KR20140099526A - 안구 건조증의 치료를 위한 jnk 신호 전달 경로의 세포-투과성 펩타이드 억제자의 용도 - Google Patents

안구 건조증의 치료를 위한 jnk 신호 전달 경로의 세포-투과성 펩타이드 억제자의 용도 Download PDF

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쟝-마크 콩베트.
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자이겐 인플라메이션 리미티드
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Abstract

본 발명은 단백질 키나아제 억제자의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 안구 건조증의 치료를 위한 단백질 키나아제 c-Jun amino 말단 키나아제, JNK 억제자 (폴리-)펩타이드, 키메라 펩타이드, 또는 이를 부호화하는 핵산의 억제자들의 용도뿐만 아니라 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

안구 건조증의 치료를 위한 JNK 신호 전달 경로의 세포-투과성 펩타이드 억제자의 용도{Use of cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway for the treatment of dry eye syndrome}
본 발명은 단백질 키나아제 억제자의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 안구 건조증의 치료를 위한 단백질 키나아제 c-Jun 아미노 말단 키나아제, JNK 억제자 (폴리-)펩타이드, 키메라 펩타이드, 또는 이를 부호화하는 핵산의 억제자들의 용도뿐만 아니라 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
안구 건조증(DES)은, 또한 각막염(keratitis sicca), 안구 건조증(xerophthalmia), 건성각결막염(keratoconjunctivitis sicca)(KCS) 또는 각막 건성(cornea sicca)으로 불리는, 결과적으로, 누액 생산의 감소 또는 누액 막 증발의 증가 중 어느 하나에 의해 유발되는 안구 건조에 의해 유발되는 눈 질병이다. 전형적인 안구 건조증의 증상은 건조, 작열감(burning) 및 모래가 들어간듯한(sandy-gritty) 눈 자극이다. 안구 건조증은 종종 안구의 표면 염증과 관련된다. 만약 안구 건조증이 치료되지 않고 방치되거나 심각해지면, 시력의 손상 또는 심지어 시력의 상실을 일으키는 안구 손상을 유발하는 합병증을 생성할 수 있다. 비치료된 안구 건조증은 특히 눈 상피(eye epithelium), 편평상피화생(squamous metaplasia), 술잔 세포(goblet cells)의 손실, 각막 표면의 비대, 각막 침식, 점상 각막병증(punctate keratopathy), 상피 결함(epithelial defects), 각막 궤양(corneal ulceration), 각막 신혈관형성(corneal neovascularization), 각막 흉터(corneal scarring), 각막 얇아짐(corneal thinning), 및 심지어 각막 구멍(corneal perforation)의 병리학적 경우를 초래하게 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 안구 건조증 및/또는 관련된 병리학적 효과, 증상 등을 치료하는 의약을 제공하는 것이다.
이러한 목적은 안구 건조증 문제의 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 길이가 150개 미만의 아미노산을 포함하는 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드의 용도에 의해 해결되었다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드가 특히 안구 건조증 문제의 치료에 적합함을 발견하였다. 이는 비록 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드가 기술분야로부터 일반적으로 알려져 있다 하더라도, 선행기술에 의해 명백하지도 또는 제안되지도 않았다.
본 발명 내에서, JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 인간 또는 랫(rat) IB1 서열, 바람직하게는 SEQ ID NO: 102 (랫으로부터 IB1 cDNA 및 이의 예견된 아미노산 서열을 나타냄), SEQ ID NO: 103 (rIB1 유전자-스플라이스 공여체의 엑손-인트론 경계에 의해 부호화(encoded)되는 랫으로부터 IB1 단백질 서열을 나타냄), SEQ ID NO: 104 (Homo sapiens로부터 IB1 단백질 서열을 나타냄), 또는 SEQ ID NO: 105 (Homo sapiens로부터 IB1 cDNA 서열을 나타냄)에 따르는 어느 서열에 의해 정의되거나 부호화된 아미노산 서열로부터, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO: 104 (Homo sapiens로부터 IB1 단백질 서열을 나타냄), 또는 SEQ ID NO: 105 (Homo sapiens로부터 IB1 cDNA 서열을 나타냄), 또는 이들의 어느 절편 또는 변이체로부터 따르는 어느 서열에 의해 정의되거나 부호화된 아미노산 서열로부터 전형적으로 유래될 수 있다. 다시 말해, JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 인간 또는 랫 IB1 서열의 절편, 변이체 또는 이러한 절편의 변이체를 포함한다. 인간 또는 랫 IB 서열은 SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104 또는 SEQ ID NO: 105에 따르는 서열에 의해 각각 정의되고 부호화된다.
바람직하게는, 본 발명에 사용된 이러한 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 150개 미만의 아미노산 잔기, 바람직하게는 5 내지 150개 아미노산 잔기의 범위, 더욱 바람직하게는 10 내지 100개 아미노산 잔기, 더욱 더 바람직하게는 10 내지 75개 아미노산 잔기 및 가장 바람직하게는 10 내지 50개 아미노산 잔기의 범위, 예를 들어 10 내지 30개, 10 내지 20개, 또는 10 내지 15개 아미노산 잔기의 총 길이를 포함한다.
더욱 바람직하게는, 이러한 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드 및 상기 범위는 상기 언급된 어느 서열, 더욱 더 바람직하게는 SEQ ID NO: 104에 따라 정의되거나 SEQ ID NO: 105에 의해 부호화된 아미노산 서열, 더욱 더 바람직하게는 SEQ ID NO: 105의 420 내지 980 염기 또는 SEQ ID NO: 104의 105 내지 291 아미노산 사이의 영역, 및 가장 바람직하게는 SEQ ID NO: 105의 561 내지 647 염기 또는 SEQ ID NO: 104의 152 내지 180 아미노산 사이의 영역으로부터 선택될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 전형적으로 JNK에 결합 및/또는 전사 인자, 예를 들어 c-Jun 또는 ATF2(각각 예시 SEQ ID NOs: 15 및 16 참조) 또는 Elk1이 활성화된 적어도 하나의 JNK의 활성화를 억제한다.
마찬가지로, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 바람직하게는 SEQ ID NOs: 1 내지 4, 13 내지 20 및 33 내지 100의 어느 하나에 따르는 적어도 하나의 아미노산 서열, 또는 절편, 유도체 또는 이의 변이체를 포함하거나 구성된다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 SEQ ID NOs: 1 내지 4, 13 내지 20 및 33 내지 100 따르는 아미노산 서열, 또는 변이체, 절편 또는 이의 유도체의 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 카피들(copies)을 포함할 수 있다. 만약 하나 이상의 카피가 존재한다면, 본 발명에서 사용된 SEQ ID NOs: 1 내지 4, 13 내지 20 및 33 내지 100에 따르는 이들 아미노산 서열들, 또는 변이체들, 절편들, 또는 이의 유도체들은 어떠한 연결자 서열도 없이 또는 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 5개 아미노산을 포함하는 연결자 서열을 통해 서로 직접 연결될 수 있다. 연결자 서열을 형성하는 아미노산은 바람직하게는 아미노산 잔기로 글리신 또는 프롤린으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 SEQ ID NOs: 1 내지 4, 13 내지 20 및 33 내지 100에 따르는 이들 아미노산 서열들, 또는 절편들, 변이체들 또는 이의 유도체들은 둘, 셋 또는 그 이상의 프롤린 잔기의 힌지(hinge)에 의해 서로에 의해 분리될 수 있다.
본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 적어도 1 또는 2개, 바람직하게는 적어도 3, 4 또는 5개, 더욱 바람직하게는 적어도 6, 7, 8 또는 9개 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 10개 또는 그 이상의 D- 및/또는 L-아미노산을 포함하며, 상기 D- 및/또는 L-아미노산은 블록 구조(blockwise), 비-블록 구조(non-blockwise) 또는 대체 방식(alternate manner)으로 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 서열 내에 정렬될 수 있다.
바람직한 일 실시예에 따르면, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 특히 L-아미노산으로 구성될 수 있다. 그 다음에 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 3에 따르는 적어도 하나의 "천연 JNK 억제자 서열"을 포함하거나 구성될 수 있다. 이와 관련하여, "천연" 또는 "천연 JNK 억제자 서열(들)" 용어는 L-아미노산의 전체로 구성된, 본 발명에서 사용된 SEQ ID NOs: 1 또는 3의 어느 하나에 따르는 비-변경된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드 서열을 말한다.
따라서, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 적어도 하나의 (천연) 아미노산 서열 NH2-Xn b-RPTTLXLXXXXXXXQD- Xn a-Xn b-COOH (L-IB 제네릭(s)) [SEQ ID NO: 3] 및/또는 IB1 XRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX (L-IB (제네릭)) [SEQ ID NO: 19]의 JNK 결합 도메인(JBDs)을 포함 또는 구성될 수 있다. 이와 관련하여, 각각 X는 전형적으로 아미노산 잔기, 바람직하게는 어떤 (천연)아미노산 잔기로부터 선택된 것을 나타낸다. Xn a 는 전형적으로 상기 n (X의 반복 횟수)이 0 또는 1인 하나의 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌을 제외한 어떤 아미노산 잔기로부터 선택된 것을 나타낸다. 게다가, 각 Xn b는 상기 n (X의 반복 횟수)이 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 또는 그 이상, 만약 n (X의 반복 횟수)이 Xn a 에는 0이라면 직접적으로 인접한(adjacent) Xn b은 이 위치에 세린 또는 트레오닌을 피하기 위하여, 이것의 N-말단에 세린 또는 트레오닌을 바람직하게는 포함하지 않는, 어떤 아미노산 잔기로부터 개별적으로 선택될 수 있다. 바람직하게는, Xn b은 SEQ ID NO: 1 또는 3으로부터 유래된 펩타이드 잔기들의 근접(contiguous) 스트레치(stretch)를 나타낸다. Xn a 및 Xn b는 D 또는 L 아미노산을 나타낼 수 있다. 추가적으로, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 IB1 DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT (L-IB1) [SEQ ID NO: 17]의 JNK 결합 도메인을 포함하는 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 (천연) 아미노산 서열을 포함 또는 구성될 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 게다가 적어도 하나의 (천연) 아미노산 서열 NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH (L-IB1(s)) [SEQ ID NO: 1]을 포함 또는 구성될 수 있다.
게다가, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 IB1 L-IB1(s1) (NH2-TLNLFPQVPRSQD-COOH, SEQ ID NO: 33); L-IB1(s2) (NH2-TTLNLFPQVPRSQ-COOH, SEQ ID NO: 34); L-IB1(s3) (NH2-PTTLNLFPQVPRS-COOH, SEQ ID NO: 35); L-IB1(s4) (NH2-RPTTLNLFPQVPR-COOH, SEQ ID NO: 36); L-IB1(s5) (NH2-KRPTTLNLFPQVP-COOH, SEQ ID NO: 37); L-IB1(s6) (NH2-PKRPTTLNLFPQV-COOH, SEQ ID NO: 38); L-IB1(s7) (NH2-RPKRPTTLNLFPQ-COOH, SEQ ID NO: 39); L-IB1(s8) (NH2-LNLFPQVPRSQD-COOH, SEQ ID NO: 40); L-IB1(s9) (NH2-TLNLFPQVPRSQ-COOH, SEQ ID NO: 41); L-IB1(s10) (NH2-TTLNLFPQVPRS-COOH, SEQ ID NO: 42); L-IB1(s11) (NH2-PTTLNLFPQVPR-COOH, SEQ ID NO: 43); L-IB1(s12) (NH2-RPTTLNLFPQVP-COOH, SEQ ID NO: 44); L-IB1(s13) (NH2-KRPTTLNLFPQV-COOH, SEQ ID NO: 45); L-IB1(s14) (NH2-PKRPTTLNLFPQ-COOH, SEQ ID NO: 46); L-IB1(s15) (NH2-RPKRPTTLNLFP-COOH, SEQ ID NO: 47); L-IB1(s16) (NH2-NLFPQVPRSQD-COOH, SEQ ID NO: 48); L-IB1(s17) (NH2-LNLFPQVPRSQ-COOH, SEQ ID NO: 49); L-IB1(s18) (NH2-TLNLFPQVPRS-COOH, SEQ ID NO: 50); L-IB1(s19) (NH2-TTLNLFPQVPR-COOH, SEQ ID NO: 51); L-IB1(s20) (NH2-PTTLNLFPQVP-COOH, SEQ ID NO: 52); L-IB1(s21) (NH2-RPTTLNLFPQV-COOH, SEQ ID NO: 53); L-IB1(s22) (NH2-KRPTTLNLFPQ-COOH, SEQ ID NO: 54); L-IB1(s23) (NH2-PKRPTTLNLFP-COOH, SEQ ID NO: 55); L-IB1(s24) (NH2-RPKRPTTLNLF-COOH, SEQ ID NO: 56); L-IB1(s25) (NH2-LFPQVPRSQD-COOH, SEQ ID NO: 57); L-IB1(s26) (NH2-NLFPQVPRSQ-COOH, SEQ ID NO: 58); L-IB1(s27) (NH2-LNLFPQVPRS-COOH, SEQ ID NO: 59); L-IB1(s28) (NH2-TLNLFPQVPR-COOH, SEQ ID NO: 60); L-IB1(s29) (NH2-TTLNLFPQVP-COOH, SEQ ID NO: 61); L-IB1(s30) (NH2-PTTLNLFPQV-COOH, SEQ ID NO: 62); L-IB1(s31) (NH2-RPTTLNLFPQ-COOH, SEQ ID NO: 63); L-IB1(s32) (NH2-KRPTTLNLFP-COOH, SEQ ID NO: 64); L-IB1(s33) (NH2-PKRPTTLNLF-COOH, SEQ ID NO: 65); 및 L-IB1(s34) (NH2-RPKRPTTLNL-COOH, SEQ ID NO: 66)의 JNK 결합 도메인을 포함하는 군에서 선택된 적어도 하나의 (천연) 아미노산 서열을 포함 또는 구성될 수 있다.
추가적으로, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 IB1 PGTGCGDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT (IB1-long) [SEQ ID NO: 13] 의 (긴) JNK 결합 도메인(JBDs), IB2 IPSPSVEEPHKHRPTTLRLTTLGAQDS (IB2-long) [SEQ ID NO: 14]의 (긴) JNK 결합 도메인, c-Jun GAYGYSNPKILKQSMTLNLADPVGNLKPH (c-Jun) [SEQ ID NO: 15]의 JNK 결합 도메인, ATF2 TNEDHLAVHKHKHEMTLKFGPARNDSVIV (ATF2) [SEQ ID NO: 16]의 JNK 결합 도메인 (예를 들어, 도 1A-1C 참조)을 포함하는 군에서 선택된 적어도 하나의 (천연)아미노산 서열을 포함 또는 구성될 수 있다. 이와 관련하여, 정렬(alignment)은 부분적으로 보존된 8개 아미노산 서열을 나타내며(예를 들어, 도 1A 참조) 게다가 IB1 및 IB2의 JBDs의 비교는 두 서열간에 매우 보존된 일곱개 및 세개의 아미노산의 두 블록들을 나타낸다.
다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 상기 정의된 D-아미노산으로 부분 또는 독점적으로 구성될 수 있다. 더욱 바람직하게는, D-아미노산으로 구성된 이들 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 상기 (천연) JNK 억제자 서열의 비-천연 D 레트로-인버소(retro-inverso) 서열이다. 용어 "레트로-인버소 (폴리-)펩타이드"는 서열의 방향이 반전(reversed)되고 각 아미노산 잔기의 키랄성(chirality)이 역전(inverted)된 선형 펩타이드 서열의 이성질체를 의미한다(예를 들어, Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368,692-693 (1994) 참조). D-거울상 이성질체들의 결합 및 역합성의 장점은 각 알파 탄소에서 사이드-체인의 위치가 보존되는 동안, 카보닐 및 각 아미드 결합 내 아미노 기의 위치가 교체된다. 특별히 달리 명시되지 않는 한, 본 발명에 따라 사용된 어떤 주어진 L-아미노산 서열 또는 펩타이드는 천연 L-아미노산 서열 또는 펩타이드에 대응을 위해 서열 또는 펩타이드의 반전을 합성에 의해 D 레트로-인버소 서열 또는 펩타이드로 변환될 수 있다.
본 발명에서 사용되고 상기 정의된 D 레트로-인버소 (폴리-)펩타이드는 유용한 특징의 다양성을 가진다. 예를 들어, 본 발명에서 사용된 D 레트로-인버소 (폴리-)펩타이드는 본 발명에서 사용된 L-아미노산 서열처럼 효율적으로 세포로 들어가는 반면, 본 발명에서 사용된 D-레트로-인버소 서열은 대응하는 L-아미노산 서열에 비해 보다 안정적이다.
따라서, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 NH2-Xn b- Xn a-DQXXXXXXXLXLTTPR- Xn b-COOH (D-IB1 제네릭(s)) [SEQ ID NO: 4] 및/또는 XS/TDQXXXXXXXLXLTTPRX (D-IB (제네릭)) [SEQ ID NO: 20] 아미노산 서열에 따르는 적어도 하나의 D 레트로-인버소 서열을 포함 또는 구성될 수 있다. 이와 관련하여 사용된 것처럼, X, Xn a 및 Xn b(바람직하게는, D 아미노산을 나타냄)는 상기 정의된 것과 같으며, 상기 Xn b는 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 또는 4로부터 유래된 잔기의 인접한 스트레치를 나타낸다. 만약 n이 Xn a에서 0이라면, 직접적으로 인접한 Xn b는 바람직하게는 이것의 C-말단에 세린 또는 트레오닌을 포함하지 않는다. 추가적으로, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 IB1 TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD (D-IB1) [SEQ ID NO: 18]의 JNK 결합 도메인(JBSs)를 포함하는 아미노산 서열에 따르는 적어도 하나의 D 레트로-인버소 서열을 포함 또는 구성될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 아미노산 서열 NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH (D-IB1(s)) [SEQ ID NO: 2]에 따르는 적어도 하나의 D 레트로-인버소 서열을 포함 또는 구성될 수 있다. 게다가, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 IB1 D-IB1(s1) (NH2-QPFLNLTTPRKPR-COOH, SEQ ID NO: 67); D-IB1(s2) (NH2-VQPFLNLTTPRKP-COOH, SEQ ID NO: 68); D-IB1(s3) (NH2-PVQPFLNLTTPRK-COOH, SEQ ID NO: 69); D-IB1(s4) (NH2-RPVQPFLNLTTPR-COOH, SEQ ID NO: 70); D-IB1(s5) (NH2-SRPVQPFLNLTTP-COOH, SEQ ID NO: 71); D-IB1(s6) (NH2-QSRPVQPFLNLTT-COOH, SEQ ID NO: 72); D-IB1(s7) (NH2-DQSRPVQPFLNLT-COOH, SEQ ID NO: 73); D-IB1(s8) (NH2-PFLNLTTPRKPR-COOH, SEQ ID NO: 74); D-IB1(s9) (NH2-QPFLNLTTPRKP-COOH, SEQ ID NO: 75); D-IB1(s10) (NH2-VQPFLNLTTPRK-COOH, SEQ ID NO: 76); D-IB1(s11) (NH2-PVQPFLNLTTPR-COOH, SEQ ID NO: 77); D-IB1(s12) (NH2-RPVQPFLNLTTP-COOH, SEQ ID NO: 78); D-IB1(s13) (NH2-SRPVQPFLNLTT-COOH, SEQ ID NO: 79); D-IB1(s14) (NH2-QSRPVQPFLNLT-COOH, SEQ ID NO: 80); D-IB1(s15) (NH2-DQSRPVQPFLNL-COOH, SEQ ID NO: 81); D-IB1(s16) (NH2-FLNLTTPRKPR-COOH, SEQ ID NO: 82); D-IB1(s17) (NH2-PFLNLTTPRKP-COOH, SEQ ID NO: 83); D-IB1(s18) (NH2-QPFLNLTTPRK-COOH, SEQ ID NO: 84); D-IB1(s19) (NH2-VQPFLNLTTPR-COOH, SEQ ID NO: 85); D-IB1(s20) (NH2-PVQPFLNLTTP-COOH, SEQ ID NO: 86); D-IB1(s21) (NH2-RPVQPFLNLTT-COOH, SEQ ID NO: 87); D-IB1(s22) (NH2-SRPVQPFLNLT-COOH, SEQ ID NO: 88); D-IB1(s23) (NH2-QSRPVQPFLNL-COOH, SEQ ID NO: 89); D-IB1(s24) (NH2-DQSRPVQPFLN-COOH, SEQ ID NO: 90); D-IB1(s25) (NH2-DQSRPVQPFL-COOH, SEQ ID NO: 91); D-IB1(s26) (NH2-QSRPVQPFLN-COOH, SEQ ID NO: 92); D-IB1(s27) (NH2-SRPVQPFLNL-COOH, SEQ ID NO: 93); D-IB1(s28) (NH2-RPVQPFLNLT-COOH, SEQ ID NO: 94); D-IB1(s29) (NH2-PVQPFLNLTT-COOH, SEQ ID NO: 95); D-IB1(s30) (NH2-VQPFLNLTTP-COOH, SEQ ID NO: 96); D-IB1(s31) (NH2-QPFLNLTTPR-COOH, SEQ ID NO: 97); D-IB1(s32) (NH2-PFLNLTTPRK-COOH, SEQ ID NO: 98); D-IB1(s33) (NH2-FLNLTTPRKP-COOH, SEQ ID NO: 99); 및 D-IB1(s34) (NH2-LNLTTPRKPR-COOH, SEQ ID NO: 100)의 JNK 결합 도메인(JBDs)을 포함하는 아미노산 서열에 따르는 적어도 하나의 D 레트로-인버소 서열을 포함 또는 구성될 수 있다.
본 발명에서 사용되고 상기 공개된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 표 1(SEQ ID NO:s 1-4, 13-20 및 33-100)에 개시되었다. 하기 표는 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드/서열의 명칭뿐만 아니라, 이들의 서열 식별 번호, 이들의 길이, 및 아미노산 서열을 나타낸다. 게다가, 하기 표 1은 서열뿐만 아니라, 예를 들어 SEQ ID NO's: 1, 2, 5, 6, 9 및 11 및 SEQ ID NO's: 3, 4, 7, 8, 10 및 12, 각각에 대한 이들의 제네릭 화학식(formulas)을 나타낸다. 표 1은 나아가 키메라 서열 SEQ ID NOs: 9-12 및 23-32(하기 참조), L-IB1 서열 SEQ ID NOs: 33 내지 66 및 D-IB1 서열 SEQ ID NOs: 67 내지 100을 개시한다.
