CN113508126B - 新型肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽或其药学上可接受的盐及其用途。本发明可有效治疗或预防胰岛炎。此外,本发明可有效治疗或预防1型糖尿病。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型肽,更具体而言,涉及一种新型肽及其用途。
背景技术
胰岛的淋巴细胞浸润被称为胰岛炎。胰岛炎最终破坏分泌胰岛素的胰腺β-细胞,导致1型糖尿病(T1D){Lennon GP,Bettini M,Burton AR,Vincent E,Arnold PY,Santamaria P,Vignali DA."T cell islet accumulation in type 1 diabetes is atightly regulated,cell-autonomous event".Immunity.2009 Oct 16;31(4):643-53,etc.)。此外,据报道,1型糖尿病可通过保护胰腺免受胰岛炎来缓解{Norman Ende,RuifengChen,Alluru S.Reddi."Effect of human umbilical cord blood cells on glycemiaand insulitis in type 1 diabetic mice".Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 325(2004)665-669,etc.}。
已知多种细胞因子如IFN-γ(干扰素-γ)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)和TGF-β1(转化生长因子-β1)参与胰岛炎的发展和抑制。已知胰岛炎是由IFN-γ引起的{von HerrathMG,Oldstone MB."Interferon-γis Essential for Destruction ofβCells andDevelopment of Insulin-dependent Diabetes Mellitus".J.Exp Med.1997 Feb 3;185(3):531-9,etc.},还已知其是由TNF-α引起的{Kyoungho Suk,Sunshin Kim,Yun-Hee Kim,Kyoung-Ah Kim,Inik Chang,Hideo Yagita,Minho Shong,Myung-Shik Lee."IFN-γ/TNF-αSynergism as the Final Effector in Autoimmune Diabetes:A Key Role for STAT1/IFN Regulatory Factor-1 Pathway in PancreaticβCell Death".J.Immunol April 1,2001,166(7)4481-4489,etc.}。同时,已经报道TGF-β1表达增加保护非肥胖糖尿病(NOD)小鼠免受胰岛炎的影响{Piccirillo CA,Chang Y,Prud'homme GJ."TGF-β1Somatic GeneTherapy Prevents Autoimmune Disease in Nonobese Diabetic Mice"J.Immunol.1998Oct 15;161(8):3950-6,etc.}。
因此,有必要开发对胰岛炎具有效果的材料。
[引文列表]
[非专利文献]
(非专利文献1)Lennon GP,Bettini M,Burton AR,Vincent E,Arnold PY,Santamaria P,Vignali DA."T cell islet accumulation in type 1 diabetes is atightly regulated,cell-autonomous event".Immunity.2009 Oct 16;31(4):643-53.
(非专利文献2)Norman Ende,Ruifeng Chen,Alluru S.Reddi."Effect of humanumbilical cord blood cells on glycemia and insulitis in type 1 diabeticmice".Biochemical and Biophysical Research Communications 325(2004)665-669.
(非专利文献3)von Herrath MG,Oldstone MB."Interferon-γIs Essentialfor Destruction ofβCells and Development of Insulin-dependent DiabetesMellitus".J.Exp.Med.1997 Feb 3;185(3):531-9.
(非专利文献4)Kyoungho Suk,Sunshin Kim,Yun-Hee Kim,Kyoung-Ah Kim,InikChang,Hideo Yagita,Minho Shong,Myung-Shik Lee."IFN-γ/TNF-αSynergism as theFinal Effector in Autoimmune Diabetes:A Key Role for STAT1/IFN RegulatoryFactor-1 Pathway in PancreaticβCell Death".J.Immunol.April 1,2001,166(7)4481-4489.
(非专利文献5)Piccirillo CA,Chang Y,Prud'homme GJ."TGF-β1 Somatic GeneTherapy Prevents Autoimmune Disease in Nonobese Diabetic Mice"J.Immunol.1998Oct 15;161(8):3950-6.
