법인데, 여기에서 대상체는 인간이다.

구현예 7은 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 의한 방법인데, 여기에서 TAA는 내재성 레트로바이러스(ERV) 단백질이다.

구현예 8은 구현예 7에 의한 방법인데, 여기에서 ERV는 종양 세포에서 발현되는 ERV 단백질이다.

구현예 9는 구현예 7 및 8 중 어느 하나에 의한 방법인데, 여기에서 ERV는 인간의 내재성 레트로바이러스 단백질 K(HERV-K) 패밀리 유래이다.

구현예 10은 구현예 9에 의한 방법인데, 여기에서 HERV-K 단백질은 HERV-K 외피 단백질, HERV-K gag 단백질, 및 HERV-K mel 단백질로부터 선택된다.

구현예 11은 구현예 9에 의한 방법인데, 여기에서 HERV-K 단백질은 HERV-K 외피 단백질, HERV-K gag 단백질, HERV-K mel 단백질, 및 이의 면역원성 절편으로부터 선택된다.

구현예 12는 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 의한 방법인데, 여기에서 TAA는 암배아 항원(CEA), 세포 표면 연결된 뮤신 1(MUC-1), 전립선산 포스파타제(PAP), 전립선 특이적인 항원(PSA), 인간 상피 성장인자 수용체 2(HER-2), 서바이빈, 티로신 관련 단백질 1(TRP1), 티로신 관련 단백질 1(TRP2), 브라큐리, FOLR1, PRAME, p15, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

구현예 13은 구현예 1 내지 6, 및 12 중 어느 하나에 의한 방법인데, 여기에서 TAA는 암배아 항원(CEA) 및 세포 표면 연결된 뮤신 1(MUC-1)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

구현예 14는 구현예 1 내지 6, 및 12 중 어느 하나에 의한 방법인데, 여기에서 TAA는 PAP 또는 PSA로 이루어진 군으로부터 선택된다.

구현예 15는 구현예 1 내지 6, 및 12, 14 중 어느 하나에 의한 방법인데, 여기에서 TAA는 PSA이다.

구현예 16은 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 의한 방법인데, 여기에서 TAA는: 5-α-환원효소(reductase), α-태아단백질(fetoprotein)(AFP), AM-1, APC, 에이프릴(April), B 흑색종 항원 유전자(BAGE), β-카테닌, Bcl12, bcr-abl, 브라큐리, CA-125, 카스파제(caspase)-8(CASP-8, 또한 FLICE로도 알려짐), 카텝신(Cathepsin), CD19, CD20, CD21/보체 수용체 2(CR2), CD22/BL-CAM, CD23/FcεRII, CD33, CD35/보체 수용체 1(complement receptor)(CR1), CD44/PGP-1, CD45/백혈구 공통 항원("LCA"), CD46/막 보조인자(cofactor) 단백질(MCP), CD52/CAMPATH-1, CD55/부식(decay) 가속 인자(DAF), CD59/프로텍틴(protectin), CDC27, CDK4, 암배아성 항원(CEA), c-myc, 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase)-2(cox-2), 결장직장암 유전자에서의 결실("DCC"), DcR3, E6/E7, CGFR, EMBP, Dna78, 파르네실 트랜스퍼라제(farnesyl transferase), 섬유아세포 성장인자-8a(FGF8a), 섬유아세포 성장인자-8b(FGF8b), FLK-1/KDR, 엽산 수용체, G250, G 흑색종 항원 유전자 패밀리(GAGE-패밀리), 가스트린 17, 가스트린-방출 호르몬, 강글리오시드(ganglioside) 2(GD2)/강글리오시드 3(GD3)/강글리오시드-모노시알산-2("GM2"), 고나도트로핀(gonadotropin) 방출 호르몬 (GnRH), UDP-GlcNAc:R1Man(α1-6)R2 [GlcNAc에서 Man로(α1-6)] β1,6-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제(acetylglucosaminyltransferase) V(GnT V), GP1, gp100/Pme117, gp-100-in4, gp15, gp75/티로신-관련 단백질-1(gp75/TRP-1), 인간 융모막 고나도트로핀(hCG), 헤파라나제(heparanase), HER2, 인간 유선 종양 바이러스(HMTV), 70 킬로달톤 열-충격 단백질("HSP70"), 인간의 텔로머라제 역전사효소(telomerase reverse transcriptase)(hTERT), 인슐린-유사 성장인자 수용체-1(IGFR-1), 인터류킨-13 수용체 (IL-13R), 유도성 일산화질소 합성효소(synthase)(iNOS), Ki67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA, LKLR-FUT, 흑색종 항원-암호화 유전자 1(MAGE-1), 흑색종 항원-암호화 유전자 2(MAGE-2), 흑색종 항원-암호화 유전자 3(MAGE-3), 흑색종 항원-암호화 유전자 4(MAGE-4), 맘마글로빈(mammaglobin), MAP17, T-세포-1에 의해 인식된 멜란(Melan)-A/흑색종 항원(MART-1), 메소텔린(mesothelin), MIC A/B, MT-MMP, 뮤신, 고환-특이적인 항원 NY-ESO-1, 오스테오넥틴(osteonectin), p15, P170/MDR1, p53, p97/멜라노트랜스페린(melanotransferrin), PAI-1, 태반-유래 성장인자(PDGF), μPA, PRAME, 프로바신(probasin), 프로게니포이에틴(progenipoietin), 전립선-특이적인 항원(PSA), 전립선-특이적인 막 항원(PSMA), RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, SSX-패밀리, STAT3, STn, TAG-72, 형질전환 성장인자-알파(TGF-α), 형질전환 성장인자-베타(TGF-β), 티모신(Thymosin)-베타-15, 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), TP1, TRP-2, 티로시나제(tyrosinase), 맥관 내피 성장인자 (VEGF), ZAG, p16INK4, 및 글루타티온(glutathione)-S-트랜스퍼라제(GST)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 암배아 항원(CEA), 세포 표면 연결된 뮤신 1(MUC-1), 전립선산 포스파타제(PAP), 전립선 특이적인 항원(PSA), 인간 상피 성장인자 수용체 2(HER-2), 서바이빈, 티로신 관련 단백질 1(TRP1), 티로신 관련 단백질 1(TRP2), 브라큐리, 및 이들의 조합으로 이루어진 군.

구현예 17은 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 의한 방법인데, 여기에서 재조합 MVA는 CD40L 항원을 암호화하는 제3 핵산을 추가로 포함한다.

구현예 18은 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 의한 방법인데, 대상체에게 적어도 하나의 면역 관문 분자 길항제 또는 작용제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

구현예 19는 구현예 18에 의한 방법인데, 여기에서 면역 관문 분자 길항제 또는 작용제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 및 ICOS로부터 선택된다.

구현예 20은 구현예 18 및 19 중 어느 하나에 의한 방법인데, 여기에서 면역 관문 분자 길항제는 PD-1 및/또는 PD-L1이다.

구현예 21은 구현예 20에 의한 방법인데, 여기에서 면역 관문 분자 길항제는 추가로 LAG-3를 포함한다.

구현예 22는 구현예 18 내지 21 중 어느 하나에 의한 방법인데, 여기에서 면역 관문 분자 길항제는 항체를 포함한다.

구현예 23은 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 의한 방법인데, 대상체에게 제2 TAA에 특이적인 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

구현예 24는 구현예 23에 의한 방법인데, 여기에서 제2 TAA에 특이적인 항체는 종양의 세포막에 발현되는 항원에 특이적이다.

구현예 25는 구현예 23에 의한 방법인데, 여기에서 제2 TAA에 특이적인 항체는 a) 종양의 세포막에 발현되는 항원에 특이적이며, b) Fc 도메인을 포함한다.

구현예 26은 구현예 1 내지 25 중 어느 하나에 의한 방법에 사용하기 위한 약학적 조성물이다.

구현예 27은 구현예 1 내지 25 중 어느 하나에 의한 방법에 사용하기 위한 백신이다.

구현예 28은 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)로서, 상기 재조합 MVA는 a) 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산 및 b) 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함한다.

구현예 29는 구현예 28에 의한 재조합 MVA인데, 여기에서 TAA는 내재성 레트로바이러스(ERV) 단백질이다.

구현예 30은 구현예 29에 의한 재조합 MVA인데, 여기에서 ERV 단백질은 인간의 내재성 레트로바이러스 단백질 K (HERV-K) 패밀리 유래이다.

구현예 31은 구현예 30에 의한 재조합 MVA인데, 여기에서 레트로바이러스 단백질 K는 HERV-K 외피 단백질, HERV-K gag 단백질, 및 HERV-K mel 단백질로부터 선택된다.

구현예 32는 CD40L을 암호화하는 제3 핵산을 추가로 포함하는, 구현예 28 내지 31 중 어느 하나에 의한 재조합 MVA이다.

구현예 33은 a) 구현예 28 내지 32 중 어느 하나의 재조합 MVA, 및 b) 적어도 하나의 면역 관문 분자 길항제 또는 작용제 중 적어도 하나를 포함하는 약학적 조합이다.

구현예 34는 구현예 33에 의한 약학적 조합인데, 여기에서 면역 관문 분자 길항제 또는 작용제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 및 ICOS로부터 선택된다.

구현예 35는 구현예 34에 의한 약학적 조합인데, 여기에서 면역 관문 분자 길항제는 PD-1 및/또는 PD-L1이다.

구현예 36은 구현예 35에 의한 약학적 조합인데, 여기에서 면역 관문 분자 길항제는 추가로 LAG-3를 포함한다.

구현예 37은 구현예 33 내지 36 중 어느 하나에 의한 약학적 조합인데, 여기에서 면역 관문 분자 길항제는 항체를 포함한다.

구현예 38은 a) 구현예 28 내지 32 중 어느 하나의 재조합 MVA, 및 b) 제2 TAA에 특이적인 항체를 포함하는 약학적 조합이다.

구현예 39는 구현예 38에 의한 약학적 조합인데, 여기에서 제2 TAA에 특이적인 항체는 종양의 세포막에 발현되는 항원에 특이적이다.

구현예 40은 구현예 39에 의한 약학적 조합인데, 여기에서 제2 TAA에 특이적인 항체는 a) 종양의 세포막에 발현되는 항원에 특이적이고, b) Fc 도메인을 포함한다.

구현예 41은 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/거나 생존을 증가시키는데 사용하기 위한, 구현예 28 내지 32 중 어느 하나에 의한 재조합 MVA, 구현예 27에 의한 백신, 구현예 26에 의한 약학적 조성물, 구현예 33 내지 40 중 어느 하나에 의한 약학적 조합이다.

구현예 42는 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/거나 생존을 증가시키는 방법에 사용하기 위한, 구현예 28 내지 32 중 어느 하나에 의한 재조합 MVA, 구현예 27에 의한 백신, 구현예 26에 의한 약학적 조성물, 구현예 33 내지 40 중 어느 하나에 의한 약학적 조합으로서, 상기 방법은 대상체에게 구현예 28 내지 32의 재조합 MVA, 구현예 27에 의한 백신, 구현예 26에 의한 약학적 조성물, 또는 구현예 33 내지 40 중 어느 하나에 의한 약학적 조합을 종양내 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 종양내 투여는 TAA 항원과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-종양내 주사에 비해, 암 종양에서 염증 반응을 강화하고, 종양 감소를 증가시키고/거나, 대상체의 전체 생존을 증가시킨다.

구현예 43은 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/거나 생존을 증가시키는 방법에 사용하기 위한, 구현예 28 내지 32 중 어느 하나에 의한 재조합 MVA, 구현예 27에 의한 백신, 구현예 26에 의한 약학적 조성물, 구현예 33 내지 40 중 어느 하나에 의한 약학적 조합으로서, 상기 방법은 대상체에게 구현예 28 내지 32의 재조합 MVA, 구현예 27에 의한 백신, 구현예 26에 의한 약학적 조성물, 또는 구현예 33 내지 40 중 어느 하나에 의한 약학적 조합을 정맥내 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 정맥내 투여는 TAA 항원과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-정맥내 투여에 비해, 종양 감소를 증가시키고/거나, 대상체의 전체 생존을 증가시킨다.

구현예 44는 암 대상체의 암 종양에서 강화된 염증 반응을 유도하는 방법에 사용하기 위한, 구현예 28 내지 32 중 어느 하나에 의한 재조합 MVA, 구현예 27에 의한 백신, 구현예 26에 의한 약학적 조성물, 구현예 33 내지 40 중 어느 하나에 의한 약학적 조합으로서, 상기 방법은 대상체에게 구현예 28 내지 32의 재조합 MVA, 구현예 27에 의한 백신, 구현예 26에 의한 약학적 조성물, 또는 구현예 33 내지 40 중 어느 하나에 의한 약학적 조합을 종양내 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 종양내 투여는 TAA 항원과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-종양내 주사에 비해, 대상체의 암 종양에서 염증 반응을 강화한다.

구현예 45는 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한, 구현예 28 내지 32 중 어느 하나에 의한 재조합 MVA, 구현예 27에 의한 백신, 구현예 26에 의한 약학적 조성물, 구현예 33 내지 40 중 어느 하나에 의한 약학적 조합이다.

구현예 46은 암을 치료하기 위한 방법에서 사용하기 위한, 구현예 28 내지 32 중 어느 하나에 의한 재조합 MVA, 구현예 27에 의한 백신, 구현예 26에 의한 약학적 조성물, 구현예 33 내지 40 중 어느 하나에 의한 약학적 조합인데, 여기에서 암은: 유방암, 폐암, 두경부암, 갑상선암, 흑색종, 위암, 방광암, 신장암, 간암, 흑색종, 췌장암, 전립선암, 난소암, 요로상피세포암, 자궁경부암, 또는 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

구현예 47은 구현예 44에 의한 재조합 MVA인데, 여기에서 강화된 염증 반응은 종양에 국재화된다.

