KR101305533B1 - Ｊｎｋ 신호 전달 경로의 세포 투과성 펩티드 억제제 - Google Patents

Ｊｎｋ 신호 전달 경로의 세포 투과성 펩티드 억제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 키나아제 억제제에 관한 것으로서, 더 구체적으로는 단백질 키나아제 c-Jun 아미노 말단 키나아제의 억제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 JNK 억제제 서열, 키메라 펩티드 및 이를 코딩하는 핵산뿐만 아니라 JNK 신호전달과 관련된 병태생리를 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

Description

ＪＮＫ 신호 전달 경로의 세포 투과성 펩티드 억제제 {CELL―PERMEABLE PEPTIDE INHIBITORS OF THE JNK SIGNAL TRANSDUCTION PATHWAY}
본 발명은 단백질 키나아제 억제제에 관한 것으로서, 더 구체적으로는 단백질 키나아제 c-Jun 아미노 말단 키나아제의 억제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 JNK 억제제 서열, 키메라(chimeric) 펩티드, 이를 코딩하는 핵산 및 JNK 신호전달과 관련된 병태생리(pathophysiologies)를 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
c-Jun 아미노 말단 키나아제 (c-Jun amino terminal kinase; JNK)는 미토겐 활성화 단백질 (MAP) 키나아제의 스트레스 활성화 그룹의 일원이다. 이들 키나아제는 세포 성장 및 분화의 조절과, 더 일반적으로는 환경 자극에 대한 세포의 반응에 관계된다. JNK 신호 전달 경로는 환경적 스트레스에 반응하여, 그리고 몇몇 종류의 세포 표면 수용체의 참여에 의하여 활성화된다. 이들 수용체는 사이토카인 수용체, 세르펜틴 수용체 및 수용체 티로신 키나아제를 포함할 수 있다. 포유류 세포에서는, JNK는 종양원성 형질전환(oncogenic transformation) 및 환경적 스트레스에 대한 중재적 적응 반응 등의 생물학적 프로세스와 관련된다. 또한 JNK는 면역 세포의 성숙 및 분화뿐만 아니라, 면역계에 의한 파괴로 정의되는 세포에서의 예정된 세포 사멸을 포함하는 면역 반응의 조절과 관련이 있다. 이러한 독특한 특성으로 인해 JNK 신호 전달은 약리학적 개입(pharmacological intervention)을 개발하기 위한 유망한 표적이 된다. 몇몇 신경계 장애 중에서, JNK 신호 전달은 특히 허혈성 발작(ischemic stroke) 및 파킨슨병과 관련된다.
JNK 신호 전달과 강하게 관련된 질병을 치료하는 한가지 접근법은 JNK 신호 전달 경로의 억제제를 공급하는 것이다. 그러한 억제제로서 당해 기술 분야에 이미 알려진 것에는, 예를 들어 상류(upstream) 키나아제 억제제 (예컨대, CEP-1347), JNK의 소형 화학적 억제제 (SP600125 및 AS601245; 예컨대, 그 단백질 키나아제의 ATP 결합 자리와 경쟁함으로써 키나아제의 활성에 직접적으로 영향을 주는 것) 및 JNK와 그의 기질 사이의 상호작용에 대한 펩티드 억제제 (D-JNKI 및 I-JIP) 등을 특히 포함한다 (예컨대, Kuan et al., Current Drug Targets-CNS & Neurological Disorders, February 2005, vol. 4, no. 1, pp. 63-67(5) 참조).
상류 키나아제 억제제 CEP-1347 (KT7515)은 혼합 직계 키나아제 패밀리(mixed lineage kinase family)의 반합성 억제제이다. CEP-1347 (KT7515)은 1차 배아 배양 및 영양 공급 중지(trophic withdrawal) 후에 분화된 PC12 세포에서 및 1-메틸-4-페닐테트라히드로피리딘으로 처리된 마우스에서 c-Jun 아미노 말단 키나아제(JNKs)의 활성화를 억제하는 용량에서 뉴런의 생존을 촉진한다. 또한, CEP-1347 (KT7515)은 배양된 닭 배아 후근신경절, 교감, 섬모 및 운동뉴런의 장기간 생존을 촉진시킬 수 있다 (예컨대, Borasio et al., Neuroreport. 9(7): 1435-1439, May 11th 1998 참조).
소형 화학적 JNK 억제제 SP600125는 c-Jun 인산화의 수준을 감소시키고, 세포자멸사로부터 도파민성 뉴런을 보호하며, C57BL/6N 마우스의 MPTP-유도 PD에서 도파민 수준을 부분적으로 회복시키는 것이 발견되었다 (Wang et al., Neurosci Res. 2004 Feb; 48(2); 195-202). 더욱이, 이들 결과는 JNK 경로가 생체 내에서 MPTP의 신경독성 효과의 주된 매개체이고, JNK 활성의 억제가 PD를 치료하는 새롭고 효과적인 전략을 의미할 수 있다는 것을 나타낸다.
소형 화학적 억제제의 추가적인 예로 전술한 JNK 억제제 AS601245가 있다. AS601245는 JNK 신호 전달 경로를 억제하고, 대뇌허혈(大腦虛血) 후의 세포 생존을 촉진한다. 생체 내에서, AS601245는 일과성 완전 허혈(transient global ischemia)의 저빌(gerbil) 모델에서 해마 CA1 뉴런의 지연 소실(delayed loss)에 대한 상당한 보호를 제공한다. 이러한 효과는 JNK 억제 및 그에 따른 c-Jun 발현 및 인산화에 의해 매개된다 (예컨대, Carboni et al., J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jul; 310(1):25-32. Epub 2004 Feb 26th 참조).
JNK 신호 전달 경로의 억제제의 3번째 종류는 전술한 바와 같이 JNK 및 그의 기질 사이의 상호작용의 펩티드 억제제이다. 그러한 JNK 억제제 펩티드의 제조를 위한 출발 포인트로서, 자연적으로 발생하는 JNK 단백질의 서열 정렬(sequence alignment)이 사용될 수 있다. 일반적으로, 이들 단백질은 JNK 결합 도메인 (JBDs)을 포함하고, IB1 또는 IB2와 같은 다양한 인슐린 결합 (IB) 단백질에서 나올 수 있다. 그러한 예시적 서열 정렬의 결과는, 예컨대 IB1 [서열 번호 13], IB2 [서열 번호 14], c-Jun [서열 번호 15] 및 ATF2 [서열 번호 16]의 JNK 결합 도메인 사이 에서의 서열 정렬이다 (예컨대, 도 1A∼1C 참조). 그러한 정렬은 부분적으로 보존된 8개 아미노산 서열을 밝혀낸다 (예컨대, 도 1A 참조). IB1 및 IB2의 JBDs의 비교로 2개의 서열 사이에 고도로 보존된 7개 및 3개 아미노산의 2가지 블록을 추가로 밝혀낸다.
예컨대 WO 01/27268에서 그러한 정렬에 기초하여 만들어진 서열이 개시되어 있다. 특히, WO 01/27268은 HIV-TAT 단백질의 염기성 수송 서열(basic trafficking sequence)로부터 유래된 소위 TAT 세포 투과 서열과, IB1의 최소 20개 아미노산의 억제 서열을 포함하는 소형 세포 투과성 융합 펩티드를 개시하고 있다. 상기 양쪽 성분들은 서로 공유적으로 결합 되어있다. WO 01/27268에서 개시된 MAPK-JNK 신호 전달 경로의 예시적인 (그리고 현재 유일한) 억제제는, 예컨대 L-JNKI1 (L 아미노산으로 이루어지는 JNK-억제제 펩티드) 또는 프로테아제 저항 D-JNKI1 펩티드 (비천연 D 아미노산으로 이루어지는 JNK-억제제 펩티드)이다. 이들 JNK-억제제 (JNKI) 펩티드는 JNK (JNK1, JNK2 및 JNK3)에 특이적이다. 전술한 작은 화합물 억제제와 대조적으로, 상기 WO 01/27268에서의 억제제 서열, 예컨대 JNKI1은 JNK와 그의 기질 사이의 상호작용을 억제한다. TAT로부터 유도된 그의 수송(trafficking) 서열에 의하여, 상기 융합 펩티드는 세포 내로 효율적으로 운반된다. 수송 성분에 의하여 얻어진 새로운 특성에 기인하여, 상기 융합 펩티드는 세포 내로 활발하게 운반되고, 여기서 그들은 단백질 분해(proteolytic degradation)시까지 유효하게 잔존한다.
그러나, WO 01/27268에 기재된 펩티드는 인산화효소 (키나아제)에 의하여 여 전히 용이하게 접근될 수 있다. 키나아제의 표적으로서 제공되고, 그에 따라 인산화의 대상이 될 수 있는 펩티드의 임의의 아미노산이 그러한 펩티드를 불활성화시키는데 중요한 인자가 된다. 따라서, 본 발명의 첫 번째 목적은 WO 01/27268에 개시되어 있는 바와 같은 펩티드의 기능적 특성을 보유하지만, 인산화효소 (키나아제)에 대한 향상된 안정성을 제공하는, JNK 신호 전달 경로에 대한 신규의 억제제 서열을 제공하는 것이다.
또한, WO 01/27268에 따른 억제제 서열은, 특히 큰 스케일의 양으로 (예컨대, 산업적 생산을 위한 경우) 제조하는 경우 비용이 많이 드는 회수 및 정제 단계를 필요로 한다. 따라서, 본 발명의 두 번째 목적은 언급한 당해 기술분야의 경우보다 더 용이하고, 더 비용 효율이 좋은 생산 및 회수를 가능하게 하는 억제제 서열을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적은 서열 번호 1, 2, 3 또는 4, 또는 이들의 단편, 유도체 또는 변이체 중 1개 이상의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들 중 1개 이상의 아미노산 서열로 이루어지고, 길이가 150개 아미노산 미만인 것을 포함하는 JNK 억제제 서열에 의하여 해결된다.
좋기로는, 본 발명의 JNK 억제제 서열은 JNK에 결합하고/결합하거나, 예컨대 c-Jun 또는 ATF2 (예컨대, 각각 서열 번호 15 및 16) 또는 Elk1과 같은 1종 이상의 JNK 활성화 전사 인자의 활성화를 억제한다.
일반적으로, 본 발명의 JNK 억제제 서열은 150개 미만의 아미노산 잔기, 좋기로는, 5∼150개 아미노산 잔기, 더욱 좋기로는, 10∼100개 아미노산 잔기, 더욱더 좋기로는, 10∼75개 아미노산 잔기, 가장 좋기로는, 15∼50개 아미노산 잔기의 총 길이를 포함한다.
본 발명의 JNK 억제제 서열은 서열 번호 1, 2, 3 또는 4, 또는 이들의 단편, 유도체 또는 변이체 중 1개 이상의 아미노산 서열을 함유하거나 또는 이들 중 1개 이상의 아미노산 서열로 이루어지는 것이 좋다. 더욱 좋기로는, 본 발명의 JNK 억제제 서열은 서열 번호 1, 2, 3 또는 4, 또는 이들의 단편, 유도체 또는 변이체의 아미노산 서열의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 카피를 함유할 수 있다. 1개를 넘는 카피가 있는 경우, 이들 본 발명의 서열 번호 1, 2, 3 또는 4, 또는 이들의 단편, 유도체 또는 변이체의 아미노산 서열은 링커 서열 없이 직접적으로, 또는 1∼10개, 좋기로는 1∼5개의 아미노산을 포함하는 링커 서열을 통해 서로 연결될 수 있다. 링커 서열을 형성하는 아미노산 서열은 아미노산 잔기로서 글리신 또는 프롤린으로부터 선택되는 것이 좋다. 더 좋기로는, 이들 본 발명의 서열 번호 1, 2, 3 또는 4, 또는 이들의 단편, 유도체 또는 변이체의 아미노산 서열은 2개, 3개 또는 그 이상의 프롤린 잔기의 경첩(hinge)에 의하여 서로 분리될 수 있다.
전술한 본 발명의 JNK 억제제 서열은 L-아미노산, D-아미노산 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 좋기로는, 본 발명의 JNK 억제제 서열은 1개 이상, 좋기로는 3개 이상, 더욱 좋기로는 6개 이상, 더욱더 좋기로는 10개 이상의 D- 및/또는 L-아미노산을 포함하는데, 상기 D- 및/또는 L-아미노산은 본 발명의 JNK 억제제 서열에서 블록방식(blockwise), 비블록방식(non-blockwise) 또는 교대 방식(alternate manner)으로 배열될 수 있다.
한 가지 양호한 실시 상태에서, 본 발명의 JNK 억제제 서열은 L-아미노산만으로 구성될 수 있다. 본 발명의 JNK 억제제 서열은 서열 번호 1 또는 3에 따른 1개 이상의 "천연 JNK 억제제 서열"을 포함하거나 또는 이들로 이루어질 수 있다. 여기서, "천연(native)" 또는 "천연 JNK 억제제 서열(들)"은 전부 L-아미노산으로 구성되는, 서열 번호 1 또는 3 중의 어느 하나에 따른 변경되지 않은 본 발명의 JNK 억제제 서열을 말한다.
따라서, 본 발명의 JNK 억제제 서열은 1개 이상의 (천연) 아미노산 서열 NH2-Xn b-Xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH [서열 번호 3]을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 여기서 사용된, 각각의 X는 아미노산 잔기로서, 좋기로는 임의의 (천연) 아미노산 잔기에서 선택되는 아미노산 잔기를 의미한다. Xn a는 1개의 아미노산 잔기, 좋기로는 세린 또는 트레오닌을 제외한 임의의 아미노산 잔기에서 선택되는 아미노산 잔기를 의미하며, 여기서 n은 0 또는 1이다. 또한, 각각의 Xn b는 임의의 아미노산 잔기 중에서 선택될 수 있는데, 여기서, n은 0∼5, 5∼10, 10∼15, 15∼20, 20∼30 또는 그 이상이고, Xn a에서 n이 0인 경우, Xn b는 그의 C-말단에 세린 또는 트레오닌을 포함하지 않아서 이 위치에서의 세린 또는 트레오닌을 피하도록 하여야 한다. 좋기로는, Xn b는 서열 번호 1 또는 3으로부터 유래된 펩타이드 잔기의 인접한 스트레치(contiguous stretch)를 나타낸다. 더욱 좋기로는, 본 발명의 JNK 억제제 서열은 1개 이상의 (천연) 아미노산 서열 NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH [서열 번호 1]를 더 포함하거나 추가적으로 구성될 수 있다. Xn a 및 Xn b는 D 또는 L 아미노산을 의미한다.
또 다른 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 JNK 억제제 서열은 부분적으로 또는 전적으로 D-아미노산로 구성될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 이들 D-아미노산으로 구성되는 본 발명의 JNK 억제제 서열은 전술한 (천연) JNK 억제제 서열의 비천연 D 레트로-인버소(non-native D retro-inverso) 서열이다. "레트로-인버소(retro-inverso) 서열"이라는 용어는 서열의 방향(direction)이 반대이고, 각 아미노산 잔기의 키랄성(chirality)이 역전된 선형 펩티드 서열의 이성질체(isomer)를 말한다 (예컨대, Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368,692-693 (1994) 참조). D-거울상체 및 역합성(reverse synthesis)의 결합의 이점은 각각의 알파 탄소에서 측쇄 기의 위치는 보존되면서, 각각의 아미드 결합에서 카르보닐기 및 아미노기의 위치가 교환된다는 것이다. 특별히 달리 언급하지 않는 한, 본 발명에 따른 임의의 주어진 L-아미노산 서열 또는 펩티드는 상응하는 천연 L-아미노산 서열 또는 펩티드에 대한 역 서열 또는 펩티드들 합성하는 것에 의하여 D 레트로-인버소 서열 또는 펩티드로 전환될 수 있는 것이다.
전술한 본 발명의 D 레트로-인버소 서열은 다양한 유용한 특성을 가진다. 예를 들어, 본 발명의 D 레트로-인버소 서열은 본 발명에 따른 L-아미노산 서열만큼 효과적으로 세포로 들어가는 한편, 본 발명의 D 레트로-인버소 서열은 대응하는 L-아미노산 서열보다 더 안정하다.
따라서, 본 발명의 JNK 억제제 서열은 아미노산 서열 NH2-Xn b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn a-Xn b-COOH [서열 번호 4]에 따른 1개 이상의 D 레트로-인버소 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 여기서 사용된, X, Xn a, Xn b는 앞에서 정의한 바와 같은데 (좋기로는, D 아미노산을 나타냄), 여기서 Xn b는 좋기로는 서열 번호 2 또는 4로부터 유래된 잔기의 인접한 스트레치(contiguous stretch)를 나타낸다. 더욱 좋기로는, 본 발명의 JNK 억제제 서열은 아미노산 서열 NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH [서열 번호 2]에 따른 1개 이상의 D 레트로-인버소 서열을 포함사거나 또는 이들로 이루어질 수 있다.
전술한 본 발명의 JNK 억제제 서열이 표 1에 기재되어 있다 (서열 번호 1∼4). 표 1에는 본 발명의 JNK 억제제 서열의 이름뿐만 아니라 그 서열들의 식별 번호, 길이 및 아미노산 서열이 기재되어 있다. 또한, WO 01/27268 (서열 번호 17∼26)에 기재된 선행 기술의 서열은 비교를 위해서 기재한다. 이들 선행 기술의 서열은 본 발명의 JNK 억제제 서열 또는 본 발명의 키메라 펩티드로서 본 명세서에 개시된 것이 아니고, 따라서 본 발명의 범위에서 디스클레이머(disclaimer)의 방법에 의해 명백하게 배제된다.
Figure 112008018069556-pct00001
또 다른 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 JNK 억제제 서열은 전술한 본 발명의 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 천연 또는 비천연 아미노산 서열의 1개 이상의 변이체, 단편 및/또는 유도체를 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 좋기로는, 이들 변이체, 단편 및/또는 유도체는 전술한 본 발명의 천연 또는 비천연 JNK 억제제 서열, 특히 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 천연 또는 비천연 아미노산 서열의 생물학적 활성 (즉, JNK에 대한 결합 및/또는 1종 이상의 JNK 활성화 전사 인자 (예컨대, c-Jun, ATF2 또는 Elk1)의 활성화의 억제)을 보유한다. 예컨대, 펩티드의 표적 분자에 대한 결합 테스트와 같은 다양한 시험법으로 또는 생물물리학적 방법 (예컨대, 분광법, 컴퓨터 모델링, 구조 분석 등)으로 기능성(functionality)이 시험될 수 있다. 특히, 본 발명의 JNK 억제제 서열 또는 그의 변이체, 단편 및/또는 유도체는 그 펩티드의 소수성 영역 및 친수성 영역을 확인하여, 그에 따라 결합 실험에서와 같은 실험적 조작 또는 항체 합성을 위한 기질의 디자인에 있어 도움이 되도록 하는데 이용될 수 있는 친수성 분석법 (예컨대, Hopp and Woods, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 3824-3828 참조)에 의하여 분석될 수 있다. 또한, 특이적인 구조적 모티프(motifs)로 추측되는 (본 발명의) JNK 억제제 서열의 영역 또는 그의 변이체, 단편 및/또는 유도체의 영역을 확인하기 위하여 2차 구조 분석이 수행될 수 있다 (예컨대, Chou and Fasman, 1974, Biochem 13: 222-223 참조). 조작, 번역, 2차 구조 예측, 친수성 및 소수성 프로파일, 열린 해독틀 (ORF) 예측 및 플롯팅(plotting) 및 서열 상동성의 측정이 당해 기술 분야에서 이용할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 구조 분석의 기타의 방법으로 예컨대 X선 결정학 (예컨대, Engstrom, 1974. Biochem Exp Biol 11: 7-13 참조)을 포함하고, 질량 분석법 및 기체 크로마토그래피 (예컨대, METHODS IN PROTEIN SCIENCE, 1997, J. Wiley and Sons, New York, NY 참조) 및 컴퓨터 모델링 (예컨대, Fletterick and Zoller, eds., 1986. Computer Graphics and Molecular Modeling, In: CURRENT COMMUNICATIONS IN MOLECULAR BIOLOGY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 참조)이 또한 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 JNK 억제제 서열은 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 (천연 또는 비천연) 아미노산 서열의 1개 이상의 변이체를 포함하거나 또는 이들로 이루어질 수 있다. 본 발명과 관련하여, "서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 (천연 또는 비천연) 아미노산 서열의 변이체"는 좋기로는 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 서열 중의 한 가지로부터 유래된 서열로서, 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 아미노산 서열에서의 아미노산의 변경을 포함하는 것이다. 일반적으로 그러한 변경은 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 아미노산의 1∼20개, 좋기로는 1∼10개, 더욱 좋기로는 1∼5개의 치환, 부가 및/또는 결실을 포함하는데, 여기서 상기 변이체는 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 서열 중 하나와 약 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타낸다.