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种新型肽。
本发明的另一个目的是提供本发明的肽的新用途。
本发明的目的不限于上述,并且本领域技术人员从以下描述中将清楚地理解这里未提及的其它目的。
问题的解决手段
本发明提供了由SEQ ID NO:1(YGAGAGAGY)的氨基酸序列组成的肽或其药学上可接受的盐。
在该氨基酸序列中,Y表示酪氨酸(Tyr),G表示甘氨酸(Gly),A表示丙氨酸(Ala)。
构成肽的氨基酸包括L-、D-和DL-型,它们都包括在本发明肽的氨基酸中。同样,显然Y可以解释为具有包括4-羟基苯丙氨酸以及酪氨酸作为氨基酸的含义。
所述肽包括其变体,其中根据本发明的肽结构的一部分通过天然突变或人工突变而改变,但不改变其主要活性。
作为药学上可接受的盐,可以举出盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、马来酸盐、富马酸盐、草酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、钠盐、钾盐、钙盐等。
此外,本发明提供了根据本发明的肽或其药学上可接受的盐的用途,优选其用于治疗或预防胰岛炎的用途。其中,术语“治疗”综合地指减轻或缓解症状,术语“预防”以包括从症状表现前的无症状阶段抑制疾病发展的广泛含义使用。
治疗或预防可以是由于IFN-γ(干扰素-γ)表达的抑制、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)表达的抑制和TGF-β1(转化生长因子-β1)表达的诱导中的至少一种。
IFN-γ表达的抑制可以是IFN-γmRNA表达的抑制。
TNF-α表达的抑制可以是TNF-αmRNA表达的抑制。
TGF-β1表达的诱导可以是TGF-β1 mRNA表达的诱导。
此外,本发明提供本发明的肽或其药学上可接受的盐的用途,优选其用于治疗或预防1型糖尿病(T1D)的用途。
1型糖尿病可以由胰岛炎引起。
治疗或预防可以是由于选自抑制胰岛炎的发展和减轻胰岛炎中的至少一种。
治疗或预防可以是由于血糖降低。
血糖降低可以是由于选自胰岛炎发展的抑制和减轻胰岛炎中的至少一种。
此外,本发明提供了用于治疗或预防胰岛炎的组合物,其包含根据本发明的肽或其药学上可接受的盐。此外,本发明提供了用于治疗或预防1型糖尿病的组合物,其包含根据本发明的肽或其药学上可接受的盐。所述组合物可以是药物组合物。
所述组合物可以包含根据本发明的肽或其药学上可接受的盐作为活性成分。
所述组合物还包含药学上可接受的添加剂,并且可以由根据本发明的肽或其药学上可接受的盐和药学上可接受的添加剂组成。
本发明的肽可以通过肽化学领域中通常使用的方法制备。例如,肽可以参考本领域广泛已知的文献,或通过诸如溶液相合成或固相合成的方法来制备。
作为形成肽键的方法,可以举出酰基叠氮法、酰卤法、酰基咪唑法、碳化二亚胺法、鏻法、酸酐法、混合酸酐法、氧化还原法、Woodward试剂K等。
在缩合反应之前,可以保护不参与反应的羧基、氨基等,并且可以通过本领域已知的方法活化参与缩合反应的羧基。
作为保护羧基的官能团,可以举出甲基、叔丁基、芳基、五氟苯基、苄基、对甲氧基苄基、甲氧基乙氧基甲基等成酯基团。
作为保护氨基的官能团,可以举出三苯甲基羰基、芳氧基羰基、环己氧基羰基、三氯乙氧基羰基、苄氧基羰基、叔丁氧基羰基、和/或9-芴基甲氧羰基等。
作为羧基的活性形式,可以举出混合酸酐、叠氮化物、酰氯和活性酯[与醇(例如五氯苯酚、2,4-二硝基苯酚、氰基甲醇、对硝基苯酚、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二羧酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺或1-羟基苯并三唑)的酯)]等。
在形成肽键的缩合反应中可用的溶剂可以包括苯、甲苯、己烷、丙酮、硝基甲烷、环己烷、醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、吡啶、二恶烷、四氢呋喃、水、甲醇和乙醇等,它们可以单独使用或组合使用。
