BRPI0616824B1

BRPI0616824B1 - peptídeo quimérico, seu uso, composição farmacêutica compreendendo o mesmo, e kit

Info

Publication number: BRPI0616824B1
Application number: BRPI0616824-8A
Authority: BR
Inventors: Christophe Bonny
Original assignee: Xigen Inflammation Ltd.
Priority date: 2005-09-12
Filing date: 2006-09-12
Publication date: 2020-10-27
Also published as: UA98101C2; EP3012266A1; NO20081664L; US20160264630A1; HK1118841A1; US20140200187A1; KR20080052586A; EP2418217B1; HRP20160379T1; SI2418217T1; PL2418217T3; EA200800680A1; ES2567708T3; CN101263157A; DK2418217T3; US20170320917A1; WO2007031280A3; US9290538B2; HK1223948A1; NO342272B1

Abstract

INIBIDORES DE PEPTÍDEO PERMEÁVEL À CÉLULA DA VIA DE TRANSDUÇÃO DE SINAL DE JNK. A presente invenção refere-se a inibidores de proteína quinase e mais especificamente a inibidores da proteína quinase c-Jun amino terminal quinase. Adicionalmente, a presente invenção fornece seqüèncias inibidoras de JNK, peptídeos quiméricos, ácidos nucléicos que codificam os mesmos assim como composições farmacêuticas para tratar patofisiologias associadas a sinalização de JNK.

Description

[001] A presente invenção refere-se a inibidores de proteína qui- nase e mais especificamente a inibidores da proteína quinase c-Jun quinase amino terminal. Além disso, a presente invenção fornece sequências inibidoras de JNK, peptídeos quiméricos, ácidos nucléicos que codificam os mesmos assim como composições farmacêuticas para tratar patofisiologias associadas com a sinalização de JNK.

[002] A c-Jun quinase amino terminal (JNK) é um membro do grupo ativado por estresse das proteínas quinase ativadas por mitóge- no (MAP). Essas quinases têm sido implicadas no controle do crescimento e diferenciação celular e, mais geralmente, na resposta de células a estímulos ambientais. A via de transdução de sinal de JNK é ativada em resposta ao estresse ambiental e pela ação de diversas classes de receptores da superfície celular. Esses receptores podem incluir receptores de citocina, receptores de serpentina e tirosina quinases receptoras. Em células de mamíferos, a JNK tem sido implicada em processos biológicos tais como a transformação oncogênica e mediação de respostas adaptativas mediadas ao estresse ambiental. JNK também está associada com a modulação de respostas imunes, incluindo a maturação e diferenciação de células imunes assim como a efetuação de morte celular programada em células identificadas para des-truição pelo sistema imune. Essa propriedade única torna a sinalização de JNK um alvo promissor para o desenvolvimento de intervenção farmacológica. Dentre diversos distúrbios neurológicos, a sinalização de JNK está particularmente implicada no acidente vascular cerebral isquêmico e doença de Parkinson.

[003] Uma abordagem no combate a distúrbios fortemente relacionados à sinalização de JNK é o fornecimento de inibidores da via de sinalização de JNK. Tais inibidores como já conhecidos na técnica anterior, incluem particularmente, por exemplo, inibidores de quinase à montante (por exemplo, CEP-1347, pequenos inibidores químicos de JNK (SP600125 e AS601245), que afetam diretamente a atividade da quinase, por exemplo, pela competição com o sítio de ligação de ATP da proteína quinase e inibidores de peptídeo da interação entre JNK e seus substratos (D-JNKI e l-JIP) (vide por exemplo, Kuan et al., Current Drug Targets - CNS & Neurological Disorders, Fevereiro de 2005, vol. 4, no. 1, pp. 63-67(5)).

[004] O inibidor da quinase à montante CEP-1347 (KT7515) é um inibidor semi-sintético da família de quinase de linhagem mista. CEP- 1347 (KT7515) promove a sobrevivência neuronal em dosagens que inibem a ativação das c-Jun quinases amino-terminais (JNKs) em culturas embrionárias primárias e células PC12 diferenciadas após a retirada trófica e em camundongos tratados com 1 -metil-4-fenil tetraidropi- ridina. Além disso, CEP-1347 (KT7515) pode promover a sobrevivência a longo prazo de gânglio da raiz dorsal, neurônios simpáticos, cilia-res e motores embrionários de pinto cultivados (vide, por exemplo, Bo- rasio etal., Neuroreport. 9(7): 1435-1439, 11 de maio de 1998.).

[005] Foi descoberto que o pequeno inibidor químico de JNK SP600125 reduz os níveis de fosforilação de c-Jun, para proteger neurônios dopaminérgicos da apoptose, e restaurar parcialmente o nível de dopamina em PD induzida por MPTP em camundongos C57BL/6N (Wang et al., Neurosci Res. 2004 Feb; 48(2); 195-202). Esses resultados indicam ainda que a via de JNK é a principal mediadora dos efeitos neurotóxicos de MPTP in vivo e a inibição da atividade de JNK pode representar uma nova e eficaz estratégia para tratar PD.

[006] Um exemplo adicional de pequenos inibidores químicos é o inibidor de JNK AS601245 anteriormente mencionado. AS601245 inibe a via de sinalização de JNK e promove a sobrevivência celular após isquemia cerebral. In vivo, AS601245 forneceu proteção significativa contra a perda tardia de neurônios CA1 do hipocampo de um modelo de gerbo de isquemia global transitória. Esse efeito é mediado pela inibição de JNK e portanto pela expressão e fosforilação de c-Jun (vide por exemplo, Carboni et al., J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jul; 310(1):25-32. Epub 26 Fev 2004).

[007] Uma terceira classe de inibidores da via de sinalização de JNK representa inibidores de peptídeo da interação entre JNK e seus substratos, como mencionado acima. Como ponto de partida para a construção de tais peptídeos inibidores de JNK um alinhamento de sequência de proteínas JNK de ocorrência natural pode ser usado. Tipicamente, essas proteínas compreendem domínios de ligação de JNK (JBDs) e ocorrem em várias proteínas de ligação a insulina (IB), tais como IB1 ou IB2. Os resultados de tal alinhamento de sequência exemplar é, por exemplo um alinhamento de sequência entre os domínios de ligação de JNK de IB1 [SEQ ID NO: 13], IB2 [SEQ ID NO: 14], c-Jun [SEQ ID NO: 15] e ATF2 [SEQ ID NO: 16] (vide, por exemplo figuras 1A-1C). Tal alinhamento revela uma sequência de 8 aminoáci- dos parcialmente conservada (vide, por exemplo, figura 1A). Uma comparação dos JBDs de IB1 e IB2 ainda revela dois blocos de sete e três aminoácidos que são altamente conservados entre as duas sequências.

[008] Sequências construídas com base em tal alinhamento são, por exemplo, descritas na WO 01/27268. Particularmente, WO 01/27268 descreve pequenos peptídeos de fusão permeáveis à célula, que compreendem uma assim chamada sequência TAT de permeação celular derivada da sequência de tráfego básica da proteína HIV-TAT e um mínimo de 20 aminoácidos da sequência inibidora de IB1. Ambos os componentes estão covalentemente ligados um ao outro. Inibidores exemplares (e até o momento os únicos) da via de sinalização de MAPK-JNK descritos na WO 01/27268, são, por exemplo, L-JNKI1 (peptídeo inibidor de JNK composto de L aminoácidos) ou os peptí- deos D-JNKI1 resistentes a protease (peptídeo inibidor de JNK composto de D aminoácidos não nativos). Esses peptídeos inibidores de JNK (JNKI) são específicos para JNK (JNK1, JNK2 e JNK3). Em contraste a esses pequenos compostos inibidores como discutidos acima, as sequências inibidoras em WO 01/27268, por exemplo, JNKI1, inibem mais especificamente a interação entre JNK e seu substrato. Pela sua sequência de tráfego derivada de TAT, o peptídeo de fusão é transportado eficientemente para as células. Devido às novas propriedades obtidas pelo componente de tráfego, os peptídeos de fusão são transportados ativamente para as células, onde eles permanecem eficazes até a degradação proteolítica.

[009] Entretanto, peptídeos de acordo com a WO 01/27268 ainda são facilmente acessíveis pelas fosforilases (quinases). Qualquer ami- noácido de um peptídeo que serve como um alvo para quinases e, portanto, podem ser submetidos à fosforilação, representa um fator importante para a inativação de tais peptídeos. Portanto, é um primeiro objetivo da presente invenção fornecer novas sequências inibidoras para a via de sinalização de JNK, que retêm as propriedades funcionais dos peptídeos como descrito em WO 01/27268, mas fornecem estabilidade melhorada em relação a fosforilases (quinases).

[0010] Além disso, sequências inibidoras de acordo com WO 01/27268 requerem uma etapa de recuperação e purificação dispendiosa, particularmente se preparada em quantidades em larga escala (por exemplo, para produção industrial). Assim é um segundo objetivo da presente invenção fornecer sequências inibidoras que permitem produção e recuperação mais fácil e econômica do que aquelas da técnica atual.

[0011] Esses objetivos são solucionados por uma sequência inibi- dora de JNK que compreende menos do que 150 aminoácidos de extensão, em que a sequência inibidora de JNK compreende ou consiste em pelo menos uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4 ou uma variante, fragmento ou derivado dessas.

[0012] Preferivelmente, a sequência inibidora de JNK da invenção se liga à JNK e/ou inibe a ativação de pelo menos um fator de transcrição ativado por JNK, por exemplo, c-Jun ou ATF2 (vide, por exemplo, SEQ ID NOs: 15 e 16, respectivamente) ou Elk1.

[0013] Tipicamente, as sequências inibidoras de JNK de acordo com a presente invenção compreendem uma extensão total de menos do que 150 resíduos de aminoácidos, preferivelmente uma faixa de 5 a 150 resíduos de aminoácidos, mais preferivelmente de 10 a 100 resíduos de aminoácidos, ainda mais preferivelmente de 10 a 75 resíduos de aminoácidos e o mais preferivelmente numa faixa de 15 a 50 resíduos de aminoácidos.

[0014] A sequência inibidora de JNK da invenção contém preferivelmente ou consiste em pelo menos uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4 ou um fragmento, variante, ou derivado dessas. Mais preferivelmente, a sequência inibidora de JNK da invenção pode conter 1, 2, 3, 4 ou ainda mais cópias de uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4 ou uma variante, fragmento ou derivado dessas. Se presentes em mais de uma cópia, essas sequências de aminoácidos da invenção de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4 ou variantes, fragmentos ou derivados dessas podem estar ligadas diretamente umas com a outras sem qualquer sequência ligante ou através de uma sequência ligante que compreende 1 a 10, preferivelmente 1 a 5 aminoácidos. Aminoácidos que formam a sequência ligante são preferivelmente selecionados entre glicina e prolina como resíduos de aminoácidos. Mais preferivelmente, essas sequências de aminoácidos da invenção de acordo com SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4 ou fragmentos, variantes, ou derivados dessas podem ser separadas umas da outras por uma dobradiça de dois, três ou mais resíduos de prolina.

[0015] As sequências inibidoras de JNK da invenção como definidas acima podem ser compostas de L-aminoácidos, D-aminoácidos ou uma combinação de ambos. Preferivelmente, as sequências inibidoras de JNK da invenção compreendem pelo menos 1, preferivelmente pelo menos 3, mais preferivelmente pelo menos 6 e ainda mais preferivelmente pelo menos 10 D- e/ou L-aminoácidos, em que os D- e/ou L- aminoácidos podem estar dispostos nas sequências inibidoras de JNK da invenção em forma de blocos ou não, ou de uma forma alternada.

[0016] De acordo com uma modalidade preferida as sequências inibidoras de JNK da invenção podem ser compostas exclusivamente de L-aminoácidos. As sequências inibidoras de JNK da invenção podem então compreender ou consistir em pelo menos uma "sequência inibidora de JNK nativa" de acordo com as SEQ ID NO: 1 ou 3. Nesse contexto, o termo "nativa" ou "sequência(s) inibidora(s) de JNK nati- va(s)" refere-se a sequências inibidoras de JNK da invenção não- alteradas de acordo com qualquer uma das SEQ ID Nos: 1 ou 3, inteiramente composta de L-aminoácidos.

[0017] Conseqüentemente, a sequência inibidora de JNK da invenção pode compreender ou consistir em pelo menos uma sequência de aminoácidos (nativa) NH2-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb- COOH [SEQ ID NO: 3], Como usado nesse contexto, cada X representa um resíduo de aminoácido, preferivelmente selecionado a partir de qualquer resíduo de aminoácido (nativo). Xna representa um resíduo de aminoácido, preferivelmente selecionado a partir de qualquer resíduo de aminoácido exceto serina ou treonina, em que n é 0 ou 1. Além disso, cada Xnb pode ser selecionado a partir de qualquer resíduo de aminoácido, em que n é 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 ou mais, com a condição de que se n for 0 para Xna, Xnb não deve compreender uma serina ou treonina na sua terminação-C, a fim de evitar uma serina ou treonina nessa posição. Preferivelmente, Xnb representa uma fita contígua de resíduos de peptídeos derivada da SEQ ID NO: 1 ou 3. Mais preferivelmente, a sequência inibidora de JNK da invenção pode ainda compreender ou consistir em pelo menos um sequência de aminoácido (nativa) NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH [SEQ ID NO: 1], Xna e Xnb representam tanto D quanto L aminoácidos.

[0018] De acordo com outra modalidade preferida, as sequências inibidoras de JNK da invenção podem ser compostas em parte ou exclusivamente de D-aminoácidos. Mais preferivelmente, essas sequências inibidoras de JNK da invenção compostas de D-aminoácidos são sequências retroinversas D não nativas das sequências inibidoras de JNK acima (nativas). O termo "sequências retroinversas" refere-se a um isômero de uma sequência de peptídeos linear na qual a direção da sequência é reversa e a quiralidade de cada resíduo de aminoácido está invertida (vide, por exemplo, Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368,692-693 (1994)). A vantagem de combinar D-enantiômeros e síntese reversa é que as posições dos grupos carbonila e amino em cada ligação de amida estão trocadas, enquanto que a posição dos grupos da cadeia lateral em cada carbono alfa está preservada. A menos que especificamente estabelecido de outra maneira, presume-se que qualquer dada sequência de L- aminoácido ou peptídeo de acordo com a presente invenção pode ser convertida em uma sequência ou peptídeo D retroinverso pela síntese de um reverso de sequência ou peptídeo para a sequência ou peptídeo de L-aminoácido nativo correspondente.

[0019] As sequências D retroinversas da invenção como definido acima, têm uma variedade de propriedades úteis. Por exemplo, as sequências D retroinversas da invenção entram nas células tão eficientemente quanto as sequências de L-aminoácidos de acordo com a presente invenção, embora as sequências D retroinversas da invenção sejam mais estáveis do que as sequências de L-aminoácidos correspondentes.

[0020] Conseqüentemente, as sequências inibidoras de JNK da invenção podem compreender ou consistir em pelo menos uma sequência D retroinversa de acordo com a sequência de aminoácidos NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-COOH [SEQ ID NO: 4], Como usados nesse contexto, X, Xna e Xnb são como definidos acima (preferivelmente representando D aminoácidos), em que Xnb representa preferivelmente uma fita contígua de resíduos derivados das SEQ ID NO: 2 ou 4. Mais preferivelmente, as sequências inibidoras de JNK da invenção podem compreender ou consistir em pelo menos uma sequência D retroinversa de acordo com a sequência de aminoácidos NH2- DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH [SEQ ID NO: 2],

[0021] As sequências inibidoras de JNK da invenção como descrito acima estão apresentadas na Tabela 1 (SEQ ID Nos: 1-4). A tabela apresenta o nome das sequências inibidoras de JNK da invenção, assim como seus números de identificação de sequência, suas extensões e sequência de aminoácidos. Adicionalmente, sequências da técnica anterior de acordo com WO 01/27268 (SEQ ID NOs: 17-26) também são dadas por razões comparativas. Essas sequências da técnica anterior não são descritas aqui como sequências inibidoras de JNK da invenção ou peptídeos quiméricos da invenção e estão portanto explicitamente excluídas do escopo da presente invenção por meio de uma ressalva.

(Na Tabela 1 sequências exemplares assim como suas fórmulas genéricas são mostradas para as SEQ ID Nos: 1, 2, 5, 6, 9 e 11 e SEQ ID Nos: 3, 4, 7, 8, 10 e 12, respectivamente).

[0022] De acordo com outra modalidade preferida, a sequência inibidora de JNK da invenção compreende ou consiste em pelo menos uma variante, fragmento e/ou derivado das sequências de aminoácidos nativas ou não-nativas da invenção definidas acima de acordo com as SEQ ID Nos: 1, 2, 3 ou 4. Preferivelmente, essas variantes, fragmentos e/ou derivados retêm atividade biológica das sequências inibidoras de JNK nativas ou não nativas da invenção descritas acima, particularmente das sequências de aminoácidos nativas ou não- nativas de acordo com as SEQ ID Nos: 1, 2, 3 ou 4, isto é se ligam a JNK e/ou inibem a ativação de pelo menos um fator de transcrição ativado por JNK, por exemplo c-Jun, ATF2 ou Elk1. A funcionalidade pode ser testada por vários testes, por exemplo, testes de ligação do peptídeo a sua molécula alvo ou por métodos biofísicos, por exemplo, espectroscopia, modelagem computadorizada, análise estrutural, etc. Particularmente, uma sequência inibidora de JNK da invenção ou variantes, fragmentos e/ou derivados dessa podem ser analisados por análise de hidrofilicidade (vide, por exemplo, Hopp & Woods, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 3824-3828) que pode ser utilizada para identificar as regiões hidrofóbicas e hidrofílicas dos peptídeos, auxiliando assim na criação de substratos para manipulação experimental, tal como em experimentos de ligação ou para síntese de anticorpo. Análise estrutural secundária também pode ser realizada para identificar regiões de uma sequência inibidora de JNK (da invenção) ou de variantes, fragmentos e/ou derivados dessa que assumem motivos estruturais específicos (vide, por exemplo, Chou & Fasman, 1974, Bio- chem 13: 222-223). Manipulação, tradução, previsão de estrutura secundária, perfis de hidrofilicidade e hidrofobicidade, previsão de fase de leitura aberta e plotagem e determinação de homologias de sequência podem ser obtidos usando programas de computador disponíveis na técnica. Outros métodos de análise estrutural incluem, por exemplo, cristalografia por raio X (vide, por exemplo, Engstrom, 1974. Biochem Exp Biol 11: 7-13), espectroscopia de massa e cromatografia a gás (vide, por exemplo, METHODS IN PROTEIN SCIENCE, 1997, J. Wiley and Sons, Nova Iorque, NY) e modelagem computadorizada (vide, por exemplo, Fletterick & Zoller, eds., 1986. Computer Graphics and Molecular Modeling, In: CURRENT COMMUNICATIONS IN MOLECULAR BIOLOGY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) também podem ser empregados.

