PT1928903E

PT1928903E - Inibidores peptídicos de permeação celular da via de transdução de sinal de jnk

Info

Publication number: PT1928903E
Application number: PT06792004T
Authority: PT
Inventors: Christophe Bonny
Original assignee: Xigen Sa
Priority date: 2005-09-12
Filing date: 2006-09-12
Publication date: 2012-07-02
Also published as: UA98101C2; EP3012266A1; NO20081664L; US20160264630A1; HK1118841A1; US20140200187A1; KR20080052586A; EP2418217B1; HRP20160379T1; SI2418217T1; PL2418217T3; EA200800680A1; ES2567708T3; CN101263157A; DK2418217T3; US20170320917A1; WO2007031280A3; US9290538B2; HK1223948A1; NO342272B1

Description

DESCRIÇÃO

"INIBIDORES PEPTÍDICOS DE PERMEAÇÃO CELULAR DA VIA DE TRANSDUÇÃO DE SINAL DE JNK" A presente invenção refere-se a inibidores de proteína cinase e, mais especificamente, a inibidores da proteína cinase c-Jun amino terminal cinase. Adicionalmente, a presente invenção proporciona sequências inibidoras de JNK, péptidos quiméricos, assim como composições farmacêuticas para o tratamento de patofisiologias associadas com a sinalização de JNK. A c-Jun amino terminal cinase (JNK) é um membro do grupo activado por stress de proteína cinases activadas por mitogénio (MAP). Estas cinases foram implicadas no controlo do crescimento e diferenciação celular e, mais genericamente, na resposta de células a estímulos ambientais. A via de transdução de sinal da JNK é activada em resposta a stress ambiental e pelo envolvimento de várias classes de receptores de superfície celular. Estes receptores podem incluir receptores de citocina, receptores em serpentina e receptores de tirosina cinases. Em células de mamíferos, a JNK foi implicada em processos biológicos, tais como transformação oncogénica e mediação de respostas adaptativas a stress ambiental. A JNK foi também associada com a modulação de respostas imunes, incluindo maturação e diferenciação de células imunes, assim como com a efectivação da morte celular programada em células identificadas para destruição pelo sistema imune. Esta propriedade singular torna a sinalização de JNK um alvo promissor para o desenvolvimento de intervenção farmacológica. Entre vários distúrbios neurológicos, a sinalização de JNK está 1 particularmente implicada no acidente vascular cerebral isquémico e na doença de Parkinson. Uma abordagem no combate a distúrbios fortemente relacionados com a sinalização de JNK é a provisão de inibidores da via de sinalização de JNK. Tais inibidores, como já sabido na técnica anterior, incluem particularmente, e. g., inibidores a montante da cinase (por exemplo, CEP-1347), inibidores quimicos pequenos de JNK (SP600125 e AS601245), os quais afectam directamente a actividade da cinase, e. g., por competição com o sitio de ligação de ATP da proteína cinase, e inibidores peptídicos da interacção entre JNK e os seus substratos (D-JNKI e I-JIP) (ver, e. g., Kuan et al., Current Drug Targets - CNS & Neurological Disorders, Fevereiro de 2005, vol. 4, N° 1, pp. 63-67(5)). O inibidor a montante da cinase CEP-1347 (KT7515) é um inibidor semi-sintético da família das cinases de linhagem mista. O CEP-1347 (KT7515) promove a sobrevivência neuronal a dosagens que inibem a activação das c-Jun amino terminal cinases (JNK) em culturas primárias embrionárias e células PC12 diferenciadas após retirada trófica e em murganhos tratados com l-metil-4-fenil-tetra-hidropiridina. Além disso, o CEP-1347 (KT7515) pode promover a sobrevivência a longo prazo de neurónios embrionários de pinto cultivados do gânglio espinal, simpático, ciliar e motor (ver, e. g., Borasio et ai., Neuroreport. 9(7): 1435-1439, 11 de Maio de 1998).

Verificou-se que o inibidor químico pequeno de JNK SP600125 reduz os níveis de fosforilação de c-Jun, para proteger neurónios dopaminérgicos de apoptose e para restaurar parcialmente o nível de dopamina na PD induzida por MPTP em murganhos C57BL/6N (Wang et al., Neurosci Res. Fev 2004; 48(2); 195-202). Estes resultados indicam, adicionalmente, que a via de JNK é o principal mediador dos efeitos neurotóxicos de MPTP 2 in vivo e a inibição da actividade de JNK pode representar uma nova e eficaz estratégia para tratar a PD.

Um exemplo adicional de inibidores químicos pequenos é o inibidor de JNK AS601245 acima mencionado. 0 AS601245 inibe a via de sinalização de JNK e promove a sobrevivência celular após isquemia cerebral. In vivo, o AS601245 proporcionou protecção significativa contra a perda retardada de neurónios CAI do hipocampo num modelo de isquemia global transiente em gerbos. Este efeito é mediado por inibição de JNK e, deste modo, por expressão e fosforilação de c-Jun (ver, e. g., Carboni et al., J Pharmacol Exp Ther. Jul de 2004; 310 (1):25-32. Epub em 16 de Fevereiro de 2004) .

Uma terceira classe de inibidores da via de sinalização de JNK representa inibidores peptídicos da interacção entre JNK e os seus substratos, como acima mencionado. Como ponto de partida para a construção de tais péptidos inibidores de JNK, pode ser utilizado um alinhamento de sequências de proteínas naturais de JNK. Tipicamente, estas proteínas compreendem domínios de ligação a JNK (GBD) e ocorrem em várias proteínas de ligação a insulina (IB), tais como IB1 ou IB2. Os resultados de um tal alinhamento de sequências exemplificativo são, e. g., um alinhamento de sequências entre os domínios de ligação de JNK de IB1 [SEQ ID N° : 13], IB2 [SEQ ID N° : 14], c-Jun [SEQ ID N° : 15] e ATF2 [SEQ ID N°: 16] (ver, e. g., FIG. 1A-1C). Um tal alinhamento revela uma sequência de 8 aminoácidos parcialmente conservada (ver, e. g., FIG. IA) . Uma comparação dos JBD de IB1 e IB2 revela ainda dois blocos de sete e três aminoácidos que são altamente conservados entre as duas sequências.

As sequências construídas na base de tal alinhamento são, e. g., divulgadas no documento WO 01/27268. Particularmente, o 3 documento WO 01/27268 divulga péptidos de fusão pequenos de permeação celular, compreendendo a denominada sequência de permeação celular TAT derivada da sequência básica de tráfico da proteína HIV-TAT e uma sequência inibidora mínima de 20 aminoácidos de IBI. Ambos os componentes estão ligados covalentemente entre si. Os inibidores exemplificativos (e presentemente os únicos) da via de sinalização de MAPK-JNK divulgados no documento WO 01/27268 são, e. g., o L-JNKI1 (péptido inibidor de JNK composto de L aminoácidos) ou os péptidos D-JNKI1 resistentes a protease (péptido inibidor de JNK composto de D aminoácidos não nativos). Estes péptidos inibidores de JNK (JNKI) são específicos para JNK (JNK1, JNK2 e JNK3). Em contraste com aqueles compostos pequenos inibidores como acima discutidos, as sequências de inibidor no documento WO 01/27268, e. g., JNKI1, inibem mais exactamente a interacção entre JNK e o seu substrato. Pela sua sequência de tráfico derivada de TAT, o péptido de fusão é transportado eficientemente para dentro das células. Devido às novas propriedades obtidas pelo componente de tráfico, os péptidos de fusão são activamente transportados para dentro das células, onde permanecem eficazes até degradação proteolítica.

Contudo, os péptidos de acordo com o documento WO 01/27268 estão ainda facilmente acessíveis por fosforilases (cinases). Qualquer aminoácido de um péptido que sirva como um alvo para cinases e, deste modo, possa ser submetido a fosforilação, representa um factor importante para a inactivação de tais péptidos. Deste modo, é um primeiro objectivo da presente invenção proporcionar novas sequências de inibidor para a via de sinalização de JNK, as quais retêm as propriedades funcionais dos péptidos como divulgados no documento WO 01/27268, mas proporcionam estabilidade aumentada para fosforilases (cinases). 4

Além disso, as sequências de inibidor de acordo com o documento WO 01/27268 requerem um dispendioso passo de recuperação e purificação, particularmente se preparadas em quantidades a grande escala (e. g., para produção industrial).

Assim, é um segundo objectivo da presente invenção proporcionar sequências de inibidor que permitem uma produção e recuperação mais fáceis e mais eficientes em termos de custos, do que aquelas do estado da técnica.

Estes objectivos são resolvidos por uma sequência inibidora de JNK consistindo na sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID N°: 2.

De um modo preferido, a sequência inibidora de JNK da invenção liga-se a JNK e/ou inibe a activação de, pelo menos, um factor de transcrição activado por JNK, e. g. , c-Jun ou ATF2 (ver, e. g., SEQ ID N°: 15 e 16, respectivamente) ou Elkl.

A sequência inibidora de JNK da invenção é composta exclusivamente de D-aminoácidos. A sequência inibidora de JNK invenção composta de D-aminoácidos é uma sequência retro-inversa D não nativa de uma sequência inibidora de JNK (nativa). A expressão "sequência retro-inversa" refere-se a um isómero de uma sequência linear de péptido em que o sentido da sequência é invertido e a quiralidade de cada resíduo de aminoácido é invertida (ver, e. g., Jameson et al., Nature, 368, 744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994)). A vantagem de combinar D-enantiómeros e síntese inversa é que as posições dos grupos carbonilo e amino em cada ligação amida são trocadas, enquanto a posição dos grupos da cadeia lateral em cada carbono alfa é preservada. Salvo referência específica em contrário, pensa-se que qualquer sequência ou péptido de L-aminoácidos dados de acordo com a presente invenção podem ser 5 convertidos numa sequência ou péptido retro-inversos D por síntese de um inverso da sequência ou péptido para a sequência ou péptido de L-aminoácido nativo correspondente.

As sequências retro-inversas D como acima definidas, têm uma variedade de propriedades úteis. Por exemplo, as sequências retro-inversas D da invenção entram nas células tão eficientemente quanto sequências de L-aminoácidos de acordo com a presente invenção, enquanto as sequências retro-inversas D da invenção são mais estáveis do que as sequências de L-aminoácidos correspondentes. A sequência inibidora de JNK da invenção consiste de uma sequência retro-inversa D de acordo com a sequência de aminoácidos NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH [SEQ ID N°: 2]. A sequência inibidora de JNK da invenção como acima divulgada é apresentada na Tabela 1 (SEQ ID N°: 2) . A tabela apresenta o nome das sequências inibidoras de JNK da invenção, assim como o seu número identificador de sequência, o seu comprimento e a sequência de aminoácidos. Adicionalmente, as sequências da técnica anterior de acordo com o documento WO 01/27268 (SEQ ID N°: 17-26) são também apresentadas para fins comparativos. Para declinar responsabilidades estas sequências da técnica anterior não são aqui divulgadas como sequências inibidoras de JNK da invenção ou péptidos quiméricos da invenção e estão, deste modo, explicitamente excluídas do âmbito da presente invenção.

As sequências inibidoras de JNK consistindo de SEQ ID N°: 1, 3 e 4 não estão no âmbito da presente invenção. 6 TABELA 1

NOME DA SEQUÊNCIA/PÉPTIDO SEQ ID N° AA SEQUÊNCIA L-IB1 1 19 RPKRPTTLNL FPQVPRSQD (NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH) D-IB1 2 19 DQSRPVQPFL NLTTPRKPR (NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH) L-IB (genérico) 3 18 XRPTTLXLXX XXXXXQDX (NH2-X„b-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-COOH) D-IB (genérico) 4 18 XDQXXXXXXX LXLTTPRX (NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-COOH) L-TAT 5 10 GRKKRRQRRR (NH2 -GRKKRRQRRR-COOH) D-TAT 6 10 RRRQRRKKRG (NH2-RRRQRRKKRG-COOH) L-genérico-TAT 7 17 XXXXRKKRRQ RRRXXXX (NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-COOH) D-genérico-TAT 8 17 XXXXRRRQRR KKRXXXX (NH2-Xnb-RRRQRRKKR-X„b-COOH) L-TAT-IB1 9 31 GRKKRRQRRR PPRPKRPTTL NLFPQVPRSQ D (NH2-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH) L-TAT-IB (genérico) 10 38 XXXXXXXRKK RRQRRRXXXX XRPTTLXLXX XXXXXQDX (NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-COOH) D-TAT-IB1 Π 31 DQSRPVQPFL NLTTPRKPRP PRRRQRRKKR G (NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH) D-TAT-IB (genérico) 12 38 XDQXXXXXXX LXLTTPRXXX XXRRRQRRKK RXXXXXXX (NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH) IBI-longo 13 29 PGTGCGDTYR PKRPTTLNLF PQVPRSQDT IB2-longo 14 27 IPSPSVEEPH KHRPTTLRLT TLGAQDS c-Jun 15 29 GAYGYSNPKI LKQSMTLNLA DPVGNLKPH ATF2 16 29 TNEDHLAVHK HKHEMTLKFG PARNDSVIV L-IB1 17 23 DTYRPKRPTT LNLFPQVPRS QDT D-IB1 18 23 TDQSRPVQPF LNLTTPRKPR YTD L-IB (genérico) 19 19 XRPTTLXLXX XXXXXQDS/TX D-IB (genérico) 20 19 XS/TDQXXXXXX XLXLTTPRX L-genérico-TAT 21 17 XXXXRKKRRQ RRRXXXX D-genérico-TAT 22 17 XXXXRRRQRR KKRXXXX L-TAT-IB1 23 35 GRKKRRQRRR PPDTYRPKRP TTLNLFPQVP RSQDT L-TAT-IB (genérico) 24 42 XXXXXXXRKK RRQRRRXXXX XXXXRPTTLX LXXXXXXXQD S/TX D-TAT-IB1 25 35 TDQSRPVQPF LNLTTPRKPR YTDPPRRRQR RKKRG D-TAT-IB (genérico) 26 42 XT/SDQXXXXXX XLXLTTPRXX XXXXXXRRRQ RRKKRXXXXX XX (Na Tabela 1, as sequências exemplificativas, assim como as suas fórmulas genéricas são apresentadas para SEQ ID N° : 1, 2, 5, 6, 9 e 11 e SEQ ID N°: 3, 4, 7, 8, 10 e 12, respectivamente) 7

Qualquer dos péptidos aqui divulgados pode ter uma modificação no seu terminal, seja no terminal C ou N, ou em ambos. 0 terminal C pode, de um modo preferido, ser modificado por uma modificação de amida, enquanto o terminal N pode ser modificado por qualquer grupo protector de NH2 adequado, tal como, e. g., acilação. A este respeito, "um aminoácido modificado" pode ser qualquer aminoácido que esteja alterado, e. g., por glicosilação diferente em vários organismos, por fosforilação ou por marcação de aminoácidos específicos. Tal marcador é então tipicamente seleccionado do grupo de marcadores compreendendo: (i) marcadores radioactivos, i. e., fosforilação radioactiva ou um marcador radioactivo com enxofre, hidrogénio, carbono, azoto, etc.; (ii) pigmentos coloridos (e. g., digoxigenina, etc.); (iii) grupos fluorescentes (e. g., fluoresceina, etc.); (iv) grupos quimioluminescentes; (v) grupos para imobilização numa fase sólida (e. g., His-tag, biotina, strep-tag, flag-tag, anticorpos, antigénio, etc.); e (vi) uma combinação de marcadores de dois ou mais dos marcadores mencionadas em (i) a (v).