본 발명의 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 (천연 또는 비천연) 아미노산 서열의 변이체가 특이적 아미노산의 치환에 의하여 얻어지는 경우라면, 그러한 치환은 보존적 아미노산 치환을 포함하는 것이 좋다. 보존적 아미노산 치환은 충분히 유사한 물리화학적 특성을 가지는 그룹 내의 동의적(synonymous) 아미노산 서열 잔기를 포함하여, 그 그룹의 일원들 사이에서의 치환은 그 분자의 생물학적 활성을 보존할 것이다 (예컨대, Grantham, R. (1974), Science 185, 862-864 참조). 특히, 삽입 및/또는 결실이 단지 수개 (예컨대, 20개 미만, 좋기로는 10개 미만)의 아미노산만을 포함하고, 기능적 활성에 결정적인 아미노산을 제거 또는 치환시키지 않는다면, 아미노산은 전술한 서열에서 그들의 기능의 변경 없이 삽입 및/또는 결실될 수 있다는 사실은 당해 기술 분야의 숙련자에게 명백하다. 더욱이, 생체 내 또는 시험관 내에서 본 발명의 JNK 억제제 서열의 불활성화 또는 본 발명의 키메라 펩티드의 불활성화를 피하기 위하여, 인산화효소, 좋기로는 키나아제에 대해 접근될 수 있는 아미노산 자리에서 추가적인 트레오닌을 가져오는 치환은 본 발명의 변이체에서 회피될 것이다.
동일한 그룹으로 분류되고, 보존적 아미노산 치환에 의하여 일반적으로 상호교환 가능한 양호한 동의적 아미노산 잔기를 표 2에 기재한다.
Figure 112008018069556-pct00002
본 발명의 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 변이체의 구체적 형태 중 하나는 일반적으로 서열 번호 1, 2, 3 또는 4와 비교하여 1개 이상의 결실에 의하여 변경된, 본 발명의 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 (천연 또는 비천연) 아미노산 서열의 단편이다. 좋기로는, 단편은 서열 번호 1, 2, 3 또는 4 중 하나의 4개 이상의 연속된 아미노산 (이들 서열 중 하나로부터의 에피토프의 특이적 인식을 가능하게 하기 위해 일반적으로 충분한 길이임)을 포함한다. 더욱더 좋기로는, 상기 단편은 서열 번호 1, 2, 3 또는 4 중 하나의 4∼18개, 4∼15개, 또는 가장 바람직하게는 4∼10개의 연속된 아미노산을 포함한다. 아미노산의 결실은 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 임의의 위치에서, 좋기로는 N- 또는 C-말단에서 일어날 수 있다. 특히, 서열 번호 2 (DQSRPVQPFLNLTTPRKPR)의 펩티드는 그의 N- 및/또는 C-말단에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산이 결실될 수 있다. 다시 말하면, 서열 번호 2의 바람직한 짧은 형태는 서열 QSRPVQPFLNLTTPRKPR, SRPVQPFLNLTTPRKPR, RPVQPFLNLTTPRKPR, PVQPFLNLTTPRKPR 또는 VQPFLNLTTPRKPR, 또는 각각 DQSRPVQPFLNLTTPRKP, DQSRPVQPFLNLTTPRK, DQSRPVQPFLNLTTPR, DQSRPVQPFLNLTTP, DQSRPVQPFLNLTT 또는 QSRPVQPFLNLTTPRKP, SRPVQPFLNLTTPRKP, SRPVQPFLNLTTPRK, RPVQPFLNLTTPRKP, RPVQPFLNLTTPRK 또는 PVQPFLNLTTP 일 수 있다. 본 발명의 펩티드 서열이 더 짧을수록, 그의 비특이적 세포 독성은 더 낮아진다. 어떤 실시 상태에서는, 사용되는 펩티드는 생물학적 기능(예컨대, JNK 억제 기능)을 여전히 보유하는 가능한 가장 짧은 서열을 가질 것이다.
또한, 본 발명의 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 (천연 또는 비천연) 아미노산 서열의 단편은 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 서열 중의 하나와 약 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열로서 정의될 수 있다.
본 발명의 JNK 억제제 서열은 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 (천연 또는 비천연) 아미노산 서열의 1개 이상의 유도체를 더 포함하거나 또는 이들로 구성될 수 있다. 이와 관련하여, "서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 (천연 또는 비천연) 아미노산 서열의 유도체"는 좋기로는 서열 번호 1, 2, 3 또는 4의 서열 중 하나로부터 유래되는 아미노산 서열로서, 상기 유도체는 1개 이상의 변형된 L- 또는 D-아미노산 (비천연 아미노산(들)을 형성하는 것), 좋기로는 1∼20개, 더욱 좋기로는 1∼10개, 더욱더 좋기로는 1∼5개의 변형된 L- 또는 D-아미노산을 포함한다. 변이체 또는 단편의 유도체도 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 명세서에서 개시된 펩티드 중의 하나는 그들의 말단, 즉 C- 또는 N-말단 중의 하나 또는 양쪽 모두에 변형을 가질 수 있다. 좋기로는, C-말단은 아미드 변형(amide modification)에 의하여 변형될 수 있는 반면, N-말단은 임의의 적절한 NH2-보호기 (예컨대, 아실화)로 변형될 수 있다.
이와 관련하여 "변형된(modified) 아미노산"은, 예컨대 다양한 생물에서의 서로 다른 글리코실화에 의하여, 인산화에 의하여 또는 특정 아미노산을 표지화(labeling)하는 것에 의하여 변형된 아미노산일 수 있다. 상기 표지는 다음을 포함하는 표지의 군 중에서 일반적으로 선택될 수 있다.
(i) 방사성 표지, 즉, 방사성 인산화 또는 황, 수소, 탄소, 질소 등으로의 방사성 표지,
(ii) 착색 염료 (예컨대, 디곡시제닌(digoxygenin) 등),
(iii) 형광 군(群) (예컨대, 플루오레신(fluorescein) 등),
(iv) 화학발광 군,
(v) 고체상 위에 고정화를 위한 군 (예컨대, 히스티딘-태그(His-tag), 비오틴, strep-tag(스트렙-태그), flag-tag(플래그-태그), 항체, 항원 등) 및
(vi) (i) 내지 (v)에서 언급한 표지의 2종 이상 표지의 조합.
전술한 바와 관련하여, 본 발명의 조회(query) 아미노산에 대해 예컨대 95% 이상의 "서열 동일성을 공유하는" 서열을 가지는 아미노산 서열이라는 표현은, 대상 아미노산 서열이 아미노산 서열의 100개 아미노산마다 5개까지의 아미노산 변경을 포함할 수 있는 것을 제외하고는, 대상 아미노산 서열은 조회 서열과 동일하다는 것을 의미하는 것이다. 다시 말하면, 조회 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 동일한 서열을 가지는 아미노산 서열을 얻기 위해서, 대상 서열에서 아미노산 잔기의 5% 까지(100개 중 5개)가 또 다른 아미노산으로 삽입 또는 치환되거나 결실될 수 있다.
정확하게 일치하지 않는 서열에 있어서, 제1 서열의 "% 동일성"이 제2 서열과 관련하여 측정될 수 있다. 일반적으로, 비교되는 이들 2개의 서열은 그 서열들 사이에서의 최대 상관관계를 얻기 위하여 정렬된다. 이것은 정렬의 정도를 증가시키기 위하여 하나 또는 양쪽의 서열에서 "틈(gaps)"을 삽입하는 것을 포함할 수 있다. % 동일성은 동일하거나 유사한 길이의의 서열에 있어 특히 적합하게, 비교되는 각 서열의 전체 길이에 걸쳐서 측정 (소위, 전체 정렬(global alignment))되거나, 또는 동일하지 않은 길이의 서열들에 있어서 더욱 적합하게, 더 짧은, 한정된 길이에 걸쳐서 측정 (소위, 국소 정렬(local alignment))될 수 있다.
2개 이상의 서열들의 동일성 및 상동성을 비교하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 따라서, 예를 들면, 위스콘신 서열 분석 패키지, 버전 9.1(Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 387-395.)에서 이용할 수 있는 프로그램, 예컨대, BESTFIT 및 GAP 프로그램을 2개의 폴리뉴클레오티드 사이의 % 동일성 및 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 % 상동성을 측정하는데 사용할 수 있다. BESTFIT은 "국소 상동성" 알고리즘 (Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197.)을 사용하고, 2개의 서열 사이의 유사한 최선의 단일 영역을 찾는다. 서열들 사이의 동일성 및/또는 유사성을 측정하기 위한 기타의 프로그램들, 예컨대, NCBI의 홈페이지 (월드 와이드 웹 사이트 ncbi.nlm.nih.gov)를 통해서 접근할 수 있는 BLAST 패밀리의 프로그램 (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410) 및 FASTA (Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448.) 등도 당해 기술 분야에 알려져 있다.
본 발명의 JNK 억제제 서열은 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법, 예컨대, 아래에서 설명할 화학적 합성법 또는 유전 공학적 방법에 의하여 얻거나 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 JNK 억제제 서열 중의 목적하는 영역을 포함하고, 시험관 내 또는 생체 내에서 목적하는 활성을 달성하는, 본 발명의 JNK 억제제 서열의 일부에 상응하는 펩티드는 펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
따라서, 두 번째 측면에서, 본 발명은 1개 이상의 제1 도메인 및 1개 이상의 제2 도메인을 포함하는 키메라 펩티드를 제공하는데, 상기 제1 도메인은 수송(trafficking) 서열을 포함하고, 상기 제2 도메인은 앞에서 정의한 본 발명의 JNK 억제제 서열을 포함하는 것이다.
일반적으로, 본 발명의 키메라 펩티드는 25개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대, 25 내지 250개 아미노산 잔기, 더 좋기로는 25 내지 200개 아미노산 잔기, 더욱더 좋기로는 25 내지 150개 아미노산 잔기 및 25 내지 100개 아미노산 잔기, 가장 좋기로는 25 내지 50개 아미노산 잔기의 길이이다.
제1 도메인으로서, 본 발명의 키메라 펩티드는 좋기로는 수송 서열을 포함하는데, 그 서열은 펩티드(상기 서열이 그 안에 존재하는 펩티드)를 목적하는 세포의 목적지에 인도하는 임의의 아미노산의 서열 중에서 일반적으로 선택되는 것이다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 수송 서열은 일반적으로 펩티드가 원형질막을 통과하도록 (예컨대, 세포 외부로부터 원형질막을 통하여 세포질 속으로) 지시(direct)한다. 그 대신에 또는 추가적으로, 수송 서열은 예컨대 2개의 성분 (예컨대, 세포 투과를 위한 성분 및 핵 내 위치화를 위한 성분)의 결합에 의하여, 또는 예컨대 세포막 운반의 특성을 가지고 예컨대 핵내로의 운반으로 표적화된 단일 성분에 의하여, 펩티드가 세포 내의 목적하는 위치 (예컨대, 핵, 리보좀, 소포체(ER), 리소좀, 퍼옥시좀)로 지시(direct)할 수 있다. 또한, 수송 서열은 세포질 성분 또는 기타의 성분 또는 세포의 구획 (예컨대, 소포체, 미토콘드리아, 글룸 기관(gloom apparatus), 리소좀성 소포)에 결합할 수 있는 또 다른 성분을 포함할 수 있다. 따라서, 예컨대 제1 도메인의 수송 서열 및 제2 도메인의 JNK 억제제 서열은 세포질 내 또는 기타의 세포내 구획에 위치될 수 있다. 이것은 흡수(uptake)에 따른 세포 내에서 키메라 펩티드의 위치(localization)을 결정할 수 있게 된다.
좋기로는, 수송 서열 (본 발명의 키메라 펩티드의 제1 도메인에 포함되는 것)은 5 내지 150개 아미노산 서열의 길이, 더 좋기로는 5 내지 100개의 길이, 가장 좋기로는 5 내지 50개, 5 내지 30개 또는 5 내지 15개 아미노산의 길이를 가진다.
더욱 좋기로는, 수송 서열 (본 발명의 키메라 펩티드의 제1 도메인에 포함되는 것)은 제1 도메인에서 연속 아미노산 서열 스트레치(stretch)로서 있을 수 있다. 그 대신에, 제1 도메인 중의 수송 서열은 2개 이상의 단편으로 나누어질 수 있는데, 여기서 이들 단편 모두는 전체 수송 서열을 닮고, 그러한 수송 서열이 전술한 그의 운반 특성을 보유한다면, 1 내지 10개, 좋기로는 1 내지 5개의 아미노산에 의해 서로 분리될 수 있다. 상기 수송 서열의 단편을 분리하는 이들 아미노산은 예컨대 수송 서열과 상이한 아미노산 서열로부터 선택될 수 있다. 그 대신에, 제1 도메인은 1개 이상의 성분으로 구성되는 수송 서열을 함유할 수 있는데, 그 각 성분은 예컨대 특정 세포 구획으로 수송되는 제2 도메인의 JNK 억제제 서열의 수송을 위한 그 자신의 기능을 가진다.
전술한 수송 서열은 L-아미노산, D-아미노산 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 좋기로는, 본 발명의 수송 서열은 1개 이상, 좋기로는 3개 이상, 더 좋기로는 6개 이상, 더욱더 좋기로는 10개 이상의 L-아미노산 및/또는 D-아미노산을 포함하는데, 여기서 상기 D- 및/또는 L-아미노산은 본 발명의 JNK 수송 서열에서 블록 방식(blockwise), 비블록 방식(non-blockwise) 또는 교대 방식(alternate manner)으로 배열될 수 있다.
또 다른 한가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 키메라 펩티드의 수송 서열은 L-아미노산만으로 구성될 수 있다. 더욱 좋기로는, 본 발명의 키메라 펩티드의 수송 서열은 전술한 1개 이상의 "천연(native)" 수송 서열을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 이와 관련하여, "천연"이라는 용어는 변경되지 않은 수송 서열로서, L-아미노산만으로 구성된 것을 말한다.
또 다른 실시 상태에 있어서, 본 발명의 키메라 펩티드의 수송 서열은 D-아미노산만으로 구성될 수 있다. 더욱 좋기로는, 본 발명의 키메라 펩티드의 수송 서열은 전술한 바와 같은 그 서열의 D 레트로-인버소 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 키메라 펩티드의 제1 도메인의 수송 서열은 자연적으로 생성되는 공급원으로부터 얻거나, 또는 유전 공학 기술 또는 화학적 합성을 사용하여 생산될 수 있다 (예컨대, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 참조).
예컨대, 천연 단백질, 예컨대, TAT 단백질 (예컨대, 미국 특허 제5,804,604호 및 제5,674,980호에 기재되어 있는 것; 이들 각 참조 문헌은 본 명세서에 참조 통합됨), VP22 (예컨대, WO 97/05265; Elliott and O'Hare, Cell 88 : 223-233 (1997)에 기재되어 있음), 비바이러스성 단백질 (Jackson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 10691-10695 (1992)), 안테나페디아(Antennapedia) 유래 수송 서열(예컨대, 안테나페디아 운반체 서열) 또는 염기성 펩티드, 예컨대, 5 내지 15개의 아미노산, 좋기로는 10 내지 12개의 아미노산 길이이고, 80% 이상, 더 좋기로는 85% 이상 또는 90%의 염기성 아미노산(예컨대, 아르기닌, 리신 및/또는 히스티딘 등)을 포함하는 펩티드 유래 수송 서열을 포함하는, 제1 도메인의 수송 서열의 공급원이 사용될 수 있다. 또한, 수송 서열로서 사용되는 천연 단백질 중의 하나의 변이체, 단편 및 유도체가 본 명세서에 함께 개시되어 있다. 변이체, 단편 및 유도체와 관련해서는, JNK 억제제 서열에 관하여 전술한 정의가 언급되어 있다. 변이체, 단편 및 유도체는 JNK 억제제 서열에 대해 언급한 것과 상응하게 정의된다. 특히, 수송 서열과 관련하여서는, 변이체 또는 단편 또는 유도체는 앞에서 정의된 것과 같이 수송 서열로서 사용되는 천연 단백질 중의 하나와 약 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열로서 정의될 수 있다.
본 발명의 키메라 펩티드의 양호한 실시 상태에 있어서, 제1 도메인의 수송 서열은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)1 TAT 단백질로부터 유래된 서열, 특히, 그 TAT 단백질을 이루는 86개 아미노산 중 일부 또는 전부를 포함하거나 이들로 구성될 수 있다.
본 발명의 수송 서열에 있어서, 전장 TAT 단백질의 부분 서열이 TAT 단백질의 기능적으로 효과적인 단편 (즉, 세포로의 진입 및 흡수를 지시하는 영역을 포함하는 TAT 펩티드)을 만드는데 사용될 수 있다. 그러한 어떤 서열이 TAT 단백질의 기능적으로 효과적인 단편인지 여부는 알려진 기술을 사용하여 측정될 수 있다 (예컨대, Franked et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86 : 7397-7401 (1989) 참조). 따라서, 본 발명의 키메라 펩티드의 제1 도메인 중의 수송 서열은 86개 미만의 아미노산을 포함하고, 세포 내로의 흡수를 보이고, 필요에 따라 세포의 핵 내로의 흡수를 보이는 TAT 단백질 서열의 기능적으로 효과적인 단편 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 더욱 좋기로는, 키메라 펩티드의 세포막을 가로지르는 관통을 지시하기 위한 운반체로서 사용될 TAT의 부분 서열 (단편)은 전장 TAT의 염기성 영역(아미노산 48번 내지 57번 또는 49번 내지 57번)을 포함하도록 한다.
더 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 수송 서열은 TAT 잔기 48번 내지 57번 또는 49번 내지 57번을 함유하는 아미노산 서열, 가장 좋기로는, 일반식(generic) TAT 서열 NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-COOH [서열 번호 7] (식 중, Xn b는 앞에서 정의한 것과 같음)을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 그 대신에, 본 발명의 수송 서열은 예컨대 아미노산 서열 NH2-GRKKRRQRRR-COOH [서열 번호 5]을 함유하는 펩티드를 포함하거나 그 펩티드로 구성될 수 있다.
또 다른 더욱 바람직한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 수송 서열은 전술한 바와 같은 서열의 D 레트로-인버소 펩티드, 즉, 서열 NH2-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH [서열 번호 8]인 일반식 TAT 서열의 D 레트로-인버소 서열을 포함할 수 있다. 또한, 여기서 Xn b는 앞에서 정의한 바와 같다 (좋기로는, D 아미노산을 의미한다). 더욱이, 서열 번호 7∼8 중의 하나에서 "Xn b" 잔기의 개수는 표현되어 있는 하나로 한정되지 않으며, 전술한 바와 같이 변할 수 있다. 가장 좋기로는, 본 발명의 수송 서열은 D 레트로-인버소 서열 NH2-RRRQRRKKRG-COOH [서열 번호 6]을 포함할 수 있다.
또 다른 실시 상태에 있어서, 본 발명의 수송 서열은 앞에서 정의한 바와 같은 수송 서열의 변이체를 포함하거나 그 변이체로 구성될 수 있다. "수송 서열의 변이체"는 좋기로는 전술한 수송 서열로부터 유래된 서열로서, 예컨대, 전술한 수송 서열 내에 존재하는 1개 이상의 아미노산의 부가, (내부) 결실 (단편을 만듦) 및/또는 치환 등의 변형을 포함하는 것이다. 그러한 변형(들)은 일반적으로 1 내지 20개, 좋기로는 1 내지 10개 및 더욱 좋기로는 1 내지 5개의 아미노산의 치환, 부가 및/또는 결실을 포함한다. 더욱이, 변이체는 전술한 수송 서열, 더욱 좋기로는 서열 번호 5 내지 8 중의 하나와 약 30%, 50%, 70%, 80%,90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 것이 좋다.