[0023] Conseqüentemente, a sequência inibidora de JNK da invenção pode compreender ou consistir em pelo menos uma variante (nativa ou não nativa) de sequências de aminoácidos de acordo com as SEQ ID Nos.: 1, 2, 3 ou 4. No contexto da presente invenção, "uma variante (nativa ou não nativa) de uma sequência de aminoácido de acordo com as SEQ ID Nos.: 1, 2, 3 ou 4" é preferivelmente uma sequência derivada de qualquer uma das sequências de acordo com as SEQ ID Nos.: 1, 2, 3 ou 4, em que a variante compreende alterações de aminoácidos das sequências de aminoácido de acordo com as SEQ ID Nos.: 1,2, 3 ou 4. Tais alterações compreendem tipicamente 1 a 20, preferivelmente de 1 a 10 e mais preferivelmente 1 a 5 substituições, adições e/ou deleções de aminoácidos de acordo com as SEQ ID Nos.: 1, 2, 3 ou 4, em que a variante exibe uma identidade de sequência com qualquer uma das sequências de acordo com as SEQ ID Nos.: 1, 2, 3 ou 4 de pelo menos cerca de 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou ainda 99%.

[0024] Se variantes das sequências de aminoácidos (nativa ou não nativa) da invenção de acordo com SEQ ID Nos.: 1,2, 3 ou 4 são obtidas pela substituição de aminoácidos específicos, tais substituições compreendem preferivelmente substituições conservativas de aminoácidos. Substituições conservativas de aminoácidos podem incluir resíduos de aminoácidos sinônimos dentro de um grupo que tem propriedades fisicoquímicas suficientemente similares, tal que uma substituição entre membros do grupo preservará a atividade biológica da molécula (vide, por exemplo, Grantham, R. (1974), Science 185, 862-864). É evidente para a pessoa versada na técnica que aminoácidos também podem ser inseridos e/ou deletados nas sequências definidas acima sem alterar suas funções, particularmente se as inserções e/ou deleções envolvem apenas poucos aminoácidos, por exemplo, menos do que vinte e preferivelmente menos do que dez e não removem ou deslocam aminoácidos que são críticos para a atividade funcional. Além disso, substituições devem ser evitadas em variantes da inven-ção, que levam treoninas adicionais em posições de aminoácidos que são acessíveis a uma fosforilase, preferivelmente uma quinase, a fim de evitar inativação das sequências inibidoras de JNK da invenção ou do peptídeo quimérico da invenção in vivo ou in vitro.

[0025] Preferivelmente, resíduos de aminoácidos sinônimos, que são classificados nos mesmos grupos e são tipicamente intercambiá- veis pelas substituições conservatives de aminoácidos, são definidos na Tabela 2. TABELA 2 Grupos Preferidos de Resíduos de Aminoácidos Sinônimos Aminoácido Resíduo Sinônimo

[0026] Uma forma específica de uma variante de SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4 de acordo com a invenção é um fragmento das sequências de aminoácidos (nativas ou não nativas) de acordo com as SEQ ID Nos.: 1, 2, 3 ou 4, que é tipicamente alterado por pelo menos uma de- leção quando comparado com as SEQ ID NOs 1, 2, 3 ou 4. Preferivelmente, um fragmento compreende pelo menos 4 aminoácidos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4, uma extensão tipicamente suficiente para permitir o reconhecimento específico de um epítopo a partir de qualquer uma dessas sequências. Ainda mais preferivelmente, o fragmento compreende 4 a 18, 4 a 15 ou o mais preferivelmente 4 a 10 aminoácidos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4. Aminoácidos deletados podem ocorrer em qualquer posição das SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4, preferivelmente N- ou C- terminalmente. Em particular, peptídeos da SEQ ID NO: 2 (DQS- RPVQPFLNLTTPRKPR) podem ser deletados na sua terminação N- e/ou C- por 1, 2, 3, 4, ou 5 aminoácidos. Em outras palavras, versões mais curtas preferidas de SEQ ID NO: 2 podem ter a sequência QSRPVQPFLNLTTPRKPR, SRPVQPFLNLTTPRKPR, RPVQPFLN- LTTPRKPR, PVQPFLNLTTPRKPR, ou VQPFLNLTTPRKPR ou, respectivamente, DQSRPVQPFLNLTTPRKP, DQSRPVQPFLNLTTPRK, DQSRPVQPFLNLTTPR, DQSRPVQPFLNLTTP, DQSRPVQPFLNLTT, ou QSRPVQPFLNLTTPRKP, SRPVQPFLNLTTPRKP, SRPVQPFLN- LTTPRK, RPVQPFLNLTTPRKP, RPVQPFLNLTTPRK ou PVQPFLN- LTTP. Quanto mais curta a sequência de peptídeo da invenção usada, mais baixa sua toxicidade celular inespecífica. Em certas modalidades, os peptídeos usados devem ter a sequência mais curta possível, que ainda retém a função biológica, por exemplo, a função inibidora de JNK.

[0027] Além disso, um fragmento das sequências de aminoácidos da invenção (nativas ou não nativas) de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4 pode ser definido como uma sequência que partilha uma identidade de sequência com qualquer uma das sequências de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4 de pelo menos cerca de 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou mesmo 99%.

[0028] As sequências inibidoras de JNK da invenção podem ainda compreender ou consistir em pelo menos um derivado das sequências de aminoácidos (nativas ou não nativas) de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4. Nesse contexto, "um derivado de uma sequência de aminoácido (nativa ou não-nativa) de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4" é preferivelmente uma sequência de aminoácido derivada de qualquer uma das sequências de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4, em que o derivado compreende pelo menos um L- ou D- aminoácido modificado (que forma aminoácido(s) não-natural(is)), preferivelmente 1 a 20, mais preferivelmente 1 a 10 e ainda mais preferivelmente 1 a 5 L- ou D-aminoácidos modificados. Derivados de variantes ou fragmentos também caem dentro do escopo da presente invenção.

[0029] Qualquer um dos peptídeos descritos aqui pode ter uma modificação em suas terminações, tanto na terminação C quanto N ou ambas. A terminação C pode ser preferivelmente modificada por uma modificação de amida, enquanto a terminação N pode ser modificada por qualquer grupo de proteção de NH2 adequado, tal como, por exemplo, acilação.

[0030] "Um aminoácido modificado" nesse contexto pode ser qualquer aminoácido que é alterado, por exemplo, por glicosilação diferente em vários organismos, por fosforilação ou por marcação específica de aminoácidos. Tal marcador é então tipicamente selecionado a partir do grupo de marcadores que compreende:

[0031] (i) marcadores radioativos, isto é fosforilação radioativa ou um marcador radioativo com enxofre, hidrogênio, carbono, nitrogênio, etc.;

[0032] (ii) corantes coloridos (por exemplo, digoxigenina, etc.);

[0033] (iii) grupos fluorescentes (por exemplo, fluoresceina, etc.);

[0034] (iv) grupos quimioluminescentes;

[0035] (v) grupos para imobilização em uma fase sólida (por exemplo, His-tag, biotina, estrep-tag, flag-tag, anticorpos, antígeno, etc.); e

[0036] (vi) uma combinação de marcadores de dois ou mais dos marcadores mencionados sob (i) a (v).

[0037] No contexto acima, uma sequência de aminoácidos que tem uma sequência que "partilha uma identidade de sequência" de, pelo menos, por exemplo, 95% com uma sequência de aminoácidos pesquisada da presente invenção, pretende significar que a sequência da sequência de aminoácidos objeto é idêntica à sequência pesquisada exceto que a sequência de aminoácidos objeto pode incluir até cinco alterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos pesquisada. Em outras palavras, para se obter uma sequência de aminoácidos que tem uma sequência de pelo menos 95% de identidade com uma sequência de aminoácidos pesquisada, até 5% (5 de 100) dos resíduos de aminoácidos na sequência objeto podem ser inseridos ou substituídos por outros aminoácidos ou dele- tados.

[0038] Para sequências sem correspondência exata, um "% de identidade" de uma primeira sequência pode ser determinado com relação a uma segunda sequência. Em geral, essas duas sequências a ser comparadas são alinhadas para dar uma correlação máxima entre as sequências. Isso pode incluir inserir "intervalos" tanto em uma quanto em ambas as sequências para aumentar o grau de alinhamento. Uma % de identidade pode então ser determinada sobre a extensão completa de cada uma das sequências sendo comparadas (o chamado alinhamento global), que é particularmente adequado para sequências de mesma extensão ou extensão similar, ou sobre extensões mais curtas, definidas (o chamado alinhamento local), que é mais adequado para sequências de extensão desigual.

[0039] Métodos para comparar a identidade e homologia de duas ou mais sequências são bem-conhecidos na técnica. Assim, por exemplo, programas disponíveis no Wisconsin Sequence Analysis Package, versão 9.1 (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 387-395.), por exemplo os programas BESTFIT e GAP podem ser usados para determinar o % de identidade entre dois polinucleotídeos e o % de identidade e % de homologia entre duas sequências de poli- peptídeo. BESTFIT usa o algoritmo de "homologia local" de (Smith & Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197.) e encontra a melhor região única de similaridade entre duas sequências. Outros programas para determinar a identidade e/ou similaridade entre sequências também são conhecidos na técnica, por exemplo a família de programas BLAST (Altschul et ai., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410), acessível através da página da internet do NCBI no site da rede de alcance mundial ncbi.nlm.nih.gov) e FASTA (Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98; Pearson & Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444 - 2448.).

[0040] Sequências inibidoras de JNK de acordo com a presente invenção podem ser obtidas ou produzidas por métodos bem- conhecidos na técnica, por exemplo, por síntese química ou por métodos de manipulação genética como discutido abaixo. Por exemplo, um peptídeo que corresponde a uma porção de uma sequência inibidora de JNK da invenção incluindo uma região desejada da dita sequência inibidora de JNK, ou que media a atividade desejada in vitro ou in vivo pode ser sintetizado pelo uso de um sintetizador de peptídeo.

[0041] De acordo com um segundo aspecto a presente invenção fornece um peptídeo quimérico que inclui pelo menos um primeiro domínio e pelo menos um segundo domínio, em que o primeiro domínio compreende uma sequência de tráfego, enquanto que o segundo do- mínio compreende uma sequência inibidora de JNK da invenção como definido acima.

[0042] Tipicamente, peptídeos quiméricos de acordo com a presente invenção têm uma extensão de pelo menos 25 resíduos de aminoácidos, por exemplo, 25 a 250 resíduos de aminoácidos, mais preferivelmente de 25 a 200 resíduos de aminoácidos, ainda mais preferivelmente 25 a 150 resíduos de aminoácidos, 25 a 100 e o mais preferivelmente 25 a 50 resíduos de aminoácidos.

[0043] Como um primeiro domínio o peptídeo quimérico da invenção compreende preferivelmente uma sequência de tráfego, que é selecionada tipicamente a partir de qualquer sequência de aminoácidos que direciona um peptídeo (no qual ela está presente) para um destino celular desejado. Assim, a sequência de tráfego, como usada aqui, direciona tipicamente o peptídeo através da membrana plasmática, por exemplo, para fora da célula, através da membrana plasmática, e para dentro do citoplasma. Alternativamente, ou em adição, a sequência de tráfego pode direcionar o peptídeo a uma localização desejada dentro da célula, por exemplo, o núcleo, o ribossomo, o retículo endoplasmá- tico (ER), um lissoma ou peroxissoma, por exemplo, por combinar dois componentes (por exemplo, um componente para permeabilidade celular e um componente para localização nuclear) ou por um único componente que tem, por exemplo, propriedades de transporte pela membrana celular e transporte direcionado, por exemplo, intranuclear. A sequência de tráfego pode compreender adicionalmente outro componente que é capaz de se ligar a um componente citoplasmático ou qualquer outro componente ou compartimento da célula (por exemplo, retículo endoplasmático, mitocôndria, aparelho de "gloom", vesículas lisossomais). Conseqüentemente, por exemplo, a sequência de tráfego do primeiro domínio e a sequência inibidora de JNK do segundo domínio podem estar localizadas no citoplasma ou em qualquer outro com- partimento da célula. Isso permite determinar a localização do peptí- deo quimérico na célula após a absorção.

[0044] Preferivelmente, a sequência de tráfego (estando incluída no primeiro domínio do peptídeo quimérico da invenção) tem uma extensão de 5 a 150 sequências de aminoácidos, mais preferivelmente uma extensão de 5 a 100 e o mais preferivelmente uma extensão de 5 a 50, 5 a 30 ou até 5 a 15 aminoácidos.

[0045] Mais preferivelmente, a sequência de tráfego (contida no primeiro domínio do peptídeo quimérico da invenção) pode ocorrer como uma fita contínua de sequência de aminoácidos no primeiro domínio. Alternativamente, a sequência de tráfego no primeiro domínio pode ser clivada em dois ou mais fragmentos, em que todos esses fragmentos se assemelham a sequência de tráfego inteira e podem estar separados um do outro por 1 a 10, preferivelmente 1 a 5 aminoácidos, com a condição de que a sequência de tráfego como tal mantenha suas propriedades transportadoras como descrito acima. Esses aminoácidos que separam os fragmentos da sequência de tráfego podem, por exemplo, ser selecionados a partir de sequências de aminoácidos que diferem da sequência de tráfego. Alternativamente, o primeiro domínio pode conter uma sequência de tráfego composta por mais de um componente, cada componente com sua própria função para o transporte da sequência inibidora JNK carga do segundo domínio para, por exemplo, um compartimento celular específico.

[0046] A sequência de tráfego como definida acima pode ser composta de L-aminoácidos, D-aminoácidos ou um combinação de ambos. Preferivelmente, as sequências de tráfego da invenção compreendem pelo menos 1, preferivelmente pelo menos 3, mais preferivelmente pelo menos 6 e ainda mais preferivelmente pelo menos 10 L- aminoácidos e/ou D-aminoácidos, em que os D e/ou L-aminoácidos podem ser arranjados nas sequências de tráfego de JNK da invenção em forma de blocos ou não, ou de uma maneira alternativa.

[0047] De acordo com uma modalidade alternativa, a sequência de tráfego do peptídeo quimérico da invenção pode ser composta exclusivamente de L-aminoácidos. Mais preferivelmente, a sequência de tráfego do peptídeo quimérico da invenção compreende ou consiste em pelo menos uma sequência de tráfego "nativa" como definido acima. Nesse contexto, o termo "nativa" refere-se a sequências de tráfego não alteradas, compostas inteiramente de L-aminoácidos.

[0048] De acordo com outra modalidade alternativa, a sequência de tráfego do peptídeo quimérico da invenção pode ser composta exclusivamente de D-aminoácidos. Mais preferivelmente, a sequência de tráfego do peptídeo quimérico da invenção pode compreender um peptídeo D retroinverso das sequências como apresentado acima.

[0049] A sequência de tráfego do primeiro domínio do peptídeo quimérico da invenção pode ser obtida a partir de fontes que ocorrem naturalmente ou pode ser produzida pelo uso de técnicas de manipulação genética ou síntese química (vide, por exemplo, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. 2a edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

[0050] Fontes para a sequência de tráfego do primeiro domínio podem ser empregadas incluindo, por exemplo, proteínas nativas tais como, por exemplo, a proteína TAT (por exemplo, como descrito nas Patentes US Nos. 5.804.604 e 5.674.980, cada uma dessas referências estando incorporadas aqui por referência), VP22 (descrita em, por exemplo, WO 97/05265; Elliott & O'Hare, Cell 88: 223-233 (1997)), proteínas não virais (Jackson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10691- 10695 (1992)), sequências de tráfego derivadas de Antennapedia (por exemplo, a sequência transportadora de antennapedia) ou de peptídeos básicos, por exemplo, peptídeos que têm uma extensão de 5 a 15 aminoácidos, preferivelmente 10 a 12 aminoácidos e que compreendem pelo menos 80%, mais preferivelmente 85% ou ainda 90% de aminoácidos básicos, tais como por exemplo, arginina, lisina e/ou his- tidina. Além disso, variantes, fragmentos e derivados de uma das proteínas nativas usadas como sequências de tráfego são descritos na presente descrição. Com relação a variantes, fragmentos e derivados refere-se à definição dada acima para sequências inibidoras de JNK. Variantes, fragmentos assim como derivados são correspondentemente definidos como apresentado acima para sequências inibidoras de JNK. Particularmente, no contexto de sequência de tráfego, uma variante ou fragmento ou derivado pode ser definido como uma sequência que partilha uma identidade de sequência com uma das proteínas nativas usadas como sequências de tráfego como definido acima de pelo menos cerca de 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou mesmo 99%.

[0051] Em uma modalidade preferida do peptídeo quimérico da invenção, a sequência de tráfego do primeiro domínio compreende ou consiste em uma sequência derivada da proteína TAT do vírus da imunodeficiência humana (HIV) 1, particularmente alguns ou todos os 86 aminoácidos que compõem a proteína TAT.

