CN105079780B - 一种特异结合trb3的多肽在治疗腹主动脉瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物在制备腹主动脉瘤的药物中的应用；所述的多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示序列；所述多肽的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽和/或所述多肽配合药物辅料形成的给药剂型。该多肽是通过表面等离子共振(Biacore)的方法筛选出来，具有与TRB3特异性结合，并能阻断TRB3和P62蛋白结合的能力；同时该肽段的衍生物Pep2‑A2可以治疗血管紧张素II诱导的ApoE敲除小鼠腹主动脉瘤。因此本发明及其衍生物可以作为TRB3新的抑制剂，并可应用于开发抑制腹主动脉瘤的疫苗或药物。

Description

一种特异结合TRB3的多肽在治疗腹主动脉瘤中的应用

技术领域

本发明涉及一种多肽及其衍生物在制备治疗或预防腹主动脉瘤的药物中的应用。

背景技术

腹主动脉瘤指腹主动脉出现向侧面和前后搏动的膨胀性肿块，呈瘤样扩张，通常主动脉直径增大50％以上可定义为动脉瘤。该疾病病变部位具有极高破裂风险，瘤体一旦破裂，常伴有休克表现，死亡率高达78％-92％，严重威胁人类健康。瘤体未破裂时，患者常伴有脐周及中上腹部剧烈疼痛症状，并发动脉粥样硬化、糖尿病、下肢动脉栓塞、肾积水等疾病，严重影响患者生活质量。腹主动脉瘤常见于老年男性，男女发病之比为10：3。目前尚针对腹主动脉瘤的治疗策略十分有限，大多数患者接受高风险和高成本的手术治疗。

大量研究指出，腹主动脉瘤病理的发生发展与炎症因子白介素6、白介素8与氧化应激堆积密切相关。自噬为机体病变的一种重要防御机制，经典的自噬被定义为通过溶酶体途径清除细胞内冗余、错误折叠蛋白以及损伤细胞器，防止氧自由基堆积与炎症。P62是自噬过程中重要的“货车蛋白”。P62蛋白结构域中含有泛素相关结构域(Ubiquitinassociateddomain,UBA)，与泛素化蛋白((Ubiquitin，Ub)结合，作为“货车”将受损细胞器或蛋白募集于自噬小体膜上的LC3，这个过程主要通过P62蛋白的 LIR(LC3-InteractingRegion,LIR)结构域实现，介导泛素化蛋白的降解，同时，P62的表达水平也随之降低。当自噬受到抑制或自噬流被阻断时，P62与其结合的泛素化蛋白不能及时降解，在胞浆内堆积而表达升高。胞浆内P62可与氧化应激形成恶性循环，造成细胞毒性，促进炎症发生发展。

TRB3(TribblesHomologue3)是Tribbles同源蛋白家族成员之一，最早在果蝇中被鉴定到，并发现该蛋白能抑制有丝分裂，调节发育过程中细胞的增殖、迁移及形态形成。在哺乳动物中，有三种Tribbles同源蛋白：TRB1，TRB2和TRB3，它们都是假激酶蛋白家族成员。这三种蛋白都含有Ser/Thr蛋白激酶样结构域 (Kinaselikedomain,KD)，但却缺乏ATP的结合位点和催化残基，因此没有激酶活性。尽管如此，Tribbles蛋白却具有接头蛋白样的功能，参与多种蛋白复合体的组装。在哺乳动物Tribbles家族成员中，TRB3的研究最为深入，其相互作用蛋白包括转录因子、泛素连接酶、细胞膜上II型BMP受体以及MAPK、PI3K信号通路成员。通过与这些蛋白相互作用，TRB3参与了糖脂代谢、脂肪细胞分化、凋亡、应激和胶原表达等的调控。近来多种证据表明，TRB3在腹主动脉瘤相关疾病动脉粥样硬化的发生发展过程中都具有重要的调节作用，提示TRB3可能是治疗腹主动脉瘤及其相关性疾病的潜在靶点。