As sequências inibidoras de JNK de acordo com a presente invenção podem ser obtidas ou produzidas por métodos bem conhecidos na técnica, e. g., por síntese química ou por métodos de engenharia genética como discutidos abaixo. Por exemplo, um péptido que corresponde a uma porção de uma sequência inibidora de JNK da invenção, incluindo uma região desejada da referida sequência inibidora de JNK, ou que medeia a desejada actividade in vitro ou in vivo, pode ser sintetizada através da utilização de um sintetizador de péptidos.

De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um péptido quimérico consistindo de um primeiro domínio e um segundo domínio, em que o primeiro domínio compreende uma sequência de tráfico, enquanto o segundo domínio consiste de uma sequência inibidora de JNK da invenção como acima definido, e em que o primeiro domínio está ligado à extremidade do terminal C do segundo domínio

Tipicamente, os péptidos quiméricos de acordo com a presente invenção têm um comprimento de, pelo menos, 25 resíduos de aminoácidos, e. g., 25 a 250 resíduos de aminoácidos, de um modo mais preferido, 25 a 200 resíduos de aminoácidos, de um modo ainda mais preferido, 25 a 150 resíduos de aminoácidos, 25 a 100 e, de um modo muito preferido, 25 a 50 resíduos de aminoácidos.

Como um primeiro domínio, o péptido quimérico da invenção compreende, de um modo preferido, uma sequência de tráfico, o qual é tipicamente seleccionado de qualquer sequência de aminoácidos que dirige um péptido (no qual está presente) a um destino celular desejado. Assim, a sequência de tráfico, como aqui utilizada, dirige tipicamente o péptido através da membrana plasmática, e. g., de fora da célula, através da membrana plasmática e para o citoplasma. Alternativamente ou adicionalmente, a sequência de tráfico pode direccionar o péptido a uma localização desejada dentro da célula, e. g., o núcleo, o ribossoma, o retículo endoplasmático (ER), um 9 lisossoma ou um peroxissoma, através, e. g., da combinação de dois componentes (e. g., um componente para a permeabilidade celular e um componente para a localização nuclear) ou através de um único componente que tem, e. g., propriedades de transporte através da membrana celular e seja direccionado, e. g., transporte intranuclear. A sequência de tráfico pode adicionalmente compreender um outro componente, que é capaz de ligação a um componente citoplasmático ou qualquer outro componente ou compartimento da célula (e. g., retículo endoplasmático, mitocôndria, aparelho de Golgi, vesiculas lisossomais). Desta forma, e. g., a sequência de tráfico do primeiro domínio e a sequência inibidora de JNK do segundo domínio podem estar localizados no citoplasma ou qualquer outro compartimento celular. Isto permite determinar a localização do péptido quimérico na célula após incorporação.

De um modo preferido, a sequência de tráfico (sendo incluída no primeiro domínio do péptido quimérico da invenção) tem um comprimento de 5 a 150 aminoácidos, de um modo mais preferido, um comprimento de 5 a 100 e, de um modo muito preferido, um comprimento desde 5 a 50, 5 a 30 ou mesmo 5 a 15 aminoácidos.

De um modo mais preferido, a sequência de tráfico (contida no primeiro dominio do péptido quimérico da invenção) pode ocorrer como uma região contínua de sequência de aminoácidos no primeiro domínio. Alternativamente, a sequência de tráfico no primeiro domínio pode estar dividida em dois ou mais fragmentos, em que qualquer destes fragmentos se assemelha à sequência de tráfico completa e podem estar separados uns dos outros por 1 a 10, de um modo preferido, 1 a 5 aminoácidos, desde que a sequência de tráfico como tal retenha as suas propriedades de transporte, como acima divulgado. Estes aminoácidos que separam os fragmentos da sequência de tráfico podem, e. g., ser 10 seleccionados de sequências de aminoácidos que diferem da sequência de tráfico. Alternativamente, o primeiro domínio pode conter uma sequência de tráfico composta por mais que um componente, cada componente com a sua própria função para o transporte da carga de sequência inibidora JNK do segundo domínio para, e. g., um compartimento celular específico. A sequência de tráfico como acima definida pode ser composta de L-aminoácidos, D-aminoácidos ou de uma combinação de ambos. De um modo preferido, as sequências de tráfico da invenção compreendem, pelo menos 1, de um modo preferido, pelo menos 3, de um modo mais preferido, pelo menos 6 e, de um modo ainda mais preferido, pelo menos 10 L-aminoácidos e/ou D-aminoácidos, em que os L- e/ou D-aminoácidos podem estar organizados nas sequências de tráfico de JNK da invenção de uma forma em bloco, não bloco ou outra alternativa.

De acordo com uma forma de realização alternativa, a sequência de tráfico do péptido quimérico da invenção pode ser composta exclusivamente de L-aminoácidos. De um modo mais preferido, a sequência de tráfico do péptido quimérico da invenção compreende ou consiste de, pelo menos, uma sequência de tráfico "nativa" como acima definida. Neste contexto, o termo "nativa" refere-se a sequências de tráfico não alteradas, totalmente compostas de L-aminoácidos.

De acordo com outra forma de realização alternativa, a sequência de tráfico do péptido quimérico da invenção pode ser composta exclusivamente de D-aminoácidos. De um modo mais preferido, a sequência de tráfico do péptido quimérico da invenção pode compreender um péptido retro-inverso D das sequências como acima apresentadas. 11 A sequência de tráfico do primeiro domínio do péptido quimérico da invenção pode ser obtida a partir de fontes naturais ou pode ser produzida por utilização de técnicas de engenharia genética ou síntese química (ver, e. g., Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual. 2a edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I.).

As fontes para a sequência de tráfico do primeiro domínio que podem ser utilizadas incluem, e. g., proteínas nativas, tais como, e. g., a proteína TAT (e. g., como descrita nas patentes U.S. N° 5804604 e 567498), VP22 (descrita, e. g., no documento WO 97/05265; Elliott e 0'Hare, Cell 88: 223-233 (1997)), proteínas não virais (Jackson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10691-10695 (1992)), sequências de tráfico derivadas de

Antennapedia (e. g., a sequência transportadora de Antennapedia) ou a partir de péptidos básicos, e. g., péptidos que têm um comprimento de 5 a 15 aminoácidos, de um modo preferido, 10 a 12 aminoácidos e compreendendo, pelo menos, 80%, de um modo mais preferido, 85% ou mesmo 90% de aminoácidos básicos, tais como, e. g., arginina, lisina e/ou histidina. Além disso, são aqui divulgadas variantes, fragmentos e derivados de uma das proteínas nativas utilizadas como sequências de tráfico. No que se refere a variantes, fragmentos e derivados faz-se referência à definição apresentada acima para as sequências inibidoras de JNK. As variantes, fragmentos, assim como derivados são correspondentemente definidos como apresentado acima para as sequências inibidoras de JNK. Particularmente, no contexto da sequência de tráfico, uma variante ou fragmento ou derivado podem ser definidos como uma sequência que partilha uma identidade de sequência com uma das proteínas nativas utilizadas como sequências de tráfico, como acima definidas, de, pelo menos, cerca de 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou mesmo 99%. 12

Numa forma de realização preferida do péptido quimérico da invenção, a sequência de tráfico do primeiro domínio compreende ou consiste de uma sequência derivada da proteína TAT do vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV), particularmente alguns ou a totalidade dos 86 aminoácidos que formam a proteína TAT.

Para uma sequência de tráfico da invenção, podem ser utilizadas sequências parciais da proteína TAT de tamanho total que formem um fragmento funcionalmente eficaz de uma proteína TAT, i. e., um péptido TAT que inclui a região que medeia a entrada e a incorporação em células. Se tal sequência é ou não um fragmento funcionalmente eficaz da proteína TAT, pode ser determinado utilizando técnicas conhecidas (ver, e. g., Flanked et al., Proc. Natl. Acad. Sei, USA 86: 7397-7401 (1989)). Assim, a sequência de tráfico no primeiro domínio do péptido quimérico da invenção pode ser derivada de um fragmento ou porção funcionalmente eficaz de uma sequência da proteína TAT que compreenda menos de 86 aminoácidos e que apresente incorporação em células e, opcionalmente, incorporação no núcleo da célula.

De um modo mais preferido, é pretendido que as sequências parciais (fragmentos) de TAT a serem utilizadas como transportador, para mediar a permeação do péptido quimérico através da membrana celular, compreendam a região básica (aminoácidos 48 a 57 ou 49 a 57) de TAT de tamanho total.

De acordo com uma forma de realização mais preferida, a sequência de tráfico da invenção pode compreender ou consistir de uma sequência de aminoácidos contendo os resíduos TAT de 48-57 ou 49 a 57 e, de um modo muito preferido, uma sequência de TAT genérica NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-COOH [SEQ ID N° : 7], em que Xnb é como acima definido. Alternativamente, a sequência de tráfico da invenção pode compreender ou consistir de um péptido 13 contendo, e. g., a sequência de aminoácidos NH2-GRKKRRQRRR-COOH [SEQ ID N°: 5].

De acordo com outra forma de realização mais preferida, a sequência de tráfico da invenção pode compreender um péptido retro-inverso D das sequências como acima apresentadas, i. e., a sequência retro-inversa D da sequência de TAT genérica que tem a sequência NH2-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH [SEQ ID N° : 8]. Também aqui, Xnb é como acima definido (de um modo preferido, representando D-aminoácidos). Além disso, o número de resíduos "Xnb" em qualquer SEQ ID N°:7-8 não está limitado a esse descrito e pode variar como acima descrito. De um modo muito preferido, a sequência de tráfico da invenção pode compreender a sequência retro-inversa D NH2-RRRQRRKKRG-COOH [SEQ ID N°: 6] .

De acordo com outra forma de realização, a sequência de tráfico da invenção pode compreender ou consistir de variantes das sequências de tráfico como acima definidas. Uma "variante de uma sequência de tráfico" é, de um modo preferido, uma sequência derivada de uma sequência de tráfico como acima definida, em que a variante compreende uma modificação, por exemplo, adição, deleção (interna) (que conduz a fragmentos) e/ou substituição de, pelo menos, um aminoácido presente na sequência de tráfico como acima definida. Tal modificação, ou modificações, compreende tipicamente 1 a 20, de um modo preferido, 1 a 10 e, de um modo mais preferido, 1 a 5 substituições, adições e/ou deleções de aminoácidos. Além disso, a variante apresenta, de um modo preferido, uma identidade de sequência com a sequência de tráfico como acima definida, de um modo mais preferido, com qualquer SEQ ID N°: 5 a 8 de, pelo menos, cerca de 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou mesmo 99%. 14

De um modo preferido, tal modificação da sequência de tráfico conduz a uma sequência de tráfico com estabilidade aumentada ou diminuída. Alternativamente, podem ser concebidas variantes da sequência de tráfico para modular a localização intracelular do péptido quimérico da invenção. Quando adicionadas exogenamente, tais variantes como acima definidas são tipicamente concebidas de modo que seja retida a capacidade da sequência de tráfico para entrar na célula (i. e., a incorporação da variante da sequência de tráfico na célula é substancialmente semelhante àquela da proteína nativa que utiliza a sequência de tráfico). Por exemplo, a alteração da região básica que se pensa ser importante para a localização nuclear (ver, e. g., Dang e Lee, J. Biol. Chem. 264: 18019-18023 (1989); Hauber et al., J. Virol. 63 : 1181-1187 (1989); et al., J. Virol. 63: 1-8 (1989)) pode resultar num localização citoplasmática ou localização parcialmente citoplasmática da sequência de tráfico e, deste modo, da sequência inibidora de JNK como componente do péptido quimérico da invenção. Além do acima, podem ser introduzidas modificações adicionais na variante, e. g., por ligação, e. g., de colesterol ou outras unidades lipídicas à sequência de tráfico para produzir uma sequência de tráfico que tem uma solubilidade na membrana aumentada. Quaisquer das variantes das sequências de tráfico da invenção divulgadas acima podem ser produzidas utilizando técnicas tipicamente conhecidas de um especialista (ver, e. g., Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual. 2a edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I.).