[0052] Para uma sequência de tráfego da invenção, sequências parciais da proteína TAT de extensão completa podem ser usadas formando um fragmento funcionalmente eficaz de uma proteína TAT, isto é, um peptídeo TAT que inclui a região que media a entrada e absorção nas células. Se tal sequência é ou não um fragmento funcionalmente eficaz da proteína TAT pode ser determinado usando técnicas conhecidas (vide, por exemplo, Franked et al., Proc. Natl. Acad. Sei, USA 86: 7397-7401 (1989)). Assim, a sequência de tráfego no primeiro domínio do peptídeo quimérico da invenção pode ser derivada de um fragmento funcionalmente eficaz ou uma porção de uma se- quência de uma proteína TAT que compreende pelo menos 86 aminoácidos, e que exibe absorção para dentro de células e opcionalmente absorção para o núcleo da célula. Mais preferivelmente, sequências parciais (fragmentos) de TAT a ser usadas como transportadores para mediar a permeação do peptídeo quimérico através da membrana celular, pretendem compreender a região básica (aminoácidos de 48 a 57 ou 49 a 57) de TAT de extensão completa.

[0053] De acordo com uma modalidade mais preferida, a sequência de tráfego da invenção pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos que contém os resíduos 48-57 ou 49 a 57 de TAT, e o mais preferivelmente uma sequência genérica de TAT NH2- Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-COOH [SEQ ID NO: 7], em que Xnb é como definido acima. Alternativamente, a sequência de tráfego da invenção pode compreender ou consistir em um peptídeo que contém, por exemplo, a sequência de aminoácidos NH2-GRKKRRQRRR-COOH [SEQ ID NO: 5],

[0054] De acordo com outra modalidade preferida a sequência de tráfego da invenção pode compreender um peptídeo D retroinverso das sequências como apresentadas acima, isto é, a sequência D retro- inversa da sequência genérica de TAT que tem a sequência NH2-Xnb- RRRQRRKKR-Xnb-COOH [SEQ ID NO: 8], Aqui também Xnb é como definido acima (preferivelmente representando D aminoácidos). Além disso, 0 número de resíduos "Xnb" em qualquer uma das SEQ ID NOs: 7-8 não é limitado àquele descrito e pode variar como descrito acima. O mais preferivelmente, a sequência de tráfego da invenção pode compreender a sequência D retroinversa NH2-RRRQRRKKRG-COOH [SEQ ID NO: 6],

[0055] De acordo com outra modalidade a sequência de tráfego da invenção pode compreender ou consistir em variantes das sequências de tráfego como definidas acima. Uma "variante de uma sequência de tráfego" é preferivelmente uma sequência derivada de uma sequência de trâns tráfego ito como definida acima, em que a variante compreende uma modificação, por exemplo adição, deleção (interna) (levando a fragmentos) e/ou substituição de pelo menos um aminoácido presente na sequência de tráfego como definido acima. Tal(is) modifica- ção(ões) compreende(m) tipicamente 1 a 20, preferivelmente 1 a 10 e mais preferivelmente 1 a 5 substituições, adições e/ou deleções de aminoácidos. Além disso, a variante exibe preferivelmente uma identidade de sequência com sequência de tráfego como definido acima, mais preferivelmente com qualquer uma das SEQ ID Nos: 5 a 8, de pelo menos cerca de 30%, 50%, 70%, 80%,90%, 95%, 98% ou até 99%.

[0056] Preferivelmente, tal modificação da sequência de tráfego leva a uma sequência de tráfego com estabilidade aumentada ou diminuída. Alternativamente, variantes da sequência de tráfego podem ser desenhadas para modular a localização intracelular do peptídeo quimérico da invenção. Quando adicionadas exogenamente, tais variantes como definidas acima são tipicamente desenhadas tal que a habilidade da sequência de tráfego de entrar nas células é mantida (isto é, a absorção da variante da sequência de tráfego na célula é subs-tancialmente similar àquela da sequência de tráfego da proteína nativa usada). Por exemplo, alteração da região básica tida como importante para a localização nuclear (vide, por exemplo, Dang & Lee, J. Biol. Chem. 264: 18019-18023 (1989); Hauber etal., J. Virol. 63: 1181-1187 (1989); Ruben et al., J. Virol. 63: 1-8 (1989)) pode resultar em uma localização citoplasmática ou localização parcialmente citoplasmática da sequência de tráfego, e portanto da sequência inibidora de JNK como componente do peptídeo quimérico da invenção. Além do acima, modi-ficações adicionais podem ser introduzidas na variante, por exemplo, por ligar por exemplo colesterol ou outras porções lipídicas à sequên- cia de tráfego para produzir uma sequência de tráfego que tem solubilidade à membrana aumentada. Qualquer uma das variantes descritas acima das sequências de tráfego da invenção podem ser produzidas usando técnicas tipicamente conhecidas pela pessoa versada na técnica (vide por exemplo, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. 2a edição. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

[0057] Como um segundo domínio, o peptídeo quimérico da invenção compreende tipicamente uma sequência inibidora de JNK da invenção, selecionada a partir de qualquer uma das sequências inibidoras de JNK da invenção como definido acima, incluindo variantes, fragmentos e/ou derivados dessas sequências inibidoras de JNK da invenção.

[0058] Ambos os domínios, isto é o primeiro e segundo domínio(s) do peptídeo quimérico da invenção podem estar ligados tal como para formar uma unidade funcional. Qualquer método para ligar o primeiro e segundo domínio(s) como geralmente conhecido na técnica pode ser aplicado.

[0059] De acordo com uma modalidade, o primeiro e segundo do- mínio(s) do peptídeo quimérico da invenção estão preferivelmente ligados por uma ligação covalente. Uma ligação covalente, como definida aqui, pode ser, por exemplo, uma ligação peptídica, que pode ser obtida pela expressão da proteína quimérica da invenção como uma proteína de fusão. Proteínas de fusão, como descritas aqui, podem ser formadas e usadas de maneiras análogas ou prontamente adaptáveis a partir de técnicas de DNA recombinante, como descrito abaixo. En-tretanto, ambos os domínios também podem ser ligados através de cadeias laterais ou podem ser ligados por uma porção química ligante.

[0060] O primeiro e/ou segundo domínios do peptídeo quimérico da invenção podem ocorrer em uma ou mais cópias no peptídeo qui- mérico da invenção. Se ambos os domínios estão presentes em uma única cópia, o primeiro domínio pode estar ligado tanto a terminação N quanto C do segundo domínio. Se estiver presente em múltiplas có-pias, o primeiro e segundo domínios podem estar arranjados em qualquer ordem possível. Por exemplo, o primeiro domínio pode estar presente no peptídeo quimérico da invenção em um número múltiplo de cópias, por exemplo, em duas, três ou mais cópias, que estão arrumadas preferivelmente em ordem consecutiva. Então, o segundo domínio pode estar presente em uma única cópia que ocorre na terminação N ou C da sequência que compreende o primeiro domínio. Alternativa-mente, o segundo domínio pode estar presente em um número múltiplo de cópias, por exemplo, em duas, três ou mais cópias, e o primeiro domínio pode estar presente em uma única cópia. De acordo com ambas as alternativas, o primeiro e segundo domínios podem ocupar qualquer lugar em um arranjo consecutivo. Arranjos exemplares são mostrados a seguir: por exemplo, primeiro domínio - primeiro domínio - primeiro domínio - segundo domínio; primeiro domínio - primeiro domínio - segundo domínio - primeiro domínio; primeiro domínio - segundo domínio - primeiro domínio - primeiro domínio; ou, por exemplo, segundo domínio - primeiro domínio - primeiro domínio - primeiro domínio. É bem-compreendido por uma pessoa versada que esses exemplos são apenas para fins ilustrativos e não devem limitar o escopo da invenção a eles. Assim, o número de cópias e o arranjo podem ser variados como definido inicialmente.

[0061] Preferivelmente, o primeiro e segundo domínios podem estar ligados diretamente um ao outro sem nenhum ligante. Alternativamente, eles podem estar ligados um com o outro através de uma sequência ligante que compreende 1 a 10, preferivelmente 1 a 5 aminoácidos. Aminoácidos que formam a sequência ligante são preferivelmente selecionados entre glicina ou prolina como resíduos de aminoá- eidos. Mais preferivelmente, o primeiro e segundo domínio(s) podem estar separados um do outro por uma dobradiça de dois, três ou mais resíduos de prolina entre o primeiro e segundo domínios.

[0062] O peptídeo quimérico da invenção como definido acima, compreendendo pelo menos um primeiro e pelo menos um segundo domínio, pode ser composto por L-aminoácidos, D-aminoácidos ou uma combinação de ambos. Nesse, cada domínio (assim como os li- gantes usados) pode ser composto de L-aminoácidos, D-aminoácidos ou uma combinação de ambos (por exemplo, D-TAT e L-IB1 (s) ou L- TAT e D-IB1 (s), etc.). Preferivelmente, o peptídeo quimérico da invenção compreende pelo menos 1, preferivelmente pelo menos 3, mais preferivelmente pelo menos 6 e ainda mais preferivelmente pelo menos 10 L-aminoácidos e/ou D-aminoácidos, em que D- e L- aminoácidos podem estar arranjados no peptídeo quimérico da invenção em forma de blocos ou não, ou de uma maneira alternada.

[0063] De acordo com uma modalidade específica o peptídeo quimérico da invenção compreende ou consiste em peptídeos quiméricos de L-aminoácidos de acordo com o peptídeo genérico L-TAT-IB [NH2- Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-COOH, SEQ ID NO: 10], em que X, Xna e Xnb são preferivelmente como definido acima. Mais preferivelmente, 0 peptídeo quimérico da invenção compreende ou consiste no peptídeo quimérico de L-aminoácidos L-TAT-IB1 [NH2- GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH, SEQ ID NO: 9]-

[0064] De acordo com uma modalidade específica alternativa 0 peptídeo quimérico da invenção compreende ou consiste em peptídeos quiméricos de D-aminoácidos dos peptídeos quiméricos de L- aminoácidos descritos acima. Exemplares de peptídeos quiméricos D retroinversos de acordo com a presente invenção são, por exemplo, 0 peptídeo genérico D-TAT-IB [NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb- RRRQRRKKR-Xnb-COOH, SEQ ID NO: 12]. Aqui, X, Xna e Xnb são preferivelmente como definidos acima (preferivelmente representando D- aminoácidos). Mais preferivelmente, o peptídeo quimérico da invenção compreende ou consiste em peptídeos quiméricos de D-aminoácidos de acordo com o peptídeo TAT-IB1 [NH2- DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH, SEQ ID NO: 11], Entretanto, a porção ligante do primeiro e segundo domínios (ao invés de PP) pode ser composta por Xna - Xnb que são como definidos acima. Em particular, o(s) segundo(s) domínio(s) da SEQ ID NO: 11, eventualmente com -Xna-Xnb- ao invés de (PP), pode(m) ser deleta- do(s) nas suas terminações N ou C por 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos. Em outra modalidade preferida, 0 primeiro domínio da SEQ ID NO: 11 pode ser deletado em suas terminações N ou C por 1 ou 2 aminoácidos. Essa(s) deleção(ões) pode(m) ser combinada(s) com a(s) dele- ção(ões) descrita(s) para os resíduos de aminoácidos das terminações do segundo domínio. Conseqüentemente, variantes preferidas de SEQ ID NO:11 são, por exemplo, as seguintes sequências com deleções do segundo domínio em sua(s) terminação(ões) N e/ou C: QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, SRPVQPFLN- LTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb- RRRQRRKKRG, PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, ou VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG ou, respectivamente, DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, DQS- RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, DQSRPVQPFLN- LTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb- RRRQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, ou QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, SRPVQPFLN- LTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb- RRRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG ou PVQPFLNLTTP-Xna- Xnb-RRRQRRKKRG. Modalidades preferidas que contêm deleções meramente na(s) terminação(ões) do primeiro domínio são: QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, QSRPVQPFLN- LTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb- RRQRRKKRG, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR, QSRPVQPFLN- LTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKR, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb- RQRRKK. Exemplos de combinações de deleções no primeiro e segundo domínios são: QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb- RRRQRRKKR, SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, PVQPFLN- LTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, ou VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb- RRRQRRKKR ou, respectivamente, DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna- Xnb-RRRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, DQSRPVQPFLN- LTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb- RRRQRRKKR, ou QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, SRPVQPFLNLTTPRK- Xna-Xnb-RRRQRRKKR, RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKR ou PVQPFLNLTTP-Xna- Xnb-RRRQRRKKR, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK, SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, RPVQPFLN- LTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK, PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb- RRRQRRKK, ou VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK ou, respectivamente, DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKK, DQS- RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKK, DQSRPVQPFLNLTTPR- Xna-Xnb-RRRQRRKK, DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKK, DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRRQRRKK, ou QSRPVQPFLN- LTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKK, SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb- RRRQRRKK, SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKK, RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKK, RPVQPFLNLTTPRK-Xna- Xnb-RRRQRRKK ou PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKK, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR, SRPVQPFLN- LTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR, RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb- RRQRRKKR, PVQPFLNLTTPRKPR-Xπa-Xnb-RRQRRKKR, ou VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR ou, respectivamente, DQS- RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKR, DQSRPVQPFLN- LTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb- RRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xπb-RRQRRKKR, DQS- RPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRQRRKKR, ou QSRPVQPFLNLTTPRKP- Xna-Xnb-RRQRRKKR, SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKP- Xna-Xnb-RRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG ou PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, QSRPVQPFLNLTTPRKPR- Xna-Xnb-RRQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb- RRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, ou VQPFLN- LTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG ou, respectivamente, DQS- RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, DQSRPVQPFLN- LTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb- RRQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xπb-RRQRRKKRG, DQS- RPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, ou QSRPVQPFLNLTTPRKP- Xna-Xnb-RRQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb- RRQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRK- Xna-Xnb-RRQRRKKRG ou PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG, SRPVQPFLN- LTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb- RQRRKKRG, PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xπb-RQRRKKRG, ou VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG ou, respectivamente, DQS- RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RQRRKKRG, DQSRPVQPFLN- LTTPRK-Xna-Xnb-RQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb- RQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RQRRKKRG, DQS- RPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RQRRKKRG, ou QSRPVQPFLNLTTPRKP- Xna-Xnb-RQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKP- Xna-Xnb-RQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RQRRKKRG ou PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RQRRKKRG. Novamente, quanto menores forem os peptídeos, menor sua toxicidade celular (inespecífica). Entretanto, os peptídeos devem manter sua função biológica, isto é sua permeabilidade pela membrana celular (primeiro domínio) e sua função inibidora de JNK (segundo domínio).

[0065] O primeiro e segundo domínio(s) do peptídeo quimérico da invenção como definido acima podem ser ligados um ao outro por acoplamento químico ou bioquímico realizado de qualquer maneira conhecida na técnica, por exemplo, pelo estabelecimento de uma ligação peptídica entre o primeiro e segundo domínio(s), por exemplo pela expressão do primeiro e segundo domínio(s)como uma proteína de fusão, ou por exemplo por reticulação do primeiro e segundo domí- nio(s)do peptídeo quimérico da invenção.

[0066] Vários métodos de reticulação química são inespecíficos, isto é, eles não se direcionam ao ponto de acoplamento de qualquer sítio em particular no polipeptídeo de transporte ou macromolécula de carga. Como um resultado, o uso de agentes de reticulação inespecíficos pode atacar sítios funcionais ou sítios de bloqueio estericamente ativos, tornando as proteínas conjugadas biologicamente inativas. Assim, preferivelmente tais métodos de reticulação são usados, o que permite um acoplamento mais específico do primeiro e segundo domí- nio(s).

[0067] Uma maneira de aumentar a especificidade do acoplamen- to é um acoplamento químico direto a um grupo funcional presente apenas uma vez ou poucas vezes em um ou ambos o primeiro e segundo domínios a serem reticulados. Por exemplo, cisteína que é o único aminoácido de proteína que contém um grupo tiol, ocorre em várias proteínas apenas poucas vezes. Também, por exemplo, se um polipeptídeo não contém resíduos de lisina, um reagente de reticula- ção específico para aminas primárias será seletivo para a terminação amina daquele polipeptídeo. A utilização bem-sucedida dessa abordagem para aumentar a especificidade de acoplamento requer que o polipeptídeo tenha resíduos adequadamente raros e reativos em áreas da molécula que podem ser alteradas sem perda da atividade biológica da molécula.

[0068] Resíduos de cisteína podem ser substituídos quando eles ocorrem em partes de uma sequência de polipeptídeo onde sua participação em uma reação de reticulação poderia provavelmente interferir de outra forma com a atividade biológica. Quando um resíduo de cisteína é substituído, é tipicamente desejável minimizar as alterações resultantes no enovelamento do polipeptídeo. Alterações no enovelamento do polipeptídeo são minimizadas quando a substituição é qui-micamente ou estericamente similar à cisteína. Por essas razões, a serina é preferida como substituinte para cisteína. Como demonstrado nos exemplos abaixo, um resíduo de cisteína pode ser introduzido em uma sequência de aminoácido de um polipeptídeo para fins de reticulação.

[0069] Quando um resíduo de cisteína é introduzido, a introdução próxima ou na terminação amina ou carboxila é preferida. Métodos convencionais estão disponíveis para tais modificações de sequência de aminoácidos, em que o polipeptídeo de interesse é produzido por síntese química ou através de expressão de DNA recombinante.

[0070] O acoplamento do primeiro e segundo domínio(s) também pode ser obtido através de um agente de acoplamento ou de conjugação. Existem vários reagentes de reticulação intermolecular que podem ser utilizados (vide, por exemplo, Means & Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, pp. 39-43). Dentre esses reagentes estão, por exemplo, propionate de N-succinimidil 3-(2-piridilditio) (SPDP) ou N,N'-(1,3-fenileno) bismaleimida (ambos os quais são altamente específicos para grupos de sulfidrila e formam ligações irreversíveis); N, N'-etileno-bis-(iodoacetamida) ou outro reagente que tem 6 a 11 ligações de metileno de carbono (que são relativamente específicas para grupos de sulfidrila); e 1,5-diflúor-2,4- dinitrobenzeno (que forma ligações irreversíveis com grupos amino e tirosina). Outros reagentes de reticulação úteis para esse propósito incluem: p,p'-diflúor-m, m'-dinitrodifenilsulfona que forma reticulações irreversíveis com grupos amina e fenólicos; adipimidato de dimetila (que é específico para grupos amino); fenol-1,4 dissulfonilcloreto (que reage principalmente com grupos amino); hexametilenodiisocianato ou diisotiocianato, ou azofenil-p-diisocianato (que reage principalmente com grupos amina); glutaraldeído (que reage com várias cadeias late-rais diferentes) e disdiazobenzidina (que reage primariamente com tirosina e histidina).