서열/펩타이드 명칭 SEQ ID NO AA 서열
L-IB1(s) 1 19 RPKRPTTLNLFPQVPRSQD
(NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
D-IB1(s) 2 19 DQSRPVQPFLNLTTPRKPR
(NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH)
L-IB (generic) (s) 3 19 NH2-Xn b- RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn a--Xn b-COOH
D-IB (generic) (s) 4 19 NH2-Xn b- Xn a-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn b-COOH
L-TAT 5 10 GRKKRRQRRR
(NH2-GRKKRRQRRR-COOH)
D-TAT 6 10 RRRQRRKKRG
(NH2-RRRQRRKKRG-COOH)
L-generic-TAT (s) 7 11 NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-COOH
D-generic-TAT (s) 8 11 NH2-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH
L-TAT-IB1(s) 9 31 GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD
(NH2-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
L-TAT-IB (generic) (s) 10 29 NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b -RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn a -Xn b-COOH
D-TAT-IB1(s) 11 31 DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG
(NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH)
D-TAT-IB (generic) (s) 12 29 NH2-Xn b-Xn a-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH
IB1-long 13 29 PGTGCGDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT
(NH2- PGTGCGDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT -COOH)
IB2-long 14 27 IPSPSVEEPHKHRPTTLRLTTLGAQDS
(NH2- IPSPSVEEPHKHRPTTLRLTTLGAQDS -COOH)
c-Jun 15 29 GAYGYSNPKILKQSMTLNLADPVGNLKPH
(NH2- GAYGYSNPKILKQSMTLNLADPVGNLKPH -COOH)
ATF2 16 29 TNEDHLAVHKHKHEMTLKFGPARNDSVIV
(NH2- TNEDHLAVHKHKHEMTLKFGPARNDSVIV -COOH)
L-IB1 17 23 DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT
(NH2- DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT -COOH)
D-IB1 18 23 TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD
(NH2- TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD -COOH)
L-IB (generic) 19 19 XRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX
(NH2- XRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX -COOH)
D-IB (generic) 20 19 XS/TDQXXXXXXXLXLTTPRX
(NH2- XS/TDQXXXXXXXLXLTTPRX -COOH)
L-generic-TAT 21 17 XXXXRKKRRQRRRXXXX
(NH2- XXXXRKKRRQRRRXXXX -COOH)
D-generic-TAT 22 17 XXXXRRRQRRKKRXXXX
(NH2- XXXXRRRQRRKKRXXXX -COOH)
L-TAT-IB1 23 35 GRKKRRQRRRPPDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT
(NH2- GRKKRRQRRRPPDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT -COOH)
L-TAT-IB (generic) 24 42 XXXXXXXRKKRRQRRRXXXXXXXXRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX
(NH2- XXXXXXXRKKRRQRRRXXXXXXXXRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX-COOH)
D-TAT-IB1 25 35 TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTDPPRRRQRRKKRG
(NH2- TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTDPPRRRQRRKKRG -COOH)
D-TAT-IB (generic) 26 42 XT/SDQXXXXXXXLXLTTPRXXXXXXXXRRRQRRKKRXXXXXXX
(NH2- XT/SDQXXXXXXXLXLTTPRXXXXXXXXRRRQRRKKRXXXXXXX -COOH)
L-TAT-IB1(s1) 27 30 RKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD
(NH2-RKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
L-TAT-IB1(s2) 28 30 GRKKRRQRRRXn cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD
(NH2-GRKKRRQRRRXn cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
L-TAT-IB1(s3) 29 29 RKKRRQRRRXn cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD
(NH2-RKKRRQRRRXn cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
D-TAT-IB1(s1) 30 30 DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKR
(NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKR-COOH)
D-TAT-IB1(s2) 31 30 DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXn cRRRQRRKKRG
(NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXn cRRRQRRKKRG-COOH)
D-TAT-IB1(s3) 32 29 DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXn cRRRQRRKKR
(NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXn cRRRQRRKKR-COOH)
L-IB1(s1) 33 13 TLNLFPQVPRSQD
(NH2-TLNLFPQVPRSQD-COOH)
L-IB1(s2) 34 13 TTLNLFPQVPRSQ
(NH2-TTLNLFPQVPRSQ-COOH)
L-IB1(s3) 35 13 PTTLNLFPQVPRS
(NH2-PTTLNLFPQVPRS-COOH)
L-IB1(s4) 36 13 RPTTLNLFPQVPR
(NH2-RPTTLNLFPQVPR-COOH)
L-IB1(s5) 37 13 KRPTTLNLFPQVP
(NH2-KRPTTLNLFPQVP-COOH)
L-IB1(s6) 38 13 PKRPTTLNLFPQV
(NH2-PKRPTTLNLFPQV-COOH)
L-IB1(s7) 39 13 RPKRPTTLNLFPQ
(NH2-RPKRPTTLNLFPQ-COOH)
L-IB1(s8) 40 12 LNLFPQVPRSQD
(NH2-LNLFPQVPRSQD-COOH)
L-IB1(s9) 41 12 TLNLFPQVPRSQ
(NH2-TLNLFPQVPRSQ-COOH)
L-IB1(s10) 42 12 TTLNLFPQVPRS
(NH2-TTLNLFPQVPRS-COOH)
L-IB1(s11) 43 12 PTTLNLFPQVPR
(NH2-PTTLNLFPQVPR-COOH)
L-IB1(s12) 44 12 RPTTLNLFPQVP
(NH2-RPTTLNLFPQVP-COOH)
L-IB1(s13) 45 12 KRPTTLNLFPQV
(NH2-KRPTTLNLFPQV-COOH)
L-IB1(s14) 46 12 PKRPTTLNLFPQ
(NH2-PKRPTTLNLFPQ-COOH)
L-IB1(s15) 47 12 RPKRPTTLNLFP
(NH2-RPKRPTTLNLFP-COOH)
L-IB1(s16) 48 11 NLFPQVPRSQD
(NH2-NLFPQVPRSQD-COOH)
L-IB1(s17) 49 11 LNLFPQVPRSQ
(NH2-LNLFPQVPRSQ-COOH)
L-IB1(s18) 50 11 TLNLFPQVPRS
(NH2-TLNLFPQVPRS-COOH)
L-IB1(s19) 51 11 TTLNLFPQVPR
(NH2-TTLNLFPQVPR-COOH)
L-IB1(s20) 52 11 PTTLNLFPQVP
(NH2-PTTLNLFPQVP-COOH)
L-IB1(s21) 53 11 RPTTLNLFPQV
(NH2-RPTTLNLFPQV-COOH)
L-IB1(s22) 54 11 KRPTTLNLFPQ
(NH2-KRPTTLNLFPQ-COOH)
L-IB1(s23) 55 11 PKRPTTLNLFP
(NH2-PKRPTTLNLFP-COOH)
L-IB1(s24) 56 11 RPKRPTTLNLF
(NH2-RPKRPTTLNLF-COOH)
L-IB1(s25) 57 10 LFPQVPRSQD
(NH2-LFPQVPRSQD-COOH)
L-IB1(s26) 58 10 NLFPQVPRSQ
(NH2-NLFPQVPRSQ-COOH)
L-IB1(s27) 59 10 LNLFPQVPRS
(NH2-LNLFPQVPRS-COOH)
L-IB1(s28) 60 10 TLNLFPQVPR
(NH2-TLNLFPQVPR-COOH)
L-IB1(s29) 61 10 TTLNLFPQVP
(NH2-TTLNLFPQVP-COOH)
L-IB1(s30) 62 10 PTTLNLFPQV
(NH2-PTTLNLFPQV-COOH)
L-IB1(s31) 63 10 RPTTLNLFPQ
(NH2-RPTTLNLFPQ-COOH)
L-IB1(s32) 64 10 KRPTTLNLFP
(NH2-KRPTTLNLFP-COOH)
L-IB1(s33) 65 10 PKRPTTLNLF
(NH2-PKRPTTLNLF-COOH)
L-IB1(s34) 66 10 RPKRPTTLNL
(NH2-RPKRPTTLNL-COOH)
D-IB1(s1) 67 13 QPFLNLTTPRKPR
(NH2-QPFLNLTTPRKPR-COOH)
D-IB1(s2) 68 13 VQPFLNLTTPRKP
(NH2-VQPFLNLTTPRKP-COOH)
D-IB1(s3) 69 13 PVQPFLNLTTPRK
(NH2-PVQPFLNLTTPRK-COOH)
D-IB1(s4) 70 13 RPVQPFLNLTTPR
(NH2-RPVQPFLNLTTPR-COOH)
D-IB1(s5) 71 13 SRPVQPFLNLTTP
(NH2-SRPVQPFLNLTTP-COOH)
D-IB1(s6) 72 13 QSRPVQPFLNLTT
(NH2-QSRPVQPFLNLTT-COOH)
D-IB1(s7) 73 13 DQSRPVQPFLNLT
(NH2-DQSRPVQPFLNLT-COOH)
D-IB1(s8) 74 12 PFLNLTTPRKPR
(NH2-PFLNLTTPRKPR-COOH)
D-IB1(s9) 75 12 QPFLNLTTPRKP
(NH2-QPFLNLTTPRKP-COOH)
D-IB1(s10) 76 12 VQPFLNLTTPRK
(NH2-VQPFLNLTTPRK-COOH)
D-IB1(s11) 77 12 PVQPFLNLTTPR
(NH2-PVQPFLNLTTPR-COOH)
D-IB1(s12) 78 12 RPVQPFLNLTTP
(NH2-RPVQPFLNLTTP-COOH)
D-IB1(s13) 79 12 SRPVQPFLNLTT
(NH2-SRPVQPFLNLTT-COOH)
D-IB1(s14) 80 12 QSRPVQPFLNLT
(NH2-QSRPVQPFLNLT-COOH)
D-IB1(s15) 81 12 DQSRPVQPFLNL
(NH2-DQSRPVQPFLNL-COOH)
D-IB1(s16) 82 11 FLNLTTPRKPR
(NH2-FLNLTTPRKPR-COOH)
D-IB1(s17) 83 11 PFLNLTTPRKP
(NH2-PFLNLTTPRKP-COOH)
D-IB1(s18) 84 11 QPFLNLTTPRK
(NH2-QPFLNLTTPRK-COOH)
D-IB1(s19) 85 11 VQPFLNLTTPR
(NH2-VQPFLNLTTPR-COOH)
D-IB1(s20) 86 11 PVQPFLNLTTP
(NH2-PVQPFLNLTTP-COOH)
D-IB1(s21) 87 11 RPVQPFLNLTT
(NH2-RPVQPFLNLTT-COOH)
D-IB1(s22) 88 11 SRPVQPFLNLT
(NH2-SRPVQPFLNLT-COOH)
D-IB1(s23) 89 11 QSRPVQPFLNL
(NH2-QSRPVQPFLNL-COOH)
D-IB1(s24) 90 11 DQSRPVQPFLN
(NH2-DQSRPVQPFLN-COOH)
D-IB1(s25) 91 10 DQSRPVQPFL
(NH2-DQSRPVQPFL-COOH)
D-IB1(s26) 92 10 QSRPVQPFLN
(NH2-QSRPVQPFLN-COOH)
D-IB1(s27) 93 10 SRPVQPFLNL
(NH2-SRPVQPFLNL-COOH)
D-IB1(s28) 94 10 RPVQPFLNLT
(NH2-RPVQPFLNLT-COOH)
D-IB1(s29) 95 10 PVQPFLNLTT
(NH2-PVQPFLNLTT-COOH)
D-IB1(s30) 96 10 VQPFLNLTTP
(NH2-VQPFLNLTTP-COOH)
D-IB1(s31) 97 10 QPFLNLTTPR
(NH2-QPFLNLTTPR-COOH)
D-IB1(s32) 98 10 PFLNLTTPRK
(NH2-PFLNLTTPRK-COOH)
D-IB1(s33) 99 10 FLNLTTPRKP
(NH2-FLNLTTPRKP-COOH)
D-IB1(s34) 100 10 LNLTTPRKPR
(NH2-LNLTTPRKPR-COOH)
D-아미노산으로 독점적으로 구성된 여기에 주어진 서열은 "D-명칭(D-name)"에 의해 식별됨이, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, SEQ ID NO:100은 서열/펩타이드 명칭 "D-IB1 (s34)"을 가진다. 주어진 아미노산 서열은 LNLTTPRKPR이다. 그러나, 모든 아미노산은 여기 D-아미노산이다.
또한, 용어 "L-아미노산으로 전체적으로 구성된"; "D-아미노산으로 독점적으로 구성된" "D-아미노산으로 전체적으로 구성된" 및/또는 "D-아미노산으로 독점적으로 구성된" 및 글리신 잔기의 존재를 배재할 필요가 없는(그러나 할 수 있는) 서열에 관한 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해 이해될 수 있다. 글리신은 비-카이랄인 유일한 아미노산이다. 따라서, 용어 "L-아미노산으로 전체적으로 구성된"; "D-아미노산으로 독점적으로 구성된" "D 아미노산으로 전체적으로 구성된" 및/또는 "D-아미노산으로 독점적으로 구성된"은 각각 가능한 사용되는 L-아미노산 또는 D-아미노산을 명확하게 만들기 위한 의도이다. 그럼에도 불구하고, 만약 글리신의 존재가 필요하거나 아미노산 서열 내 주어진 위치에서 선호된다면, 그곳에 남을 수 있다. 좋은 예시는 L-TAT (SEQ ID NO:5)이다. 본 발명에서 사용된 상기 서열은 "비록" 상기 서열이 비카이랄 글리신 잔기를 포함하더라도 L-아미노산으로 독점적으로 구성되는 것으로 생각된다. 마찬가지로, 본 발명에서 사용된 D-TAT (SEQ ID NO:6)은 "비록" 상기 서열이 비카이랄 글리신 잔기를 포함하더라도 D-아미노산으로 독점적으로 구성되는 것으로 생각될 수 있다.
다른 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 상기 정의된 천연 또는 비-천연 아미노산 서열의 적어도 하나의 변이체, 절편 및/또는 유도체을 포함 또는 구성될 수 있다. 바람직하게는, 이들 변이체, 절편 및/또는 유도체은 본 발명에서 사용된 상기 개시된 천연 또는 비-천연 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드, 특히 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 천연 또는 비-천연 아미노산 서열의 생물학적 활성, 즉, 예를 들어 c-Jun, ATF2 또는 Elk1, 적어도 하나의 JNK 활성화된 전사 인자의 JNK 결합 및/또는 활성화의 억제를 유지한다. 기능성은 다양한 테스트, 예를 들어 이의 목표 분자에 펩타이드의 결합 테스트 또는 생물 물리학적 방법, 예를 들어 분광학, 컴퓨터 모델링, 구조 분석 등에 의해 실험될 수 있다. 특히, 상기 정의된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드 또는 변이체, 절편 및/또는 이의 유도체은 펩타이드의 소수성 및 친수성 부위를 식별하는데 사용될 수 있어, 결합 실험, 또는 항체 합성과 같은 실험적 조작(manipulation)을 위한 기질의 디자인을 돕는 친수성 분석(예를 들어, Hopp and Woods, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 3824-3828 참조) 에 의해 분석될 수 있다. 또한, 이차 구조 분석은 특정한 구조적 모티프(motifs)를 추정하는 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드 또는 이의 변이체, 절편 및/또는 유도체의 부위를 식별하기 위해 수행될 수 있다(예를 들어, Chou and Fasman, 1974, Biochem 13: 222-223 참조). 조작, 번역, 이차 구조 예측, 친수성 및 소수성 프로필, 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 예측 및 구성(plotting), 및 서열 상동관계(homologies)의 결정은 기술 분야에서 가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 하기를 포함하는 구조 분석의 다른 방법, 예를 들어 X-선 결정화(예를 들어, Engstrom, 1974. Biochem Exp Biol 11: 7-13 참조), 질량 분석기 및 가스 크로마토그래피(예를 들어, METHODS IN PROTEIN SCIENCE, 1997, J. Wiley and Sons, New York, NY 참조) 및 컴퓨터 모델링(예를 들어, Fletterick and Zoller, eds., 1986. Computer Graphics and Molecular Modeling, In: CURRENT COMMUNICATIONS IN MOLECULAR BIOLOGY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 참조)이 또한 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100을 따르는 (천연 또는 비-천연) 아미노산 서열의 적어도 하나의 변이체를 포함 또는 구성될 수 있다. 본 발명에서 이와 관련하여, "SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100을 따르는 (천연 또는 비-천연) 아미노산 서열의 변이체"는 바람직하게는 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 어느 서열로부터 유래될 서열로, 상기 변이체는 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 아미노산 서열의 아미노산 변이체를 포함한다. 이러한 변이체는 전형적으로 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100을 따르는 아미노산의 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10 및 더욱 바람직하게는 1 내지 5 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하며, 상기 변이체는 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 어느 서열과 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 적어도 약 99%까지의 서열 상동성(identity)을 보인다.
만약 본 발명에서 사용되고 상기 정의된 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100을 따르는 (천연 또는 비-천연) 아미노산 서열의 변이체가 특정 아미노산의 치환에 의해 얻어진다면, 이러한 치환은 바람직하게는 보존적(conservative) 아미노산 치환을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 충분히 유사한 물리화학적 특징을 갖는 그룹 내에 동의(synonymous) 아미노산 잔기를 포함할 수 있어, 그룹의 멤버 간 치환은 분자의 생물학적 활성을 보존할 것이다(예를 들어, Grantham, R. (1974), Science 185, 862-864 참조). 또한 아미노산은, 특히 만약 삽입 및/또는 결실이 오직 몇몇 아미노산, 예를 들어 20개 미만, 및 바람직하게는 10개 미만을 포함하고, 기능적 활성에 치명적인 아미노산의 제거 또는 교체가 없다면, 이들 기능의 변화 없이 상기 정의된 서열 내에 삽입 및/또는 결실될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다. 게다가, 본 발명에서 사용된 것처럼 치환은 본 발명에서 사용된 JNK-억제자 (폴리-)펩타이드 또는 체내 또는 체외에서 사용된 키메라 펩타이드의 불활성화를 회피하기 위해, 가인산분해효소(phosphorylase), 바람직하게는 인산화효소에 대한 접근이 가능한 아미노산 위치에 추가적인 트레오닌을 연결하는 변이체에서 회피되어야 한다.
바람직하게는, 동일한 그룹으로 분류되고 전형적으로 보존적 아미노산 치환에 의해 교체될 수 있는 동의 아미노산 잔기는 하기 표 2에 정의된다.
동의 아미노산 잔기들의 바람직한 그룹
아미노산 동의 잔기
Ser Ser, Thr, Gly, Asn
Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His
Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro Gly, Ala, (Thr), Pro
Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala Gly, Thr, Pro, Ala
Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly Ala, (Thr), Pro, Ser, Gly
Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys Ser, Thr, Cys
His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln Glu, Lys, Asn, His, (Thr), Arg, Gln
Asn Gln, Asp, Ser, Asn
Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp Glu, Asn, Asp
Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp Trp
본 발명에서 사용된 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100의 변이체의 특정한 형태는, SEQ ID NOs 1-4, 13-20 및 33-100와 비교하여 적어도 하나의 결실에 의해 전형적으로 변형된 본 발명에서 사용된 SEQ ID NOs: 1, 1-4, 13-20 및 33-100"에 따르는 (천연 또는 비-천연) 아미노산 서열의 절편이다. 바람직하게는, 절편은 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100의 적어도 4개 인접한 어느 아미노산을 포함하며, 길이는 전형적으로 이들 어느 서열로부터 항원의 특정한 인식을 허용하기에 충분하다. 더욱 더 바람직하게는, 절편은 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100의 어느 인접한 아미노산 4 내지 18개, 4 내지 15개, 또는 가장 바람직하게는 4 내지 10개 포함하며, 범위의 하한선은 4, 또는 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개일 수 있다. 결실된 아미노산은 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100, 바람직하게는 N- 또는 C-말단의 어느 위치에서 일어날 수 있다.
게다가, 상기 설명된 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 (천연 또는 비-천연) 아미노산 서열의 절편은 적어도 약 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%까지의 본 발명에서 사용된 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 어느 서열과 함께 서열 상동성을 공유하는 서열로 정의될 수 있다.
본 발명에서 사용된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드/서열은 나아가 상기 정의된 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 (천연 또는 비-천연) 아미노산 서열의 적어도 하나의 유도체을 포함 또는 구성될 수 있다. 이와 관련하여, "SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 (천연 또는 비-천연) 아미노산 서열의 유도체"은 바람직하게는 SEQ ID NOs: 1-4, 13-20 및 33-100에 따르는 어느 서열로부터 유래된 아미노산 서열이며, 상기 유도체은 적어도 하나의 변형된 L- 또는 D-아미노산(비-천연 아미노산(들)을 형성하는), 바람직하게는 1 내지 20, 더욱 바람직하게는 1 내지 10, 및 더욱 더 바람직하게는 1 내지 5 변형된 L- 또는 D-아미노산을 포함한다. 변이체 또는 절편의 유도체은 또한 본 발명의 범위에 속한다.
이러한 관점에서 "변형된 아미노산"은 예를 들어, 다양한 유기체에서 다른 글리코실화에 의해, 인산화에 의해 또는 특정 아미노산 표시에 의해 변형되는 어느 아미노산일 수 있다. 이러한 표시는 하기를 포함하는 표시의 군으로부터 이후 전형적으로 선택된다:
(i) 방사성 표지, 즉 방사성 인산화 또는 황, 수소, 탄소, 질소 등과 함께 방사성 표지;
(ii) 유색 염료(예를 들어 디곡시게닌(digoxygenin) 등);
(iii) 형광성 그룹(예를 들어 플루오레세인(fluorescein) 등);
(iv) 화학발광(chemoluminescent) 그룹;
(v) 고체상에 고정을 위한 그룹(예를 들어 히스-택(His-tag), 비오틴(biotin), 스트랩-택(strep-tag), 플랙-택(flag-tag), 항체, 항원 등); 및
(vi) 상기 (i) 내지 (v)에 언급된 표지의 2 또는 그 이상의 표지의 조합.
이와 관련하여, 예를 들어 본 발명의 쿼리(query) 아미노산 서열에 적어도 95%의 "서열 상동성 공유하는" 서열을 갖는 아미노산 서열은 대상(subject) 아미노산 서열은 쿼리 아미노산 서열의 각 100개 아미노산 당 5개까지 아미노산 변이체를 포함할 수 있는 것을 제외하고 대상 아미노산 서열의 서열은 쿼리 서열에 동일한 것을 의미한다. 다시 말해서, 쿼리 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산 서열을 획득하기 위해서, 대상 서열에 아미노산 잔기의 5%(100 중 5)에까지 다른 아미노산으로 삽입 또는 치환되거나 결실될 수 있다.