有研究指出，TRB3与自噬底物p62相互结合，阻断自噬。因此，研究和开发TRB3 蛋白的抑制剂，或者阻断其与P62蛋白结合的物质，具有很好的恢复自噬流，治疗腹主动脉瘤及其相关性疾病发生和发展的成药前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前缺乏能有效利用的TRB3蛋白抑制剂的现状，而提供一种能特异性结合TRB3的多肽及其在制备治疗或预防腹主动脉瘤类药物中的应用。

本发明的发明人在研究的过程中发现，在腹主动脉瘤病变部位以及血管紧张素II刺激的主动脉平滑肌细胞中，发现自噬经典指标LC3I向LC3II转化，表明自噬上游信号的激活。发明人还进一步发现TRB3的表达量升高，与p62发生相互作用，阻断了自噬流，造成腹主动脉瘤病变部位蛋白、炎症因子与氧化应激的堆积。基于发明人的研究工作，本发明提供下述技术方案。

本发明提供的技术方案是：一种可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物在制备治疗或预防腹主动脉瘤的药物中的应用；

所述的多肽的氨基酸序列为如SEQIDNO：1所示序列；

所述多肽的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽。

本发明中，所述的如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列中，可适当引入氨基酸替换，缺失或添加，只要改变后的氨基酸序列仍然能够形成能与TRB3特异性结合的多肽且该多肽仍然保持改变前的活性即可。

本发明中，所述的细胞穿膜肽为本领域常规所述的细胞穿膜肽，只要其能辅助将所述多肽送入细胞以发挥作用即可，一般而言，所述的细胞穿膜肽为由10～30个氨基酸组成的短肽分子。所述的细胞穿膜肽较佳地为Pep2多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO： 2所示；即在本发明中，所述的多肽衍生物较佳地为以Pep2多肽连接如SEQIDNO：1所示序列中的嵌合多肽。所述的细胞穿膜肽还可以为HIV-1病毒反转录激活因子 (Trans-activatortranscription，Tat)蛋白的TAT肽(YGRKKRRQRRR，其氨基酸序列如 SEQID：3所示)、果蝇触角同源异型蛋白的转录因子Antp肽(RQIKIWFQNRRMKWKK，其氨基酸序列如SEQID：4所示)、Pep-1肽(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV，其氨基酸序列如SEQID： 5所示)、MPG肽(GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV，其氨基酸序列如SEQID：6所示)和 RGD肽(Arg-Gly-Asp，其氨基酸序列如SEQIDNO:7所示)中的任一种或多种。所述细胞穿膜肽较佳地连接在所述多肽的N端或者C端，更佳的是N端。

本发明所述的多肽及其衍生物可以作为活性成分用于制备预防或治疗腹主动脉瘤的药物。所述的“活性成分”是指具有预防或治疗腹主动脉瘤功能的化合物，即所述多肽或所述多肽的衍生物用于制备预防或治疗腹主动脉瘤的药物。在该药物中，所述多肽或所述多肽的衍生物可以单独作为活性成分，也可以和其他化合物一起作为活性成分。

本发明中，所述的药物可以包含生理学或药学上可接受的载体，所述的载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料，较佳地选自壳聚糖及其衍生物、卡波姆和脂质体中的一种或多种。因此，在本发明中，所述的多肽或所述多肽的衍生物较佳地与所述药物辅料组成药物组合物。所述的药物组合物可以为本领域常规所述的各种剂型，较佳地是固体、半固体或液体的形式，可以是水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地是片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。所述药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药，所述注射给药较佳地包括：静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射途径给药。

本发明所述的药物组合物在治疗时的使用剂量根据患者的年龄和病情而定，使用剂量较佳地为0.1～15mg/kg，更佳地为5～10mg/kg，最优选为5mg/kg，给药次数较佳地为一天一次或数次。