구현예 48은 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법인데, 상기 방법은 대상체에게 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 CD40L을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 종양내 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 재조합 MVA의 종양내 투여는 TAA와 CD40L을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-종양내 주사에 비해, 암 종양에서 염증 반응을 강화하고, 종양 감소를 증가시키고/거나, 대상체의 전체 생존을 증가시킨다.

구현예 49는 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법인데, 상기 방법은 대상체에게 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 CD40L을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 정맥내 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 재조합 MVA의 정맥내 투여는 TAA와 CD40L 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-종양내 주사에 비해, 자연 살해(NK) 세포 반응을 강화시키고, TAA에 특이적인 CD8 T 세포 반응을 강화시킨다.

구현예 50은 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법인데, 상기 방법은 대상체에게 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 CD40L을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 투여하는 단계를 포함하되, 여기에서 상기 재조합 MVA의 투여는 재조합 MVA 및 CD40L 항원 그 자체의 투여에 비해, 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 전체 생존을 증가시킨다.

구현예 51은 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/거나 생존을 증가시키기 위한 방법에 사용하기 위한, 구현예 28 내지 32 중 어느 하나에 의한 재조합 MVA, 구현예 27에 의한 백신, 구현예 26에 의한 약학적 조성물, 구현예 33 내지 40 중 어느 하나에 의한 약학적 조합으로서, 상기 방법은 대상체에게 구현예 28 내지 32의 재조합 MVA, 구현예 27에 의한 백신, 구현예 26에 의한 약학적 조성물, 또는 구현예 33 내지 40 중 어느 하나에 의한 약학적 조합을 정맥내 및/또는 종양내 투여하는 단계를 포함하되, 상기 정맥내 및/또는 종양내 투여는: 1) TAA를 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스; 2) TAA를 암호화하는 제1 핵산과 CD40L 항원을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스; 또는 3) TAA를 암호화하는 제1 핵산, 4-1BBL 항원을 암호화하는 제2 핵산, 및 CD40L 항원을 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택된 임의의 MVA의 비-정맥내 또는 비-종양내 투여에 비해, 종양 감소를 증가시키고/거나, 대상체의 전체 생존을 증가시킨다.

구현예 52는 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/거나 생존을 증가시키기 위한 방법에 사용하기 위한, 구현예 28 내지 32 중 어느 하나에 의한 재조합 MVA, 구현예 27에 의한 백신, 구현예 26에 의한 약학적 조성물, 구현예 33 내지 40 중 어느 하나에 의한 약학적 조합으로서, 상기 방법은 대상체에게 구현예 28 내지 32의 재조합 MVA, 구현예 27에 의한 백신, 구현예 26에 의한 약학적 조성물, 또는 구현예 33 내지 40 중 어느 하나에 의한 약학적 조합을 정맥내 및 종양내 투여하는 단계를 포함하는데, 여기에서 상기 정맥내 및 종양내 투여는: 1) TAA를 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스; 2) TAA를 암호화하는 제1 핵산과 CD40L 항원을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스; 또는 3) TAA를 암호화하는 제1 핵산, 4-1BBL 항원을 암호화하는 제2 핵산, 및 CD40L 항원을 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택된 임의의 MVA의 비-정맥내 또는 비-종양내 투여에 비해, 종양 감소를 증가시키고/거나, 대상체의 전체 생존을 증가시킨다. 상기 정맥내 및 종양내 투여는 당업계의 숙련자에게 명백한 바와 같이, 동시에 또는 상이한 시점에 실시될 수 있다.

실시예

이하의 실시예는 본 발명을 예시하나, 청구항의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석해서는 안된다.

실시예 1: 재조합 MVA - TAA -4- 1BBL 및 MVA - TAA - CD40L의 제작

본 기재 내용의 요소들을 구현하는 재조합 MVA 바이러스의 생성은, 지정된 전달유전자를 이들의 프로모터와 함께 벡터 MVA-BN에 삽입함으로써 실시되었다. 전달유전자는 전달유전자 및 선별 카세트, 뿐만 아니라 MVA-BN 내의 표적화된 좌위와 상동성을 갖는 서열을 함유하는 재조합 플라스미드를 사용하여 삽입되었다. 바이러스 게놈과 재조합 플라스미드 간의 상동 재조합은, MVA-BN 감염된 CEF 세포에 재조합 플라스미드를 형질감염시킴으로써 달성되었다. 이후, 선별 카세트는 CRE-재조합효소(recombinase)를 발현하는 플라스미드의 도움으로 제2 단계 동안 결실되며, 상기 재조합효소는 선별 카세트에 측접하는 loxP 부위를 특이적으로 표적화하고, 따라서 그 사이의 서열을 절단한다.

MVA-OVA 및 MVA-OVA-4-1BBL의 제작을 위해, 상기 재조합 플라스미드는 전달유전자 OVA, 또는 OVA와 4-1BBL을 포함하는데, 이들의 앞에는 각각 프로모터 서열, 뿐만 아니라 MVA-BN 내의 표적화된 삽입 영역과 동일한 서열이 선행하여, 바이러스 게놈에 상동 재조합이 가능해진다.

MVA-OVA-CD40L의 제작을 위해, 상기 재조합 플라스미드는 전달유전자 OVA 및 CD40L을 포함하는데, 이들의 앞에는 각각 프로모터 서열, 뿐만 아니라 MVA-BN 내의 표적화된 삽입 영역과 동일한 서열이 선행하여, 바이러스 게놈 내에서 상동 재조합이 가능해진다.

MVA-gp70-4-1BBL의 제작을 위하여, 재조합 플라스미드는 2개의 전달유전자 gp70 및 4-1BBL을 포함하며, 이들 각각의 앞에는 프로모터 서열, 뿐만 아니라 MVA-BN 내의 표적화된 삽입 영역과 동일한 서열이 선행하여, 바이러스 게놈 내에서 상동 재조합이 가능해진다. 유사하게, MVA-gp70-CD40L의 제작을 위해, 재조합 플라스미드는 2개의 전달유전자 gp70 및 CD40L을 포함하는데, 이들 각각의 앞에는 프로모터 서열이 선행하여, MVA-gp70-4-1-BBL-CD40L의 제작을 원할 때 재조합 플라스미드에 적절한 변화가 이루어진다.

MVA-HERV-K, MVA-HERV-K-4-1BBL, 및 MVA-HERV-K-4-1BBL-CD40L의 제작을 위하여, 재조합 플라스미드는 HERV-K, HERV-K와 4-1BBL, 및 HERV-K, 4-1BBL 및 CD40L 전달유전자를 각각 포함한다. 각각의 전달유전자 또는 전달유전자들의 세트의 앞에는 프로모터 서열, 뿐만 아니라 MVA-BN 내의 표적화된 삽입 영역과 동일한 서열이 선행하여, 바이러스 게놈 내에서 상동 재조합이 가능해진다.

상기 기재된 mBN MVA의 생성을 위하여, CEF 세포 배양액에 각각 MVA-BN을 접종하고, 상응하는 재조합 플라스미드를 각각 형질감염시켰다. 다음으로, 이러한 세포 배양액으로부터의 샘플을, 선택 압력을 유도하는 약물을 함유하는 배지 중의 CEF 배양액에 접종하고, 형광-발현 바이러스 클론을 플라크 정제에 의해 분리하였다. 이러한 바이러스 클론으로부터의 형광-단백질-함유 선별 카세트의 상실은, 각 제작물 내의 선별 카세트에 측접하는 2개의 loxP 부위에 관여하는 CRE-매개된 재조합에 의해 제2 단계에서 매개되었다. 제2 재조합 단계 이후에는, 단지 MVA-BN의 표적화된 좌위 내에 삽입된 전달유전자 서열(예를 들어, OVA, 4-1BBL, gp70, HERV-K, 및/또는 CD40L) 및 이들의 프로모터만이 유지되었다. 선별 카세트가 결여된 플라크-정제된 바이러스의 스톡(stock)을 제조하였다.

전달유전자의 식별 방법은, 기재된 제작물이 접종된 세포에서 입증된다.

본원에 기재된 제작물의 생성은, 박테리아 인공 염색체(BAC) 내의 클로닝된 버전의 MVA-BN을 사용함으로써 수행되었다. 재조합 플라스미드는 프로모터의 각각의 하류에 기재된 전달유전자 서열을 함유하였다. 상기 플라스미드는 또한 MVA 내에도 존재하여, 통합 영역의 특이적인 표적화를 가능하게 하는 서열을 포함한다. 간략히, 감염성 바이러스는 BAC DNA를 BHK-21 세포에 형질감염시키고, 이들을 헬퍼 바이러스로서의 쇼프 섬유종(Shope fibroma) 바이러스에 의해 재감염시킴으로써, BAC로부터 재구성되었다. CEF 세포 배양 시 3회의 추가적인 계대 이후, 제작물의 헬퍼-바이러스-불포함 버전을 얻었다. 예시적인 MVA 생성은 또한 문헌[Baur 등 ((2010) Virol. 84: 8743-52, "Immediate-early expression of a recombinant antigen by modified vaccinia virus Ankara breaks the immunodominance of strong vector-specific B8R antigen in acute and memory CD8 T-cell responses"])에서도 찾아볼 수 있다.

실시예 2: MVA -OVA-4- 1BBL 감염된 종양 세포에 의한 CD8 T 세포의 4- 1BBL -매개 상호 자극은, DC의 필요 없이 사이토카인 생산에 영향을 미친다.

수지상 세포(DC)는, C57BL/6 마우스 유래의 골수 세포를 재조합 Flt3L의 존재 하에서 14일 동안 배양한 후 생성되었다. B16.F10(흑색종 모델) 세포를 MVA-OVA, MVA-OVA-CD40L, 또는 MVA-OVA-4-1BBL에 의해 10의 MOI로 감염시키고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 다음날, 감염된 종양 세포를 수집하고, 지시된 경우 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서, DC의 존재 하에서 1:1의 비로 공동 배양하였다. 미경험 OVA(257-264) 특이적인 CD8+ T 세포를 OT-I 마우스로부터 자기에 의해 정제하고, 1:5의 비로 공동 배양액에 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하였다. 이후, 배양 상청액을 Luminex에 의한 사이토카인 농도 분석을 위해 모았다. 결과는 도 1에서: IL-6(도 1a); GM-CSF(도 1b); IL-2(도 1c); 및 IFN-γ(도 1d)의 상청액 농도로 나타나 있다. 데이터는 평균±SEM로 제시되어 있다.

이전에 보고된 것들과 관련하여, MVA-OVA-CD40L은 DC의 활성화 및 이들의 항원 제시 능력에 크게 영향을 미쳤다. 따라서, MVA-OVA-CD40L-감염된 FLDC는 다량의 IL-6을 생산하였다(도 1a). 중요하게는, OVA-특이적인 T 세포 반응은 오직 DC의 존재 하에서만 유도될 수 있으나, 그러나 MVA-CD40L 감염된 B16.F10 세포 그 자체에 의해서는 직접 유도될 수 없었다(도 1b 및 도 1c). 이러한 결과는 MVA-OVA-CD40L의 이점을 밝히기 위한 DC의 명백한 요건을 나타낸다. 반대로, MVA-OVA-4-1BBL은 DC에서 IL-6 생산을 유도하지 않았으나, MVA-OVA-4-1BBL-감염된 B16.F10 세포는 T 세포 활성화 사이토카인 IFN-γ, IL-2 및 GM-CSF의 분비를 DC-독립적인 방식으로 유발하였다(도 1a-도 1d).

실시예 3: MVA -OVA-4- 1BBL 감염된 종양 세포는, 직접(즉, DC의 필요 없이) 항원-특이적인 CD8 T 세포를 활성화된 효과기 T 세포로 분화시킨다.

수지상 세포(DC)는, C57BL/6 마우스 유래의 골수 세포를 재조합 Flt3L의 존재 하에서 14일 동안 배양한 후 생성되었다. B16.F10(흑색종 모델) 세포에 MVA-OVA, MVA-OVA-CD40L, 또는 MVA-OVA-4-1BBL을 10의 MOI로 감염시키고, 37℃에서 5% CO2 하에 밤새 배양하였다. 다음날, 감염된 종양 세포를 수집하고, 지시된 경우 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서 DC의 존재 하에서 1:1의 비로 공동 배양하였다. 그 동안, 미경험 OVA(257-264) 특이적인 CD8+ T 세포를 OT-I 마우스로부터 자기에 의해 정제하고, 이를 1:5의 비로 공동 배양액에 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 염색하고, 유세포 측정에 의해 분석하였다. 결과는 도 2에 OT-I CD8+ T 세포 상의 T-bet의 GMFI(도 2a) 및 OT-I CD8+ T 세포의 CD44+그랜자임 B+ IFN-γ+ TNFα+의 백분율(도 2b)로서 나타나 있다. 데이터는 평균±SEM으로 나타나 있다.

결과는 교차-제시 DC의 부재 하에, 그랜자임 B+ 및 IFNγ+ 세포독성 효과기 T 세포의 유도가 4-1BBL에 의존적이라는 것을 나타낸다(도 2b). 도 1에 제시된 결과와 종합하면, 이러한 발견은 DC의 활성화를 통해 가동되는 MVA-암호화 CD40L과는 반대로, MVA에 의해 암호화된 4-1BBL은 T 세포에 DC-독립적인 방식으로 직접 작용한다는 것을 뒷받침한다.

실시예 4: CD40L 또는 4- 1BBL을 암호화하는 MVA에 의한 감염은, 종양 세포주 및 대식세포에서 종양 세포 사멸을 유도한다.

종양 세포주 B16.OVA(도 3a 및 3b), MC38(도 3c) 및 B16.F10(도 3d)은, 지정된 MOI로 20시간 동안 감염되었다. 이후, 세포를 이들의 생존능에 대해 유세포 측정에 의해 분석하였다. 도 3a으로부터의 샘플 내 혈청 HMGB1은, ELISA에 의해 정량화하였다(도 3b). 골수-유래 대식세포(BMDM)는, 지정된 MOI로 20시간 동안 감염되었다. 이후, 세포를 이들의 생존능에 대해 유세포 측정에 의해 분석하였다. 결과는 도 3a~3e에 나타나 있다. 데이터는 평균±SEM으로 제시되어 있다.