정확한 일치(correspondence)가 없는 서열에 대해, 첫번째 서열의 "% 상동성"은 두번째 서열에 관하여 결정될 수 있다. 일반적으로, 비교되는 이들 두 서열은 서열 간 최대 상관관계(correlation)를 주기 위해 정렬된다. 이는 정렬의 정도를 향상시키기 위해 하나 또는 두 서열에 "갭"을 삽입하는 것을 포함할 수 있다. % 상동성은 특히 동일하거나 유사한 길이의 서열에 특히 적합한 비교되는 각 서열의 전체 길이(소위 글로벌 정렬), 또는 동일하지 않은 길이의 서열에 보다 적합한 보다 짧은, 정의된 길이(소위 로컬 정렬)에 걸쳐 이후 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 2 또는 그 이상의 상동성(identity) 및 상동관계(homology)를 비교하는 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려져 있다. 따라서 예를 들어, 위스콘신 서열 분석 패키지 버전 9.1(Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1)(Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 387-395.)에서 가능한 프로그램, 예를 들어, 프로그램 BESTFIT 및 GAP 프로그램은 두 폴리뉴클레오타이드 사이의 % 유사성 및 두 폴리펩타이드 서열 사이의 % 상동성 및 % 상동관계를 결정하는데 사용될 수 있다. BESTFIT은 "로컬 상동관계" 알고리즘을 사용하고(Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197.) 두 서열 사이의 유사성의 최적의 단일 영역(region)을 찾는다. 서열간 상동성 및/또는 유사성 결정을 위한 다른 프로그램, 예를 들어 프로그램의 BLAST 패밀리(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410), 월드 와이드 웹 사이트 ncbi.nlm.nih.gov에서 NCBI의 홈페이지를 통해 접근가능한) 및 FASTA(Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448.)은 또한 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려졌다.
본 발명에 따라 사용되고 상기 정의된 JNK-억제자 (폴리-)펩타이드/서열은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들어 하기 논의된 화학적 합성에 의하거나 유전 공학 방법에 의해 획득되거나 생산될 수 있다. 예를 들어, 상기 JNK 억제자 서열의 원하는 영역을 포함하거나 체내 또는 체외에서 원하는 활성을 조절하는 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 서열의 부분에 대응하는 펩타이드는 펩타이드 합성기(synthesizer)의 사용에 의해 합성될 수 있다.
본 발명에서 사용되고 상기 정의된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 나아가 수송(trafficking) (폴리-)펩타이드에 의해 변형될 수 있고, 본 발명에서 사용되고 상기 정의된 JNK 억제자 (폴리-) 펩타이드를 세포 내로 효과적으로 수송시킨다. 이러한 변형된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 바람직하게는 키메라 (폴리-)펩타이드로 제공되고 사용된다.
따라서 본 발명의 두번째 측면에 따르면 적어도 하나의 첫번째 도메인 및 적어도 하나의 두번째 도메인을 포함하는 키메라 (폴리-)펩타이드의 사용을 제공하며, 대상의 안구 건조증 치료를 위해 약학적 조성물의 제조를 위해 상기 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인은 수송 서열을 포함하는 반면, 키메라 (폴리-)펩타이드의 두번째 도메인은 상기 정의된 JNK 억제자 서열, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1-4, 13-20 및 33-100 또는 이의 유도체 또는 절편에 따르는 어느 서열을 포함한다.
전형적으로, 본 발명에 따라 사용된 키메라 (폴리-)펩타이드는 적어도 25개 아미노산 잔기, 예를 들어 25 내지 250개 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 25 내지 200개 아미노산 잔기, 더욱 더 바람직하게는 25 내지 150개 아미노산 잔기, 25 내지 100개 및 가장 바람직하게는 아미노산 25 내지 50개 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.
본 발명에서 사용된 키메라 (폴리-)펩타이드의 첫번째 도메인은 바람직하게는, 원하는 세포의 목적지에 펩타이드(존재하는)를 지정하는 아미노산의 어느 서열로부터 전형적으로 선택된 수송 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명에서 사용된 수송 서열은 전형적으로, 예를 들어 세포 밖으로부터, 원형질막을 통해, 및 세포질 내로 원형질막을 가로질러 펩타이드를 지정한다. 그렇지 않으면, 또는 추가로, 수송 서열은 세포 내 원하는 위치, 예를 들어, 핵, 리보좀, 소포체(ER), 리소좀, 또는 퍼옥시좀에 예를 들어, 두 요소의 조합(예를 들어, 세포 투과도를 위한 요소 및 핵 위치를 위한 요소)에 의해 또는 예를 들어, 세포막 수송 및 목적된 예를 들어, 핵내 수송의 특징을 갖는 하나의 단일 요소에 의해 펩타이드를 지정할 수 있다. 수송 서열은 세포질 요소 또는 세포의 어느 다른 요소 또는 구획(compartment)(예를 들어 소포체, 미토콘드리아, 글룸 기구(gloom apparatus), 리소좀의 소포)에 결합할 수 있는 다른 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 첫번째 도메인의 수송 서열 및 두번째 도메인의 JNK 억제자 서열은 세포질 내 또는 세포의 어느 다른 구획에 위치할(localized) 수 있다. 이는 흡수 시 세포 내 키메라 펩타이드의 위치화(localization)를 결정하게 한다.
바람직하게는, 수송 서열(본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함되는)은 5 내지 150개 아미노산 서열 길이, 더욱 바람직하게는 5 내지 100개의 길이, 및 가장 바람직하게는 5 내지 50개의 길이, 5 내지 30개 또는 더욱이 5 내지 15개 아미노산의 길이를 갖는다.
더욱 바람직하게는, 수송 서열(본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함된)은 첫번째 도메인에서 지속적인 아미노산 서열로서 발생할 수 있다. 그렇지 않으면, 첫번째 도메인의 수송 서열은, 이들 모든 절편은 전체 수송 서열을 닮으며 각각 1 내지 10개로, 바람직하게는 1 내지 5개 아미노산으로부터 나누어 질 수 있으며, 이와 같은 수송 서열은 상기 개시된 것처럼 이의 수송체 특성을 유지한 채로 둘 또는 그 이상의 절편으로 나누어 질 수 있다. 수송 서열의 절편을 분리하는 이들 아미노산은 예를 들어 수송 서열과는 다른 아미노산 서열로부터 선택될 수 있다. 그렇지 않으면, 첫번째 도메인은 하나 이상의 요소, 예를 들어 특정 세포 분획에 두번째 도메인의 카고(cargo) JNK 억제자 서열의 수송을 위한 이의 고유의 기능을 갖는 각 요소로 구성된 수송 서열을 포함할 수 있다.
상기 정의된 수송 서열은 L-아미노산, D-아미노산, 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 수송 서열(본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함된)은 적어도 1 또는 2까지, 바람직하게는 적어도 3, 4 또는 5, 더욱 바람직하게는 적어도 6, 7, 8 또는 9 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 10 또는 그 이상 D- 및/또는 L-아미노산을 포함할 수 있고, 상기 D- 및/또는 L-아미노산은 블록 구조(blockwise), 비-블록 구조 또는 대체 방식으로 JNK 수송 서열 내에 정렬될 수 있다.
하나의 대체적인 실험예에 따르면, 본 발명에서 사용된 키메라 (폴리-)펩타이드의 수송 서열은 L-아미노산으로 독점적으로 구성될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 수송 서열은 상기 정의된 적어도 하나의 "천연" 수송 서열을 포함 또는 구성될 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "천연"은 L-아미노산으로 전체적으로 구성된 비-변형된 수송 서열을 의미한다.
다른 대체 실험예에 따르면, 본 발명에서 사용된 키메라 (폴리-)펩타이드의 수송 서열은 D-아미노산으로 독점적으로 구성될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 수송 서열은 상기 나타난 서열의 D 레트로-인버소(retro-inverso) 펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 키메라 (폴리-)펩타이드의 첫번째 도메인의 수송 서열은 자연적으로 발생하는 원천(sources)으로부터 획득될 수 있거나 유전 공학 기술 또는 화학 합성에 의해 생산될 수 있다(예를 들어 Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 참조).
첫번째 도메인의 수송 서열을 위한 원천은 예를 들어 TAT 단백질(예를 들어 미국 특허 Nos. 5,804,604 및 5,674,980에 설명된, 이들 각각 문헌은 참조문헌으로써 본 발명에 포함됨)과 같은 천연 단백질, VP22(예를 들어 WO 97/05265; Elliott and O'Hare, Cell 88 : 223-233 (1997)에 설명된), 비-바이러스성 단백질(Jackson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 10691-10695 (1992)), 안테나페디아(Antennapedia)로부터(예를 들어 안테나페디아 수송 서열) 또는 예를 들어, 5 내지 15개 아미노산, 바람직하게는 10 내지 12개 아미노산의 길이를 가지며 적어도 80% 더욱 바람직하게는 85% 또는 90%까지 예를 들어 아르기닌, 라이신 및/또는 히스티딘과 같은 염기성(basic) 아미노산을 포함하는 염기성 펩타이드로부터 유래된 수송 서열을 포함하여 사용될 수 있다. 나아가, 수송 서열로 사용되는 천연 단백질 가운데 하나의 변이체, 절편 및 유도체은 여기에 함께 개시되었다. 변이체, 절편 및 유도체에 관해서는 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 서열을 위해 상기 주어진 정의에 언급된다. 변이체, 절편뿐만 아니라 유도체은 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 서열에 대한 상기 내용에 대응하여 정의된다. 특히, 수송 서열, 변이체 또는 절편 또는 유도체의 관점에서 적어도 약 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%까지 상기 정의된 것과 같은 수송 서열로써 사용된 천연 단백질의 하나와 함께 서열 상동성을 공유하는 서열로써 정의될 수 있다.
본 발명에서 사용된 키메라 (폴리-)펩타이드의 바람직한 실시예에서, 첫번째 도메인의 수송 서열은 인간 면역결핍 바이러스(HIV)1 TAT 단백질, 특히 TAT 단백질을 구성하는 86개 아미노산의 일부 또는 전부로부터 유래된 서열을 포함 또는 구성될 수 있다.
수송 서열(본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함되는)을 위해, 전체-길이 TAT 단백질의 부분 서열은 TAT 단백질의 기능적으로 효과적인 절편 즉, 세포로 침투 및 흡수를 조절하는 부위를 포함하는 TAT 펩타이드를 형성하는데 사용될 수 있다. 이러한 서열이 TAT 단백질의 기능적으로 효과적인 절편인지 여부는 알려진 기술을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어 Franked et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86 : 7397-7401 (1989) 참조). 따라서, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에서 수송 서열은 86개 미만의 아미노산을 포함하며 세포 내로 흡수 및, 세포 핵 속으로 선택적으로 흡수를 보이는 TAT 단백질 서열의 기능적으로 효과적인 절편 또는 부분으로부터 유래될 수 있다. 보다 바람직하게는, 세포막을 가로질러 키메라 펩타이드의 투과를 조절하는 수송체로 사용되는 TAT의 부분 서열(절편)은 전체-길이 TAT의 염기 부위(아미노산 48 내지 57개 또는 49 내지 57개)를 포함하는 것으로 의도된다.
더욱 바람직한 실시예에 따르면, 수송 서열(본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함되는)은 TAT 잔기 48-57개 또는 49 내지 57개, 및 가장 바람직하게는 X 또는 Xn b는 상기 정의와 같은 제네릭 TAT 서열 NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-COOH (L-generic-TAT (s)) [SEQ ID NO: 7] 및/또는 XXXXRKKRRQ RRRXXXX (L-generic-TAT) [SEQ ID NO: 21]을 포함하는 아미노산 서열을 포함 또는 구성된다. 게다가, SEQ ID NOs :8에서 "Xn b" 잔기의 수는 하나의 도시에 한정되지 않으며, 상기 설명된 것처럼 다양할 수 있다. 그렇지 않으면, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함되는 수송 서열은 예를 들어 아미노산 서열 NH2-GRKKRRQRRR-COOH (L-TAT) [SEQ ID NO: 5]을 포함하는 펩타이드를 포함 또는 구성될 수 있다.
더욱 바람직한 다른 실시예에 따르면, 수송 서열(본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함되는)은 상기 개시된 서열의 D 레트로-인버소 펩타이드, 즉 NH2-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH (D-generic-TAT (s)) [SEQ　ID　NO　:　8] 및/또는 XXXXRRRQRRKKRXXXX (D-generic-TAT) [SEQ ID NO: 22] 서열을 갖는 제네릭 TAT 서열의 D 레트로-인버소 서열을 포함할 수 있다. 또한 여기에, Xn b은 상기와 같이 정의된다(바람직하게는 D 아미노산을 나타냄). 게다가 SEQ ID NOs :8 에서 "Xn b" 잔기의 수는 하나의 도시에 한정되지 않으며 상기 설명과 같이 다양할 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 수송 서열은 D 레트로-인버소 서열 NH2-RRRQRRKKRG-COOH (D-TAT) [SEQ　ID　NO:　6]을 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함되는 수송 서열은 상기 정의와 같이 수송 서열의 변이체를 포함 또는 구성될 수 있다. "수송 서열의 변이체"는 바람직하게는 상기 정의와 같이 수송 서열로부터 유래된 서열이며, 상기 변이체는 변형(modification), 예를 들어, 상기 정의와 같은 수송 서열에 존재하는 적어도 하나의 아미노산의 삽입, (내부의) 결실(절편을 유도하는) 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 이러한 변형(들)은 전형적으로 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10 및 더욱 바람직하게는 1 내지 5 아미노산의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 게다가, 변이체는 바람직하게는 상기 정의된 수송 서열과 서열 상동성을 보이는, 보다 바람직하게는 SEQ ID NOs: 5 내지 8 또는 21-22의 어느 것과, 적어도 약 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%까지도 서열 상동성을 보인다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함되는 수송 서열의 이러한 변이체는 증가된 또는 감소된 안정성으로 수송 서열을 유도한다. 그렇지 않으면 수송 서열의 변이체는 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 세포 내 위치화(localization)를 조절하기 위해 제작될 수 있다. 외인성으로(exogenously) 추가될 때, 상기 정의된 이러한 변이체는 세포로 침투하기 위한 수송 서열의 능력이 유지되도록 전형적으로 제작될 수 있다(즉, 세포 안으로 수송 서열의 변이체의 흡수는 수송 서열로 사용된 천연 단백질의 그것과 실질적으로 유사하다). 예를 들어, 핵 위치화에 중요하다고 생각되는 염기성 부위의 변화(예를 들어 Dang and Lee, J. Biol. Chem. 264 : 18019-18023 (1989); Hauber et al., J. Virol. 63 : 1181-1187 (1989) ; et al., J. Virol. 63 : 1-8 (1989) 참조)는 수송 서열의, 및 따라서, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 요소로 JNK 억제자 서열의 원형질 위치 또는 부분적인 원형질 위치에 발생할 수 있다. 상기에 더하여, 추가적인 변형은 향상된 막 용해도를 갖는 수송 서열을 생산하기 위해 수송 서열에 예를 들어, 예를 들어 콜레스테롤 또는 다른 지질 일부의 연결에 의해 변이체에 유발될 수 있다. 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 도메인에 포함되는 수송 서열의 상기 공개된 어느 변이체는 통상의 기술자에게 전형적으로 알려진 기술을 사용하여 생산될 수 있다(예를 들어 Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 참조).
본 발명에서 사용된 두번째 도메인 키메라 펩타이드는 이들 JNK 억제자 서열의 변이체, 절편 및/또는 유도체을 포함하는, 상기 정의된 JNK 억제자 서열의 어느 것으로부터 선택된 JNK 억제자 서열을 포함한다.
본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 양쪽 도메인, 즉 첫번째 및 두번째 도메인(들)은 기능적 단위를 형성하기 위한 것과 같이 결합될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적으로 알려진 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 결합을 위한 어떤 방법이라도 적용될 수 있다.
한 실시예에 따르면, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인은 바람직하게는 공유 결합에 의해 연결된다. 본 발명에서 정의된 공유 결합은 예를 들어 결합 단백질로 상기 정의된 키메라 펩타이드의 발현에 의해 획득될 수 있는 펩타이드 결합일 수 있다. 본 발명에서 설명된 결합 단백질은 하기 설명과 같이 유사하거나 평범한 재조합 DNA 기술로부터 쉽게 채용가능한 방법으로 형성되고 사용될 수 있다. 그러나, 양쪽 도메인은 또한 곁사슬을 통해 연결될 수 있거나 화학적 연결자 일부분에 의해 연결될 수 있다.
본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 및/또는 두번째 도메인은 상기 키메라 펩타이드 내 하나 또는 그 이상의 카피(copies)로 발생할 수 있다. 만약 양쪽 도메인이 단일 카피로 존재하면, 첫번째 도메인이 두번째 도메인의 N-말단 또는 C-말단 끝 중 어느 하나에 연결될 수 있다. 만약 복수의 카피들이 존재한다면, 첫번째 및 두번째 도메인(들)은 어떠한 가능한 순서로 정렬될 수 있다. 예를 들어 첫번째 도메인은 바람직하게는 연속적인 순서로 정렬된 복수의 카피 수, 예를 들어 둘, 셋 또는 그 이상의 카피로 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드에 존재할 수 있다. 그 다음, 두번째 도메인은 첫번째 도메인을 포함하는 서열의 N- 또는 C-말단에서 발생하는 단일 카피에 존재할 수 있다. 그렇지 않으면, 두번째 도메인은 복수의 카피 수, 예를 들어 둘, 셋 또는 그 이상 카피로 존재할 수 있으며, 첫번째 도메인은 단일 카피로 존재할 수 있다. 양쪽 대안에 따르면, 첫번째 및 두번째 도메인(들)은 연속적인 정렬 내 어떠한 장소를 취할 수 있다. 예시적인 정렬은 하기에 나타냄: 예를 들어 첫번째 도메인 - 첫번째 도메인 - 첫번째 도메인 - 두번째 도메인; 첫번째 도메인 - 첫번째 도메인 - 두번째 도메인 - 첫번째 도메인; 첫번째 도메인 - 두번째 도메인 - 첫번째 도메인 - 첫번째 도메인; 또는 예를 들어 두번째 도메인 - 첫번째 도메인 - 첫번째 도메인 - 첫번째 도메인. 이들 예시들은 단지 설명 목적을 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니라는 것은 통상의 기술자에게 잘 이해된다. 따라서, 카피의 수 및 정렬은 처음에 정의된 것처럼 다양할 수 있다.
바람직하게는, 첫번째 및 두번째 도메인(들)은 어떠한 연결자도 없이 서로 직접적으로 연결될 수 있다. 그렇지 않으면, 그들은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5 아미노산을 포함하는 연결자 서열을 통해 서로 연결될 수 있다. 연결자 서열을 형성하는 아미노산은 바람직하게는 아미노산 잔기로 글리신 또는 프롤린으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 첫번째 및 두번째 도메인(들)은 첫번째 및 두번째 도메인(들) 사이에 둘, 셋 또는 그 이상의 프롤린 잔기의 힌지(hinge)에 의해 서로에 의해 분리될 수 있다.
적어도 하나의 첫번째 및 적어도 하나의 두번째 도메인을 포함하는 상기 정의되고 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 그 안에, 각 도메인(사용된 결합자뿐만 아니라)은 L-아미노산, D-아미노산, 또는 이들의 조합(예를 들어 D-TAT 및 L-IB1(s) 또는 L-TAT 및 D-IB1(s) 등)으로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드는 적어도 1 또는 2까지, 바람직하게는 적어도 3, 4 또는 5, 더욱 바람직하게는 적어도 6, 7, 8 또는 9 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 10 또는 그 이상 D- 및/또는 L-아미노산을 포함할 수 있으며, 상기 D- 및/또는 L-아미노산은 블록 구조, 비-블록 구조 또는 대체 방식으로 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드에 정렬될 수 있다.
특정 실시예에 따르면 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드는 제네릭 L-TAT-IB 펩타이드 NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b -RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn a -Xn b-COOH (L-TAT-IB (제네릭) (s)) [SEQ ID NO: 10]에 따르는 L-아미노산 키메라 펩타이드를 포함 또는 구성되며, 상기 X, Xn a 및 Xn b는 바람직하게는 상기 정의된 바와 같다. 보다 바람직하게는 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드는 L-아미노산 키메라 펩타이드 NH2-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH (L-TAT-IB1 (s)) [SEQ ID NO: 9]를 포함하거나 구성된다. 그렇지 않으면 또는 추가적으로, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드는 L-아미노산 키메라 펩타이드 서열 GRKKRRQRRR PPDTYRPKRP TTLNLFPQVP RSQDT (L-TAT-IB1) [SEQ ID NO: 23], 또는 XXXXXXXRKK RRQRRRXXXX XXXXRPTTLX LXXXXXXXQD S/TX (L-TAT-IB generic) [SEQ ID NO: 24]을 포함 또는 구성되며, 상기 X는 또한 바람직하게는 상기 정의된 바와 같거나, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드는 L-아미노산 키메라 펩타이드 서열 RKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD (L-TAT-IB1(s1)) [SEQ ID NO: 27], GRKKRRQRRRXn cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD (L-TAT-IB1(s2)) [SEQ ID NO: 28], 또는 RKKRRQRRRXn cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD (L-TAT-IB1(s3)) [SEQ ID NO: 29]를 포함 또는 구성된다. 이와 관련하여, 각 X는 전형적으로 상기 정의된 아미노산 잔기를 나타내며, 더욱 바람직하게는 Xn c는 펩타이드 잔기의 인접한 스트레치를 나타내며, 각 X는 독립적으로 글리신 또는 프롤린으로부터 서로로부터 선택되며, 예를 들어, 모노토닉(monotonic) 글리신 스트레치 또는 모노토닉 프롤린 스트레치, 상기 n(Xn c의 반복 횟수)는 전형적으로 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 또는 그 이상, 바람직하게는 0-5 또는 5-10이다. Xn c는 D 또는 L 아미노산 중 어느 하나를 나타낼 수 있다.
다른 특정한 실시예에 따르면 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드는 상기 개시된 L-아미노산 키메라 펩타이드의 D-아미노산 키메라 펩타이드를 포함 또는 구성된다. 본 발명에 따르는 예시적인 D 레트로-인버소 키메라 펩타이드는 예를 들어 제네릭 D-TAT-IB 펩타이드 NH2-Xn b-Xn a-DQXXXXXXXLXLTTPR- Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH (D-TAT-IB (generic) (s)) [SEQ ID NO: 12]이다. 여기에, X, Xn a and Xn b는 바람직하게는 상기 정의된 바와 같다(바람직하게는 D 아미노산을 나타냄). 보다 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드는 TAT-IB1 펩타이드 NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH (D-TAT-IB1(s)) [SEQ ID NO: 11]를 따르는 D-아미노산 키메라 펩타이드를 포함 또는 구성된다. 그렇지 않으면 또는 추가적으로, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드는 D-아미노산 키메라 펩타이드 서열 TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTDPPRRRQRRKKRG (D-TAT-IB1) [SEQ ID NO: 25], 또는 XT/SDQXXXXXXXLXLTTPRXXXXXXXXRRRQRRKKRXXXXXXX (D-TAT-IB generic) [SEQ ID NO: 26]을 포함하거나 구성될 수 있으며, 상기 X는 또한 바람직하게는 상기 정의된 바와 같거나, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드는 D-아미노산 키메라 펩타이드 서열 DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKR (D-TAT-IB1(s1)) [SEQ ID NO: 30], DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXn cRRRQRRKKRG (D-TAT-IB1(s2)) [SEQ ID NO: 31], 또는 DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXn cRRRQRRKKR (D-TAT-IB1(s3)) [SEQ ID NO: 32]를 포함 또는 구성된다. Xn c는 상기 정의된 바와 같을 수 있다.