[0071] Reagentes de reticulação podem ser homobifuncionais, isto é, que tem dois grupos funcionais que sofrem a mesma reação. Um reagente de reticulação homobifuncional preferido é bismaleimidohe- xano ("BMH"). BMH contém dois grupos funcionais de maleimida, que reagem especificamente com compostos que contem sulfidrila sob condições moderadas (pH 6,5 - 7,7). Os dois grupos de maleimida estão conectados por uma cadeia de hidrocarboneto. Portanto, BMH é útil para reticulação irreversível de polipeptídeos que contêm resíduos de cisteína.

[0072] Reagentes de reticulação também podem ser heterobifun- cionais. Agentes de reticulação heterobifubcionais têm dois grupos funcionais diferentes, por exemplo um grupo que reage com amina e um grupo que reage com tiol, que irão reticular duas proteínas que tem aminas e tióis livres, respectivamente.

[0073] Exemplos de agentes de reticulação heterobifuncionais são 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidila ("SMCC"), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida ("MBS"), e butirato de succinimida 4-(p-maleimidofenil) ("SMPB"), um análogo de cadeia estendida de MBS. O grupo succinimidila desses reticulado- res reage com uma amina primária e a maleimida que reage com tiol forma uma ligação covalente com o tiol de um resíduo de cisteína.

[0074] Reagentes de reticulação geralmente têm pouca solubilidade em água. Uma porção hidrofílica, tal como um grupo sulfonato, pode ser adicionada ao reagente de reticulação para melhorar sua solubilidade em água. Com relação a isso, Sulfo-MBS e Sulfo-SMCC são exemplos de reagentes de reticulação modificados quanto a solubilidade em água, que podem ser usados de acordo com a presente invenção.

[0075] Muitos reagentes de reticulação produzem um conjugado que é essencialmente não clivável sob condições celulares. Entretanto, alguns reagentes de reticulação contêm uma ligação covalente, tal como um dissulfeto, que é clivável sob condições celulares. Por exemplo, reagente de Traut, ditiobis(succinimidilpropionato) ("DSP") e N- succinimidila 3-(2-piridilditio)propionato de n-succinimidila ("SPDP") são reticuladores cliváveis bem-conhecidos. O uso de um reagente de reticulação clivável permite que a porção de carga se separe do poli- peptídeo de transporte após a liberação na célula-alvo. Ligação de dissulfeto direta também pode ser útil.

[0076] Vários reagentes de reticulação, incluindo aqueles discutidos acima estão disponíveis comercialmente. Instruções detalhadas para seu uso são facilmente disponíveis a partir de fornecedores comerciais. Uma referencia geral sobre reticulação de proteína e preparação de conjugado é: Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press (1991).

[0077] A reticulação química pode incluir o uso de braços espaça- dores. Braços espaçadores fornecem flexibilidade intramolecular ou ajustam as distâncias intramoleculares entre porções conjugadas e dessa maneira podem ajudar na preservação da atividade biológica. Um braço espaçador pode estar na forma de uma porção polipeptídica que inclui aminoácidos espaçadores, por exemplo, prolina. Alternativamente, um braço espaçador pode ser parte do reagente de reticulação, tal como em "SPDP de cadeia longa" (Pierce Chem. Co., Rockford, IL., cat. No. 21651 H).

[0078] Além disso, variantes, fragmentos ou derivados de um dos peptídeos quiméricos descritos acima são descritos aqui. Com relação a fragmentos e variantes geralmente é referida a definição dada acima para sequências inibidoras de JNK.

[0079] Particularmente, no contexto da presente invenção, "uma variante de um peptídeo quimérico" é preferivelmente uma sequência derivada de qualquer uma das sequências de acordo com SEQ ID NOs: 9 a 12, em que a variante quimérica compreende alterações de aminoácido dos peptídeos quiméricos da invenção de acordo com SEQ ID NOs: 9 a 12. Tais alterações compreendem tipicamente 1 a 20, preferivelmente 1 a 10 e mais preferivelmente 1 a 5 substituições, adições e/ou deleções (levando a fragmentos) de aminoácidos de acordo com SEQ ID NOs: 9 a 12, em que o peptídeo quimérico alterado da invenção exibe uma identidade de sequência com qualquer uma das sequências de acordo com as SEQ ID Nos: 9, 10, 11 ou 12 de pelo menos cerca de 30%, 50%, 70%, 80%, ou 95%, 98%, ou ainda 99%. Preferivelmente, essas variantes mantêm a atividade biológica do pri- meiro e segundo domínio conforme contido no peptídeo quimérico da invenção, isso é, a atividade de tráfego do primeiro domínio como descrito acima, e atividade do segundo domínio para ligação de JNK e;ou inibição da ativação de pelo menos um fator de transcrição ativado por JNK.

[0080] Conseqüentemente, o peptídeo quimérico da invenção também compreende fragmentos dos peptídeos quiméricos da invenção antes mencionados, particularmente das sequências de peptídeo quimérico da invenção de acordo com SEQ ID NOs: 9, 10, 11 ou 12. Dessa forma, no contexto da presente invenção, um "fragmento do peptídeo quimérico da invenção é preferivelmente uma sequência derivada de qualquer uma das sequências de acordo com SEQ ID NOs: 9, 10, 11 ou 12, em que o fragmento compreende pelo menos 4 aminoácidos contíguos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 9, 10, 11 ou 12. Esse fragmento compreende preferivelmente uma extensão que é suficiente para permitir reconhecimento específico de um epítopo de qualquer uma das sequências e transportar a sequência para dentro das células, núcleo ou uma localização adicional preferida. Ainda mais preferivelmente, o fragmento compreende 4 a 18, 4 a 15 ou o mais preferivelmente 4 a 10 aminoácidos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 9, 10, 11 ou 12. Fragmentos do peptídeo quimérico da invenção ainda podem ser definidos como uma sequência que partilha uma identidade de sequência com qualquer uma das sequências de acordo com as SEQ ID NOs: 9, 10, 11 ou 12 de pelo menos cerca de 30%, 50%, 70%, 80%, ou 95%, 98%, ou ainda 99%.

[0081] Finalmente, o peptídeo quimérico da invenção compreende também derivados dos peptídeos quiméricos da invenção antes mencionados, particularmente das sequências de peptídeo quimérico da invenção de acordo com as SEQ ID NOs: 9, 10, 11 ou 12.

[0082] Adicionalmente, a presente invenção refere-se a sequências de ácido nucléico que codificam sequências inibidoras de JNK da invenção, peptídeos quiméricos da invenção ou seus fragmentos, variantes ou derivados como definido acima. Um ácido nucléico adequado preferível que codifica uma sequência inibidora de JNK da invenção é escolhido a partir do ácido nucléico IB1 humano (No. de Acesso do GenBank (AF074091), o ácido nucléico IB1 de rato (No. de Acesso do GenBank AF108959) ou IB2 humano (No. de Acesso do GenBank AF218778).

[0083] Ácidos nucléicos que codificam as sequências inibidoras de JNK ou peptídeos quiméricos da invenção podem ser obtidos por qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, por amplificação por PCR usando iniciadores sintéticos hibridizáveis com as terminações 3’ e 5’ da sequência e/ou por clonagem de um cDNA ou biblioteca genômica usando uma sequência de oligonucleotídeo específica para a dada sequência de gene).

[0084] Adicionalmente, sequências de ácidos nucléicos também são descritas aqui, que hibridizam sob condições estringentes com a fita apropriada que codifica uma sequência inibidora de JNK da invenção (nativa) ou peptídeo quimérico como definido acima. Preferivelmente, tais sequências de ácido nucléico compreendem pelo menos 6 ácidos nucléicos (contíguos) que tem uma extensão suficiente para permitir hibridização específica. Mais preferivelmente, tais sequências de ácido nucléico compreendem 6 a 38, ainda mais preferivelmente 6 a 30 e o mais preferivelmente 6 a 20 ou 6 a 10 ácidos nucléicos (contíguos).

[0085] "Condições estringentes" são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Geralmente, condições estringentes podem ser selecionadas para ser cerca de 5°C mais baixas do que o ponto de fusão térmica (TM) para a sequência específica em uma força iônica e pH definidos. A TM é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% da sequência alvo hibridiza com uma sonda perfeitamente pareada. Tipicamente, condições estringen- tes serão aquelas nas quais a concentração de sal é de pelo menos 0,02 molar em pH 7 e a temperatura é de pelo menos 60°C. Como outros fatores podem afetar a estringência de hibridização (incluindo, entre outros, composição de base e tamanho das fitas complementares), a presença de solventes orgânicos e a extensão do não pareamento de base, a combinação de parâmetros é mais importante do que a medida absoluta de qualquer um.

[0086] "Condições de alta estringência" podem compreender o seguinte, por exemplo: Etapa 1: Filtros contendo DNA são pré-tratados por 8 horas durante a noite a 65°C em tampão composto de 6*SSC, Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP 0,02%, Ficoll 0,02%, BSA 0,02%, e 500 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. Etapa 2: Filtros são hibridizados por 48 horas a 65°C, na mistura de pré- hibridização acima a qual é adicionado 100 mg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e 5-20*106 cpm de sonda marcada com 32P. Etapa 3: Filtros são lavados por 1 hora a 37°C em uma solução que contem 2*SSC, PVP 0,01%, Ficoll 0,01%, e BSA 0,01%. Isso é seguido por uma lavagem em 0,1*SSC a 50°C por 45 minutos. Etapa 4: Filtros são autoradiografados. Outras condições de alta estringência que podem ser usadas são bem-conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY; and Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, a Laboratory Manual, Stockton Press, NY).

[0087] "Condições de estringência moderada" podem incluir o seguinte: Etapa 1: Filtros contendo DNA são pré-tratados por 6 horas a 55°C em uma solução que contem 6*SSC, 5* solução de Denhardt, SDS 0,5% e 100 mg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. Etapa 2: Filtros são hibridizados por 18-20 horas a 55°C na mesma solução com 5-20*106 cpm de sonda marcada com 32P adicionados. Etapa 3: Filtros são lavados a 37°C por 1 hora em uma solução que contem 2*SSC, SDS 0,1% e então lavados duas vezes por 30 minutos a 60°C em uma solução contendo 1*SSC e SDS 0,1%. Etapa 4: Filtros são secos e expostos para auto-radiografia. Outras condições de es- tringência moderada que podem ser usadas são bem-conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY; e Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, a Laboratory Manual, Stockton Press, NY).

[0088] Finalmente, "condições de baixa estringência" podem incluir: Etapa 1: Filtros contendo DNA são pré-tratados por 6 horas a 40°C em uma solução contendo formamida 35%, SSC 5X, Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, PVP 0,1%, Ficoll 0,1%, BSA 1% e 500 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. Etapa 2: Filtros são hibridi- zados por 18-20 horas a 40°C na mesma solução com a adição de PVP 0,02%, Ficoll 0,02%, BSA 0,2%, 100 pg/ml de DNA desnaturado de esperma de salmão, dextrano 10% (p/v) e 5-20*106 cpm de sonda marcada com 32P. Etapa 3: Filtros são lavados por 1,5 hora a 55°C em uma solução contendo SSC 2X, Tris-HCI 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM e SDS 0,1%. A solução de lavagem é trocada por solução nova e incubada por 1,5 hora adicional a 60°C. Etapa 4: Filtros são secos e expostos para auto-radiografia. Se necessário, os filtros são lavados uma terceira vez a 65-68°C e reexpostos ao filme. Outras condições de baixa estringência que podem ser usadas são bem-conhecidas na técnica (por exemplo, como empregado para hibridizações entre espécies). Vide, por exemplo, Ausubel et al., (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; e Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.

[0089] As sequências de ácido nucléico fornecidas pela presente invenção podem ser usadas para expressar peptídeos da invenção, isto é, uma sequência inibidora de JNK da invenção ou um peptídeo quimérico da invenção para análise, caracterização ou uso terapêutico; como marcadores para tecidos nos quais os peptídeos (da invenção) correspondentes são preferencialmente expressos (tanto constitutivamente quanto em um estágio particular de diferenciação ou desenvol-vimento do tecido ou em estados de doença). Outros usos para o ácido nucléico incluem, por exemplo, marcadores de peso molecular em análise baseada em eletroforese em gel de ácidos nucléicos.

[0090] De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção, vetores de expressão também são fornecidos para expressão recombinante de uma ou mais sequências inibidoras de JNK da invenção e/ou peptídeos quiméricos como definido acima. O termo "vetor de expressão" é usado aqui para designar DNA ou RNA circular ou linear que é tanto de fita dupla quanto de fita simples. Ele compreende ainda pelo menos um ácido nucléico da invenção a ser transferido para uma célula hospedeira ou para um organismo hospedeiro unicelular ou mul- ticelular. O vetor de expressão da invenção compreende preferivelmente um ácido nucléico da invenção que codifica a sequência inibidora de JNK da invenção ou um fragmento ou variante dessa, ou o peptídeo quimérico da invenção ou um fragmento ou variante desse. Adicionalmente, um vetor de expressão de acordo com a presente invenção compreende preferivelmente elementos apropriados para suportar a expressão incluindo vários elementos regulatórios, tais como intensi- ficadores/promotores de fontes virai, bacteriana, de planta, mamíferos e outras fontes eucarióticas que direcionam a expressão do polinucleo- tídeo inserido na célula hospedeira, tais como isolantes, elementos limítrofes, LCRs (por exemplo, descrito por Blackwood & Kadonaga (1998), Science 281, 61-63) ou regiões de acoplamento de ma- triz/esqueleto (por exemplo, descrito por Li, Harju & Peterson, (1999), Trends Genet. 15, 403-408). Em algumas modalidades, os elementos regulatórios são heterólogos (isto é, não o promotor do gene nativo). Alternativamente, os sinais de transcrição e tradução necessários também podem ser fornecidos pelo promotor nativo para os genes e/ou suas regiões flanqueadoras.

[0091] O termo "promotor" como usado aqui refere-se a uma região do DNA que funciona para controlar a transcrição de um ou mais sequências de ácido nucléico da invenção, e que é estruturalmente identificado pela presença de um sítio de ligação para RNA polimerase dependente de DNA e de outras sequências de DNA, que interagem para regular a função do promotor. Um fragmento de promoção de expressão funcional de um promotor é uma sequência promotora encurtada ou truncada que retém a atividade de um promotor. A atividade de promotor pode ser medida por qualquer ensaio conhecido na técnica (vide por exemplo, Wood, de Wet, Dewji, & DeLuca, (1984), Bio- chem Biophys. Res. Commun. 124, 592-596; Seliger and McElroy, (1960), Arch. Biochem. Biophys. 88, 136-141) ou disponibilizado comercialmente por Promega®).

[0092] Uma "região intensificadora" como usada no vetor de expressão da invenção, refere-se tipicamente a uma região de DNA que funciona para aumentar a transcrição de um ou mais genes. Mais especificamente, o termo "intensificador", como usado aqui, é um elemento regulatório de DNA que intensifica, aumenta, aprimora ou melhora a expressão de um gene independentemente de sua localização e orientação com relação ao gene a ser expresso e pode estar intensificando, aumentando, aprimorando ou melhorando a expressão de mais de um promotor.

[0093] Sequências promotoras/intensificadoras como definidas acima para o vetor de expressão da invenção podem utilizar sequências regulatórias de planta, animal, inseto ou fungo. Por exemplo, elementos promotores/intensificadores podem ser usados a partir de levedura e outros fungos (por exemplo o promotor GAL4, o promotor da álcool desidrogenase, o promotor de fosfoglicerol quinase, o promotor de fosfatase alcalina). Alternativamente, ou além disso, eles podem incluir regiões de controle transcricional de animal, por exemplo, (i) a região de controle do gene da insulina ativa dentro das células β pan- creáticas (vide, por exemplo Hanahan, et al., 1985. Nature 315: 115- 122); (ii) a região de controle do gene da imunoglobulina ativa dentro das células linfóides (vide, por exemplo Grosschedl, et al., 1984, Cell 38: 647-658); (iii) a região de controle do gene da albumina ativa dentro do fígado (vide, por exemplo Pinckert, et al., 1987. Genes and Dev 1: 268-276); (iv) a região de controle do gene da proteína básica da mielina ativa dentro das células de oligodendrócitos do cérebro (vide, por exemplo Readhead, et al., 1987, Cell 48: 703-712); e (v) a região de controle do gene do hormônio de liberação da gonadotropina ativa dentro do hipotálamo (vide, por exemplo, Mason, et al., 1986, Science 234: 1372-1378), e similares.

[0094] Além disso, o vetor de expressão da invenção pode compreender um marcador de amplificação. Esse marcador de amplificação pode ser selecionado do grupo que consiste em, por exemplo, adenosina desaminase (ADA), diidrofolato redutase (DHFR), gene de resistência a múltiplos fármacos (MDR), ornitina decarboxilase (ODC) e resistência a N-(fosfonoacetil)-L-aspartato (CAD). A amplificação do gene que codifica as proteínas acima definidas, isto é, a proteína de interesse (POI) e/ou a proteína de fusão da invenção, permite aumen-tar o nível de expressão dessas proteínas após a integração do vetor em uma célula (Kaufman et al. (1985), Mol. Cell Biol. 5, 1750-1759).

[0095] Exemplares de vetores de expressão ou seus derivados adequados para a presente invenção incluem particularmente, por exemplo, vírus humanos ou de animais (por exemplo, vírus da vacínia ou adenovirus); vírus de insetos (por exemplo, baculovírus); vetores de levedura; vetores de bacteriófagos (por exemplo, fago lambda); vetores de plasmídeo e vetores de cosmídeo.