도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이, MVA-OVA 또는 MVA-OVA-CD40L에 의한 감염은, PBS-처리된 종양 세포에 비해 세포 사멸을 약하게 유도하였다. 흥미롭게도, MVA-OVA-4-1BBL에 의한 감염은, 감염 18시간 이후 종양 세포 사멸을 유의하게 향상시켰다.

비-항원성 세포주에서 이러한 결과를 추가로 확인하기 위해, 본 발명자들은 MVA, MVA-CD40L 및 MVA-4-1BBL(이들 중 어느 것도 TAA를 암호화하지 않음)에 의해 감염된 MC38(도 3c) 및 B16.F10(도 3d) 종양 세포를 사용하는 유사한 검정법을 수행하였다. 일관되게, 이러한 MVA에 의한 감염은 이러한 종양 세포주에서 세포 사멸을 유도하고, 골수-유래 대식세포(BMDM)를 효과적으로 사멸시켰다(도 3e). 종합하면, 이러한 데이터들은 MVA 감염이 종양 세포 및 대식세포를 사멸시키고, 이는 CD40L 또는 4-1BBL이 재조합 MVA에 의해 발현될 때 증가한다는 것을 입증하였다.

종양 세포의 종양 용해성 바이러스 감염은, 소위 면역원성 세포 사멸(ICD)을 유도하였다(Workenhe 등 (2014) Mol . Ther . 22: 251-56). ICD는 세포내 단백질, 예컨대 칼레티쿨린(calreticulin), ATP, 또는 면역계에서 알라민(alarmin)으로 작용하는 HMGB1의 방출을 포함하여, 강화된 항원-제시로 이어지고, 이로 인해 항종양 면역을 유도한다. 본 발명자들은 MVA 감염이 분비된 HMGB1에 의해 ICD를 유도할 것인지 시험하였다. 예측하지 못하게도, 본 발명자들은, MVA-OVA-4-1BBL 및 MVA-OVA-CD40L이 MVA-OVA에 비해 HMGB1의 유의한 증가를 유도한다는 사실을 발견하였다(도 3b).

실시예 5: 4 - 1BBL을 암호화하는 MVA는 , 생체 내에서 NK 세포의 활성화를 유도한다

C57BL/6 마우스(n = 5/그룹)를, 200 μg의 항 4-1BBL 항체(클론 TKS-1)와 조합한, 식염수 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-OVA (도 4에서 "rMVA"), 5×10⁷ TCID50의 MVA-OVA-4-1BBL(도 4에서 "rMVA-4-1BBL"), 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-OVA에 의해 정맥내 면역화하였다. 24시간 후, 마우스를 희생시키고, 비장을 유세포 측정 분석을 위해 가공하였다. 결과는 도 4a 및 도 4b에 나타나 있다. CD69(도 4a) 및 CD70(도 4b)의 기하 평균 형광 강도(GMFI)가 나타나 있다. 데이터는 평균±SEM으로 나타나 있고, 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.

결과는, NK 세포 반응의 품질이, 4-1BBL 없는 MVA-OVA의 IV 투여에 비해 MVA-OVA에 대한 4-1BBL의 첨가에 의해 강화되고, NK 세포의 활성화 마커인 CD69 및 CD70은, 둘 다 MVA-OVA에 비해 강하게 상향 조절된다고 나타났다(도 4a 및 도 4b). 차단 4-1BBL 항체의 공동 주사는, MVA-OVA-유도된 NK 세포의 활성화는 완전히 4-1BBL-독립적이지만, 과다한 4-1BBL 신호가 MVA-OVA-4-1BBL에 의해 전달될 때 강화될 수 있다고 나타났다.

실시예 6: 4 - 1BBL을 암호화하는 MVA에 의한 정맥내 면역화는, 생체 내에서 혈청 IFN -γ 분비를 촉진한다

C57BL/6 마우스(n = 5/그룹)를, 200 μg의 항 4-1BBL 항체(클론 TKS-1)와 조합한, 식염수 또는 5×10⁷ TCID50의 "rMVA" (=MVA-OVA), 5×10⁷ TCID50의 "rMVA-4-1BBL" (=MVA-OVA-4-1BBL), 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-OVA에 의해 정맥내 면역화시켰다. 결과는 도 5a 및 5b에 나타나 있다. 데이터는 평균±SEM으로 나타나 있다. 도 5a: 6시간 후, 마우스를 채혈하고, 혈청을 전혈로부터 분리하고, 혈청 내 IFN-γ 농도를 Luminex에 의해 결정하였다. 도 5b: 3시간, 21시간 및 45시간 후, 마우스에 브레펠딘 A를 정맥내 주사하여, 단백질 분비를 중단시켰다. 마우스를 면역화의 6시간, 24시간 및 48시간 이후에 희생시키고, 비장 세포를 유세포 측정에 의해 분석하였다

4-1BB-매개 NK 세포의 활성화는, 증가된 혈청 수준의 NK 효과기 사이토카인 IFNγ와 동시에 일어난다(도 5a). NK 세포는 활성화 시 다량의 IFN-γ를 생산하는 것으로 알려져 있다. 혈청 내 증가된 IFN-γ 수준의 원인이 NK 세포일 수 있는지를 결정하기 위해, 지정된 재조합 MVA 벡터를 정맥내 주사한 이후 상이한 시점들에서 IFN-γ-생산 NK 세포의 비율을 결정하였다. 주사 6시간 후, 높은 혈청 수준의 IFN-γ이 측정될 때, IFN-γ+ NK 세포의 백분율은 최고였고, 그 후 천천히 감소하였다(도 5b). IFN-γ 양성 NK 세포의 최고 빈도는, MVA-OVA-4-1BBL이 사용된 때 관찰되었다. 종합하면, 이러한 데이터는, rMVA-4-1BBL의 정맥내 면역화가 NK 세포의 강한 활성화, 및 NK 세포 효과기 사이토카인 IFN-γ의 증가된 생산으로 이어진다는 것을 나타낸다.

실시예 7: 정맥내 rMVA -4- 1BBL 면역화는, B16.OVA 종양-보유 마우스에서 혈청 IFN -γ 분비를 촉진시킨다

B16.OVA 종양-보유 C57BL/6 마우스를 그룹으로 나누고(n=5/그룹), 종양 접종 7일 후 PBS 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-OVA (도면에서 "rMVA") 또는 MVA-OVA-4-1BBL (도면에서 "rMVA-4-1BBL")를 i.v.(정맥내) 제공하였다. 6시간 후, 마우스를 채혈하고, 혈청을 전혈로부터 분리하고, 혈청 내 IFN-γ 농도를 Luminex에 의해 결정하였다. 결과는 도 6에 나타나 있다. 데이터는 평균±SEM으로 나타나 있다.

도 6에 나타난 데이터는, 흑색종 종양 모델에서 다른 실험에서 보고된 것과 유사한 효과가 NK 세포에서도 또한 얻을 수 있다는 것을 입증한다. 면역화 6시간 후, 혈청 IFN-γ 수준은 MVA-OVA-4-1BBL 면역화된 종양-보유 마우스에게 크게 증가되었고, 이는 강한 NK 세포의 활성화를 나타낸다(도 6).

실시예 8: 정맥내 rMVA -4- 1BBL 프라임 및 부스트 면역화는, 항원- 및 벡터-특이적인 CD8+ T 세포 확대를 향상시킨다.

도 7a 내지 도 7d는 정맥내 rMVA-4-1BBL 프라임 및 부스트 면역화 이후, 항원 및 벡터-특이성을 나타내었다. C57BL/6 마우스(n = 4/그룹)에, 0일 차에 식염수 또는 5×10⁷ TCID50의 rMVA(= MVA-OVA), 5×10⁷ TCID50의 rMVA-4-1BBL(=MVA-OVA-4-1BBL), 또는 5×10⁷ TCID50의 rMVA를 200 μg의 항 4-1BBL 항체(클론 TKS-1)와 조합하여 정맥내 프라임 면역화를 제공하고, 41일 차에 부스트 면역화시켰다. 1차 면역화의 6일, 21일, 35일, 48일 및 64일 이후 마우스를 채혈하고, 말초혈의 유세포 분석을 실시하였다. 1차 면역화 70일 후, 마우스를 희생시켰다. 비장을 수집하고, 유세포 측정 분석을 수행하였다.

결과는 도 7a 내지 도 7d에 나타나 있다. 도 7a는 말초혈 백혈구(PBL) 중의 항원(OVA)-특이적인 CD8+ T 세포의 백분율을 나타내고, 도 7b는 PBL 중의 벡터 (B8R)-특이적인 CD8+ T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 7c는 살아있는 세포들 중 항원(OVA)-특이적인 CD8+ T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 7d는 살아있는 세포들 중 벡터(B8R)-특이적인 CD8+ T 세포를 나타낸다. 데이터는 평균±SEM으로 나타나 있다.

결과는, B8- 및 OVA-특이적인 CD8 T 세포가 제1 면역화 7일 후 최대에 이르고, 제2 면역화 이후 41 일차에 추가로 확대된다는 것을 나타낸다(도 7a 및 도 7b). 41일 시점에서, rMVA에 비해, B8 및 OVA 둘 다에 대한 항원-특이적인 T 세포 반응의 관점에서 rMVA-4-1BBL이 명백히 유익하다. 흥미롭게도, 차단 4-1BBL 항체의 공동-주사는, rMVA-유도된 T 세포 반응은 완전히 4-1BBL-독립적이나, 과다한 4-1BBL 신호가 rMVA-4-1BBL에 의해 전달될 때 강화될 수 있다고 나타났다(도 7a 및 도 7b). 이러한 결과와 연관되어, rMVA-4-1BBL 프라임/부스트 면역화는 또한 제1 면역화 70일 후 비장에서 OVA- 및 B8-특이적인 T 세포 반응을 개선시켰다(도 7c 및 도 7d).

실시예 9: TAA 및 4- 1BBL을 암호화하는 MVA 바이러스의 정맥내 주사의 증가된 항종양 효과

B16.OVA 종양-보유 C57BL/6 마우스를 그룹으로 나누고(n=5/그룹), 종양 접종의 7일 후(검은색 점선) PBS 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-OVA 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-OVA-4-1BBL을 i.v.(정맥내) 제공하였다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, 4-1BBL을 암호화하는 MVA 바이러스의 정맥내 투여는 종양 성장 지연이 연장된 결과, MVA 또는 대조군(PBS)에 비해 종양 부피를 감소시킨다.

실시예 10: 4 - 1BBL 또는 CD40L을 암호화하는 MVA 바이러스의 종양내 주사의 강화된 항종양 효과

B16.OVA 종양-보유 C57BL/6 마우스(n= 4-5/그룹)를 그룹으로 나누고, 종양 접종의 7일 후(검은색 점선), 12일 후 및 15일 후(회색 파선), PBS 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-OVA (도면에서 "rMVA"), MVA-OVA-CD40L(도면에서 "rMVA-CD40L"), 또는 MVA-OVA-4-1BBL (도면에서 "rMVA-4-1BBL")를 종양내(i.t.) 제공하였다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다. 도 9a 내지 도 9d에 나타난 바와 같이, 강화된 항종양 효과는 TAA와 4-1BBL 또는 CD40L 중 어느 하나를 암호화하는 MVA 바이러스의 종양내 주사를 통해 실현되었다. 더욱 특히, 도 9d에 나타난 바와 같이, 종양 성장의 유의하게 더 큰 감소는 4-1BBL을 암호화하는 MVA 바이러스에서 나타났다. 본 발명은 임의의 특정 메커니즘 또는 작용 모드에 구속되지 않지만, 4-1BBL과 CD40L 사이에서 관찰되는 차이에 대한 하나의 가설은, 4-1BBL이 NK 세포 및 T 세포를 활성화시키는 것을 목표로 하는 반면, CD40L은 DC를 활성화하는 것을 목표로 한다는 것이다. B16 흑색종 종양은 T 세포에 의해 더욱 침윤되고(문헌[Mosely 등 (2016) Cancer Immunol . Res. 5(1): 29-41]); 따라서, 4-1BBL을 암호화하는 MVA는 이 세팅에서 CD40L을 암호화하는 MVA보다 더욱 효과적이다.

4-1BBL 및 CD40L이 종양 성장 또는 직경에 대해 이들의 효과를 발휘하는 정확한 메커니즘 또는 경로와는 무관하게, 도 9의 데이터는 4-1BBL을 암호화하는 MVA의 종양내 주사가 종양 성장 조절의 연장, 및 일부 경우에 심지어 종양의 완전한 감소(rejection)를 발생시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 11: 확립된 결장암에 대한, TAA와 CD40L 를 갖도록 암호화된 MVA 바이러스의 종양내 주사의 강화된 항종양 효과

MC38 종양-보유 C57BL/6 마우스를 그룹으로 나누고(n=5/그룹), 종양 접종의 14일 후(검은색 점선), 19일 후 및 22일 후(검은색 파선), PBS 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-TAA(도면에서, "rMVA") 또는 MVA-TAA-CD40L(도면에서, "rMVA-CD40L")를 종양내(i.t.) 제공하였다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다. 결과는 도 10a, 10b, 및 10c에서 비-항원성의 확립된 MC38 결장 암종에 대하여 나타나 있다. 이 실험에서 MVA에 의해 발현된 TAA는, 항원 AH1A5, p15E, 및 TRP2를 포함하였다.

이러한 결과들은, 하나 이상의 TAA 외에 CD40L을 암호화하는 MVA의 종양내 주사가, MC38 결장 암종 모델에서 종양 성장을 유의하게 지연시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 12: 면역관문 차단 및 종양 항원 특이적인 항체는, MVA -OVA-4- 1BBL의 종양내 투여에 의해 시너지 효과를 갖는다.