反应温度可以在通常用于反应中的约-70℃至100℃的范围内,优选在-30℃至30℃的范围内。
从肽上除去保护基的脱保护反应根据保护基的种类,可以使用能够除去保护基而不影响肽键的酸化合物、碱化合物或过渡金属进行。
脱保护反应可以通过酸处理进行,使用例如氯化氢、溴化氢、氟化氢、乙酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸、三甲基氯硅烷或者它们的混合物。
当通过酸处理进行脱保护反应时,可以通过加入助剂如苯甲醚、苯酚或苯甲硫醚来促进脱保护反应。
可选地,可以通过使用例如氨、二乙胺、肼、吗啉、N-甲基吡咯烷、哌啶、碳酸钠或者它们的混合物的碱处理来进行脱保护反应。
可选地,可以通过使用例如锌、汞、钯/氢等的过渡金属处理来进行脱保护反应。
反应完成后,可以使用典型的肽纯化方法,例如萃取、层分离、固体沉淀、重结晶或柱色谱来纯化肽。
此外,根据本发明的肽可以使用典型的方法转化为其变体或其药学上可接受的盐。
本发明的肽可以使用自动肽合成仪合成,或者可以通过遗传操作生产。例如,通过遗传操作制备编码包含融合配偶体和根据本发明的肽的融合蛋白的融合基因,然后用于转化宿主微生物,并在宿主微生物中表达融合蛋白,之后使用蛋白水解酶或化合物从融合蛋白中切割或分离根据本发明的肽,从而产生所需的肽。
本发明的肽或其药学上可接受的盐以24.3mg/日至4860mg/日,优选48.6mg/日至2430mg/日的量肠胃外给药。口服给药时,其量相当于非肠道给药时的量的5至10倍。给药可以一日一次或一日多次,量可以基于成人(体重60kg),但可以根据体重、身体状况等变化。本发明的肽或其药学上可接受的盐可以主要通过肠胃外途径给药,例如静脉内注射、皮下注射、椎管内给药、经皮给药、经鼻给药或直肠内给药。在一些情况下,可以口服给药。
本发明的肽或其药学上可接受的盐或组合物可以与药学上可接受的添加剂一起配制成注射剂、栓剂、粉剂、滴鼻剂、颗粒剂、片剂或透皮贴剂。
药学上可接受的添加剂可以根据本领域技术人员熟知的多种因素来应用,包括例如,特定的生物活性材料、其浓度、稳定性和预期的生物利用度;待治疗的病症和疾病或与其相关的病症;待治疗的个体、其年龄、体型和一般健康状态;以及组合物给药途径,例如鼻、口、眼、局部、透皮和肌肉途径,但本发明不限于此。除了口服给药途径之外,用于生物活性材料给药的药学上可接受的添加剂可以包括水溶液,该水溶液包括D5W(5%葡萄糖水溶液)、右旋糖和其体积的5%内的量的生理盐。对于局部病灶内注射,任何可注射的水凝胶都可以用于增强治疗效果并增加其持续时间。此外,药学上可接受的添加剂可以包含用于改善有效成分的稳定性的其他组分,例如防腐剂和抗氧化剂。本发明的肽或其药学上可接受的盐或组合物可以通过相关领域的适当方法配制,优选参照本领域关于配制方法的广泛已知文献配制以适合于每种疾病或组分。
本发明的肽可以储存在盐溶液中,或者可以在加入甘露醇或山梨醇后在安瓿中冻干,并且可以在溶解于盐水后给药。
另外,本发明提供了治疗或预防胰岛炎的方法,包括对需要给药的哺乳动物(包括人)给药根据本发明的肽或其药学上可接受的盐。另外,本发明提供了治疗或预防1型糖尿病的方法,包括对需要给药的哺乳动物(包括人)给药根据本发明的肽或其药学上可接受的盐。此外,本发明提供了根据本发明的肽或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防胰岛炎的药物中的用途。此外,本发明提供了根据本发明的肽或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防1型糖尿病的药物中的用途。所给药的肽或其药学上可接受的盐可以是有效量的肽或其药学上可接受的盐。
除非另有说明,否则与本发明的肽或其药学上可接受的盐以及用途、组合物和方法相关的所述内容在相同的范围内彼此等同地应用,除非它们彼此矛盾。
发明效果
根据本发明,可以有效地治疗或预防胰岛炎。此外,根据本发明,可以有效地治疗或预防1型糖尿病。
附图说明