本发明中，所述的腹主动脉瘤为本领域常规所指的病理状态，包括：(1)腹主动脉直径增大，呈瘤样，(2)炎症因子白介素6高度表达，3)炎症因子白介素8高度表达， (4)氧化应激堆积，(5)细胞凋亡指标cleavedcaspase3高度表达。

在符合本领域常识的基础上，上述的各优选条件可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料除特别说明之外，均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明的多肽或多肽衍生物能够特异性地与TRB3结合，从而阻断TRB3与P62蛋白的相互作用，恢复自噬流，该肽段的衍生物Pep2-A2可以治疗血管紧张素II诱导的ApoE敲除小鼠腹主动脉瘤，具有非常显著的疗效。

附图说明

图1为用表面等离子共振方法验证多肽A2与蛋白TRB3的动力学结合曲线。其中右图为A2和TRB3的结合曲线。

图2为用酶联免疫吸附法(ELISA)验证多肽A2与蛋白TRB3的结合直方图。中阳性对照为P62蛋白,阴性对照为牛血清白蛋白BSA。

图3为用竞争酶联免疫吸附法(ELISA)验证多肽A2竞争TRB3和P62蛋白结合的直方图。其中对照为TRB3与P62的结合直方图，A2代表加入多肽A2后TRB3与P62的结合直方图。

图4为用免疫共沉淀的方法验证在细胞水平多肽A2的衍生物Pep2-A2对蛋白TRB3和P62相互作用的影响。

图5为用H&E染色方法证明相比于瘤旁对照，腹主动脉瘤患者病变部位丢失了血管完整性，，血管中层大量平滑肌细胞丢失。

图6为用免疫印迹方法证明腹主动脉瘤患者病变部位TRB3蛋白表达水平增加，自噬流被阻断。

图7为用激光共聚焦的方法验证P62蛋白与TRB3蛋白的结合。

图8为用免疫印迹方法证明腹主动脉瘤患者病变部位白介素6、8表达水平增加。

图9为用免疫荧光方法证明腹主动脉瘤患者病变部位氧化应激水平增加。

图10为用免疫印迹方法证明腹主动脉瘤患者病变部位凋亡指标cleavedcaspase3表达增加。

图11为免疫印迹方法证明Pep2-A2可恢复血管紧张素II造成的主动脉平滑肌细胞自噬流阻断。

图12为免疫印迹方法证明Pep2-A2可抵抗血管紧张素II上调的主动脉平滑肌细胞白介素6、8表达。

图13为免疫荧光方法证明Pep2-A2可抵抗血管紧张素II上调的氧化应激堆积。

图14为免疫印迹方法证明Pep2-A2可抵抗血管紧张素II上调的凋亡指标cleavedcaspase3表达增加。

图15为超声方法证明Pep2-A2可抵抗血管紧张素II诱发的腹主动脉瘤疾病发生发展。

图16为免疫印迹验证肽段Pep2-A2可以降低血管紧张素II诱导的ApoE敲除小鼠腹主动脉瘤中白介素6、8表达。

图17为免疫荧光方法验证肽段Pep2-A2可以抵抗血管紧张素II诱导的ApoE敲除小鼠腹主动脉瘤中氧化应激堆积。

图18为免疫印迹方法验证肽段Pep2-A2可以抵抗血管紧张素II诱导的ApoE敲除小鼠腹主动脉瘤中凋亡指标cleavedcaspase3表达增加。

术语和简称

本发明中，部分物质的全称或相应的中文名称如下：

AngII：血管紧张素II

ApoEKO：载脂蛋白E敲除

IL,CXCL：白介素

DHE：二氢乙啶

BSA：牛血清白蛋白

DMEM：一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基

SDS：十二烷基硫酸钠

PVDF：聚偏氟乙烯

PBST：PhosphateBufferedSalinewithTween-20,pH7.5,10x，去污缓冲液

ECL：电化学发光

TRB3：Tribbles同源蛋白3

DAPI：聚偏二氟乙烯

PMSF：苯甲基磺酰氟

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中，序列如SEQIDNO：1所示的多肽为A2连接Pep2细胞穿膜肽(Pep2 的氨基酸序列为HLYVSPW，如序列表中SEQIDNO:2所示)后形成的嵌合多肽称为Pep2-A2，上述多肽或嵌合肽均由北京赛百盛基因技术有限公司人工合成。A2通过两个甘氨酸链连接到Pep2的C端。以上嵌合肽的序列结构如下：