상기 정의된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)은 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 어떠한 적절한 방법으로 수행되는 화학적 또는 생화학적 짝지음(coupling), 예를 들어 첫번째 및 두번째 도메인(들) 사이에 펩타이드 결합의 확립(establishing)에 의해, 예를 들어 결합 단백질로 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 발현에 의해, 또는 예를 들어 상기 정의된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 가교에 의해 서로 연결될 수 있다.
상기 정의된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 화학적 가교에 적합한 많은 알려진 방법은 비-특이적이며, 즉 이들은 수송 폴리펩타이드 또는 카고 거대 분자의 어떠한 특정한 위치에도 짝지음의 포인트를 지정하지 않는다. 결과적으로, 비-특이적 가교제의 사용은 복합 단백질을 생물학적으로 불활성화되게 만들어 기능성 자리를 공격하거나 활성 자리를 입체적으로 막을 수 있다. 따라서, 바람직하게는 이러한 가교 방법이 사용되고, 이는 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 보다 특정한 짝지음을 허용한다.
이와 관련하여, 짝지음 특성을 향상시키기 위한 한가지 방법은 가교되는 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 하나 또는 모두에서 단 일회 또는 몇회 존재하는 기능성 기에 화학적 짝지음을 지정한다. 예를 들어, 티올기를 포함하는 유일한 단백질 아미노산인 시스테인은 단지 몇회 많은 단백질에서 발생한다. 또한, 예를 들어, 만약 폴리펩타이드가 리신 잔기를 포함하지 않는다면, 일차 아민에 대해 특정한 가교제는 그 폴리펩타이드의 아미노 말단에 대해 선택적일 것이다. 짝지음 특성을 향상시키기 위한 이러한 접근의 성공적인 활용은 펩타이드가 분자의 생물학적 활성의 손실 없이 변형될 수 있는 분자의 영역에 적절하게 드물고 반응성 있는 잔기를 가지는 것이 요구된다. 시스테인 잔기는 가교 반응에 이들의 참여에서 이들이 폴리펩타이드 서열의 부분에 일어날 때 교체될 수 있으며 그렇지 않으면 생물학적 활성을 방해할 것이다. 시스테인 잔기가 교체될 때, 폴리펩타이드 폴딩에 결과 변화를 최소화하기 위해 전형적으로 바람직하다. 폴리펩타이드 폴딩의 변화는 교체가 화학적으로 및 입체적으로 시스테인과 유사할 때 최소화된다. 이러한 이유로, 세린은 시스테인의 대체로 바람직하다. 하기 실시예에서 설명된 바와 같이, 시스테인 잔기는 가교 목적을 위해 폴리펩타이드의 아미노산 서열로 도입될 수 있다. 시스테인 잔기가 도입될 때, 아미노 또는 카르복시 말단 또는 근처에 도입이 바람직하다. 전통적인 방법은 이러한 아미노산 서열 변형을 위해 가능하며, 상기 관심있는 폴리펩타이드는 화학적 합성 또는 재조합 DNA의 발현을 통해 생산된다.
상기 정의되고 본 발명에 사용된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 짝지음은 또한 짝지음 또는 결합제(conjugating agent)를 통해 수행될 수 있다. 활용될 수 있는 몇몇 분자간 가교제가 있다(예를 들어 Means and Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, pp. 39-43 참조). 이들 시약(reagents) 중에서, 예를 들어 N-숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate)(SPDP) 또는 N,N'-(1,3-페닐렌) 비스말레이미드(N,N'-(1,3-phenylene) bismaleimide)(이들 모두는 설피드릴(sulfhydryl) 기에 매우 특이적이고 비가역 결합을 형성); N, N'-에틸렌-비스-(아이오도아세트아미드)(N, N'-ethylene-bis-(iodoacetamide)) 또는 6 내지 11 카본 메틸렌 다리를 갖는 다른 이러한 시약(설피드릴 기에 비교적 특이적인); 및 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene)(아미노 및 티로신기의 비가역적 결합을 형성함). 본 목적에 유용한 다른 가교제는 하기를 포함함: p,p'-디플루오로-m(p,p'-difluoro-m), m'-디니트로디페닐설폰(m'-dinitrodiphenylsulfone) 아미노 및 페놀기의 비가역적 가교를 형성함); 디메틸 아디피미데이트(dimethyl adipimidate)(아미노기에 특이적임); 페놀-1,4 디설포닐클로라이드(phenol-1,4　disulfonylchloride)(아미노기에 주로 반응함); 헥사메틸렌디이소시아네이트(hexamethylenediisocyanate) 또는 디이소티오시아네이트(diisothiocyanate), 또는 아조페닐-p-디이소시아네이트(azophenyl-p-diisocyanate)(아미노기와 주로 반응함); 글루타알데하이드(glutaraldehyde)(몇몇 다른 곁사슬과 반응함) 및 디스디아조벤지딘(disdiazobenzidine)(티로신 및 히스티딘과 일차적으로 반응함).
상기 정의된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 가교에 사용되는 가교제는 동종이작용성(homobifunctional), 즉 동일한 반응 하에 두가지 기능성기를 가질 수 있다. 바람직한 동종이작용성 가교제는 비스말레이미도헥산(bismaleimidohexane)("BMH")이다. BMH는 두 말레이미드(maleimide) 기능성기를 포함하며, 상기 반응은 온화한 조건(pH 6.5~7.7) 하에서 설피드릴을 포함하는 화합물에 특이적으로 반응한다. 두 말레이미드기는 탄화수소 사슬에 의해 연결된다. 따라서, BMH는 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩타이드의 비가역적 가교에 유용하다.
상기 정의된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 가교에 유용한 가교제는 또한 이종이작용성(heterobifunctional)일 수 있다. 이종이작용성 가교제는 두개의 다른 기능성기, 각각 자유 아민 및 티올을 갖는 두 단백질을 가교결합할 예를 들어 아민-반응성 기 및 티올-반응성 기를 가진다. 이종이작용성 가교제의 예시는 숙시니미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)("SMCC"), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스터(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)("MBS", 및 숙신이미드 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(succinimide 4-(p-maleimidophenyl)butyrate)("SMPB"), MBS의 확장된 체인 유사체(analog)이다. 이들 가교제의 숙시니미딜기는 일차 아민과 반응하고, 티올-반응성 말레이미드는 시스테인 잔기의 티올과 공유결합을 형성한다.
상기 정의된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 가교에 적합한 가교제는 종종 낮은 수용해성를 갖는다. 설포네이트기와 같은 친수성 일부분은 따라서 이의 수용해성을 향상시키기 위해 가교제에 첨가될 수 있다. 이러한 관점에서, 설포-MBS 및 설포-SMCC는 수용해도를 위해 변형된 가교제의 예시이며, 이는 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
마찬가지로, 많은 가교제는 세포 환경(condition) 하에서 필수적으로 비-절단성인 결합을 만든다. 그러나, 상기 정의된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 가교에 특히 적합한 몇몇 가교제는 세포 환경에서 절단될 수 있는 이황화물(disulfide)과 같은 공유결합을 포함한다. 예를 들어, 트라웃 시약(Traut's reagent), 디티오비스(dithiobis)(숙신이미딜프로피오네이트(succinimidylpropionate))("DSP"), 및 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트("SPDP")는 절단성 가교제로 잘 알려져있다. 절단성 가교제의 사용은 목표 세포 내에 전달 후에 수송 폴리펩타이드로부터 분리를 위해 카고(cargo) 일부분을 허용한다. 직접적인 이황화 결합은 또한 유용할 수 있다.
상기 논의된 하나를 포함하는 많은 가교제는 시중에서 구입할 수 있다. 이들의 사용에 대한 상세한 지도는 상업적 공급자로부터 쉽게 사용할 수 있다. 단백질 가교 및 결합의 제조에 대한 일반적인 참조는: Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press (1991).
상기 정의된 키메라 펩타이드의 첫번째 및 두번째 도메인(들)의 화학적 가교는 스페이서 암(spacer arms)의 사용을 포함할 수 있다. 스페이서 암은 분자내 유연성을 제공하거나 결합된 일부간의 분자내 거리를 조정하며 따라서 생물학적 활성 보존을 도울 수 있다. 스페이서암은 스페이서 아미노산, 예를 들어 프롤린을 포함하는 폴리펩타이드 일부분의 형태일 수 있다. 그렇지 않으면, 스페이서암은 "롱-체인 SPDP" (Pierce Chem. Co., Rockford, IL., cat. No. 21651 H)와 같이 가교제의 부분일 수 있다.
나아가, 상기 공개된 키메라 펩타이드의 하나의 변이체, 절편 또는 유도체은 본 발명에서 사용될 수 있다. 절편 및 변이체에 대하여 JNK 억제자 서열에 대해 상기 주어진 정의로 일반적으로 언급된다.
특히, 본 발명과 관련하여,"키메라 펩타이드의 변이체"는 바람직하게는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32를 따르는 어느 서열로부터 유래된 서열이며, 상기 키메라 변이체는 본 발명에서 사용된 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32에 따르는 키메라 펩타이드의 아미노산 변형을 포함한다. 이러한 변이체는 전형적으로 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32를 따르는 아미노산의 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10 및 더욱 바람직하게는 1 내지 5 치환, 삽입 및/또는 결실 (절편을 유도하는)을 포함하며, 상기 본 발명에서 사용된 변형된 키메라 펩타이드 적어도 약 30%, 50%, 70%, 80%, 또는 95%, 98%, 또는 99%까지의 SEQ ID NOs: 9-12 및 23 내지 32에 따르는 어느 서열과 서열 상동성을 보인다. 바람직하게는, 이들 변이체는 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드에 포함된 첫번째 및 두번째 도메인의 생물학적 활성, 즉 상기 개시된 첫번째 도메인의 수송 활성 및 JNK 결합 및/또는 적어도 하나의 JNK 활성화된 전사 인자의 활성화를 억제하기 위한 두번째 도메인의 활성을 유지한다,
따라서, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드는 또한 앞서 개시된 키메라 펩타이드의 절편, 특히 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 하나에 따르는 키메라 펩타이드 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명과 관련하여, "키메라 펩타이드의 절편"은 바람직하게는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32에 따르는 어느 서열에서 유래된 서열이며, 상기 절편은 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 것의 적어도 4개의 인접한 아미노산을 포함한다. 이러한 절편은 바람직하게는 이들 어느 서열로부터 항원의 특정한 인식을 허용하기에 충분하며 세포, 핵 또는 나아가 바람직한 위치에 서열을 수송하기에 충분한 길이를 포함한다. 더욱 더 바람직하게는, 절편은 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 것의 4 내지 18개, 4 내지 15개, 또는 가장 바람직하게는 4 내지 10개 인접한 아미노산을 포함한다. 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드의 절편은 나아가 적어도 약 30%, 50%, 70%, 80%, 또는 95%, 98%, 또는 99%까지의 SEQ ID NOs: 99 내지 12 및 23 내지 32의 어느 것에 따르는 어느 서열과 서열 상동성을 공유하는 서열로 정의될 수 있다.
최종적으로, 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드는 또한 앞서 개시된 키메라 펩타이드의 특히 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 것에 따르는 키메라 펩타이드 서열의 유도체을 포함한다.
특히 본 발명의 바람직한 용도는 안구 건조증의 치료를 위해, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열로 구성 또는 포함하거나, SEQ ID NO: 11과 적어도 약 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 92% 또는 95%까지의 서열 상동성을 공유하는 아미노산 서열로 구성 또는 포함하는 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드의 용도이다. SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열로 구성 또는 포함하거나, SEQ ID NO: 11과 적어도 약 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 92% 또는 95%까지의 서열 상동성을 공유하는 아미노산 서열로 구성 또는 포함하는 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 예를 들어 눈에 국소적으로(locally) 또는 전신에(systemically) 투여될 수 있다.
본 발명은 추가적으로 본 발명에서 정의된 대상의 안구 건조증 치료용 약학적 조성물의 제조를 위해 상기 정의된 JNK 억제자 서열을 부호화하는 핵산 서열, 키메라 펩타이드 또는 이들의 절편, 변이체 또는 유도체, 상기 정의된 모든 것의 용도에 관련된다. 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 서열을 부호화하는 바람직한 적절한 핵산은 전형적으로 인간 IB1 핵산(GenBank Accession No. (AF074091), 랫(rat) IB1 핵산(GenBank Accession No. AF 108959), 또는 인간 IB2(GenBank Accession No AF218778) 또는 상기 정의된 어느 서열을 부호화하는 어느 핵산 서열, 즉 SEQ ID NO: 1-26에 따르는 어느 서열로부터 선택된다.
본 발명에서 사용된 JNK 억제자 서열을 부호화하는 핵산 또는 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드는 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 어느 방법에 의해 획득될 수 있다(예를 들어 서열의 3'- 및 5'- 말단에 혼성화될 수 있는 합성 프라이머를 이용하는 PCR 증폭을 통해 및/또는 cDNA로부터 클로닝을 통해 또는 주어진 유전자 서열에 특정한 올리고핵산 서열을 이용하는 유전체 라이버러리).
추가적으로, 핵산 서열 또한 본 발명에서 개시되었으며, 이는 상기 정의된 (천연) JNK 억제자 서열 또는 키메라 펩타이드의 코딩(coding)에 적절한 가닥(strand)과 함께 엄격한(stringent) 조건 에서 혼성화한다. 바람직하게는, 이러한 핵산 서열은 특정한 혼성화를 허용하기에 충분한 길이를 갖는 적어도 6 (인접한) 핵산을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 이러한 핵산 서열은 6 내지 38개, 더욱 더 바람직하게는 6 내지 30개, 및 가장 바람직하게는 6 내지 20개 또는 6 내지 10개 (인접한) 핵산을 포함한다.
"엄격한 조건"은 서열 의존적이며 다른 조건 하에서는 다를 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정한 서열에 대한 열의(thermal) 녹는점(TM) 보다 약 5℃ 낮도록 선택될 수 있다. TM은 완벽하게 일치되는 프로브에 혼성화하는 목표 서열의 50%에 온도이다(정의된 이온 강도 및 pH 하에서). 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7에서 적어도 약 0.02 몰이며, 온도는 적어도 약 60℃인 것이다. 다른 요인들은 혼성화의 엄격성(다른 것들 중, 염기 조성물 및 보완적 가닥의 크기를 포함), 유기 용매의 존재 및 염기 부정합의 정도에 영향을 미칠 수 있으며, 파라미터의 조합은 어느 하나의 완벽한 측정에 비해 보다 중요하다.
"매우 엄격한 조건"은 하기를 포함할 수 있다, 예를 들어 1단계: DNA를 포함하는 필터는 6*SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.02% BSA, 및 500 ㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA로 구성된 버퍼에 65℃에서 밤사이에 8시간 동안 전처리되었다. 2단계: 필터는 65℃에서 48시간 동안 혼성화되었다. 상기 전혼성화 혼합물 내에 100 mg/ml 변성된 연어 정자 DNA 및 5-20*106 cpm of 32P-표지된 프로브가 첨가되었다. 3단계: 필터는 2*SSC, 0.01% PVP, 0.01% Ficoll, 및 0.01% BSA을 포함하는 용액에 37℃에서 1시간 동안 세척되었다. 다음으로 45분 동안 50℃에서 0.1*SSC에 세척되었다. 4단계: 필터들이 방사성 촬영 되었다. 본 발명에 사용될 수 있는 매우 엄격한 다른 조건은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있다(예를 들어 Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY; and Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, a Laboratory Manual, Stockton Press, NY 참조)
"보통의 엄격한 조건"은 하기를 포함할 수 있다: 1단계: DNA를 포함하는 필터는 55℃에 6시간 동안 전처리 되었다. 6*SSC, 5*Denhardt's 용액, 0.5% SDS 및 100 mg/ml 변성된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 내. 2단계: 필터는 5-20*106 cpm 32P-표지된 프로브가 첨가된 동일한 용액에 55℃에서 18-20 시간동안 혼성화되었다. 3단계: 필터는 2*SSC, 0.1% SDS 포함하는 용액 내 1시간 동안 37℃에서 세척되었고, 그 후 1*SSC and 0.1% SDS 포함하는 용액 내 60℃에서 30분 동안 두번 세척되었다. 4단계: 필터들은 도말(blotted) 건조되었고 방사선에 노출되었다. 본 발명에서 사용될 수 있는 보통의 엄격한 다른 조건은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려져있다(예를 들어 Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY; and Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, a Laboratory Manual, Stockton Press, NY 참조).
최종적으로, "낮은 엄격한 조건"은 하기를 포함할 수 있다: 1단계: DNA를 포함하는 필터는 35% 포름아미드, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.1% PVP, 0.1% Ficoll, 1% BSA, 및 500 ㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 내 40℃에서 6시간 동안 전처리되었다. 2단계: 필터는 0.02% PVP, 0.02% Ficoll, 0.2% BSA, 100 ㎍/ml 연어 정자 DNA, 10% (wt/vol) 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 및 5-20 x 106 cpm 32P-표지된 프로브가 첨가된 동일한 용액 내 40℃에서 18-20 시간 동안 혼성화되었다. 3단계: 필터는 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, 및 0.1% SDS를 포함하는 용액 내 55 C에서 1.5 시간 동안 세척되었다. 세척 용액은 깨끗한 용액으로 교체되었고 60℃에서 추가적인 1.5 시간 배양되었다. 4단계: 필터들은 도말 건조되었고 방사능에 노출되었다. 만약 필요하다면, 필터는 65-68℃에서 3회 세척되었고 필름에 재 노출되었다. 본 발명에 사용될 수 있는 낮은 엄격한 다른 조건은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려져 있다(예를 들어, 종간 혼성화에 이용과 같은). 예를 들어 Ausubel et al., (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; and Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY 참조.
본 발명에 따라 상기 정의된 핵산 서열은 펩타이드, 즉 분석, 특징화(characterization) 또는 치료적 용도를 위해 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 서열 또는 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드; 대응되는 펩타이드(본 발명에 사용된)가 우선적으로 발현된(구성적이거나(constitutively) 또는 조직 분화 또는 발달의 특정한 단계 또는 질병 상태에서) 조직에 대한 마커를 발현시키는데 사용될 수 있다, 이들 핵산에 대한 다른 용도는 예를 들어 핵산의 겔 전기영동 기초의 분석에서 분자량 마커를 포함한다.
본 발명의 추가적인 실시예에 따르면, 발현 벡터는 상기 정의된 하나 또는 그 이상의 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드의 재조합 발현을 위한 상기 목적에 사용될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 이중-가닥 또는 단일-가닥의 원형 또는 선형의 DNA 또는 RNA를 지정하기(designate) 위해 본 발명에 사용된다. 이는 나아가 숙주 세포 속으로 또는 단세포 또는 다세포 숙주 유기체 속으로 이식되는 상기 정의된 적어도 하나의 핵산을 포함한다. 본 발명에서 사용된 발현 벡터는 바람직하게는 본 발명에서 사용된 JNK 억제자 서열 또는 절편 또는 이의 변이체, 또는 본 발명에서 사용된 키메라 펩타이드, 또는 이의 절편 또는 변이체를 부호화하는 상기 정의된 핵산을 포함한다. 추가적으로 본 발명에 따른 발현 벡터는 바람직하게는 바이러스, 박테리아, 식물, 포유류, 및 다른 진핵생물 원천으로부터 인헨서/프로모터와 같이 절연체(insulators), 경계 인자, LCRs(예를 들어 Blackwood and Kadonaga (1998), Science 281, 61-63에 의해 설명된) 또는 매트릭스/스캐폴드 결합(attachment) 부위(예를 들어 Li, Harju and Peterson, (1999), Trends Genet. 15, 403-408에 의해 설명된)와 같이 숙주 세포 내에 삽입된 폴리뉴클레오티드의 발현을 끌어내는 다양한 조절 인자를 포함하는 지원(supporting) 발현에 대한 적절한 인자를 포함한다. 몇몇 실시예에서는 조절 인자는 이종이다(즉, 천연 유전자 프로모터가 아니다). 그렇지 않으면, 필요한 전사 및 번역 신호는 또한 유전자 및/또는 이들의 측면(flanking) 구역을 위한 천연 프로모터에 의해 공급될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프로모터"는 상기 정의된 하나 또는 그 이상의 핵산 서열의 전사를 조절하는 기능을 하며, DNA-의존적 RNA-폴리머라제에 대한 결합 위치의 존재 및 프로모터 기능을 조절하기 위해 상호작용하는 다른 DNA 서열의 존재에 의해 구조적으로 식별되는 DNA의 영역에 관한 것이다. 프로모터의 기능적인 발현 촉진 절편은 프로모터로 활성을 유지하는 단축되거나 생략된(truncated) 프로모터 서열이다. 프로모터 활성은 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 어떤 분석을 통해 측정될 수 있다(예를 들어 Wood, de Wet, Dewji, and DeLuca, (1984), Biochem Biophys. Res. Commun. 124, 592-596; Seliger and McElroy, (1960), Arch. Biochem. Biophys. 88, 136-141) 참조 또는 Promega®로부터 시중에서 구입가능함).
본 발명에서 정의된 발현 벡터 내에 사용된 "인헨서 영역"은 전형적으로 하나 또는 그 이상의 유전자의 전사를 향상시키는 기능을 하는 DNA의 영역에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 사용된 용어 "인헨서"는 유전자의 위치 및 발현되는 vis-a'-vis 유전자의 방향과 관계없이 유전자의 발현을 증진(enhances), 증가(augments), 향상(improves), 또는 개선(ameliorate)하며, 하나 이상의 프로모터의 발현을 증진, 증가, 향상, 또는 개선할 수 있는 DNA 조절 인자이다
본 발명에 정의된 발현 벡터에서 사용된 프로모터/인헨서 서열은 식물, 동물, 곤충, 또는 곰팡이 조절 서열을 활용할 수 있다. 예를 들어, 프로모터/인헨서 인자는 효모 및 다른 곰팡이로부터 사용될 수 있다(예를 들어 GAL4 프로모터, 알코올 탈수소효소(dehydrogenas) 프로모터, 포스포글리세롤(phosphoglycerol) 인산화효소 프로모터, 알칼리(alkaline) 포스파타제(phosphatase) 프로모터). 그렇지 않으면, 또는 추가적으로, 이들은 동물 전사 조절 영역을 포함할 수 있다, 예를 들어 (i) 췌장 베타-세포 내에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역(예를 들어 Hanahan, et al., 1985. Nature 315: 115-122 참조); (ii) 림프성 세포 내에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역(예를 들어 Grosschedl, et al., 1984, Cell 38 : 647-658 참조); (iii) 간 내에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역(예를 들어 Pinckert, et al., 1987. Genes and Dev 1: 268-276 참조; (iv) 뇌 희소돌기아교세포(oligodendrocyte cells) 내에 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역(예를 들어 Readhead, et al., 1987, Cell 48: 703-712 참조); 및 (v) 시상하부 내에 활성인 성선자극호르몬(gonadotropin)-방출 호르몬 유전자 조절 영역(예를 들어 Mason, et al., 1986, Science 234: 1372-1378 참조) 등.