좋기로는, 수송 서열의 그러한 변형은 안정성이 증가되거나 감소된 수송 서열을 만든다. 또 다르게는, 수송 서열의 변이체는 본 발명의 키메라 펩티드의 세포내 위치화를 조절하도록 디자인될 수 있다. 외부에서 첨가될 때, 전술한 그러한 변이체는 세포로 들어가게 하는 수송 서열의 능력을 유지하도록 일반적으로 디자인된다 (즉, 세포 내로의 수송 서열의 변이체의 흡수는 수송 서열로 사용되는 천연 단백질의 흡수와 실질적으로 유사하다). 예를 들어, 핵 위치화를 위해 중요할 것으로 생각되는 염기성 영역의 변경 (예컨대, Dang and Lee, J. Biol. Chem. 264 : 18019-18023 (1989); Hauber et al., J. Virol. 63 : 1181-1187 (1989) ; et al., J. Virol. 63 : 1-8 (1989) 참조)은 그 수송 서열, 그에 따라, 본 발명의 키메라 펩티드의 성분으로서 JNK 억제제 서열이 세포질에 위치하거나 또는 부분적으로 세포질에 위치하도록 할 수 있다. 전술한 바에 더하여, 변이체에, 예컨대 콜레스테롤 또는 기타의 지질 모이어티를 수송 서열에 결합시켜 막 용해도(membrane solubility)가 증가된 수송 서열을 만드는 것과 같은 추가의 변형이 도입될 수 있다. 전술한 본 발명의 수송 서열의 변이체는 당해 기술분야의 숙련자에게 일반적으로 알려진 기술을 사용하여 제조될 수 있다 (예컨대, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 참조)
본 발명의 키메라 펩티드는 제2 도메인으로서 본 발명의 JNK 억제제 서열의 변이체, 단편 및/또는 유도체를 포함하는 전술한 본 발명의 JNK 억제제 서열 중에서 선택된 본 발명의 JNK 억제제 서열을 포함한다.
양쪽 도메인, 즉 본 발명의 키메라 펩티드의 제1 및 제2 도메인(들)은 기능적 유닛(functional unit)을 형성하는 것과 같이 연결될 수 있다. 제1 및 제2 도메인(들)을 연결하기 위한 방법은 당해 기술 분야에 일반적으로 알려진 것과 같은 방법이 적용될 수 있다.
한가지 실시 상태에서, 본 발명의 키메라 펩티드의 제1 및 제2 도메인(들)은 좋기로는 공유 결합으로 결합된다. 본 명세서에서 정의되는 것과 같이, 공유 결합은 예컨대 융합 단백질로서 본 발명의 키메라 단백질을 발현시키는 것에 의하여 얻어질 수 있는 펩티드 결합일 수 있다. 본 명세서에서 정의되는 바와 같이, 융합 단백질은 아래에서 설명될 표준적인 재조합 DNA 기술과 유사한 방식으로 또는 그로부터 용이하게 적용될 수 있는 방식으로 만들어지고 사용될 수 있다. 그러나, 양쪽 도메인들은 또한 측쇄를 통하여 결합되거나, 화학적 링커 모이어티에 의하여 결합될 수 있다.
본 발명의 키메라 펩티드의 제1 및/또는 제2 도메인은 본 발명의 키메라 펩티드에서 1개 이상의 카피(copies)로 있을 수 있다. 양쪽 도메인이 단일 카피로 존재하는 경우, 제1 도메인은 제2 도메인의 N-말단 또는 C-말단 중의 하나와 연결될 수 있다. 다중 카피로 존재하는 경우, 제1 및 제2 도메인(들)은 임의의 가능한 순서로 배열될 수 있는데, 예컨대, 제1 도메인은 본 발명의 키메라 펩티드에서 좋기로는 연속적인 순서로 배열된 다중 카피 수 (예컨대, 2, 3, 또는 그 이상의 카피)로 존재할 수 있다. 그리고, 제2 도메인은 제1 도메인을 포함하는 서열의 N-말단 또는 C-말단에 존재하는 단일 카피로 존재할 수 있다. 그 대신에, 제2 도메인은 다중 카피 수(예컨대, 2, 3, 또는 그 이상의 카피)로 존재하고, 제1 도메인은 단일 카피로 존재할 수 있다. 상기 양쪽의 방식에 있어서, 제1 및 제2 도메인(들)은 연속되는 배열로 임의의 위치를 취할 수 있다. 다음과 같은 예시적 배열을 나타낼 수 있다: 예컨대, 제1 도메인-제1 도메인-제1 도메인-제2 도메인; 제1 도메인-제1 도메인-제2 도메인-제1 도메인; 제1 도메인-제2 도메인-제1 도메인-제1 도메인; 또는 예컨대, 제2 도메인-제1 도메인-제1 도메인-제1 도메인. 이들 예들이 단지 설명적인 목적을 위한 것이고, 본 발명의 범위가 여기에 제한되지는 않을 것이라는 사실을 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 이해될 수 있을 것이다. 따라서, 카피 수 및 배열은 처음 정의한 바와 같이 변화될 수 있다.
좋기로는, 제1 및 제2 도메인(들)은 어떠한 링커 없이 서로 직접적으로 결합될 수 있다. 그 대신에, 이들은 1 내지 10개, 좋기로는 1 내지 5개 아미노산을 포함하는 링커 서열을 통하여 서로 연결될 수 있다. 링커 서열을 형성하는 아미노산은 좋기로는 아미노산 잔기로서 글리신 또는 프롤린으로부터 선택된다. 더 좋기로는, 제1 및 제2 도메인(들)은 제1 및 제2 도메인(들) 사이에 2개, 3개 또는 그 이상의 프롤린 잔기의 힌지(hinge)에 의하여 서로 분리될 수 있다.
앞에서 정의한 바와 같은 1개 이상의 제1 도메인과 1개 이상의 제2 도메인을 포함하는 본 발명의 키메라 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다.
여기서, 각 도메인 (뿐만 아니라 사용되는 링커도)은 L-아미노산, D-아미노산 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다 (예컨대, D-TAT 및 L-IB1(s) 또는 L-TAT 및 D-IB1(s) 등). 좋기로는, 본 발명의 키메라 펩티드는 1개 이상, 좋기로는 3개 이상, 더욱 좋기로는 6개 이상, 더욱더 좋기로는 10개 이상의 L-아미노산 및/또는 D-아미노산을 포함하는데, 여기서 D- 및/또는 L-아미노산은 본 발명의 키메라 펩티드에서 블록 방식, 비블록 방식 또는 교대 방식으로 배열될 수 있다.
구체적인 실시 상태에 있어서, 본 발명의 키메라 펩티드는 일반식 L-TAT-IB 펩티드 [NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-Xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH, 서열 번호 10]에 따른 L-아미노산 키메라 펩티드를 포함하거나 그 펩티드로 구성될 수 있는데, 여기서, X, Xn a, Xn b는 앞에서 정의한 바와 같다. 더 좋기로는, 본 발명의 키메라 펩티드는 L-아미노산 키메라 펩티드 L-TAT-IB1 [NH2-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH, 서열 번호 9]을 포함하거나 그 펩티드로 구성될 수 있다.
또 다른 구체적인 실시 상태에 있어서, 본 발명의 키메라 펩티드는 전술한 L-아미노산 키메라 펩티드의 D-아미노산 키메라 펩티드를 포함하거나 그 펩티드로 구성될 수 있다. 본 발명에 따른 예시적인 D 레트로-인버소 키메라 펩티드로는 예컨대 일반식 D-TAT-IB 펩티드 [NH2-Xn b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH, 서열 번호 12]가 있다. 여기서, X, Xn a, Xn b는 좋기로는 앞에서 정의한 바와 같다(좋기로는 D 아미노산을 의미함). 더 좋기로는, 본 발명의 키메라 펩티드는 TAT-IB1 펩티드 [NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH, 서열 번호 11]에 따른 D-아미노산 키메라 펩티드를 포함하거나 그 펩티드로 구성될 수 있다. 그러나, 제1 및 제2 도메인의 링커 부분 (PP 대신)은 앞에서 정의한 바와 같은 -Xn a-Xn b-으로 구성될 수 있다. 특히, 최종적으로 (PP) 대신에 -Xn a-Xn b-를 가지는, 서열 번호 11의 제2 도메인(들)은 그들의 N- 및/또는 C-말단에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산이 결실될 수 있다. 또 다른 양호한 실시 상태에 있어서, 서열 번호 11의 제1 도메인은 그의 N- 및/또는 C-말단에서 1 또는 2개의 아미노산이 결실될 수 있다. 이(들) 결실(들)은 전술한 제2 도메인의 말단의 아미노산 잔기에서의 결실(들)과 결합될 수 있다. 따라서, 서열 번호 11의 양호한 변이체는, 예컨대 그들의 N- 및/또는 C-말단(들)에서 제2 도메인의 결실을 가진 다음과 같은 서열이다: QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG, PVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG, 또는 VQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG 또는, 각각, DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTP-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTT-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG, 또는 QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG 또는 PVQPFLNLTTP-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG. 제1 도메인의 말단(들)에서 단지 결실만을 함유하는 양호한 실시 상태는 다음과 같다: QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKK, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RQRRKKRG, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRQRRKKR, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RQRRKKR, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RQRRKK. 제1 및 제2 도메인에서의 결실의 조합이 있는 예는 다음과 같다: QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR, SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR, RPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR, PVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR, 또는 VQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR 또는, 각각, DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTTPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTTP-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTT-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR, 또는 QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR, SRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR, SRPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR, RPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR, RPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR 또는 PVQPFLNLTTP-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKK, SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKK, PVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKK, 또는 VQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKK 또는, 각각, DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRRQRRKK, DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RRRQRRKK, DQSRPVQPFLNLTTPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKK, DQSRPVQPFLNLTTP-Xn a-Xn b-RRRQRRKK, DQSRPVQPFLNLTT-Xn a-Xn b-RRRQRRKK, 또는 QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRRQRRKK, SRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRRQRRKK, SRPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RRRQRRKK, RPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRRQRRKK, RPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RRRQRRKK 또는 PVQPFLNLTTP-Xn a-Xn b-RRRQRRKK, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRQRRKKR, SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRQRRKKR, RPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRQRRKKR, PVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRQRRKKR, 또는 VQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRQRRKKR 또는, 각각, DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTTPR-Xn a-Xn b-RRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTTP-Xn a-Xn b-RRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTT-Xn a-Xn b-RRQRRKKR, 또는 QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRQRRKKR, SRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG 또는 PVQPFLNLTTP-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, PVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, 또는 VQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG 또는, 각각, DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTPR-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTP-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTT-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, 또는 QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG 또는 PVQPFLNLTTP-Xn a-Xn b-RRQRRKKRG, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RQRRKKRG, PVQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RQRRKKRG, 또는 VQPFLNLTTPRKPR-Xn a-Xn b-RQRRKKRG 또는, 각각, DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTPR-Xn a-Xn b-RQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTP-Xn a-Xn b-RQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTT-Xn a-Xn b-RQRRKKRG, 또는 QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKP-Xn a-Xn b-RQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRK-Xn a-Xn b-RQRRKKRG 또는 PVQPFLNLTTP-Xn a-Xn b-RQRRKKRG. 또한, 펩티드가 더 짧아질수록, 그들의 (비특이적) 세포 독성은 적어진다. 그러나, 상기 펩티드는 그들의 생물학적 기능, 즉, 세포막 투과성 (제1 도메인) 및 그들의 JNK 억제 기능 (제2 도메인)을 보유하여야만 한다.
앞에서 정의한 바와 같은 본 발명의 키메라 펩티드의 제1 및 제2 도메인(들)은 당해 기술 분야에 알려진 여하한 적절한 방식으로 수행되는 화학적 또는 생화학적 결합에 의하여, 예컨대, 제1 및 제2 도메인(들) 사이의 펩티드 결합의 형성에 의하여, 예컨대, 융합 단백질로서 제1 및 제2 도메인(들)을 발현시키는 것에 의하여 또는 예컨대, 본 발명의 키메라 펩티드의 제1 및 제2 도메인(들)을 가교(crosslinking)시키는 것에 의하여 서로 연결될 수 있다.
알려진 많은 화학적 가교법은 비특이적인데, 즉, 운반 폴리펩티드 또는 수송되는(cargo) 거대분자에서 임의의 특정 자리로의 결합의 지점을 지시하지 않는다. 그 결과, 비특이적 가교제의 사용은 기능성 자리를 공격하거나 또는 활성 자리를 입체적으로 차단하여, 그 복합 단백질을 생물학적으로 비활성으로 만들 수 있다. 따라서, 좋기로는 제1 및 제2 도메인(들)의 더욱 특이적인 결합을 가능하게 하는 가교 방법이 사용된다.
결합 특이성을 증가시키는 한가지 방법은 가교될 제1 및 제2 도메인(들) 중 하나 또는 양쪽 모두에서 단지 한번 또는 몇 번 존재하는 작용기(functional group)에 대해 직접적으로 화학적 결합을 시키는 것이다. 예를 들어, 티올기를 함유하는 유일한 단백질의 아미노산인 시스테인은 여러 단백질에서 단지 몇 개만 존재한다. 또한, 예를 들어, 리신 잔기를 함유하지 않는 폴리펩티드라면, 1차 아민에 대해 특이적인 가교제는 그 폴리펩티드의 아미노 말단에 대해 선택적일 것이다. 결합 특이성을 증가시키기 위한 이러한 접근법의 성공적인 이용을 위해서는 그 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성을 상실하지 않고 변경될 수 있는 영역에서 적절하게 드물고(rare) 반응성인 잔기를 가질 것을 필요로 한다.
치환되지 않으면 가교 반응에서의 그들의 참여가 생물학적 활성을 간섭할 것 같은 폴리펩티드 서열의 일부에 시스테인 잔기들이 존재하는 경우, 그 시스테인 잔기들은 치환될 수 있다. 시스테인 잔기가 치환될 경우, 폴리펩티드의 폴딩(folding)에 있어서 나타나는 변화를 최소화시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 폴리펩티드 폴딩에서의 변화는 그 대체물이 화학적으로 및 입체적으로 시스테인과 유사한 경우 최소화된다. 이러한 이유로, 시스테인의 대체물로서 세린이 좋다. 아래의 예에서 설명되는 것과 같이, 시스테인 잔기는 가교의 목적을 위하여 폴리펩티드의 아미노산 서열 내로 도입될 수 있다.
시스테인 잔기가 도입되는 경우, 아미노 또는 카르복시 말단에 또는 그 말단에 인접하게 도입되는 것이 좋다. 그러한 아미노산 서열 변경을 위해서 그 대상 폴리펩티드가 화학적 합성법에 의하여 또는 재조합 DNA의 발현을 통하여 생산되는 통상적인 방법이 이용될 수 있다.
또한, 제1 및 제2 도메인(들)의 결합은 커플링 또는 접합제(coupling or conjugating agent)를 통하여 이루어질 수 있다. 이용될 수 있는 몇몇 분자 내 가교 시약이 있다 (예컨대, Means and Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, pp. 39-43 참조). 이들 시약 중에는 예를 들어 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) 또는 N,N'-(1,3-페닐렌) 비스말레이미드 (이들 양쪽 모두는 설피드릴기에 대하여 매우 특이적이고, 비가역적인 결합을 형성한다); N, N'-에틸렌-비스-(요도아세트아미드) 또는 6 내지 11개의 탄소 메틸렌 브릿지를 가지는 기타의 그러한 시약 (이들은 설피드릴기에 대하여 비교적 특이적이다); 및 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 (이것은 아미노기 및 티로신기와 비가역적인 결합을 형성한다)이 있다. 이러한 목적을 위해 유용한 기타의 가교 시약에는 p,p'-디플루오로-m,m'-디니트로디페닐설폰 (이것은 아미노 및 페놀기와 비가역적인 가교를 형성한다); 디메틸 아디프이미데이트 (이것은 아미노기에 대해 특이적이다); 페놀-1,4 디술포닐클로라이드 (이것은 아미노기와 주로 반응한다); 헥사메틸렌디이소시아네이트 또는 디이소티오시아네이트, 또는 아조페닐-p-디이소시아네이트 (이들은 아미노기와 주로 반응한다); 글루타르알데하이드 (이것은 몇몇 서로 다른 측쇄와 반응한다); 및 디스디아조벤지딘 (이것은 티로신 및 히스티딘과 우선적으로 반응한다)가 포함된다.
가교제는 동종이작용성(homobifunctional), 즉, 동일한 반응을 수행하는 2개의 작용기를 가질 수 있다. 양호한 동종이작용성 가교제로 비스말레이미도헥산 ("BMH")이 있다. BMH는 온화한 조건 (pH 6.5∼7.7) 하에서 설피드릴 함유 화합물과 특이적으로 반응하는 2개의 말레이미드 작용기를 함유한다. 상기 2개의 말레이미드기는 탄화수소 사슬에 의하여 연결된다. 따라서, BMH는 시스테인 잔기를 함유하는 폴리펩티드들의 비가역적인 가교를 위해 유용하다.
또한, 가교제는 이종이작용성(heterobifunctional)일 수 있다. 이종이작용성 가교제는 2개의 서로 다른 작용기를 가지는데, 예컨대, 유리 아민 및 티올을 가진 2개의 단백질과 각각 가교되는 아민 반응성 기와 티올 반응성 기를 가진다.
이종이작용성 가교제의 예에는, 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 ("SMCC"), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 ("MBS") 및 MBS의 연장된 사슬 유사체인 숙신이미드 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 ("SMPB")가 있다. 이들 가교제의 숙신이미딜기는 1차 아민과 반응하고, 티올 반응성 말레이미드는 시스테인 잔기의 티올기와 공유 결합을 형서한다.
가교 시약은 흔히 물에 대한 낮은 용해도를 가진다. 친수성 모이어티 (예컨대, 설포네이트기)가 가교 시약의 물에 대한 용해도를 향상시키기 위해 그 가교 시약에 첨가될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에 있어서 사용될 수 있는 물에 대한 용해도를 위해 변형된 가교 시약의 예로 설포-MBS 및 설포-SMCC가 있다.
많은 가교 시약들은 세포의 조건하에서 본질적으로 비절단성인(non-cleavable) 결합물(conjugate)을 만들어 낸다. 그러나, 일부 가교 시약은 이황화물과 같은 세포 조건 하에서 절단될 수 있는 공유 결합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 트라우트 시약(Traut's reagent), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트) ("DSP") 및 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 ("SPDP")는 잘 알려진 절단될 수 있는 가교제이다. 절단될 수 있는 가교 시약의 사용은 표적 세포 속으로 운반된 후 수송되는 모이어티가 운반 폴리펩티드로부터 분리되는 것을 가능하게 한다. 직접적인 이황화 결합 역시 유용할 것이다.
전술한 것을 포함하는 수많은 가교 시약이 시판중에 있다. 그들의 사용에 대한 상세한 지침은 그 상업적 공급자로부터 용이하게 얻을 수 있다. 단백질 가교 및 접합 조제에 대한 일반적인 참조문헌으로 Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press (1991)이 있다.
화학적 가교는 스페이서 암(spacer arms)의 사용을 포함할 수 있다. 스페이서 암은 분자 내 유연성을 제공하고, 접합된 모이어티들 사이의 분자 내의 거리를 조절하며, 그에 따라 생물학적 활성의 유지에 도움을 줄 수 있다. 스페이서 암은 스페이서 아미노산 (예컨대, 프롤린)을 포함하는 폴리펩티드 모이어티의 형태일 수 있다. 그 대신에, 스페이서 암은 "긴사슬 SPDP"에서와 같은 가교 시약의 일부일 수 있다 (Pierce Chem. Co., Rockford, IL., cat. No. 21651 H).
또한, 전술한 키메라 펩티드 중 하나의 변이체, 단편 또는 유도체가 본 명세서에 함께 개시되어 있다. 단편 및 변이체와 관련하여, JNK 억제제 서열에 대하여 전술한 정의가 일반적으로 참조될 수 있다.
특히, 본 발명과 관련하여, "키메라 펩티드의 변이체"는 좋기로는 서열 번호 9 내지 12에 따른 서열 중의 하나로부터 유래된 서열로서, 상기 키메라 변이체는 서열 번호 9 내지 12에 따른 본 발명의 키메라 펩티드의 아미노산 변경을 포함한다. 그러한 변경은 1 내지 20개, 좋기로는 1 내지 10개, 더욱 좋기로는 1 내지 5개의 아미노산의 치환, 부가 및/또는 결실 (단편을 만듦)을 일반적으로 포함하는데, 그 변경된 본 발명의 키메라 펩티드는 서열 번호 9, 10, 11 또는 12에 따른 서열 중의 하나와 약 30%, 50%, 70%, 80% 또는 95%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타낸다. 좋기로는, 이들 변이체는 본 발명의 키메라 펩티드에서 함유되어 있는 것과 같은 제1 및 제2 도메인의 생물학적 활성, 즉, 전술한 제1 도메인의 수송 활성과, JNK에 결합 및/또는 1종 이상의 JNK 활성화 전사 인자의 활성화 억제를 위한 제2 도메인의 활성을 보유한다.