Pep2-A2的序列为：

“N”-His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Leu-Thr-Arg-Leu-Leu-Gln-Thr-Lys-“C”(其序列如序列表中SEQIDNO:8所示)。

下述实施例中所述室温如本领域常规所述，一般指15～25℃。

实施例1：用表面等离子共振的方法筛选与TRB3蛋白结合的肽段。

首先将P62蛋白分段截短成不同的多肽片段，用多肽固相合成仪进行肽段合成，此过程由北京赛百盛基因有限公司进行。实施例整个筛选过程在表面等离子共振仪BiacoreT200中进行。

筛选方法如下：

1.将纯化的蛋白TRB3(购自R&D公司)通过氨基偶联到CM5芯片上(购自GE公司)，以10μL/min的流速洗去未结合的蛋白，并且平衡芯片表面2小时。

2.将不同浓度的250μL多肽片段(200,50,12.5,6.25nM)自动进样，整个过程在25℃进行。所使用的缓冲液为HBS-EP缓冲液(0.01MHEPES,0.15MNaCl,3mMEDTA,0.005％表面活性剂)。

3.用BiacoreT200自带分析软件模拟不同浓度多肽与TRB3的结合曲线，得出图1中与TRB3蛋白结合能力较强的肽段A2。A2序列如下：

A2：Gly-Gly-Trp-Leu-Thr-Arg-Leu-Leu-Gln-Thr-Lys

图1中的横坐标为反应时间，单位为秒。纵坐标为反应芯片表面与多

肽的反应强度，单位为RU。结果表明从P62蛋白结构域中截取的肽段中，A2肽段与TRB3蛋白有较高的亲和力。

实施例2：ELISA方法验证肽段A2与蛋白TRB3的结合。

具体操作步骤如下：

1.将人TRB3蛋白及牛血清白蛋白(BSA)用PBS稀释至10μg/ml，每孔添加100μl， 4℃包被96孔ELISA板过夜。

2.用含有0.1％Tween-20PBS洗三次。用200μl封闭液(10％BSA--PBS)包板，37℃包被2h。

3.倒掉包被液，对应加入1μg/ml多肽B1，A2和B3溶液200μl，同时设置阳性对照孔，加入200μl1μg/mlP62蛋白溶液，37℃孵育1h。

4.用含有0.1％Tween-20PBS洗五次。每孔加入100μl用封闭液1：4000稀释后的抗M13单克隆抗体，室温孵育1h。

5.用含有0.1％Tween-20PBS洗六次。配制底物显色液(100mmol/L乙酸钠，PH6.0，每50ml缓冲液加入10μl30％过氧化氢，100μg/mlTMB)，每孔加入100μl，室温孵育5min。每孔加入50μl0.1M稀硫酸，终止反应。

6.结果以样品孔的OD450值绘制柱状图，见图2。

结果表明A2肽段与TRB3蛋白有较高的亲和力。

实施例3：竞争ELISA的方法验证肽段A2可以竞争TRB3与P62蛋白的结合。

具体操作步骤如下：

1.将人TRB3蛋白及BSA用PBS稀释至10μl/ml，每孔添加100μl，4℃包被96 孔ELISA板过夜。

2.用含有0.1％Tween-20PBS洗三次。用200μl封闭液(10％BSA--PBS)包板，37℃包被2h。

3.倒掉包被液，对应加入1μg/mlP62蛋白溶液200μl，37℃孵育

1h。

4.用含有0.1％Tween-20PBS洗五次。每孔加入100μl用封闭液稀的辣根过氧化氢酶标记的多肽A2，室温孵育1h。

5.用含有0.1％Tween-20PBS洗六次。配制底物显色液(100mmol/L乙酸钠，PH6.0，每50ml缓冲液加入10μl30％过氧化氢，100μg/mlTMB)，每孔加入100μl，室温孵育5min。每孔加入50μl0.1M稀硫酸，终止反应。