图1是示出实施例1的肽对抑制或减少胰岛炎发展的效果的分析结果图;
图2是示出实施例1的肽对降低血糖水平的效果的分析结果图;
图3是示出实施例1的肽对抑制IFN-γ表达和TNF-α表达的效果的分析结果图;
图4是示出实施例1的肽对诱导TGF-β1表达的效果的分析结果图;
图5是示出比较例1和比较例2的肽对抑制IFN-γ和TNF-α表达的效果的分析结果图;
图6是示出比较例1和比较例2的肽对诱导TGF-β1表达的效果的分析结果图。
具体实施方式
通过以下实施例、比较例和制备实施例,可以更好地理解本发明,其中实施例和制备实施例仅用于说明本发明,而不应解释为限制本发明的范围。
以下实施例等中使用的试剂是市售的优质产品,除非另有说明,均购自Sigma-Aldrich。
<实施例1>肽的制备
使用固相肽合成法制备下表1所示的肽。具体地,利用Fmoc(9-芴基甲氧羰基)的化学性质,使用固相法合成该肽。
更具体地说,将0.55mmol/g固体树脂(Wang树脂;Sigma-Aldrich)、5ml二甲基甲酰胺(DMF)、1.1mmol Fmoc-Tyr(tBu)-OH和0.55mmol O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)置于充分干燥的反应器中,并在室温下搅拌2小时,由此合成Fmoc-Tyr(tBu)-树脂,之后过滤合成的树脂,并用二甲基甲酰胺洗涤。向洗涤后的树脂中加入8ml20%哌啶溶液(溶于二甲基甲酰胺),并在室温下搅拌30min,从而合成Fmoc(芴基甲氧羰基-保护基)-去保护的Tyr(tBu)-树脂。过滤合成的Tyr(tBu)-树脂,然后用二甲基甲酰胺洗涤。
向洗涤过的Tyr(tBu)-树脂中加入5ml二甲基甲酰胺、1.1mmol Fmoc-Gly-OH和0.55mmol O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU),并在室温下搅拌2小时,由此合成Fmoc-Gly-Tyr(tBu)-树脂,之后过滤合成的树脂,然后用二甲基甲酰胺洗涤。向洗涤后的树脂中加入8ml 20%哌啶溶液(溶于二甲基甲酰胺),并在室温下搅拌30min,由此合成Fmoc-脱保护的Gly-Tyr(tBu)-树脂。将合成的Gly-Tyr(tBu)-树脂过滤,并用二甲基甲酰胺洗涤。通过这些步骤,在甘氨酸和酪氨酸之间形成肽键。
然后,依次使用Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH,重复与在甘氨酸和酪氨酸之间形成肽键相同的步骤,制备具有下述表1所示的氨基酸序列的肽-树脂化合物。
然后,向该化合物中加入10ml三氟乙酸和水以95:5(v/v)的比例的混合溶液,在室温下搅拌3小时,然后过滤,之后向得到的滤液中加入乙醚,由此结晶固体。将所得固体过滤,用乙醚洗涤,然后干燥,从而合成具有下表1所示氨基酸序列的粗肽化合物。
使用Shimadzu 5mm Shim-pack ODS C18柱(20×250mm)通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化粗肽化合物并冻干,从而得到白色固体形式的实施例1的肽。
使用Shim-Pack 5mm ODS C18柱(4.6×250mm)通过分析RP-HPLC鉴定纯化的肽,并使用基质辅助激光解吸电离(MALDI)-质谱仪(Axia CFR,Kratos Analytical,Manchester,UK)测定肽的分子量。
[表1]
氨基酸序列 | SEQ ID NO: | |
实施例1 | YGAGAGAGY | 1 |
在表1中,Y表示酪氨酸(Tyr),G表示甘氨酸(Gly),A表示丙氨酸(Ala)。
<实施例2>肽效果的评价
2-1抑制或减少胰岛炎发展的效果评价
实验证实了实施例1的肽抑制或减少胰岛炎发展的效果。