Como um segundo domínio, o péptido quimérico da invenção compreende tipicamente uma sequência inibidora de JNK da invenção, como definida acima. 15

Ambos os domínios, i. e., o primeiro e segundo domínio, (s) do péptido quimérico da invenção, podem ser ligados de tal modo para formar uma unidade funcional. Qualquer método para ligar o primeiro e segundo domínio como geralmente conhecido na técnica pode ser aplicado.

De acordo com uma forma de realização, o primeiro e segundo domínios do péptido quimérico da invenção estão, de um modo preferido, ligados através de uma ligação covalente. Uma ligação covalente, como aqui definida, pode ser, e. g., uma ligação peptídica, que pode ser obtida através da expressão da proteína quimérica da invenção como uma proteína de fusão. As proteínas de fusão, como aqui descritas, podem ser formadas e utilizadas de modos análogos ou prontamente adaptáveis a partir de técnicas convencionais de ADN recombinante, como descritas abaixo. Contudo, ambos os domínios podem também ser ligados através de cadeias laterais ou podem ser ligados através de uma unidade química de ligante. 0 primeiro e/ou segundo domínios do péptido quimérico da invenção podem ocorrer em uma ou mais cópias no péptido quimérico da invenção. Se ambos os domínios estiverem presentes numa única cópia, o primeiro domínio está ligado à extremidade do terminal C do segundo domínio. 0 segundo domínio pode estar presente em múltiplas cópias, e. g., em duas, três ou mais cópias, e o primeiro domínio pode estra presente numa única cópia.

De um modo preferido, o primeiro e segundo domínios podem estar ligados directamente um ao outro sem qualquer ligante. Alternativamente, podem estar ligados um ao outro através de uma sequência ligante compreendendo 1 a 10, de um modo preferido, 1 a 5 aminoácidos. Os aminoácidos que formam a sequência ligante 16 são seleccionados, de um modo preferido, de glicina ou prolina, como resíduos de aminoácidos. De um modo mais preferido, o primeiro e segundo domínios podem estar separados através de uma charneira de dois, três ou mais resíduos de prolina, entre o primeiro e segundo domínios. 0 péptido quimérico da invenção como definido acima, consiste de um primeiro e de um segundo domínio, pode ser composto de D-aminoácidos ou de uma combinação de L- e D-aminoácidos. Aí, o primeiro domínio (assim como os ligantes utilizados) pode ser composto de L-aminoácidos, D-aminoácidos ou uma combinação de ambos (e. g.f D-TAT e L-IB1 ou L-TAT e D-IB1, etc.) . De um modo preferido, o péptido quimérico da invenção compreende, pelo menos 1, de um modo preferido, pelo menos 3, de um modo mais preferido, pelo menos 6 e, de um modo ainda mais preferido, pelo menos 10 L-aminoácidos e/ou D-aminoácidos, em que os D- e/ou L-aminoácidos podem estar organizados no péptido quimérico da invenção de uma forma em bloco, não bloco ou outra alternativa.

De acordo com uma forma de realização específica, o péptido quimérico da invenção compreende ou consiste de péptidos quiméricos de D-aminoácidos de acordo com o péptido TAT-IB1 [NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH, SEQ ID N° : 11]. Contudo, a porção de ligação do primeiro e segundo domínios (em vez de PP) pode ser composta de - Xna-Xnb“/· que é como definida acima. O primeiro e segundo domínios do péptido quimérico da invenção como acima definido, podem ser ligados um ao outro por acoplamento químico ou bioquímico, realizado de qualquer forma adequada conhecida na técnica, e. g., por estabelecimento de uma ligação peptídica entre o primeiro e o segundo domínios, e. g., 17 por expressão do primeiro e segundo domínios como uma proteína de fusão ou, e. g., por reticulação do primeiro e segundo domínios do péptido quimérico da invenção.

Muitos métodos de reticulação química conhecidos são não específicos, i. e., não direccionam o ponto de acoplamento a nenhum local particular no polipéptido transportador ou macromolécula de carga. Como resultado, a utilização de agentes de reticulação não específicos podem atacar locais funcionais ou bloquearem estericamente sítios activos, tornando as proteínas conjugadas biologicamente inactivas. Assim, de um modo preferido, tais métodos de reticulação são utilizados, os quais permitem um acoplamento mais específico do primeiro e segundo domínios.

Uma forma de aumentar a especificidade do acoplamento é um acoplamento químico directo a um grupo funcional presente apenas uma vez ou algumas vezes em um ou ambos o primeiro e segundo domínios a serem reticulados. Por exemplo, a cisteína, a qual é o único aminoácido proteico contendo um grupo tiol, ocorre em muitas proteínas apenas algumas vezes. Também, por exemplo, se um polipéptido não contiver resíduos de lisina, um reagente de reticulação específico para aminas primárias será selectivo para o terminal amino desse polipéptido. A utilização bem-sucedida desta abordagem para aumentar a especificidade do acoplamento requer que o polipéptido tenha os resíduos reactivos e raros apropriadamente nas áreas da molécula que podem ser alteradas sem perda da actividade biológica da molécula.

Os resíduos de cisteína podem ser substituídos quando ocorrem em partes de uma sequência polipeptídica onde a sua participação numa reacção de reticulação poderia, caso contrário, provavelmente interferir com a actividade biológica. 18

Quando um resíduo de cisteína é substituído, é tipicamente desejável minimizar as alterações resultantes no enrolamento do polipéptido. As alterações no enrolamento do polipéptido são minimizadas quando a substituição é química e estericmente semelhante à cisteína. Para estas razões, a serina é preferida como uma substituição para a cisteína. Como demonstrado nos exemplos abaixo, um resíduo de cisteína pode ser introduzido na sequência de aminoácidos de um polipéptido para fins de reticulação.

Quando um resíduo de cisteína é introduzido, a introdução no ou perto do terminal amino ou carboxilo é preferida. Estão disponíveis métodos convencionais para tais modificações da sequência de aminoácidos, em que o polipéptido de interesse é produzido por síntese química ou através de expressão de ADN recombinante. 0 acoplamento do primeiro e segundo domínios pode também ser realizado através de um agente de acoplamento ou conjugação. Existem vários reagentes de reticulação intermolecular que podem ser utilizados (ver, por exemplo, Means e Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, pp. 39-43) . Entre estes reagentes estão, por exemplo, o propionato de 3-(2-piridilditio)-N-succinimidilo (SPDP) ou N,N'-(1,3-fenileno)-bismaleimida (ambos os quais são altamente específicos para grupos sulfidrílicos e formam ligações irreversíveis); N,N'-etileno-bis-(iodoacetamida) ou outro reagente destes que tem pontes de metileno com 6 a 11 carbonos (que são relativamente específicas para grupos sulfidrílicos); e 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno (que formam ligações irreversíveis com grupos amino e tirosina). Outros reagentes de reticulação úteis para este fim incluem: p,p'-difluoro-m,m'-dinitrodifenilsulfona que forma ligações irreversíveis com os 19 grupos amino e fenólico); adipimidato de dimetilo (que é específico para grupos amino); disulfonilcloreto de fenol-1,4 (que reage principalmente com grupos amino); hexametilenodiisocianato ou diisotiocianato, ou azofenil-p-diisocianato (que reage principalmente com grupos amino); glutaraldeído (que reage com várias cadeias laterais diferentes) e disdiazobenzidina (que reage principalmente com tirosina e histidina).

Os reagentes de reticulação podem ser homobifuncionais, i. e., tem dois grupos funcionais que são objecto da mesma reacção. Um reagente de reticulação homobifuncional preferido é a bismaleimido-hexano ("BMH"). A BMH contém dois grupos funcionais de maleimida, os quais reagem especificamente com compostos contendo sulfidrilo sob condições suaves (pH 6,5-7,7). Os dois grupos de maleimida estão ligados através de uma cadeia hidrocarbonatada. Deste modo, a BMH é útil para reticulação irreversível de polipéptidos que contêm resíduos de cisteína.

Os reagentes de reticulação podem também ser heterobifuncionais. Os agentes de reticulação heterobifuncionais têm dois grupos funcionais diferentes, por exemplo, um grupo reactivo a amina e um grupo reactivo a tiol que irão reticular duas proteínas que têm aminas e tióis livres, respectivamente.

Os exemplos de agentes de reticulação heterobifuncionais são 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato ("SMCC"), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida ("MBS") e 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimida ("SMPB"), um análogo de MBS de cadeia prolongada. 0 grupo succinimidilo destes agentes de reticulação reage com uma amina primária e a maleimida reactiva a tiol forma uma ligação covalente com o tiol de um resíduo de cisteína. 20

Os reagentes de reticulação têm frequentemente baixa solubilidade em água. Uma unidade hidrofílica, tal como um grupo sulfonato, pode ser adicionada ao reagente de reticulação para melhorar a sua solubilidade em água. A este respeito, Sulfo-MBS e Sulfo-SMCC são exemplos de reagentes de reticulação modificados para solubilidade em água que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção.

Muitos reagentes de reticulação produzem um conjugado que é essencialmente não clivável sob condições celulares. Contudo, alguns reagentes de reticulação contêm uma ligação covalente, tal como um dissulfureto que é clivável sob condições celulares. Por exemplo, o reagente de Traut, ditiobis(succinimidilpropionato) ("DSP"), e 3-(2-piridilditio)-propionato de N-succinimidilo ("SPDP") são agentes de reticulação cliváveis bem conhecidos. A utilização de um reagente de reticulação clivável permite que a unidade de carga se separe do polipéptido transportador após distribuição na célula alvo. A ligação dissulfureto directa pode também ser útil.

Numerosos reagentes de reticulação, incluindo aqueles discutidos acima, estão comercialmente disponíveis. As instruções detalhadas para a sua utilização estão prontamente disponíveis a partir de fornecedores comerciais. Uma referência geral sobre reticulação de proteínas e preparação de conjugados é: Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press (1991) . A reticulação química pode incluir a utilização de braços espaçadores. Os braços espaçadores proporcionam flexibilidade intramolecular ou ajustam as distâncias intramoleculares entre unidades conjugadas e, desse modo, podem ajudar a preservar a 21 actividade biológica. Um braço espaçador pode ser na forma de uma unidade polipeptidica que inclua aminoácidos espaçadores, e. g., prolina. Alternativamente, um braço espaçador pode ser parte do reagente de reticulação, tal como em "long-chain SPDP" (Pierce Chem. Co., Rockford, IL., N° de cat. 21651 H) .

As sequências inibidoras de JNK e/ou os péptidos quiméricos da invenção, assim como, os seus fragmentos, variantes ou derivados, podem ser utilizados como imunogénios para produzir anticorpos que se ligam imunoespecificamente a estes componentes peptidicos. Tais anticorpos incluem, e. g., policlonais, monoclonais, quiméricos, de cadeia simples, fragmentos Fab e uma biblioteca de expressão de Fab. Vários processos conhecidos na técnica podem ser utilizados para a produção destes anticorpos.

As sequências inibidoras de JNK da invenção e/ou os péptidos quiméricos da invenção podem ser formulados em composições farmacêuticas, também aqui abrangidas. Estas composições podem compreender, além de uma destas substâncias, um excipiente, veiculo, tampão, estabilizador farmaceuticamente aceitáveis ou outros materiais bem conhecidos dos especialistas na técnica. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente activo. A natureza precisa do veiculo ou outro material pode depender da via de administração, e. g., vias orais, intravenosas, cutâneas ou subcutâneas, nasais, intramusculares, intraperitoneais ou por penso. As composições farmacêuticas para administração oral podem ser na forma de comprimido, cápsula, pó ou liquido. Um comprimido pode incluir um veiculo sólido, tal como gelatina ou um adjuvante. As composições farmacêuticas liquidas incluem geralmente um veiculo liquido, tais como água, vaselina, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Podem ser incluídos uma solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução sacarídica ou 22 gl icóis, tais como etilenoglicol, propilenoglicol ou polietilenoglicol.

Para injecção intravenosa, cutânea ou subcutânea, ou injecção no local afectado, o ingrediente activo será na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que é apirógena e tem um pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Aqueles com conhecimento relevante na técnica são bem capazes de preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotónicos, tais como injecção de cloreto do sódio, injecção de Ringer, injecção de Ringer com lactato. Podem ser incluídos conservantes, estabilizadores, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos, sempre que necessário. Seja este um polipéptido, péptido ou molécula de ácido nucleico, outro composto farmaceuticamente útil de acordo com a presente invenção que seja para ser administrado a um indivíduo, a administração é, de um modo preferido, numa "quantidade profilacticamente eficaz" ou numa "quantidade terapeuticamente eficaz" (consoante o caso), sendo isto suficiente para apresentar benefício ao indivíduo. A quantidade administrada de facto e a taxa e decurso temporal da administração dependerão da natureza e gravidade do que está a ser tratado. A prescrição do tratamento, e. g., decisões de dosagem etc., está dentro da responsabilidade dos médicos assistentes e outros médicos, e toma em consideração, tipicamente, o distúrbio a ser tratado, o estado do doente individual, o local de distribuição, o método de administração e outros factores conhecidos dos médicos assistentes. Exemplos das técnicas e dos protocolos mencionados acima são encontrados em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16a edição, Osol, A. (ed), 1980. 23

Alternativamente, podem ser utilizadas terapias direccionadas para distribuir as sequências inibidoras de JNK da invenção e os péptidos quiméricos da invenção, mais especificamente a determinados tipos de células, através da utilização de sistemas de direccionamento, tais como um anticorpo (direccionado) ou ligandos específicos de célula. Os anticorpos utilizados para o direccionamento são tipicamente específicos para proteínas de superfície celular de células associadas com quaisquer das doenças, como definidas abaixo. A título de exemplo, estes anticorpos pode ser dirigidos a anticorpos de superfície celular, tais como, e. g., proteínas de superfície associadas a células B, tais como a proteína DR de MHC classe II, CD18 (cadeia beta de LFA-1), CD45RO, CD40 ou

Bgp95 ou proteínas de superfície celular seleccionadas de, CD CD2, CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CDl 0, CD13, CD16, CDl 9, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD3 0, CD33, CD3 4, CD3 8, CD39, CD4, CD43, CD45, CD52, CD56, CD68, CD71, CD138, etc.