6.结果以样品孔的OD450值绘制柱状图，见图3。

结果表明A2肽段可以竞争P62蛋白与TRB3蛋白的结合。

实施例4：免疫共沉淀的方法验证肽段Pep2-A2可以在细胞水平竞争蛋白p62与蛋白TRB3的结合。

将肽段A2连接上细胞穿膜肽Pep2(序列为HLYVSPW)，组成新的衍生物Pep2-A2，此肽段由赛百盛基因技术有限公司进行合成，纯度>98％。

免疫共沉淀试剂如下：

裂解液A液：0.6057gTris碱，1.7532gNaCl，0.1017gMgCl2·6H2O，0.0742gEDTA，10mL甘油，10mL10％NP40，加去离子水至150mL，用盐酸调pH值至7.6，定容至191mL，充分混匀，使用0.45μm滤膜过滤，4℃储存。

裂解液B液：200μL2Mβ-磷酸甘油，4mL2.5MNaF，2mL100mMNaVO3，2mL100mMPMSF，200μL1MDTT，1mg/mL的Leu、Pep、Apr各200μL，总体积共9mL。母液于-20℃储存。使用前，将B液中各成分的母液解冻，分别按上述组成比例加入A液中并混匀。

ProteinA/GPlus-Agarose购自美国Santacruz公司。

具体操作步骤如下：

1.将肝癌HepG2细胞铺90mm大皿，待细胞贴壁后加入1mg/ml的多肽Pep2-A2，孵育12小时后收集细胞。

2.以免疫共沉淀裂解液裂解细胞，收获细胞总蛋白约4-10mg，将各组蛋白调整至相同浓度。每组蛋白各取200μg，留作细胞裂解液Input作为对照。

3.剩余蛋白加入2μgP62抗体或者与P62抗体种属相同的NormalIgG，同时加入 10μLProteinA/GPlus-Agarose充分重悬，4℃缓慢旋转摇动过夜。4℃、3000rpm离心 5min，小心吸除上清，宁可留下少量上清也不能吸到Agarose。加入0.5mL免疫共沉淀洗液，混匀，冰浴静置1min，4℃、3000rpm离心30sec，小心吸除上清。重复洗涤5 次，最后一次离心前静置5min。小心吸除上清，加入20-30μL2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀，95℃变性3min，迅速转移至冰浴冷却。12000rpm室温离心2min，上清即为沉淀的蛋白样品，取部分或全部进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

结果如图4所示，细胞穿膜肽将肽段A2带入细胞后可以明显抑制TRB3蛋白与P62蛋白的结合。

实施例5：获取腹主动脉瘤患者瘤旁对照与病变部位组织(由北京安贞医院提供)，并获取腹主动脉瘤患者瘤旁对照与病变部位的石蜡切片，进行苏木素&伊红(H&E)染色 (由北京雪邦科技有限公司实施)。使用光学显微镜观察与拍照，标尺＝50微米。

结果如图5所示，相比于瘤旁对照，腹主动脉瘤患者血管中层病变部位破碎，表明大量平滑肌细胞丢失。

实施例6：用免疫印迹方法证明腹主动脉瘤患者病变部位TRB3蛋白表达水平增加，自噬流被阻断。

具体操作步骤如下：

(1)用小剪刀剪碎并裂解腹主动脉瘤患者瘤旁对照与病变部位组织，并于4℃、12000rpm离心30min，小心收取除上清；

(2)调整蛋白浓度相同，按体积比4：1加入5xloadingbuffer(购自北京普利莱基因有限公司，即5xSDS-PAGE非还原性蛋白上样缓冲液B1030)