实验动物是8周龄的雌性NOD/ShiLtJ(Jackson Lab)。NOD(非肥胖糖尿病)小鼠是胰岛炎和1型糖尿病的动物模型。在这些动物中,已知1型糖尿病平均在18周龄发病,并且在30周龄达到90%的发病率。所有动物均在SPF屏障条件下饲养。该研究得到Osong MedicalInnovation Foundation Laboratory Animal Center(Kbio-IACUC-2018-066)的动物护理和使用机构委员会的批准。适应期为1周,亮/暗循环为12小时(08:00关灯-20:00开灯)。温度为20±2℃,相对湿度为60至80%。由于糖尿病的发病率可能被肠道微生物抑制,因此将用HCl将pH调节至2.8-3.2的水供给实验动物。
从上述制备的实验动物的尾巴每周取血一次,并使用血糖仪(Roche,Accu-CHEKPerforma)测量来自尾巴的血滴的血糖水平。当血糖水平测定为250mg/dL以上,且在此后第三天重新测定的血糖水平也为250mg/dL以上时,认为已经发生了1型糖尿病,进行实验。
选择两只患有1型糖尿病的实验动物作为实施例1的处理组,并皮下(SC)给予100μl实施例1的肽(5mg/kg)。每天早晚给药14天,使用血糖仪测定血糖值。当血糖水平降至250mg/dL以下时停止给药。另外,选择两只1型糖尿病实验动物作为阴性对照组,并以与实施例1的处理组相同的方式进行处理,不同之处在于,给予PBS(磷酸盐缓冲盐水,Welgene)代替实施例1的肽。在第14天,选择一只血糖水平经测量低于250mg/dL的实验动物作为正常组,并用于比较1型糖尿病实验动物和无1型糖尿病实验动物的胰岛炎评分。
在第14天测量血糖水平后,从实验动物中取出胰腺,并固定在10%天然缓冲福尔马林(10%NBF,Sigma,HT5011)中,以制备石蜡块。将固定的胰腺组织切片,用苏木精和伊红(H&E)染色,并使用光学显微镜观察以证实胰岛炎的发展。胰岛炎根据其程度分为4个阶段,阶段0中无法观察到胰岛炎,阶段1中在胰岛周围观察到胰岛炎,阶段2中观察到小于75%的胰岛炎,阶段3中观察到75%以上的胰岛炎。对于实施例1的处理组,测量两只动物中胰岛的数量,根据胰岛炎的阶段对单个胰岛进行分类,从而确定胰岛炎评分,并且将胰岛总数中与每个胰岛炎阶段相对应的胰岛的数量表示为百分比。阴性对照组和正常组与实施例1的处理组同样地求出胰岛炎评分,将胰岛总数中的与各胰岛炎阶段对应的胰岛的数量作为百分率。其结果示于图1。
图1是示出实施例1的肽对抑制或减少胰岛炎发展的效果的分析结果图。在图1中,x轴代表各组,y轴代表胰岛炎评分{胰岛炎(胰岛%)}。在图1中,0分表示阶段0,1分表示阶段1,2分表示阶段2,3分表示阶段3。
如图1所示,在实施例1的处理组中,与阴性对照组相比,最严重阶段3的百分比降低,可分泌胰岛素的阶段0-2的百分比增加。特别是在实施例1的处理组中,与阴性对照组相比,未发生胰岛炎的阶段0的百分比大约加倍。基于上述结果,可以发现实施例1的肽通过抑制胰岛炎的发展和缓解胰岛炎而在治疗胰岛炎方面是有效的。此外,实施例1的处理组中阶段0的百分比高于正常组。因此,实施例1的肽能够抑制胰岛炎的发展,表明实施例1的肽在治疗和预防胰岛炎两方面都是有效的。
最终,可以得出结论,本发明的肽对胰岛炎具有治疗和/或预防效果。
2-2:降低血糖水平的效果评价
为了评价实施例1的肽对1型糖尿病(T1D)的效果,实验验证了实施例1的肽对降低患有1型糖尿病的实验动物中的血糖水平的效果。
具体而言,分析在实施例2-1的实验动物中实施例1的处理组和阴性对照组的血糖水平,从而评价实施例1的肽降低血糖水平的效果。其结果示于图2。
图2是示出实施例1的肽对降低血糖水平的效果的分析结果图。其中,x轴表示处理后的时间(d),y轴表示血糖值(mg/dL)。
如图2所示,实施例1的处理组(实施例1-1和实施例1-2)中两只动物的血糖水平显着降低,然后保持在正常范围内,但阴性对照组(阴性对照组-1和阴性对照组-2)中两只动物的血糖水平持续升高。
基于上述结果,可以证实本发明的肽在降低血糖水平方面是有效的。由于本发明的肽在降低1型糖尿病小鼠的血糖水平和维持正常血糖水平方面是有效的,本发明的肽能够通过降低血糖水平来治疗或预防1型糖尿病。此外,如上所述,由于本发明的肽能够抑制和减少胰岛炎的发展,因此通过其作用,可以表现出对1型糖尿病的治疗和/或预防效果,并且可被认为具有降低血糖水平的效果。