As construções de direccionamento podem ser tipicamente preparadas através de ligação covalente da sequência inibidora de JNK e dos péptidos quiméricos da invenção a um anticorpo específico para uma proteína de superfície celular ou através de ligação a um ligando específico de célula. As proteínas podem, e. g., ser ligadas a um tal anticorpo ou podem ser ai ligadas através de uma ligação peptídica ou por acoplamento químico, reticulação, etc. A terapia direccionada pode ser depois realizada através da administração da construção de direccionamento numa quantidade farmaceuticamente eficaz a um doente através de quaisquer das vias de administração como definidas abaixo, e. g., vias de distribuição intraperitoneal, nasal, intravenosa, oral e por penso. De um modo preferido, as sequências inibidoras de JNK da invenção ou os péptidos quiméricos da invenção ligados aos anticorpos direccionados ou ligandos específicos da célula, como acima definidos, podem ser 24 libertadas in vitro ou in vivo, e. g., através de hidrólise da ligação covalente, através de peptidases ou qualquer outro método adequado. Alternativamente, se as sequências inibidoras de JNK da invenção ou os péptidos quiméricos da invenção estiverem ligados a um pequeno ligando especifico de célula, a libertação do ligando não pode ser realizada. Se presentes à superfície celular, os péptidos quiméricos da invenção podem entrar na célula com base na actividade da sua sequência de tráfico. 0 direccionamento pode ser desejável por uma variedade de razões; por exemplo, se as sequências inibidoras de JNK da invenção ou os péptidos quiméricos da invenção forem inaceitavelmente tóxicos ou se fosse requerida, caso contrário, uma dosagem demasiado elevada.

As sequências inibidoras de JNK da invenção e/ou os péptidos quiméricos podem ser administrados numa forma de precursor através da utilização de um anticorpo ou um vírus. As sequências inibidoras de JNK da invenção e/ou os péptidos quiméricos podem ser depois convertidos na forma activa através de um agente activador produzido, ou direccionado, nas células a serem tratadas. Este tipo de abordagem é por vezes conhecido como ADEPT (terapia de profármaco com enzima dirigida por anticorpo) ou VDEPT (terapia de profármaco com enzima dirigida por vírus) ; o primeiro envolvendo o direccionamento do agente activador às células através de conjugação a um anticorpo específico de célula, enquanto o último envolve a produção de agente activador, e. g., uma sequência inibidora de JNK ou o péptido quimérico, num vector por expressão a partir de ADN codificante num vector virai (ver, por exemplo, documentos EP-A-415731 e WO 90/07936). A presente invenção abrange ainda a utilização de sequências inibidoras de JNK da invenção e/ou péptidos quiméricos da 25 invenção, para preparar uma composição farmacêutica, e. g., como acima definida, para prevenir e/ou tratar distúrbios de proliferação celular associados com a activação de JNK num indivíduo ("distúrbio associado a JNK"). Tipicamente, uma tal composição farmacêutica utilizada de acordo com a presente invenção inclui como um componente activo, e. g. : (i) qualquer uma ou mais das sequências inibidoras de JNK e/ou os péptidos quiméricos da invenção e/ou (ii) células compreendendo qualquer uma ou mais das sequências inibidoras de JNK e/ou os péptidos quiméricos da invenção. A prevenção e/ou tratamento de acordo com a presente invenção incluem tipicamente a administração de uma composição farmacêutica da invenção, como acima definida. 0 termo "modular" inclui a supressão da expressão de JNK quando é sobreexpresso. Inclui também a supressão da fosforilação de c-jun, ATF2 ou NFAT4, por exemplo, através da utilização de um péptido de qualquer um ou mais das SEQ ID N° : 1-4 e/ou 9-12, como um inibidor competitivo do sítio de ligação natural de c-jun, ATF2 e NFAT4 numa célula. 0 termo "modular" inclui também a supressão de complexos hetero- e homoméricos de factores de transcrição compostos de c-jun, ATF2 ou NFAT4 e os seus parceiros relacionados, tais como, por exemplo, o complexo AP-1 que é composto de c-jun, AFT2 e c-fos. Quando um distúrbio de proliferação celular está associado com sobreexpressão de JNK, tais sequências inibidoras de JNK supressoras podem ser introduzidas numa célula. Em alguns exemplos, "modular" pode incluir o aumento da expressão de JNK, por exemplo, através da utilização de um anticorpo específico para o péptido IB que bloqueia a ligação de um péptido IB a JNK, prevenindo assim a inibição de JNK pelo péptido relacionado com IB. 26 A prevenção e/ou o tratamento de um indivíduo com a composição farmacêutica da invenção como acima divulgada pode ser realizada tipicamente por administração (in vivo) de uma quantidade ("terapeuticamente eficaz") da referida composição farmacêutica a um indivíduo, em que o indivíduo pode ser, e. g., qualquer mamífero, e. g., um humano, um primata, murganho, rato, cão, gato, vaca, cavalo ou porco. A expressão "terapeuticamente eficaz" significa que o componente activo da composição farmacêutica está numa quantidade suficiente para melhorar o distúrbio associado a JNK. A expressão "distúrbio de proliferação celular" ou "distúrbio associado a JNK" como acima utilizado, denota tipicamente populações de células malignas, assim como não malignas in vivo e in vitro que parecem frequentemente diferir morfológica e funcionalmente do tecido circundante e que são tipicamente caracterizadas por níveis aberrantes de JNK. Um "nível aberrante de JNK" pretende significar um nível aumentado ou diminuído de JNK numa parte do indivíduo a ser tratado, relativamente àquele presente numa parte análoga não afectada de um indivíduo que não tem o distúrbio.

Por exemplo, as composições farmacêuticas da invenção podem ser úteis na prevenção e/ou tratamento de malignidades dos vários sistemas de órgãos, nas quais a activação de JNK foi frequentemente demonstrada, e. g., pulmão, mama, linfóide, tracto gastrointestinal e genito-urinário, assim como adenocarcinomas que incluem malignidades, tais como a maioria dos cancros do cólon, carcinoma das células renais, cancro da próstata, carcinoma das células não pequenas do pulmão, cancro do intestino delgado e cancro do esófago. Estão também incluídos a leucemia, distúrbios ou patofisiologias associadas com transformação oncogénica, assim como cancros com transformações 27 oncogénicas de Bcr-Abl que requerem, claramente, a activação de JNK.

As composições farmacêuticas da invenção são também aplicáveis na prevenção e/ou tratamento de doenças de proliferação celular com relação imunológica ou não malignas, tais como psoríase, pênfigo vulgar, síndrome de Behcet, síndrome de dificuldade respiratória aguda (ARDS), doença cardíaca isquémica, síndrome pós-diálise, artrite reumatóide, síndrome da imunodeficiência adquirida, vasculite, choque séptico e outros tipos de inflamação aguda, e histiocitose lipídica. São especialmente preferidos os distúrbios imunopatológicos. Essencialmente, qualquer distúrbio que está etiologicamente ligado à actividade da cinase JNK, é considerado susceptível de prevenção ou tratamento, e. g., distúrbios ou patofisiologias associadas com a activação de JNK numa célula ou células, como definido acima, e. g., restenose, perda de audição, trauma do ouvido, isquemia, acidente vascular cerebral e/ou distúrbios ou patofisiologias associadas com a maturação e diferenciação de células imunes, lesões de reperfusão, hipoxia, doenças relacionadas com a apoptose (e. g., que ocorrem em infecções virais (e. g., SIDA), doenças auto-imunes, distúrbios neurodegenerativos (e. g., acidente vascular cerebral, traumatismo cerebral, lesão da espinal medula, esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença de Huntington, doença de Alzheimer e doença de Parkinson), doença cardiovascular, osteoporose e envelhecimento, resposta a estímulos que causam stress e com efeitos secundários devido ao tratamento com, e. g., citocinas pró-inflamatórias. A composição farmacêutica da invenção pode também ser utilizada para tratar ou prevenir efeitos associados com a diabetes ou com tensão de cisalhamento celular, tal como em estados patológicos induzidos por hipertensão arterial, incluindo hipertrofia do coração e cardíaca e lesões 28 arterioscleróticas, e em bifurcações dos vasos sanguíneos, e semelhantes, por radiação ionizante, como utilizada em radioterapia e na luz ultravioleta (luz UV), por radicais livres, agentes que danificam o ADN, incluindo fármacos quimioterapêuticos, através de lesões por isquemia/reperfusão, por hipoxia; e/ou hipo- e hipertermia. Finalmente, no contexto das doenças, distúrbios ou patofisiologias mencionados acima, a composição farmacêutica da invenção pode ser utilizada para inibir a expressão de genes cuja expressão aumenta na presença de um polipéptido activo de JNK. Estes genes e produtos génicos incluem tipicamente, e. g., citocinas pró-inflamatórias. Tais citocinas são encontradas em todas as formas de doenças inflamatórias, autoinflamatórias, imunes e auto-imunes, doenças degenerativas, miopatias, cardiomiopatias e rejeição de enxerto.

As sequências inibidoras de JNK da invenção e/ou os péptidos quiméricos da invenção podem ser ainda utilizados em qualquer situação em que é desejada a inibição da actividade de JNK, uma vez que as JNK e todas as suas isoformas participam no desenvolvimento e estabelecimento de estados patológicos ou nas suas vias. Tal utilização pode incluir aplicações in vitro, ex vivo e aplicações in vivo.

De acordo com uma forma de realização adicional, as sequências inibidoras de JNK da invenção ou os péptidos quiméricos da invenção, podem ser utilizados em ensaios (in vitro) (e. g., imunoensaios) para detectar, prognosticar, diagnosticar ou monitorizar vários estados, doenças e/ou distúrbios, como acima definidos, ou monitorizar o seu tratamento. 0 imunoensaio pode ser realizado por um método compreendendo a colocação em contacto de uma amostra derivada de um doente com um anticorpo para uma sequência inibidora de JNK da invenção, um péptido quimérico da invenção, sob condições 29 tais que pode ocorrer ligação imunoespecífica, e subsequentemente a detecção ou medição da quantidade de qualquer ligação imunoespecifica através do anticorpo. Numa forma de realização específica, um anticorpo específico para uma sequência inibidora de JNK da invenção ou péptido quimérico da invenção pode ser utilizado para analisar uma amostra de tecido ou soro de um doente, para a presença de JNK ou de uma sequência inibidora de JNK; em que um nível aberrante de JNK é indicativo de um estado patológico. Os imunoensaios que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, sistemas de ensaio competitivo e não competitivo utilizando técnicas, tais como Transferência de Western, radioimunoensaios (RIA), imunoensaio de adsorção ligado à enzima (ELISA), imunoensaios "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reacções de precipitina, reacções de precipitina por difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, imunoensaios fluorescentes, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunorradiométricos e imunoensaios de proteína A, etc. Alternativamente, podem ser realizados ensaios (in vitro) através da distribuição das sequências inibidoras de JNK da invenção, péptidos quiméricos da invenção ou anticorpos às sequências inibidoras de JNK da invenção ou aos péptidos quiméricos da invenção para direccionar a células, tipicamente seleccionadas de, e. g., células animais, células humanas ou microrganismos cultivados, e para monitorizar a resposta celular por métodos biofísicos tipicamente conhecidos de um especialista. As células alvo tipicamente utilizadas aí podem ser células cultivadas {in vitro) ou células in vivo, i. e., células que compõem os órgãos ou tecidos de animais ou humanos vivos, ou microrganismos encontrados em animais ou humanos vivos. 30 A presente invenção proporciona adicionalmente kits para utilização em diagnóstico ou terapêutica que incluem um ou mais recipientes contendo sequências inibidoras de JNK da invenção ou péptidos quiméricos da invenção e, opcionalmente, anticorpos para as sequências inibidoras de JNK da invenção ou os péptidos quiméricos da invenção, e. g., um anticorpo anti-sequência inibidora de JNK e, opcionalmente, um parceiro de ligação marcado para o anticorpo. 0 marcador incorporado, desse modo, no anticorpo pode incluir, mas não estar limitado a, uma unidade quimioluminescente, enzimática, fluorescente, colorimétrica ou radioactiva. Noutra forma de realização especifica, também são proporcionados kits para utilização em diagnóstico que compreendem um ou mais recipientes contendo ácidos nucleicos que codificam, ou alternativamente, que são o complemento a uma sequência inibidora de JNK da invenção e/ou um péptido quimérico da invenção, opcionalmente, um parceiro de ligação marcado para estes ácidos nucleicos. Numa forma de realização especifica alternativa, o kit pode compreender, em um ou mais recipientes, um par de iniciadores oligonucleotídicos (e. g., cada com 6-30 nucleótidos de comprimento) que são capazes de actuar como iniciadores de amplificação para a reacção em cadeia da polimerase (PCR; ver, e. g., Innis et ai., 1990 . PCR PROTOCOLS, Academic Press, Inc., San Diego, CA), reacção em cadeia da ligase, reacção cíclica de sonda e semelhantes, ou outros métodos conhecidos na técnica, utilizados em contexto com os ácidos nucleicos da invenção. O kit pode, opcionalmente, compreender ainda uma quantidade predeterminada de uma sequência inibidora de JNK da invenção, um péptido quimérico da invenção purificados para utilização como um diagnóstico, padrão ou controlo nos ensaios. A presente invenção não é para estar limitada no âmbito pelas formas de realização especificas aqui descritas. De facto, 31 várias modificações da invenção, além daquelas aqui descritas, serão evidentes aos especialistas na técnica a partir da descrição anterior e figuras que a acompanham.

Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como geralmente compreendido por um técnico com conhecimento geral na matéria a que esta invenção pertence. Embora os métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, são descritos abaixo métodos e materiais adequados. No caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, deverá dominar. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos. Outras caracteristicas e vantagens da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e reivindicações.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIGS. 1A-C são diagramas que mostram alinhamentos de regiões conservadas de domínios de JBD nos factores de transcrição indicados. As sequências inibidoras de JNK foram identificadas por inspecção destes alinhamentos de sequências. Os resultados deste alinhamento são mostrados a título de exemplo nas FIGS. 1A-1C. A FIG. IA representa a região de mais alta homologia entre os JBD de IBl, IB2, c-Jun e ATF2. 0 painel B representa a sequência de aminoácidos dos JBD de L-IB1 e L-IB1 para fins comparativos. Os resíduos totalmente conservados são indicados por asteriscos, enquanto os resíduos alterados para Ala no vector GFP-JBD23Mut são 32 indicados por circunferências. A FIG. 1C mostra as sequências de aminoácidos de proteínas quiméricas que incluem uma sequência inibidora de JNK e uma sequência de tráfico. No exemplo mostrado, a sequência de tráfico é derivada do polipéptido TAT do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e a sequência inibidora de JNK é derivada de um polipéptido IBI(s). As sequências de humano, murganho e rato são idênticas nos painéis B e C. FIG. 2 é um diagrama que mostra as sequências de péptidos de fusão TAT-IB genéricos de humano, murganho e rato. FIG. 3 representa os resultados da avaliação da neuroprotecção contra isquemia cerebral focal num modelo de MCAO permanente. A determinação da eficácia da protecção foi realizada em doses diferentes (ver Figura 3). Como pode ser observado na Figura 3, pelo menos doses de 11 mg/kg, 3 mg/kg, 0,3 mg/kg e 0,03 mg/kg, contribuem para uma protecção cerebral. A melhor protecção é observada a uma dose de 0,03 mg/kg. FIG. 4 ilustra a avaliação da neuroprotecção por um péptido quimérico da invenção de acordo com a SEQ ID N°: 11 após administração i.v. contra isquemia cerebral focal, num modelo de MCAO transiente. Subsequente à isquemia provocada em murganhos adultos, os murganhos foram sacrificados 48 h após reperfusão. Foram preparadas secções criostáticas em série e foram calculados os volumes de enfarte. Como pode ser observado na 33

Figura 4, os péptidos quiméricos da invenção proporcionam neuroprotecção eficiente. FIG. 5 mostra os resultados de um ensaio de culturas neuronais realizado por medição da libertação de LDH após estimulação com NMDA. Os resultados indicam claramente um efeito neuroprotector do péptido D-JNKIl quimérico (SEQ ID N° : 11) da invenção, uma vez que alterações degenerativas devido a exposição a NMDA foram totalmente inibidas, como indicado pela ausência de libertação significativa de LDH acima dos controlos. FIG. 6 representa os resultados da inibição da actividade endógena de JNK em células HepG2 utilizando péptidos de fusão da invenção de acordo com a SEQ ID N° : 9 e 11, num abordagem de poço único.

Como pode ser observado na Figura 6, particularmente o painel d na Figura 6, o D-TAT-IB1 de acordo com a SEQ ID N°: 11 (aqui abreviado como D-JNKI) inibe eficazmente a actividade de JNK, ainda melhor do que L-TAT-IB1 de acordo com a SEQ ID N° : 9 (aqui abreviado como L-JNKI). FIG. 7 mostra o efeito protector da protecção de D-TAT-IB1 contra a perda permanente de audição. Alterações do nível limite de audição (nível de pressão sonora dB) em cobaios, após trauma sonoro (120 dB a 6 kHz durante 30 minutos) a 8 kHz, a frequência máxima impactada, medida 20 minutos (deslocamento provisório de limite, TTS, cinzento) 34 e 15 dias após exposição ao som (deslocamento permanente do limite). Os cobaios receberam D-TAT-IB1 num gel de ácido hialurónico depositado sobre a membrana da janela redonda coclear 30 minutos antes, 30 minutos depois ou 4 horas após o trauma sonoro; os ouvidos não tratados serviram como controlo. O TTS foi medido 20 minutos após o trauma sonoro, enquanto o PTS (preto), que corresponde à perda permanente de audição, foi determinado após 15 dias. Como mostrado, o D-TAT-IB1 não apenas protege substancialmente contra perda permanente de audição devido a trauma sonoro, se aplicado preventivamente antes da exposição ao som, mas também de uma forma dependente do tempo se administrado após o trauma. 0 PTS em ouvidos tratados foi significativamente mais baixo para administração de D-TAT-IB1, 30 minutos e 4 horas após o trauma do que nos ouvidos não tratados de controlo.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Identificação de Sequências Inibidoras de JNK

As sequências de aminoácidos importantes para a interacção eficiente com JNK foram identificadas através de alinhamentos de sequências entre JBD conhecidos. Uma comparação de sequência entre os JBD de IB1 [SEQ ID N° : 13], IB2 [SEQ ID N° : 14], c-Jun [SEQ ID N° : 15] e ATF2 [SEQ ID N° : 16] definiu uma sequência de 8 aminoácidos fracamente conservada (FIG. IA) . Uma vez que os JBD IB1 e IB2 são aproximadamente 100 vezes tão eficientes quanto c-Jun ou ATF2 na ligação de JNK (Dickens et al. Science 35 277: 693 (1997), foi concluído que os resíduos conservados entre IBl e IB2 devem ser importantes para conferir ligação máxima. A comparação entre os JBD de IBl e IB2 definiu dois blocos de sete e três aminoácidos que são altamente conservados entre as duas sequências.

Estes dois blocos estão contidos numa sequência peptídica de 19 aminoácidos em L-IB1 [SEQ ID N°: 1] e são também mostrados por fins comparativos numa sequência peptídica de 23 aa derivada de IBl [SEQ ID N°: 17]. Estas sequências são mostradas na FIG. 1B, traços na sequência de L-IBl indicam uma lacuna na sequência, de modo a alinhar os resíduos conservados com L-IBl.

Exemplo 2: Preparação de Proteínas de Fusão Inibidoras de

JNK

As proteínas de fusão inibidoras de JNK da invenção de acordo com a SEQ ID N°: 9 foram sintetizadas através de ligação covalente entre a extremidade C-terminal da SEQ ID N°: 1 e o N-terminal de um péptido transportador de 10 aminoácidos derivado do HIV-TAT4g 57 (Vives et al., J. Biol. Chem. 272: 16010 (1997)) de acordo com a SEQ ID N°: 5, através de um ligante consistindo de dois resíduos de prolina. Este ligante foi utilizado para permitir flexibilidade máxima e prevenir alterações estruturais secundárias não desejadas. As construções básicas foram também preparadas e designadas L-IBl (SEQ ID N°: 1) e L-TAT [SEQ ID N°: 5], respectivamente. Todos os péptidos retro-inversos D de acordo com a SEQ ID N° : 11 foram sintetizados em conformidade. As construções básicas foram também preparadas e designadas D-IB1 [SEQ ID N° : 2] e D-TAT [SEQ ID N°: 6], respectivamente. 36

Todos os péptidos de fusão D e L da invenção de acordo com as SEQ ID N°: 9, 10, 11 e 12 foram produzidos através de síntese clássica de Fmock e adicionalmente analisados através de Espectrometria de Massa. Foram, por último, purificados através de HPLC. Para determinar os efeitos do ligante de prolina, foram produzidos dois tipos de péptido TAT, um com duas prolinas e o outro sem prolinas. A adição das duas prolinas não pareceu modificar a entrada ou a localização do péptido TAT dentro das células. Péptidos genéricos que mostram os resíduos de aminoácidos conservados são apresentados na FIG. 2.

Exemplo 3: Inibição da morte celular por IBD19

Foram estudados os efeitos da sequência JBD de 19 aa de comprimento de IB1 em actividades biológicas de JNK. A sequência de 19 aa foi ligada através do N-terminal à Proteína Fluorescente Verde (construção GFP JBD19) e foi avaliado o efeito desta construção na apoptose de células β pancreáticas induzida por IL1. Este modo de apoptose foi previamente mostrado como sendo bloqueado por transfecção com JBDi_28o enquanto inibidores específicos de ERK1/2 ou p38 não protegeram (ver Ammendrup et al. supra).

Os oligonucleótidos correspondentes a JBD19 e compreendendo uma sequência conservada de 19 aminoácidos, assim como uma sequência mutada nas regiões totalmente conservadas, foram sintetizados e introduzidos direccionalmente nos sítios EcoRI e sall do vector pEGFP-Nl que codifica a Proteína Fluorescente Verde (GFP) (da firma Clontech). Foram cultivadas células βΤΟ-3 produtoras de insulina em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitela, 100 pg/mL de estreptomicina, 100 unidades/mL de penicillina e 2 mM de glutamina. As células 37 βΤΟ-3 produtoras de insulina foram transfectadas com os vectores indicados e foi adicionada IL-Ιβ (10 ng/mL) ao meio de cultura de células. O número de células apoptóticas foi contado às 48 horas após a adição da IL-Ιβ, utilizando um microscópio de fluorescência invertida. As células apoptóticas foram discriminadas das células normais através da caracteristica de "projecções em forma de bolha" do citoplasma e foram contadas após dois dias. O GFP é o vector de expressão da Proteína Fluorescente Verde utilizado como controlo; JBD19 é o vector que expressa uma GFP quimérica ligada à sequência de 19 aa derivada do JBD de IB1; JBDl9Mut é o mesmo vector que GFP-JBD19, mas com um JBD mutado nos quatro resíduos conservados mostrados como FIG. 1B; e JBD^so é o vector GFP ligado ao JBD total (aa 1-280) . A construção que expressa GFP-JBD19 preveniu a apoptose de células β pancreáticas induzida por IL-Ιβ tão eficientemente quanto o JBDL280 total.

Como controlos adicionais, as sequências mutadas em resíduos totalmente conservados de IBI tinham capacidade extremamente diminuída para prevenir a apoptose.

Exemplo 4: Importação celular de péptidos TAT-IBl

Foi avaliada a capacidade das formas L- e D-enantioméricas de TAT e de péptidos da invenção TAT-IBl ("péptidos TAT-IB") para entrarem nas células. L-TAT, D-TAT, L-TAT-IB1 da invenção, e péptidos D-TAT-IB1 da invenção [SEQ ID N°: 5, 6, 9 e 12, respectivamente] foram marcados por adição ao N-terminal de um resíduo de glicina conjugado com fluoresceína. Os péptidos marcados (1 μΜ) foram adicionados a culturas de células βΤ0-3, que foram mantidas como descrito no Exemplo 3. A horas 38 predeterminadas, as células foram lavadas com PBS e fixas durante cinco minutos em metanol-acetona (1:1) gelado, antes de serem examinadas com um microscópio de fluorescência. Foi utilizada BSA marcada com fluoresceina (1 μΜ, 12 moles/mole de BSA) como um controlo. Os resultados demonstraram que, todos os péptidos marcados com fluoresceina acima tinham entrado em células eficientemente e rapidamente (menos de cinco minutos), assim que adicionados ao meio de cultura. Pelo contrário, a albumina de soro bovino marcada com fluoresceina (1 μΜ BSA, 12 moles de fluoresceina/mole de BSA) não entrou nas células. Um estudo ao longo do tempo indicou que a intensidade do sinal fluorescente para os péptidos L-enantioméricos diminuiu em 70%, após um periodo de 24 horas. Pouco ou nenhum sinal estava presente às 48 horas. Pelo contrário, D-TAT e D-TAT-IB1 da invenção foram extremamente estáveis dentro das células.

Os sinais fluorescentes para todos estes péptidos retro-inversos D estavam ainda muito fortes após 1 semana e o sinal estava apenas ligeiramente diminuído após 2 semanas de tratamento.

Exemplo 5: Inibição In vitro da fosforilação de c-JUN, ATF2 e Elkl

Os efeitos dos péptidos na fosforilação mediada por JNK dos seus factores de transcrição alvo foram investigados in vitro. Foram produzidos JNK1, JNK2 e JNK3 recombinantes e não activados utilizando um kit de lisado de reticulócito de coelho TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (Promega) e utilizados em ensaios de cinase da fase sólida com c-Jun, ATF2 e Elkl, isoladamente ou fundidos com glutationo-S-transferase (GST), como substratos. Foram realizados estudos de resposta à dose em que L-TAT ou 39 péptidos L-TAT-IB1 da invenção (0-25 μΜ) foram misturados com as cinases JNK1, JNK2, ou JNK3 recombinantes, em tampão de reacção (20 mM de Tris-acetato, 1 mM de EGTA, 10 mM de p-nitrofenil-fosfato (pNPP), 5 mM de pirofosfato de sódio, 10 mM de p-glicerofosfato, 1 mM de ditiotreitol) durante 20 minutos. As reacções da cinase foram iniciadas após adição de 10 mM de MgCl2 e 5 pCi 33P-[gama]-dATP e 1 yg de GST-Jun (aa 1-89), GST-AFT2 (aa 1-96) ou GST-ELK1 (aa 307-428) . As proteinas de fusão com GST foram adquiridas à Stratagene (La Jolla, CA).