[0096] A presente invenção fornece adicionalmente uma variedade de sistemas vetor hospedeiro, que podem ser utilizados para expressar a(s) sequência(s) codificante(s) de peptídeo dos ácidos nucléicos da invenção como definido acima. Esses incluem, mas não se limitam a: (i) sistemas de células de mamífero que são infectadas com o vírus da vacínia, adenovirus e similares; (ii) sistemas de células de inseto infectadas com baculovírus e similares; (iii) levedura contendo vetores de levedura ou (iv) bactéria transformada com bacteriófago, DNA, plasmídeo de DNA ou cosmídeo de DNA. Dependendo do sistema vetor hospedeiro utilizado, qualquer um de vários elementos de transcrição e tradução adequados pode ser usado.

[0097] Preferivelmente, pode ser selecionada uma linhagem de célula hospedeira, adequada para tal sistema vetor de hospedeiro, que modula a expressão de sequências de interesse ou modifica ou processa peptídeos expressos codificados pelas sequências da maneira específica desejada. Além disso, a expressão a partir de certos promotores pode ser intensificada na presença de certos indutores em uma linhagem hospedeira selecionada; assim facilitando o controle da expressão de um peptídeo geneticamente manipulado. Além disso, células hospedeiras diferentes possuem mecanismos característicos e específicos para o processamento e modificação traducional e pós- traducional (por exemplo, glicosilação, fosforilação e similares) de peptídeos expressos. Linhagens celulares ou sistemas de hospedeiros apropriados podem então ser escolhidos para assegurar que a modificação e processamento desejados do peptídeo estranho sejam obtidos. Por exemplo, a expressão de um peptídeo dentro de um sistema bacteriano pode ser usada para produzir um peptídeo de núcleo não- glicosilado; enquanto que a expressão dentro de células de mamíferos assegura a glicosilação "nativa" de um peptídeo heterólogo.

[0098] A presente invenção ainda fornece anticorpos direcionados contra as sequências inibidoras de JNK da invenção e/ou peptídeos quiméricos da invenção. Além disso, são fornecidos meios eficazes para a produção de anticorpos específicos para sequências inibidoras de JNK de acordo com a presente invenção, ou para peptídeos quiméricos da invenção contendo tal sequência inibidora.

[0099] De acordo com a invenção, sequências inibidoras de JNK e/ou peptídeos quiméricos da invenção, assim como, fragmentos, variantes, ou derivados dessas, podem ser utilizados como imunógenos para gerar anticorpos que se ligam especificamente a esses componentes de peptídeo. Tais anticorpos incluem, por exemplo, policlonal, monoclonal, quiméricos, cadeia única, fragmentos Fab e biblioteca de expressão de Fab. Em uma modalidade específica a presente inven-ção fornece anticorpos para peptídeos quiméricos ou para sequências inibidoras de JNK como definido acima. Vários procedimentos conhecidos dentro da técnica podem ser usados para a produção desses anticorpos da invenção.

[00100] Como forma de exemplo, vários animais hospedeiros podem ser imunizados para a produção de anticorpos policlonais por injeção com qualquer peptídeo quimérico ou sequência inibidora de JNK da invenção como definido acima. Vários adjuvantes podem ser usados dessa forma para aumentar a resposta imunológica que incluem, mas não são limitados a, adjuvante de Freund (completo e incompleto), géis minerais (por exemplo, hidróxido de alumínio), substâncias ativas na superfície (por exemplo, lisolecitina, polióis plurônicos, poliâ- nions, peptídeos, emulsões oleosas, dinitrofenol, etc.), CpG, polímeros, Pluronics, e adjuvantes humanos tais como, Bacilo Calmette- Guerin e Corynebacterium parvum.

[00101] Para a preparação de anticorpos monoclonais direcionados contra um peptídeo quimérico ou sequência inibidora de JNK da invenção como definido acima, qualquer técnica que forneça a produção de moléculas de anticorpo por cultura de linhagem celular contínua pode ser utilizada. Tais técnicas incluem, mas não são limitadas a, técnica de hibridoma (vide, Kohler & Milstein, 1975. Nature 256: 495- 497); a técnica de trioma; a célula de hibridoma de célula B humana (vide Kozbor, et al., 1983, Immunol Today 4: 72) e a técnica de hibridoma de EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (vide Cole, et al., 1985. hr. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Anticorpos monoclonais humanos podem ser utilizados na prática da presente invenção e podem ser produzidos pelo uso de hibridomas humanos (vide, Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sei USA 80: 2026-2030) ou pela transformação de células B humanas com o Vírus Epstein Barr in vitro (vide, Cole, et al., 1985. /n: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

[00102] De acordo com a invenção podem ser adaptadas técnicas para a produção de anticorpos de cadeia única específicos para as sequências inibidoras de JNK e/ou peptídeos quiméricos da invenção (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 4.946.778). Além disso, podem ser adaptados métodos para construção de bibliotecas de expressão de Fab (vide, por exemplo, Huse et al., 1989. Science 246: 1275-1281) para permitir identificação rápida e eficaz de fragmentos Fab monoclonais com a especificidade desejada para essas sequências inibidoras de JNK e/ou peptídeos quiméricos da invenção, como definido acima. Anticorpos não humanos podem ser "humanizados" por procedimentos bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.225.539). Fragmentos de anticorpo que contêm os idiotipos para sequências inibidoras de JNK e/ou peptídeos quiméricos da invenção podem ser produzidos por procedimentos bem-conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, (i) um fragmento F(ab')2 produzido por digestão com pepsina de uma molécula de anticorpo; (ii) um fragmento Fab gerado pela redução de ligações dissulfeto de um fragmento F(ab')2; (iii) um fragmento Fab gerado pelo tratamento da molécula de anticorpo com papaína e um agente redutor e (iv) fragmentos Fv.

[00103] Em uma modalidade dessa invenção, métodos para rastre- amento de anticorpos da invenção que possuem a especificidade desejada incluem, mas não são limitados a, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) e outros procedimentos mediados imunologi- camente conhecidos na técnica. Em uma modalidade específica, a seleção de anticorpos que são específicos para um epítopo em particular de uma sequência inibidora de JNK e/ou peptídeo quimérico da invenção (por exemplo, um fragmento desse que compreende tipicamente uma extensão de 5 a 20, preferivelmente 8 a 18 e o mais preferivelmente 8 a 11 aminoácidos) é facilitada pela geração de hibridomas que se ligam ao fragmento de uma sequência inibidora de JNK da invenção e/ou peptídeo quimérico da invenção que possui tal epítopo. Esses anticorpos que são específicos para um epítopo como definido acima também são fornecidos aqui.

[00104] Os anticorpos da invenção podem ser usados em métodos conhecidos dentro da técnica que refere-se à localização e/ou quantificação de uma sequência inibidora de JNK da invenção (e/ou que corresponde a um peptídeo quimérico da invenção), por exemplo, para uso na medição dos níveis do peptídeo dentro de amostras fisiológicas apropriadas, para uso em métodos de diagnostico, ou para uso em visualização por imagem do peptídeo e similares.

[00105] As sequências inibidoras, peptídeos quiméricos e/ou ácidos nucléicos de JNK da invenção podem ser formulados em composições farmacêuticas, também abrangidas aqui. As composições podem compreender, além de uma dessas substâncias, um excipiente, veículo, tampão, estabilizante ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem-conhecidos dos versados na técnica. Tais materiais devem ser atóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do veículo ou outro material pode depender da via de administração, por exemplo, vias, oral, intravenosa, cutânea, ou subcutânea, nasal, intramuscular, intraperitoneal ou por emplastro.

[00106] Composições farmacêuticas para administração oral podem ser em forma de comprimido, cápsula, pó ou líquido. Um comprimido pode incluir um veículo sólido tal como gelatina ou um adjuvante. Composições farmacêuticas líquidas geralmente incluem um veículo líquido tal como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução de sacarídeo, ou glicóis tais como etileno glicol, propileno glicol, ou polietileno glicol podem, ser incluídos.

[00107] Para injeção intravenosa, cutânea, ou subcutânea, ou injeção no local de afecção, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável que é livre de pirogênio, e tem pH, isotonicidade e estabilidade aceitáveis. Aqueles versados na técnica serão capazes de preparar soluções adequadas usando, por exemplo, veículos isotônicos, tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Ringer Lactato. Conservantes, estabili- zantes, tampões, antioxidantes e /ou outros aditivos podem ser incluídos, como necessário. Quer seja um polipeptídeo, peptídeo, ou molécula de ácido nucléico, ou outro composto farmaceuticamente útil de acordo com a presente invenção que for para ser dado a um indivíduo, a administração será preferivelmente uma "quantidade profilaticamente eficaz" ou uma "quantidade terapeuticamente eficaz" (como for o caso), isso sendo suficiente para mostrar benefício para o indivíduo. A quantidade real administrada, a taxa e curso de tempo de administra- ção, dependerão da natureza e severidade do que está sendo tratado.

[00108] Prescrição de tratamento, por exemplo, decisões sobre a dosagem etc., está dentro da responsabilidade do clínico geral ou outros médicos, e tipicamente leva em consideração a desordem a ser tratada, a condição do paciente individual, o local de liberação, o método de administração e outros fatores conhecidos dos médicos. Exemplos das técnicas e protocolos mencionados acima podem ser encontrados em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16a edição Osol, A. (ed), 1980.

[00109] Alternativamente, terapias direcionadoras podem ser usadas para liberar as sequências inibidoras de JNK, peptídeos quiméricos e ácidos nucléicos da invenção mais especificamente a certos tipos de célula, pelo uso de sistemas direcionadores tais como um anticorpo (direcionador) ou ligantes específicos de células. Anticorpos usados para direcionar são tipicamente específicos para proteínas da superfície de células associadas com qualquer uma das doenças co-mo definido abaixo. Como forma de exemplo, esses anticorpos podem ser direcionados para anticorpos de superfície celular tais como proteínas de superfície associadas à célula B tais como proteína DR de MHC classe II, CD18 (cadeia beta de LFA-1), CD45RO, CD40 ou Bgp95, ou proteínas de superfície celular selecionadas a partir de, por exemplo, CD2, CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD13, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD39, CD4, CD43, CD45, CD52, CD56, CD68, CD71, CD138, etc. Construtos direcionadores podem ser preparados tipicamente li- gando-se covalentemente as sequências inibidoras de JNK, peptídeos quiméricos e ácidos nucléicos da invenção a um anticorpo específico para uma proteína de superfície celular ou pela ligação a um ligante específico de uma célula. Proteínas podem ser, por exemplo, ligadas a tal anticorpo ou podem ser acopladas a ele por uma ligação de peptí- deo ou por acoplamento químico, reticulação, etc. A terapia direciona- dora pode ser então realizada pela administração do construto direcio- nador em uma quantidade farmaceuticamente eficaz a um paciente por qualquer uma das vias de administração definidas abaixo, por exemplo, vias intraperitoneal, nasal, intravenosa, oral e por emplastro. Preferivelmente, as sequências inibidoras de JNK da invenção, peptídeos quiméricos ou ácidos nucléicos da invenção ligados aos anticorpos direcionadores ou ligantes específicos de célula como definido acima, podem ser liberados in vitro ou in vivo, por exemplo, por hidrólise da ligação covalente, por peptidases ou por qualquer outro método adequado. Alternativamente, se as sequências inibidoras de JNK, peptídeos quiméricos ou ácidos nucléicos da invenção, forem ligados a um pequeno ligante específico de célula, a liberação do ligante pode não ocorrer. Se presente na superfície celular, os peptídeos quiméricos da invenção podem entrar na célula pela atividade de sua sequência de tráfego. O direcionamento pode ser desejável por uma variedade de razões; por exemplo, se as sequências inibidoras de JNK, peptídeos quiméricos, e ácidos nucléicos da invenção forem inaceitavelmente tóxicos ou se de outra forma, eles necessitarem de uma dosagem alta demais.

[00110] Ao invés de administrar as sequências inibidoras de JNK e/ou peptídeos quiméricos da invenção diretamente, eles poderiam ser produzidos nas células-alvo pela expressão a partir de um gene codifi- cante introduzido nas células, por exemplo, a partir de um vetor viral a ser administrado. O vetor virai codifica tipicamente as sequências inibidoras de JNK da invenção e/ou peptídeos quiméricos da invenção. O vetor poderia ser direcionado para as células específicas a ser tratadas. Além disso, o vetor conteria elementos regulatórios, que são ligados mais ou menos seletivamente pelas células-alvo por regulação definida. Essa técnica representa uma variante da técnica de VDEPT (terapia de pró-fármaco direcionado por vírus), que utiliza proteínas maduras ao invés das suas formas precursoras.

[00111] Alternativamente as sequências inibidoras de JNK e/ou peptídeos quiméricos da invenção poderiam ser administrados em uma forma precursora pelo uso de um anticorpo ou um vírus. As sequências inibidoras de JNK da invenção e/ou peptídeos quiméricos podem então ser convertidos na forma ativa por um agente ativador produzido, ou direcionado para, as células a ser tratadas. Esse tipo de abordagem é algumas vezes conhecida como ADEPT (terapia de pró- fármaco direcionada por anticorpo) ou VDEPT (terapia de pró-fármaco direcionada por vírus); o primeiro envolvendo direcionamento do agente ativador para as células por conjugação a um anticorpo célula- específico, enquanto que o último envolve a produção do agente ativador, por exemplo, uma sequência inibidora de JNK ou o peptídeo quimérico, em um vetor pela expressão a partir de um DNA codificante em um vetor viral (vide, por exemplo, EP-A-415731 e WO 90/07936).

[00112] A presente invenção ainda abrange o uso de sequências inibidoras de JNK da invenção, peptídeos quiméricos da invenção e/ou sequências de ácido nucléico da invenção, para preparar uma composição farmacêutica, por exemplo, como definido acima, para prevenir e/ou tratar distúrbios de proliferação celular associadas com ativação de JNK em um indivíduo ("desordem associada a JNK"). Tipicamente, tal composição farmacêutica usada de acordo com a presente inven-ção inclui um componente ativo, por exemplo, (i) qualquer uma ou mais das sequências inibidoras de JNK da invenção e/ou peptídeos quiméricos da invenção, e/ou variantes, fragmentos ou derivados desses; e/ou (ii) ácidos nucléicos que codificam uma sequência inibidora de JNK da invenção e/ou peptídeo quimérico da invenção e/ou variantes ou fragmentos desses, e/ou (iii) células que compreendem qualquer uma ou mais das sequências inibidoras de JNK da invenção e/ou peptídeos quiméricos da invenção, e/ou variantes, fragmentos ou derivados desses e/ou (iv) células transfectadas com um vetor e/ou ácidos nucléicos que codificam uma sequência inibidora de JNK da invenção e/ou um peptídeo quimérico da invenção e/ou variantes ou fragmentos desses.

[00113] Prevenção e/ou tratamento de acordo com a presente invenção inclui tipicamente administração de uma composição farmacêutica da invenção como definido acima. O termo "modular" também inclui supressão de complexos hetero- e homoméricos de fatores de transcrição formados de c-jun, ATF2, ou NFAT4 e seus parceiros relacionados, tais como, por exemplo, o complexo AP-1 que é formado de c-jun, AFT2 e c-fos. Quando uma desordem de proliferação celular es-tá associada com a superexpressão de JNK, tais sequências inibidoras de JNK supressoras podem ser introduzidas em uma célula. Em alguns casos, "modular" pode incluir o aumento da expressão de JNK, por exemplo, pelo uso de um anticorpo peptídeo IB-específico que bloqueia a ligação de um peptídeo IB à JNK, assim evitando a inibição de JNK pelo peptídeo relacionado a IB.

[00114] Prevenção e/ou tratamento de um indivíduo com a composição farmacêutica da invenção como descrito acima pode ser realizado tipicamente pela administração (in vivo) de uma quantidade ("tera- peuticamente eficaz") da dita composição farmacêutica a um indivíduo, em que o indivíduo pode ser, por exemplo, qualquer mamífero, por exemplo, um ser humano, um primata, camundongo, rato, cachorro, gato, vaca, cavalo ou porco. O termo "terapeuticamente eficaz" significa que o componente ativo da composição farmacêutica é de quantidade suficiente para melhorar a desordem associada com JNK.

[00115] O termo "desordem de proliferação celular" ou "desordem associada a JNK" como usado acima denota tipicamente populações malignas e não malignas de células in vivo e in vitro que freqüente- mente parecem diferir morfologicamente e funcionalmente do tecido vizinho e que são caracterizadas tipicamente por níveis aberrantes de JNK. Um "nível aberrante de JNK" pretende significar um nível aumentado ou diminuído de JNK em uma parte do indivíduo a ser tratado em relação àquele presente em uma parte análoga não afetada de um indivíduo que não tem a desordem.

[00116] Por exemplo, as composições farmacêuticas da invenção podem ser úteis em prevenir, e/ou tratar malignidades dos vários sistemas de órgãos, nos quais a ativação de JNK foi freqüentemente demonstrada, por exemplo, pulmão, mama, linfóide, trato gastrointestinal, e genito-urinário assim como adenocarcinomas que incluem malignidades tais como cânceres de cólon, carcinoma de célula renal, câncer de próstata, carcinoma de célula não pequena do pulmão, câncer do intestino delgado, câncer de esôfago. Leucemia, distúrbios ou patofisi- ologias associadas com transformação oncogênica assim como cânceres com transformações oncogênicas Bcr-Abl que requerem claramente ativação de JNK também estão incluídas.