最终,可以得出结论,本发明的肽能够治疗和/或预防1型糖尿病。
2-3.抑制IFN-γ表达和TNF-α表达以及诱导TGF-β1表达的效果评价评价实施例1的肽对与胰岛炎相关的细胞因子{IFN-γ(干扰素-γ),TNF-α(肿瘤坏死因子-α)和TGF-β1(转化生长因子-β1)}的效果。已知胰岛炎是由IFN-γ和TNF-α的表达引起的,并且已知TGF-β1表达增加保护胰腺免于胰岛炎。因此,通过测定实施例1的肽是否抑制IFN-γ和TNF-α表达以及是否诱导TGF-β1表达,评价其对胰岛炎的效果。
从实施例2-1中制备的实验动物的尾巴每周取血一次,并使用血糖仪(Roche,Accu-CHEK Performa)测量其血滴的血糖水平。确认血糖水平为“高”(600mg/dL以上),对小鼠进行颈椎脱臼,并从中提取脾脏。将细胞过滤器(BD,352350)置于50ml管中,使用注射器的活塞端使提取的脾组织通过细胞过滤器,之后向含有过滤细胞的管中加入HBSS(Hanks’平衡盐溶液),以便用水洗涤细胞,随后离心(1,000rpm,5min)以除去上清液。用1ml HBSS悬浮细胞,加入10ml 1×RBC裂解缓冲液(Ebioscience,00-4333-57),轻轻搅拌混合,在冰中静置5min,然后离心(1,000rpm,5min)以除去上清液。向所得细胞再一次加入10ml RBC裂解缓冲液,在冰中静置5min,进一步离心(1,000rpm,5min)以除去上清液,然后用10ml HBSS洗涤两次。在最终离心(1,000rpm,5min)后,用1ml HBSS悬浮细胞,用台盼蓝溶液以1:1稀释50×50μl细胞,用血细胞计数器计数细胞数。将分离的脾细胞以1×107细胞/孔的量置于6孔板中的2ml含有10%FBS(胎牛血清,Corning,35-015-CV)的RPMI-1640(Welgene,LM011-01)培养基中,并向其中加入2ng/ml用于诱导T细胞活性的抗小鼠CD28(Ebioscience,16-0281-82)。同时,在5%CO2培养箱中于37℃用100mM实施例1的肽处理细胞3小时以评价IFN-γ和TNF-α表达的变化,并处理72小时以评价TGF-β1表达的变化。
然后,离心(1,000rpm,5min)细胞以除去上清液,通过用5ml TRIzol(Invitrogen,15596-018)吹吸以裂解细胞。在细胞中加入100μl氯仿,剧烈搅拌混合,然后在室温下静置2min。然后,进行离心(12,000rpm,15min),仅将上清液小心转移至新的1.5ml E-管中,加入300μl异丙醇,在温和搅拌下混合,然后允许在室温下静置10min。然后,离心(12,000rpm,15min)以除去上清液,用500μl稀释在DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水(LPS溶液,CBW004)中的70%乙醇洗涤,离心(12,000rpm,10min)以除去上清液,之后在开盖状态下蒸发掉剩余的乙醇。加入30μl DEPC处理的水洗脱RNA并定量。
使用1mg定量的RNA,通过cDNA合成试剂盒(ELPISbio,EBT-1512)的实验程序合成cDNA。然后,按照PCR(聚合酶链式反应)试剂盒(Solgent,SEF01-M50H)的程序,扩增每种细胞因子(IFN-γ,TNF-α,TGF-β1)的cDNA和用于定量测定细胞因子表达变化的管家基因GAPDH。然后,将PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳以证实DNA条带,然后使用Image J程序定量,并以相对于GAPDH的百分比计算定量值。对照组以除了使用PBS(磷酸盐缓冲盐水,Welgene)代替实施例1的肽和抗小鼠CD28之外,以与实施例1的处理组相同的方式进行处理,阴性对照组除了使用PBS(磷酸盐缓冲盐水,Welgene)代替实施例1的肽之外,以与实施例1的处理组相同的方式进行处理。其结果示于图1和图2。每种细胞因子的PCR引物序列如下表2所示。