추가적으로, 본 발명에서 정의된 발현 벡터는 증폭 마커를 포함할 수 있다. 이 증폭 마커는 예를 들어 아데노신 탈아미노효소(adenosine deaminase)(ADA), 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase)(DHFR), 복수 약물 저항 유전자(MDR), 오르니틴 탈탄산효소(ornithine decarboxylase)(ODC) 및 N-(포스폰아세틸)-L-아스파테이트 저항(N-(phosphonacetyl)-L-aspartate resistance)(CAD)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 적합한 예시적인 발현 벡터 또는 이들의 유도체은 특히, 예를 들어 인간 또는 동물 바이러스(예를 들어 우두(vaccinia) 바이러스 또는 아데노바이러스); 곤충 바이러스(예를 들어 배큘로바이러스(baculovirus)); 효모 벡터; 박테리오파지 벡터(예를 들어 람다 파지); 플라스미드 벡터 및 코스미드 벡터를 포함한다.
본 발명은 추가적으로 상기 정의된 핵산의 펩타이드 코딩 서열(들) 발현이 가능한 숙주-벡터 시스템의 다양성을 활용할 수 있다. 이들은 (i) 우두 바이러스, 아데노바이러스 등에 감염되는 포유류 세포 시스템; (ii) 배큘로바이러스 등에 감염되는 곤충 세포 시스템; (iii) 효모 벡터를 포함하는 효모 또는 (iv) 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 숙주-벡터 시스템 활용에 따라, 적절한 전사 및 번역 인자의 다수 중 어느 하나가 사용될 수 있다.
바람직하게는, 그러한 숙주-벡터 시스템에 적합한 숙주 세포 균주는 관심있는 삽입 서열의 발현을 조절하여 선택될 수 있거나, 또는 특정한 원하는 방식에서 서열에 의해 부호화되는 발현된 펩타이드를 변형 또는 공정(processes)한다. 추가로, 특정 프로모터로부터 발현은 선택된 숙주 균주에 특정한 유도자(inducers)의 존재로 증진될 수 있다; 따라서 유전적으로-조작된 펩타이드의 발현의 조절을 촉진한다. 게다가 다른 숙주 세포는 발현된 펩타이드의 번역 및 번역 후의 공정 및 변형(예를 들어 글리코실화, 인산화 등)에 대한 특징 및 특정한 메커니즘을 가진다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 따라서 원하는 변형을 달성하기 위해 선택될 수 있고 외래 펩타이드의 공정이 수행된다. 예를 들어, 박테리아 시스템 내 펩타이드 발현은 비-글리코실화된 코어 펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있다. 반면 포유류 세포 내 발현은 이종 펩타이드의 "천연" 글리코실화를 달성한다.
본 발명에 따라 정의된 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 핵산, 벡터, 및/또는 숙주 세포는 본 발명에서 정의된 질병들 중 어느 것의 예방 또는 치료, 특히 본 발명에서 정의된 안구 건조증의 예방 또는 치료에 적용될 수 있는 약학적 조성물로 제형화 될 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 따른 이러한 약학적 조성물은 활성 요소로 포함한다, 예를 들어: (i) JNK 억제자 서열의 어느 하나 또는 그 이상 및/또는 상기 정의된 키메라 펩타이드, 및/또는 변이체, 절편 또는 이들의 유도체, 특히 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 JNK 억제자 서열 및/또는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 서열에 따르는 키메라 펩타이드, 및/또는 상기 정의 내에 SEQ ID NOs: 5 내지 8 및 21 내지 22의 어느 것에 따르는 수송 서열, 또는 이의 변이체 또는 절편을 포함하는 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 JNK 억제자 서열; 및/또는 (ii) JNK 억제자 서열을 부호화하는 핵산 및/또는 상기 정의된 키메라 펩타이드 및/또는 이의 변이체 또는 절편, 및/또는 (iii) JNK 억제자 서열의 어느 하나 또는 그 이상을 포함하는 세포 및/또는 키메라 펩타이드, 및/또는 상기 정의된 변이체, 절편 또는 이의 유도체 및/또는 (iv) 벡터로 감염된 세포 및/또는 JNK 억제자 서열을 부호화하는 핵산 및/또는 상기 정의된 키메라 펩타이드 및/또는 이의 변이체 또는 절편.
바람직한 실시예에 따르면, 본 발명에 따라 사용된 이러한 약학적 조성물은 전형적으로 상기 정의된 안전하고 효과적인 양의 요소(component), 바람직하게는 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 적어도 하나의 JNK 억제자 서열의 및/또는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 서열에 따르는 적어도 하나의 키메라 펩타이드 및/또는 상기 정의 내에 SEQ ID NOs: 5-8 및 21 내지 22 중 어느 것에 따르는 수송 서열, 또는 이의 변이체 또는 절편을 포함하는 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 적어도 하나의 JNK 억제자 서열 또는 이를 부호화하는 적어도 하나의 핵산, 또는 적어도 하나의 벡터, 또는 상기 정의된 숙주 세포를 포함한다.
대상에 투여되는 약학적 조성물 내 각각의 JNK-억제자 서열 및 키메라 펩타이드의 양은 - 이에 제한됨이 없어- 매우 낮은 복용량(dose)을 가질 수 있다. 따라서, 복용량은 DTS-108(Florence Meyer-Losic et al., Clin Cancer Res., 2008, 2145-53)과 같은 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 펩타이드 약물보다 훨씬 낮을 수 있다. 이는 몇몇 긍정적인 측면, 예를 들어 잠재적인 부반응의 감소 및 비용의 감소를 가진다.
바람직하게는, 복용량(kg 체중 당)은 10 mmol/kg까지, 바람직하게는 1mmol/kg까지, 더욱 바람직하게는 100 μmol/kg까지, 더욱 더 바람직하게는 10 μmol/kg까지, 더욱 더 바람직하게는 1 μmol/kg까지, 더욱 더 바람직하게는 100 nmol/kg까지, 가장 바람직하게는 50 nmol/kg까지의 의 범위이다.
따라서 복용량 범위는 바람직하게는 약 1 pmol/kg 내지 약 1 mmol/kg, 약 10 pmol/kg 내지 약 0,1 mmol/kg, 약 10 pmol/kg 내지 약 0,01 mmol/kg, 약 50 pmol/kg 내지 약 1 μmol/kg, 약 100 pmol/kg 내지 약 500 nmol/kg, 약 200 pmol/kg 내지 약 300 nmol/kg, 약 300 pmol/kg 내지 약 100 nmol/kg, 약 500 pmol/kg 내지 약 50 nmol/kg, 약 750 pmol/kg 내지 약 30 nmol/kg, 약 250 pmol/kg 내지 약 5 nmol/kg, 약 1 nmol/kg 내지 약 10 nmol/kg, 또는 상기 수치 중 어느 2의 조합일 수 있다.
SEQ ID NO: 30에 따르는 JNK-억제자의 예시 복용량은 예를 들어 약 10, 50 또는 100 ㎍/kg일 수 있다.
이와 관련하여, 상기 약학적 조성물을 사용할 때 치료의 처방은, 예를 들어 복용량 등의 결정은 전형적으로 일반적 전문가들(practitioners) 및 다른 의학적 의사들의 책임감 내에서, 및 전형적으로 치료될 질병, 각각 환자의 상태, 전달 위치, 투여 방법 및 전문가들에 알려진 다른 인자를 고려한다. 상기 언급된 기술 및 규약(protocols)의 예시는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980에서 찾을 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 사용된 약학적 조성물의 요소에 대해 상기 언급된 "안전하고 효과적인 양"은, 안구 건조증의 긍정적인 변화를 현저하게 유도하기에 충분한 이들 요소의 각각 또는 전체의 양을 의미한다. 동시에, 그러나, "안전하고 효과적인 양"은 심각한 부작용을 회피하기에는 덜 충분하며, 이는 장점 및 위험 사이의 합리적인(sensible) 관계를 허용함을 말한다. 이들 한계의 결정은 전형적으로 합리적인 의학적 판단의 범위 내에 있다. 이러한 요소의 "안전하고 효과적인 양"은 치료될 특정한 조건 및 또한 치료될 환자의 나이 및 신체적 조건, 조건의 심각성(severity), 치료 기간, 병행 치료의 특성(nature), 특정한 약학적으로 허용가능한 사용된 담체, 및 유사한 인자, 동반 의사의 지식 및 경험 내에 관련되어 달라질 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 인간을 위한 및 또한 수의학적 의학적 목적을 위한 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 약학적 조성물은, 이들 물질들 중 어느 하나를 더하여, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에게 잘 알려진 (호환성 있는) 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제(excipient), 버퍼, 안정화제(stabilizer) 또는 다른 물질을 더 포함할 수 있다.
이와 관련하여, 표현 "(호환성 있는) 약학적으로 허용가능한 담체"는 바람직하게는 조성물의 액체 또는 비-액체 바탕을 포함한다. 용어 "호환성 있는"은 본 발명에서 사용된 약학적 조성물의 구성 성분(constituents)이 상기 정의된 약학적으로 활성이 있는 요소 및 보통의 사용 조건 하에 조성물의 약학적 효과를 지속적으로 감소시킬 수 있는 상호작용이 일어나지 않는 그러한 환경에서 하나의 다른 요소와 함께 혼합될 수 있는 것을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 반드시, 물론, 치료될 사람에게 투여에 적절하게 이들을 만들기 위해 충분히 높은 순도 및 충분히 낮은 독성을 가진다.
?약 본 발명에서 사용된 약학적 조성물이 액체 형태로 제공되면, 약학적으로 허용가능한 담체는 전형적으로 하나 또는 그 이상의 (호환 가능한) 약학적으로 허용가능한 액체 담체를 포함할 것이다. 조성물은 (호환 가능한) 약학적으로 허용가능한 액체 담체로서, 예를 들어 발열원(pyrogen)이 없는 물; 등장성 식염수(isotonic saline) 또는 버퍼 (수성) 용액, 예를 들어 인산염, 시트르산염 등 버퍼 용액, 예를 들어, 땅콩 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 테오브로마(theobroma)로부터 오일와 같은 식물성 오일; 예를 들어 폴리프로필렌 글리콜, 글리세롤, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 알긴산 등을 포함할 수 있다. 특히 본 발명에서 사용된 약학적 조성물의 투여를 위해, 버퍼, 바람직하게는 수용성 버퍼가 사용될 수 있다.
만약 본 발명에서 사용된 약학적 조성물이 고체 형태로 제공된다면, 약학적으로 허용가능한 담체는 전형적으로 하나 또는 그 이상의 (호환 가능한) 약학적으로 허용가능한 고체 담체를 포함할 것이다. 조성물은 (호환 가능한) 약학적으로 허용가능한 고체 담체를 포함할 수 있으며 예를 들어 예를 들어 하나 또는 그 이상의 호환 가능한 고체 또는 액체 필터 또는 희색액 또는 캡슐화 화합물은 사람에 투여를 위해 적당하게 또한 사용될 수 있다. 이러한 (호환 가능한) 약학적으로 허용가능한 고체 담체의 몇몇 예시는 예를 들어 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 설탕; 예를 들어 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 전분; 예를 들어 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; 가루로 만든 트래거캔스(tragacanth); 맥아; 젤라틴; 수지; 예를 들어 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트와 같은 고체 활주제; 칼슘 설페이트 등이 있다.
(호환 가능한) 약학적으로 허용가능한 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 투여 경로에 의존할 수 있다. 따라서 (호환 가능한) 약학적으로 허용가능한 담체의 선택은 본 발명에 따라 사용된 약학적 조성물이 투여되는 방식에 의해 원칙적으로 결정될 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 약학적 조성물은 예를 들어 전신에 투여될 수 있다. 투여를 위한 경로는 예를 들어 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 피하(subcutaneous), 피내(intradermal), 또는 경피(transdermal) 경로 등과 같은 비경구 경로(예를 들어 주사를 통해), 경구(orally) 또는 직장(rectally) 경로 등과 같은 장내 경로(enteral routes), 비강(nasal), 또는 비강내(intranasal) 경로 등과 같은 국소 경로, 또는 표피 경로 또는 패치 전달과 같은 다른 경로를 포함한다. 특히 선호되는 것은 또한 눈에/눈 속에 국소 투여, 예를 들어 초자체내(intravitreous) 투여, 결막하(subconjunctival) 투여 및/또는 점적(instillation)이다. 점적은 특히 만약 SEQ ID NO:11와 같은 JNK 억제자 펩타이드가 사용될 경우, 본 발명에서 논의된 안구 건조증의 치료용 투여의 가장 바람직한 경로이다.
나아가 본 발명에서 정의된 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 또는 핵산 서열은, 예를 들어 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열을 따르는 JNK 억제자 서열 및/또는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 서열을 따르는 키메라 펩타이드, 및/또는 SEQ ID NOs: 5 내지 8 및 21 내지 22의 어느 것을 따르는 수송 서열을 포함하는 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열 또는 상기 정의 내 이의 변이체 또는 절편을 따르는 JNK 억제자 서열이 안구 건조증의 치료, 예를 들어 안구 수술 또는 트라우마 이후, 특히 일반적으로 레이져 안구 수술로 알려진 라식(laser-assisted in situ keratomileusis) 이후에 활용될 수 있다.
통상적인 안구 건조의 치료는 인공 눈물, 사이클로스포린(특히 사이클로스포린 A; 예를 들어 Restasis®)의 투여; 자가혈청안약(autologous serum eye drops); 윤활 눈물 연고 및/또는 (코르티코-)스테로이드((cortico-)steroids)의 예를 들어 드롭 또는 안 연고의 형태로 투여를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 안구 건조의 일반적인 치료와 함께, 특히 상기 언급된 치료의 어느 하나와 함께 본 발명에서 정의된 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 또는 핵산의 조합된 투여를 포함하는 안구 건조증의 치료 방법에서, JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 또는 본 발명에서 정의된 핵산 서열, 예를 들어 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열을 따르는 JNK 억제자 서열 및/또는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 서열에 따르는 키메라 펩타이드, 및/또는 SEQ ID NOs: 5 내지 8 및 21 내지 22의 어느 것에 따르는 수송 서열을 포함하는 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 JNK 억제자 서열, 또는 상기 정의 내 이의 변이체 또는 절편의 용도에 관련된다. 특히 바람직하게는 사이클로스포린 A와의 가장 바람직한 것은 인공 눈물과의 조합이다. 조합된 투여는 병행(parallel) 투여 및/또는 순차적(subsequent) 투여(우선 본 발명에서 설명된 JNK 억제자 및 그 후 (코르티코)스테로이드 또는 역으로)를 포함한다. 분명히, 순차적 및 병행 투여는 또한 조합될 수 있다, 예를 들어 치료는 본 발명에서 설명된 JNK 억제자로 시작되고 치료 (코르티코)스테로이드의 과정에서 시간에 다음 시점은 병행 또는 역으로 주어질 수 있다.
사용되는 약학적 조성물의 적당한 양은 동물 모델을 이용한 일반 실험을 통해 결정될 수 있다. 이러한 모델은, 어떠한 제한도 가짐이 없이, 토끼, 양, 쥐, 랫(rat), 개 및 비-인간 영장류 모델을 포함한다. 주사를 위한 바람직한 단위 복용량 형태는 멸균수, 생리식염수 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 이러한 용액의 pH는 약 7.4로 조정되어야 한다. 주사를 위해 적절한 담체는 하이드로겔, 조절된 또는 지연된 방출을 위한 장치, 폴리락트산 및 콜라겐 망을 포함한다. 국소(topical) 적용(application)을 위한 적절한 약학적으로 허용가능한 담체는, 로션, 크림, 겔 등으로 용도에 적합한 이들을 포함한다. 만약 조성물이 경구로 투여된다면, 정제, 캡슐 및 이와 같은 것이 바람직한 단위 복용량 형태이다. 경구 투여를 위해 사용될 수 있는 단위 복용량 형태의 제조를 위한 약학적으로 허용가능한 담체는 선행 기술에서 잘 알려져 있다. 이의 선택은 본 발명의 목적에 중요하지 않으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 어려움 없이 만들어질 수 있는 미감, 비용 및 저장성과 같은 제2의 문제(secondary consideration)에 의존할 수 있다.
경구 투여를 위한 약학적 조성물은 정제, 캡슐, 파우더 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 젤라틴, 및 선택적으로 애쥬번트(adjuvant)와 같은 상기 정의된 고체 담체를 포함할 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 약학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일과 같이 상기 정의된 액체 담체를 포함할 수 있다. 생리식염수 용액, 덱스트로스 또는 다른 당류(saccharide) 용액 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다.
예를 들어, 정맥내, 피부 또는 피하 주사, 고통스러운 자리에 주사를 위해 또는 특히 안구에 점적을 위해, 활성 성분은 바람직하게는 발열원(pyrogen)이 없으며 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수용성 용액의 형태가 될 것이다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 관련 기술들은 사용하는 적절한 용액, 예를 들어 소듐 클로라이드 주사(Sodium Chloride Injection), 링거 주사(Ringer's Injection), 락테이티드 링거 주사(Lactated Ringer's Injection)와 같은 등장성 담체를 잘 제조할 수 있다. 방부제, 안정제, 버퍼, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다. 개인에게 주어진 본 발명에 따르는 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 핵산 분자, 다른 약학적으로 유용한 화합물인지에 따라, 투여는 바람직하게는 개인에게 이익(benefit)을 보이기에 충분한 "예방을 위한(prophylactically) 효과적인 양 또는 "치료적으로 효과적인 양"(이러한 경우가 있을 수 있음) 내 이다. 실제 투여되는 양, 및 투여 속도 및 시간-과정은 치료되는 것의 특성 및 심각성(severity)에 의존할 것이다.
본 발명에서 정의된 질병의 예방 및/또는 치료는 전형적으로 상기 정의된 약학적 조성물의 투여를 포함한다. 용어 "조절"은 상기 질병의 어느 것에서 과발현될 때 JNK의 발현의 억제를 포함한다. 이는 또한 이에 제한됨이 없이, 상기 어느 질병들 가운데, c-jun, ATF2 또는 NFAT4의 인산화의 억제, 세포 내 천연 c-jun, ATF2 및 NFAT4 결합 부위의 경쟁적인 억제자로서, 예를 들어 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열을 따르는 적어도 하나의 JNK 억제자 서열을 사용하여 및/또는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 서열에 따르는 적어도 하나의 키메라 펩타이드, 및/또는 SEQ ID NOs: 5 내지 8 및 21 내지 22의 어느 것에 따르는 수송 서열을 포함하는 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 적어도 하나의 JNK 억제자 서열, 상기 정의 내 이들의 변이체 또는 절편을 포함한다. 용어 "조절"은 또한, 이에 제한됨이 없이, c-jun, ATF2, 또는 NFAT4 및 예를 들어 c-jun, AFT2 및 c-fos로 이루어진 AT-1 복합체와 같은 이들의 관련된 파트너로 이루어진 전사 인자의 이종(hetoro-) 및 동종(homomeric) 복합체의 억제를 포함한다. 어떤 경우에, "조절"은 예를 들어 JNK에 IB-펩타이드의 결합을 막아 IB-관련된 펩타이드에 의해 JNK 억제를 막는 IB 펩타이드-특이 항체의 사용에 의해, 이후 JNK 발현의 증가를 포함할 수 있다.
상기 개시된 약학적 조성물로 대상의 예방 및/또는 치료는 전형적으로 대상에 상기 약학적 조성물의 ("치료적으로 효과적인") 양의 투여에 의해 수행될 수 있으며, 상기 대상은 예를 들어 어느 포유류, 예를 들어 인간, 영장류, 쥐, 랫, 개, 고양이, 소, 말 또는 돼지일 수 있다. 용어 "치료적으로 효과적인"은 안구 건조증 및/또는 관련된 증상을 개선하기 위해 충분한 양의 약학적 조성물의 활성 요소를 의미한다.
따라서, 상기 정의된 펩타이드, 예를 들어 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 적어도 하나의 JNK 억제자 서열 및/또는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 서열에 따르는 적어도 하나의 키메라 펩타이드, 및/또는 SEQ ID NOs: 5 내지 8 및 21 내지 22의 어느 것에 따르는 수송 서열을 포함하는 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 적어도 하나의 JNK 억제자 서열, 또는 상기 정의 내 이의 변이체 또는 절편은 안구 건조증의 치료에 본 발명의 특정한 실시예에서 활용될 수 있다.
상기 정의되고 창의적인 약학적 조성물 내에 포함된 펩타이드는 또한 핵산에 의해 부호화될 수 있다. 만약 상기 펩타이드가 유전자 치료의 목적을 위해 투여된다면 이는 특히 유리하다. 이와 관련하여, 유전자 치료는 예를 들어 상기 정의된 약학적 조성물의 방식에 의해 대상에 상기 정의된 특정한 핵산의 투여에 의해 수행되는 치료에 관련되고, 상기 핵산(들)은 독점적으로 L-아미노산을 포함한다. 본 발명의 이러한 실시예에서, 핵산은 이 후 질병 또는 장애의 기능을 조절함으로써 치료적 효과를 가하기 위해 제공되는 이들의 부호화된 펩타이드(들)을 생산한다. 본 발명이 속하는 기술분야 내에서 가능한 유전자 치료에 관련된 어느 방법은 본 발명의 수행(practice)에 사용될 수 있다(예를 들어 Goldspiel, et al., 1993. Clin Pharm 12: 488-505 참조).
바람직한 실시예에서, 상기 정의되고 유전자 치료에 사용된 핵산은 적절한 숙주 내에 상기 정의된 IB-관련된 펩타이드의 어느 하나 또는 그 이상을 부호화하고 발현하는 발현 벡터의 일부, 즉 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 JNK 억제자 서열 및/또는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 서열에 따르는 키메라 펩타이드, 및/또는 SEQ ID NOs: 5 내지 8 및 21 내지 22의 어느 것에 따르는 수송 서열을 포함하는 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 JNK 억제자 서열, 또는 상기 정의 내에 이의 변이체 또는 절편이다. 특정한 실시예에서, 이러한 발현 벡터는 JNK 억제자 서열의 코딩 영역(들)에 실시가능하게 연결된 프로모터를 가진다. 프로모터는 예를 들어, 유도적인 또는 구성요소인(constitutive), 및, 선택적으로, 조직 특이적으로 상기와 같이 정의될 수 있다.
다른 특정한 실시예에서, 상기 정의된 핵산 분자는 유전자 치료에 사용되며, 상기 정의된 핵산 분자의 코딩 서열은 유전체 내에 원하는 위치에 상동(homologous) 재조합을 촉진시키는 영역의 측면에 있어, 이들 핵산의 염색체내 발현을 제공한다(예를 들어 Koller and Smithies, 1989. Proc Natl Acad Sci USA 86: 8932-8935 참조).