B16.OVA 흑색종 세포(5×10⁵)를 C57BL/6 마우스에 피하 주사하였다. 종양의 직경이 약 5mm에 이르면, 마우스를 그룹으로 나누고(n = 5/그룹), 지시된 경우(체크 표시) 200 μg의 IgG2a, 항 TRP-1 또는 항 PD-1을 복강내(i.p.) 제공하였다. 마우스를 종양 접종의 13일 후(검은색 점선), 18일 후 및 21일 후(회색 파선), PBS 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-OVA-4-1BBL로 종양내 면역화시켰다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다. 결과는 도 11에 나타나 있다. 종양 관련 항원(TAA) Trp1에 특이적인 항체(항-Trp1)가 MVA-OVA-4-1BBL의 종양내 투여와 조합될 때, 항 PD-1 그 자체에 비해 종양 부피의 감소가 증가되었다(도 11, 중간 줄). 면역 관문 분자 항체 PD-1이 MVA-OVA-4-1BBL의 종양내 투여와 조합될 때, 항 D-1 그 자체에 비해 종양 부피의 감소가 증가된다(도 11, 아랫 줄).

이러한 실험은, 항-PD-1 및 항-TRP-1 항체는 단일 제제로서 종양 성장 조절을 강화시키나, 상기 어느 하나의 항체와 MVA-OVA-4-1BBL의 조합은 MVA-OVA-4-1BBL이 나타낸 치료 효과를 개선시킨다는 것을 입증한다. 여기에서, 종양내 MVA 4-1BBL과 면역관문 차단 또는 TAA-표적화 항체의 조합 치료는, 어느 단독 치료보다도 더 큰 치료 활성을 가졌다. 이 데이터는 또한 시너지 효과를 위해 잠재적으로 ADCC를 유도하는 종양-특이적인 항체가 4-1BBL을 발현시키는 MVA의 종양내 주사와 조합될 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 13: 작용성 항-CD137 항체 치료에 비해, 우수한 종양내 MVA -OVA-4- 1BBL 주사의 항-종양 효과

B16.OVA 종양-보유 C57BL/6 마우스를 그룹으로 나누고(n=5/그룹), PBS, 5×10⁷ TCID50의 MVA-OVA-4-1BBL, 또는 10μg의 항-4-1BB (3H3, BioXcell)를 종양 접종의 7일, 12일 및 15일 이후(검은색 파선)에 종양내 주사하였다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다.

도 12a는 작용성 항-4-1BBL 항체(3H3)에 비해, 우수한 MVA-OVA-4-1BBL의 항-종양 효과를 나타내었다. 도 12b는 MVA-OVA-4-1BBL에 의한 종양내 면역화는 혈액에서 오직 OVA-특이적인 T 세포 반응만을 유도하나, 작용성 항-4-1BBL 항체는 혈액에서 어떠한 OVA-특이적인 T 세포도 유도하지 않았다는 것을 나타낸다.

따라서, 이러한 데이터들은 종양내 MVA-OVA-4-1BBL 치료가 종양-특이적인 T 세포 반응 뿐만 아니라 종양 성장 조절 둘 다의 관점에서 작용성 항-CD137 항체보다 더욱 강력하다는 것을 나타낸다.

실시예 14: CT26 종양 모델에서 CD40L을 갖도록 암호화된 내재성 레트로바이러스(ERV) 항원 Gp70를 암호화하는 MVA의 정맥내 주사의 증가된 항종양 효과

CT26 종양-보유 Balb/c 마우스를 그룹으로 나누고(n=5/그룹), 마우스에 종양을 도입한 지 12일 후(검은색 점선), PBS 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-BN, MVA-Gp70, 또는 MVA-Gp70-CD40L을 정맥내(i.v.) 제공하였다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다. 도 13a 및 도 13b에 나타난 바와 같이, 내재성 레트로바이러스 항원 Gp70을 암호화하는 MVA 바이러스의 정맥내 투여는, MVA 또는 대조군(PBS)에 비해 종양 부피를 감소시켰다. 항-종양 효과는 CD40L이 추가로 MVA-Gp70-CD40L에 의해 암호화될 때, 더욱 개선되었다.

도 13c는 MVA-Gp70 또는 MVA-Gp70-CD40L의 정맥내 주사 시, 혈액 내 Gp70 특이적인 CD8 T 세포의 유도를 나타낸다.

따라서, 이러한 실험에서, 쥣과의 단백질 gp70(쥣과의 백혈병 바이러스의 외피 단백질)인 모델 ERV를 암호화하는 MVA("MVA-gp70")가 제작되었다. 상호 자극성 분자 CD40L을 추가로 포함하는 MVA도, 또한 생성되었다("MVA-gp70-CD40L"). 이러한 새로운 제작물의 항-종양 가능성은, CT26.wt 결장 암종 모델을 사용하여 시험하였다. CT26.wt 세포는 높은 수준의 gp70를 발현하는 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Scrimieri (2013) Oncoimmunol 2: e26889] 참고). CT26.wt 종양 보유 마우스를 생성하고, 종양이 적어도 5mm×5mm일 때, 상기에 지시한 바와 같이 이를 정맥내 면역화시켰다. MVA 단독에 의한 면역화는, 종양 성장을 약간 지연시켰다. 반대로, MVA-gp70에 의한 면역화는, 5개의 종양 중 3개의 완전한 감소를 유발하였다(도 13a 및 도 13 b). MVA-Gp70-CD40L에 의한 면역화에서 훨씬 더 놀라운 결과를 얻었는데, 5개의 종양 중 4개의 감소를 유발하였다(도 13a 및 도 13 b).

이러한 항-종양 반응이 면역화 이후 gp70-특이적인 T 세포의 유도와 관계되는지를 결정하기 위해, H-2Kd-제한된 gp70 에피토프 AH1을 사용하여, 혈액 재-자극을 실시하였다. 이러한 결과(도 13c)는, MVA-Gp70 및 MVA-Gp70-CD40L 처리된 마우스에서 gp70-특이적인 CD8 T 세포 반응의 강한 유도를 나타낸다(도 13c).

실시예 15: B16.F10 종양 모델에서 CD40L와 함께 암호화된 내재성 레트로바이러스 항원 Gp70을 암호화하는 MVA의 정맥내 주사의 증가된 항종양 효과

B16.F10 종양-보유 C57BL/6 마우스를 그룹으로 나누고(n=5/그룹), 종양이 대략 5×5 mm로 측정될 때, 종양 접종 7일 이후(검은색 점선) PBS 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-BN, MVA-Gp70, 또는 MVA-Gp70-CD40L을 정맥내(i.v.) 제공하였다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다. 도 14a에 나타난 바와 같이, 내재성 레트로바이러스 항원 Gp70 및 CD40L을 암호화하는 MVA 바이러스의 정맥내 투여는, MVA 또는 대조군(PBS)에 비해 종양 부피를 감소시켰다.

도 14b는 MVA-Gp70 또는 MVA-Gp70-CD40L의 정맥내 주사 시, 혈액 내 Gp70 특이적인 CD8 T 세포의 유도를 나타낸다.

따라서, 이러한 실험에서, MVA-Gp70 및 MVA-Gp70-CD40L에 의한 치료의 효능은, 독립적인 추가 종양 모델에서 입증되었다. B16.F10은 C57BL/6로부터 유래된 흑색종 세포주이고, 높은 수준의 Gp70을 발현한다(문헌[Scrimieri (2013) Oncoimmunol 2: e26889]). MVA 단독에 의한 치료("MVA-BN")는, 비-어주번트화 MVA-Gp70의 효과에 견줄만한, B16.F10 종양의 일부 종양 성장 지연으로 이어졌다(도 14a). 그러나, MVA-Gp70-CD40L은 MVA 골격 대조군 단독보다 더 강한 항-종양 효과를 발생시켰다(도 14a). 추가적인 실험에서, Gp70-항원-암호화 MVA를 제공받은 양쪽 그룹은, H-2Kb-제한적인 gp70 에피토프 p15e에 대해 특이적인 CD8 T 세포 반응을 나타내지만, 또한 CD40L이 MVA에 의해서 암호화될 때, 주변 T 세포 반응에서 극적인 증가는 관찰되지 않았다고 입증되었다(도 14b).

실시예 16: gp70 및 4- 1BBL을 암호화하는 MVA 바이러스의 정맥내 주사의 증가된 항종양 효과 [ 예측예 ]

B16.OVA 종양-보유 C57BL/6 마우스 그룹으로 나누고(n=5/그룹), 종양 접종 7일 후(검은색 점선) PBS 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-OVA 또는 MVA-gp70-4-1BBL을 정맥내 제공하였다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정하였다. 인간의 내재성 레트로바이러스(ERV) 단백질의 마우스 상동체는, 정상적인 마우스 조직에서 많이 발현되지 않고, 마우스 종양 조직에서 주로 발현되지도 않기 때문에, 인간 ERV의 효능은 마우스 모델에서 효과적으로 연구할 수 없다. Gp70는 매우 잘 연구되어 온 마우스 ERV 단백질이다(예를 들어, 문헌[Bronte 등 (2003) J Immunol . 171 (12): 6396-6405]; 문헌[Bashratyan 등 (2017) Eur . J. Immunol . 47: 575-584]; 및 문헌[Nilsson 등 (1999) Virus Genes 18: 115-120] 참고). 따라서, 마우스에서 gp70-특이적인 암 백신의 연구는, 인간에서의 ERV-특이적인 암 백신의 효능에 대한 강한 예측값을 가질 확률이 매우 높다.

실시예 17: gp70 및 4- 1BBL 또는 CD40L 중 어느 하나를 암호화하는 MVA 바이러스의 종양내 주사의 강화된 항종양 효과 [예측예]

B16.OVA 종양-보유 C57BL/6 마우스를 그룹으로 나누고(n=4-5/그룹), 종양 접종의 7일 후(검은색 점선), 12일 후 및 15일 후(회색 파선), PBS 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-OVA, MVA-OVA-CD40L, 또는 MVA-OVA-4-1BBL을 종양내(i.t.) 제공하였다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정하였다.

실시예 18: rMVA - HERV -K-4- 1BBL에 의한 투여는, 감염된 종양 세포의 직접 항원 제시에 의해 사이토카인 생산에 영향을 미친다 [예측예]

수지상 세포(DC)는 C57BL/6 마우스 유래의 골수 세포를 재조합 Flt3L의 존재 하에서 14일 동안 배양한 후 생성되었다. B16.F10 세포를 MVA-HERV-K, MVA-HERV-K-CD40L, MVA-HERV-K-4-1BBL, 또는 MVA-HERV-K-4-1BBL-CD40L에 의해 MOI 10으로 감염시키고, 밤새 방치하였다. 다음날, 감염된 종양 세포를 수집하고, 지시된 경우 4시간 동안 37℃, 5% CO2에서, DC의 존재 하에서 1:1의 비로 공동 배양하였다. HERV-K 특이적인 CD8+ T 세포를 HERV-K 면역화 마우스로부터 자기에 의해 정제하고, 1:5의 비로 공동 배양액에 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하였다. 이후, 배양 상청액을 Luminex에 의한 사이토카인 농도 분석을 위해 모았다. 사이토카인 수준 측정은, (A) IL-6, (B) GM-CSF, (C) IL-2 및 (D) IFNγ를 포함한다. 데이터는 평균±SEM으로 제시되어 있다.

실시예 19: rMVA - HERV -K-4- 1BBL에 의한 투여는, 감염된 종양 세포의 직접 항원 제시에 의해 항원-특이적인 CD8+ T 세포를 활성화된 효과기 T 세포로 유도한다 [예측예]

수지상 세포(DC)는 C57BL/6 마우스 유래의 골수 세포를 재조합 Flt3L의 존재 하에서 14일 동안 배양함으로써 생성되었다. B16.F10 세포에 MVA-HERV-K, MVA-HERV-K-CD40L, MVA-HERV-K-4-1BBL, 또는 MVA-HERV-K-4-1BBL-CD40L를 MOI 10으로 감염시키고, 밤새 방치하였다. 다음날, 감염된 종양 세포를 수집하고, 지시된 경우 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 DC의 존재 하에서 1:1의 비로 공동 배양하였다. 그 동안, HERV-K 특이적인 CD8+ T 세포를 HERV-K 면역화 마우스로부터 자기에 의해 정제하고, 1:5의 비로 공동 배양액에 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 염색하고, 유세포 측정에 의해 분석하였다. 사이토카인 분석은 (A) OT-I CD8+ T 세포 상의 T-bet의 GMFI, 및 (B) OT-I CD8+ T 세포의 CD44+그랜자임 B+ IFNγ+ TNFα+의 백분율에 대해 실시하였다. 데이터는 평균±SEM으로 나타나 있다.

실시예 20: CD40L 또는 4- 1BBL에 의해 암호화된 rMVA - HERV -K에 의한 감염은, 종양 세포주 및 대식세포에서 종양 세포 사멸을 유도한다 [예측예]

종양 세포주 B16.OVA (A 및 B), MC38 (C) 및 B16.F10 (D)을, 지정된 MOI로 20시간 동안 감염시켰다. 이후, 세포를 이들의 생존능에 대해 유세포 측정으로 분석하였다. (A)로부터의 샘플 내 혈청 HMGB1을, ELISA에 의해 정량화한다. 골수 유래 대식세포(BMDM)를 지정된 MOI로 20시간 동안 감염시켰다. 이후, 세포를 이들의 생존능에 대해 유세포 측정으로 분석하였다. 데이터는 평균±SEM으로 제시되어 있다.