[表2]
在表2中,t表示胸腺嘧啶,a表示腺嘌呤,c表示胞嘧啶,g表示鸟嘌呤。
图3是示出实施例1的肽对抑制IFN-γ表达和TNF-α表达的效果的分析结果图,图4是示出实施例1的肽对诱导TGF-β1表达的效果的分析结果图。在图3和图4中,x轴代表对照组{(-)}、阴性对照组(抗CD28)和实施例1的处理组(抗CD28+实施例1),在图3和图4中,y轴代表相对于GAPDH的mRNA表达水平百分比{细胞因子/GAPDH(%)}。
如图3所示,根据已知产生胰岛炎的IFN-γ和TNF-α表达水平的评价结果,与阴性对照组相比,表达水平均降低。因此,可以证实实施例1的肽抑制IFN-γ和TNF-α的表达,表明胰岛炎的发展被抑制,从而有效地治疗和/或预防胰岛炎。
如图4所示,根据对已知影响胰腺的胰岛炎保护作用的TGF-β1表达水平的评价结果,与阴性对照组相比,表达水平升高。因此,可以确认实施例1的肽诱导TGF-β1的表达,由此保护胰腺免于胰岛炎,从而有效地治疗和/或预防胰岛炎。
因此,可以证实实施例1的肽通过抑制IFN-γ表达和TNF-α表达和/或诱导TGF-β1表达而有效治疗和/或预防胰岛炎。
总之,本发明的肽或其药学上可接受的盐能够通过抑制IFN-γ表达、抑制TNF-α表达和/或诱导TGF-β1表达而表现出胰岛炎的治疗和/或预防效果。最后,可以得出结论,根据本发明的肽或其药学上可接受的盐能够治疗和/或预防1型糖尿病。
<比较例1和比较例2>肽的制备
为了评价实施例1的肽的一部分是否示出活性,制备了比较例1的肽和比较例2的肽,其包含与实施例1的肽的氨基酸序列的一部分相应的氨基酸序列。比较例1的肽和比较例2的肽分别为从实施例1的肽的氨基酸序列(YGAGAGAGY)的C端开始依次由6个氨基酸组成的肽(GAGAGY)和从其N端开始依次由6个氨基酸组成的肽(YGAGAG)。比较例1的肽和比较例2的肽是基于下表3所示的氨基酸序列,以与实施例1的肽相同的方式制备的。
[表3]
氨基酸序列 | SEQ ID NO: | |
比较例1 | GAGAGY | 10 |
比较例2 | YGAGAG | 11 |
在表3中,Y表示酪氨酸(Tyr),G表示甘氨酸(Gly),A表示丙氨酸(Ala)。
<比较实验>比较例1和比较例2的肽的效果评价
为了评价比较例1和2的肽是否如实施例1的肽那样有效抑制IFN-γ表达和TNF-α表达并诱导TGF-β1表达,进行了以下实验。
本实验除了使用比较例1的肽或比较例2的肽代替实施例1的肽之外,以与实施例2-3相同的方式进行。其结果示于图5和图6。
图5是示出比较例1和2的肽对抑制IFN-γ表达和TNF-α表达的效果的分析结果图,图6是示出比较例1和2的肽对诱导TGF-β1表达的效果的分析结果图。在图5和图6中,x轴代表对照组{(-)}、阴性对照组(抗CD28)、比较例1的处理组(抗CD28+比较例1)和比较例2的处理组(抗CD28+比较例2),在图5和6中,y轴代表相对于GAPDH的mRNA表达水平百分比{细胞因子/GAPDH(%)}。
如图5所示,根据已知产生胰岛炎的IFN-γ和TNF-α表达水平的评价结果,与阴性对照组相比,比较例1的处理组和比较例2的处理组中的IFN-γ和TNF-α的表达水平没有显著变化,相反发现比较例2的处理组的TNF-α的表达水平增加。另外,如图6所示,根据对已知影响胰腺的胰岛炎保护作用的TGF-β1表达水平的评价结果,与阴性对照组相比,比较例1的处理组和比较例2的处理组的表达量均没有大的变化。从这些结果可以看出,比较例1和比较例2的肽与实施例1的肽不同,没有表现出抑制IFN-γ表达、抑制TNF-α表达和诱导TGF-β1表达的效果。
基于上述结果,可以得出结论,实施例1的肽整体,而不是其一部分,在抑制IFN-γ表达和TNF-α表达以及诱导TGF-β1表达方面是有效的,并且对胰岛炎和1型糖尿病具有效果。
<制备实施例1>注射液的制备
将10mg与实施例1同样制备的肽溶解于PBS中,制成1ml溶液。将该溶液装入注射用安瓿中,得到注射液。
工业可利用性
本发明可有效治疗或预防胰岛炎。此外,本发明可有效治疗或预防1型糖尿病。因此,本发明具有在工业可利用性。