특히 상기 정의된 것처럼 상기 언급된 안구 건조증과 관련하여, 유전자 치료의 목적을 위해 환자에게 본 발명에 따라 상기 정의된 핵산의 전달은 직접적(즉 환자가 직접적으로 핵산 또는 핵산을 포함하는 벡터에 노출됨) 또는 간접적(즉 세포들이 우선 체외에서 핵산으로 형질전환된 이후 환자에 이식됨)일 수 있다. 이들 두가지 접근법은 체내 또는 체외 유전자 치료로서 각각 알려져 있다. 본 발명의 특정한 실시예에서, 핵산은 체내에 직접적으로 투여되고, 여기서 부호화된 생산물을 생성하기 위해 발현된다. 이는 특히 관심있는 수용체 등을 발현하는 "목표" 세포 타입에 사용될 수 있는, 예를 들어 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 핵산을 구성 및 세포 내로 되도록 하는 방식으로 동일한 투여(예를 들어 결함이 있거나 약화된 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터; U. S. Patent No. 4,980,286 참조); 직접적인 네이키드(naked) DNA의 투입; 마이크로입자 총 형질전환법(microparticle bombardment)을 사용(예를 들어 "GeneGun"; Biolistic, DuPont); 지질로 핵산을 코팅; 연관된 세포-표면 수용체/감염(transfecting)제의 사용; 리포좀, 마이크로입자, 또는 마이크로캡슐의 캡슐화; 핵으로 침투하는 것으로 알려진 펩타이드에 연결된 것의 투여; 또는 수용체-매개 엔도시토시스(endocytosis)를 하게 하는 리간드에 연결된 것의 투여에 의한 것을(예를 들어 Wu and Wu, 1987.J Biol Chem 262: 4429-4432 참조) 포함하는 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 많은 방법들 중 어느 것에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 수행에서 유전자 치료에 추가적인 접근은 전기천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection), 칼슘 인산염-매개 감염, 바이러스 감염 등과 같은 이러한 방법에 의해 체외 조직 배양 내 세포에 상기 정의된 핵산의 이식을 포함한다. 일반적으로, 이식 방법은 세포로 선택가능한 마커의 이식이 수반됨을 포함한다. 세포는 이후 흡수되고 이식된 유전자를 발현하는 이들 세포의 분리를 촉진할 수 있도록 선택 압력(예를 들어 항생제 저항성) 하에 위치한다. 이들 세포는 이후 환자에게 전달된다. 특정한 실시예에서, 결과 재조합 세포의 생체내 투여 전에, 핵산은 본 발명이 속하는 기술분야에서 어느 알려진 방법, 예를 들어 형질주입(transfection), 전기천공, 미세주사(microinjection), 관심 핵산 서열을 포함하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터로 감염, 세포 융합, 염색체-매개 유전자 이식, 마이크로세포-매개 유전자 이식, 스페로플라스트(spheroplast) 융합, 및 이식에 의해 방해되지 않는 수용 세포의 필수적인 발달 및 생리학적인 기능을 보장하는 유사한 방법에 의해 세포에 도입된다. 예를 들어 Loeffler and Behr, 1993. Meth Enzymol 217 : 599-618 참조. 선택된 기술은 핵산은 세포에 의해 발현될 수 있도록, 세포에 핵산의 안정적인 이식을 위해 제공되어야 한다. 바람직하게는, 이식된 핵산은 유전적이며 후대 세포에 의해 발현가능하다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 결과 재조합 세포는 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 다양한 방법, 예를 들어 상피 세포(예를 들어, 피하)의 주사, 환자에 피부 이식으로 재조합 피부 세포의 적용, 및 재조합 혈액 세포의 정맥 주사(예를 들어 조혈 줄기 또는 간세포)에 의해 환자에게 전달될 수 있다. 사용을 위해 구상되는(envisioned) 세포의 총량은 원하는 효과, 환자의 상태 등에 따르며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 유전자 치료의 목적을 위해 핵산이 도입될 수 있는 세포는 어떠한 원하는, 가능한 세포 형태를 포함할 수 있으며, 이종(xenogeneic), 이질(heterogenic), 동계(syngeneic), 또는 자가유래(autogeneic)일 수 있다. 세포 타입은, 이에 한정되는 않으며, 상피 세포, 내피 세포, 케라티노사이트(keratinocytes), 섬유아세포(fibroblasts), 근육세포, 간세포(hepatocytes) 및 혈액 세포, 또는 다양한 줄기 또는 간 세포, 특히 배아 심장 근육 세포, 간 줄기 세포(국제 특허 공개 WO 94/08598), 신경 줄기 세포(Stemple and Anderson, 1992,Cell 71 : 973-985), 예를 들어, 골수, 제대혈, 말초혈, 태아 간 등으로부터 얻어진 조혈 줄기 또는 간 세포를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 유전자 치료를 위해 활용된 세포는 환자에게 자가유래이다.
그렇지 않으면 및/또는 추가적으로, 본 발명에서 언급된 질병의 치유(treating)를 위해 타게팅 치료(targeting therapies)는, (타게팅) 항체 또는 세포 특이 리간드와 같은 타게팅 시스템의 사용에 의해, JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 및/또는 상기 정의된 핵산 보다 구체적으로는 특정한 세포의 타입을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 타게팅을 위해 사용된 항체는 전형적으로 하기 정의된 어느 질병과 관련된 세포의 세포 표면 단백질에 특이적이다. 예로서, 이들 항체는 MHC 클래스 II DR 단백질, CD18 (LFA-1 베타 체인), CD45RO, CD40 또는 Bgp95, 또는 예를 들어 CD2, CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD13, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD39, CD4, CD43, CD45, CD52, CD56, CD68, CD71, CD138로부터 선택된 세포 표면 단백질 등과 같은 B-세포 연관 표면 단백질과 같은 세포 표면 항체에 지정될 수 있다. 타게팅 구성은 전형적으로 세포 표면 단백질에 특이적인 항체에 본 발명에 따르는 본 발명에서 정의된 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 및 핵산에 공유 결합에 의해 또는 세포 특이적 리간드에 결합에 의해 제조될 수 있다. 단백질은 예를 들어 항체와 같은 것에 결합될 수 있거나 펩타이드 결합에 의해 또는 화학적 짝지음, 가교(crosslinking) 등에 의해 이에 결합될 수 있다. 타게팅 치료는 이후 하기 정의된, 예를 들어 복강내(intraperitoneal), 비강(nasal), 정맥내(intravenous), 구강 및 패치 전달 경로, 어느 투여 경로에 의해 환자에게 약학적으로 효과적인 양으로 타게팅 구성을 투여함으로써 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 정의된 타게팅 항체 또는 세포 특이적 리간드에 결합하는, 본 발명에 따르는 본 발명에서 정의된 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 또는 핵산은 예를 들어, 공유 결합의 가수분해에 의해, 펩티다아제(peptidases)에 의해, 또는 어느 다른 적절한 방법에 의해 체내 또는 체외로 방출될 수 있다. 그렇지 않으면, 본 발명에 따르는 본 발명에서 정의된 만약 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 또는 핵산은 작은 세포 특이적 리간드에 결합하고 리간드의 방출은 수행되지 않을 것이다. 만약 세포 표면에 존재한다면, 키메라 펩타이드는 이의 수송 서열의 활성에 따라 세포에 침투할 수 있다. 타게팅은 다양한 이유에서 바람직할 수 있다; 예를 들어 만약 본 발명에 따르는 본 발명에서 정의된 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 및 핵산이 받아들일 수 없을 정도로(unacceptably) 독성이 있거나 만약 그렇지 않으면 너무 높은 복용량(dosage)를 요구하는 경우.
본 발명에 따르는 본 발명에 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드의 직접적인 투여 대신에, 그들은 세포에 도입되는 부호화 유전자로부터 발현에 의해 목표 세포 내에, 예를 들어 투여되는 바이러스 벡터로부터 생산될 것이다. 바이러스 벡터는 전형적으로 본 발명에 따르는 본 발명에 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드를 부호화한다. 벡터는 치료될 특정한 세포에 목표되어야 한다. 게다가, 벡터는 정의된 조절(regulation)에 따라 목표 세포에 의해 보다 선택적으로 더욱 또는 덜 전환(switched)되는 조절 인자를 포함할 수 있다. 이러한 기술은 그들의 전구체 형태 대신에 성숙 단백질을 활용하는, VDEPT 기술의 변이체를 나타낸다(바이러스-지정된 효소 전구약물 치료).
그렇지 않으면, 본 발명에서 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드는 항체 또는 바이러스의 사용에 의해 전구체 형태로 투여될 수 있다. 이들 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드는 이후 생산 활성화제, 또는 목표로 된, 치료될 세포에 의해 활성화 형태로 변환될 수 있다. 이 접근의 타입은 ADEPT(항체-지정 효소 전구약물 치료) 또는 VDEPT(바이러스-지정 효소 전구약물 치료)로 종종 알려져 있다; 전자는 세포-특이적 항체에 결합에 의해 세포에 타게팅 활성화제를 포함하는 반면, 후자는 활성화제, 예를 들어 바이러스 벡터 내 부호화 DNA로부터 발현에 의한 벡터에, JNK 억제자 서열 또는 키메라 펩타이드의 생산을 포함한다(예를 들어 EP-A-415731 및 WO 90/07936 참조).
추가적인 실시예에 따르면, 본 발명에서 정의된 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 또는 핵산, 예를 들어 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 JNK 억제자 서열 및/또는SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 어느 서열에 따르는 키메라 펩타이드, 및/또는 SEQ ID NOs: 5 내지 8 및 21 내지 22의 어느 것에 따르는 수송 서열을 포함하는 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 JNK 억제자 서열, 또는 상기 정의 내에 이의 변이체 또는 절편은 상기 정의된 안구 건조증의 검출(detect), 예측(prognose), 진단(diagnose), 또는 감시(monitor)하기 위한 (체외) 분석(예를 들어 면역분석법) 또는 이의 치료의 감시에 활용될 수 있다. 면역분석법은 면역특이적-결합이 일어날 수 있는 조건하에서, 이후 항체에 의한 어느 면역특이적-결합의 양을 검출 또는 측정하는 상기 정의된 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 또는 핵산 서열에 항체로 환자로부터 유래된 샘플에 접촉을 포함하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 특정한 실시예에서, JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드 또는 핵산 서열에 대해 특이적인 항체는 JNK 또는 JNK 억제자 서열의 존재에 대해 환자로부터 조직 또는 혈청 샘플을 분석하기 위해 사용될 수 있다; 상기 JNK의 비정상(aberrant) 수준은 발병 상태의 지표이다. 활용될 수 있는 면역분석은 웨스턴 블롯, 방사면역측정(RIA), 효소결합면역흡착분석(ELISA), "샌드위치" 면역분석, 면역침전분석, 침강(precipitin)반응, 겔확산침강반응, 면역침윤분석, 면역확산분석, 교착분석, 형광면역분석, 보체결합분석, 면역방사계측(immunoradiometric)분석, 및 단백질-A 면역분석 등과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 및 비-경쟁적 분석 시스템을 포함하며, 이에 한정되지는 않는다. 그렇지 않으면, (체외) 분석은 예를 들어 배양된 동물 세포, 인간 세포 또는 미생물로부터 전형적으로 선택된 목표 세포에, 그리고 통상의 기술자에게 전형적으로 알려진 생물 물리학적 방법에 의한 세포 반응을 감시하기 위해, 상기 정의된 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 핵산 또는 JNK 억제자 서열에 또는 키메라 펩타이드에 항체의 전달에 의해 수행될 수 있다. 그 안에 전형적으로 사용된 목표 세포는 배양된 세포(체외) 또는 체내 세포, 즉 살아있는 동물 또는 인간에서 발견된 살아있는 동물 또는 인간, 또는 미생물의 기관 또는 조직을 구성하는 세포일 수 있다.
본 발명은 추가적으로 진단 또는 치료 목적, 특히 상기 정의된 안구 건조증의 치료, 예방 또는 감시를 위한 키트의 용도를 제공하며, 상기 키트는 JNK 억제자 서열, 키메라 펩타이드, 핵산 서열 및/또는 상기 정의된 이들 JNK 억제자 서열에 대한 또는 키메라 펩타이드에 대한 항체, 예를 들어 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 JNK 억제자 서열에 대한, SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32의 서열의 어느 것에 따르는 키메라 펩타이드에 대한, SEQ ID NOs: 5 내지 8 및 21 내지 22의 어느 것에 따르는 수송 서열을 포함하는 SEQ ID NOs: 1 내지 4 및 13 내지 20 및 33-100의 어느 서열에 따르는 JNK 억제자 서열에 대한, 또는 상기 정의 내에 이의 변이체 또는 절편에 대한 항-JNK 억제자 서열 항체, 또는 이러한 항-JNK 억제자 서열 항체 및, 선택적으로, 항체에 표지된 결합 파트너를 포함하는 하나 또는 그 이상의 용기(containers)를 포함한다. 항체 내에 따라 병합된 표지는 화학발광의(chemiluminescent), 효소의, 형광성의, 비색적(colorimetric) 또는 방사성의 일부분을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 다른 특정한 실시예에서, 안구 건조증의 치료, 예방 또는 감시에 진단적 용도를 위한 키트는 부호화하는 핵산을 포함하는 하나 또는 그 이상의 용기를 포함하는 것이 제공되고, 또는 그렇지 않으면, 상기 정의된 JNK 억제자 서열 및/또는 키메라 펩타이드에 상보적인(complement) 것, 선택적으로, 이들 핵산에 표지된 결합 파트너가 또한 제공된다. 다른 특정한 실시예에서, 키트는 하나 또는 그 이상의 용기, 중합효소연쇄반응(PCR; 예를 들어 Innis, et al., 1990. PCR PROTOCOLS, Academic Press, Inc., San Diego, CA 참조), 결합효소연쇄반응, 순환 프로브 반응(cyclic probe reaction) 등을 위한 프라이머의 증폭으로 활동할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍(예를 들어 각 6-30개 길이의 뉴클레오티드)을 포함하는 키트로써 상기 목적을 위해 사용될 수 있거나, 본 발명이 속하는 기술분야 내에 알려진 다른 방법은 상기 정의된 핵산과 관련하여 사용되었다. 키트는 상기 목적을 위한 분석에서 진단, 표준(standard) 또는 조절로써 용도를 위해, 선택적으로, 나아가 상기 정의된 정제된 JNK 억제자 서열, 상기 정의된 키메라 펩타이드, 또는 이들을 부호화하는 핵산의 미리결정된(predetermined) 양을 포함한다.
본 발명은 본 발명에서 설명된 특정한 실시예에 의해 발명의 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본 발명에서 설명된 그것들에 추가하여 본 발명의 다양한 변형은 앞서 말한 설명 및 첨부 도면으로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항들의 범위 내에 속한다.
다양한 공개들이 본 발명에서 인용되었고, 개시된 내용은 그들의 전체가 참고로 인용된다.
따라서, 본 발명에 따른 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드의 용도는 안구 건조증 및/또는 관련된 병리학적 효과, 증상 등을 치료하는 의약을 제공할 수 있다.
도면 1a~1b는 랫(rat)으로부터 IB1 cDNA 서열 및 이의 예견된 아미노산 서열(SEQ ID NO:102)을 나타냄.
도면 2a~2c는 rIB1 유전자 - 스플라이스 공여체의 엑손-인트론 경계에 의해 부호화된 랫으로부터 IB1 단백질 서열(SEQ ID NO:103)을 나타냄.
도면 3a~3c는 Homo sapiens로부터 IB1 단백질 서열(SEQ ID NO:104)을 나타냄.
도면 4a~4b는 Homo sapiens로부터 IB1 cDNA 서열(SEQ ID NO:105)을 나타냄.
도면 5는 안구 건조증 유도된 스코폴라민으로 동물에 대해 TBUT AUC 수치의 계산된 평균을 나타냄. 이는 수송체(vehicle)로 처리된 동물에 대한 결과, 및 SEQ ID NO: 11의 서열로 모든-D-레트로-인버소 JNK-억제자 (폴리-)펩타이드의 3가지 다른 농도임.
도면 6은 안구 건조 유도된 스코폴라민으로 동물에 대해 PRTT AUCs 계산된 평균을 나타냄(7-21일). 이는 수송체로 처리된 동물에 대한 결과, 및 SEQ ID NO: 11의 서열로 모든-D-레트로-인버소 JNK-억제자 (폴리-)펩타이드의 3가지 다른 농도임.
도면 7은 안구 건조증 유도된 스코폴라민으로 동물에 대해 조직학적 각막 병변 점수(histological Cornea Lesion Scores) 평균을 나타냄. 이는 수송체로 처리된 동물에 대한 결과, 및 SEQ ID NO: 11의 서열로 모든-D-레트로-인버소 JNK-억제자 (폴리-)펩타이드의 3가지 다른 농도임.
다르게 정의되지 않는한, 본 발명에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명에 속하는 기술분야에서 통상의 기술자 중의 한명에 의해 일반적으로 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 설명된 것들에 유사 또는 동등한 방법 및 물질은 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 적절한 방법 및 물질은 아래에 설명된다. 모든 공개, 특허 출원, 특허, 및 본 발명에 언급된 다른 참고문헌은 그들의 전체가 참고로 포함된다. 상충되는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서는 통제할 것이다. 추가로, 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적이며 제한되지 않도록 의도된다.
용액 및 생산물
SEQ ID NO: 11의 모든-D-레트로-인버소 JNK-억제자 (폴리-)펩타이드는 폴리펩타이드 연구소(Polypeptide Laboratories)(프랑스)에 의해 생산되었고 고성능액체크로마토그래피(HPLC)에 의해 정제되었다. 이는 식별을 위해 질량분석법 및 순도를 위해 RP-HPLC로 분석되었다(폴리펩타이드 연구소, 프랑스). 오직 냉동건조된, 분말은 2-8℃에서 저장되었다.
쥐에서 안구 건조의 스코폴라민-유도된 모델에 세가지 복용량에 SEQ　ID　NO: 11 의 모든-D-레트로-인버소 JNK-억제자 (폴리-)펩타이드의 효과
연구 개념
본 연구의 목적은 스코폴라민-유도된 안구 건조의 쥐 모델에서 세가지 복용량 수준에 SEQ　ID　NO: 11의 모든-D-레트로-인버소 JNK-억제자 (폴리-)펩타이드의 효과를 측정하는 것이다.
SEQ ID NO: 11의 펩타이드는 안구 건조의 이 쥐과 모델 내 효율에 대해 실험되었다. 펩타이드는 낮은, 중간 및 높은 복용량에서 실험되었다. SEQ ID NO: 11의 펩타이드에 대해 낮은, 중간 및 높은 복용량 수준에 대한 샘플 제형 내에 측정된 농도는 각각 0.06% (w/v), 0.25% (w/v) 및 0.6% (w/v)이다. 또한 음성 대조군으로 제공된 수송체(vehicle)는 주사 USP를 위한 0.9% 소듐 클로라이드이다.
연구는 각각 12마리 쥐의 4그룹 및 4마리 쥐의 추가적인 그룹을 포함하는 암컷 C57BL/6 쥐의 총 5 그룹으로 구성된다. 양쪽(Bilateral) 단기 안구 건조는 스코폴라민 브롬화수소산염(Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)의 조합의 주사(피하(SC), 하루 4회, 0.5 mg/복용량, 0-21일)에 의해 및 일정한 통풍(air draft)의 건조 환경에 쥐를 노출시킴으로써 유도된다. 시작하는 첫째날, 그룹 1-4의 쥐들은 수송체(0.9% 멸균 식염수;음성 대조군 항목) 또는 SEQ ID NO: 11 (0.06%, 0.25% 및 0.6%)의 펩타이드의 양쪽 국소 안구(양안(oculus uterque); OU) 투여 (5㎕/눈/복용량)로 21일 동안 하루 3회(TID) 처리되었다. 그룹 5의 쥐들은 유도되지 않은(안구 건조가 없는) 비처리된 군으로 유지되었다.
살아있는 (처리) 기간 동안, 임상적 관찰은 매일 한번 기록되었다; 각막 플루오레세인 염색으로 세극등(slit-lamp) 실험(SLE), 누액층 파괴 시간 실험(tear break-up time test)(TBUT), 및 페놀 레드 실 실험(phenol red thread test)(PRTT)는 일주일에 3회 수행되었다. 부검(Necropsies)은 22일째 수행되었다; 눈, 안검, 결막, 및 눈물샘은 각 동물의 양안으로부터 수집되었다. 오른쪽 눈으로부터 조직(우안(oculus dexter), OD)은 고정되었고 이후 현미경으로 측정되었다. 왼쪽 눈으로부터 조직(좌안(oculus sinister); OS)은 액체 질소 내 급속 냉동되었고 연이은 분석이 가능하도록 -80℃에서 냉동 보관되었다. 하기 표 3에 실험적 설계를 나타내었다.
그룹 동물의 수
(암컷) 		안구 건조의 유도
(QID, SC)
0 내지 21일 		처리
(TID, OU,
5 ㎕/눈)
1* 내지 21일
1 12 스코폴라민
(2.5 mg/mL sol.의 200 ㎕, 0.5 mg/dose)		 수송체
2 12 SEQ ID NO: 11의 펩타이드(0.06%)
3 12 SEQ ID NO: 11의 펩타이드(0.25%)
4 12 SEQ ID NO: 11의 펩타이드(0.6%)
5 4 안구 건조 유도되지 않음 비처리
실험 방법
1. 복용량(Dose) 제조
SEQ　ID　NO: 11의 (폴리-)펩타이드는 건조 분말의 300.65 mg을 포함하는 1.5-mL 투명한 플라스틱 미세분리(microfuge) 유리병으로 폴리펩타이드 연구소(프랑스)로부터 획득되었다.
연구의 시작 전에, SEQ　ID　NO: 11의 (폴리-)펩타이드는 멸균 식염수(수송체) 내에 생성되었다. 각 농도의 복용 용액은 0.2-㎛ 필터를 사용하여 멸균되었고, 다수의 미리-표지된 유리병에 배정되었고, -20℃에서 냉동되었다. 제형(formulation) 샘플 내에 측정된 농도는 0.058%, 0.25% 및 0.624% 반올림하여 0.06%, 0.25% 및 0.6%이었다.
각각 복용하는 날에, 복용 용액의 한 세트는 해동되었고(thawed) 당일의 복용량 투여를 위해 사용되었다. 대조군(수송체)는 복용할 준비가 제공되었다; 복용량 제조는 필요하지 않다.
2. 세극등 실험(SLE)
연구에 들어가기 전에, 각 동물은 SLE 및 국소-적용된 플루오레세인을 사용한 간접적인 안과(ophthalmic) 실험을 수행하였다. 안구 연구결과는 드레이즈 스케일(Draize scale) 안구 점수를 사용하여 기록되었다. SLE 및 드레이즈 점수는 살아있는 기간 동안 일주일에 3회 반복되었다.
3. 누액층 파괴 시간(TBUT) 실험 및 후속 각막 실험
TBUT 실험은 각막에 플루오레세인의 적용 후에 완벽한 깜빡임 및 누액층에 첫번째 랜덤 건조 부위의 출현 사이에 몇초의 경과 시간을 측정하여 주당 3회 수행되었다. TBUT를 수행하기 위하여, 0.1% 액체 소듐 플루오레세인은 결막낭(conjunctival sac)으로 떨어뜨려졌고, 안검은 3회 수동으로 폐쇄되었고, 이후 각막을 덮은 연속 플루오레세인-포함 누액층을 나타내어 열어 놓았으며, 막 파괴(건조 부위 또는 스트릭(streak)의 출현)를 위해 요구되는 시간(몇초 내)이 기록되었다. 0.1% 플루오레세인의 다른 드롭(drop)이 각막에 재적용된 후, 적어도 90초 후에, 각막 상피 손상은 코발트 블루 필터로 세극등을 사용해 등급이 나뉘었다; 각막은 이후 드레이즈 안구 스케일로 점수화 되었다.