(3)上样至SDS电泳凝胶，电泳后，取胶，使用电转仪将蛋白转至PVDF膜。

(4)使用10％BSA封闭，按抗体说明书比例分别加入稀释特异性抗TRB3、LC3II、p62一抗(购自美国CST公司)，4℃孵育12h。

(5)使用PBST在摇床中室温洗涤6x8min，按说明书比例稀释辣根酶标记的二抗，室温孵育2h。

(6)使用PBST在摇床中室温洗涤6x8min。

(7)使用ECL发光液曝光，使用ECL4000(购自北京普利莱基因有限公司，SuperECLPlus超敏发光液P1010)成像。以GAPDH(购自美国CST公司)作为内参，GAPDH 斑块灰度一致表明细胞总蛋白数目一致。

结果如图6所示，与瘤旁对照相比，腹主动脉瘤患者病变部位TRB3、LC3II指标灰度显著增加，同时自噬底物p62灰度显著增加，说明TRB3、LC3II、p62的蛋白水平增加，表明自噬流损伤。

实施例7：用激光共聚焦的方法验证P62蛋白与TRB3蛋白的结合。

具体操作如下：

(1)获取腹主动脉瘤患者瘤旁对照与病变部位的冰冻切片(由北京雪邦科技有限公司实施)。

(2)PBS洗5遍。

(3)用TRB3和P62一抗4℃孵育过夜。

(4)次日PBS洗5遍。

(5)用特异性二抗(购自北京中衫金桥有限公司)，37度孵育半小时，PBS洗5遍。

(6)用含有抗淬灭剂的DAPI(购自北京中衫金桥有限公司)封片。

(7)待片子风干后用激光共聚焦显微镜扫描TRB3蛋白与P62蛋白之间的共定位，结果见图3，标尺＝18.75微米。

结果如图7所示，与瘤旁对照相比，腹主动脉瘤患者病变部位大量TRB3蛋白与P62蛋白存在明显的共定位。其中图3第一列图代表TRB3的染色，第二列图代表P62的染色，第三列图代表DAPI的染色(标记细胞核的燃料)，第四列图代表TRB3和P62、DAPI 重叠后的染色。

实施例8：用免疫印迹方法证明腹主动脉瘤患者病变部位白介素6、8表达水平增加。

组织处理具体操作步骤同实施例6，免疫印迹操作步骤中，一抗选用抗白介素6、 8的特异性一抗(购自美国R&D公司)，其余具体操作步骤同实施例6。

结果如图8所示，与瘤旁对照相比，腹主动脉瘤患者病变部位介素6、8灰度显著增加，表明表达水平增加，炎症水平增高。

实施例9：用免疫荧光方法证明腹主动脉瘤患者病变部位氧化应激水平增加。

具体操作如下：

(1)腹主动脉瘤患者瘤旁对照以及病变部位的冰冻切片获取方法同实施例7，切片PBS洗5遍。

(3)用氧化应激探针DHE(购自威格拉斯生物技术有限公司)室温孵育20min。

(4)PBS洗5遍。

(5)用含有抗淬灭剂的DAPI(购自北京中衫金桥有限公司)封片。

(7)待片子风干后用激光共聚焦显微镜扫描，使用Image-ProPlus6.0分析荧光强度，数据用X±SD表示，t检验统计分析各组差异显著性，由SPSS13.0统计软件分析，并使用Sigmaplot8.0作柱状图，结果见图4。