SEQUENCE LISTING
<110> 因首生物科学有限公司
<120> 新型肽及其用途
<130> P70920KRO
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptide
<400> 1
Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr
1 5
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> forward primer for IFN-gamma
<400> 2
actggcaaaa ggatggtgac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer for IFN-gamma
<400> 3
tgagctcatt gaatgcttgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> forward primer for TNF-alpha
<400> 4
agcccccagt ctgtatcctt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer for TNF-alpha
<400> 5
ctccctttgc agaactcagg 20
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> forward primer for TGF-beta1
<400> 6
gcttcagctc cacagag 17
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer for TGF-beta1
<400> 7
ggttgtagag ggcaagg 17
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> forward primer for GAPDH
<400> 8
tcatgaccac agtccatgcc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> reverse primer for GAPDH
<400> 9
tccaccaccc tgttgctgta 20
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptide
<400> 10
Gly Ala Gly Ala Gly Tyr
1 5
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> peptide
<400> 11
Tyr Gly Ala Gly Ala Gly
1 5
Claims (6)
1.由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽或其药学上可接受的盐。
2.一种用于治疗或预防胰岛炎的药物组合物,其包含权利要求1所述的肽或其药学上可接受的盐。
3.根据权利要求2所述的药物组合物,其中,所述治疗或预防是由于选自IFN-γ(干扰素-γ)表达的抑制、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)表达的抑制和TGF-β1(转化生长因子-β1)表达的诱导中的至少一种。
4.一种用于治疗或预防1型糖尿病的药物组合物,其包含权利要求1所述的肽或其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求4所述的药物组合物,其中,所述1型糖尿病由胰岛炎引起。
6.根据权利要求5所述的药物组合物,其中,所述治疗或预防是由于选自抑制胰岛炎的发展和减轻胰岛炎中的至少一种。
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