Dez yL de esferas de glutationo-agarose foram também adicionados à mistura. Os produtos de reacção foram depois separados por SDS-PAGE num gel de poliacrilamida desnaturante a 10%. Os géis foram secos e subsequentemente expostos a filmes de raio X (Kodak). Foi observada inibição quase completa da fosforilação de c-Jun, ATF2 e Elkl pelas JNK em doses do péptido TAT-IB da invenção tão baixos quanto 2,5 μΜ. Contudo, uma acentuada excepção foi a ausência de inibição de TAT-IB da fosforilação de JNK3 de Elkl. Globalmente, o péptido TAT-IB1 da invenção mostrou efeitos superiores na inibição da fosforilação da família de JNK dos seus factores de transcrição alvo. A capacidade de D-TAT, D-TAT-IB1 da invenção e de péptidos L-TAT-IB1 da invenção (dosagem de estudo de 0-250 μΜ) para inibir a fosforilação de GST-Jun (aa 1 -73) por JNK1, JNK2 e JNK3 recombinante foi analisada como descrito acima. No geral, o péptido D-TAT-IB1 diminuiu a fosforilação mediada por JNK de c-Jun, mas a níveis aproximadamente 10-20 vezes menos eficientes do que L-TAT-IB1. 40

Exemplo 6: Inibição da Fosforilagão de c-JUN por JNK

Activados

Os efeitos dos péptidos L-TAT ou L-TAT-IB1 da invenção em JNK activadas por estímulos que causam stress foram avaliados utilizando GST-Jun para diminuir JNK de células HeLa irradiadas com luz UV ou células PTC tratadas com IL-Ιβ. As células PTC foram cultivadas como descrito acima. As células HeLa foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de vitela, 100 pg/mL de estreptomicina, 100 unidades/mL de penicilina e 2 mM de glutamina. Uma hora antes de serem utilizadas para a preparação do extracto celular, as células PTC foram activadas com IL-Ιβ como descrito acima, enquanto as células HeLa foram activadas com luz UV (20 J/m2) . Os extractos celulares foram preparados a partir de células de controlo, células HeLa irradiadas com Luz UV e células βΤΟ-3 tratadas com IL-Ιβ através de raspagem das culturas celulares em tampão de lise (20 mM de Tris-acetato, 1 mM de EGTA, 1% de Triton X-100, 10 mM de p-nitrofenil-fosfato, 5 mM de pirofosfato de sódio, 10 mM de p-glicerof osf ato, 1 mM de ditiotreitol) . Os restos celulares foram removidos por centrifugação durante cinco minutos a 15000 rpm num rotor SS-34 da Beckman. Cem pg de extracto foram incubados durante uma hora à temperatura ambiente com um pg de GST-jun (aminoácidos 1-89) e 10 pL de esferas de glutationo-agarose (Sigma). Depois de quatro lavagens com tampão de raspagem, as esferas foram ressuspensas no mesmo tampão suplementado com os péptidos L-TAT ou L-TAT-IB1 da invenção (25 pM) durante 20 minutos. As reacções da cinase foram depois iniciadas por adição de 10 mM de MgCl2 e 5 pCi de 33P-[gama]-dATP e incubadas durante 30 minutos a 30 °C. Os produtos de reacção foram depois separados por SDS num gel de poliacrilamida desnaturante a 10%. Os géis foram secos e, subsequentemente, expostos a filmes de raio X (Kodak) . Os péptidos TAT-IB da 41 invenção preveniram eficientemente a fosforilaçao de c-jun por JNK activadas nestas experiências.

Exemplo 7: Inibição in vivo da fosforilação de c-JUN por péptidos TAT-IB da invenção

Para determinar se os péptidos permeáveis a células da invenção poderiam bloquear a sinalização de JNK in vivo, foi utilizado um sistema GAL4 heterólogo. As células HeLa, cultivadas como descrito acima, foram co-transfectadas com o vector repórter 5xGAL-LUC conjuntamente com a construção de expressão Gal-Jun (Stratagene), compreendendo o domínio de activação de c-Jun (aminoácidos 1-89) ligado ao domínio GAL4 de ligação a ADN. A activação de JNK foi realizada através da co-transfecção de vectores que expressam as cinases MKK4 e MKK7 directamente a montante (ver Whitmarsh et al., Science 285: 1573 (1999)). Resumidamente, 3xl05 células foram transfectadas com os plasmídeos em placas de 3,5 cm utilizando DOTAP (Boehringer Mannheim) , seguindo as instruções do fabricante. Para as experiências que envolvem Gal-Jun, 20 ng do plasmídeo foram transfectados com 1 pg do plasmídeo repórter pFR-Luc (Stratagene) e 0,5 pg dos plasmídeos que expressam MKK4 ou MKK7. Três horas após a transfecção, os meios celulares foram mudados e foram adicionados os péptidos TAT e TAT-IB1 (1 pM). As actividades da luciferase foram medidas 16 horas mais tarde utilizando o "Dual Repórter System" da empresa Promega, após normalização do conteúdo de proteína. A adição do péptido TAT-IB1 bloqueou a activação de c-Jun após activação mediada por MKK4 e MKK7 de JNK. Porque as células HeLa expressam isoformas de JNK1 e JNK2 mas não JNK3, transfectou-se células com JNK3. Uma vez mais, o péptido TAT-IB inibiu a activação mediada por JNK2 de c-Jun. 42

Exemplo 8: Inibição da Morte Induzida Por IL-Ιβ de Células β Pancreáticas Através de Péptidos TAT-IB A requerente investigou os efeitos dos péptidos L-TAT-IB da invenção na promoção de apoptose de células β induzida por IL-1. As culturas de células βΤΟ-3 foram incubadas durante 30 minutos com 1 μΜ de péptidos L-TAT-IB1 da invenção, seguida por 10 ng/mL de IL-1. Uma segunda adição do péptido (1 μΜ) foi realizada 24 horas mais tarde. As células apoptóticas foram contadas após dois dias de incubação com IL-Ιβ utilizando coloração nuclear de iodeto de propídio (as células coradas de vermelho estão mortas) e Hoechst 33342 (as células coradas de azul são células com a membrana plasmática intacta). A adição dos péptidos TAT-IB da invenção inibiu a apoptose induzida por IL-1 de células βΤ0-3 cultivadas na presença de IL-Ιβ durante dois dias. A inibição a longo prazo da morte celular induzida por IL-1 foi examinada por tratamento de células βΤΟ-3 como descrito acima, excepto que a incubação das células com os péptidos e IL-Ιβ foi mantida durante 12 dias. Foram adicionados péptidos adicionais (1 μΜ) todos os dias e IL-Ιβ adicional (10 ng/mL) foi adicionada de 2 em 2 dias. O péptido TAT-IB1 da invenção confere forte protecção contra apoptose nesta condições. Tomadas em conjunto, estas experiências proporcionam provas que os péptidos TAT-IB da invenção são moléculas biologicamente activas capazes de prevenir os efeitos da sinalização de JNK no destino celular.

Exemplo 9: Síntese de Péptidos IB totalmente retro-inversos da invenção

Os péptidos da invenção podem ser péptidos apenas com D-aminoácidos sintetizados de forma inversa para prevenir 43 proteólise natural (i. e., péptidos totalmente retro-inversos D). Um péptido totalmente retro-inverso D da invenção proporcionaria um péptido com propriedades funcionais semelhantes ao péptido nativo, em que os grupos laterais dos aminoácidos componentes corresponderiam ao alinhamento do péptido nativo, mas reteriam uma estrutura resistente a proteases. Os péptidos retro-inversos da invenção são análogos sintetizados utilizando D-aminoácidos por ligação dos aminoácidos num cadeia peptídica, de modo que a sequência de aminoácidos no análogo peptídico retro-inverso seja exactamente oposta àquela no péptido seleccionado que serve como modelo. Para ilustrar, se a proteína natural TAT (formada por L-aminoácidos) tiver a sequência GRKKRRQRRR [SEQ ID N° : 5], o análogo peptídico retro-inverso deste péptido (formado por D-aminoácidos) teria a sequência RRRQRRKKRG [SEQ ID N°: 6]. Os processos para a síntese de uma cadeia de D-aminoácidos para formar os péptidos retro-inversos são conhecidos na técnica (ver, e. g. , Jameson et ai., Nature, 368, 744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692- 693 (1994); Guichard et al., J. Med. Chem. 39, 2030-2039 (1996)). Especificamente, os retro-péptidos foram produzidos por síntese de F-mock clássica e adicionalmente analisados por Espectrometria de Massa. Foram, por último, purificados por HPLC.

Um vez que um problema inerente aos péptidos nativos é a degradação por proteases naturais e a imunogenicidade inerente, os compostos heterobivalentes ou heteromultivalentes desta invenção serão preparados de modo a incluir o "isómero retro-inverso" do péptido desejado. A protecção do péptido de proteólise natural deve, deste modo, aumentar a eficácia do composto heterobivalente ou heteromultivalente específico, através de prolongamento da semi-vida e da diminuição da 44 extensão da resposta imune com o intuito de destruir activamente os péptidos.

Exemplo 10: Actividade biológica a longo prazo dos péptidos IB totalmente retro-inversos da invenção A actividade biológica a longo prazo é prevista para o heteroconjugado do péptido contendo D-TAT-IB retro-inverso da invenção, quando comparada ao análogo nativo de L-aminoácidos devido à protecção do péptido D-TAT-IB da invenção de degradação por proteases nativas, como mostrado no Exemplo 5.

Foi analisada a inibição da morte de células β pancreáticas induzida por IL-Ιβ através do péptido D-TAT-IB1 da invenção. As células βΤ0-3 foram incubadas como descrito acima durante 30 minutos com uma única adição dos péptidos indicados (1 μΜ), depois foi adicionado IL-1 (10 ng/mL).

As células apoptóticas foram depois contadas após dois dias de incubação com IL-Ιβ por utilização de coloração nuclear de iodeto e propídio e Hoechst 33342. Um mínimo de 1000 células foi contado para cada experiência. 0 erro padrão das médias (SEM) é indicado, n=5. O péptido D-TAT-IB1 diminuiu a apoptose induzida por IL-1 numa extensão semelhante aos péptidos L-TAT-IB.

Foi também analisada a inibição a longo prazo da morte celular induzida por IL-Ιβ pelo péptido D-TAT-IB1. Células βΤΟ-3 foram incubadas como acima durante 30 minutos com uma única adição dos péptidos indicados (1 μΜ) , depois foi adicionada IL-Ιβ (10 ng/mL), seguida por adição de citocina de dois em dois dias. As células apoptóticas foram depois contadas após 15 dias de incubação com IL-1 por utilização de coloração nuclear de 45 iodeto de propídio e Hoechst 33342. É de assinalar que uma única adição do péptido TAT-IB1 não confere protecção a longo prazo. Um mínimo de 1000 células foi contado para cada experiência. Como resultado, o D-TAT-IB1 da invenção, mas não o L-TAT-IB1 da invenção, foi capaz de conferir protecção a longo prazo (15 dias) .

Exemplo 11: Inibição da Morte de Células β Pancreáticas Induzida por Irradiação Através dos Péptidos TAT-IB A JNK é também activada por radiação ionizante. Para determinar se os péptidos TAT-IB da invenção proporcionam protecção contra lesão da JNK induzida por radiação, células "WiDr" foram irradiadas (30 Gy) na presença ou ausência de péptidos D-TAT, L-TAT-IB1 da invenção ou D-TAT-IB1 da invenção (1 μΜ adicionado 30 minutos antes da irradiação). As células de controlo (CTRL) não foram irradiadas. As células foram analisadas 48 horas mais tarde através de coloração de PI e Hoechst 3342, como descrito acima. N = 3, os SEM são indicados. Os péptidos L-TAT-IBl e D-TAT-IB1 da invenção foram ambos capazes de prevenir a apoptose induzida por irradiação nesta linha humana de cancro do cólon.

Exemplo 12: Radioprotecção Contra Radiação Ionizante Pelos Péptidos TAT-IB da Invenção

Para determinar os efeitos radioprotectores dos péptidos TAT-IB da invenção, murganhos C57B1/6 (2 a 3 meses de idade) foram irradiados com um Phillips RT 250 R-ray a uma taxa de dose de 0,74 Gy/min (17 mA, filtro de Cu de 0,5 mm). Trinta minutos antes da irradiação, os animais foram injectados i.p. com 46 péptidos TAT, L-TAT-IBl da invenção ou D-TAT-IB1 da invenção (301 de uma solução a 1 mM) . Resumidamente, os murganhos foram irradiados como se segue: os murganhos foram colocados em pequenas caixas de plástico com a cabeça fora da caixa. Os animais foram colocados de costas sob a fonte de radiação e o seu pescoço fixo num pequeno tudo de plástico para manter a sua cabeça numa posição correcta. O corpo foi protegido com chumbo.

Antes da irradiação, os murganhos foram mantidos com ração granulada padrão para murganho, contudo após a irradiação os murganhos foram alimentados com um alimento semi-líquido que foi renovado todos os dias. A reacção da mucosa do lábio foi depois avaliada por 2 observadores independentes de acordo com o sistema de pontuação desenvolvido por Parkins et al. (Parkins et al., Radiotherapy & Oncology, 1: 165-173, 1983), em que foi determinado o estado de eritema, assim como a presença de edema, descamação e exsudação. Adicionalmente, os animais foram pesados antes de cada registo do seu estado de eritema/edema.

Os resultados destas experiências indicam que os péptidos TAT-IB de invenção protegem contra a perda de peso e eritema/edema associado com a radiação ionizante.

Exemplo 13: Supressão de Factores de Transcrição de JNK por péptidos L-TAT-IBl da invenção

Foram realizados ensaios de retardamento em gel com uma sonda AP-1 duplamente marcada (5'- CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3' (SEQ ID N°: 27). Os extractos nucleares de células HeLa foram tratadas ou não durante uma hora com 5 ng/mL de TNF-α, como 47 indicado. Os péptidos TAT e L-TAT-IB1 da invenção foram adicionados 30 minutos antes de TNF-cx. É mostrada apenas a parte do gel com o complexo especifico de ADN AP-1 (como demonstrado por experiências de competição com competidores não marcados específicos e não específicos).