실시예 21: 4-1BBL을 암호화하는 재조합 MVA 의 종양내 투여는, Treg 세포의 감소 및 종양내의 T 세포 고갈의 감소를 생성한다 [예측예 ]

B16.OVA 종양-보유 C57BL/6 마우스를 그룹으로 나누고(n=5/그룹), 종양 접종 7일 후(검은색 점선), PBS 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-OVA 또는 MVA-OVA-4-1BBL을 종양내(i.t.) 제공하였다. 5일 후, 마우스를 희생시키고, 비장 및 종양을 수집하고, 형광 색소 접합된 항체로 염색하여, Treg 침윤 및 T 세포 고갈을 평가하였다. (A) CD45+ 종양-침윤 백혈구 중의 CD4+ FoxP3+ T 세포의 백분율; PD-1의 기하 평균 형광 강도(B) 및 종양 침윤 CD8 T 세포 상의 Lag-3(C). 데이터는 평균±SEM으로 제시되어 있다.

실시예 22: 면역관문 차단 및 종양 항원 특이적인 항체는, rMVA gp -70-4-1BBL의 종양내 투여와 시너지 작용을 한다 [예측예]

B16.OVA 종양-보유 C57BL/6 마우스를 그룹으로 나누고(n=5/그룹), 지시된 경우(체크 표시) 200 μg의 IgG2a, 항 TRP-1 또는 항 PD-1을 제공하였다. 마우스를 종양 접종의 13일 후(검은색 점선), 18일 후 및 21일 후(회색 파선)에 PBS 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-gp70-4-1BBL에 의해 종양내 면역화시켰다. 종양 성장은 규칙적인 간격으로 측정되었다.

실시예 23: IT 면역화에 대한 사이토카인/ 케모카인 MVA - BN 골격 반응은, 4- 1BBL 어주번트화에 의해 증가될 수 있다.

종양 미세환경(TME) 내에서 재조합 MVA의 염증 유도 가능성을 평가하기 위해, B16.OVA 종양 유래의 조직에서 사이토카인 및 케모카인을 분석하였다. 먼저, 5×10⁵개의 B16.OVA 세포를 C57BL/6 마우스에 피하(s.c.) 이식하였다. 10일 차에, 마우스를 PBS 또는 2×10⁸ TCID₅₀의 MVA-BN, MVA-OVA, 또는 MVA-OVA-4-1BBL에 의해 종양내(i.t.) 면역화하였다(n=5 내지 6마리의 마우스/그룹).

주사 6시간 후, 사이토카인 및 케모카인의 발현을 측정하였다(도 15). PBS가 처리된 조직 내의 사이토카인/케모카인 발현은, 종양에 대한 바늘 삽입과 식염수 전단 압력에 의해 유도된 기저 염증 특성을 나타낸다. IL-6, IFN-α, IL-15 및 TNF-α을 포함하는 사이토카인, 뿐만 아니라 CXCL1, CCL2, 및 MIP2와 같은 케모카인도 상향 조절되었다(도 15). 인간에서 NF-κβ 활성화에 의해 유도되고, IL-8의 생산을 자극하는 IL-25(또한, IL-17E로도 알려짐)도, 또한 검출되었다(문헌[Lee 등 (2001) J. Biol . Chem. 276: 1660-64]). 흥미롭게도, MVA-OVA-4-1BBL이 주사된 종양은, MVA-BN이 주사된 종양 또는 MVA-OVA가 주사된 종양 병변에 비해, 전-염증성 사이토카인, 예컨대 IL-6, IFN-α 또는 IL-15/IL15Rα에서 유의한 증가를 나타내었다.

실시예 24: 종양내(i.t.) 면역화에 대한 사이토카인/ 케모카인의 전-염증성 반응은, MVA -OVA-4- 1BBL에 의해 증가된다 .

마우스 및 종양을, 실시예 23에 기재된 바와 같이 처리하였다. 놀랍게도, IFN-γ 및 GM-CSF를 포함하는 몇몇 전-염증성 사이토카인은, 단지 MVA-OVA-4-1BBL에 의한 종양내 면역화 이후에만 생산되었다(도 16). IL-18, CCL5, CCL3 및 IL-22를 포함하는 다른 전-염증성 사이토카인의 생산은, MVA-OVA 또는 MVA-OVA-4-1BBL에 의한 종양내(i.t.) 면역화에 의해 강화되었으나, MVA-BN 또는 PBS 단독에 의한 경우 그러하지 않았다.

종합하면, 이 데이터는 종양내(i.t.) MVA 면역화가 종양 미세환경(TME)에서 염증성 사이토카인/케모카인 전환을 유도하고, 이로 인해 염증 반응을 강화시킬 수 있다는 것을 입증한다. 증가된 효과는 MVA 또는 MVA-OVA에 비해, MVA-OVA-4-1BBL에 의한 종양내 면역화에서 관찰되었다. 이러한 방식으로, 4-1BBL의 첨가는 재조합 MVA를 "어주번트화"하였다고 말할 수 있다.

실시예 25: MVA -OVA-4- 1BBL의 종양내 주사 이후, TME 및 주변 LN의 정량적 및 정성적인 T-세포 분석

MVA-OVA 및 MVA-OVA-4-1BBL의 종양내(i.t.) 주사 이후, 염증에 의해 유도된 세포 과정을 더욱 잘 이해하기 위하여, 종양내(i.t.) 주사 이후 상이한 시점들에서의 선천성 및 적응성 면역 침출물의 심층 분석을 수행하였다. B16.OVA 종양-보유 마우스에 PBS 또는 2x10⁸ TCID₅₀의 MVA-OVA 또는 MVA-OVA-4-1BBL을 종양내(i.t.) 주사하였다. 프라임 면역화의 1일, 3일 및 7일 이후, 마우스를 희생시켰다. 종양 및 종양-주변 림프절(TdLN)을 절제하여, 콜라게나제 및 DNase를 처리하고, 단일 세포를 유세포 측정에 의해 분석하였다. 면역 세포 집단을 분석하여, 이들의 크기, 증식 거동, 및 기능 상태를 결정하였다.

결과는, MVA-OVA 또는 MVA-OVA-4-1BBL에 의한 B16.OVA 종양의 주사가, 종양내(i.t.) 면역화 7일 후 종양에 대한 CD45⁺ 백혈구의 침윤을 유도한다는 것을 나타내었다(도 17, 윗줄 좌측 히스토그램). 흥미롭게도, TdLN 내의 CD45⁺ 백혈구 수의 확대가, i.t.(종양내) 면역화(도 17. 윗줄 우측 히스토그램), 특히 4-1BBL을 발현하는 MVA의 주사의 3일 이후 이미 관찰되었다. 이러한 차이는 종양내(i.t.) 면역화 7일 후 TdLN에서 추가로 확대되었는데, 이는 MVA 면역 -매개 항종양 효과가 면역화 3일 후만큼 빨리 TdLN에서 시작된다는 것을 암시한다.

백신화-기반 항종양 치료의 하나의 양태는, 종양-특이적인 CD8⁺ 및 CD4⁺ T 세포의 확대 및 회복(reinvigoration)과, 종양내의 이들의 농축이다. CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포는 둘 다 종양에서 면역화 1주 후 증가되었다(도 17, 각각 둘째 및 셋째 줄, 좌측 히스토그램). CD4+ T 세포는 종양에서 MVA-OVA-4-1BBL에 의한 i.t. 면역화 7일 후까지 증가할 뿐만 아니라, TdLN에서는 상기 i.t. 면역화의 3일 후에 개시하여 7일 후에 피크를 이룬다. CD8⁺ T 세포는 7 일차까지 종양내 CD45⁺ 세포의 증가에 크게 기여하였다. MVA-OVA-4-1BBL의 주사는, 종양(7 일차) 및 dLN(3 일차 및 7 일차) 둘 다에서의 MVA-OVA의 주사에 비해, CD8⁺ T 세포 집단을 추가로 확대시켰다.

OVA-특이적인 CD8⁺ T 세포의 정량화는, 종양내(i.t.) 면역화 7일 후, 특히 MVA-OVA-4-1BBL로 처리된 그룹에서 종양 미세환경 내에서의 증가를 나타내었다(도 17, 좌측 하부). 놀랍게도, TdLN 내의 OVA-특이적인 CD8⁺ T 세포의 확대는 면역화 3일 후 피크를 이루고, MVA-OVA-4-1BBL 처리된 그룹에서는 더 높았다(도 17, 우측 하부). 종합하면, 이러한 데이터들은 MVA-OVA, 특히 MVA-OVA-4-1BBL에 의한 종양내 면역화가 종양 주변 림프절에서 치료 3일 후 적응성 면역 반응의 생성을 강화하여, 7일 후까지 종양 미세환경에서 항원-특이적인 CD8⁺ T 세포를 유의하게 증가시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 26: MVA -OVA-4- 1BBL의 종양내 주사에 의한 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 유도

MVA-OVA-4-1BBL의 종양내 주사에 의해 유도된 종양 주변 림프절(TdLN) 내의 OVA-특이적인 CD8⁺ T 세포는, 높은 증식 능력을 발휘하였다. Ki67을 발현시키는 OVA-특이적인 CD8⁺ T 세포의 백분율(세포 증식의 지표)은, PBS에 비해 MVA-OVA 치료 이후 TdLN에서 더 높았고, MVA-OVA-4-1BBL에 의해 면역화된 마우스에서는 추가로 증가되었다(도 18a). 게다가, 종양내의 OVA-특이적인 CD8 T 세포는 MVA-OVA 뿐만 아니라 MVA-OVA-4-1BBL에 의한 면역화 7일 후, 고갈 마커 PD-1을 하향 조절하였는데, 이는 기능성의 회복을 암시하였다(도 18b).

Treg 세포(또한, "조절 T 세포")는 항-종양 면역 반응의 강력한 억제제이다(예를 들어, 문헌[Tanaka 등 (2017) Cell Res. 27: 109-118] 참고). MVA-OVA의 종양내 주사는 종양내 OVA-특이적인 Teff/Treg의 비(즉, "Teff" 세포 또는 "효과기 T 세포" 대 Treg 세포의 비)를 증가시키고, MVA-OVA-4-1BBL에 의한 치료 7일 후 추가적인 증가가 나타났다(도 18c). 따라서, MVA-OVA 및 특히 MVA-OVA-4-1BBL에 의한 종양내 치료는, 항-종양 면역 반응에 유익한 CD8+ T 효과기 세포에 유리하게 종양내 Treg의 빈도를 감소시켰다.

실시예 27: MVA -OVA-4- 1BBL의 종양내 주사 이후, TME 및 주변 LN의 정량적 및 정성적인 NK 세포 분석

MVA-OVA에 의한 i.t. 면역화 이후 NK 세포의 정량화는, 종양내 면역화 1일 후 종양내 NK 세포의 감소를 나타내었다(도 19, 윗줄, 좌측 히스토그램). 이러한 변화는 MVA-OVA-4-1BBL이 사용될 때 더욱 현저하였다. 동시에, 종양 주변 림프절(TdLN) 내의 NK 세포는 MVA-OVA 및 MVA-OVA-4-1BBL 둘 다에 의한 면역화의 3일 및 7일 이후 증가되었으나(도 19, 윗줄 우측 히스토그램), MVA-OVA-4-1BBL은 TdLN에서 NK 세포의 가장 높은 증가를 유도하였다.

CD69는 초기 NK 세포의 활성화의 마커이다. 바이러스 벡터인 MVA-OVA 및 MVA-OVA-4-1BBL은, 둘 다 종양 뿐만 아니라 주변 림프절에서 활성화 마커 CD69의 즉각적인 상향 조절을 유도한다(TdLN; 도 19, 둘째 줄). 나아가, i.t. 면역화는 종양 및 TdLN 둘 다에서 다양한 시점에서 NK 세포 내 그랜자임 B을 유도하는데, 이는 강화된 세포독성 NK 세포 기능의 표시이다(도 19, 셋째 줄).

최종적으로, Ki67 발현에 의한 NK 세포의 증식 능력을 분석하였다. 3일 차에, NK 세포 상의 Ki67 발현은 MVA-OVA 또는 MVA-OVA-4-1BBL을 종양내 처리한 마우스의 종양 및 TdLN에서 유의하게 증가하였다(도 19, 마지막 줄).

이러한 결과는, 4-1BBL-어주번트화 MVA-OVA(즉, MVA-OVA-4-1BBL)가, MVA-OVA에 비해, 종양내 주사 이후 NK 세포에서 CD69, 그랜자임 B 및 Ki67 표면 마커의 발현을 추가로 증가시킨다는 것을 입증한다. 이러한 실험은 또한 종양내 면역치료 이후 항-종양 T 세포 및 NK 세포 반응의 증가에 대한 주변 림프절(TdLN)의 유의한 역할을 밝혔다.

본 발명은 임의의 특정 운영 메커니즘에 구속되지 않지만, 3일 차에 TdLN 내의 T 세포의 확대 및 7일 차에 종양내 T 세포의 침윤 지연(도 17 참고)은, 종양-특이적인 T 세포가 TdLN 내에서 프라이밍되고 확대된 후, 종양으로 이동하여 종양 세포를 사멸한다는 시나리오를 뒷받침한다. 바이러스 벡터의 종양내 주사는 또한 TdLN에서 직접 NK 세포의 활성화로 이어지고, 이로 인해 DC 활성화를 추가로 유도할 수 있다.

실시예 28: 종양내 MVA 암 치료에서의 CD8 T 세포의 역할

(예를 들어, 도 17에서) 종양 및 TdLN에서의 T 세포 반응의 분석은, 종양내(i.t.) 치료 이후, 두 영역 모두에서의 종양-특이적인 T 세포의 확대를 나타내었다. 실험은 MVA-OVA-4-1BBL 매개 항-종양 효과에 대한 T 세포의 기여를 평가하기 위해 수행하였다. 이 실험에서는, C57BL/6 마우스에 B16.OVA 흑색종 세포(5×10⁵ 세포)를 주사하였고, 몇몇 치료들 중 하나 이후에 종양 성장을 모니터링하였다. 상기 치료는 100 μg의 CD8-T-세포-고갈 항체("αCD8," 클론 2.43) 또는 동형체 대조군 항체의 존재 또는 부재 하에서의, PBS 또는 MVA-OVA-4-1BBL의 종양내(i.t.) 주사를 포함하였다. MVA-OVA-4-1BBL의 주사는 종양의 직경이 5mm에 이른 때 (i.t.) 실시되었고, 1주 내에 2회 반복하였다. MVA-OVA-4-BBL에 의한 제1 주사의 하루 전에, 마우스에 항-CD8 또는 IgG2b 항체를 i.p. 주사하였고, 이 치료를 다음 2주 내에 4회 반복하였다. 도 20에 제시된 데이터는, CD8 T 세포가 효과적인 MVA 종양 치료에 필수적이라는 것을 나타낸다. 종합하면, 이러한 데이터들은 MVA-유도 활성화와 종양 및 TdLN 내의 종양-특이적인 CD8 T 세포의 확대가 종양 성장 조절을 위해 중요한 사건이라는 사실을 나타낸다.