[00117] As composições farmacêuticas da invenção também são aplicáveis em prevenir e/ou tratar doenças de proliferação de célula não malignas ou relacionadas à imunidade tais como psoríase, pênfigo vulgar, síndrome de Behcet, síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS), doença cardíaca isquêmica, síndrome pós-diálise, artrite reumatóide, síndrome da imunodeficiência adquirida, vasculite, choque séptico, e outros tipos de inflamação aguda, e histiocitose lipí- dica. Especialmente preferidos são distúrbios imunopatológicas. Essencialmente, qualquer desordem, que é ligada etiologicamente à atividade quinase de JNK, é considerada suscetível à prevenção ou tratamento, por exemplo, distúrbios ou patofisiologias associadas a ativação de JNK em uma célula ou células como definido acima, por exemplo, reestenose, perda de audição, trauma de ouvido, isquemia, der- rame e/ou distúrbios ou patofisiologias associadas com maturação e diferenciação de células imunes, injúrias de reperfusão, hipóxia, doenças relacionadas a apoptose (por exemplo, que ocorrem em infecções virais (por exemplo, AIDS), doenças autoimunes, distúrbios neurode- generativas (por exemplo, acidente vascular cerebral, trauma cerebral, injúria de medula espinhal, esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença de Huntington, doença de Alzheimer, e doença de Parkinson), doença cardiovascular, osteoporose e envelhecimento), resposta a estímulos estressantes, e com efeitos secundários devido ao tratamento com, por exemplo, citocinas pró-inflamatórias. A composição farmacêutica da invenção também pode ser usada para tratar ou prevenir efeitos associados com diabetes ou com tensão mecânica celular, tais como em estados patológicos induzidos por hipertensão arterial, incluindo hipertrofia do coração e cardíaca e lesões ateroscleróticas, e em bifurcações de vasos sangüíneos, e similares, por radiação ionizante, como usado em radioterapia e luz ultravioleta (luzes UV), por radicais livres, agentes que danificam o DNA, incluindo fármacos quimioterápi- cos, por injúrias de isquemia/reperfusão, por hipóxia; e/ou hipo- e hi- pertemia. Finalmente, no contexto das doenças, distúrbios ou patofisiologias mencionadas acima, a composição farmacêutica da invenção pode ser usada para inibir a expressão de genes cuja expressão aumenta na presença de um polipeptídeo de JNK ativo. Esses genes e produtos gênicos incluem tipicamente, por exemplo, citocinas pró- inflamatórias. Tais citocinas são encontradas em todas as formas de doenças inflamatórias, autoinflamatórias, imunes e autoimunes, doenças degenerativas, miopatias, cardiomiopatias e rejeição de enxerto.

[00118] As sequências inibidoras de JNK da invenção, peptídeos quiméricos da invenção ou sequências de ácido nucléico da invenção podem ainda ser usadas em qualquer situação na qual a inibição da atividade de JNK for desejada, já que JNKs e todas as suas isoformas participam no desenvolvimento e estabelecimento de estados patológicos ou em vias desses. Tal uso pode incluir aplicações in vitro, ex vivo ou aplicações in vivo.

[00119] Conseqüentemente, ácidos nucléicos da invenção como definido acima, podem ser utilizados em uma modalidade específica da presente invenção para modular as vias ativadas de sinalização de JNK por meio de terapia gênica, preferivelmente para tratar uma das condições, doenças, e/ou distúrbios como definido acima. Nesse contexto, terapia gênica refere-se à terapia que é realizada pela administração de um ácido nucléico da invenção a um indivíduo, por exemplo, por meio de uma composição farmacêutica como definido acima, em que o(s) ácido(s) nucléico(s) da invenção compreende(m) exclusivamente L-aminoácidos. Nessa modalidade da presente invenção, o ácido nucléico produz seu(s) peptídeo(s) codificado(s), que então ser- ve(m) para exercer um efeito terapêutico pela modulação da função da doença ou desordem. Qualquer um dos métodos relacionados à terapia gênica disponíveis dentro da técnica podem ser usados na prática da presente invenção (vide, por exemplo Goldspiel, et al., 1993. Clin Pharm 12: 488-505).

[00120] Em uma modalidade preferida, o ácido nucléico da invenção usado para terapia gênica é parte de um vetor de expressão que expressa qualquer um ou mais dos peptídeos relacionados a IB da invenção, isto é, uma sequência inibidora de JNK da invenção e/ou peptídeo quimérico da invenção, ou fragmentos ou derivados desses, dentro de um hospedeiro adequado. Em uma modalidade específica tal vetor de expressão possui um promotor que é operativamente ligado a região(ões) codificante(s) de uma sequência inibidora de JNK. O promotor pode ser definido como acima, por exemplo, induzível ou constitutivo, e opcionalmente, tecido-específico.

[00121] Em outra modalidade específica, uma molécula de ácido nucléico da invenção é usada para terapia gênica, na qual as sequências codificantes da molécula de ácido nucléico da invenção (e quaisquer outras sequências desejadas dessas) são flanqueadas por regiões que promovem recombinação homóloga em um local desejado dentro do genoma, assim fornecendo expressão intracromossômica de ácidos nucléicos (vide, por exemplo, Koller & Smithies, 1989. Proc Natl Acad Sci USA 86: 8932-8935).

[00122] Liberação do ácido nucléico da invenção em um paciente com a finalidade de terapia gênica pode ser tanto direta (isto é, o paciente é exposto diretamente ao ácido nucléico ou vetor contendo ácido nucléico) ou indireta (isto é, as células são primeiro transformadas com o ácido nucléico in vitro, e então transplantadas para o paciente). Essas duas abordagens são conhecidas, respectivamente, como terapia gênica in vivo ou ex vivo. Em uma modalidade específica da presente invenção, um ácido nucléico é administrado diretamente in vivo, onde ele é expresso para produzir o produto codificado. Isso pode ser reali-zado por qualquer um de vários métodos conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, construir o ácido nucléico como parte de um vetor de expressão de ácido nucléico apropriado e administrar o mesmo de uma maneira tal que ele se torne intracelular (por exemplo, por infecção usando um vetor retroviral ou outro vetor virai defeituoso ou atenuado, vide, Patente U.S. No. 4.980.286); injetar diretamente DNA nu; usar bombardeio de micropartículas (por exemplo, um "GeneGun"; Biolística, DuPont); revestir os ácidos nucléicos com lipídeos; usar receptores de superfície celular/agentes transfectantes; encapsular em lipossomos, micropartículas ou microcápsulas; administrá-lo em ligação a um peptídeo que é conhecido por entrar no núcleo; ou adminis- trá-lo ligado a um ligante predisposto a endocitose mediada por receptor (vide, por exemplo, Wu & Wu, 1987.J Biol Chem 262: 4429-4432), que pode ser usado para "direcionar" tipos celulares que expressam especificamente os receptores de interesse, etc.

[00123] Uma abordagem adicional para terapia gênica na prática da presente invenção envolve transferir um gene para dentro de células em cultura de tecido in vitro por tais métodos, como eletroporação, li- pofecção, transfecção mediada por fosfato de cálcio, infecção virai, ou similar. Geralmente, o método de transferência inclui a transferência concomitante de um marcador selecionável para as células. As células são então colocadas sob pressão seletiva (por exemplo, resistência a antibiótico) de modo a facilitar o isolamento dessas células que absorveram, e que estão expressando, o gene transferido. Essas células são então liberadas para um paciente. Em uma modalidade específica, antes da administração in vivo da célula recombinante resultante, o ácido nucléico é introduzido em uma célula por qualquer método conhecido dentro da técnica, incluindo, por exemplo, transfecção, eletroporação, microinjeção, infecção com vetor virai ou bacteriófago contendo as sequências de ácido nucléico de interesse, fusão celular, transferência gene mediada por cromossomo, transferência de gene mediada por microcélula, fusão de esferoplasto, e métodos similares que garantem que as funções do desenvolvimento e fisiológicas necessárias das células receptoras não são interrompidas pela transferência. Vide, por exemplo, Loeffler & Behr, 1993. Meth Enzymol 217: 599-618. A técnica escolhida deve fornecer a transferência estável do ácido nucléico para a célula, tal que o ácido nucléico seja capaz de ser expresso pela célula. Preferivelmente, o ácido nucléico transferido é hereditário e capaz de ser expresso pela progénie da célula.

[00124] Em modalidades preferidas da presente invenção, as células recombinantes resultantes podem ser liberadas a um paciente por vários métodos conhecidos dentro de técnica incluindo, por exemplo, injeção de células epiteliais (por exemplo subcutaneamente), aplicação de células da pele recombinantes como um enxerto de pele ao paciente, e injeção intravenosa de células vermelhas do sangue (por exemplo células-tronco ou progenitoras hematopoiéticas). A quantidade total de células que são consideradas para uso depende do efeito desejado, do estado do paciente, e similares, e pode ser determinada por um versado na técnica. As células dentro das quais um ácido nucléico pode ser introduzido para fins de terapia gênica abrangem qualquer tipo celular desejado disponível, e pode ser xenogeneico, heterogeneico, singeneico ou autogeneico. Os tipos celulares incluem, mas não são limitados a, células diferenciadas, tais como células epiteliais, células endoteliais, queratinócitos, fibroblastos, células musculares, hepatóci- tos, e células sangüíneas, ou várias células-tronco ou progenitoras, em particular células musculares cardíacas embrionárias, células-tronco do fígado (Publicação de Patente Internacional WO 94/08598), células- tronco neurais (Stemple & Anderson, 1992,Cell 71: 973-985), células- tronco ou progenitoras hematopoiéticas, por exemplo obtidas da medula óssea, sangue de cordão umbilical, sangue periférico, fígado fetal, e similares. Em uma modalidade preferida, as células utilizadas para terapia gênica são autólogas para o paciente.

[00125] De acordo com uma modalidade adicional, as sequências inibidoras de JNK da invenção, peptídeos quiméricos da invenção, sequências de ácido nucléico da invenção, ou anticorpos para sequências inibidoras de JNK da invenção ou para peptídeos quiméricos da invenção podem ser utilizados em ensaios (in vitro) (por exemplo, imu- noensaios) para detectar, dar prognóstico, diagnosticar, ou monitorar várias condições, doenças, e /ou distúrbios como definido acima, ou monitorar o tratamento dessas. O imunoensaio pode ser realizado por um método que compreende colocar uma amostra derivada de um paciente em contato com um anticorpo para uma sequência inibidora de JNK da invenção, um peptídeo quimérico da invenção, ou uma sequência de ácido nucléico da invenção, sob condições tais que a liga- ção imunoespecífica possa ocorrer, e subseqüentemente detectar ou medir a quantidade de qualquer ligação imunoespecífica pelo anticorpo. Em uma modalidade específica, um anticorpo específico para uma sequência inibidora de JNK da invenção, peptídeo quimérico da invenção ou sequência de ácido nucléico da invenção pode ser usado para analisar uma amostra de tecido ou soro de um paciente quanto à presença de JNK ou uma sequência inibidora de JNK; em que um nível aberrante de JNK é indicativo de uma condição de doença. Os imuno- ensaios que podem ser utilizados incluem, mas não são limitados a sistemas de ensaio competitivos e não competitivos usando técnicas tais como Western Blots, radioimunoensaios (RIA), ensaio imunoab- sorvente ligado à enzima (ELISA), imunoensaios "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitina, reações de precipitina de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, imunoensaios fluorescentes, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunoradiometricos, e imunoensaios de proteína-A, etc. Alternativamente, ensaios (/n vitro) podem ser realizados pela liberação das sequências inibidoras de JNK da invenção, peptídeos quiméricos da invenção, sequências de ácido nucléico da invenção ou anticorpos para sequências inibidoras de JNK da invenção ou para peptídeos qui-méricos da invenção para direcionar células-alvo selecionadas tipicamente a partir de células animais em cultura, células humanas ou microorganismos, e para monitorar a resposta celular por métodos biofísicos tipicamente conhecidos de um versado na técnica. As células- alvo tipicamente usadas nisso podem ser células em cultura (in vitro) ou células in vivo, isto é, células que compõem os órgãos ou tecidos de seres humanos ou animais vivos, ou microorganismos encontrados em seres humanos ou animais vivos.

[00126] A presente invenção ainda fornece kits para uso diagnóstico ou terapêutico que incluem um ou mais recipientes contendo sequências inibidoras de JNK da invenção, peptídeos quiméricos da invenção, sequências de ácido nucléico da invenção e/ou anticorpos para sequências inibidoras de JNK da inveenção, ou para peptídeos quiméricos da invenção, por exemplo, um anticorpo anti-sequência inibidora de JNK e, opcionalmente, um parceiro de ligação marcado para o anticorpo. O marcador incorporado dessa forma no anticorpo pode incluir, mas não é limitado, uma porção quimioluminescente, enzimáti- ca, fluorescente, colorimétrica, ou radioativa. Em outra modalidade específica, são fornecidos kits para uso diagnóstico que compreende um ou mais recipientes contendo ácidos nucléicos que codificam, ou alternativamente, que são o complemento para, uma sequência de JNK da invenção e/ou peptídeo quimérico da invenção, opcionalmente, um parceiro de ligação marcador para esses ácidos nucléicos, também são fornecidos. Em uma modalidade específica alternativa, o kit pode compreender, em um ou mais recipientes, um par de oligonucleotídeos iniciadores (por exemplo, cada um de 6-30 nucleotídeos de extensão) que são capazes de agir como iniciadores de amplificação para a reação em cadeia da polimerase (PCR; vide, por exemplo, Innis, et al., 1990. PCR PROTOCOLS, Academic Press, Inc., San Diego, CA), reação em cadeia da ligase, reação de sonda cíclica, e similares, ou outros métodos conhecidos dentro da técnica usados no contexto com os ácidos nucléicos da invenção. O kit pode ainda compreender, opcionalmente, uma quantidade predeterminada de uma sequência inibidora de JNK da invenção, um peptídeo quimérico da invenção, ou ácidos nucléicos que os codificam, para uso como um diagnóstico, padrão ou controle nos ensaios.

[00127] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas descritas aqui. De fato, várias modificações da invenção além daquelas descritas que se tornarão claras para os versados na técnica a partir da descrição anterior e figuras anexas. Tais modificações caem dentro do escopo das reivindicações anexas.

[00128] Várias publicações são citadas aqui, as descrições das quais estão incorporadas por referência na sua totalidade.

[00129] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que o comu- mente compreendido por um versado na técnica a qual essa invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas aqui estão incorporadas por referência na sua totalidade. No caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, controlará. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes. Outras características e vantagens da presente invenção serão claras a partir da seguinte descrição detalhada e reivindicações.

DESCRIÇÃO DE FIGURAS

[00130] Figuras 1A-C são diagramas mostrando alinhamentos de regiões de domínio JBD conservadas nos fatores de transcrição indicados. As sequências inibidoras de JNK foram identificadas pela inspeção desses alinhamentos de sequência. Os resultados desse alinhamento são exemplarmente mostrados nas figuras 1A-1C. A figura 1A mostra a região de maior homologia entre os JBDs de IB1, IB2, c- Jun e ATF2. O painel B representa a sequência de aminoácido dos JBDs de L-IB1 (s) e L-IB1 por razões comparativas. Resíduos completamente conservados estão indicados por asteriscos, enquanto que resíduos trocados para Ala no vetor GFP-JBD23Mut estão indicados por círculos abertos. A figura 1 C mostra as sequências de aminoácido de proteínas quiméricas que incluem uma sequência inibidora de JNK e uma sequência de tráfego. No exemplo mostrado, a sequência de trá- fego é derivada do polipeptídeo TAT do vírus da imunodeficiência humana (HIV), e a sequência inibidora de JNK é derivada de um polipeptídeo IB1(s). Sequências humanas, de camundongo, e de rato são idênticas nos Painéis B e C.

[00131] Figura 2 é um diagrama mostrando sequências de peptídeos de fusão TAT-IB genéricos de humano, camundongo e rato.

[00132] Figura 3 descreve os resultados da avaliação da neuropro- teção contra isquemia focal cerebral em modelo MCAO permanente. A determinação da eficácia da proteção foi realizada em doses diferentes (vide Figura 3). Como pode ser visto a partir da Figura 3, pelo menos doses de 11 mg/kg, 3 mg/kg, 0,3mg/kg e 0,03 mg/kg, contribuem para proteção cerebral. A melhor proteção é observada na dose de 0,03 mg/kg.

[00133] Figura 4 ilustra a avaliação de neuroproteção por um peptídeo quimérico da invenção de acordo com SEQ ID NO: 11 após administração i.v. contra isquemia focal cerebral, em um modelo de MCAO transitório. Após a provocação de isquemia em camundongos adultos, os camundongos foram mortos 48 horas após reperfusão. Seções seriadas de criostato foram preparadas e volumes de infarto foram calculados. Como pode ser visto a partir da Figura 4, o peptídeo quimérico da invenção fornece neuroproteção eficaz.

[00134] Figura 5 mostra os resultados de um ensaio sobre culturas neuronais realizado pela medida da liberação de LDH após estímulo com NMDA. Os resultados indicam claramente um efeito neuroprotetor do peptídeo quimérico D-JNKI1 da invenção (SEQ ID NO: 11), já que alterações degenerativas devido à exposição a NMDA foram completamente inibidas como indicado pela ausência de liberação significativa de LDH dos controles acima.

[00135] Figura 6 descreve os resultados da inibição da atividade de JNK endógena em células HepG2 usando peptídeos de fusão da invenção de acordo com SEQ ID NOs: 9 e 11 em uma abordagem de um poço. Como pode ser visto a partir da Figura 6, particularmente painel d na Figura 6, D-TAT-IBI(s) de acordo com SEQ ID NO: 11 (aqui abreviado como D-JNKI) inibe eficazmente a atividade de JNK, ainda melhor do que L-TAT-IBI(s) de acordo com SEQ ID NO: 9 (aqui abreviado como L-JNKI).

[00136] Figura 7 mostra o efeito protetor de D-TAT-IBI(s). Proteção contra perda auditiva permanente. Alterações do nível de limiar de audição (nível de pressão sonora em dB) em porcos da guiné após trauma por som (120 dB a 6 kHz durante 30 minutos) a 8 kHz, a freqüên- cia impactada ao máximo, medida 20 minutos (alteração de limiar temporária, TTS, cinza) e 15 dias após a exposição ao som (alteração de limiar permanente). Porcos da guiné receberam D-TAT-IBI(s) em um gel hialurônico depositado sobre a membrana da janela redonda coclear tanto 30 minutos antes, como 30 minutos depois ou 4 horas após o trauma por som; ouvidos não tratados serviram como controles. TTS foi medido 20 minutos após o trauma por som, enquanto que PTS (preto), que corresponde à perda auditiva permanente, foi determinado após 15 dias. Como mostrado, D-TAT-IBI(s) não apenas protege substancialmente contra perda auditiva permanente por trauma por som se aplicado preventivamente antes da exposição ao som, mas também de uma forma dependente do tempo se administrado após o trauma. PTS em ouvidos tratados foi significativamente menor para a administração de D-TAT-IBI(s) 30 minutos e 4 horas após o trauma em ouvidos de controle não tratados.