Os péptidos L-TAT-IB1 da invenção diminuem a formação do complexo de ligação ADN AP-1 na presença de TNF-a.

Exemplo 14: Avaliação da neuroprotecção contra isquemia cerebral focal, num modelo de MCAO permanente - Determinação da eficácia da protecção a diferentes doses, (ver Figura 3) A isquemia cerebral focal foi induzida em ratos com 12 dias de idade. As crias foram anestesiadas numa câmara de indução com 2% de isoflurano e durante a operação a anestesia foi mantida utilizando uma máscara com 2% de isoflurano. A MCAO foi induzida por electrocoagulação de um ramo principal da artéria cerebral média (MCA). Os ratos foram colocados sobre o lado direito e foi feita uma incisão dérmica oblíqua entre a orelha e o olho. Após excisão do músculo temporal, o osso craniano foi removido da sutura frontal para um nível abaixo do arco zigomático. A MCA esquerda, exposta imediatamente após a sua aparição sobre a fissura rinal, foi electrocoagulada permanentemente ao nível da veia cerebral inferior, antes da MCA bifurcar nos ramos frontais e parietais. A incisão craniana da pele foi depois fechada. As crias de rato foram depois colocadas numa incubadora mantida a 37 °C até acordaram e foram depois transferidas para a sua mãe. Após 6 horas, um péptido D-TAT-IB1 quimérico da invenção de acordo com a SEQ ID N° : 11 foi injectado intraperitonealmente. Após 24 horas da coagulação, os ratos foram anestesiados com hidrato de cloral e perfundidos através da aorta ascendente com 48

4% de paraformaldeído em PBS. Cérebro foi depois removido e mantido durante 2 horas na mesma solução de fixador e colocados num gradiente de 30% de sacarose em PBS durante cerca de 15 horas a 4 °C. Os cérebros foram congelados em isopentano (-40 °C) e mantidos a -20 °C. Foram recolhidas secções criostáticas coronais de 50 pm em lâminas de vidro. As secções foram coradas com violeta de cresilo. Cada décima secção foi analisada e o volume total da lesão foi calculado utilizando o programa Neuroleucida. No grupo A de controlo, o volume médio da lesão foi 21,47 mm3. Todos os grupos tratados têm uma média mais baixa do que o grupo de controlo. Uma diferença estatisticamente significativa é observada entre o grupo A e o grupo C, E e F (teste t unilateral, p=0,030, p=0,002, p=0,001, respectivamente). Os resultados são mostrados na Figura 4.

Como resultado, estes dados suportam a conclusão de que o péptido D-TAT-IB1 quimérico da invenção de acordo com a SEQ ID N° : 11, administrado a uma dose de 11 mg/kg, 3 mg/kg, 0,3 mg/kg e 0,03 mg/kg, contribui para uma protecção cerebral. Os resultados a uma dose de 1 mg/kg, 0,003 mg/kg e 0,0003 mg/kg comparativamente ao grupo de soro fisiológico sugerem que a amostra total não foi suficientemente grande para alcançar uma diferença significativa. A melhor protecção é observada a uma dose de 0,03 mg/kg.

Exemplo 15: Avaliação da neuroprotecgão por péptidos quiméricos da invenção após administração i.v. contra isquemia cerebral focal, num modelo de MCAO transiente (ver Figura 4).

Isquemia transiente em murganhos adultos. Utilizando murganhos ICR-CD1 machos (6 semanas de idade; 18-37 g; Harlan), provocou-se isquemia por introdução de um filamento a partir da 49 artéria carótida comum para a carótida interna e avançando o mesmo para o circulo arterial, obstruindo assim a artéria cerebral média. Mediu-se o fluxo sanguineo cerebral regional por fluxometria laser Doppler, com uma sonda fixa no crânio ao longo da isquemia até 10 minutos após a reperfusão. A temperatura rectal foi medida e mantida a 37 °C. Os murganhos foram sacrificados 48 h após a reperfusão. Foram realizadas secções criostáticas em série de 20 pm utilizando um sistema computador-microscópio eguipado com o programa Neurolucida (MicroBrightField) e os volumes da área isquémica e de todo o cérebro foram calculados (às cegas) com o programa Neuroexplorer. XG-102 0,3 = 0,3 mg/kg, XG-102 1=1 mg/kg, XG-102 5=5 mg/kg

Os volumes de enfarte (mm3) após administração i.v. de bolus de placebo e XG-102 0,3, 1,3 mg/kg, 6 horas após reperfusão (30 minutos de oclusão) num modelo de murganhos adultos, foram como se seguem.

Enfartes Média Desvio-padrão controlo n=5 72 17 XG102 0,3 n=5 16 4 XG102 1 n=l 16 XG102 3 n=5 15 5 50

Exemplo 16: Ensaio em culturas neuronais por medição da libertação de LDH após estimulação com NMDA (ver Figura 5). 0 efeito neuroprotector do péptido D-TAT-IB (genérico)/D-JNKI1 (SEQ ID N° : 12) foi avaliado em culturas- irmãs pré-tratadas durante 30 minutos com as concentrações indicadas de péptidos ou MK-801, antes da exposição continua a 100 μΜ de NMDA. Após 12 h de tratamento com NMDA, em culturas pré-tratadas com 5 μΜ de D-TAT-IB (genérico)/D-JNKI1, as alterações degenerativas devido à exposição a NMDA foram inibidas totalmente como indicado pela ausência de libertação significativa de LDH acima dos controlos (Fig. 5) . O aspecto morfológico, número e distribuição dos neurónios foram indistinguíveis dos controlos.

Cultura neuronal cortical. Dissecou-se pequenos pedaços de córtex dos cérebros de crias de rato com dois dias de idade, incubou-se os mesmos com 200 unidades de papaína durante 30 minutos a 34 °C e depois os neurónios foram plaqueados a densidades de aproximadamente lxlO6 células/placa, em placas pré-revestidas com 100 pg/mL de poli-D-lisina. O meio de plaqueamento consistiu de B27/Neurobasal (Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado com 0,5 mM de glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina.

Ensaio de citotoxicidade de lactato desidrogenato (LDH). A libertação de LDH no meio envolvente 12, 24 e 48 h após administração de NMDA, foi medida utilizando o kit de ensaio de citotoxicidade não radioactivo Cytotox 96 (Promega, WI) (ver Fig. 5). 51

Exemplo 17: Inibição da actividade endógena de JNK em células HepG2 utilizando uma abordagem de poço único (ver Figura 6).

As células HepG2 foram inoculadas a 3000 células/poço, no dia anterior à experiência. Depois, concentrações crescentes de interleucina-1β [IL-Ιβ(v)] ou factor de necrose tumoral [TNFoí( ·) ] (a) foram adicionadas para activar JNK durante

30 minutos. As células foram lisadas em 20 mM de Hepes, 0,5% de Tween pH 7,4 e processadas para JNK AlphaScreen. (b) Z' para a actividade de JNK induzida por 10 ng/mL de IL-Ιβ e medida em 384 poços/placa (n=96). (c) Inibição da actividade de JNK endógena induzida por IL-Ιβ com inibidores químicos de JNK [estaurosporina (°)e SP600125 (·)]. (d) Efeito de inibidores peptídicos L-TAT-IBI(s) de acordo com a SEQ ID N°: 9 [aqui abreviado como L-JNKi (v) ) e D-TAT-IB1 de acordo com a SEQ ID N°: 11 (aqui abreviado como D-JNKi (♦)) e JBD (·) (corresponde a L-JNKI sem a sequência TAT)] na actividade de JNK dependente de IL-Ια. Todos os painéis são representativos de três experiências independentes (n=3). Métodos: Ensaio de cinase Alphascreen

Principio: AlphaScreen é uma tecnologia não radioactiva baseada em esferas utilizada para estudar interacções biomoleculares num formato de microplaca. O acrónimo ALPHA significa Ensaio Homogéneo de Proximidade com Luminescência Amplificada. Envolve uma interacção biológica que coloca esferas de um "dador" e de um "aceitador" em íntima proximidade, depois uma cascata de reacções químicas actua de modo a produzir um sinal amplificado. Após excitação laser a 680 nm, um 52 fotossensibilizador (ftalocianina) na esfera "dadora" converte o oxigénio ambiental num estado singleto excitado. No intervalo dos seus 4 ps de semi-vida, a molécula de oxigénio singleto pode difundir até aproximadamente 200 nm em solução e se uma esfera "aceitadora" estiver dentro dessa proximidade, o oxigénio singleto reage com um derivado de tioxeno na esfera "aceitadora", produzindo quimioluminescência a 370 nm que activa adicionalmente fluoróforos contidos na mesma esfera do "aceitador". Os fluoróforos excitados emitem subsequentemente luz a 520-620 nm. Na ausência de uma esfera aceitadora, o oxigénio singleto decai para o estado fundamental e não é produzido qualquer sinal.

Os reagentes da cinase (B-GST-cJun, anticorpo anti P-cJun e JNK3 activo) foram diluídos primeiro em tampão de cinase (20 mM de Tris-HCl pH 7,6, 10 mM de MgCÍ2, 1 mM de DTT, 100 μΜ de Na3V04, 0,01% de Tween-20) e adicionados a poços (15 pL) . As reacções foram depois incubadas na presença de 10 pM de ATP durante 1 h a 23 °C. A detecção foi realizada através de uma adição de 10 pL de mistura de esferas (20 pg/mL de aceitador de proteína A e 20 pg/mL de dador de Estreptavidina), diluídas em tampão de detecção (20 mM de Tris-HCI pH 7,4, 20 mM de NaCl, 80 mM de EDTA, 0,3% de BSA) , seguido por uma outra incubação de 1 hora a 23 °C no escuro. Para medição da actividade endógena de JNK, foram realizados ensaios de cinase como descrito acima, excepto que o JNK3 activo foi substituído por lisados celulares e os componentes da reacção de cinase foram adicionados após a lise celular. B-GST-cjun e anticorpo P-cJun foram utilizados nas mesmas concentrações, enquanto o ATP foi utilizado a 50 pM em vez de 10 pM. O sinal de AlphaScreen foi analisado directamente no dispositivo Fusion ou En Vision. 53

Exemplo 18: Tratamento do trauma sonoro 0 D-TAT-IB1 foi aplicado sobre a membrana da janela redonda coclear de 3 grupos de cobaios (cada grupo com 6 animais) em 2 microlitros de uma formulação em gel de ácido hialurónico tamponado a 2,6% (Hylumed, Genzyme Corp.) a uma concentração de 100 μΜ, 30 minutos antes do trauma sonoro (120 dB a 6 kHz durante 30 minutos) ou 30 minutos ou 4 horas posteriormente. Ouvidos não tratados serviram como controlo. Os deslocamentos do limite de audição foram avaliados por medições da resposta do tronco cerebral auditivo, 20 minutos após o trauma (deslocamento provisório do limite, TTS) e 15 dias após o trauma (deslocamento permanente do limite, PTS). A administração de D-TAT-IB1 protegeu contra a perda permanente de audição, mesmo se aplicado após a exposição ao som excessivo, comparativamente a ouvidos não tratados. O efeito protector foi mais forte quanto mais cedo o D-TAT-IB1 foi administrado após o trauma sonoro. Assim, o d-TAT-IBl é um composto otoprotector muito eficaz no caso de trauma sonoro. A partir da descrição detalhada anterior das formas de realização específicas da invenção, deve ser evidente que foram descritos péptidos quiméricos e sequências inibidoras de JNK bioactivos e permeáveis a células únicos. Embora as formas de realização particulares fossem aqui divulgadas em detalhe, isto foi feito a título exemplificativo, apenas para fins ilustrativos, e não pretendem ser limitativas relativamente ao âmbito das reivindicações anexas que se seguem. Em particular, é contemplado pela requerente que podem ser feitas várias substituições, alterações e modificações à invenção sem esta se afastar do espírito e âmbito da invenção como definida pelas reivindicações. 54

Listagem de Sequências <110> XIGEN S.A. <120> Inibidores peptidicos de permeação celular da via de

transdução de sinal de JNK <130> U001P006W01 <150> PCT/EP2 0 05/009782 <151> 2005-09-12 <160> 27 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 19

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido L-IB1 (ver Tabela 1) <400> 1

Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gin Vai Pro Arg 15 10 15

Ser Gin Asp 55 <210> 2 <211> 19

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido D-IB1 (ver Tabela 1) <400> 2

Asp Gin Ser Arg Pro Vai Gin Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 15 10 15

Lys Pro Arg <210> 3 <211> 18

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido L-IB (genérico) (ver Tabela 1) <22 0> <221> característica_misc <222> (1)..(18) <223> Fórmula geral: NH2-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-C00H, em que X é qualquer resíduo de aminoácido (nativo), Xna é qualquer resíduo de aminoácido excepto serina e treonina e Xnb é qualquer resíduo de aminoácido; 56 <22 0> <221> repetição <222> (D . · (D <223> Xaa é Xna- -Xnb como definido na fórmula geral, em que n é 0 ou 1 para Xna e 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 ou mais para Xnb <220> <221> repetição <222> (18)..(18) <223> Xaa é Xnb como definido na fórmula geral, em que n é 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 ou mais para Xnb <4 Ο 0> 3

Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gin 15 10 15

Asp Xaa <210> 4 <211> 18

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido D-IB (genérico) (ver Tabela 1) <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (1)..(18) <223> Fórmula geral: NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-C00H, em que X é qualquer resíduo de aminoácido (nativo), Xna 57 é qualquer resíduo de aminoácido excepto serina e treonina e Xnb é qualquer resíduo de aminoácido; <220> <221> repetição <222> (1)..(1) <223> Xaa é Xnb como definido na fórmula geral, em que n é 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 ou mais para Xnb <220> <221> repetição <222> (18)..(18) <223> Xaa é Xna-Xnb como definido na fórmula geral, em que n é 0 ou 1 para Xna e 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 ou mais para Xnb <400> 4

Xaa Asp Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr Pro 15 10 15

Arg Xaa <210> 5 <211> 10

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido L-TAT (ver Tabela 1) <40 0> 5

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 15 10 58 10 6 <210> <211>

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido D-TAT (ver Tabela 1) <400> 6

Arg Arg Arg Gin Arg Arg Lys Lys Arg Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido L-genérico-TAT (ver Tabela 1) <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (D · · (17) <223> Fórmula geral: NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-COOH, qualquer resíduo de aminoácido; em que Xnb é <220> <221> repetição <222> (D · · (4) <223> Xaa é Xnb como definido na fórmula geral, em que n é 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 ou mais para Xnb 59 <220> <221> repetição <222> (14)..(17) <223> Xaa é Xnb como definido na fórmula geral, em que n é 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 ou mais para Xnb <40 0> 7

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa <210> 8 <211> 17

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido D-genérico-TAT (ver Tabela 1) <220> <221> caracteristica_misc <222> (1)..(17) <223> Fórmula geral: NH2-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH, em que Xnb é qualquer resíduo de aminoácido; <220> <221> repetição <222> t—1 <223> Xaa é Xnb como definido na fórmula geral, em que o 1—1 1 LO LO 1 o 10-15, 15-20, 20-30 ou mais para Xnb 60 <22 0> <221> repetição <222> (14)..(17) <223> Xaa é Xnb como definido na fórmula geral, em que n é 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 ou mais para Xnb <40 0> 8

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gin Arg Arg Lys Lys Arg Xaa Xaa Xaa

Xaa <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L-TAT-IB1 (ver Tabela 1) <400> 9

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Arg Pro Lys Arg 1 5 10 15

Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gin Vai Pro Arg Ser Gin Asp 20 25 30 <210> 10 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial 61 <220> <223> Péptido L-TAT (genérico) (ver Tabela 1) <220> <221> característica_misc <222> (1)..(38) <223> Fórmula geral: NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-C00H, em que X é qualquer resíduo de aminoácido (nativo), Xna é qualquer resíduo de aminoácido excepto serina e treonina e Xnb é qualquer resíduo de aminoácido; <220> <221> repetição <222> (1)..(7) <223> Xaa é Xnb como definido na fórmula geral, em que n é 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 ou mais para Xnb <22 0> <221> repetição <222> (17)..(21) <223> Xaa é Xna-Xnb como definido na fórmula geral, em que n é 0 ou 1 para Xna e 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 ou mais para Xnb <220> <221> repetição <222> (38)..(38) <223> Xaa é Xnb como definido na fórmula geral, em que n é 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 ou mais para Xnb 62 10 <4 Ο 0>

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30

Xaa Xaa Xaa Gin Asp Xaa 35 <210> 11 <211> 31

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido D-TAT-IBl (ver Tabela 1) <400> 11

Asp Gin Ser Arg Pro Vai Gin Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 15 10 15

Lys Pro Arg Pro Pro Arg Arg Arg Gin Arg Arg Lys Lys Arg Gly 20 25 30 <210> 12 <211> 38

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido D-TAT (genérico) (ver Tabela 1) 63 <220> <221> <222> <223> <22 0> <221> <222> <223> <22 0> <221> <222> <223> <22 0> <221> <222> <223> característica_misc (D · · (38) Fórmula geral: NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-C00H, em que X é qualquer resíduo de aminoácido (nativo), Xna é qualquer resíduo de aminoácido excepto serina e treonina e Xnb é qualquer resíduo de aminoácido; repetição (D · · (7)

Xaa é Xnb como definido na fórmula geral, em que n é 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 ou mais para Xnb repetição (18)..(22)

Xaa é Xna-Xnb como definido na fórmula geral, em que n é 0 ou 1 para Xna e 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 ou mais para Xnb repetição (38) .. (38)

Xaa é Xnb como definido na fórmula geral, em que n é 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 ou mais para Xnb 64 12 <400>

Xaa Asp Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr Pro 15 10 15

Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gin Arg Arg Lys Lys Arg Xaa 20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 <210> 13 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido IB1- long (ver Tabela D <40 0> 13 Pro Gly Thr Gly Cys Gly Asp Thr Tyr Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe Pro Gin Vai Pro Arg Ser Gin Asp Thr 20 25 <210> 14 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido IB2-longo (ver Tabela 1 65 14 <4 Ο 0>

Ile Pro Ser Pro Ser Vai Glu Glu Pro His Lys His Arg Pro Thr Thr 1 5 10 15

Leu Arg Leu Thr Thr Leu Gly Ala Gin Asp Ser 20 25 <210> 15 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido derivado de C-Jun (ver Tabela 1) <400> 15

Gly Ala Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys Ile Leu Lys Gin Ser Met Thr 15 10 15

Leu Asn Leu Ala Asp Pro Vai Gly Asn Leu Lys Pro His 20 25 <210> 16 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido derivado de ATF2 (ver Tabela 1) 66 16 <4 Ο 0>

Thr Asn Glu Asp His Leu Ala Vai Hls Lvs His Lys His Glu Met Thr 15 10 15

Leu Lys Phe Gly Pro Ala Arg Asn Asp Ser Vai Ile Vai 20 25 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido L-IB1 (ver Tabela 1) <400> 17

Asp Thr Tyr Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gin 15 10 15

Vai Pro Arg Ser Gin Asp Thr 20 <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido D-IB1 (ver Tabela 1) 67 18 <4 Ο 0>

Thr Asp Gin Ser Arg Pro Vai Gin Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro 15 10 15

Arg Lys Pro Arg Tyr Thr Asp 20 <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido L-IB (genérico] ) (ver Tabela 1) <220> <221> característica_misc <222> (D · · (17) <223> X é seleccionado de (nativo), qualquer resíduo <22 0> <221> característica_misc <222> (18)..(18) <223> X é seleccionado de serina ou treonina <22 0> <221> característica_misc <222> (19)..(19) <223> X é seleccionado de (nativo), qualquer resíduo de aminoácido de aminoácido 68 19 <4 Ο 0>

Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gin 15 10 15

Asp Xaa Xaa <210> 20 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido D-IB (genérico] ) (ver Tabela 1) <220> <221> característica_misc <222> (D . · (D <223> X é seleccionado de (nativo), qualquer resíduo <22 0> <221> característica_misc <222> (2) . . (2) <223> X é seleccionado de serina ou treonina <22 0> <221> característica_misc <222> (3)..(19) <223> X é seleccionado de (nativo), qualquer resíduo aminoácido aminoácido 69 20 <4 Ο 0>

Xaa Xaa Asp Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr 15 10 15

Pro Arg Xaa <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido L-genérico-TAT (ver Tabela 1) <22 0> <221> característica_misc <222> (D · · (17) <223> X é seleccionado de qualquer resíduo de aminoácido (nativo), <400> 21

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial 70 <220> <223> Péptido D-genérico-TAT (ver Tabela 1) <220> <221> característica_misc <222> (1)..(17) <223> X é seleccionado de qualquer resíduo de aminoácido (nativo), <40 0> 22

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gin Arg Arg Lys Lys Arg Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Xaa <210> 23 <211> 35

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido L-TAT-IB1 (ver Tabela 1) <400> 23

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Asp Thr Tyr Arg 15 10 15

Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gin Vai Pro Arg Ser 20 25 30

Gin Asp Thr 35 71 <210> 24 <211> 42

<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido L-TAT (genérico) (ver Tabela 1) <220> <221> caracteristica_misc <222> (1)..(40) <223> X é seleccionado de qualquer resíduo de aminoácido (nativo), <22 0> <221> característica_misc <222> (41)..(41) <223> X é seleccionado de serina ou treonina <22 0> <221> característica_misc <222> (42)..(42) <223> X é seleccionado de qualquer resíduo de aminoácido (nativo), <400> 24

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa 20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gin Asp Xaa Xaa 35 40 72 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> Thr Asp 1 Arg Lys Lys Arg <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <220> <221> <222> <223> 25 35

PRT

Artificial Péptido D-TAT-IB1 (ver Tabela 1) 25

Gin Ser Arg Pro Vai Gin Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro 5 10 15

Pro Arg Tyr Thr Asp Pro Pro Arg Arg Arg Gin Arg Arg Lys 20 25 30

Gly 35

26 42 PRT

Artificial Péptido D-TAT (ver Tabela 1) característica_misc

(D · · (D X é seleccionado de qualquer resíduo de aminoácido (nativo), 73

<220> <221> característica_misc <222> (2) . . (2) <223> X é seleccionado de serina ou treonina <220> <221> característica_misc <222> (3)..(42) <223> X é seleccionado de qualquer resíduo (nativo), <40 0> 26 Xaa Xaa 1 Asp Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 5 Xaa 10 Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr 15 Pro Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 Xaa Arg Arg Arg Gin Arg Arg 30 Lys Lys Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 Xaa <210> 27 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sonda para ensaio de retardamento em gel <400> 27 CGCTTGATGA GTCAGCCGGA A aminoácido

Tabela 1) 21

Lisboa, 22 de Junho de 2012 74

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Sequência inibidora de JNK consistindo de uma sequência de aminoácidos retro-inversa D de acordo com a SEQ ID N°: 2.
2. Sequência inibidora de JNK da reivindicação 1, em que a sequência inibidora de JNK se liga à c-jun amino terminal cinase (JNK).
3. Sequência inibidora de JNK de qualquer das reivindicações 1 2, em que a sequência inibidora de JNK inibe a activação de, pelo menos, um factor de transcrição visado por JNK quando a sequência inibidora de JNK está presente numa célula que expressa JNK.
4. Sequência inibidora de JNK de qualquer das reivindicações 1 3, em que o factor de transcrição visado por JNK é seleccionado do grupo consistindo de c-Jun, ATF2 e Elkl.
5. Sequência inibidora de JNK de qualquer das reivindicações 1 a 4, em que a sequência inibidora de JNK altera um efeito de JNK quando o péptido está presente numa célula que expressa JNK.
6. Péptido quimérico consistindo de um primeiro e de um segundo dominio ligados por uma ligação covalente, o primeiro dominio compreendendo uma sequência de tráfico e o segundo dominio compreendendo uma sequência inibidora de JNK de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, em que o primeiro domínio está ligado à extremidade do C-terminal do segundo domínio. 1
7. Péptido da reivindicação 6, em que a sequência de tráfico compreende a sequência de aminoácidos de um polipéptido TAT do vírus da imunodeficiência humana.
8. Péptido de qualquer das reivindicações 6 a 7, em que a sequência de tráfico compreende a sequência de L-aminoácidos da SEQ ID N° : 5 ou 7, ou a sequência retro-inversa D de acordo com a SEQ ID N°: 6 ou 8.
9. Péptido de qualquer das reivindicações 6 a 8, em que as sequências de tráfico aumentam a incorporação celular do péptido.
10. Péptido de qualquer das reivindicações 6 a 9, em que a sequência de tráfico dirige a localização nuclear do péptido.
11. Péptido da reivindicação 6 a 10, em que a sequência inibidora de JNK compreende a sequência de aminoácidos retro-inversa D de acordo com a SEQ ID N°: 11.
12. Péptido da reivindicação 6 a 11, em que o péptido compreende ou consiste na sequência de aminoácidos retro-inversa D de acordo com a SEQ ID N°: 11.
13. Composição farmacêutica compreendendo uma sequência inibidora de JNK consistindo de uma sequência de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 ou um péptido quimérico de acordo com qualquer das reivindicações 6 a 12, e um veículo farmaceuticamente aceitável. 2
14. Utilização de uma sequência inibidora de JNK de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 ou um péptido quimérico de acordo com qualquer das reivindicações 6 a 12 para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar uma patofisiologia seleccionada de malignidades do pulmão, mama, linfóide, tracto gastrointestinal e genito-urinário, assim como adenocarcinomas, incluindo malignidades, tais como cancros do cólon, carcinoma de célula renal, cancro da próstata, carcinoma de células não pequenas do pulmão, cancro do intestino delgado e cancro do esófago, assim como leucemia, cancros com transformações oncogénicas Bcr-Abl, psoriase, pênfigo vulgar, sindrome de Behcet, sindrome de dificuldade respiratória aguda (ARDS), doença cardíaca isquémica, sindrome pós-diálise, artrite reumatóide, sindrome da imunodeficiência adquirida, vasculite, choque séptico, restenose, perda de audição, trauma do ouvido, isquemia, acidente vascular cerebral; lesões por reperfusão, hipoxia, efeitos secundários devido a tratamento com citocinas pró-inflamatórias, diabetes, hipertrofia cardíaca e do coração e lesão arteriosclerótica, estados patológicos induzidos por radiação ionizante como utilizada em radioterapia e luz ultravioleta (luz UV) , estados patológicos induzidos por agentes que danificam o ADN, incluindo fármacos quimioterapêuticos, hipo- e hipertermia, doenças inflamatórias, autoinflamatórias, imunes e auto-imunes, doenças degenerativas, miopatias, cardiomiopatias e rejeição de enxerto.
15. Utilização de acordo com a reivindicação 19, em que a composição farmacêutica é para ser administrada através de uma via de administração seleccionada do grupo consistindo de distribuição intraperitoneal, nasal, intravenosa, oral e por penso. 3
16. Kit compreendendo uma sequência inibidora de JNK consistindo de uma sequência de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 e/ou um péptido quimérico de acordo com qualquer das reivindicações 8 a 16. Lisboa, 22 de Junho de 2012 4