따라서, 본 발명의 키메라 펩티드는 또한 전술한 본 발명의 키메라 펩티드의 단편, 특히 서열 번호 9, 10, 11 또는 12에 따른 본 발명의 키메라 펩티드 서열의 단편을 포함한다. 따라서, 본 발명과 관련하여, "본 발명의 키메라 펩티드의 단편"은 좋기로는 그 단편이 서열 번호 9, 10, 11 또는 12 중 하나에서의 4개 이상의 연속된 아미노산을 포함하는 서열 번호 9, 10, 11 또는 12에 따른 서열 중의 하나에서 유래된 서열이다. 이러한 단편은 이들 서열 중 하나로부터 에피토프의 특이적 인식을 가능하게 하기에 충분하고, 세포, 핵 또는 다른 바람직한 위치로 그 서열을 운반하기에 충분한 길이를 포함하는 것이 좋다. 더욱더 좋기로는, 상기 단편은 서열 번호 9, 10, 11 또는 12 중 하나의 4 내지 18개, 4 내지 15개, 또는 가장 좋기로는 4 내지 10개의 연속 아미노산을 포함한다. 본 발명의 키메라 펩티드의 단편은 서열 번호 9, 10, 11 또는 12에 따른 서열 중의 하나와 약 30%, 50%, 70%, 80%, 또는 95%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 서열로서 정의될 수 있다.
마지막으로, 본 발명의 키메라 펩티드는 또한 전술한 본 발명의 키메라 펩티드, 특히 서열 번호 9, 10, 11 또는 12에 따른 본 발명의 키메라 펩티드 서열의 유도체를 포함한다.
또한, 본 발명은 앞에서 정의한 본 발명의 JNK 억제제 서열, 본 발명의 키메라 펩티드, 또는 그들의 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명의 JNK 억제제 서열을 코딩하는 바람직한 적합한 핵산은 인간 IB1 핵산 (GenBank Accession No. AF074091), 레트 IB1 핵산 (GenBank Accession No. AF 108959) 또는 인간 IB2 (GenBank Accession No AF218778)으로부터 선택된다.
본 발명의 JNK 억제제 서열 또는 키메라 펩티드를 코딩하는 핵산은 당해 기술 분야에 알려진 임의의 방법에 의하여 얻을 수 있다 (예컨대, 그 서열의 3'-말단 및 5'-말단에 혼성화될 수 있는(hybridizable) 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의하여, 또는 주어진 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 서열을 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터의 클로닝에 의하여).
또한, 앞에서 정의한 본 발명의 (천연) JNK 억제제 서열 또는 키메라 펩티드를 코딩하는 적절한 가닥(strand)과 엄격(stringent) 조건하에서 혼성화하는 핵산 서열이 본 명세서에 또한 기재되어 있다. 좋기로는, 그러한 핵산 서열은 특이적 혼성화를 가능하게 하는데 충분한 길이인 6개 이상의 (연속) 핵산을 포함한다. 그러한 핵산 서열은 더 좋기로는 6 내지 38개, 더욱더 좋기로는 6 내지 30개, 가장 좋기로는 6 내지 20개 또는 6 내지 10개의 (연속) 핵산을 포함한다.
"엄격 조건"은 서열 의존적이고, 서로 다른 환경에서 상이할 것이다. 일반적으로, 엄격 조건은 설정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점 (TM) 보다 약 5℃ 더 낮게 선택될 수 있다. TM은 (설정된 이온 강도 및 pH 하에서) 표적 서열의 50%가 완벽하게 짝이 되는 프로브에 혼성화하는 온도이다. 일반적으로, 엄격 조건은 염 농도가 pH 7에서 약 0.02 몰 이상이고, 온도가 약 60℃ 이상인 조건일 것이다. 기타의 인자들이 혼성화의 엄격성에 영향을 줄 수 있기 때문에 (기타의 인자들 중에는 염기 조성, 상보적인 가닥의 크기, 유기 용매의 존재 및 염기의 미스매칭(mismatching) 정도가 포함됨), 어떤 한가지의 절대적 측정보다 변수들의 조합이 더 중요하다.
"높은 엄격 조건(high stringency conditions)"은 예컨대 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다: 단계 1: DNA를 함유하는 필터를 6 X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% PVP, 0.02% 피콜, 0.02% BSA 및 500 μg/ml 변성 연어 정자 DNA를 함유하는 버퍼에서 8시간 내지 밤새 65℃에서 전처리한다. 단계 2: 100 mg/ml 변성 연어 정자 DNA 및 5∼20 X 106 cpm 32P 표지 프로브가 첨가된 상기 전혼성화(prehybridization) 혼합물에서 필터를 65℃에서 48 시간 동안 혼성화시킨다. 단계 3: 필터를 2 X SSC, 0.01% PVP, 0.01% 피콜 및 0.01% BSA를 함유하는 용액에서 1 시간 동안 37℃에서 세척하고, 이어서, 0.1 X SSC로 50℃에서 45분 동안 세척한다. 단계 4: 필터를 자가방사기록한다(autoradiographed). 사용될 수 있는 높은 엄격성의 기타의 조건은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다 (예컨대, Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY; 및 Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, a Laboratory Manual, Stockton Press, NY 참조).
"중등(moderate) 엄격 조건"은 다음의 단계를 포함할 수 있다: 단계 1: DNA를 함유하는 필터를 6 X SSC, 5 X 덴하르트 용액(Denhardt's solution), 0.5% SDS 및 100 mg/ml 변성 연어 정자 DNA를 함유하는 용액 중에서 55℃로 6 시간 동안 전처리한다. 단계 2: 필터를 5∼20 X 106 cpm의 32P 표지 프로브를 첨가한 동일한 용액에서 55℃로 18∼20 시간 동안 혼성화시킨다. 단계 3: 필터를 2 X SSC, 0.1% SDS를 함유하는 용액에서 1시간 동안 37℃에서 세척한 후, 1 X SSC 및 0.1% SDS를 함유하는 용액에서 60℃에서 30분 동안 2번 세척한다. 단계 4: 필터를 블롯하여(blot) 건조시키고, 자가방사기록을 위해 노출시킨다. 사용될 수 있는 중등 엄격성의 기타의 조건은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다 (예컨대, Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY; 및 Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, a Laboratory Manual, Stockton Press, NY 참조).
마지막으로, "낮은 엄격 조건"은 다음을 포함할 수 있다: 단계 1: DNA를 함유하는 필터를 35% 포름아미드, 5XSSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM EDTA, 0.1% PVP, 0.1% 피콜, 1% BSA 및 500 μg/ml 변성 연어 정자 DNA를 함유하는 용액에서 40℃로 6 시간 동안 전처리한다. 단계 2: 필터를 0.02% PVP, 0.02% 피콜, 0.2% BSA, 100 μg/ml 연어 정자 DNA, 10% (wt/vol) 덱스트란 설페이트 및 5∼20 X 106 cpm 32P 표지 프로브를 첨가한 동일한 용액 중에서 18∼20 시간 동안 40℃에서 혼성화시킨다. 단계 3: 필터를 2 X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA 및 0.1% SDS를 함유하는 용액에서 55℃로 1.5 시간 동안 세척한다. 세척 용액을 새로운(fresh) 용액으로 교환하고, 60℃에서 추가적으로 1.5 시간 동안 인큐베이션한다. 단계 4: 필터를 블롯하여 건조시키고, 자가방사기록을 위해 노출시킨다. 필요에 따라, 필터를 65∼68℃에서 3번 세척하고, 필름에 다시 노출시킨다. 사용될 수 있는 낮은 엄격성의 기타의 조건은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다 (예컨대, 종간(cross-species) 혼성화를 위해 사용되는 것으로서). 예컨대, Ausubel et al., (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; 및 Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY 참조.
본 발명에 의하여 제공되는 핵산 서열은 분석, 특징화(characterization) 또는 치료적 용도를 위하여 본 발명의 펩티드, 즉, 본 발명의 JNK 억제제 서열 또는 본 발명의 키메라 펩티드를 발현하기 위해 사용될 수 있고, 대응하는 (본 발명의) 펩티드가 우선적으로 발현되는 (본질적으로 또는 조직 분화 또는 발달의 특정 단계에서 또는 질병 상태에서) 조직에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 상기 핵산을 위한 기타의 용도는 예컨대 겔 전기영동에 기초한 핵산의 분석법에서 분자량 마커를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 상태에 따르면, 발현 벡터가 전술한 1종 이상의 본 발명의 JNK 억제제 서열 및/또는 키메라 펩티드의 재조합 발현을 위해 또한 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 "발현 벡터"라는 용어는 이중 가닥 또는 단일 가닥인 환형 또는 선형 DNA 또는 RNA를 의미한다. 그것은 숙주 세포 내로 또는 단세포 또는 다세포 숙주 생물 내로 운반될 하나 이상의 본 발명의 핵산을 더 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 JNK 억제제 서열 또는 그의 단편 또는 변이체, 또는 본 발명의 키메라 펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 본 발명의 핵산을 포함하는 것이 좋다. 또한, 본 발명에 따른 발현 벡터는 다양한 조절 성분, 예컨대 숙주 세포 내에서 삽입된 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 바이러스, 박테리아, 식물, 포유동물 및 기타의 진핵세포 근원으로부터의 인헨서/프로모터, 예컨대, 인슐레이터, 바운더리 성분, LCRs (예컨대, Blackwood and Kadonaga (1998), Science 281, 61-63에 기재된 것), 또는 매트릭스/스캐폴드 부착 영역 (예컨대, Li, Harju and Peterson, (1999), Trends Genet. 15, 403-408에 기재된 것)을 포함하는 발현을 지원하기 위한 적절한 성분을 포함하는 것이 좋다. 일부 실시 상태에서, 조절 성분은 이종 유래성이다 (즉, 천연(native) 유전자 프로모터가 아님). 그 대신에, 필요한 전사 및 번역 신호는 그 유전자 및/또는 그들의 인접 영역에 대한 천연 프로모터에 의하여 또한 공급될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "프로모터"라는 용어는 1종 이상의 본 발명의 핵산 서열의 전사를 조절하는 기능을 하고, DNA 의존 RNA 폴리머라제에 대한 결합 자리의 존재 및 상호작용하여 프로모터 기능을 조절하는 기타의 DNA 서열의 존재에 의하여 구조적으로 확인되는 DNA의 영역을 말한다. 프로모터의 기능적인 발현 촉진 단편은 프로모터로서의 활성을 유지하는 짧은 또는 절단된 프로모터 서열이다. 프로모터 활성은 당해 기술 분야에서 알려진 임의의 분석법에 의하여 측정될 수 있다 (예컨대, Wood, de Wet, Dewji, and DeLuca, (1984), Biochem Biophys. Res. Commun. 124, 592-596; Seliger and McElroy, (1960), Arch. Biochem. Biophys. 88, 136-141 참조, 또는 프로메가(Promega®)로부터 구입가능함).
본 발명의 발현 백터에서 사용되는 "인핸서 영역"은 일반적으로 하나 이상의 유전자의 전사를 증가시키는 작용을 하는 DNA의 영역을 말한다. 더 구체적으로는, 본 명세서에서 "인핸서"라는 용어는 발현될 유전자에 대한 그의 위치 및 배향과 무관하게 유전자의 발현을 강화, 증대, 향상 또는 개량시키고, 하나 이상의 프로모터의 발현을 강화, 증대, 향상 또는 개량시킬 수 있는 DNA 조절 성분을 말한다.
본 발명의 발현 벡터에 있어서 전술한 프로모터/인헨서 서열은 식물, 동물, 곤충 또는 진균 조절 서열을 이용할 수 있다. 예를 들어, 효모 및 기타의 진균으로부터의 프로모터/인핸서 성분이 사용될 수 있다 (예컨대, GAL4 프로모터, 알콜 탈수소효소 프로모터, 포스포글리세롤 키나아제 프로모터, 알칼리성 인산분해효소 프로모터). 그 대신에 또는 추가적으로, 이들은 동물 전사 조절 영역, 예컨대 (i) 췌장 β세포 내에서 활성이 있는 인슐린 유전자 조절 영역 (예컨대, Hanahan, et al., 1985. Nature 315: 115-122 참조); (ii) 림프계 세포 내에서 활성이 있는 면역글로불린 유전자 조절 영역 (예컨대, Grosschedl, et al., 1984, Cell 38 : 647-658 참조); (iii) 간에서 활성이 있는 알부민 유전자 조절 영역 (예컨대, Pinckert, et al., 1987. Genes and Dev 1: 268-276 참조); (iv) 뇌 희소돌기아교세포에서 활성이 있는 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역 (예컨대, Readhead, et al., 1987, Cell 48: 703-712 참조); 및 (v) 시상하부 내에서 활성이 있는 성선자극호르몬(gonadotropin) 방출 호르몬 유전자 조절 영역 (예컨대, Mason, et al., 1986, Science 234: 1372-1378 참조) 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 발현 벡터는 증폭 마커를 포함할 수 있다. 이러한 증폭 마커는 예컨대, 아데노신 데아미나제 (ADA), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 복합 약제 내성 유전자 (MDR), 오르니틴 디카르복실레이즈 (ODC) 및 N-(포스폰아세틸)-L-아스파테이트 저항 (CAD)로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 전술한 단백질 (즉, 관심 단백질 (POI) 및/또는 본 발명의 융합 단백질)을 코딩하는 유전자의 증폭은 세포 내에서 벡터의 통합에 따라 이들 단백질의 발현 수준을 증가시키도록 한다 (Kaufman et al. (1985), Mol. Cell Biol. 5, 1750-1759).
본 발명에 적합한 예시적인 발현 벡터 또는 그들의 유도체에는, 예컨대 인간 또는 동물 바이러스 (예컨대, 우두 바이러스 또는 아데노바이러스); 곤충 바이러스 (예컨대, 바큘로바이러스); 효모 벡터; 박테리오파지 벡터 (예컨대, 람다 파지); 플라스미드 벡터 및 코스미드 벡터를 특히 포함한다.
본 발명은 또한 전술한 본 발명의 핵산의 펩티드 코딩 서열(들)을 발현시키기 위해 이용될 수 있는 다양한 숙주-벡터 시스템을 제공한다. 여기에는 (i) 우두 바이러스, 아데노바이러스 등으로 감염되는 포유동물 세포 시스템; (ii) 바큘로바이러스 등으로 감염되는 곤충 세포 시스템; (iii) 효모 벡터를 함유하는 효모 또는 (iv) 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이용되는 숙주-벡터 시스템에 따라 많은 적합한 전사 및 번역 성분 중의 하나가 사용될 수 있다.
좋기로는, 삽입된 관심 서열의 발현을 조절하거나, 그 서열에 의하여 코딩되는 발현된 펩티드를 목적하는 특정 방식으로 변형 또는 가공하는, 그 숙주-벡터 시스템에 적합한 숙주 세포주가 선택될 수 있다. 또한, 특정 프로모터로부터의 발현은 선택된 숙주 세포주에서 특정 인듀서(inducer)의 존재하에서 강화될 수 있고, 따라서, 유전적으로 조작된 펩티드의 발현의 조절을 촉진할 수 있다. 더욱이, 다양한 숙주 세포는 발현된 펩티드의 번역 및 번역후 가공 및 변형 (예컨대, 당화, 인산화 등)에 있어서 독특하고 및 특이적인 메카니즘을 가진다. 따라서, 외래 펩티드의 목적하는 변형 및 가공이 얻어지는 것을 보증하도록 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 시스템 내의 펩티드 발현은 비당화(non-glycosylated) 코어 펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있는 반면, 포유동물 세포 내에서의 발현은 이종유래 펩티드의 "천연(native)" 당화를 보증하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 JNK 억제제 서열 및/또는 본 발명의 키메라 펩티드에 대하여 유도된 항체를 제공한다. 더욱이, 본 발명에 따른 JNK 억제제 서열에 대하여 또는 그러한 억제제 서열을 함유하는 본 발명의 키메라 펩티드에 대하여 특이적인 항체의 생산을 위한 효과적인 수단이 제공된다.
본 발명에 따르면, JNK 억제제 서열 및/또는 본 발명의 키메라 펩티드뿐만 아니라 이들의 단편, 변이체 또는 유도체는 이들 펩티드 성분과 면역특이적으로 결합하는 항체를 생산하기 위한 면역원으로 이용될 수 있다. 그러한 항체로는, 예컨대 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 단쇄, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리를 들 수 있다. 구체적인 실시 상태에서, 본 발명은 전술한 바와 같이 본 발명의 키메라 펩티드에 대한 또는 JNK 억제제 서열에 대한 항체를 제공한다. 당해 기술 분야에 알려진 다양한 방법이 이들 본 발명의 항체를 생산하는데 이용될 수 있다.
예를 들어, 다양한 숙주 동물이 전술한 임의의 본 발명의 키메라 펩티드 또는 JNK 억제제 서열을 주사하여 폴리클로날 항체의 생산을 위해 면역화될 수 있다. 다양한 애주번트가 사용될 수 있고 그에 따라 면역 반응을 증가시킬 수 있는데, 상기 애주번트로는 프로인트 (완전 및 불완전) 애주번트, 미네랄 겔 (예컨대, 알루미늄 히드록사이드), 표면 활성 물질 (예컨대, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 디니트로페놀 등), CpG, 중합체, 플루로닉(Pluronics) 및 인간 애주번트, 예컨대, 칼메트-게랑 간균(Bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
전술한 본 발명의 키메라 펩티드 또는 JNK 억제제 서열로 유도된 모노클로날 항체의 제조를 위하여, 연속 세포주 배양에 의한 항체 분자의 생산을 위해 제공되는 임의의 기술이 이용될 수 있다. 그러한 기술에는 하이브리도마 기술 (Kohler and Milstein, 1975. Nature 256: 495-497 참조); 트리오마 기술; 인간 B세포 하이브리도마 기술 (Kozbor, et al., 1983, Immunol Today 4: 72 참조) 및 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 EBV 하이브리도마 기술 (Cole, et al., 1985. In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 참조)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 인간 모노클로날 항체는 본 발명의 실시에 이용될 수 있고, 인간 하이브리도마의 이용에 의하여 (Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030 참조) 또는 인간 B세포를 엡스타인 바 바이러스로 시험관내 형질전환시킴으로써 (Cole, et al.,1985. In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 참조) 생산될 수 있다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 JNK 억제제 서열 및/또는 본 발명의 키메라 펩티드에 특이적인 단쇄 항체의 생산을 위하여 기술들이 적합하게 변형될 수 있다 (예컨대, 미국 특허 제4,946,778호 참조). 또한, 전술한 이들 본 발명의 JNK 억제제 서열 및/또는 본 발명의 키메라 펩티드에 대한 목적하는 특이성을 가진 모노클로날 Fab 단편의 빠르고 효과적인 확인을 가능하게 하는 Fab 발현 라이브러리의 제작을 위하여 방법들이 적합하게 변형될 수 있다 (예컨대, Huse et al., 1989. Science 246: 1275-1281 참조). 비인간 항체는 당해 기술 분야에 알려진 기술 (예컨대, 미국 특허 제5,225,539호 참조)에 의하여 “인간화(humanized)”될 수 있다. JNK 억제제 서열 및/또는 본 발명의 키메라 펩티드에 대한 이디오타입(idiotypes)을 함유하는 항체 단편이 예컨대, (i) 항체 분자의 펩신 소화에 의하여 생산되는 F(ab')2 단편; (ii) F(ab')2 단편의 이황화 결합을 환원시킴으로써 생성되는 Fab 단편; (iii) 파파인 및 환원제로 항체 분자를 처리함으로써 생선되는 Fab 단편; 및 (iv) Fv 단편을 포함하는 당해 기술 분야에 알려진 기술에 의하여 생산될 수 있다.
본 발명의 한가지 실시 상태에서, 목적하는 특이성을 가지는 본 발명의 항체의 스크리닝 방법은 효소 연관 면역흡착 분석법 (ELISA) 및 당해 기술 분야에 알려진 기타의 면역학적으로 매개된 기술을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
구체적인 실시 상태에서, 본 발명의 JNK 억제제 서열 및/또는 본 발명의 키메라 펩티드의 특정 에피토프 (예컨대, 일반적으로 5 내지 20개, 좋기로는 8 내지 18개, 가장 좋기로는 8 내지 11개 아미노산 길이를 포함하는 그의 단편)에 특이적인 항체의 선택은 그러한 에피토프를 함유하는 본 발명의 JNK 억제제 서열 및/또는 본 발명의 키메라 펩티드의 단편에 결합하는 하이브리도마의 생성에 의하여 촉진된다. 전술한 에피토프에 특이적인 이들 항체가 본 발명에서 또한 제공된다.
본 발명의 항체는 본 발명의 JNK 억제제 서열의 위치 결정(localization) 및/또는 정량 (및/또는 본 발명의 키메라 펩티드에 상응하는 것)과 관련된 기술 분야에 알려진 방법에서 이용될 수 있는데, 예컨대, 적절한 생리학적 시료 내에서 그 펩티드의 수준 측정에 있어서의 용도, 진단 방법에서의 용도 또는 펩티드 영상화에서의 용도 등이 있다.