结果如图9所示，与瘤旁对照相比，腹主动脉瘤患者病变部位大量氧化应激堆积。

实施例10：用免疫印迹方法证明腹主动脉瘤患者病变部位凋亡指标cleavedcaspase3表达水平增加。

组织处理具体操作步骤同实施例6，免疫印迹操作步骤中，一抗选用抗cleavedcaspase3的特异性一抗(购自美国CST公司)，其余具体操作步骤同实施例6。

结果如图10所示，与瘤旁对照相比，腹主动脉瘤患者病变部位cleavedcaspase3灰度显著增加，表明表达水平增加，出现细胞凋亡。

实施例11：免疫印迹方法证明Pep2-A2可恢复血管紧张素II造成的主动脉平滑肌细胞自噬流阻断。

具体操作如下：

(1)将人主动脉平滑肌细胞T/GHA-VSMC(购自美国ATCC公司)铺至六孔板。

(2)培养24小时后，使用100nmol/LAngII刺激细胞(购自美国SigmaAldrich公司)。

(3)培养24小时后，使用5MPep2-A2继续培养24小时。

(4)收取细胞。

(5)提取蛋白与免疫印迹方法同实施例6。

结果如图11所示，血管紧张素II造成的主动脉平滑肌细胞中，TRB3、LC3、p62 灰度显著增加，与此相比，肽段Pep2-A2处理可以降低TRB3、p62的灰度，升高LC3 的灰度，表明Pep2-A2可降低显著上调血管紧张素II处理的主动脉平滑肌细胞LC3II 水平，下调p62聚集，说明恢复自噬流。

实施例12：为免疫印迹方法证明Pep2-A2可抵抗血管紧张素II上调的主动脉平滑肌细胞白介素6、8表达。

细胞培养与加入AngII、Pep2-A2刺激方法同实施例11，提取蛋白与免疫印迹方法同实施例8。

结果如图12所示，血管紧张素II造成的主动脉平滑肌细胞中，白介素6、8灰度显著增加，与此相比，肽段Pep2-A2处理可以降低白介素6、8的灰度，表明Pep2-A2 可降低显著下调血管紧张素II处理的主动脉平滑肌细胞白介素6、8水平，说明炎症的降低。

实施例13：免疫荧光方法证明Pep2-A2可抵抗血管紧张素II上调的氧化应激堆积。

(1)将对数生长期T/GHA-VSMC细胞铺预先放圆玻片(多聚赖氨酸处理)的12孔板。

(2)细胞培养与加入AngII、Pep2-A2刺激方法同实施例5。

(3)免疫荧光方法同实施例9。

结果如图13所示，直方图高度显示ROS的强度，肽段Pep2-A2可以显著降低血管紧张素II上调的氧化应激堆积。

实施例14：为免疫印迹方法证明Pep2-A2可抵抗血管紧张素II上调的主动脉平滑肌细胞凋亡指标cleavedcaspase3表达。

细胞培养与加入AngII、Pep2-A2刺激方法同实施例11，提取蛋白方法同实施例6。免疫印迹操作步骤中，一抗选用抗cleavedcaspase3的特异性一抗(购自美国CST公司)，其余具体操作步骤同实施例6。

结果如图14所示，血管紧张素II造成的主动脉平滑肌细胞中，cleavedcaspase3灰度显著增加，与此相比，肽段Pep2-A2处理可以降低cleavedcaspase3灰度，表明Pep2-A2可降低显著下调血管紧张素II处理的主动脉平滑肌细胞凋亡指标 cleavedcaspase3水平，说明凋亡的降低。

实施例15：超声方法验证肽段Pep2-A2可以降低血管紧张素II诱导的ApoE敲除小鼠腹主动脉瘤发生率。

模型制备具体方法参照文献“Regressionofabdominalaorticaneurysmbyinhibitionofc-JunN-terminalkinase,K oichiYoshimura,HirokiAoki,etal,NatureMedicine-11,1330-1338(2005)”。60只 C57BL/6JApoE敲除小鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)饲养至24周龄后分为三组，空白对照组10只，模型组小鼠25只，给药组25只。于小鼠背部植入含有生理盐水或AngII的Alzetosmoticminipumps(购于美国ALZAScientificProducts公司)4 周，其中空白对照组小鼠接受1,000ng/min/kg的生理盐水，模型组小鼠接受 1,000ng/min/kg的AngII，给药组小鼠在接受1,000ng/min/kg的AngII同时每周通过腹腔注射方式给予剂量5mg/kgTRB3pepA2。小鼠28周龄时使用超声方法计算血管直径，处死小鼠，取主动脉，观察腹主动脉瘤发生率。