4. 페놀 레드 실 누액 실험(Phenol Red Thread Tear Test)(PRTT)
누액 생산은 PRTT 실험 스트립(strip)을 사용하여 양쪽 눈에 주당 3회 측정되었다(Zone-Quick; Menicon, Nagoya, Japan). 당일의 첫번째 처리 전에, 실은 세극등 생체현미경(biomicroscopy) 하에서 30초 동안 각 눈의 결막 원개(conjunctival fornix)의 측면 안객(lateral canthus)에 적용되었다. 실에까지 누액의 이송(migration)(즉, 습윤 면 실의 길이)는 밀리미터 스케일을 사용하여 측정되었다.
5. 부검(Necropsy) 및 병리(Pathology)
22일째 부검은, 안구, 눈물샘, 안검, 및 결막을 포함하는 각 동물의 양쪽 눈은 절단되었다. 오른쪽 눈 및 관련된 조직은 10% 중성 버퍼 포르말린(formalin)(NBF)로 이송된 후에 변형된 데이비슨 용액(Davidson? solution)에 하룻밤 담그어져 고정되었다. 오른쪽 눈의 고정된 조직은 탈수되었고, 파라핀에 고정되었고, 3 내지 5-mm 두께로 나누어졌으며, 슬라이드에 고정된 조직은 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)(H&E)로 염색되었다. 염색된 슬라이드는 광학 현미경을 통해 측정되었다. 자세하고 완전한 조직병리학적(histopathologic) 평가는, 각 오른쪽 눈에 대한 조직병리학적으로 실험된 적어도 두 섹션(section) 수준으로, 눈의 모든 부위에서 수행되었다. 특별한 주의가 눈물샘뿐만 아니라 각막, 결막 및 각막의 상피(술잔 세포(goblet cells) 포함), 가해졌다. 이들 조직은 0은 정상(normal), 1은 최소(minimal), 2는 가벼운(mild), 3은 중간(moderate), 4는 극심한(severe)으로, 0-4 스케일에 기초한 상처에 대해 점수화 되었다. 각 각막에 대해, 점수는 각막 상피 두께, 및 각막 염증에 기초한다. 결막은 술잔 세포의 존재 또는 부재뿐만 아니라 부식 및 염증에 대해 점수화 되었다.
결과
암컷 C57BL/6 쥐에 안구 건조증이 유도된 스코폴라민(0.5mg/dose)의 매일 4회 SC 투여는 수성 누액 생산의 부피의 감소 및 눈을 효과적으로 윤활 및 보호할 수 있는 안정한 누액 층 유지를 덜 가능하게 하는 그들을 만드는 누액의 물리화학적 특성의 변화에 의해 특징화되었다.
1. 누액 파괴 시간(TBUT) 처리(Teat) 및 각막 실험
누액 파괴 시간 실험(TBUTs)는 안구 건조의 유도 전, 및 안구 건조 유도 후 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18 및 21일에 다시 수행되었다. 스코폴라민으로 투여(안구 건조 유도)의 시작 후에 TBUT 평균 값은 모든 동물에서 감소하기 시작하였다. 그룹 3 및 4, SEQ ID NO: 11의 펩타이드의 중간 및 고-복용량으로 처리된 동물에 대한 TBUT 평균은, 는 복용 시점 이후 계속 감소하였고, 9일째에 최저점(nadir)에 이르고, 반면 9일째에 저-복용량 그룹 2는 증가했다. 낮은, 중간 및 높은-복용량 TBUT 평균(그룹 2, 3 및 4, 각각)은 수송체 그룹 위에 있다. SEQ ID NO: 11 (그룹 2-4) 펩타이드의 낮은, 중간 및 높은 복용량으로 처리된 그룹은 일반적으로 TBUT에서 복용량-의존적 증가를 보였다. 하기 표 4에 계산된 TBUT AUC 수치 평균을 나타내었다.
그룹 TBUT AUC
그룹 1 71.19
그룹 2 88.54
그룹 3 91.19
그룹 4 89.98
그룹 5 124.54
2. 페놀 레드 실 누액 테스트(PRTT)
PRTT는 안구 건조 유도되기 전, 및 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18 및 21일째에 다시 수행되었다. 당일 내지 4일째의 PRTT 수치는 안구 건조가 유도된 모든 쥐에서 감소되었고, 스코폴라민의 투여 및 송풍기에 의해 생성된 증가된 통풍의 건조 환경에 노출 후에 누액 생산이 감소됨을 가리킨다. 대부분 그룹에서 PRTT에 최저점은 거의 7일째에 발생하였다. PRTT는 14일째에 최저점에 이르는 수송체 대조군(그룹 1)에 감소를 유지하였다. 최저점 이후에 모든 안구 건조 그룹에서 증가가 있었다. 이러한 연구결과는 화합물 처리의 시작 보다 하루 빠른 스코폴라민의 처리의 시작은 안구 건조증과 관련된 눈의 생리학적 변화를 시작하기에 충분함을 가리킨다.
SEQ ID NO: 11의 펩타이드의 낮은, 중간 및 높은 복용량 수준(Groups 2, 3 및 4 각각 0.06%, 0.25% 및 0.6%)으로 처리된 그룹은 일반적으로 PRTT에서 복용량-의존적 증가를 보였다. 하기 표 5에 평균 PRTT AUC 수치를 나타내었다.
그룹 PRTT AUC
그룹 1 35.02
그룹 2 39.96
그룹 3 42.79
그룹 4 43.17
그룹 5 113.63
3. 조직병리학
본 연구에서 조직학적 변화는 일반적으로 각막에 국한된다. 각막에서 연구 결과는 각막 상피 표면의 증가된 케라틴화, 각막 상피의 두께의 증가, 각막 상피의 증가된 세포질, 증가된 상피 세포 회전율(turnover)에 따르는 기저 상피층의 유사분열의 가볍게 증가된 빈도로 구성된다. 이들 연구결과는 각막 건조 및 각막 상피 자극에 생리학적 적응 반응의 지표이다. 표면 궤양(Surface ulceration), 각막 기질 부종(corneal stromal edema) 및 각막내 염증 침윤(inflammatory infiltrate)은 본 연구에서 나타나지 않는다. 비처리된 그룹(정상 쥐, 스코폴라민 처리되지 않음), 그룹 5의 안구들은 정상 범위 내에 있다. 모든 그룹 전체에 산재된 안검의 몇몇 최소의 비화농성(nonsuppurative) 염증이 있으나, 결막, 망막, 눈물샘 및 눈의 다른 부분은 정상 범위 내에 있다. 술잔 세포는 모든 그룹의 범위 내에서 나타났다. 술잔 세포는 누액이 강한 보다 접착성있는 막을 형성하는 것을 돕는 뮤신의 일차적 생산자이다.
가벼운(mild) 내지 중간(moderate) 각막 변화는 비처리된 정상 안구 그룹(그룹 5)를 제외한 모든 그룹에서, 다른 처리 그룹에 비하여, SEQ ID NO: 11의 펩타이드의 낮은-복용량, 그룹 1, 수송체-처리된 그룹 및 그룹 2에서 약간 보다 심각하게 관찰되었다. 이들 연구결과는 각막에 증가된 누액 생산의 긍정적인 유익한 효과와 일치한다.
SEQ ID NO: 11의 펩타이드의 고-복용량은 이러한 쥐과 안구 건조 모델에 관하여 각막 변화들을 감소/개선하는데 가장 효과적이다.
SEQUENCE LISTING <110> Xigen S.A. <120> Use of cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway for the treatment of dry eye syndrome <130> IMP142288 <150> PCT/EP2011/006003 <151> 2011-11-30 <160> 105 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-IB1(s) (see Table 1) <400> 1 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg 1 5 10 15 Ser Gln Asp <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-IB1(s) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(19) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 2 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 15 Lys Pro Arg <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-IB (generic) (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <223> Description of sequence: Description of sequence: general formula: NH2-Xnb-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xna-Xnb-COOH (see Table 1) <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> VARIANT <222> (10)..(16) <223> Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue residue except serine and threonine <220> <221> REPEAT <222> (18)..(18) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein n is 0 or 1 <220> <221> REPEAT <222> (19)..(19) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <400> 3 Xaa Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Gln Asp Xaa <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-IB (generic) (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <223> Description of sequence: general formula: NH2-Xnb-Xna-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xnb-COOH, <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(19) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> VARIANT <222> (1)..(11) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> REPEAT <222> (2)..(2) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein n is 0 or 1 <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue residue except serine and Threonine <220> <221> VARIANT <222> (4)..(10) <223> Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (19)..(19) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <400> 4 Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr Pro 1 5 10 15 Arg Xaa Xaa <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-TAT (see Table 1) <400> 5 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-TAT (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 6 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-generic-TAT (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <223> General formula: NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-COOH (see Table 1) <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <400> 7 Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-generic-TAT (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <223> General formula: NH2-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <400> 8 Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Xaa 1 5 10 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-TAT-IB1 (s) (see Table 1) <400> 9 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Arg Pro Lys Arg 1 5 10 15 Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 20 25 30 <210> 10 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-TAT (generic) (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <223> Description of sequence: General formula: NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xna-Xnb-COOH <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> VARIANT <222> (20)..(26) <223> Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> VARIANT <222> (28)..(28) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue residue except serine and Threonine <220> <221> REPEAT <222> (28)..(28) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein n is 0 or 1 <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (29)..(29) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <400> 10 Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Xaa Arg Pro Thr Thr 1 5 10 15 Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Asp Xaa 20 25 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptid D-TAT-IB1 (s) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(31) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 11 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 15 Lys Pro Arg Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly 20 25 30 <210> 12 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptid: D-TAT (generic) (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <223> General formula: NH2-Xnb-Xna-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH, <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(19) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue residue except serine and threonine <220> <221> REPEAT <222> (2)..(2) <223> Xaa is Xna as defined in the general formula, wherein n is 0 or 1 <220> <221> VARIANT <222> (4)..(10) <223> Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (19)..(19) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein Xaa represents an amino acid residue, preferably selected from any (native) amino acid residue; <220> <221> REPEAT <222> (29)..(29) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <400> 12 Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr Pro 1 5 10 15 Arg Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Xaa 20 25 <210> 13 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: peptide IB1-long (see Table 1) <400> 13 Pro Gly Thr Gly Cys Gly Asp Thr Tyr Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp Thr 20 25 <210> 14 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide IB2-long (see Table 1) <400> 14 Ile Pro Ser Pro Ser Val Glu Glu Pro His Lys His Arg Pro Thr Thr 1 5 10 15 Leu Arg Leu Thr Thr Leu Gly Ala Gln Asp Ser 20 25 <210> 15 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide derived from c-Jun (see Table 1) <400> 15 Gly Ala Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Asn Leu Lys Pro His 20 25 <210> 16 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide derived from ATF2 (see Table 1) <400> 16 Thr Asn Glu Asp His Leu Ala Val His Lys His Lys His Glu Met Thr 1 5 10 15 Leu Lys Phe Gly Pro Ala Arg Asn Asp Ser Val Ile Val 20 25 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-IB1 (see Table 1) <400> 17 Asp Thr Tyr Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln 1 5 10 15 Val Pro Arg Ser Gln Asp Thr 20 <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-IB1 (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(23) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 18 Thr Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro 1 5 10 15 Arg Lys Pro Arg Tyr Thr Asp 20 <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-IB (generic) (see Table 1) <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is selected from any amino acid residue, <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> Xaa is selected from any amino acid residue, <220> <221> VARIANT <222> (9)..(15) <223> Xaa is selected from any amino acid residue, <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> Xaa is selected from serine or threonine, <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> Xaa is selected from any amino acid residue, <400> 19 Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln 1 5 10 15 Asp Xaa Xaa <210> 20 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-IB (generic) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(19) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is selected from serine or threonine <220> <221> VARIANT <222> (5)..(11) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <400> 20 Xaa Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr 1 5 10 15 Pro Arg Xaa <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-generic-TAT (see Table 1) <220> <221> VARIANT <222> (1)..(17) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <400> 21 Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-generic-TAT (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(17) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> VARIANT <222> (1)..(17) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <400> 22 Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 23 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-TAT-IB1 (see Table 1) <400> 23 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Asp Thr Tyr Arg 1 5 10 15 Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser 20 25 30 Gln Asp Thr 35 <210> 24 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide L-TAT IB (generic) (see Table 1) <220> <221> VARIANT <222> (1)..(40) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <220> <221> VARIANT <222> (41)..(41) <223> Xaa is selected from serine or threonine <220> <221> VARIANT <222> (42)..(42) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <400> 24 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Asp Xaa Xaa 35 40 <210> 25 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-TAT-IB1 (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(35) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 25 Thr Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro 1 5 10 15 Arg Lys Pro Arg Tyr Thr Asp Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys 20 25 30 Lys Arg Gly 35 <210> 26 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: Peptide D-TAT IB (generic) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(42) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is selected from serine or threonine <220> <221> VARIANT <222> (3)..(42) <223> Xaa is selected from any amino acid residue <400> 26 Xaa Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr 1 5 10 15 Pro Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg 20 25 30 Lys Lys Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 <210> 27 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: chimeric peptide sequence L-TAT-IB1(s1) (see Table 1) <400> 27 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Arg Pro Lys Arg Pro 1 5 10 15 Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 20 25 30 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: chimeric peptide sequence L-TAT-IB1(s2) (see Table 1) <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> Xaa is selected from glycine or proline <220> <221> REPEAT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Xnc as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnc <400> 28 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Arg Pro Lys Arg Pro 1 5 10 15 Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 20 25 30 <210> 29 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: chimeric peptide sequence L-TAT-IB1(s3) (see Table 1) <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> Xaa is selected from glycine or proline <220> <221> REPEAT <222> (10)..(10) <223> Xaa is Xnc as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnc <400> 29 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Arg Pro Lys Arg Pro Thr 1 5 10 15 Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 20 25 <210> 30 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: chimeric peptide sequence D-TAT-IB1(s1) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(30) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 30 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 15 Lys Pro Arg Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg 20 25 30 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: chimeric peptide sequence D-TAT-IB1(s2) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(30) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> VARIANT <222> (20)..(20) <223> Xaa is selected from glycine or proline <220> <221> REPEAT <222> (20)..(20) <223> Xaa is Xnc as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnc <400> 31 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 15 Lys Pro Arg Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly 20 25 30 <210> 32 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: chimeric peptide sequence D-TAT-IB1(s3) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(29) <223> all amino acids are D-amino acids <220> <221> VARIANT <222> (20)..(20) <223> Xaa is selected from glycine or proline <220> <221> REPEAT <222> (20)..(20) <223> Xaa is Xnc as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnc <400> 32 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 15 Lys Pro Arg Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg 20 25 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s1) (see Table 1) <400> 33 Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 1 5 10 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s2) (see Table 1) <400> 34 Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln 1 5 10 <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s3) (see Table 1) <400> 35 Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser 1 5 10 <210> 36 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s4) (see Table 1) <400> 36 Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg 1 5 10 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s5) (see Table 1) <400> 37 Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro 1 5 10 <210> 38 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s6) (see Table 1) <400> 38 Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val 1 5 10 <210> 39 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s7) (see Table 1) <400> 39 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln 1 5 10 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s8) (see Table 1) <400> 40 Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 1 5 10 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s9) (see Table 1) <400> 41 Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s10) (see Table 1) <400> 42 Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser 1 5 10 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s11) (see Table 1) <400> 43 Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s12) (see Table 1) <400> 44 Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s13) (see Table 1) <400> 45 Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s14) (see Table 1) <400> 46 Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s15) (see Table 1) <400> 47 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro 1 5 10 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s16) (see Table 1) <400> 48 Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 1 5 10 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s17) (see Table 1) <400> 49 Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln 1 5 10 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s18) (see Table 1) <400> 50 Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser 1 5 10 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s19) (see Table 1) <400> 51 Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg 1 5 10 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s20) (see Table 1) <400> 52 Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro 1 5 10 <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s21) (see Table 1) <400> 53 Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val 1 5 10 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s22) (see Table 1) <400> 54 Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s23) (see Table 1) <400> 55 Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro 1 5 10 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s24) (see Table 1) <400> 56 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s25) (see Table 1) <400> 57 Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 1 5 10 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s26) (see Table 1) <400> 58 Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln 1 5 10 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s27) (see Table 1) <400> 59 Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser 1 5 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s28) (see Table 1) <400> 60 Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg 1 5 10 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s29) (see Table 1) <400> 61 Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro 1 5 10 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s30) (see Table 1) <400> 62 Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val 1 5 10 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s31) (see Table 1) <400> 63 Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln 1 5 10 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s32) (see Table 1) <400> 64 Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro 1 5 10 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s33) (see Table 1) <400> 65 Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: L-IB1(s34) (see Table 1) <400> 66 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu 1 5 10 <210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s1) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 67 Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys Pro Arg 1 5 10 <210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s2) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 68 Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys Pro 1 5 10 <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s3) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 69 Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys 1 5 10 <210> 70 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s4) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 70 Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 <210> 71 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s5) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 71 Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro 1 5 10 <210> 72 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s6) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 72 Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr 1 5 10 <210> 73 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s7) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(13) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 73 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr 1 5 10 <210> 74 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s8) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(12) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 74 Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys Pro Arg 1 5 10 <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s9) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(12) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 75 Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys Pro 1 5 10 <210> 76 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s10) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(12) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 76 Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys 1 5 10 <210> 77 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s11) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(12) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 77 Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 <210> 78 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s12) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(12) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 78 Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro 1 5 10 <210> 79 