본 발명의 JNK 억제제 서열, 키메라 펩티드 및/또는 본 발명의 핵산은 약학적 조성물로 조제될 수 있는데, 이러한 약학적 조성물은 본 발명에 포함된다. 이들 조성물은, 이들 물질 중 하나 이외에, 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 버퍼, 안정화제 또는 당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려진 기타의 물질을 포함할 수 있다. 그러한 물질은 비독성이어야 하고, 그 활성 성분의 효능을 간섭하지 않아야 한다. 상기 담체 또는 기타의 물질의 상세한 특성은 투여 경로 (예컨대, 정맥내, 피부 또는 피하, 코, 근육내, 복강내 또는 패치(patch) 경로)에 의존할 것이다.
구강 투여용 약학적 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액상형일 수 있다. 정제는 고체 담체, 예컨대 젤라틴 또는 애주번트를 포함할 수 있다. 액상 약학적 조성물은 일반적으로 액상 담체, 예컨대 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성유를 포함한다. 생리 식염수, 덱스트로스 또는 기타의 당용액 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사 또는 통증의 자리에 주사의 경우, 활성 성분은 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 가지는 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태일 것이다. 당해 기술 분야의 숙련자는 예컨대, 등장성 운반체 (예컨대, 염화 나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트 첨가 링거 주사액)를 사용하는 적합한 용액을 용이하게 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 버퍼, 항산화제 및/또는 기타의 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다. 그것이 개체에 주어질 수 있는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 펩티드 또는 핵산 분자, 기타의 약학적으로 유용한 화합물인지 여부에 관계없이, 개체에 유익함을 나타내기에 충분한 “예방적으로 효과적인 양” 또는 “치료적으로 효과적인 양” (그 경우에 따를 수 있다)으로 투여되는 것이 좋다. 실제 투여되는 양 및 투여 속도 및 시간 경과는 처리되는 것의 특성 및 심각성에 의존할 것이다.
치료 처방 (예컨대, 투여량의 결정 등)은 일반 개원의 및 기타의 일반의의 책임 내에 있고, 일반적으로 치료될 질병, 개별 환자의 조건, 전달 위치, 투여 방법 및 개원의에게 알려진 기타의 인자를 감안한다. 전술한 기술 및 프로토콜의 예는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980에서 찾을 수 있다.
또한, 표적 요법(targeting therapies)이 본 발명의 JNK 억제제 서열, 키메라 펩티드 및 본 발명의 핵산을, 더 구체적으로 특정 종류의 세포에, 표적 시스템, 예컨대 (표적) 항체 또는 세포 특이적 리간드의 사용에 의하여 전달하기 위하여 사용될 수 있다. 표적화를 위하여 사용되는 항체는 일반적으로 아래에서 설명하는 임의의 질병과 관련된 세포의 세포 표면 단백질에 특이적이다. 예를 들어, 이들 항체는 세포 표면 항체, 예컨대, B 세포 관련 표면 단백질, 예컨대, MHC 클래스 II DR 단백질, CD18 (LFA-1 베타 사슬), CD45RO, CD40 또는 Bgp95 또는 예컨대, CD2, CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD13, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD39, CD4, CD43, CD45, CD52, CD56, CD68, CD71, CD138 등에서 선택되는 세포 표면 단백질을 가리킬 수 있다. 표적 구조물은 본 발명의 JNK 억제제 서열, 키메라 펩티드 및 핵산을 세포 표면 단백질에 대해 특이적인 항체에 공유 결합시킴으로써 또는 세포 특이적 리간드에 결합시킴으로써 일반적으로 제조될 수 있다. 예컨대, 단백질은 펩티드 결합에 의하여 또는 화학적 커플링, 가교 등에 의하여 그러한 항체에 결합될 수 있거나, 부착될 수 있다. 표적 요법은 표적 구조물을 약학적으로 효과적인 양으로 환자에게 다음과 같은 투여 경로, 예컨대, 복강내, 코, 정맥내, 구강 및 패치 전달 경로 중의 하나에 의하여 투여함으로써 수행될 수 있다. 좋기로는, 전술한 표적 항체 또는 세포 특이적 리간드에 부착된 본 발명의 JNK 억제제 서열, 키메라 펩티드 또는 본 발명의 핵산은, 예컨대 공유 결합의 가수분해에 의하여, 펩티다아제에 의하여 또는 기타의 임의의 적절한 방법에 의하여 시험관내 또는 생체내에서 방출될 수 있다. 그 대신에, 본 발명의 JNK 억제제 서열, 키메라 펩티드 또는 본 발명의 핵산이 작은 세포 특이적 리간드에 부착되어 있는 경우, 그 리간드의 방출은 수행되지 않을 수 있다. 만약 세포 표면에 존재한다면, 본 발명의 키메라 펩티드는 그의 수송 서열의 활성에 따라 세포 내로 들어갈 수 있다. 표적화는 여러가지 이유로 바람직할 수 있는데, 예컨대, 본 발명의 JNK 억제제 서열, 키메라 펩티드 및 본 발명의 핵산이 허용할 수 없도록 독성이거나 또는 너무 높은 투여량을 요구하는 경우 바람직할 수 있다.
본 발명의 JNK 억제제 서열 및/또는 본 발명의 키메라 펩티드를 직접적으로 투여하는 대신, 이들은 예컨대 투여되는 바이러스성 벡터로부터 그 세포 내로 도입된 암호화된 유전자로부터의 발현에 의하여 표적 세포에서 생산될 수 있다. 상기 바이러스성 벡터는 본 발명의 JNK 억제제 서열 및/또는 본 발명의 키메라 펩티드를 일반적으로 코딩한다. 그 벡터는 처리될 특정 세포에 표적화될 수 있다. 더욱이, 그 벡터는 설정된 조절에 따라 표적 세포에 의하여 더 또는 덜 선택적으로 하는 조절 성분을 함유할 수 있다. 이러한 기술은 그 전구체 형태 대신 완전한 단백질을 이용하는 VDEPT 기술(바이러스 지시 효소 전구약물 치료) 의 변형이다.
그 대신에, 본 발명의 JNK 억제제 서열 및/또는 키메라 펩티드가 항체 또는 바이러스의 사용에 의하여 전구체 형태로 투여될 수 있다. 그 후, 본 발명의 JNK 억제제 서열 및/또는 키메라 펩티드는 처리될 세포에서 생산되는 또는 그 세포에 표적화된 활성화 제제에 의하여 활성 형태로 전환될 수 있다. 이러한 종류의 접근법은 때때로 ADEPT (항체 지시 효소 전구약물 요법) 또는 VDEPT (바이러스 지시 효소 전구약물 요법)로 알려져 있는데, 전자는 활성화 제제를 세포 특이적 항체에 접합시킴으로써 그 세포에 표적화하는 것을 포함하고, 반면, 후자는 바이러스성 벡터 내의 코딩하는 DNA의 발현에 의하여 벡터에서 활성화 제제 (예컨대, JNK 억제제 서열 또는 키메라 펩티드)를 생산하는 것을 포함한다 (예컨대, EP-A-415731 및 WO 90/07936 참조).
또한, 본 발명은 예컨대, 전술한 바와 같이, 대상체(subject)에서 JNK 활성화와 관련된 세포 증식성(cell-proliferative) 질환 (“JNK 관련 질환”)을 예방 및/또는 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 JNK 억제제 서열, 본 발명의 키메라 펩티드 및/또는 본 발명의 핵산 서열의 용도를 포함한다. 일반적으로, 본 발명에 따라 사용되는 그러한 약학적 조성물은 예컨대 다음과 같은 활성 성분을 포함한다: (i) 본 발명의 JNK 억제제 서열 및/또는 본 발명의 키메라 펩티드 및/또는 이들의 변이체, 단편 또는 유도체 중 한가지 이상 및/또는 (ii) 본 발명의 JNK 억제제 서열 및/또는 본 발명의 키메라 펩티드 및/또는 이들의 변이체 또는 단편을 코딩하는 핵산 및/또는 (iii) 본 발명의 JNK 억제제 서열 및/또는 본 발명의 키메라 펩티드 및/또는 이들의 변이체, 단편 또는 유도체 중 임의의 한가지를 포함하는 세포 및/또는 (iv) 본 발명의 JNK 억제제 서열 및/또는 본 발명의 키메라 펩티드 및/또는 이들의 변이체 또는 단편을 코딩하는 벡터 및/또는 핵산으로 트랜스펙션된 세포.
본 발명에 따른 예방 및/또는 치료는 전술한 본 발명의 약학적 조성물의 투여를 일반적으로 포함한다. “조절하다(modulate)”라는 용어는 JNK가 과발현되는 경우 JNK의 발현의 억제를 포함한다. 그 용어는, 예컨대 세포에서의 천연 c-jun, ATF2 및 NFAT4 결합 자리의 경쟁적 억제제로서 서열 번호 1 내지 4 및/또는 9 내지 12 중의 한가지 이상의 펩티드를 사용하는 것에 의한 c-jun, ATF2 또는 NFAT4의 인산화의 억제를 역시 포함한다. “조절하다”라는 용어는 c-jun, ATF2 또는 NFAT4 및 이들의 관련된 파트너 (예컨대 c-jun, AFT2 및 c-fos로 이루어지는 AP-1 복합체)로 이루어지는 전사 인자의 헤테로머릭(heteromeric) 및 호모머릭(homomeric) 복합체의 억제를 역시 포함한다. 세포 증식 질환이 JNK 과발현과 관련이 있는 경우, 그러한 억제성 JNK 억제제 서열이 세포로 도입될 수 있다. 일부 경우에 있어서, “조절하다”는 예컨대, JNK에 대한 IB 펩티드의 결합을 차단하여, IB 관련 펩티드에 의한 JNK 억제를 막는 IB 펩티드 특이적 항체의 사용에 의한, JNK 발현의 증가를 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이 본 발명의 약학적 조성물로 대상체를 예방 및/또는 치료하는 것은 (“치료적으로 유효한”) 양의 상기 약학적 조성물을 대상체에 (생체내로) 투여하는 것에 의하여 일반적으로 수행될 수 있는데, 여기서, 상기 대상체는 예컨대, 임의의 포유동물, 예컨대 인간, 영장류, 마우스, 쥐, 개, 고양이, 소, 말 또는 돼지일 수 있다. “약학적으로 유효한”이라는 용어는 약학적 조성물의 활성 성분이 JNK 관련 질환을 개선하는데 충분한 양이라는 것을 의미한다.
앞에서 사용된 "세포 증식 질환" 또는 "JNK 관련 질환"이라는 용어는 형태학적 및 기능적으로 주변 조직과 상이한 것으로 빈번하게 나타나고, JNK의 이상 수준이라는 특징을 일반적으로 가지는, 생체 내 및 시험관 내에서의 악성종양 및 비악성종양 세포 집단을 일반적으로 지칭한다. "JNK의 이상 수준"은 질환을 가지지 않는 대상체의 유사한 영향을 받지 않은 부분에서 존재하는 수준과 비교하여, 치료될 대상체의 부분에서의 JNK의 수준의 증가 또는 감소를 의미하도록 의도된 것이다.
예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 JNK의 활성화가 빈번하게 입증된 다양한 기관 시스템의 악성종양, 예컨대, 결장암, 신세포암종(腎細胞癌腫), 전립선암, 비소세포폐암(非小細胞肺癌), 소장암 및 식도암을 포함하는 폐, 유방, 림프계, 위장관 및 비뇨생식관의 악성 종양뿐만 아니라 선암종을 예방 및/또는 치료하는데 유용할 수 있다. 또한, JNK의 활성화를 명백하게 필요로 하는 백혈병, 발암성 형질전환과 관련된 질병 또는 병태생리뿐만 아니라 Bcr-Abl 발암성 형질전환을 가진 암도 포함된다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비악성(non-malignant) 또는 면역 관련 세포 증식 질병, 예컨대, 건선, 심상성천포창, 베체트 증후군, 급성호흡곤란 증후군(ARDS), 허혈성 심질환, 투석후 증후군, 류마티스 관절염, 후천성 면역 결핍 증후군, 혈관염 및 패혈성 쇼크 및 다른 종류의 급성 염증 및 지질 조직구증의 예방 및/또는 치료에 적용될 수 있다. 특히 양호한 것은 면역병리학적 질환이다. 특히, 병인학적으로 JNK 키나아제 활성에 관련된 모든 질병은 예방 또는 치료될 수 있는 것으로 판단되는데, 이러한 질병에는, 예컨대 전술한 세포 또는 세포들에서 JNK의 활성과 관련된 질환 또는 병태생리, 예컨대, 재협착, 난청, 귀 외상, 허혈, 뇌졸중 및/또는 면역 세포의 성숙 및 분화와 관련된 질병 또는 병태생리, 재관류 손상, 저산소증, 세포자멸사 관련 질병 (예컨대, 바이러스성 감염에서 일어나는 것 (예컨대, AIDS), 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환 (예컨대, 뇌졸중, 뇌 외상, 척수 손상, 근위축성 측삭경화증 (ALS), 헝틴턴병, 알츠하이머병 및 파킨슨병), 심혈관 질환, 골다공증 및 노화), 스트레스성 자극에 대한 반응 및 예컨대 염증 유발성 사이토카인으로의 처리에 기인한 2차 효과를 가진 것을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 당뇨병과 연관되거나 세포 전단 응력과 연관된 효과를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있는데, 이러한 효과에는, 예컨대, 심장 비후 및 동맥경화성 병변을 포함하는 동맥 고혈압 및 혈관 분기점에서의 동맥 고혈압 등에 의하여 유도되는 병리상태, 방사선치료에서 사용되는 전리 방사선 및 자외선 (UV 광)에 의하여 유도되는 병리상태, 자유 라디칼 및 화학요법 약물을 포함하는 DNA 손상 제제에 의하여 유도되는 병리상태, 허혈/재관류 손상에 의하여 유도되는 병리상태, 저산소증에 의하여 유도되는 병리상태 및/또는 저체온증 및 고열에 의하여 유도되는 병리상태를 들 수 있다. 마지막으로, 전술한 질병, 질환 또는 병태생리와 관련하여, 본 발명의 약학적 조성물은 그 발현이 활성 JNK 폴리펩티드의 존재시 증가되는 유전자의 발현을 억제하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 유전자 및 유전자 산물은, 예컨대 염증 유발성 사이토카인을 일반적으로 포함한다. 그러한 사이토카인은 모든 형태의 염증, 자가염증, 면역 및 자가면역 질환, 퇴행성 질환, 근질환, 심근질환 및 이식편 거부 반응에서 발견된다.
또한, JNKs 및 모든 그의 아이소형(isoforms)은 병리적 상태의 발달 및 형성에 또는 이들의 경로에 참여하기 때문에, 본 발명의 JNK 억제제 서열, 본 발명의 키메라 펩티드 또는 본 발명의 핵산 서열은 JNK 활성의 억제가 소망되는 어떠한 상황에서도 이용될 수 있다. 그러한 용도는 시험관내 응용, 엑스 비보(ex vivo) 및 생체내 응용을 포함할 수 있다.
따라서, 전술한 본 발명의 핵산은 본 발명의 구체적인 실시 상태에서 유전자 요법을 위하여, 좋기로는 전술한 상태, 질병 및/또는 질환 중 한 가지를 치료하기 위하여 활성화 JNK 신호 전달 경로를 조절하는데 이용될 수 있다. 이와 관련하여, 유전자 요법이란 대상체에, 예컨대 전술한 약학적 조성물을 통한 본 발명의 특이적 핵산 (L-아미노산만을 포함하는 것임)의 투여에 의하여 수행되는 요법을 말한다. 본 발명의 이러한 실시 상태에서는, 상기 핵산은 그가 코딩하는 펩티드(들)를 생산하고, 이는 상기 질병 또는 질환의 기능을 조절함으로써 치료적 효과를 발휘하도록 제공된다. 당해 기술 분야에서 이용가능한 유전자 요법과 관련된 임의의 방법이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다 (예컨대, Goldspiel, et al., 1993. Clin Pharm 12: 488-505 참조).
한가지 양호한 실시 상태에서, 유전자 요법을 위해 사용되는 본 발명의 핵산은 본 발명의 IB 관련 펩티드, 즉, 본 발명의 JNK 억제제 서열 및/또는 본 발명의 키메라 펩티드 또는 이들의 단편 또는 유도체 중 한가지 이상을 적합한 숙주 내에서 발현하는 발현 벡터의 일부이다. 구체적인 실시 상태에 있어서, 그러한 발현 벡터는 JNK 억제제 서열의 코딩 영역(들)에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 상기 프로모터는 전술한 바와 같을 수 있는데, 예컨대, 유도성(inducible) 또는 구성적(constitutive) 및 필요에 따라, 조직 특이적(tissue-specific)인 것일 수 있다.
또 다른 구체적인 실시 상태에서, 본 발명의 핵산 분자는 유전자 요법을 위해 사용되는 데, 여기서 본 발명의 핵산 분자의 코딩 서열 (및 그의 임의의 다른 목적하는 서열)은 게놈 내의 목적하는 자리에서 상동 재조합을 촉진하는 영역의 측면에 위치하여, 핵산의 크로모좀내(intra-chromosomal) 발현을 위해 제공되는 것이다 (예컨대, Koller and Smithies, 1989. Proc Natl Acad Sci USA 86: 8932-8935 참조).
유전자 요법에서 목적하는 환자로의 본 발명의 핵산의 전달은 직접적 (즉, 환자가 상기 핵산 또는 핵산 함유 벡터에 직접적으로 노출됨)이거나 간접적 (우선 세포를 상기 핵산으로 시험관 내에서 형질전환시킨 후, 그 세포를 환자에게 이식함)일 수 있다. 이들 두 가지 접근법은 각각 생체내(in vivo) 또는 엑스 비보(ex vivo) 유전자 요법으로서 알려져 있다. 본 발명의 구체적인 실시 상태에서, 핵산은 생체내로 직접적으로 투여되는데, 여기서 그 핵산은 발현되어 코딩된 생성물을 생산한다. 이것은, 예컨대 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 상기 핵산을 제작하고 그것이 세포내로 들어가도록 하는 방식으로 투여하는 방법 (예컨대, 결손 또는 약독화 레트로바이러스성 또는 기타의 바이러스성 벡터를 사용한 감염에 의하여; 미국 특허 제4,980,286호 참조); 나화(naked) DNA을 직접적으로 주사하는 방법; 마이크로입자 충격법을 사용하는 방법 (예컨대, "유전자총(GeneGun)"; Biolistic, DuPont); 상기 핵산을 지질로 코팅하는 방법; 관련된 세포 표면 수용체/트랜스펙션 제제를 사용하는 방법; 리포좀, 마이크로입자 또는 마이크로캡슐 내에 캡슐화하는 방법; 핵으로 도입되는 것으로 알려진 펩티드에 결합시켜 그 핵산을 투여하는 방법; 또는 관심 수용체를 특이적으로 발현하는 세포 종류를 "표적화"하기 위하여 사용될 수 있는, 수용체 매개 엔도사이토시스의 성향이 있는 리간드에 연결하여 그 핵산을 투여하는 방법 (예컨대, Wu and Wu, 1987.J Biol Chem 262: 4429-4432 참조) 등을 포함하는 당해 기술 분야에 알려져 있는 수많은 방법 중의 하나에 의하여 수행될 수 있다.
본 발명의 실시에서 유전자 요법에 대한 또 다른 접근법은 전기천공, 리포펙션, 칼슘 포스페이트-매개 트랜스펙션, 바이러스성 트랜스펙션 등과 같은 방법에 의하여 시험관내 조직 배양 내의 세포 속으로 유전자를 전달하는 것을 포함한다. 일반적으로, 상기 전달 방법은 그 세포에 선택 마커의 부수적 전달을 포함한다. 그 후, 그 세포는 선택 압력 (예컨대, 항생제 저항성) 하에 놓이게 되어, 상기 전달된 유전자를 얻어 발현하는 세포의 분리를 촉진한다. 그 후, 그 세포가 환자에게 전달된다. 구체적인 실시 상태에서, 얻어진 재조합 세포의 생체내 투여에 앞서, 예컨대, 트랜스펙션, 전기천공, 마이크로주사, 관심 핵산 서열을 함유하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터로의 감염, 세포 융합, 크로모좀 매개 유전자 전달, 마이크로셀 매개 유전자 전달, 스페로플라스트 융합 및 수용체 세포의 필수적인 발달 및 생리적 기능이 전달에 의하여 파괴되지 않는 것을 보증하는 기타의 유사한 방법을 포함하는 당해 기술 분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의하여 그 핵산이 세포 내로 도입된다. 예컨대, 문헌 [Loeffler and Behr, 1993. Meth Enzymol 217 : 599-618]을 참조. 선택된 기술은 세포로의 핵산의 안정한 전달을 위해 제공되어야 하고, 그 결과 그 핵산이 그 세포에 의하여 발현된다. 좋기로는, 그 전달된 핵산은 그 세포의 자손에 의하여 유전되고 발현될 수 있다.