EXEMPLOS Exemplo 1: Identificação de sequências inibidoras de JNK

[00137] Sequências de aminoácidos importantes para a interação eficiente com JNK foram identificadas por alinhamentos de sequências entre JBDs conhecidos. Uma comparação de sequência entre os JBDs de IB1 [SEQ ID NO: 13], IB2 [SEQ ID NO: 14], c-Jun [SEQ ID NO: 15] e ATF2 [SEQ ID NO: 16] definiu uma sequência fracamente conservada de 8 aminoácidos (figura 1A). Como os JBDs de IB1 e IB2 são aproximadamente 100 vezes tão eficientes quanto c-Jun ou ATF2 em se ligar a JNK (Dickens et al. Science 277: 693 (1997), foi considerado que resíduos conservados entre IB1 e IB2 devem ser importantes para conferir ligação máxima. A comparação entre os JBDs de IB1 e IB2 definiu dois blocos de sete e três aminoácidos que são altamente conservados entre as duas sequências.

[00138] Esses dois blocos estão contidos dentro de uma sequência de peptídeos de 19 aminoácidos em L-IB1 (s) [SEQ ID NO: 1] e são mostrados também por razões comparativas em uma sequência de peptídeos de 23 aa derivada de IB1 [SEQ ID NO: 17]. Essas sequências são mostradas na figurai B, traços na sequência L-IB1 indicam um intervalo na sequência a fim de alinhar os resíduos conservados com L-IB1(s).

Exemplo 2: Preparação de Proteínas de Fusão Inibidoras de JNK

[00139] Proteínas de fusão inibidoras de JNK da invenção de acordo com a SEQ ID NO: 9 foram sintetizadas por ligar covalentemente a terminação C de SEQ ID NO: 1 a um peptídeo veículo N-terminal de 10 aminoácidos de extensão derivado de HIV-TAT4g 57 (Vives et al., J Biol. Chem. 272: 16010 (1997)) de acordo com a SEQ ID NO: 5 através de um ligante que consiste em dois resíduos de prolina. Esse li- gante foi usado para permitir a flexibilidade máxima e evitar alterações estruturais secundárias indesejadas. Os construtos básicos também foram preparados e designados L-IB1(s) (SEQ ID NO: 1) e L-TAT [SEQ ID NO: 5], respectivamente.

[00140] Todos os peptídeos D retroinversos de acordo com a SEQ ID NO: 11 foram sintetizados adequadamente. Os construtos básicos também foram preparados e designados D-IB1(s) [SEQ ID NO: 2] e D- TAT [SEQ ID NO: 6], respectivamente.

[00141] Todos os peptídeos de fusão D e L da invenção de acordo com as SEQ ID NOs: 9, 10, 11 e 12 foram produzidos por síntese Fmock clássica e analisados ainda por Espectrometria de Massa. Eles foram finalmente purificados por HPLC. Para determinar os efeitos do ligante de prolina, dois tipos de peptídeo de TAT foram produzidos um com e um sem duas prolinas. A adição das duas prolinas não pareceu modificar a entrada ou a localização do peptídeo TAT dentro das células. Peptídeos genéricos mostrando os resíduos de aminoácidos conservados são dados na figura2.

Exemplo 3: Inibição de morte celular por JBD19

[00142] Efeitos da sequência de JBD de 19 aa de extensão de IB1 (s) sobre as atividades biológicas de JNK foram estudados. A sequência de 19 aa foi ligada N-terminal à Proteína Verde Fluorescente (construto GFP JBD19) e o efeito desse construto sobre a apoptose da célula β pancreática induzida por IL1 foi avaliado. Esse modo de apoptose foi mostrado previamente ser bloqueado pela transfecção com JBDI-28O enquanto que inibidores específicos de ERK1/2 ou p38 não protegeram (vide Ammendrup etal., supra).

[00143] Oligonucleotídeos que correspondem a JDB19 e compreendem uma sequência conservada de 19 aminoácidos assim como uma sequência mutada nas regiões totalmente conservadas foram sintetizados e direcionalmente inseridos nos sítios de EcoR\ e Sa/I do vetor pEGFP-N1 que codifica Proteína Verde Fluorescente (GFP) (da Clontech). Células βTC-3 produtoras de insulina foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com Soro Fetal Bovino 10%, 100 pg/mL de Estreptomicina, 100 unidades/mL de Penicilina, e Glutamina 2 mM. Células βTC-3 produtoras de insulina foram transfectadas com os vetores indicados e IL-1 β (10 ng/mL) foi adicionado ao meio de cultura da célula. O número de células apoptóticas foi contado 48 horas após a adição de IL-1 β usando um microscópio invertido de fluorescência. Células apoptóticas foram discriminadas das células normais pelo "blebbing out" característico do citoplasma e foram contadas após dois dias.

[00144] GFP é o vetor de expressão da proteína Verde Fluorescente usado como um controle; JBD19 é o vetor que expressa uma GFP quimérica ligada à sequência de 19 aa derivada de JBD de IB1; JBD19Mut é o mesmo vetor que GFP-JBD19, mas com um JBD muta- do em quatro resíduos conservados mostrado como FIG 1B; e JBD1-280 é 0 vetor de GFP ligado ao JBD inteiro (1-280 aa). O construto que expressa GFP-JBD19 evitou a apoptose de células β pancreáticas induzida por IL-1 β tão eficazmente quanto 0 JBD1-280completo.

[00145] Como controles adicionais, sequências mutadas em resíduos de IB1 (s) totalmente conservados tiveram a habilidade de evitar apoptose altamente diminuída.

Exemplo 4: Importação Celular de peptídeos TAT-IB1(s)

[00146] A habilidade das formas enantioméricas L e D de TAT e peptídeos TAT-IB1(s) da invenção ("peptídeos TAT-IB") de entrar nas células foi avaliada. Peptídeos de L-TAT, D-TAT, L-TAT-IBI(s) da invenção e D-TAT-IBI(s) da invenção [SEQ ID NOs: 5, 6, 9 e 12, respectivamente] foram marcados por adição N-terminal de um resíduo de glicina conjugado com fluoresceína. Peptídeos marcados (1 pM) foram adicionados a culturas de células βTC-3, que foram mantidas como descrito no Exemplo 3. Em períodos de tempo predeterminados as células foram lavadas com PBS e fixadas por cinco minutos em metanol-acetona gelado (1:1) antes de serem examinadas sob um microscópio de fluorescência. BSA marcado com fluoresceína (1 pM, 12 mols/mol de BSA) foi usado como um controle. Os resultados demonstraram que todos os peptídeos marcados com fluoresceína acima entraram eficientemente e rapidamente nas células (menos do que cinco minutos) uma vez adicionados ao meio de cultura. Inversamente, albumina sérica bovina marcada com fluoresceína (1 pM de BSA, 12 mols de fluoresceína/mol de BSA) não entrou nas células.

[00147] Um estudo de curso de tempo indicou que a intensidade do sinal fluorescente para os peptídeos L-enantioméricos diminuiu em 70% após um período de 24 horas. Pouco ou nenhum sinal estava presente em 48 horas. Em contraste, D-TAT e D-TAT-IBI(s) da invenção eram extremamente estáveis dentro da célula.

[00148] Sinais fluorescentes de todos esses peptídeos D retroinver- sos ainda estavam muito fortes 1 semana mais tarde, e o sinal estava apenas levemente diminuído 2 semanas após o tratamento.

Exemplo 5: Inibição In vitro de c-JUN, ATF2 e Fosforilação de Elk1

[00149] Os efeitos dos peptídeos sobre a fosforilação mediada por JNKs de seus fatores de transcrição alvo foram investigados in vitro. JNK1, JNK2 e JNK3 recombinantes e não ativados foram produzidos usando um kit de lisado de reticulócito de coelho de TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO (Promega) e usados em ensaios de quinase em fase sólida com c-Jun, ATF2 e Elk1, tanto isolados quanto fundidos com gluta- tiona-S-transferase (GST), como substratos. Estudos de dose-resposta foram realizados em que os peptídeos L-TAT ou L-TAT-IBI(s) da invenção (0-25 pM) foram misturados com as quinases JNK1, JNK2, ou JNK3 recombinantes em tampão de reação (Tris-acetato 20 mM , EG- TA 1mM, p-nitrofenil-fosfato 10 mM (pNPP), pirofosfato de sódio 5 mM, p-glicerofosfato 10 mM, ditiotreitol 1 mM) por 20 minutos. As reações de quinase foram então iniciadas pela adição de MgCh 10 mM e 5 pCi 33P-Y-dATP e 1 pg tanto de GST-Jun (aa 1-89), GST-AFT2 (aa 1-96) ou GST-ELK1 (AA de 307-428). Proteínas de fusão de GST foram adquiridas de Stratagene (La Jolla, CA).

[00150] Dez pL de esferas de agarose-glutationa também foram adicionadas à mistura. Produtos de reação foram então separados por SDS-PAGE em um gel de poliacrilamida 10% desnaturante. Os géis foram secados e subseqüentemente expostos a filmes de raio X (Kodak). A inibição quase completa de c-Jun, ATF2 e fosforilação de Elk1 por JNKs foi observada nos peptídeos TAT-IB(s) da invenção em doses tão baixas quanto 2,5 pM. Entretanto, uma exceção acentuada foi a ausência de inibição em TAT-IB(s) da forsforilação por JNK3 de Elk1. Em geral, o peptídeo TAT-IB1(s) da invenção mostrou efeitos superiores na inibição da fosforilação pela família JNK de seus fatores de transcrição alvo. A habilidade dos peptídeos D-TAT, D-TAT-IBI(s) da invenção e L-TAT-IBI(s) da invenção (estudo em dosagem de 0- 250 pM) de inibir a fosforilação de GST-Jun (aa 1-73) por JNK1, JNK2, e JNK3 recombinante foi analisada como descrito acima. Geralmente, peptídeo D-TAT-IBI(s) diminuiu a fosforilação mediada por JNK de c- Jun, mas em níveis de aproximadamente 10-20 vezes menos eficazmente do que L-TAT-IBI(s).

Exemplo 6: Inibição de fosforilação de c-JUN por JNKs ativadas

[00151] Os efeitos dos peptídeos L-TAT ou L-TAT-IBI(s) da invenção sobre JNKs ativadas por estímulos de estresse foram avaliados usando GST-Jun para destruir JNKs de células HeLa irradiadas com luz UV ou células PTC tratadas com IL-1 β. As células PTC foram cultivadas como descrito acima. Células HeLa foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino, estreptomicina 100 pg/mL, penicilina 100 unidades/ml e glutamina 2 mM. Uma hora antes de serem usadas para preparação de extrato celular, as células PTC foram ativadas com IL-1 β como descrito acima, enquanto que as HeLa foram ativadas por luz UV (20 J/m2). Os extratos celulares foram preparados a partir de células HeLa de controle, irradiadas com UV e células βTC-3 tratadas com IL-1 β por fragmentar as culturas celulares em tampão de lise (Tris-acetato 20 mM, EGTA 1 mM, Triton X-100 1%, p-nitrofenil-fosfato 10 mM, pirofosfasto de sódio 5 mM, P-glicerofosfato 10 mM, ditiotreitol 1 mM). Os resíduos foram removidos por centrifugação por cinco minutos a 15.000 rpm em um rotor Beckman SS-34. Cem pg de extratos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente com um pg de GST-jun (aminoácidos 1-89) e 10 pL de esferas de glutationa-agarose (Sigma). Após quatro lavagens com o tampão de fragmentação, as esferas foram ressuspensas no mesmo tampão suplementado com peptídeos L-TAT ou L-TAT-IBI(s) da invenção (25 pM) por 20 minutos. As reações de quinase foram então iniciadas pela adição de MgCh 10 mM e 33P-v-dATP 5 pCi e incubadas por 30 minutos a SO'C.

[00152] Os produtos de reação foram então separados por SDS- PAGE em um gel de poliacrilamida 10% desnaturante. Os géis foram secos e subseqüentemente expostos a filmes de raio-X (Kodak). Os peptídeos TAT-IB(s) da invenção evitaram eficazmente a fosforilação de c-Jun por JNKs ativadas nesses experimentos.

Exemplo 7: Inibição in vivo de fosforilação de c-JUN por peptídeos TAT-IB(s) da invenção

[00153] Para determinar se os peptídeos permeáveis à célula da invenção poderiam bloquear a sinalização de JNK in vivo, foi usado um sistema de GAL4 heterólogo. Células HeLa, cultivadas como descrito acima, foram co-transfectadas com vetor repórter 5xGAL-LUC junto com o construto de expressão GAL-Jun (Stratagene) que compreende o domínio de ativação de c-Jun (aminoácidos 1-89) ligado ao domínio de ligação ao DNA de GAL4. A ativação de JNK foi obtida pela co-transfecção de vetores expressando as quinases MKK4 e MKK7 diretamente a montante (vide Whitmarsh et ai., Science 285: 1573 (1999)). Resumidamente, 3x105 células foram transfectadas com os plasmídeos em placas de 3,5 cm usando DOTAP (Boehringer Mannheim) seguindo as instruções do fabricante. Para experimentos envolvendo GAL-Jun, 20 ng do plasmídeo foram transfectados com 1 pg do plasmídeo repórter pFR-Luv (Stratagene) e 0,5 pg dos plasmídeos expressando MKK4 ou MKK7. Três horas após a transfecção, o meio celular foi trocado e peptídeos TAT e TAT-IB1(s) (1 pM) foram adicionados. As atividades de luciferase foram medidas 16 horas mais tarde usando o "Dual Reporter System" de Promega após normalização para o conteúdo de proteína. Adição de peptídeo TAT-IB1(s) bloqueou a ativação de c-Jun após ativação de JNK mediada por MKK4 e MKK7. Pelo fato das células HeLa expressarem as isoformas JNK1 e JNK2 mas não JNK3, transfectou-se células com JNK3. Novamente, o peptídeo TAT-IB(s) inibiu a ativação de c-Jun mediada por JNK2.

Exemplo 8: Inibição de morte de célula β pancreática induzida por IL-1 β por peptídeos TAT-IB

[00154] Foi investigado o efeito dos peptídeos L-TAT-IB(s) da invenção sobre a promoção de apoptose de célula β causada por IL-1. Culturas de células βTC-3 foram incubadas por 30 minutos com 1 pM de peptídeos L-TAT-IBI(s) da invenção seguido por 10 ng/mL de IL-1. Uma segunda adição de peptídeo (1 pM) foi realizada 24 horas mais tarde. As células apoptóticas foram contadas após dois dias de incubação com IL-1 β usando coloração nuclear de iodeto de propídeo (cé-lulas coradas de vermelho são células mortas) e Hoechst 33342 (células coradas de azul são células com membrana plasmática intacta). Adição dos peptídeos TAT-IB(s) da invenção inibiu a apoptose induzida por IL-1 de células βTC-3 cultivadas na presença de IL-1 β por dois dias.

[00155] Inibição em longo prazo da morte celular induzida por IL-1 foi examinada pelo tratamento de células βTC-3 como descrito acima, exceto que a incubação das células com os peptídeos e IL-1 β foi mantida por 12 dias. Peptídeos adicionais (1 pM) foram adicionados a cada dia e IL-1 β adicional (10 ng/mL) foi adicionada a cada 2 dias. O peptídeo TAT-IB1(s) da invenção confere forte proteção contra apoptose nessas condições. Tomados juntos, esses experimentos fornecem evidencia de que os peptídeos TAT-IB(s) da invenção são moléculas biologicamente ativas capazes de evitar os efeitos da sinalização de JNK sobre a destruição da célula.

Exemplo 9: Síntese de peptídeos IB(s) totalmente-D retroinversos da invenção

[00156] Peptídeos da invenção podem ser peptídeos totalmente-D sintetizados em reverso para evitar a proteólise natural (isto é, peptídeos totalmente-D retroinversos). Um peptídeo totalmente-D retroin- verso da invenção forneceria um peptídeo com propriedades funcionais similares ao peptídeo nativo, em que os grupos laterais dos aminoácidos componentes corresponderiam ao alinhamento de peptídeo nativo, mas manteriam um esqueleto resistência à protease.

[00157] Peptídeos retroinversos da invenção são análogos sintetizados usando D-aminoácidos pela ligação dos aminoácidos em uma cadeia de peptídeo tal que a sequência de aminoácidos no peptídeo retroinverso análoga seja exatamente oposta àquela no peptídeo selecionado que serve como o modelo. Para ilustrar, se a proteína TAT de ocorrência natural (formada de L-aminoácidos) tem a sequência GRK- KRRQRRR [SEQ ID NO: 5], o análogo de peptídeo retroinverso desse peptídeo (formado de D-aminoácidos) teria a sequência RRRQRRK- KRG [SEQ ID NO: 6], Os procedimentos para sintetizar uma cadeia de D-aminoácidos para formar os peptídeos retroinversos são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368,692-693 (1994); Guichard et al., J. Med. Chem. 39,2030-2039 (1996)). Especificamente, os retropeptí- deos foram produzidos por síntese F-mock clássica e ainda analisados por Espectometria de Massa. Eles foram finalmente purificados por HPLC.

[00158] Já que um problema inerente aos peptídeos nativos é a degradação por proteases naturais e imunogenicidade inerente, os compostos heterobivalentes e heteromultivalentes dessa invenção serão preparados para incluir o "isômero retroinverso" do peptídeo desejado. Proteger o peptídeo de proteólise natural deve, portanto aumentar a eficácia do composto heterobiovalente ou heteromultivalente específico, tanto por prolongar a meia-vida como por diminuir a extensão de resposta imune direcionada para destruir ativamente os peptídeos.