실시예 29: MVA -OVA 및 MVA -OVA-4- 1BBL 매개 항-종양 효과의 Batf3 + DC-의존성

MVA-OVA-4-1BBL에 의해 유도된 항-종양 면역 반응에 기여하는 기저성 세포 및 분자 엔티티(entity)를 설명하기 위해, 본 발명자들은 다양한 면역 세포 참가자의 역할을 조사하였다. 수지상 세포 (DC)는, 항원 및 적응성 면역계의 세포에 대한 상호-자극성 신호를 시식(sample)하고 이를 제시하는 능력에 의해, 항종양 면역에서 중요 인자로 간주된다. CD8α+ DC(또한, "cDC1"로도 알려짐)를 포함하는 DC의 다양한 서브 타입은, 종양에 대한 강력한 면역 반응의 활성화에 관여하였다. 이러한 DC 서브 세트는 면역 반응 동안 항원을 교차-제시하는 특유의 능력을 갖고, CD8α+ DC는 감염(문헌[Hochrein 등 (2001) J. Immunol . 166: 5448-55]; 문헌[Mart

nez-L

pez 등 (2014) Eur . J. Immunol. 45: 119-29]) 및 암(문헌[Broz 등 (2014) Cancer Cell 26: 638-52])에 대한 반응에서, IL-12의 주요 생산자이다. CD8α+ DC는 또한 종양-관련 항원의 교차-제시에 의한 항종양 CD8+ T 세포의 강력한 유도자이기도 하다(문헌[S

nchez-Paulete 등, (2015) Cancer Discovery 6: 71-79]; 문헌[Salmon 등 (2016) Immunity 44: 924-38]). CD8α+ DC 발달은 전사 인자 Batf3에 결정적으로 의존한다(Hildner 등 (2008) Science 322: 1097-1100).

종양내 MVA 암 치료에 대한 이러한 DC 서브 세트에 대한 중요성을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 야생형 및 Batf3-결핍성(Batf3-/-) B16.OVA 종양-보유 마우스를 이용하였다. 도 21a은 B16.OVA 종양이 교차-제시 DC의 부재 하에(Batf3-/-) 극적으로 빨리 성장했다는 것을 나타내는데, 이는 종양-유발 면역 반응의 유도에 대한 이러한 항원 제시 세포(APC)의 중요한 역할을 나타낸다. 이전 실험과 연관되어, 야생형 마우스에서, MVA-OVA의 종양내 주사는 종양 성장 지연, 및 하나의 경우에는 종양의 완전한 제거로 이어졌다. 이러한 효과는, 마우스에 MVA-OVA-4-1BBL를 주사한 후 개선되었고; MVA-OVA-4-1BBL을 처리한 5마리의 마우스 중 3마리에서 종양이 감소하였다(도 21a). 흥미롭게도, 교차-제시 DC의 부재 하에서는(Batf3-/-), 종양내 MVA 면역치료는 WT 그룹에 비해 전혀 손상되지 않았다(도 21a). 그러나, Batf3-DC는 4-1BBL 유도된 항종양 반응에 참여하는 것으로 보인다(도 21a, 하부).

제1 면역화 11일 후, 말초혈 내 CD8⁺ T 림프구 집단의 유세포 측정 분석(도 21b)는, OVA-특이적인 CD8⁺ T 세포 빈도가 야생형 대응체에 비해 MVA-OVA-4-1BBL 면역화된 Batf3 ^-/- 종양 보유체에서 단지 약간만 감소된다는 것을 보여주었다. 본 발명은 임의의 특정 운영 메커니즘에 구속되거나 의존하지 않지만, 이러한 데이터들은 Batf3-의존성 DC가 MVA에 의한 종양내 암 치료에 불필요한 역할을 한다는 것을 암시한다.

실시예 30: MVA -OVA-4- 1BBL의 종양내 투여에 대한 NK 세포의 역할

NK 세포는 4-1BB를 발현시키는 것으로 알려져 있고, NK 세포에 대한 4-1BB의 라이게이션은 이러한 세포에서 증가된 증식 및 세포독성을 생성하는 것으로 나타났다(문헌[Muntasell 등 (2017) Curr . Opin . Immunol . 45: 73-81]). 초기 실험(도 19 참고)에서, 본 발명자들은 MVA-OVA-4-1BBL의 종양내 주사가 활성화 마커 CD69, 뿐만 아니라 강화된 증식에 부수적으로 따르는 NK 세포에 대한 세포독성 마커 그랜자임 B도 강하게 상향 조절시킨다는 것을 발견하였다.

4-1BBL-유도된 항-종양 면역 반응에서 NK 세포의 역할을 탐구하기 위해, 본 발명자들은 IL15Rα^-/- 마우스를 이용하였다. IL-15 수용체 알파 서브유닛(IL-15Rα)은, NK 세포의 발달에 매우 중요한 것으로 나타난 다면발현성(pleiotropic) 사이토카인인 IL-15의 고-친화성 결합을 매개한다(문헌[Lodolce 등 (1998) Immunity 9: 669-76]). 야생형 및 IL15Rα-결핍성(IL15Rα ^-/- ) B16.OVA 종양-보유 마우스를 생성하여, MVA-OVA 또는 MVA-OVA-4-1BBL에 의해 종양내 면역화하였다. MVA-OVA가 처리된 마우스는, IL-15Rα의 존재 또는 부재와 무관하게 유사한 치료 효율을 보였다(도 22a). 흥미롭게도, MVA-OVA-4-1BBL을 사용할 때 야생형 마우스(여기에서, 5마리의 마우스 중 3마리가 종양이 감소하였다)에서 관찰된 이점은, MVA-OVA-4-1BBL가 처리된 IL15Rα-결핍성 종양 보유 마우스에서는 완전히 사라졌다(여기에서, 5마리의 마우스 중 한 마리가 종양이 감소하였다; 도 22a 참고). 이러한 결과는 또한 종양 접종 이후 마우스의 생존에도 반영되었다(도 22b).

IL15Rα의 부재는 NK 세포의 발달에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 또한 T 세포 항상성 및 LN 이동을 약화시키고, 마우스에서 CD8 메모리 T 세포를 선택적으로 감소시킨다고 알려져 있다(문헌[Lodolce 등 (1998) Immunity 9: 669-76]). 따라서, 본 발명자들은 또한 이러한 치료에 대한 T 세포 반응을 조사하였다. 이전 데이터와 관련하여, 본 발명자들은 야생형 동물에서 MVA-OVA 종양내(i.t.) 면역화 시에 OVA-특이적인 CD8 T 세포의 유도를 관찰하였는데, 이는 MVA-OVA-4-1BBL에 의해 추가로 증가되었다(도 22c). 그러나, IL15Rα^-/- 마우스에서의 OVA-특이적인 T 세포 반응은, 야생형 마우스에서 발견된 반응과 유사하였다.

본 발명은 임의의 특정 메커니즘 또는 운영 모드에 구속되지 않으나, 이러한 발견은 IL15Rα^-/- 종양 보유 마우스가 종양-특이적인 T 세포 반응을 증가시킬 수 있고, 따라서 4-1BBL-강화된 NK 세포의 활성화 및 기능이 종양내 MVA-OVA-4-1BBL 치료의 치료 효율에 기여한다는 개념을 뒷받침한다는 것을 나타낸다.

실시예 31: MVA -OVA-4- 1BBL에 의한 종양내 면역화에 대한 반응에서의 NK 세포-의존성 사이토카인/케모카인의 특성

NK 세포에서 4-1BBL - 4-1BB 상호작용에 의해 선택적으로 유도된 사이토카인을 식별하기 위해, PBS 또는 5×10⁷ TCID₅₀의 MVA-OVA 또는 MVA-OVA-4-1BBL으로 종양내 처리한 B16.OVA 종양 보유 야생형 또는 IL15Rα^-/- 마우스로부터의 종양 조직에서 사이토카인과 케모카인을 분석하였다.

이전 실험은 다수의 사이토카인과 케모카인이 재조합 MVA의 종양내 주사 6시간 이후 증가되었다는 것을 나타내었다(도 15 및 16). 이러한 실험에서, MVA-OVA-4-1BBL에 의한 종양의 주사는, MVA-OVA에 의한 주사에 비해, 4-1BBL에 의한 자극 시 NK 세포에 의해 생산된다고 알려진 전-염증성 사이토카인 또는 케모카인, 예컨대 IFN-γ, CCL3, 및 CCL5의 생산에서 유의한 증가를 나타내었다(도 23). 이러한 4-1BBL-유도된 증가는 IL15Rα^-/- 마우스에서 완전히 없어졌으며, 이는 MVA-OVA-4-1BBL의 종양내 주사가 주사 6시간 이후 종양 미세환경에서 NK 세포로부터 나온 사이토카인 및 케모카인의 뚜렷한 특성을 유발한다는 것을 입증한다.

실시예 32: MVA - gp70 -4- 1BBL에 비교된, MVA - gp70 - CD40L에 의한 종양내 면역화의 항-종양 효능

Gp70은 다수의 시너지 종양 모델(B16.F10, CT26, MC38, 4T1, EL4, 등)에서 발현되는 종양 자가-항원이며, 상기 모델은 모두 기질(stroma) 및 면역 세포 조성물의 관점에서 구별되는 종양 미세환경(TME)을 나타낸다. 여기에서, 본 발명자들은 B16.F10 종양-보유 마우스의 면역화에서 CD40L 또는 4-1BBL의 종양내 면역화 이외에, 종양 항원 gp70을 암호화하는 MVA의 효능을 시험하였다.

B16.F10 흑색종 세포를 C57BL/6 마우스에 피하 주사하였다. 종양의 크기가 ~50mm³에 이르면, 마우스를 PBS, MVA-gp70, MVA-gp70-4-1BBL, MVA-gp70-CD40L, MVA-4-1BBL, 또는 MVA-CD40L에 의해 종양내 면역화하였고; 결과는 도 24에 나타나있다.

MVA-gp70에 의한 면역화는 일시적이고 약한 종양 성장 조절을 유도하였다. 이러한 항-종양 효과는 바이러스가 CD40L을 발현시킬 때 강화될 수 있었다. 그러나, MVA-gp70-4-1BBL에 의한 종양내 면역화가 가장 강한 치료 효과를 생성하여, 5마리의 치료된 동물들 중 2마리에서 완전한 종양 제거를 발생시켰다(도 24a).

놀랍게도, MVA-gp70-4-1BBL에 의한 치료 이후 종양이 치료된 마우스는, 종양이 있었던 스팟(spot)에서 색소의 상실을 나타내었다(도 24b). 이러한 탈색소증(depigmentation)은 자가면역 질환인 백반증의 표시이며, 자가-반응성 T 세포에 의한 멜라닌 세포 파괴의 결과이다. 이러한 멜라닌 세포의 파괴는 재조합 MVA에 의한 면역계의 활성화가 MVA에 의해 암호화된 TAA에 제한되지 않는다는 것을 암시한다(여기에서, gp70). 오히려, 이것은 다른 항원에 대한 면역계의 활성화를 확대시키며, 이는 에피토프 확산이라고 알려진 현상인데, 더 나은 치료 결과를 제공할 수 있는 더 넓은 면역 반응을 생성한다.

면역화에 의해 유도된 항원-특이적인 T 세포 반응을 평가하기 위해, 제1 면역화 11일 후에 혈액을 채취하여, 항원-특이적인 T 세포의 존재에 대해 분석하였다. MVA-gp70 및 MVA-gp70-CD40L 둘 다, 뿐만 아니라 MVA-CD40L 및 MVA-4-1BBL에 의한 면역화는, 1 내지 2% 범위의 측정가능한 p15E-특이적인 T 세포 반응을 유도하였다(도 24c). 중요하게는, 이 반응은 MVA-gp70-4-1BBL을 제공받은 마우스에서 대폭 증가하였다(>5 배). p15E 펩티드 재자극에 대한 이러한 항원-특이적인 T 세포 반응은, 상이한 치료 그룹들에서의 치료 효율과 관계된다.

실시예 33: MVA - gp70 -4- 1BBL - CD40L의 종양내 면역화의 항-종양 효능

재조합 MVA는 4-1BBL 및 CD40L와 함께 종양 항원 gp70을 발현하도록 생성되었고, B16 흑색종 모델에서 종양내 시험되었다. B16.F10 흑색종 세포를 C57BL/6 마우스에 피하 주사하였다. 종양이 ~50mm³에 이르면, 마우스를 PBS, MVA-gp70, MVA-gp70-4-1BBL, MVA-gp70-CD40L, MVA-gp70-4-1BBL-CD40L, 또는 gp70를 발현하지 않는 상응하는 MVA 제작물에 의해 종양내 면역화시켰다.

MVA-gp70에 의한 면역화는, 일시적이고 유의한 종양 성장 조절을 유도하였다(도 25a). 이 항-종양 효과는 바이러스가 CD40L 또는 4-1BBL을 발현할 때 강화될 수 있었다. 그러나, MVA-gp70-4-1BBL-CD40L에 의한 종양내 면역화는, 가장 강한 치료 효과--5마리의 치료된 동물 중 4마리에서 완전한 종양 제거로 이어졌다(도 25A). 놀랍게도, MVA-gp70-4-1BBL-CD40L가 처리된 4마리의 치유된 마우스 중 3마리는, 실시예 32에서 논의된 바와 같이, 치료에 사용된 종양에서 자가면역 질환 백반증의 표시인 색소의 상실을 나타내었다.