본 발명의 양호한 실시상태에 있어서, 얻어진 재조합 세포는, 예컨대, 상피 세포 주사 (예컨대, 피하적으로), 환자에게의 피부 이식편으로서 재조합 피부 세포의 이용 및 재조합 혈액 세포의 정맥내 주사 (예컨대, 조혈 줄기 또는 기원 세포)를 포함하는 당해 기술 분야에 알려진 다양한 방법에 의하여 환자에게 전달될 수 있다. 사용을 위해 예상되는 세포의 총량은 목적하는 효과, 환자 상태 등에 따라 다르고, 당해 기술 분야의 숙련자에 의하여 결정될 수 있다. 유전자 요법의 목적을 위하여 핵산이 그 속에 도입될 수 있는 세포는, 임의의 목적하는 이용가능한 세포 종류를 포함하고, 이종발생성(xenogeneic), 이종(heterogenic), 동계(syngeneic) 또는 자가(autogeneic)일 수 있다. 세포 종류는 분화된 세포, 예컨대, 상피 세포, 내피 세포, 각질 세포, 섬유모세포, 근세포, 간세포 및 혈액 세포 또는 다양한 줄기 또는 기원 세포, 특히, 배아 심장 근육 세포, 간 줄기 세포 (국제 특허 공개 WO 94/08598), 신경 줄기 세포 (Stemple and Anderson, 1992,Cell 71 : 973-985), 조혈 줄기 또는 기원 세포, 예컨대, 골수, 제대혈, 말초 혈액, 태아 간으로부터 얻어진 것 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 양호한 실시 상태에서, 유전자 요법을 위해 이용되는 세포는 환자의 자가(autologous) 세포이다.
또 다른 실시 상태에 따르면, 본 발명의 JNK 억제제 서열, 본 발명의 키메라 펩티드, 본 발명의 핵산 서열 또는 본 발명의 JNK 억제제 서열에 대한 항체 또는 본 발명의 키메라 펩티드에 대한 항체는 (시험관내) 분석 (예컨대, 면역분석)에서 이용되어 전술한 다양한 상태, 질병 및/또는 질환을 검출, 예측, 진단 또는 모니터하거나, 이들이 치료를 모니터할 수 있다. 상기 면역분석법은 면역특이적 결합이 일어날 수 있는 조건하에서 본 발명의 JNK 억제제 서열, 본 발명의 키메라 펩티드 또는 본 발명의 핵산 서열에 대한 항체를 가진 환자로부터 유래된 시료를 접촉시키는 단계와, 이어서 상기 항체에 의한 임의의 면역특이적 결합의 양을 검출하고 측정하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 수행될 수 있다. 구체적인 실시 상태에 있어서, 본 발명의 JNK 억제제 서열, 본 발명의 키메라 펩티드 또는 본 발명의 핵산 서열에 대해 특이적인 항체는 JNK 또는 JNK 억제제 서열의 존재에 대하여 환자로부터의 조직 또는 혈청 시료를 분석하는데 사용될 수 있는데, 여기서 JNK의 이상 수준은 질병 상태의 지표가 된다. 이용될 수 있는 면역분석은 예컨대, 웨스턴 블롯, 방사선면역측정법 (RIA), 효소 연관 면역흡착 분석법 (ELISA), "샌드위치(sandwich)" 면역분석법, 면역침전 분석법, 침강(precipitin) 반응, 겔 확산 침강소 반응, 면역 확산 분석법, 응집 분석법, 형광 면역분석법, 보체 결합(complement-fixation) 분석법, 면역방사측정 분석법 및 단백질 A 면역분석법 등과 같은 기술을 이용하는 경쟁적 및 비경쟁적 분석 시스템을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 또한, (시험관내) 분석법은 본 발명의 JNK 억제제 서열, 본 발명의 키메라 펩티드, 본 발명의 핵산 서열 또는 본 발명의 JNK 억제제 서열에 대한 항체 또는 본 발명의 키메라 펩티드에 대한 항체를, 예컨대 배양된 동물 세포, 인간 세포 또는 미생물에서 일반적으로 선택되는 표적 세포에 전달함으로써 수행될 수 있고, 당해 기술 분야의 숙련자에게 일반적으로 알려져 있는 생물물리학적 방법에 의하여 세포 반응을 모니터할 수 있다. 본 발명에서 일반적으로 사용되는 표적 세포는 배양된 세포 (시험관내) 또는 생체내 세포, 즉, 살아있는 동물 또는 인간의 기관 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 JNK 억제제 서열, 본 발명의 키메라 펩티드, 본 발명의 핵산 서열 및/또는 본 발명의 JNK 억제제 서열에 대한 항체 또는 본 발명의 키메라 펩티드에 대한 항체, 예컨대, 항JNK 억제제 서열 항체와, 필요에 따라 그 항체에 대한 표지된 결합 파트너를 함유하는 1개 이상의 용기를 포함하는 진단 또는 치료용 키트를 제공한다. 그에 따라 상기 항체에 혼입된 상기 표지는 화학발광성, 효소성, 형광, 비색 또는 방사선 모이어티를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 구체적인 실시 상태에서, 본 발명의 JNK 억제제 서열 및/또는 본 발명의 키메라 펩티드를 코딩하는 핵산 또는 그 대신에 이들에 상보적인 핵산과, 필요에 따라 이들 핵산에 대한 표지된 결합 파트너를 함유하는 1개 이상의 용기를 포함하는 진단용 키트가 제공된다. 또 다른 구체적인 실시 상태에서, 상기 키트는 1개 이상의 용기에서, 중합효소 연쇄 반응 (PCR; 예컨대, Innis, et al., 1990. PCR PROTOCOLS, Academic Press, Inc., San Diego, CA 참조), 리가제 연쇄 반응, 환식(cyclic) 프로브 반응 등 또는 본 발명의 핵산과 관련하여 사용되는 기타의 당해 기술 분야에 알려진 방법을 위한 증폭 프라이머로서 행동할 수 있는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (예컨대, 각각 길이가 6∼30개 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기 분석법에 있어서 진단, 기준 또는 대조군으로서의 용도를 위하여 미리 설정된 양의 정제된 본 발명의 JNK 억제제 서열, 본 발명의 키메라 펩티드 또는 이들을 코딩하는 핵산을 필요에 따라 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정의 실시 상태에 의하여 그 범위가 제한되지 않는다. 사실, 본 명세서에 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 전술한 상세한 설명 및 포함된 도면으로부터 당해 기술 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 그러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함된다.
본 명세서에서 인용하는 다양한 문헌은 그 전부가 본 발명에 참조로서 통합된다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련자 중 한 명에 의하여 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다고 하더라도, 적절한 방법 및 재료는 아래에 기재된 것이다. 본 명세서에 언급된 모든 공개, 특허 출원, 특허 및 기타의 참고 문헌은 그 전부가 본 명세서에 참조로서 통합된다. 대립되는 경우에는, 정의를 포함하여 본 명세서가 기준이 될 것이다. 또한, 재료, 방법 및 예는 단지 설명을 위한 것이지 제한을 의도한 것이 아니다. 본 발명의 기타의 특징 및 효과는 다음의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1A 내지 C는 표시된 전사 인자에서의 보존된 JBD 도메인 영역의 정렬을 나타낸 도표이다. JNK 억제제 서열이 이들 서열 정렬에 의하여 확인되었다. 이러한 정렬의 결과를 도 1A∼1C에서 예시적으로 나타낸다. 도 1A는 IB1, IB2, c-Jun 및 ATF2의 JBDs 사이에서 가장 상동성을 가진 영역을 나타낸다. 패널 B는 비교를 위하여 L-IB1(s) 및 L-IB1의 JBDs의 아미노산 서열을 나타낸다. 완전하게 보존된 잔기를 별표로 나타내고, 반면 GFP-JBD23Mut 벡터에서 Ala로 변화된 잔기를 빈 원으로 나타내었다. 도 1C는 JNK 억제제 서열 및 수송 서열을 포함하는 키메라 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 나타낸 예에서는, 수송 서열은 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) TAT 폴리펩티드로부터 유래되고, JNK 억제제 서열은 IB1(s) 폴리펩티드로부터 유래된 것이다. 인간, 마우스 및 쥐의 서열은 도 1B 및 1C에서 동일하다.
도 2는 인간, 마우스 및 쥐로부터의 일반식 TAT-IB 융합 펩티드의 서열을 나타낸 그림이다.
도 3은 영구적 MCAO 모델에서 국소 대뇌 허혈에 대한 신경보호 평가로부터의 결과를 도해한 것이다. 보호 효율성의 측정을 상이한 용량에서 수행하였다 (도 3 참조). 도 3으로부터 이해할 수 있는 것처럼, 적어도 11 mg/kg, 3 mg/kg, 0.3mg/kg 및 0.03 mg/kg의 용량에서 대뇌 보호에 기여를 한다. 최선의 보호는 0.03 mg/kg의 용량에서 관찰된다.
도 4는 일과성 MCAO 모델에서 국소 대뇌 허혈에 대한 i.v. 투여 후의 EQ ID NO: 11에 따른 본 발명의 키메라 펩티드에 의한 신경보호의 평가를 도해한 것이다. 성체 마우스에서 허혈을 유발시킨 다음, 그 마우스를 재관류(reperfusion) 48 시간 후에 희생시켰다. 일련의 냉동박절 절편을 만들고, 경색 부피를 계산하였다. 도 4로부터 알 수 있듯이, 본 발명의 키메라 펩티드는 효과적인 신경보호를 제공한다.
도 5는 NMDA 자극에 따른 LDH 방출을 측정함으로써 수행된 뉴런 배양물에 대한 분석의 결과를 보여준다. 대조군 이상의 유의적 LDH 방출의 부재에 의하여 나타나는 것처럼 NMDA 노출에 기인한 퇴행적 변화가 완전하게 억제되었기 때문에, 그 결과는 본 발명의 키메라 D-JNKI1 펩티드 (서열 번호 11)의 신경보호 효과를 명백하게 나타낸다.
도 6은 원-웰 접근법(one-well approach)에서 서열 번호 9 및 11에 따른 본 발명의 융합 펩티드를 사용한, HepG2 세포에서 내인성 JNK 활성의 억제의 결과를 도해한다. 도 6으로부터 알 수 있듯이, 특히 도 6d에서, 서열 번호 11에 따른 D-TAT-IB1(s) (여기서, D-JNKI로 축약)은 서열 번호 9에 따른 L-TAT-IB1(s) (여기서, L-JNKI로 축약) 보다 JNK 활성을 훨씬 더 효과적으로 억제한다.
도 7은 영구적 청력 상실에 대한 D-TAT-IB1(s) 보호의 보호 효과를 도해한다. 최대 충격 주파수 8 kHz로의 소음 외상 (30분 동안 6kHz로 120 dB) 후의 기니피그에서 청력 역치 수준 (dB 소리 압력 수준)의 변화를 소음 노출 후 20분 (일시적 역치 변화, TTS, 회색) 및 15일 (영구적 역치 변화, PTS)에 측정하였다. 기니피 그는 소음 외상 30분 전, 30분 후 또는 4시간 후에, 달팽이관 둥근 창 막 위에 침착된(deposited) 알루론산 겔로서 D-TAT-IB1(s)를 투여받았고, 대조군으로서 비처리 귀가 제공되었다. TTS는 소음 외상 후 20분에 측정되었고, 영구 청력 손상에 대응하는 PTS (블랙)는 15일 후에 측정되었다. 나타낸 바와 같이, D-TAT-IB1(s)는 소음 외상 전에 예방적으로 이용된다면, 소음 외상으로부터의 영구 청력 손상을 실질적으로 보호할 뿐만 아니라, 그 외상 후에 투여되는 경우 시간 의존적으로 보호한다. 외상 30분 및 4시간 후의 D-TAT-IB1(s)의 투여의 경우 처리된 귀에서의 PTS는 비처리 대조군 귀에 비하여 유의적으로 더 낮았다.
실시예 1: JNK 억제제 서열의 동정
JNK와 효율적으로 상호작용하는데 중요한 아미노산 서열을 알려진 JBDs 간의 서열 정렬에 의하여 동정하였다. IB1 [서열 번호 13], IB2 [서열 번호 14], c-Jun [서열 번호 15] 및 ATF2 [서열 번호 16]의 JBDs 간의 서열 비교는 약하게 보존된 8개 아미노산 서열을 분명하게 한다 (도 1A). JNK 결합에 있어서 IB1 및 IB2의 JBDs가 c-Jun 또는 ATF2에 비해 약 100 배 효율적이기 때문에 (Dickens et al. Science 277: 693 (1997)), IB1 및 IB2 사이에서 보존된 잔기들이 최대 결합을 부여하는데 중요하여야 한다는 것은 합리적이었다. IB1 및 IB2의 JBDs 간의 비교는 그 2개의 서열 간에 고도로 보존된 7개 및 3개의 아미노산의 2개의 블록을 분명하게 한다.
이들 2개의 블록은 L-IB1(s) [서열 번호 1] 중의 19개 아미노산의 펩티드 서열 내에 함유되어 있고, 또한, IB1 [서열 번호 17]로부터 유래된 23개 아미노산 펩 티드 서열에서 비교를 위해 나타내었다. 이들 서열을 L-IB1 서열에서 L-IB1(s)과 보존된 잔기를 정렬하기 위하여 서열에서의 갭(gap)을 L-IB1 서열에서 줄을 그어(dashes), 도 1B에 표시하였다.
실시예 2: JNK 억제제 융합 단백질의 제조
서열 번호 9에 따른 본 발명의 JNK 억제제 융합 단백질을 서열 번호 1의 C-말단을 서열 번호 5에 따른 HIV-TAT4g 57 (Vives et al., J Biol. Chem. 272: 16010 (1997))로부터 유래된 N-말단 10개 아미노산 길이의 운반체에 2개의 프롤린 잔기로 이루어지는 링커를 통한 공유 결합에 의하여 합성하였다.
이러한 링커는 최대의 유연성을 가능하게 하고 원하지 않는 2차 구조적 변화를 막기 위해 사용되었다. 또한, 그 기초적 구조물을 각각 제조하여 L-IB1(s) (서열 번호 1) 및 L-TAT [서열 번호 5]로 명명하였다.
서열 번호 11에 따른 모든 D 레트로-인버소 펩티드를 그와 상응하게 합성하였다. 또한, 그 기초적 구조물을 각각 제조하여 D-IB1(s) [서열 번호 2] 및 D-TAT [서열 번호 6]로 명명하였다.
서열 번호 9, 10, 11 및 12에 따른 모든 본 발명의 D 및 L 융합 펩티드를 전형적인 Fmock 합성법으로 만들고, 질량 분석기에 의하여 추가적으로 분석하였다. 마지막으로 이들을 HPLC로 정제하였다. 프롤린 링커의 효과를 측정하기 위하여, 2개의 프롤린을 가진 것과 가지지 않은 것 2가지 종류의 TAT 펩티드를 생산하였다. 2개의 프롤린의 첨가는 세포 내에서 TAT 펩티드의 진입 또는 위치 결정을 변형시키는 것으로 나타나지 않았다. 보존된 아미노산 잔기를 나타내는 일반식 펩티드를 도 2에 나타내었다.
실시예 3: JBD19 에 의한 세포 사멸의 억제
JNK의 생물학적 활성에 대한 IB1(s)의 19개 아미노산 길이의 JBD 서열의 효과를 연구하였다. 상기 19개 아미노산 서열의 N-말단을 녹색 형광 단백질에 연결하고 (GFP JBD19 구조물), IL1에 의하여 유도되는 췌장 β세포의 세포자멸사에 대한 이러한 구조물의 효과를 측정하였다. 이러한 방식의 세포자멸사는 JBD1 -280로의 트랜스펙션에 의하여 차단되는 반면, ERK1/2 또는 p38의 특이적 억제제는 보호하지 않는다는 것이 이미 보고된바 있다 (see Ammendrup et al., supra).
JBD19에 상응하고, 19개 아미노산의 보존된 서열뿐만 아니라 완전히 보존된 영역에서 돌연변이된 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성하여, 녹색 형광 단백질 (GFP)을 코딩하는 pEGFP-N1 벡터 (Clontech로부터 구득)의 EcoRI 및 SalI 자리 내로 직접적으로 삽입하였다. 인슐린 생산 βTC-3 세포를 10% 소태아혈청, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 100 units/mL 페니실린 및 2 mM 글루타민으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 인슐린 생산 βTC-3 세포를 상기 벡터로 트렌스펙션시키고, IL-1β (10 ng/mL)를 세포 배양 배지에 첨가하였다. IL-1β의 첨가하고 48 시간이 지난 시점에 도립 형광 현미경을 사용하여 세포자멸사 세포의 수를 계수하였다. 세포자멸사 세포들을 세포질의 "거품처럼 터지는(blebbing out)" 특징에 의하여 정상 세포와 식별하고, 2일 후에 계수하였다.
GFP는 대조군으로서 사용된 녹색 형광 단백질 발현 벡터이고; JBD19는 IB1의 JBD로부터 유래된 19개 아미노산 서열에 연결된 키메라 GFP를 발현하는 벡터이며; JBD19Mut는 GFP-JBD19와 동일한 벡터이지만 도 1B에서 나타낸 4개의 보존된 잔기에서 돌연변이된 JBD를 가진 것이고; JBD1 -280은 전체 JBD (아미노산 1∼280)에 연결된 GFP 벡터이다. GFP-JBD19 발현 구조물은 IL-1β 유도 췌장 β세포 세포자멸사를 전체 JBD1 -280 만큼 효과적으로 막았다.
추가적인 대조군으로서, 완전히 보존된 IB1(s) 잔기에서 돌연변이된 서열은 세포자멸사를 막는 능력이 매우 감소되었다.
실시예 4: TAT - IB1 (s) 펩티드의 세포 유입
세포로 들어가는 TAT의 L- 및 D-거울상체형 및 본 발명의 TAT-IB1(s) 펩티드 ("TAT-IB 펩티드")의 능력을 평가하였다. L-TAT, D-TAT, 본 발명의 L-TAT-IB1(s) 및 본 발명의 D-TAT-IB1(s) 펩티드 [각각 서열 번호 5, 6, 9 및 12]를 플루오레신에 결합된 글리신 잔기를 N-말단 첨가시켜 표지시켰다. 표지된 펩티드 (1 μM)를 실시예 3에 기재한 바와 같이 유지시킨 βTC-3 세포 배양물에 첨가하였다. 예정된 시간에 세포를 PBS로 세척하고, 형광 현미경으로 조사하기 전에 얼음같이 찬(ice-cold) 메탄올-아세톤 (1:1)에서 5분 동안 고정시켰다. 플루오레신 표지화 BSA (1 μM, 12 몰/몰 BSA)를 대조군으로 사용하였다. 그 결과는 모든 상기 플루오레신 표지화 펩티드는 배양 배지에 첨가될 때 효과적으로 그리고 빠르게 (5분 미만) 세포로 들어간다는 것을 증명하였다. 반대로, 플루오레신 표지화 소혈청 알부민 (1 μM BSA, 12 몰 플루오레신/몰 BSA)은 세포로 들어가지 않았다.
시간 경과 연구는 L-거울상체 펩티드에 대한 형광 신호의 강도가 24시간 후에 70% 까지 감소한다는 것을 보여주었다. 48시간에는 신호는 거의 내지 전혀 없었다. 대조적으로, D-TAT 및 본 발명의 D-TAT-IB1(s)는 세포 내에서 매우 안정하였다.
이들 모든 D 레트로-인버소 펩티드로부터의 형광 신호는 1 주 후에도 매우 강했고, 그 신호는 처리 2 주 후에 단지 약하게 감소하였다.
실시예 5: c- JUN , ATF2 및 Elk1 인산화의 시험관 내 억제
그들의 표적 전사 인자의 JNKs 매개 인산화에 대한 펩티드들의 효과를 시험관 내에서 조사하였다. 재조합 및 비활성화 JNK1, JNK2 및 JNK3를 전사 및 번역 토끼 망상적혈구 용해 키트 (Promega)를 사용하여 제조하고, 이를 기질로서 c-Jun, ATF2 및 Elk1 (단독으로 또는 글루타티온-S-트란스퍼라제 (GST)에 융합된)와 함께 고체상 키나아제 분석에 사용하였다. 본 발명의 L-TAT 또는 L-TAT-IB1(s) 펩티드 (0∼25 μM)를 반응 버퍼 (20 mM Tris-아세테이트, 1mM EGTA, 10 mM p-니트로페닐-포스페이트 (pNPP), 5 mM 소듐 피로포스페이트, 10 mM p-글리세로포스페이트, 1 mM 디티오트레이톨)에서 20분 동안 상기 재조합 JNK1, JNK2 또는 JNK3 키나아제와 혼합시켜, 용량 반응 연구를 수행하였다. 키나아제 반응을 10 mM MgCl2 및 5 pCi 33P-γ-dATP와, 1 μg의 GST-Jun (aa 1-89), GST-AFT2 (aa 1-96) 또는 GST-ELK1 (aa 307-428) 중 하나를 첨가하여 개시시켰다. GST-융합 단백질을 Stratagene (La Jolla, CA)으로부터 구입하였다.