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s13) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(12) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 79 Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr 1 5 10 <210> 80 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s14) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(12) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 80 Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr 1 5 10 <210> 81 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s15) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(12) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 81 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu 1 5 10 <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s16) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 82 Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys Pro Arg 1 5 10 <210> 83 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s17) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 83 Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys Pro 1 5 10 <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s18) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 84 Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys 1 5 10 <210> 85 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s19) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 85 Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 <210> 86 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s20) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 86 Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro 1 5 10 <210> 87 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s21) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 87 Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr 1 5 10 <210> 88 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s22) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 88 Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr 1 5 10 <210> 89 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s23) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 89 Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu 1 5 10 <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s24) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(11) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 90 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn 1 5 10 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s25) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 91 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu 1 5 10 <210> 92 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s26) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 92 Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn 1 5 10 <210> 93 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s27) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 93 Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu 1 5 10 <210> 94 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s28) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 94 Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr 1 5 10 <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s29) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 95 Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr 1 5 10 <210> 96 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s30) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 96 Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro 1 5 10 <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s31) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 97 Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 <210> 98 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s32) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 98 Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys 1 5 10 <210> 99 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s33) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 99 Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys Pro 1 5 10 <210> 100 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: D-IB1(s34) (see Table 1) <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(10) <223> all amino acids are D-amino acids <400> 100 Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg Lys Pro Arg 1 5 10 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer specific for GAPDH (Forward) <400> 101 atgcccccat gtttgtgatg 20 <210> 102 <211> 2953 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 102 ccgccccagc tcagtccgaa ccccgcggcg gcggcggcct cctccacacg cctccacctc 60 cgccgccgcc gccgccgccg ccgcctcccg cgccgctctc cgcccggatg gccaggctga 120 gcccgggaat ggcggagcga gagagcggcc tgagcggggg tgccgcgtcc ccaccggccg 180 cttccccatt cctgggactg cacatcgcgt cgcctcccaa tttcaggctc acccatgata 240 tcagcctgga ggagtttgag gatgaagacc tttcggagat cactgatgag tgtggcatca 300 gcctgcagtg caaagacacc ttgtctctcc ggcccccgcg cgccgggcta ctgtctgcgg 360 gtagcagcgg tagcgcgggg agccggctgc aggcggagat gctgcagatg gacctgatcg 420 acgcggcaag tgacactccg ggcgccgagg acgacgaaga ggacgacgac gagctcgctg 480 cccaacggcc aggagtgggg ccttccaaag ccgagtctgg ccaggagccg gcgtctcgca 540 gccagggtca gggccagggc cccggcacag gctgcggaga cacctaccgg cccaagaggc 600 ctaccacgct caaccttttc ccgcaggtgc cgcggtctca ggacacgctg aataataact 660 ctttaggcaa aaagcacagt tggcaggacc gtgtgtctcg atcatcctcc cctctgaaga 720 caggggagca gacgcctcca catgaacata tctgcctgag tgatgagctg ccgccccagg 780 gcagtcctgt tcccacccag gatcgtggca cttccaccga cagcccttgt cgccgtactg 840 cagccaccca gatggcacct ccaagtggtc cccctgccac tgcacctggt ggccggggcc 900 actcccatcg agatcggtcc atatcagcag atgtgcggct cgaggcgact gaggagatct 960 acctgacccc agtgcagagg cccccagacc ctgcagaacc cacctccacc ttcttgccac 1020 ccactgagag ccggatgtct gtcagctcgg atcctgaccc tgccgcttac tctgtaactg 1080 cagggcgacc gcacccttcc atcagtgaag aggatgaggg cttcgactgt ctgtcatccc 1140 cagagcaagc tgagccacca ggtggagggt ggcggggaag cctcggggag ccaccaccgc 1200 ctccacgggc ctcactgagc tcggacacca gcgcactgtc ctacgactct gtcaagtaca 1260 cactggtggt ggatgagcat gcccagcttg agttggtgag cctgcggcca tgttttggag 1320 attacagtga cgaaagcgac tctgccactg tctatgacaa ctgtgcctct gcctcctcgc 1380 cctacgagtc agccattggt gaggaatatg aggaggcccc tcaaccccgg cctcccacct 1440 gcctgtcaga ggactccaca ccggatgagc ctgacgtcca cttctctaag aagtttctga 1500 atgtcttcat gagtggccgc tctcgttcct ccagtgccga gtcctttggg ctgttctcct 1560 gtgtcatcaa tggggaggag catgagcaaa cccatcgggc tatattcagg tttgtgcctc 1620 ggcatgaaga tgaacttgag ctggaagtgg acgaccctct gctggtggag ctgcaggcag 1680 aagactattg gtatgaggcc tataacatgc gcactggagc ccgtggtgtc tttcctgcct 1740 actatgccat tgaggtcacc aaggagcctg agcacatggc agcccttgcc aaaaacagcg 1800 actggattga ccagttccgg gtgaagttcc tgggctctgt ccaggttcct tatcacaagg 1860 gcaatgatgt cctctgtgct gctatgcaaa agatcgccac cacccgccgg ctcaccgtgc 1920 actttaaccc gccctccagc tgtgtccttg aaatcagcgt taggggtgtc aagataggtg 1980 tcaaagctga tgaagctcag gaggccaagg gaaataaatg tagccacttt ttccagctaa 2040 aaaacatctc tttctgtggg taccatccaa agaacaacaa gtactttggg tttatcacta 2100 agcaccctgc tgaccaccgg tttgcctgcc atgtctttgt gtctgaagat tccaccaaag 2160 ccctggcaga gtctgtgggg cgtgcatttc agcagttcta caagcaattt gtggaatata 2220 cctgtcctac agaagatatc tacttggagt agcagcaacc cccctctctg cagcccctca 2280 gccccaggcc agtactagga cagctgactg ctgacaggat gttgtactgc cacgagagaa 2340 tgggggagtg agggctgttg gggtcggggg gcaggggttt ggggagaggc agatgcagtt 2400 tattgtaata tatggggtta gattaatcta tggaggacag tacaggctct ctcggggctg 2460 gggaagggca gggctggggt gggggtcagg catctggcca caaaggggtc ccctagggac 2520 agaggcgctg caccatcctg ggcttgtttc atactagagg ccctggcttt ctggctcttg 2580 ggtcctgcct tgacaaagcc cagccacctg gaagtgtcac cttcccttgt ccacctcacc 2640 cagtgccctg agctcatgct gagcccaagc acctccgaag gactttccag taaggaaatg 2700 gcaacatgtg acagtgagac cctgttctca tctgtggggc tccggcagct ccgaccccca 2760 gcctggccag cacgctgacc ctggcaagct tgtgtgttca aagaaggaga gggccacagc 2820 aagccctgcc tgccagggaa ggttccctct cagctggccc cagccaactg gtcactgtct 2880 tgtcacctgg ctactactat taaagtgcca tttcttgtct gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaactc gag 2953 <210> 103 <211> 714 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 103 Met Ala Arg Leu Ser Pro Gly Met Ala Glu Arg Glu Ser Gly Leu Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ala Ala Ser Pro Pro Ala Ala Ser Pro Phe Leu Gly Leu His 20 25 30 Ile Ala Ser Pro Pro Asn Phe Arg Leu Thr His Asp Ile Ser Leu Glu 35 40 45 Glu Phe Glu Asp Glu Asp Leu Ser Glu Ile Thr Asp Glu Cys Gly Ile 50 55 60 Ser Leu Gln Cys Lys Asp Thr Leu Ser Leu Arg Pro Pro Arg Ala Gly 65 70 75 80 Leu Leu Ser Ala Gly Ser Ser Gly Ser Ala Gly Ser Arg Leu Gln Ala 85 90 95 Glu Met Leu Gln Met Asp Leu Ile Asp Ala Ala Ser Asp Thr Pro Gly 100 105 110 Ala Glu Asp Asp Glu Glu Asp Asp Asp Glu Leu Ala Ala Gln Arg Pro 115 120 125 Gly Val Gly Pro Ser Lys Ala Glu Ser Gly Gln Glu Pro Ala Ser Arg 130 135 140 Ser Gln Gly Gln Gly Gln Gly Pro Gly Thr Gly Cys Gly Asp Thr Tyr 145 150 155 160 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg 165 170 175 Ser Gln Asp Thr Leu Asn Asn Asn Ser Leu Gly Lys Lys His Ser Trp 180 185 190 Gln Asp Arg Val Ser Arg Ser Ser Ser Pro Leu Lys Thr Gly Glu Gln 195 200 205 Thr Pro Pro His Glu His Ile Cys Leu Ser Asp Glu Leu Pro Pro Gln 210 215 220 Gly Ser Pro Val Pro Thr Gln Asp Arg Gly Thr Ser Thr Asp Ser Pro 225 230 235 240 Cys Arg Arg Thr Ala Ala Thr Gln Met Ala Pro Pro Ser Gly Pro Pro 245 250 255 Ala Thr Ala Pro Gly Gly Arg Gly His Ser His Arg Asp Arg Ser Ile 260 265 270 Ser Ala Asp Val Arg Leu Glu Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Leu Thr Pro 275 280 285 Val Gln Arg Pro Pro Asp Pro Ala Glu Pro Thr Ser Thr Phe Leu Pro 290 295 300 Pro Thr Glu Ser Arg Met Ser Val Ser Ser Asp Pro Asp Pro Ala Ala 305 310 315 320 Tyr Ser Val Thr Ala Gly Arg Pro His Pro Ser Ile Ser Glu Glu Asp 325 330 335 Glu Gly Phe Asp Cys Leu Ser Ser Pro Glu Gln Ala Glu Pro Pro Gly 340 345 350 Gly Gly Trp Arg Gly Ser Leu Gly Glu Pro Pro Pro Pro Pro Arg Ala 355 360 365 Ser Leu Ser Ser Asp Thr Ser Ala Leu Ser Tyr Asp Ser Val Lys Tyr 370 375 380 Thr Leu Val Val Asp Glu His Ala Gln Leu Glu Leu Val Ser Leu Arg 385 390 395 400 Pro Cys Phe Gly Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Asp Ser Ala Thr Val Tyr 405 410 415 Asp Asn Cys Ala Ser Ala Ser Ser Pro Tyr Glu Ser Ala Ile Gly Glu 420 425 430 Glu Tyr Glu Glu Ala Pro Gln Pro Arg Pro Pro Thr Cys Leu Ser Glu 435 440 445 Asp Ser Thr Pro Asp Glu Pro Asp Val His Phe Ser Lys Lys Phe Leu 450 455 460 Asn Val Phe Met Ser Gly Arg Ser Arg Ser Ser Ser Ala Glu Ser Phe 465 470 475 480 Gly Leu Phe Ser Cys Val Ile Asn Gly Glu Glu His Glu Gln Thr His 485 490 495 Arg Ala Ile Phe Arg Phe Val Pro Arg His Glu Asp Glu Leu Glu Leu 500 505 510 Glu Val Asp Asp Pro Leu Leu Val Glu Leu Gln Ala Glu Asp Tyr Trp 515 520 525 Tyr Glu Ala Tyr Asn Met Arg Thr Gly Ala Arg Gly Val Phe Pro Ala 530 535 540 Tyr Tyr Ala Ile Glu Val Thr Lys Glu Pro Glu His Met Ala Ala Leu 545 550 555 560 Ala Lys Asn Ser Asp Trp Ile Asp Gln Phe Arg Val Lys Phe Leu Gly 565 570 575 Ser Val Gln Val Pro Tyr His Lys Gly Asn Asp Val Leu Cys Ala Ala 580 585 590 Met Gln Lys Ile Ala Thr Thr Arg Arg Leu Thr Val His Phe Asn Pro 595 600 605 Pro Ser Ser Cys Val Leu Glu Ile Ser Val Arg Gly Val Lys Ile Gly 610 615 620 Val Lys Ala Asp Glu Ala Gln Glu Ala Lys Gly Asn Lys Cys Ser His 625 630 635 640 Phe Phe Gln Leu Lys Asn Ile Ser Phe Cys Gly Tyr His Pro Lys Asn 645 650 655 Asn Lys Tyr Phe Gly Phe Ile Thr Lys His Pro Ala Asp His Arg Phe 660 665 670 Ala Cys His Val Phe Val Ser Glu Asp Ser Thr Lys Ala Leu Ala Glu 675 680 685 Ser Val Gly Arg Ala Phe Gln Gln Phe Tyr Lys Gln Phe Val Glu Tyr 690 695 700 Thr Cys Pro Thr Glu Asp Ile Tyr Leu Glu 705 710 <210> 104 <211> 711 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Met Ala Glu Arg Glu Ser Gly Gly Leu Gly Gly Gly Ala Ala Ser Pro 1 5 10 15 Pro Ala Ala Ser Pro Phe Leu Gly Leu His Ile Ala Ser Pro Pro Asn 20 25 30 Phe Arg Leu Thr His Asp Ile Ser Leu Glu Glu Phe Glu Asp Glu Asp 35 40 45 Leu Ser Glu Ile Thr Asp Glu Cys Gly Ile Ser Leu Gln Cys Lys Asp 50 55 60 Thr Leu Ser Leu Arg Pro Pro Arg Ala Gly Leu Leu Ser Ala Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ala Gly Ser Arg Leu Gln Ala Glu Met Leu Gln Met Asp Leu 85 90 95 Ile Asp Ala Thr Gly Asp Thr Pro Gly Ala Glu Asp Asp Glu Glu Asp 100 105 110 Asp Asp Glu Glu Arg Ala Ala Arg Arg Pro Gly Ala Gly Pro Pro Lys 115 120 125 Ala Glu Ser Gly Gln Glu Pro Ala Ser Arg Gly Gln Gly Gln Ser Gln 130 135 140 Gly Gln Ser Gln Gly Pro Gly Ser Gly Asp Thr Tyr Arg Pro Lys Arg 145 150 155 160 Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp Thr 165 170 175 Leu Asn Asn Asn Ser Leu Gly Lys Lys His Ser Trp Gln Asp Arg Val 180 185 190 Ser Arg Ser Ser Ser Pro Leu Lys Thr Gly Glu Gln Thr Pro Pro His 195 200 205 Glu His Ile Cys Leu Ser Asp Glu Leu Pro Pro Gln Ser Gly Pro Ala 210 215 220 Pro Thr Thr Asp Arg Gly Thr Ser Thr Asp Ser Pro Cys Arg Arg Ser 225 230 235 240 Thr Ala Thr Gln Met Ala Pro Pro Gly Gly Pro Pro Ala Ala Pro Pro 245 250 255 Gly Gly Arg Gly His Ser His Arg Asp Arg Ile His Tyr Gln Ala Asp 260 265 270 Val Arg Leu Glu Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Leu Thr Pro Val Gln Arg 275 280 285 Pro Pro Asp Ala Ala Glu Pro Thr Ser Ala Phe Leu Pro Pro Thr Glu 290 295 300 Ser Arg Met Ser Val Ser Ser Asp Pro Asp Pro Ala Ala Tyr Pro Ser 305 310 315 320 Thr Ala Gly Arg Pro His Pro Ser Ile Ser Glu Glu Glu Glu Gly Phe 325 330 335 Asp Cys Leu Ser Ser Pro Glu Arg Ala Glu Pro Pro Gly Gly Gly Trp 340 345 350 Arg Gly Ser Leu Gly Glu Pro Pro Pro Pro Pro Arg Ala Ser Leu Ser 355 360 365 Ser Asp Thr Ser Ala Leu Ser Tyr Asp Ser Val Lys Tyr Thr Leu Val 370 375 380 Val Asp Glu His Ala Gln Leu Glu Leu Val Ser Leu Arg Pro Cys Phe 385 390 395 400 Gly Asp Tyr Ser Asp Glu Ser Asp Ser Ala Thr Val Tyr Asp Asn Cys 405 410 415 Ala Ser Val Ser Ser Pro Tyr Glu Ser Ala Ile Gly Glu Glu Tyr Glu 420 425 430 Glu Ala Pro Arg Pro Gln Pro Pro Ala Cys Leu Ser Glu Asp Ser Thr 435 440 445 Pro Asp Glu Pro Asp Val His Phe Ser Lys Lys Phe Leu Asn Val Phe 450 455 460 Met Ser Gly Arg Ser Arg Ser Ser Ser Ala Glu Ser Phe Gly Leu Phe 465 470 475 480 Ser Cys Ile Ile Asn Gly Glu Glu Gln Glu Gln Thr His Arg Ala Ile 485 490 495 Phe Arg Phe Val Pro Arg His Glu Asp Glu Leu Glu Leu Glu Val Asp 500 505 510 Asp Pro Leu Leu Val Glu Leu Gln Ala Glu Asp Tyr Trp Tyr Glu Ala 515 520 525 Tyr Asn Met Arg Thr Gly Ala Arg Gly Val Phe Pro Ala Tyr Tyr Ala 530 535 540 Ile Glu Val Thr Lys Glu Pro Glu His Met Ala Ala Leu Ala Lys Asn 545 550 555 560 Ser Asp Trp Val Asp Gln Phe Arg Val Lys Phe Leu Gly Ser Val Gln 565 570 575 Val Pro Tyr His Lys Gly Asn Asp Val Leu Cys Ala Ala Met Gln Lys 580 585 590 Ile Ala Thr Thr Arg Arg Leu Thr Val His Phe Asn Pro Pro Ser Ser 595 600 605 Cys Val Leu Glu Ile Ser Val Arg Gly Val Lys Ile Gly Val Lys Ala 610 615 620 Asp Asp Ser Gln Glu Ala Lys Gly Asn Lys Cys Ser His Phe Phe Gln 625 630 635 640 Leu Lys Asn Ile Ser Phe Cys Gly Tyr His Pro Lys Asn Asn Lys Tyr 645 650 655 Phe Gly Phe Ile Thr Lys His Pro Ala Asp His Arg Phe Ala Cys His 660 665 670 Val Phe Val Ser Glu Asp Ser Thr Lys Ala Leu Ala Glu Ser Val Gly 675 680 685 Arg Ala Phe Gln Gln Phe Tyr Lys Gln Phe Val Glu Tyr Thr Cys Pro 690 695 700 Thr Glu Asp Ile Tyr Leu Glu 705 710 <210> 105 <211> 2136 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 atggcggagc gagaaagcgg cggcctggga gggggggccg cgtccccgcc cgccgcctcc 60 ccgttcctgg ggctgcacat cgcttcgcct cccaatttca ggctcaccca tgacatcagc 120 ctggaggagt ttgaggatga agacctctcg gagatcactg atgagtgtgg catcagctta 180 cagtgcaaag acaccctgtc cttacggccc ccgcgcgccg ggctgctctc tgcgggcggc 240 ggcggcgcgg ggagccggtt gcaggccgag atgctgcaga tggacctgat cgacgcgacg 300 ggggacactc ccggggccga ggacgacgag gaggacgacg acgaggagcg cgcggcccgg 360 cggccgggag cggggccgcc caaggccgag tccggccagg agccggcgtc ccgcggccag 420 ggccagagcc aaggccagag ccagggcccg ggcagcgggg acacgtaccg gcccaagcgg 480 cccaccacgc tcaacctctt tccgcaggtg ccgcggtctc aggacacact gaataataat 540 tctctgggca aaaagcacag ttggcaggat cgggtgtctc gatcatcctc acccctgaag 600 acaggggagc agacaccacc gcatgaacac atctgcctga gcgatgagct gcccccccag 660 agcggccccg cccccaccac agatcgaggc acctccaccg acagcccttg ccgccgcagc 720 acagccaccc agatggcacc tccgggtggt ccccctgctg ccccgcctgg gggtcggggc 780 cactcgcatc gagaccgaat ccactaccag gccgatgtgc gactagaggc cactgaggag 840 atctacctga ccccagtgca gaggccccca gacgctgcag agcccacctc cgccttcctg 900 ccgcccactg agagccggat gtcagtcagc tccgatccag accctgccgc ctacccctcc 960 acggcagggc ggccgcaccc ctccatcagt gaagaggaag agggcttcga ctgcctgtcg 1020 tccccagagc gggctgagcc cccaggcgga gggtggcggg ggagcctggg ggagccgccg 1080 ccacctccac gggcctctct gagctcggac accagcgccc tgtcctatga ctctgtcaag 1140 tacacgctgg tggtagatga gcatgcacag ctggagctgg tgagcctgcg gccgtgcttc 1200 ggagactaca gtgacgagag tgactctgcc accgtctatg acaactgtgc ctccgtctcc 1260 tcgccctatg agtcggccat cggagaggaa tatgaggagg ccccgcggcc ccagccccct 1320 gcctgcctct ccgaggactc cacgcctgat gaacccgacg tccatttctc caagaaattc 1380 ctgaacgtct tcatgagtgg ccgctcccgc tcctccagtg ctgagtcctt cgggctgttc 1440 tcctgcatca tcaacgggga ggagcaggag cagacccacc gggccatatt caggtttgtg 1500 cctcgacacg aagacgaact tgagctggaa gtggatgacc ctctgctagt ggagctccag 1560 gctgaagact actggtacga ggcctacaac atgcgcactg gtgcccgggg tgtctttcct 1620 gcctattacg ccatcgaggt caccaaggag cccgagcaca tggcagccct ggccaaaaac 1680 agtgactggg tggaccagtt ccgggtgaag ttcctgggct cagtccaggt tccctatcac 1740 aagggcaatg acgtcctctg tgctgctatg caaaagattg ccaccacccg ccggctcacc 1800 gtgcacttta acccgccctc cagctgtgtc ctggagatca gcgtgcgggg tgtgaagata 1860 ggcgtcaagg ccgatgactc ccaggaggcc aaggggaata aatgtagcca ctttttccag 1920 ttaaaaaaca tctctttctg cggatatcat ccaaagaaca acaagtactt tgggttcatc 1980 accaagcacc ccgccgacca ccggtttgcc tgccacgtct ttgtgtctga agactccacc 2040 aaagccctgg cagagtccgt ggggagagca ttccagcagt tctacaagca gtttgtggag 2100 tacacctgcc ccacagaaga tatctacctg gagtag 2136

Claims (24)

  1. 안구 건조증 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 길이가 150개 미만의 아미노산을 포함하는 JNK 억제자 (폴리-) 펩타이드의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 상기 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 5 내지 150개 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 10 내지 100개 아미노산 잔기, 더욱 더 바람직하게는 10 내지 75개 아미노산 잔기 및 가장 바람직하게는 10 내지 50개 아미노산 잔기의 범위를 포함하는 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드의 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 c-jun 아미노 말단 카이네이즈(c-jun amino terminal kinase, JNK)에 결합하는 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드의 용도.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드가 JNK 발현 세포 내에 존재할 때 적어도 하나의 JNK 목표 전사 인자의 활성화를 억제하는 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드의 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 목표 전사 인자는 c-Jun, ATF2, 및 Elkl로 이루어진 군에서 선택된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드의 용도.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 펩타이드가 JNK 발현 세포 내에 존재할 때 JNK 효과를 변화시키는 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드의 용도.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 이들의 조합으로 정의되고, 바람직하게는 적어도 1 또는 2, 바람직하게는 적어도 3, 4 또는 5, 더욱 바람직하게는 적어도 6, 7, 8 또는 9 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 10 또는 그 이상의 D- 및/또는 L-아미노산을 포함하며, 상기 D- 및/또는 L-아미노산은 블록 구조(block wise), 비-블록 구조 또는 대체(alternate) 방식(manner)으로 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드에서 정렬되는 JNK 억제자 서열의 용도.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104 또는 SEQ ID NO: 105에 따르는 어느 서열에 의해 정의되거나 부호화(encoded)된 인간 또는 랫(rat) IB1(폴리-)펩타이드의 절편, 변이체, 또는 이러한 절편의 변이체를 포함하는 용도.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제자 서열은 SEQ ID NOs: 1 내지 4, 13 내지 20 및 33 내지 100에 따르는 적어도 하나의 아미노산 서열, 또는 절편, 유도체 또는 이의 변이체를 포함하거나 이로 이루어지는 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드의 용도.
  10. 첫번째 도메인은 수송(trafficking) (폴리-)펩타이드를 포함하며, 두번째 도메인은 안구 건조증 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 청구항 제1항 내지 제9항 중 어느 항에서 정의된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드를 포함하며, 공유결합으로 연결된 적어도 하나의 첫번째 도메인 및 적어도 하나의 두번째 도메인을 포함하는 키메라(chimeric) (폴리-)펩타이드의 용도.
  11. 제10항에 있어서, 상기 키메라 (폴리)펩타이드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 이들의 조합으로 구성되고, 바람직하게는 적어도 1 또는 2, 바람직하게는 적어도 3, 4 또는 5, 더욱 바람직하게는 적어도 6, 7, 8 또는 9 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 10 또는 그 이상의 D-및/또는 L-아미노산으로 구성되며, 상기 D- 및/또는 L-아미노산은 블록 구조, 비-블록 구조 또는 대체 방식으로 키메라 펩타이드에서 정렬되는 키메라 (폴리-)펩타이드의 용도.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 수송 (폴리-)펩타이드는 인간 면역결핍 바이러스 TAT 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 (폴리-)펩타이드의 용도.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수송 서열은 SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 21 또는 22의 아미노산 서열로 구성되거나 포함하는 키메라 (폴리-)펩타이드의 용도.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수송 (폴리-)펩타이드는 펩타이드의 세포 흡수를 증가시키는 키메라 (폴리-)펩타이드의 용도.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수송 (폴리-)펩타이드는 펩타이드의 핵 위치화(nuclear localization)를 지시하는 키메라 (폴리-)펩타이드의 용도.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 (폴리-)펩타이드는 SEQ ID NOs: 9 내지 12 및 23 내지 32 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 절편, 또는 이의 변이체로 구성되거나 포함하는 키메라 (폴리-)펩타이드의 용도.
  17. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 (폴리-)펩타이드는 SEQ ID NO: 9 또는 11의 아미노산 서열로 구성되거나 포함하는 키메라 펩타이드의 용도.
  18. 안구 건조증의 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 정의된 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드 또는 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에서 정의된 키메라 (폴리-)펩타이드를 부호화하는 분리된 핵산의 용도.
  19. 안구 건조증의 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 제18항에서 정의된 핵산을 포함하는 벡터의 용도.
  20. 안구 건조증의 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 제19항에서 정의된 벡터를 포함하는 세포의 용도.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 피하(subcutaneous), 피내(intradermal), 경피(transdermal)를 포함하는 비경구 경로(parenteral routes); 경구(orally), 직장(rectally)을 포함하는 장내 경로(enteral routes); 비강(nasal), 비강내(intranasal)를 포함하는 국소 경로(topical routes); 표피(epidermal) 또는 패치(patch) 전달을 포함하는 다른 경로; 및 눈에 국소 투여, 바람직하게는 초자체내(intravitreous) 투여, 결막하(subconjunctival) 투여 및/또는 점적(instillation)으로 이루어진 군에서 선택된 투여 경로로 투여되는 용도.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드 및/또는 키메라 (폴리-)펩타이드의 복용량(kg 체중 당)은 10 mmol/kg까지, 바람직하게는 1 mmol/kg까지, 더욱 바람직하게는 100μmol/kg까지, 더욱 더 바람직하게는 10μmol/kg까지, 더욱 더 바람직하게는 1μmol/kg까지, 더욱 더 바람직하게는 100 nmol/kg까지, 가장 바람직하게는 50 nmol/kg까지의 범위인 용도.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드 및/또는 키메라 (폴리-)펩타이드의 복용량은 약 1 pmol/kg 내지 약 1 mmol/kg, 약 10 pmol/kg 내지 약 0,1 mmol/kg, 약 10 pmol/kg 내지 약 0,01 mmol/kg, 약 50 pmol/kg 내지 약 1 μmol/kg, 약 100 pmol/kg 내지 약 500 nmol/kg, 약 200 pmol/kg 내지 약 300 nmol/kg, 약 300 pmol/kg 내지 약 100 nmol/kg, 약 500 pmol/kg 내지 약 50 nmol/kg, 약 750 pmol/kg 내지 약 30 nmol/kg, 약 250 pmol/kg 내지 약 5 nmol/kg, 약 1 nmol/kg 내지 약 10 nmol/kg, 또는 상기 수치의 어느 둘의 조합의 범위인 용도.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드는 SEQ ID NO:11의 서열로 구성되고 바람직하게는 점적의 방식에 의해 투여되는 용도.
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