结果如图15所示，肽段Pep2-A2可以显著降低血管紧张素II诱导的ApoE敲除小鼠腹主动脉瘤发生率与血管直径。

实施例16：免疫印迹验证肽段Pep2-A2可以降低血管紧张素II诱导的ApoE敲除小鼠腹主动脉瘤中白介素6、8表达。

小鼠造模方法具体操作步骤同实施例15。

蛋白提取具体操作步骤同实施例6。免疫印迹操作步骤中，一抗选用抗白介素6、 8的特异性一抗(购自美国R&D公司)，其余具体操作步骤同实施例6。

结果如图16所示，免疫印迹验证肽段Pep2-A2可以降低腹主动脉瘤中白介素6、8表达。

结果如图16所示，血管紧张素II诱导的ApoE敲除小鼠主动脉中，白介素6、8 灰度显著增加，与此相比，肽段Pep2-A2处理可以降低白介素6、8的灰度，表明Pep2-A2 可降低显著下调血管紧张素II处理的ApoE敲除小鼠主动脉主动脉白介素6、8水平，说明炎症的降低。

实施例17：免疫荧光方法验证肽段Pep2-A2可以抵抗血管紧张素II诱导的ApoE 敲除小鼠主动脉中氧化应激堆积。

冰冻切片获取方法同实施例7，免疫荧光方法同实施例9。

结果如图17所示，直方图高低表明氧化应激强度，免疫荧光方法验证肽段Pep2-A2可以降低血管紧张素II诱导的ApoE敲除小鼠腹主动脉瘤中氧化应激。

实施例18：为免疫印迹方法证明Pep2-A2可抵抗血管紧张素II上调ApoE敲除小鼠的主动脉cleavedcaspase3表达。

小鼠造模方法具体操作步骤同实施例15。

提取蛋白方法同实施例6。免疫印迹操作步骤中，一抗选用抗cleavedcaspase3的特异性一抗(购自美国CST公司)，其余具体操作步骤同实施例6。

结果如图18所示，血管紧张素II诱导的ApoE敲除小鼠腹主动脉瘤中，cleavedcaspase3灰度显著增加，而肽段Pep2-A2处理可以降低cleavedcaspase3灰度，表明Pep2-A2可降低显著下调血管紧张素II诱导的ApoE敲除小鼠腹主动脉瘤中凋亡指标cleavedcaspase3水平，说明凋亡的降低。

Claims (11)

1.一种特异结合TRB3的多肽或多肽嵌合肽在制备治疗腹主动脉瘤的药物中的应用；所述的多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示；

所述多肽嵌合肽为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽；

所述细胞穿膜肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:7中的任一种所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的多肽嵌合肽为如序列表中SEQ ID NO：1所示序列中多肽的N端与细胞穿膜肽连接。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的多肽嵌合肽为如序列表中SEQ ID NO：1所示序列中多肽的C端与细胞穿膜肽连接。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述特异性结合TRB3的多肽或多肽嵌合肽作为单一活性成分在制备治疗腹主动脉瘤的药物中的应用。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述特异性结合TRB3的多肽或多肽嵌合肽与其他抗腹主动脉瘤的药物联合作为活性成分在制备治疗腹主动脉瘤的药物中的应用。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的腹主动脉呈瘤样扩大，直径显著增加。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的腹主动脉瘤引起的主动脉自噬阻断与蛋白堆积。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的腹主动脉瘤引起的炎症因子白介素6表达增高。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的腹主动脉瘤引起的炎症因子白介素8表达增高。

10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的腹主动脉瘤引起的氧化应激增加。

11.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的腹主动脉瘤引起的细胞凋亡增加。

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