또한, 10 μL 글루타티온-아가로스 비드를 상기 혼합물에 첨가하였다. 그 후, 반응 생성물을 변성 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서의 SDS-PAGE에 의하여 분리하였다. 겔을 건조한 후, 이어서 X레이 필름(Kodak)에 노출시켰다. 2.5 μM의 낮은 투여량의 본 발명의 TAT-IB(s) 펩티드에서 JNKs에 의한 c-Jun, ATF2 및 Elk1 인산화의 거의 완전한 억제가 관찰되었다. 그러나, 현저한 예외는 Elk1의 JNK3 인산화에 대한 TAT-IB(s) 억제의 부재였다. 전반적으로, 본 발명의 TAT-IB1(s) 펩티드는 그들의 표적 전사 인자의 JNK 패밀리 인산화를 억제하는데 있어서 더 우수한 효과를 보여주었다. 재조합 JNK1, JNK2 및 JNK3에 의한 GST-Jun (aa 1∼73) 인산화의 억제에 대한 D-TAT, 본 발명의 D-TAT-IB1(s) 및 본 발명의 L-TAT-IB1(s) 펩티드 (0∼250 μM 용량 연구)의 능력이 전술한 바와 같이 분석되었다. 전반적으로, D-TAT-IB1(s) 펩티드는 c-Jun의 JNK 매개 인산화를 감소시켰지만, 그 수준에 있어서 L-TAT-IB1(s) 보다는 약 10∼20 배 덜 효과적이었다.
실시예 6: 활성화된 JNKs 에 의한 c- JUN 인산화의 억제
GST-Jun을 UV 광조사된 HeLa 세포 또는 IL-1β 처리 PTC 세포로부터 끌어낸 JNKs에 사용하여, 스트레스성 자극에 의하여 활성화되는 JNKs에 대한 L-TAT 또는 본 발명의 L-TAT-IB1(s) 펩티드의 효과를 측정하였다. PTC 세포를 전술한 바와 같이 배양하였다. HeLa 세포를 10 % 소태아혈청, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 100 units/ml 페니실린 및 2 mM 글루타민으로 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포 추출물 제조에 사용하기 1시간 전에, PTC 세포를 전술한 바와 같이 IL-1β로 활성화시키고, 반면 HeLa 세포는 UV광 (20 J/m2)으로 활성화시켰다. 용해 버퍼 (20 mM Tris-아세테이트, 1 mM EGTA, 1% 트리톤 X-100, 10 mM p-니트로페닐-포스페이트, 5 mM 소듐 피로포스페이트, 10 mMP-글리세로포스페이트, 1 mM 디티오트레이톨)에서 세포 배양물을 스크래핑(scraping)함으로써 세포 추출물을 대조군, UV 광조사된 HeLa 세포 및 IL-1β 처리된 βTC-3 세포로부터 제조하였다. SS-34 베크만 로터(Beckman rotor)에서 15,000 rpm으로 5분 동안 원심분리시켜 파편(debris)을 제거하였다. 100 μg 추출물을 1 μg GST-jun (아미노산 1-89) 및 10 μL 글루타티온-아가로스 비드 (Sigma)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 스크래핑 버퍼로 4번 세척한 후에, 상기 비드를 L-TAT 또는 본 발명의 L-TAT-IB1(s) 펩티드 (25 μM)로 보충된 동일한 버퍼에서 20분 동안 재현탁시켰다. 그 후, 10 mM MgCl2 및 5 pCi33P-γ-dATP의 첨가로 키나아제 반응을 개시시키고, 30℃에서 30분 동안 배양하였다.
그 후, 반응 생성물을 변성 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서의 SDS-PAGE에 의하여 분리하였다. 겔을 건조한 후, 이어서 X레이 필름(Kodak)에 노출시켰다. 본 발명의 TAT-IB(s) 펩티드는 이들 실험에서 활성화된 JNKs에 의하여 c-Jun의 인산화를 효과적으로 차단하였다.
실시예 7: 본 발명의 TAT - IB (s) 펩티드에 의한 c- Jun 인산화의 생체 내 억제
본 발명의 세포 투과성 펩티드가 생체 내에서 JNK 신호전달을 차단할 수 있는지 여부를 결정하기 위해서, 우리는 이종유래 GAL4 시스템을 사용하였다. 전술한 바와 같이 배양된 HeLa 세포를, GAL4 DNA 결합 도메인에 연결된 c-Jun (아미노산 1-89)의 활성화 도메인을 포함하는 GAL-Jun 발현 구조물 (Stratagene)과 함께 5xGAL-LUC 리포터 벡터로 공동 트랜스펙션(co-transfected)시켰다. JNK의 활성화를 바로 상류의(directly upstream) 키나아제 MKK4 및 MKK7을 발현하는 벡터의 공동 트랜스펙션에 의하여 달성하였다 (Whitmarsh et al., Science 285: 1573 (1999) 참조). 축약하면, 제조자의 지침에 따라서, 3x105 세포를 DOTAP (Boehringer Mannheim)를 사용한 3.5 cm 디쉬에서 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. GAL-Jun을 포함하는 실험에 있어서, 20 ng의 상기 플라스미드를 1 μg의 리포터 플라스미드 pFR-Luc (Stratagene) 및 0.5 μg의 MKK4 또는 MKK7 발현 플라스미드와 함께 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 3 시간 후, 세포 배지를 교환하고, TAT 및 TAT-IB1(s) 펩티드 (1 μM)를 첨가하였다. 단백질 함량에 대해 표준화(normalization)시킨 후 프로메가(Promega)의 "듀얼 리포터 시스템(Dual Reporter System)"을 사용하여 루시퍼라제 활성을 16 시간 후에 측정하였다. TAT-IB1(s) 펩티드의 첨가는 JNK의 MKK4 및 MKK7 매개 활성화에 따른 c-Jun의 활성화를 차단하였다. HeLa 세포가 JNK1 및 JNK2 아이소형(isoforms)을 발현하고 있으나 JNK3 아이소형을 발현하고 있지 않기 때문에, JNK3로 세포를 트랜스펙션시켰다. TAT-IB(s) 펩티드는 c-Jun의 JNK2 매개 활성화를 억제하였다.
실시예 8: TAT - IB 펩티드에 의한 IL -1β 유도 췌장 β세포 사멸의 억제
IL-1이 유발하는 β세포 세포자멸사의 촉진에 대한 본 발명의 L-TAT-IB(s) 펩티드의 효과를 조사하였다. βTC-3 세포 배양물을 1 μM의 본 발명의 L-TAT-IB1(s) 펩티드에 이어서 10 ng/mL의 IL-1로 30분 동안 배양하였다. 24 시간 후에 펩티드의 두 번째 첨가 (1 μM)를 수행하였다. IL-1β로 배양한 지 2일 후에, 프로피디움 아이오다이드 (적색으로 염색된 세포는 죽은 세포이다) 및 Hoechst 33342 (청색으로 염색된 세포는 무손상(intact) 원형질막을 가진 세포이다) 핵 염색을 사용하여, 세포자멸사 세포를 계수하였다. 본 발명의 TAT-IB(s) 펩티드의 첨가는 IL-1β의 존재하에서 2일 동안 배양된 βTC-3 세포의 IL-1 유도 세포자멸사를 억제하였다.
상기 펩티드 및 IL-1β로 상기 세포의 배양을 12일 동안 지속시킨다는 것으로 제외하고, 전술한 바와 같은 βTC-3 세포를 처리함으로써, IL-1 유도 세포 사멸의 장기간 억제를 조사하였다. 추가적인 펩티드 (1 μM)를 매일(each day) 첨가하고, 추가적인 IL-1β (10 ng/mL)를 2일 마다 첨가하였다. 본 발명의 TAT-IB1(s) 펩티드는 이들 조건에서 세포자멸사에 대한 강한 보호를 부여한다. 종합하면, 이들 실험은 본 발명의 TAT-IB(s) 펩티드가 세포 운명에 대한 JNK 신호전달의 효과를 차단할 수 있는 생물학적으로 활성인 분자라는 것의 증거를 제공한다.
실시예 9: 본 발명의 완전 D 레트로 - 인버소 IB (s) 펩티드의 합성
본 발명의 펩티드는 자연적인 단백질분해(proteolysis)를 막기 위하여 역으로 합성된 완전 D 아미노산 펩티드(all-D amino acid peptides), 즉 완전 D 레트로-인버소 펩티드(all-D retro-inverso peptides)일 수 있다. 본 발명의 완전 D 레트로-인버소 펩티드는, 그 성분 아미노산의 측기가 천연 펩티드 배열에 상응하지만, 프로테아제 저항성 골격을 보유하는, 천연 펩티드와 유사한 기능적 특성을 가진 펩티드를 제공할 것이다.
본 발명의 레트로-인버소 펩티드는, 그 펩티드 사슬에 D-아미노산을 부착하여, 그 레트로-인버소 펩티드 유사체에서 아미노산의 서열이 모델로서 제공되는 선택된 펩티드에서의 서열과 정확히 반대가 되는, D-아미노산을 사용하여 합성된 유사체이다. 예시적으로, 자연 발생 TAT 단백질 (L-아미노산으로 형성됨)이 서열 GRKKRRQRRR [서열 번호 5]을 가지는 경우, 이 펩티드의 레트로-인버소 펩티드 유사체 (D-아미노산으로 형성됨)는 서열 RRRQRRKKRG [서열 번호 6]을 가지게 된다. 레트로-인버소 펩티드를 만들기 위해 D-아미노산의 사슬을 합성하는 방법은 당해 기술 분야에 알려져 있다 (예컨대, Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368,692-693 (1994); Guichard et al., J. Med. Chem. 39,2030-2039 (1996) 참조). 구체적으로, 레트로-펩티드를 전형적인 F-mock 합성 방법에 의하여 생산하여, 이를 추가로 질량 분석기로 분석하였다. 마지막으로, 이들을 HPLC로 정제하였다.
천연 펩티드가 가지는 고유의 문제점인 천연 프로테아제에 의한 분해 및 고유 항원성 때문에, 본 발명의 이종이가(heterobivalent) 또는 이종다가(heteromultivalent) 화합물은 목적하는 펩티드의 "레트로-인버소 이성질체"를 포함하도록 제조되는 것이다. 따라서, 천연 단백질 분해로부터의 상기 펩티드의 보호는, 반감기의 연장 및 그 펩티드를 활발하게 파괴시키는 것을 노리는 면역 반응의 정도의 감소 양쪽 모두에 의하여, 특이적 이종이가 또는 이종다가 화합물의 효율성을 증가시킬 것이다.
실시예 10: 본 발명의 완전 D 레트로 - 인버소 IB (s) 펩티드의 장기간 생물학 적 활성
실시예 5에서 나타낸 바와 같이, 천연 프로테아제에 의한 분해로부터의 본 발명의 D-TAT-IB(s) 펩티드의 보호에 기인하는, 천연 L-아미노산 유사체와 비교할 때, 펩티드 이종 접합물(heteroconjugate)을 함유하는 본 발명의 D-TAT-IB(s) 레트로-인버소에 대한 장기간 생물학적 활성을 예측하였다.
본 발명의 D-TAT-IB1(s) 펩티드에 의한 IL-1β 유도 췌장 β 세포 사멸의 억제를 분석하였다. 전술한 바와 같이, βTC-3 세포를 지적된 펩티드 (1 μM)의 한 번의 단일 첨가로 30분 동안 배양한 후, IL-1 (10 ng/ml)을 첨가하였다.
IL-1β와 함께 배양한 지 2일 후에 프로피디움 아이오다이드 및 Hoechst 33342 핵 염색을 사용하여 세포자멸사 세포를 계수하였다. 최소 1,000개 세포가 각 실험에서 계수되었다. 평균의 표준 오차 (SEM)는 n=5로 표시되었다. D-TAT-IB1 펩티드는 IL-1 유도 세포자멸사를 L-TAT-IB 펩티드와 유사한 정도로 감소시켰다.
D-TAT-IB1 펩티드에 의한 IL-1P 유도 세포 사멸의 장기간 억제 역시 분석되었다. βTC-3 세포를 전술한 바와 같이 지적된 펩티드 (1 μM)의 한 번의 단일 첨가로 30분 동안 배양한 후, IL-1β (10 ng/ml)를 첨가하였고, 그 후 매 마다 그 사이토카인을 첨가하였다. IL-1과 함께 배양한 지 15일 후에 프로피디움 아이오다이드 및 Hoechst 33342 핵 염색을 사용하여 세포자멸사 세포를 계수하였다. TAT-IB1 펩티드의 한 번의 단일 첨가는 장기간의 보호를 부여하지 않는다는 것이 주목된다. 최소 1,000개의 세포가 각 실험에서 계수되었다. 결론적으로, 본 발명의 D-TAT-IB1(s)은 장기간 (15일)의 보호를 줄 수 있었지만, 본 발명의 L-TAT-IB1(s)은 그렇지 아니하였다.
실시예 11: TAT - IB (s) 펩티드에 의한 방사선( irradiation ) 유도 췌장 β세포 사멸의 억제
JNK는 또한 전리 방사선(ionizing radiation)에 의하여 활성화된다. 본 발명의 TAT-IB(s) 펩티드가 방사선 유도 JNK 손상에 대한 보호를 제공하는지 여부를 측정하기 위하여, D-TAT, 본 발명의 L-TAT-IB1(s) 또는 본 발명의 D-TAT-IB1(s) 펩티드 (방사선조사 30분 전에 1 μM이 첨가됨)의 존재 또는 부재시에 "WiDr" 세포에 방사선조사(irradiated) (30 Gy)하였다. 대조군 세포(CTRL)는 방사선조사되지 않았다. 세포를 전술한 바와 같이 PI 및 Hoechst 3342 염색으로 48시간 후에 분석하였다. N = 3, SEM으로 표시하였다. 본 발명의 L-TAT-IB1(s) 및 D-TAT-IB1(s) 펩티드는 양쪽 모두 인간 결장암 세포주에서 방사선조사 유도 세포자멸사를 차단할 수 있었다.
실시예 12: 본 발명의 TAT - IB (s) 펩티드에 의한 전리 방사선에 대한 방사선보호
본 발명의 TAT-IB(s) 펩티드의 방사선보호 효과를 측정하기 위하여, C57B1/6 마우스 (생후 2 내지 3 개월)를 필립스 RT 250 R-ray로 선량률 0.74 Gy/분 (17 mA, 0.5 mm Cu 필터)으로 방사선조사 하였다. 방사선조사 30분 전에, 상기 동물을 TAT, 본 발명의 L-TAT-IB1(s) 또는 본 발명의 D-TAT-IB1(s) 펩티드 중의 하나로 (1 mM 용액 중 301) i.p. 주사하였다. 요약하면, 마우스는 다음과 같이 방사선 조사되었다: 마우스를 작은 플라스틱 상자안에 넣고, 머리를 상자 밖으로 나오게 두었다. 방사선조사기 아래 마우스의 등을 위치시키고, 머리를 정확한 위치로 유지시키기 위한 작은 플라스틱 터널에 마우스의 목을 고정시켰다. 마우스의 몸을 납으로 보호하였다.
방사선조사에 전에는 마우스를 표준 펠렛 마우스 고형사료(chow)로 사육하였지만, 방사선조사 후에는 매일 새로운 유동식 사료(semi-liquied food)로 먹이를 주었다.
그 후, 2명의 독립된 관찰자가 파킨스 등이 개발한 채점 시스템 (Parkins et al, Radiotherapy & Oncology, 1: 165-173, 1983)에 따라 입술 점막(lip mucosa)의 반응을 평가하였다 (여기서, 홍반 상태(erythema status)뿐만 아니라 부종(edema)의 존재, 상피박리(desquamation) 및 삼출(exudation)이 인용되었다). 또한, 그 동물의 홍반/부종 상태를 각각 기록하기 전에 체중을 측정하였다.
이들 실험의 결과는 본 발명의 TAT-IB(s) 펩티드는 전리 방사선에 관련된 체중 감소 및 홍반/부종에 대한 보호가 가능하다는 것을 나타낸다.
실시예 13: 본 발명의 L- TAT - IB1 (s) 펩티드에 의한 JNK 전사 인자의 억제
AP-1 이중 표지 프로브 5'-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3' (서열 번호 27)로 겔 지연 분석법(Gel retardation assays)을 수행하였다. 지시된 바와 같이 5 ng/ml TNF-α로 1시간 동안 처리되거나 처리되지 않은 HeLa 세포 핵을 추출하였다. TAT 및 본 발명의 L-TAT-IB1(s) 펩티드를 TNF-α의 30분 전에 첨가하였다. 특이적 AP-1 DNA 복합체를 가진 겔의 일부만 (표지되지 않은 특이적 및 비특이적 경쟁자(competitors) 경쟁 실험에 의하여 증명된 바와 같이)이 나타났다.
본 발명의 L-TAT-IB1(s) 펩티드는 TNF-α의 존재하에서 AP-1 DNA 결합 복합체의 형성을 감소시킨다.
실시예 14: 영구 MCAO 모델에서 국소 대뇌 허혈( focal cerebral ischemia )에 대한 신경보호( neuroprotection )의 평가 - 상이한 용량에서의 보호의 효율성의 측정 (도 3 참조)
생후 12일의 쥐에서 국소 대뇌 허혈을 유도시켰다. 유도 챔버에서 2% 이소플루란으로 쥐들을 마취시켰고, 수술(operation) 동안 2% 이소플루란 마스크(mask)를 사용하여 마취를 유지하였다. 중간대뇌동맥 (MCA)의 주 가지를 전기응고시켜 MCAO를 유도시켰다. 쥐를 오른쪽이 아래로 가도록 위치시키고, 귀와 눈 사이에서 사형(斜形) 피부 절개를 하였다. 측두근의 절제 후, 전두봉합(frontal suture)으로부터 관골궁(zygomatic arch) 아래 정도까지 두개골을 제거하였다. 후열(rhinal fissure) 위의 그의 출현 후에 바로 노출된 남아있는 MCA를 전두 및 두정 가지로 두 갈래로 나뉘는 MCA 전에 하대뇌정맥 수준에서 영구적으로 전기응고시켰다. 그 후, 두피 절개를 봉합하였다. 그 후, 어린 쥐를 37℃로 유지된 인큐베이터에 깨어날 때까지 넣은 다음, 어미 쥐에게 보냈다.
6시간 후에 본 발명의 서열 번호 11에 따른 키메라 D-TAT-IB1(s) 펩티드를 복강내로 주사하였다. 응고 24시간 후에, 그 쥐를 클로랄 하이드레이트로 마취시키고, PBS 내의 4% 파라포름알데하이드로 오름대동맥(ascending aorta)을 통하여 관류시켰다(perfused). 그 후, 뇌를 제거하고, 동일한 고정액에 2시간 동안 둔 후, PBS 중의 30% 수크로스 구배에 4℃에서 약 15 시간 동안 위치시켰다. 뇌를 이소펜탄(-40℃) 중에서 동결시키고, -20℃에서 보관하였다. 50 μm의 관상 냉동박절 절편 (coronal cryostat sections)을 유리 슬라이드 위에 수집하였다. 그 절편을 크레실 바이올렛으로 염색하였다. 각각 10번째 절편을 분석하여, 뉴로루시다 프로그램(Neuroleucida programme)을 사용하여 병변(lesion)의 총 부피를 계산하였다. 대조군 A에서, 평균 병변 부피는 21.47 mm3이었다. 모든 처리군은 대조군보다 더 낮은 평균값을 가진다. 그룹 A와, 그룹 C, E 및 F (각각, 단측(one-tailed) t-테스트, p=0.030, p=0.002, p=0.001) 사이에서 유의미한 통계적 차이가 관찰되었다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
결론적으로, 이들 데이터는 11 mg/kg, 3 mg/kg, 0.3mg/kg 및 0.03 mg/kg의 용량으로 투여된 본 발명의 서열 번호 11에 따른 키메라 D-TAT-IB1(s) 펩티드가 대뇌 보호에 기여한다는 것을 지지해준다. 식염수 군과 비교한 1mg/kg, 0.003 mg/kg 및 0.0003의 투여량에서의 결과는 전체 샘플이 유의미한 차이에 도달할 정도로 충분하게 크지 않다는 것을 제시한다. 최선의 보호는 0.03 mg/kg의 용량에서 관찰되었다.