추가로, gp70-특이적인 T 세포 반응은 제1 면역화의 11일 이후 혈액에서 측정되었다. MVA-gp70 및 MVA-gp70-CD40L, 뿐만 아니라 MVA-CD40L 및 MVA-4-1BBL에 의한 면역화는, 1 내지 2% 범위의 측정가능한 종양-특이적인 T 세포 반응을 유발하였고; 이 반응은 MVA-gp70-4-1BBL을 받은 마우스에서 극적으로 증가하였다(>5-배)(도 25b).

종합하면, B16.F10 흑색종 모델에서, 항-종양 효능은 MVA-gp70가 CD40L 또는 4-1BBL 중 어느 하나에 의해 어주번트화되었을 때 강화될 수 있었지만, 훨씬 더 강한 효과는 4-1BBL 및 CD40L이 MVA-gp70-4-1BBL-CD40L에서 함께 발현되었을 때 관찰되었다.

실시예 34: CT26.WT 종양에서 MVA - gp70 -4- 1BBL - CD40L에 의한 종양내 면역치료

이후, 제작물은 T 세포 및 골수 세포에 풍부하다고 기재되고, 면역원성이 있다고 간주된 CT26 결장 암종 모델을 사용하여 시험하였다(예를 들어, 문헌[Mosely 등 (2016) 암 Immunol. Res. 5: 29-41] 참고). Balb/c 마우스에 CT26.wt 결장 암종 세포를 피하(s.c.) 주사하였다. 종양이 ~60 mm3에 이르면, 마우스를 PBS, MVA-gp70, MVA-gp70-4-1BBL, MVA-gp70-CD40L, MVA-gp70-4-1BBL-CD40L, 또는 MVA-4-1BBL-CD40L로 종양내 면역화하였다.

MVA-gp70에 의한 i.t. 면역화는 일시적이고 유의한 종양 성장 조절을 유발하였다. 이러한 항-종양 효과는, MVA가 CD40L을 발현시킬 때는 강화되지 않았으나, 놀랍게도, MVA-gp70-4-1BBL에 의한 면역화는 모든 치료된 동물들에서 완전한 종양 제거를 발생시키는 가장 강한 치료 효과로 이어졌다(도 26a). 그러나, MVA-gp70-4-1BBL-CD40L에 의한 치료는 더 나은 치료 효율을 가져오지는 않았다. 중요하게는, 상호-자극성 분자만을 함유하고 gp70을 함유하지 않은 바이러스도, 또한 유의한 종양 성장 지연을 가져오나, MVA-gp70-4-1BBL과는 경쟁이 될 수 없었다. 이러한 발견은 처리된 마우스의 전체 생존에 반영되었다(도 26b).

H2-Ld CD8+ T 세포 에피토프 AH-1에 대한 Gp70-특이적인 T 세포 반응은, MVA-gp70 및 MVA-gp70-CD40L을 처리한 동물의 혈액에서 용이하게 탐지되었다(도 26c). 이 반응은 MVA-gp70-4-1BBL을 받은 마우스에서 극적으로 증가하였고(>10 배), 이는 도 26a 및 26b에서 나타난 치료 효율과 관련된다. MVA-gp70-4-1BBL-CD40L에 의한 치료는, 또한 혈액 내 AH-1-특이적인 T 세포 반응을 강화시켰다(도 26c).

실시예 35: B16.F10 종양 보유 마우스에 대한 MVA - gp70 -4- 1BBL - CD40L의 IT 주사 이후, 종양 미세환경 및 종양 주변 LN의 포괄적인 분석

상기 제시된 데이터는, MVA-gp70-4-1BBL-CD40L에 의한 B16.F10 종양-보유 마우스의 종양내 치료가 처리된 마우스의 80%에서 종양을 줄여준다는 것을 나타내었다(tumor rejection)(도 26 참고). 이 종양 모델에서 종양 미세환경(TME) 및 TdLN를 연구하기 위해, B16.F10 종양-보유 마우스에 PBS, 또는 5×10⁷ TCID50의 MVA-gp70, MVA-gp70-4-1BBL, MVA-gp70-CD40L 또는 MVA-gp70-4-1BBL-CD40L 중 어느 하나를 종양내(i.t.) 제공하였다. 프라임 면역화의 3일 이후, 마우스를 희생시켰다. 3일은 그 시점에서의 면역계의 선천성 및 적응성 요소 둘 다에서 변화를 나타낸 OVA 시스템에서의 이전 실험에 기초하여 선택되었다(도 17 참고). 유세포 측정을 사용하여 단일 세포를 분석하기 위해, 종양 및 TdLN을 제거하여, 콜라게나제/DNase로 소화시켰다. 면역 세포 집단의 풍부함, 뿐만 아니라 이들의 증식 거동과 기능 상태를 평가하였다.

4-1BBL- 및 CD40L-어주번트화 MVA의 종양내 주사는, 오량체 염색에서 결정된 바와 같이, 3일 시점에서 종양내의 CD8 T 세포 또는 p15E-특이적인 T 세포의 수에 대해 장점을 부여하지 않았다. 그러나, TdLN에서, MVA-gp70 및 MVA-gp70-CD40L은 CD8 T 세포를 확대시켰으나, 반면 4-1BBL의 첨가는 심지어 더 큰 효과를 생성하였다(도 27, 우측 상부). 4-1BBL의 첨가에 의해 생성된 증가는, TdLN에서 p15E-특이적인 CD8 T 세포에 대해 훨씬 더 현저하였고, 이에 대해 MVA-gp70-4-1BBL 또는 MVA-gp70-4-1BBL-CD40L 중 어느 하나에 의한 i.t. 면역화는 종양-특이적인 CD8 T 세포를 증가시켰다(도 27, 우측 중간). p15E-특이적인 CD8 T 세포의 수는 또한 이들 세포의 증식 상태와도 관련되며; 예를 들어, MVA에 대한 gp70 및 선택적으로 CD40L와 함께 4-1BBL의 첨가는, TdLN에서 최고 수의 Ki67+ gp70-p15E CD8 T 세포를 유발하였다(도 27, 우측 하부).

이러한 데이터들은, MVA-gp70에 의한 종양내(i.t.) 면역화가 종양 및 종양 주변 림프절에서의 치료 3일 후, 적응성 면역 반응의 생성을 강화시키지만, 4-1BBL 또는 4-1BBL 플러스 CD40L에 의한 어주번트화는 TdLN에서 p15E-특이적인 CD8 T 세포 반응을 특이적으로 증가시킨다는 것을 입증한다.

실시예 36: MVA의 종양내 주사 이후 종양 및 TdLN에서의 NK 세포의 유발

MVA-OVA의 종양내(i.t.) 주사는 1일차 및 3일차에 각각 NK 세포를 활성화 및 확대시켰다(도 19). 이후 본 발명자들은 상이한 MVA 제작물에 의한 주사의 3일 이후NK 세포 침윤, 활성화 및 확대를 평가하였다. 재조합 MVA에 의한 i.t. 면역화 이후 NK 세포의 정량화는, 종양(도 28, 상부 좌측) 및 TdLN을 침유하는 NK 세포가 증가함을 나타내었다(도 28, 우측 상부). 침윤은 MVA가 4-1BBL를 암호화할 때 증가되었다(예를 들어, MVA-gp70-4-1BBL 및 MVA-gp70-4-1BBL-CD40L). MVA-gp70의 종양내(i.t.) 주사는 종양내 NK 세포 (Ki67+)의 증식(도 28, 중간 좌측 참고) 및 TdLN (도 28, 우측 중간)를 유발하고, 4-1BBL 또는 4-1BBL 및 CD40L에 의한 어주번트화은 TdLN에서 이 효과를 강화시킨다.

그랜자임 B는 NK 세포의 세포독성의 마커이다(예를 들어, 문헌[Ida 등 (2005) Mod. Rheumatol. 15: 315-22] 참고). 그랜자임 B+ NK 세포는 재조합 MVA에 의한 종양내 주사 이후, 종양 및 TdLN에서 유도되었다(도 28, 좌측 하부). 다시, 재조합 MVA에 대한 4-1BBL 또는 4-1BBL-CD40L의 첨가는 TdLN에서 세포독성 NK 세포의 수를 약간 증가시켰다(도 28, 우측 하부).

모두 합쳐, 이러한 데이터들은 종양내(i.t.) 면역치료 이후, NK 세포 및 TAA-특이적인 T 세포의 확대 및 기능에서 MVA-암호화 4-1BBL-CD40L의 유의한 역할을 부각하였다. 따라서, gp70 및 4-1BBL 또는 gp70, 4-1BBL, 및 CD40L을 암호화하는 재조합 MVA에 의한 종양내 치료는, 내재성 레트로바이러스 자가-항원, 예컨대 gp70에 대한 T 세포 반응을 강화할 수 있다.

실시예 37: CT26.WT 종양-보유 마우스에서 MVA - gp70 -4- 1BBL - CD40L에 의한 정맥내 면역치료

상기 논의된 실험은 상호 자극성 분자 4-1BBL 및 CD40L과 함께 종양 항원 gp70을 암호화하는 신규한 MVA 제작물은, 종양내 적용될 때 매우 강력하다는 것을 나타내었다(도 25 및 26). 추가로, 문헌[Lauterbach 등 ((2013) Front. Immunol . 4: 251)]은, MVA-암호화 CD40L이 정맥내 제공될 때 선천성 및 적응성 면역 반응을 강화시킨다는 것을 발견하였다. 여기에서, 본 발명자들은 MVA-gp70-4-1BBL-CD40L에 의한 정맥내 (i.v.) 면역화도 또한 종양 성장 조절을 제공할 수 있는지 의문을 가졌다.

CT26.WT 결장 암종 세포를 Balb/c 마우스에 피하 주사하였다. 종양이 ~60 mm3에 이를 때, 마우스를 PBS, 또는 MVA-Gp70, MVA-Gp70-4-1BBL, MVA-Gp70-CD40L, MVA-gp70-4-1BBL-CD40L, 및 (gp70가 결핍된) MVA-4-1BBL-CD40L에 의해 정맥내 면역화시켰다. MVA-gp70에 의한 I.v. 면역화는, 5마리의 동물들 중 2마리에서 종양 제거로 이어졌다 (도 29A). 4-1BBL 또는 CD40L를 함유하는 gp70-발현 바이러스에 의해 처리된 마우스는, 각각 치유된 마우스 5마리 중 3마리, 그리고 5마리 중 4마리에서 강하게 개선된 항-종양 반응을 나타내었다. 중요하게는, MVA-gp70-4-1BBL-CD40L에 의한 i.v. 치료는, 모든 처리된 마우스에서 종양 성장 조절이 연장시켰고, 5마리의 마우스 중 3마리는 종양을 감소시켰다(도 29a). 중요하기는, 단지 상호-자극성 분자만을 함유하고 gp70은 함유하지 않은 재조합 MVA도, 또한 유의한 종양 성장 지연을 유발하였으나, MVA-gp70-4-1BBL, MVA-gp70-CD40L 또는 MVA-gp70-4-1BBL-CD40L에 의해 관찰된 것과 동일한 종양 감소로는 이어지지 않았다(도 29a). 이러한 발견은 처리된 마우스의 전체 생존에 반영되었다(도 29b).

PBL의 펩티드 재자극에 의한 혈액 내 종양-유도 CD8 T 세포 반응의 분석은, 모든 MVA 치료 그룹에서 AH1-특이적인 CD8 T 세포의 유의한 유도를 나타내었고, 이로 인해 이것은 CD40L(즉, MVA-gp70-CD40L 및 MVA-gp70-4-1BBL-CD40L)의 존재 하에서 추가로 증가될 수 있었다(도 29c).

실시예 38: HERV -K 항원을 포함하는 재조합 MVA

MVA-기반 벡터(또한 "MVA-HERV-Prame-FOLR1-4-1-BBL-CD40L"로도 지칭되는 "MVA-mBN489")는, 인간의 내재성 레트로바이러스(HERV-K), 특히, ERV-K-env 및 ERV-K-gag의 K 슈퍼패밀리의 단백질인 TAA를 포함하도록 디자인된다. MVA는 또한 인간 FOLR1 및 PRAME를 암호화하여, h4-1BBL을 발현하거나, hCD40L을 발현하거나; 또는 h4-1BBL 및 hCD40L을 둘 다 발현하도록 디자인된다.

실시예 39: 브라큐리 항원을 암호화하는 MVA에 의한 종양내 면역화

매우 약독화된 비-복제 배시니아 바이러스 MVA-BN-브라큐리는, 4개의 인간 전달유전자로 이루어지도록 디자인되어, 다양한 암에 대한 특이적이고 굳건한 면역 반응을 유도한다. 벡터는 브라큐리 인간 TAA 및 3개의 인간 상호 자극성 분자: (또한, CD80으로도 알려진) B7.1, (ICAM-1, 또한 CD54로도 알려진) 세포내 접착 분자-1, 및 (LFA-3, 또한 CD58로도 알려진) 백혈구 기능-관련 항원-3을 공동-발현한다. 3개의 상호 자극성 분자 (또는 상호 자극성 분자의 TRIad, TRICOM™)가 포함되어, 브라큐리 인간 TAA에 대한 면역 반응을 최대화한다.

브라큐리는 T-박스 패밀리의 전사 인자이며, 암 진행과 관련된 과정인 EMT의 유발자이다. 이는 정상 조직에 비해 암 세포에서 과다발현되며, 몇몇 치료 양상 및 전이 잠재성에 대한 암 세포 내성과 연관된다. 브라큐리를 발현시킨다고 알려진 암은, 폐, 유방, 난소, 척삭종(chordoma), 전립선암, 결장직장 및 췌장 선암종을 포함한다.