실시예 15: 일과성( transient ) MCAO 모델에서의 국소 대뇌 허혈에 대한 iv 투여 후의 본 발명의 키메라 펩티드에 의한 신경보호의 평가 (도 4 참조)
성체 마우스에서의 일과성 허혈. 수컷 ICR-CD1 마우스(생후 6주; 18∼37 g; Harlan)를 사용하여, 통상의 경동맥으로부터의 필라멘트(filament)를 내경동맥 속으로 도입시켜 동맥 순환속으로 진행시키고, 그에 따라 중간대뇌동맥을 폐색시킴으 로써 허혈을 자극하였다. 그 허혈을 통하여 재관류 후 10분까지 두개골에 고정된 프로브로 레이저 도플러 유속 측정(laser Doppler flowmetry)에 의하여 국소 대뇌 혈류를 측정하였다. 직장 온도를 측정하고, 37℃로 유지시켰다. 마우스를 재관류 후 48 시간에 희생시켰다. 20 μm 두께의 일련의 냉동박절 절편을 뉴로루시다 프로그램 (Neurolucida program; MicroBrightField)이 설치된 컴퓨터-현미경 시스템을 사용하여 추적하였고, 허혈 영역의 부피 및 전체 뇌의 부피를 뉴로익스플로러 프로그램 (Neuroexplorer program)으로 계산 (맹검(blinded))하였다.
XG-102 0.3 = 0.3 mg/kg, XG-102 1 = 1 mg/kg, XG-102 5 = 5 mg/kg
성체 마우스 모델에서, 재관류 (30분 클램프(clamp)) 6 시간 후 플라세보 및 XG-102 0.3, 1,3 mg/kg의 일시 iv 투여 후의 경색 부피(mm3)는 다음과 같다.
경색( infarcts ) 평균( moyenne ) 표준편차( ecart type )
대조군 n=5 72 17
XG102 0.3 n=5 16 4
XG102 1 n=1 16
XG102 3 n=5 15 5
실시예 16: NMDA 자극에 따른 LDH 방출에 의한 뉴런 배양( neuronal cultures)에 대한 분석 (도 5 참조)
100 μM NMDA에 대한 계속적인 노출 전에 표시된 농도의 펩티드 또는 MK-801 로 30분 동안 전처리된 자매 배양물(sister cultures)에서, D-TAT-IB (일반식)(s)/D-JNKI1 펩티드 (서열 번호 12)의 신경보호 효과를 평가하였다. NMDA 처리 12 시간 후에, 5 μM의 D-TAT-IB (일반식)(s)/D-JNKI1로 전처리한 배양물에서, NMDA 노출에 기인한 퇴행성(degenerative) 변화가 대조군 이상의 유의미한 LDH 방출이 없는 것에 의하여 나타난 것과 같이 완전하게 억제되었다 (도 5). 뉴런의 형태적인 외관, 수 및 분포가 대조군과 식별할 수 없었다.
피질 뉴런의 배양( Cortical neuronal culture ). 생후 2일 된 쥐의 뇌로부터의 피질의 작은 조각들을 절개하고, 200 units의 파파인과 함께 30분 동안 34℃에서 이들을 배양한 다음, 100 μg/ml 폴리-D-리신으로 미리 피복된 디쉬 상에서 약 1 x 106 세포/플레이트의 밀도로 뉴런을 평판 배양하였다. 그 평판 배양 배지는 0.5 mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신으로 보충된 B27/Neurobasal (Life Technologies, Gaithersburg, MD)로 이루어진다.
락테이트 탈수소화 ( LDH ) 세포독성 분석. NMDA 투여 후 12, 24 및 48 시간에 그 배지로(bathing medium) 방출되는 LDH를 Cytotox 96 비방사성 세포독성 분석 키트 (Promega, WI)를 사용하여 측정하였다 (도 5 참조).
실시예 17: 올인원 웰 접근법( all - in one well approach )을 사용한 HepG2 세포에서 내인성 JNK 활성의 억제 (도 6 참조)
실험 전날 HepG2 세포를 3000 세포/웰로 접종하였다. 그 후, (a) 인터루킨-1β [IL-1β(ν)] 또는 종양 괴사 인자α [TNFα(●)] 중 하나의 농도를 증가시키면서 첨가하여 30분 동안 JNK를 활성화시켰다. 세포를 20 mM Hepes, 0.5% Tween pH 7.4 중에서 용해시키고, 알파스크린(AlphaScreen) JNK을 위해 가공하였다. (b) 10 ng/ml IL-1β에 의하여 유도되고, 384 웰/플레이트 (n=96)에서 측정된 JNK 활성에 대한 Z'. (c) 화학적 JNK 억제제 [스타우로스포린(○) 및 SP600125 (●)]로의 내인성 IL-1β-유도 JNK 활성의 억제. (d) IL-1α 의존적 JNK 활성에 대한, 서열 번호 9에 따른 펩티드 억제제 L-TAT-IB1(s)의 효과 (L-JNKi(ν)로 축약함), 서열 번호 11에 따른 D-TAT-IB1(s)의 효과 (D-JNKi(◆)로 축약함) 및 JBDs(●) (TAT 서열이 없는 L-JNKI에 상응함)의 효과. 모든 패널은 3개의 독립적인 실험 (n=3)을 대표한다.
방법: 알파스크린 ( alphascreen ) 키나아제 분석
원리: 알파스크린은 마이크로플레이트 포맷(microplate format)에서 생물분자(biomolecular) 상호작용을 연구하는데 사용되는 비방사성 비드에 기초한(non-radioactive bead-based) 기술이다. 두문자 ALPHA는 증폭된 발광 인접 동종 분석 (Amplified Luminescence Proximity Homogenous Assay)을 의미한다. 이것은 매우 근접하게 "도너(donor)"와 "억셉터(acceptor)" 비드를 가져오고, 그 후 화학적 반응의 연속 단계(cascade)가 증폭된 신호를 생성하도록 작용하는 생물학적 상호작용을 포함한다. 680 nm에서 레이저 여기(excitation)에 따라, "도너" 비드 중의 광감제 (프탈로시아닌)가 주위 산소를 여기된 싱글렛 상태로 전환시킨다. 4 μ초 반감기 내에, 그 싱글렛 산소 분자는 용액 내에서 약 200 nm까지 확산할 수 있고, 만약 "억셉터" 비드가 그와 근접하게 있는 경우, 상기 싱글렛 산소는 "억셉터" 비드 내의 티옥센(thioxene) 유도체와 반응하여, 370 nm의 화학 발광을 생성하고, 그 동일한 "억셉터" 비드 내에 함유된 형광단을 추가로 활성화시킨다. 이어서, 여기된 형광단은 520∼620 nm의 빛을 방출한다. 억셉터 비드가 없는 경우, 싱글렛 산소는 바닥 상태로 떨어지고, 신호를 생산하지 않는다.
키나아제 시약 (B-GST-cJun, 항 P-cJun 항체 및 활성 JNK3)을 키나아제 버퍼 (20 mM Tris-HCl pH 7.6, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 μM Na3VO4, 0.01% Tween-20)에서 1차 희석시키고, 웰에 첨가하였다 (15 μl). 그 후, 반응을 10 μM의 ATP 존재하에서 1 시간 동안 23℃에서 인큐베이션시켰다. 검출 버퍼 (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 20 mM NaCl, 80 mM EDTA, 0.3% BSA)에서 희석시킨 10 μl의 비드 혼합물 (단백질 A 억셉터 20 μg/ml 및 스트렙타비딘 도너 20 μg/ml)의 첨가에 의하여 검출을 수행한 다음, 다시 1시간 동안 암실에서 23℃로 인큐베이션시켰다. JNK 내인성(endogenous) 활성의 측정을 위하여, 활성 JNK3를 세포 용해물로 치환시키고, 반응 키나아제 성분을 세포 용해 후에 첨가한 것을 제외하고는, 전술한 바와 같이 키나아제 분석을 수행하였다. B-GST-cjun 및 P-cJun 항체를 동일한 농도로 사용하고, 반면 ATP는 10 μM 대신 50 μM로 사용하였다. 퓨전(Fusion) 또는 엔 비젼(En Vision) 장치에서 직접적으로 알파스크린 신호를 분석하였다.
실시예 18: 소음 외상의 치료(treatment of noise trauma)
D-TAT-IB1(s)를 소음 외상 (30분 동안 6 kHz로 120 dB) 30분 전에 또는 소음 외상 30분 또는 4시간 후에, 100 μM의 농도로, 2.6% 완충 히알루론산 (Hylumed, Genzyme Corp.)의 2 마이크로리터 겔 조성물에 함유시켜 3개 군의 기니피그 (각 군은 6마리의 동물로 이루어짐)의 달팽이관(cochlea)의 둥근 창 막(round window membrane)에 적용하였다. 대조군으로 처리되지 않은 귀를 제공하였다. 소음 외상 20분 후 (일시적 역치 변화, TTS) 및 상기 외상 15일 후 (영구적 역치 변화, PTS)에 청뇌간 반응(auditory brainstem response)의 측정에 의하여 가청 역치 변화(hearing threshold shifts)를 평가하였다. D-TAT-IB1(s)의 투여는 비처리 귀와 비교하여 과도한 소음에 노출된 후에 적용되는 경우에도 영구적 청력 상실에 대하여 보호를 하였다. 소음 외상 후 더 빨리 D-TAT-IB1(s)을 투여할수록 상기 보호 효과는 더 강하였다. 따라서, D-TAT-IB1(s)는 소음 외상의 경우에 있어서 매우 효과적인 청력보호(otoprotective) 화합물이다.
전술한 본 발명의 특정 실시 상태의 상세한 설명으로부터, 독특한 세포 투과성 생물활성 키메라 펩티드 및 JNK 억제제 서열이 설명되었다는 것이 명백하다. 비록, 특정 실시 상태들이 본 명세서에서 상세하게 기재되었기는 하나, 단지 설명의 목적을 위한 예시일 뿐이고, 이어질 첨부된 청구항의 범위에 대한 한정을 위해 의도된 것이 아니다. 특히, 청구항에 정의된 바와 같이, 본 발명의 사상과 범위로부터 벗어나지 않고 본 발명에 대한 다양한 치환, 변경 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 본 발명자에 의하여 고려된다.
<110> XIGEN S.A. <120> Cell-Permeable Peptide Inhibitors of the JNK signal transduction pathway <130> KP-CH-087912 <150> PCT/EP2005/009782 <151> 2005-09-12 <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide L-IB1(s) (see Table 1) <400> 1 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg 1 5 10 15 Ser Gln Asp <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide D-IB1(s) (see Table 1) <400> 2 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 15 Lys Pro Arg <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide L-IB (generic) (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> General formula: NH2-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-COOH, wherein X is any (native) amino acid residue, Xna is any amino acid residue except serine and threonine and Xnb may be any amino acid residue; <220> <221> repeat <222> (1)...(1) <223> Xaa is Xna-Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0 or 1 for Xna and 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> repeat <222> (18)...(18) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <400> 3 Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln 1 5 10 15 Asp Xaa <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide D-IB (generic) (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> General formula: NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-COOH, wherein X is any (native) amino acid residue, Xna is any amino acid residue except serine and threonine and Xnb may be any amino acid residue; <220> <221> repeat <222> (1)...(1) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> repeat <222> (18)...(18) <223> Xaa is Xna-Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0 or 1 for Xna and 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <400> 4 Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr Pro 1 5 10 15 Arg Xaa <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide L-TAT (see Table 1) <400> 5 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide D-TAT (see Table 1) <400> 6 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide L-generic-TAT (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> General formula: NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-COOH, wherein Xnb may be any amino acid residue; <220> <221> repeat <222> (1)...(4) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> repeat <222> (14)...(17) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <400> 7 Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide D-generic-TAT (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> General formula: NH2-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH, wherein Xnb may be any amino acid residue; <220> <221> repeat <222> (1)...(4) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> repeat <222> (14)...(17) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <400> 8 Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L-TAT-IB1 (s) (see Table 1) <400> 9 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Arg Pro Lys Arg 1 5 10 15 Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 20 25 30 <210> 10 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide L-TAT (generic) (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> General formula: NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-COOH, wherein X is any (native) amino acid residue, Xna is any amino acid residue except serine and threonine and Xnb may be any amino acid residue; <220> <221> repeat <222> (1)...(7) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> repeat <222> (17)...(21) <223> Xaa is Xna-Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0 or 1 for Xna and 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> repeat <222> (38)...(38) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <400> 10 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Gln Asp Xaa 35 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptid D-TAT-IB1 (s) (see Table 1) <400> 11 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 15 Lys Pro Arg Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly 20 25 30 <210> 12 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptid: D-TAT (generic) (s) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> General formula: NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH, wherein X is any (native) amino acid residue, Xna is any amino acid residue except serine and threonine and Xnb may be any amino acid; <220> <221> repeat <222> (1)...(7) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> repeat <222> (18)...(22) <223> Xaa is Xna-Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0 or 1 for Xna and 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <220> <221> repeat <222> (38)...(38) <223> Xaa is Xnb as defined in the general formula, wherein n is 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 or more for Xnb <400> 12 Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr Pro 1 5 10 15 Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 <210> 13 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide IB1-long (see Table 1) <400> 13 Pro Gly Thr Gly Cys Gly Asp Thr Tyr Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp Thr 20 25 <210> 14 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide IB2-long (see Table 1) <400> 14 Ile Pro Ser Pro Ser Val Glu Glu Pro His Lys His Arg Pro Thr Thr 1 5 10 15 Leu Arg Leu Thr Thr Leu Gly Ala Gln Asp Ser 20 25 <210> 15 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide derived from c-Jun (see Table 1) <400> 15 Gly Ala Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Asn Leu Lys Pro His 20 25 <210> 16 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide derived from ATF2 (see Table 1) <400> 16 Thr Asn Glu Asp His Leu Ala Val His Lys His Lys His Glu Met Thr 1 5 10 15 Leu Lys Phe Gly Pro Ala Arg Asn Asp Ser Val Ile Val 20 25 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide L-IB1 (see Table 1) <400> 17 Asp Thr Tyr Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln 1 5 10 15 Val Pro Arg Ser Gln Asp Thr 20 <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide D-IB1 (see Table 1) <400> 18 Thr Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro 1 5 10 15 Arg Lys Pro Arg Tyr Thr Asp 20 <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide L-IB (generic) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> X is selected from any (native) amino acid residue, <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> X is selected from serine or threonine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> X is selected from any (native) amino acid residue, <400> 19 Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln 1 5 10 15 Asp Xaa Xaa <210> 20 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide D-IB (generic) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> X is selected from any (native) amino acid residue, <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> X is selected from serine or threonine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(19) <223> X is selected from any (native) amino acid residue, <400> 20 Xaa Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr 1 5 10 15 Pro Arg Xaa <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide L-generic-TAT (see Table 1) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> X is selected from any (native) amino acid residue, <400> 21 Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide D-generic-TAT (see Table 1) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> X is selected from any (native) amino acid residue, <400> 22 Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 23 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide L-TAT-IB1 (see Table 1) <400> 23 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Asp Thr Tyr Arg 1 5 10 15 Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser 20 25 30 Gln Asp Thr 35 <210> 24 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide L-TAT (generic) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> X is selected from any (native) amino acid residue, <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> X is selected from serine or threonine <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> X is selected from any (native) amino acid residue, <400> 24 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Asp Xaa Xaa 35 40 <210> 25 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide D-TAT-IB1 (see Table 1) <400> 25 Thr Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro 1 5 10 15 Arg Lys Pro Arg Tyr Thr Asp Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys 20 25 30 Lys Arg Gly 35 <210> 26 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide D-TAT (generic) (see Table 1) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> X is selected from any (native) amino acid residue, <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> X is selected from serine or threonine; <220> <221> misc_feature <222> (3)..(42) <223> X is selected from any (native) amino acid residue, <400> 26 Xaa Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr 1 5 10 15 Pro Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg 20 25 30 Lys Lys Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe for Gel retardation assay (see Example 13) <400> 27 CGCTTGATGA GTCAGCCGGA A 21

Claims (23)

  1. 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 이루어진 JNK 억제제 펩티드.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 JNK 억제제 펩티드는 c-jun 아미노 말단 키나아제 (JNK)와 결합하는 것인 JNK 억제제 펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 JNK 억제제 펩티드가 JNK 발현 세포 내에 존재할 때, 1종 이상의 JNK 표적화 전사 인자의 활성화를 억제하는 것인 JNK 억제제 펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 JNK 표적화 전사 인자는 c-Jun, ATF2 및 Elk1으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 JNK 억제제 펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 JNK 억제제 펩티드는 그 펩티드가 JNK 발현 세포 내에 존재할 때, JNK 효과를 변경시키는 것인 JNK 억제제 펩티드.
  7. 공유 결합 또는 링커 서열을 통하여 결합된 제1 도메인 및 제2 도메인으로 이루어지고, 상기 제1 도메인은 수송 서열 (trafficking sequence)을 포함하며, 상기 제2 도메인은 제1항에 기재된 JNK 억제제 펩티드 서열로 이루어지는 것인 키메라 펩티드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 수송 서열은 인간 면역 결핍 바이러스 TAT 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 것인 펩티드.
  9. 제7항에 있어서, 상기 수송 서열은 서열 번호 5, 6, 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인 펩티드.
  10. 제7항에 있어서, 상기 수송 서열은 상기 펩티드의 세포 흡수를 증가시키는 것인 펩티드.
  11. 제7항에 있어서, 상기 수송 서열은 상기 펩티드의 핵 위치결정 (nuclear localization)을 지시하는 것인 펩티드.
  12. 삭제
  13. 제7항에 있어서, 상기 펩티드는 서열 번호 9 또는 11의 아미노산 서열로 이루어지는 것인 펩티드.
  14. 제1항, 제3항 내지 제11항, 제13항 중 어느 하나의 항에 기재된 펩티드를 코딩하는 분리된 핵산.
  15. 제14항에 기재된 핵산을 포함하는 벡터.
  16. 제15항에 기재된 벡터를 포함하는 세포.
  17. 제1항, 제3항 내지 제11항, 제13항 중 어느 하나의 항에 기재된 펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체.
  18. 제1항, 제3항 내지 제11항, 제13항 중 어느 하나의 항에 기재된 펩티드 또는 상기 펩티드를 코딩하는 분리된 핵산과, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 JNK의 활성화로부터 기인하는 질병 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 JNK의 활성화로부터 기인하는 질병은 폐, 유방, 림프계, 위장관 및 비뇨생식관의 악성 종양, 결장암, 신세포암종(腎細胞癌腫), 전립선암, 비소세포폐암(非小細胞肺癌), 소장암 및 식도암을 포함하는 선암종; 백혈병, Bcr-Abl 발암성 암; 건선, 심상성천포창, 베체트 증후군, 급성호흡곤란 증후군 (ARDS), 허혈성 심질환, 투석후 증후군, 류마티스 관절염, 후천성 면역 결핍 증후군, 혈관염 및 패혈성 쇼크; 재협착, 난청, 귀 외상, 허혈, 뇌졸중, 재관류 손상, 저산소증; 염증 유발성 사이토카인으로의 처리에 의한 2차 손상, 당뇨병, 심장 비후 및 동맥경화성 병변, 방사선치료에 사용되는 전리 방사선 및 자외선 (uv광)에 의한 손상, 화학요법 약물을 포함하는 DNA 손상 제제에 의한 손상, 저체온증 및 고열증, 염증, 자가염증, 면역 및 자가면역 질환, 근질환, 심근질환 및 이식편 거부 반응으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 제18항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 복막내, 코, 정맥내, 구강 및 패치 (patch) 전달로 이루어지는 군에서 선택되는 투여 경로에 의하여 투여되는 것인 조성물.
  22. (a) 펩티드의 발현을 위하여 제공되는 조건하에서 제1항, 제3항 내지 제11항, 제13항 중 어느 하나의 항에 기재된 펩티드를 코딩하는 분리된 핵산을 함유하는 세포를 배양하는 단계와,
    (b) 발현된 펩티드를 회수하는 단계
    를 포함하는 제1항, 제3항 내지 제11항, 제13항 중 어느 하나의 항에 기재된 펩티드를 제조하는 방법.
  23. 제1항, 제3항 내지 제11항, 제13항 중 어느 하나의 항에 기재된 펩티드 또는
    상기 펩티드를 코딩하는 분리된 핵산 또는
    상기 핵산을 포함하는 벡터 또는
    상기 벡터를 포함하는 세포 또는
    상기 펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 키트.
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