시험관내 및 임상적 연구는 브라큐리를 암호화하는 MVA의 안전하고 잠재적인 치료 효율을 입증하기 위해 수행되었다; 예를 들어, 문헌[Hamilton 등 (2013) Oncotarget 4: 1777-90 ("Immunological targeting of tumor cells undergoing an epithelial- mesenchymal transition via a recombinant brachyury -yeast vaccine”)]; 문헌[Heery et al. (2015a) J. Immunother . Cancer 3: 132 (“Phase I, dose escalation, clinical trial of MVA - brachyury - TRICOM vaccine demonstrating safety and brachyury -specific T cell responses”)]; 문헌[Heery et al. (2015b) Cancer Immunol . Res. 3: 1248-56 (“Phase I trial of a yeast-based therapeutic cancer vaccine (GI-6301) targeting the transcription factor brachyury ”)])를 참고한다.

GLP-순응성 반복-용량 독성 연구는 1상 임상 개발에서 정맥내 경로의 사용을 뒷받침하여, NHP (게먹이원숭이(cynomolgus macaques))에서의 MVA-BN-브라큐리 (MVA-mBN240B)의 임의의 잠재적 독성을 평가하기 위해 실시되었다. 독성 연구는 NHP에서 MVA-BN-브라큐리의 공간적 및 시간적 분포를 평가하는 생체분포 부위를 포함한다.

MVA-BN-브라큐리는, 암 환자들이 선택적으로 다른 치료, 예컨대, 예를 들어, 방사선 및/또는 면역관문 억제제와 함께, MVA의 종양내 주사에 의해 치료를 받는 III 상 임상시험에서 사용된다.

본원에 기재된 상기 방법 또는 조성물의 정확한 세부 사항이, 기재된 본 발명의 사상을 벗어나지 않고도 변화되거나 변형될 수 있다는 것은 명백할 것이다. 본 발명자들은 이하의 청구항의 범주와 사상 내에 속하는 모든 이러한 변형 및 변화를 청구한다.

서열 목록

첨부되는 서열 목록에 열거된 핵산 및 아미노산 서열은, 뉴클레오티드 염기에 대해서는 표준 글자 약어(standard letter abbreviation)로, 아미노산에 대해서는 한 글자 코드 또는 3글자 코드를 사용하여 나타나 있으며, 이는 37 C.F.R. 1.822에서 정의된 바와 같다. 각각의 핵산 서열의 단지 한 가닥만이 나타나 있으나, 상보적 가닥은 제시된 가닥에 대한 임의의 참고에 의해 포함된 것으로 이해된다.

서열 목록 내의 서열:

서열번호:1: NCBI RefSeq NP_000065.1.로부터의 hCD40L 아미노산 서열(261개 아미노산)

서열번호:2: NCBI RefSeq NP_000065.1로부터의 hCD40L(792개 뉴클레오티드)

서열번호:3: NCBI RefSeq NP_003802.1로부터의 h4-1BBL(254개 아미노산)

서열번호:4: NCBI RefSeq NP_003802.1로부터의 h4-1BBL

서열번호 1

NCBI RefSeq NP_000065.1.로부터의 hCD40L (261개 아미노산)

서열번호 2

NCBI RefSeq NP_000065.1.로부터의 hCD40L (792개 뉴클레오티드)

nt-서열:

SEQUENCE LISTING <110> Bavarian Nordic A/S <120> Therapy for Treating Cancer with an Intratumoral and/or Intravenous Administration of a Recombinant MVA Encoding 4-1BBL (CD137) and/or CD40L <130> BNIT0014PCT <150> EP 18207238.9 <151> 2018-11-20 <150> US 62/807,720 <151> 2019-02-19 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45 Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60 Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys 85 90 95 Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110 Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser 115 120 125 Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140 Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln 145 150 155 160 Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr 165 170 175 Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser 180 185 190 Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His 210 215 220 Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255 Gly Leu Leu Lys Leu 260 <210> 2 <211> 792 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgatcgaga catacaacca gacaagccct agaagcgccg ccacaggact gcctatcagc 60 atgaagatct tcatgtacct gctgaccgtg ttcctgatca cccagatgat cggcagcgcc 120 ctgtttgccg tgtacctgca cagacggctg gacaagatcg aggacgagag aaacctgcac 180 gaggacttcg tgttcatgaa gaccatccag cggtgcaaca ccggcgagag aagtctgagc 240 ctgctgaact gcgaggaaat caagagccag ttcgagggct tcgtgaagga catcatgctg 300 aacaaagagg aaacgaagaa agagaactcc ttcgagatgc agaagggcga ccagaatcct 360 cagatcgccg ctcacgtgat cagcgaggcc agcagcaaga caacaagcgt gctgcagtgg 420 gccgagaagg gctactacac catgagcaac aacctggtca ccctggagaa cggcaagcag 480 ctgacagtga agcggcaggg cctgtactac atctacgccc aagtgacctt ctgcagcaac 540 agagaggcca gctctcaggc tcctttcatc gccagcctgt gcctgaagtc tcctggcaga 600 ttcgagcgga ttctgctgag agccgccaac acacacagca gcgccaaacc ttgtggccag 660 cagtctattc acctcggcgg agtgtttgag ctgcagcctg gcgcaagcgt gttcgtgaat 720 gtgacagacc ctagccaggt gtcccacggc accggcttta catctttcgg actgctgaag 780 ctgtgatgat ag 792 <210> 3 <211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro 1 5 10 15 Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe 35 40 45 Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser 50 55 60 Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp 65 70 75 80 Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val 85 90 95 Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp 100 105 110 Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu 115 120 125 Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe 130 135 140 Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser 145 150 155 160 Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala 165 170 175 Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala 180 185 190 Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala 195 200 205 Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His 210 215 220 Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val 225 230 235 240 Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 245 250 <210> 4 <211> 768 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggaatacg ccagcgacgc ctctctggac cctgaagctc cttggcctcc agctcctaga 60 gccagggctt gtagagtgct gccttgggct cttgtggctg gacttctgct tctgttgctc 120 ctggctgctg cctgcgcagt gtttcttgct tgtccatggg ctgtgtcagg agccagagca 180 tctcctggat ctgccgcttc tcccagactg agagagggac ctgaactgag ccctgatgat 240 cctgctggac tgctcgacct gagacagggc atgtttgccc agctggtggc ccagaatgtg 300 ctgctgattg atggccctct gagctggtac agcgatcctg gacttgctgg cgttagcctg 360 actggaggcc tgagctacaa ggaggacacc aaagaactgg tggtggccaa ggctggcgtg 420 tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg agagtggtgg caggcgaagg atctggatcc 480 gtgtctctgg cactgcatct gcagcctctg agatctgctg ctggtgcagc tgccctggct 540 ctgacagttg atctgcctcc tgcctccagc gaagccagaa acagcgcctt tggcttccaa 600 ggcagactgc tgcacctgtc tgctggccag agactgggag tgcacctcca cacagaagca 660 agagcaagac acgcctggca gcttacacaa ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg 720 acacctgaga ttccagctgg cttgccatct cctcgcagcg agtaatga 768

Claims (32)

1. 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA: modified vaccinia Ankara)를 대상체에 종양내 투여하는 단계를 포함하되, 상기 재조합 MVA의 종양내 투여는 TAA 항원과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-종양내 주사에 비해, 암 종양에서 염증 반응을 강화하고, 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 전체 생존을 증가시키는, 방법.
2. 암 종양을 갖는 대상체에서 종양을 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 대상체에 정맥내 투여하는 단계를 포함하되, 상기 재조합 MVA의 정맥내 투여는 TAA 항원과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-정맥내 주사에 비해, 자연 살해(NK) 세포 반응을 강화시키고, TAA에 특이적인 CD8 T 세포 반응을 강화시키는, 방법.
3. 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 대상체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 재조합 MVA의 투여는 재조합 MVA와 4-1BBL 항원 그 자체의 투여에 비해, 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 전체 생존을 증가시키는, 방법.
4. 대상체의 암 종양에서 강화된 염증 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 제1 이종 종양-관련 항원(TAA)를 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 대상체에게 종양내 투여하는 단계를 포함하되, 상기 재조합 MVA의 종양내 투여는 이종 종양-관련 항원과 4-1BBL 항원을 암호화하는 제1 핵산과 제2 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-종양내 주사에 의해 생성되는 염증 반응에 비해, 종양에서 강화된 염증 반응을 생성하는, 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 TAA는 종양 세포에서 발현되는 내재성 레트로바이러스(ERV) 단백질인, 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 ERV 단백질은 인간의 내재성 레트로바이러스 K (HERV-K) 패밀리 유래이고, HERV-K 외피 단백질 및 HERV-K gag 단백질로부터 선택되는, 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 TAA는 암배아 항원(CEA), 세포 표면 연결된 뮤신 1(MUC-1), 전립선산 포스파타제(PAP), 전립선 특이적인 항원(PSA), 인간 상피 성장인자 수용체 2(HER-2), 서바이빈(survivin), 티로신(tyrosine) 관련 단백질 1(TRP1), 티로신 관련 단백질 1(TRP2), 브라큐리(Brachyury), PRAME, FOLR1, HERV-K-env, HERV-K-gag, p15, MEL 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
9. 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 생존을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 내재성 레트로바이러스(ERV) 단백질을 암호화하는 제1 핵산과 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 재조합 MVA의 투여는 재조합 MVA와 4-1BBL 항원 그 자체의 투여에 비해, 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 전체 생존을 증가시키는, 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 ERV 단백질은 인간의 내재성 레트로바이러스 단백질 K (HERV-K) 패밀리 유래인, 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 레트로바이러스 단백질 K는 HERV-K 외피 단백질 및 HERV-K-gag 단백질로부터 선택되는, 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 재조합 MVA는 CD40L 항원을 암호화하는 제3 핵산을 추가로 포함하는, 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 대상체에게 적어도 하나의 면역 관문 분자 길항제 또는 작용제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 면역 관문 분자 길항제 또는 작용제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 및 ICOS의 길항제 또는 작용제로부터 선택되는, 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 면역 관문 분자 길항제는 항체인, 방법.
16. 암의 치료에 사용되는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)로서, a) 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산; 및 b) 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함하되, 상기 재조합 MVA의 종양내 투여는 상기 재조합 MVA의 비-종양내 주사에 비해, 암 종양의 염증 반응을 강화시키고, 암 종양의 크기를 감소시키고/시키거나, 인간 환자의 전체 생존을 증가시키는, 재조합 MVA.
17. 제16항에 있어서, c) CD40L을 암호화하는 제3 핵산을 추가로 포함하는, 재조합 MVA.
18. 제16항에 있어서, 상기 TAA는 내재성 레트로바이러스(ERV) 단백질인, 재조합 MVA.
19. 제18항에 있어서, 상기 ERV 단백질은 인간의 내재성 레트로바이러스 K (HERV-K) 패밀리 유래이고, HERV-K-env 및 HERV-K-gag로부터 선택되는, 재조합 MVA.
20. 제16항에 있어서, 상기 TAA는 암배아 항원(CEA), 세포 표면 연결된 뮤신 1(MUC-1), 전립선산 포스파타제(PAP), 전립선 특이적인 항원(PSA), 인간 상피 성장인자 수용체 2(HER-2), 서바이빈, 티로신 관련 단백질 1(TRP1), 티로신 관련 단백질 1(TRP2), 브라큐리, FOLR1, PRAME, HERV-K-env, HERV-K-gag, p15, MEL, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 재조합 MVA.
21. 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)로서, 상기 재조합 MVA는: (a) 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산, 및 (b) 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산을 포함하는, 재조합 MVA.
22. 제21항에 있어서, 상기 TAA는 인간의 내재성 레트로바이러스 K(HERV-K) 패밀리 유래의 ERV 단백질인, 재조합 MVA.
23. 제22항에 있어서, 상기 ERV 단백질은 HERV-K env 단백질 및 HERV-K gag 단백질로부터 선택되는, 재조합 MVA.
24. 제23항에 있어서, c) CD40L을 암호화하는 제3 핵산을 추가로 포함하는, 재조합 MVA.
25. (a) 제24항의 재조합 MVA; 및 (b) 적어도 하나의 면역 관문 분자 길항제 또는 작용제를 포함하는, 약학적 조합.
26. 제25항에 있어서, 상기 면역 관문 분자 길항제 또는 작용제는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 및 ICOS의 길항제 또는 작용제로부터 선택되는, 약학적 조합.
27. 암 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 생존을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산, 4-1BBL을 암호화하는 제2 핵산, 및 CD40L을 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 대상체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 재조합 MVA의 투여는 재조합 MVA, 4-1BBL 항원, 및 CD40L 항원 그 자체의 투여에 비해 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 대상체의 전체 생존을 증가시키는, 빙밥.
28. 대상체의 암 종양에서 강화된 염증 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 제1 이종 종양-관련 항원(TAA)을 암호화하는 제1 핵산, 4-1BBL 항원을 암호화하는 제2 핵산, 및 CD40L 항원을 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 대상체에 종양내 투여하는 단계를 포함하되, 상기 재조합 MVA의 종양내 투여는 이종 종양-관련 항원을 암호화하는 제1 핵산, 4-1BBL 항원을 암호화하는 제2 핵산, 및 CD40L 항원을 암호화하는 제3 핵산을 포함하는 재조합 MVA 바이러스의 비-종양내 주사에 의해 생성되는 염증 반응에 비해, 종양에서 강화된 염증 반응을 생성하는, 방법
29. 제27항에 있어서, 정맥내 투여에 의해 대상체에게 상기 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
30. 제27항에 있어서, 종양내 투여에 의해 대상체에게 상기 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
31. 제27항에 있어서, 정맥내 투여 및 종양내 투여에 의해 대상체에게 상기 재조합 변형된 배시니아 안카라(MVA)를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
32. 제31항에 있어서, 상기 정맥내 투여 및 상기 종양내 투여는 상이한 시점인, 방법.

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