Exemplo 10: Atividade biológica de longo prazo de peptídeos IB(s) to- talmente-D retroinversos da invenção

[00159] Atividade biológica de longo prazo é prevista para o hetero- conjugado de peptídeo contendo D-TAT-IB(s) retroinverso quando comparada com o análogo de L-aminoácido nativo devido à proteção do peptídeo D-TAT-IB(s) da invenção de degradação por proteases nativas, como mostrado no Exemplo 5.

[00160] A inibição de morte de célula β pancreática induzida por IL- 1 β pelo peptídeo D-TAT-IBI(s) da invenção foi analisada. Células βTC-3 foram incubadas como descrito acima por 30 minutos com uma única adição dos peptídeos indicados (1 pM), então IL-1 (10 ng/ml) foi adicionada.

[00161] As células apoptóticas foram então contadas após dois dias de incubação com IL-1 β pelo uso de coloração nuclear com Iodeto de Propídeo e Hoechst 33342. Um mínimo de 1.000 células foi contado para cada experimento. O Erro Padrão das Médias (SEM) está indicado, n=5. O peptídeo D-TAT-IB1 diminuiu a apoptose induzida por IL-1 em uma extensão similar aos peptídeos L-TAT-IB.

[00162] A inibição de longo prazo de morte celular induzida por IL- 1P pelo peptídeo D-TAT-IB1 também foi analisada. Células βTC-3 foram incubadas como acima por 30 minutos com uma única adição dos peptídeos indicados (1 pM), a seguir, IL-1 β (10 ng/ml) foi adicionada, seguida pela adição da citocina a cada dois dias. Células apoptóticas foram então contadas após 15 dias de incubação com IL-1 pelo uso de coloração nuclear com iodeto de propídeo e Hoechst 33342. Observe que uma única adição do peptídeo TAT-IB1 não confere proteção de longo prazo. Um mínimo de 1.000 células foi contado para cada experimento. Como um resultado, D-TAT-IBI(s) da invenção, mas não L- TAT-IB1(s) da invenção foi capaz de conferir proteção de longo prazo (15 dias).

Exemplo 11: Inibição de morte de célula β pancreática induzida por irradiação por peptídeos TAT-IB(s)

[00163] JNK também é ativado por radiação ionizante. Para determinar se os peptídeos TAT-IB(s) da invenção forneceriam proteção contra lesão de JNK induzida por radiação, células "WiDr" foram irradiadas (30 Gy) na presença ou ausência de peptídeos D-TAT, L-TAT- IB1 (s) da invenção, ou D-TAT-IBI(s) da invenção (1 pM adicionado 30 minutos antes da irradiação). Células de controle (CTRL) não foram irradiadas. As células foram analisadas 48 horas mais tarde por meio de coloração com PI e Hoechst 3342, como descrito acima. N = 3, SEM estão indicados. Peptídeos L-TAT-IBI(s) e D-TAT-IBI(s) da invenção foram ambos capazes de evitar a apoptose induzida por irradiação nessa linhagem de câncer de cólon humano.

Exemplo 12: radioproteção à radição ionizante por peptídeos TAT- IB(s) da invenção

[00164] Para determinar os efeitos radioprotetores dos peptídeos TAT-IB(s) da invenção, camundongos C57B1/6 (2 a 3 meses de idade) foram irradiados com um Raio X Phillips RT 250 em uma dose de 0,74 Gy/min (17 mA, filtro de Cu de 0,5 mm). Trinta minutos antes da irradiação, os animais foram injetados i.p. com peptídeos TAT da invenção, L-TAT-IBI(s) da invenção, ou D-TAT-IBI(s) da invenção (301 de uma solução de 1 mM). Resumidamente, os camundongos foram irradiados como segue: os camundongos foram colocados em pequenas caixas de plástico com a cabeça para fora da caixa. Os animais foram colocados com suas costas sob o irradiador, e seu pescoço fixado em um pequeno túnel de plástico para manter sua cabeça em uma posição correta. O corpo foi protegido com chumbo.

[00165] Antes da irradiação os camundongos foram mantidos com uma ração granular de camundongo padrão, entretanto após a irradiação os camundongos foram alimentados com um alimento semilíquido que foi renovado cada dia.

[00166] A reação da mucosa dos lábios foi então avaliada por 2 observadores independentes de acordo com o sistema de avaliação desenvolvido por Parkins et al. (Parkins et al, Radiotherapy & Oncology, 1: 165-173, 1983), no qual o estado de eritema assim como a presença de edema, descamação e exudação foi especificada. Adicionalmente os animais foram pesados antes de cada registro de seu estado de eritema/edema.

[00167] Os resultados desses experimentos indicam que os peptídeos TAT-IB(s) da invenção podem proteger contra perda de peso e eritema/edema associado com radiação ionizante.

Exemplo 13: Supressão de fatores de transcrição de JNK por peptídeos L-TAT-IBKs) da invenção

[00168] Ensaios de retardo em gel foram realizados com uma sonda dupla marcada AP-1 (5-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3' (SEQ ID NO: 27). Extratos nucleares de células HeLa que foram tratados ou não por uma hora com 5 ng/ml de TNF-a, como indicado. Peptídeos TAT e L-TAT-IBI(s) da invenção foram adicionados 30 minutos antes de TNF-a. Apenas a parte do gel com o complexo de DNA de AP-1 específico (como demonstrado por experimentos de competição com competidores não marcados específicos e inespecífico) é mostrada.

[00169] Peptídeos L-TAT-IBI(s) da invenção diminuem a formação do complexo de ligação de DNA de AP-1 em presença de TNF-α.

Exemplo 14: Avaliação da neuroprotecão contra isquemia focal cerebral, em um modelo de MCAO permanente - Determinação da eficácia da proteção em doses diferentes (vide Figura 3)

[00170] Isquemia focal cerebral foi induzida em ratos de 12 dias de idade. Filhotes foram anestesiados em uma câmara de indução com 2% de isoflurano e durante a operação a anestesia foi mantida usando uma máscara sob 2% de isoflurano. MCAO foi induzido por eletrocoa- gulação de um ramo principal da artéria cerebral medial (MCA). Os ratos foram colocados do lado direito, e uma incisão dérmica oblíqua foi feita entre a orelha e o olho. Após excisão do músculo temporal, o osso craniano foi removido da sutura frontal para um nível abaixo do arco zigomático. O MCA restante, exposto logo após sua aparição sobre a fissura nasal foi permanentemente eletrocoagulado ao nível da veia cerebral inferior antes do MCA bifurcar nos ramos frontal e parietal. A incisão de pele craniana foi então fechada. Os filhotes de rato foram então colocados em uma incubadora e mantidos a 370 até que eles acordaram, e foram então transferidos para suas mães.

[00171] 6 horas mais tarde, um peptídeo D-TAT-IBI(s) da invenção de acordo com SEQ ID NO: 11 foi injetado intraperitonealmente. 24 horas após a coagulação, os ratos foram anestesiados com hidrato de cloral e perfundidos através da aorta ascendente com 4% de parafor- maldeído em PBS. Os cérebros foram então removidos e mantidos por 2 horas na mesma solução de fixação, e colocados em um gradiente de 30% de sacarose em PBS por cerca de 15 horas a 40. Os cérebros foram congelados em isopentano (-400) e armazenados a - 200. Seções de criostato coronais de 50 pm foram coletadas em lâminas de vidro. As seções foram coradas com violeta de cresil. Cada décimo de seção foi analisado e o volume total da lesão foi calculado usando o programa Neuroleucida. No grupo de controle A, o volume médio da lesão foi de 21,47 mm3. Todos os grupos tratados têm uma média menor do que o grupo de controle. Uma diferença estatística significativa é observada entre o grupo A e os grupos C, E e F (teste-T unicaudal, p=0,030, p= 0,002, p=0,001, respectivamente). Os resultados são mostrados na Figura 4.

[00172] Como um resultado, esses dados suportam a conclusão de que o peptídeo quimérico D-TAT-IBI(s) da invenção de acordo com SEQ ID NO: 11, administrado em uma dose de 11 mg/kg, 3 mg/kg, 0,3mg/kg e 0,03 mg/kg, contribui para proteção cerebral. Os resultados em uma dose de 1 mg/kg, 0,003 mg/kg e 0,0003 comparados com o grupo de salina sugerem que a amostra total não era grande o suficiente para atingir uma diferença significativa. A melhor proteção é observada em uma dose de 0,03 mg/kg.

Exemplo 15: Avaliação de neuroproteção por peptídeos quiméricos da invenção após administração i.v. contra isquemia cerebral focal, em um modelo de MCAO transitório (vide figura 4)

[00173] Isquemia transitória em camundongos adultos. Usando camundongos ICR-CD1 machos (6 semanas de idade; 18-37 g; Harlan), provocou-se isquemia pela introdução de um filamento desde a artéria carótida comum para dentro da carótida interna e avançando para dentro do círculo arterial, assim ocluindo a artéria cerebral medial. Me- diu-se o fluxo sangüíneo cerebral regional por fluxometria de laser Doppler, com uma sonda fixa sobre o crânio por toda a isquemia até 10 min após a reperfusão. A temperatura retal foi medida e mantida a 37CC. Os camundongos foram mortos 48h após a reperfusão. Seções de criostato seriadas de 20 pm de espessura foram investigadas usando um sistema de microscópio computadorizado equipado com o programa Neurolucida (MicroBrightField) e os volumes da área isquê- mica e do cérebro total foram calculados (de forma cega) com o programa Neuroexplorer.

[00174] XG-102 0,3= 0,3 mg/kg, XG-102 1= 1 mg/kg, XG-102 5= 5 mg/kg

[00175] Os tamanhos de volume de infarto (mm3) após administração de massa i.v. de placebo e XG-102 0,3; 1 e 3 mg/kg; 6 horas após a reperfusão ("clamp" de 30 minutos) em um modelo de camundongos adultos foram como segue.

Exemplo 16: Ensaio em culturas neuronais pela medição de liberação de LDH após estímulo com NMDA (vide Figura 5)

[00176] O efeito neuroprotetor do peptídeo D-TAT-IB (genéri- co)(s)/D-JNKI1 (SEQ ID NO: 12) foi avaliado em culturas irmãs pré- tratadas por 30 min com as concentrações indicadas de peptídeos ou MK-801 antes de exposição contínua a NMDA 100 pM. Após 12 h de tratamento com NMDA, em culturas pré-tratadas com 5 pM de D-TAT- IB (genérico)(s)/D-JNKI1 as alterações degenerativas devido à exposição a NMDA foram completamente inibidas como indicado pela ausência de liberação de LDH significativa acima dos controles (Fig. 5). O aparecimento morfológico, número e distribuição dos neurônios não foram distinguíveis a partir dos controles.

[00177] Cultura neuronal cortical. Dissecou-se pequenos pedaços de córtex dos cérebros de filhotes de rato de 2 dias de idade, incubou- se com 200 unidades de papaína por 30 min a 34CC, e então colocou- se os neurônios em densidades de aproximadamente 1 x 106 célu- las/placa em placas pré-revestidas com 100 pg/ml de poli-D-lisina. O meio de plaqueamento consistiu de B27/Neurobasal (Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado com glutamina 0,5 mM, penicilina 100 U/ml e estreptomicina 100 pg/ml.

[00178] Ensaio de citotoxicidade de lactato desidrogenase (LDH). LDH liberada no meio de banho 12, 24 e 48 após a administração de NMDA foi medida usando o kit de ensaio de citotoxicidade não- radiotativo Cytotox 96 Promega, Wl) (vide Fig. 5).

Exemplo 17: Inibição de atividade de JNK endógena em células HepG2 usando uma abordagem de uma cavidade (vide figura 6)

[00179] Células HepG2 foram semeadas a 3.000 células/cavidade no dia antes do experimento. Então concentrações crescentes de in- terleucina-1 β [IL-1 β (v)] ou fator de necrose tumoral α [TNFα (•)] (a) foram adicionados para ativar JNK por 30 minutos. As células foram lisadas em Hepes 20 mM, Tween pH 7,4 e processadas por AlphaS- creen JNK. (b) Z’ para a atividade de JNK induzida por 10 ng/ml de IL- 1β e medido em 384 cavidades/placa (n = 96). (c) Inibição de atividade de JNK induzida por IL-1 β endógena com inibidores químicos de JNK [estaurosporina (°) e SP600125 (•)]. (d) Efeito de inibidores peptidícos L-TAT-IBI(s) de acordo com SEQ ID NO: 9 [aqui abreviado como L- JNKi (v)) e D-TAT-IBI(s) de acordo com SEQ ID NO: 11 (aqui abreviado como D-JNKi (♦)) e JBDs (•) (corresponde a L-JNKI sem a sequência TAT)] sobre a atividade de JNK dependente de IL-1 β. Todos os painéis são representativos de três experimentos independentes (n=3)

Métodos: Ensaio de guinase Alphascreen

[00180] Princípio: AlphaScreen é uma tecnologia não-radioativa a base de esferas usada para estudar interações biomoleculares em um formato de microplacas. O acrônimo ALPHA significa "Amplified Luminescence Proximity Homogenous Assay". Ele envolve uma interação biológica que traz uma esfera "doadora" e uma "aceptora" em proximidade, então uma cascata de reações químicas age para produzir um sinal amplificado. Por excitação por laser a 680 nm, um fotossensibili- zador (ftalocianina) na esfera "doadora" converte o oxigênio do ambiente para um estado siglete excitado. Dentro de 4 pseg de meia-vida, a molécula de oxigênio singleto pode se difundir para aproximadamente 200 nm em solução e se uma esfera aceptora estiver dentro dessa proximidade, o oxigênio singleto reage com o derivado de tioxeno em esfera "aceptora", gerando quimiluminescência a 370 nm que ainda ativa fluoróforos contidos na mesma esfera "aceptora". Os fluoróforos excitados subseqüentemente emitem luz a 520-620 nm. Na ausência de uma esfera aceptora, o oxigênio singleto cai para o estado mais estável e nenhum sinal é produzido.

[00181] Reagentes de quinase (B-GST-cJun, anticorpo anti P-cJun e JNK3 ativo) foram primeiro diluídos em tampão de quinase (Tris-HCI 20 mM pH 7.6, MgCh 10 mM, DTT 1 mM, Na3VO4100 pM, Tween-20 0,01%) e adicionados aos cavidades (15 pl). As reações foram então incubadas na presença de 10 pM de ATP por 1 ha 23'C. A detecção foi realizada por uma adição de 10 pl de misturas de esferas (aceptora de Proteína A 20 pg/ml e doadora de estreptavidina 20 pg/ml), diluída em tampão de detecção (Tris-HCI 20 mM pH 7.4, NaCI 20 mM, EDTA 80 mM, BSA 0,3%), seguido por outra incubação de 1 hora a 23'C no escuro para medição de atividade endógena de JNK, ensaios de quinase foram realizados como descrito acima exceto que JNK3 ativa foi substituída por lisados de células e os componentes de quinase da reação foram adicionados após a lise das células. Anticorpos de B- GST-cjun e P-cJun foram usados nas mesmas concentrações enquanto que ATP foi usado em 50 pM ao invés de 10 pM. O sinal de AlphaS- creen foi analisado diretamente no equipamento Fusion ou En Vision.

Exemplo 18: Tratamento de trauma por som

[00182] D-TAT-IBI(s) foi aplicado sobre a membrana da janela redonda da cóclea de 3 grupos de porcos da guiné (cada grupo com 6 animais) em 2 microlitros de uma formulação de gel de 2,6% de ácido hialurônico tamponado (Hylumed, Genzyme Corp.) em uma concentração de 100 pM 30 minutos antes do trauma por som (120 dB a 6 kHz durante 30 minutos) ou 30 minutos ou 4 após isso. Ouvidos não tratados serviram como controle. As alterações de limiar de audição foram avaliadas por mediadas de resposta de tronco cerebral auditivo 20 minutos após trauma por som (alteração de limiar temporária, TTS) e 15 dias após o trauma (alteração de limiar permanente, PTS). Administração de D-TAT-IBI(s) protegeu contra perda auditiva permanente mesmo se aplicado após a exposição a barulho excessivo em comparação com ouvidos não tratados. O efeito protetor foi mais forte quanto antes D- TAT-IB1(s) foi administrado após o trauma por som. Dessa forma D- TAT-IB1(s) é um composto otoprotetor muito eficaz o caso de trauma por som.

[00183] A partir da descrição detalhada anterior das modalidades específicas da invenção, deve ficar claro que peptídeos quiméricos bioativos permeáveis à célula e sequências inibidoras de JNK únicos foram descritos. Embora modalidades particulares tenham sido descritas aqui em detalhe, isso foi feito como forma de exemplo para fins de ilustração apenas, e não pretende ser limitante com relação ao escopo das reivindicações anexas que seguem. Em particular, é contemplado pelo inventor que várias substituições, alterações, e modificações podem ser feitas à invenção sem desconsiderar o espírito e escopo da invenção como definida pelas reivindicações.

Claims

1. Peptídeo quimérico, caracterizado pelo fato de que consiste em um primeiro domínio, um segundo domínio e opcionalmente uma sequência ligante, o primeiro domínio consistindo em uma sequência de tráfego e o segundo domínio consistindo em uma sequência inibidora de JNK, sendo que o primeiro domínio consiste na sequência de aminoácido totalmente-D retroinversa de acordo com a SEQ ID NO: 6 e sendo que o segundo domínio consiste na sequência de aminoácido totalmente-D retroinversa de acordo com a SEQ ID NO: 2, sendo que o primeiro domínio é ligado ao final do terminal- C do segundo domínio diretamente ou pela referida sequência ligante consistindo em 1 a 10 aminoácidos.

2. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência ligante consiste em 1 a 5 aminoácidos.

3. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de ligante é composto por aminoácidos L, aminoácidos D ou uma combinação de ambos.

4. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 11.

5. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as sequências de tráfego aumentam a absorção celular do peptídeo.

6. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a sequência de tráfego dire- ciona a localização nuclear do peptídeo.

7. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o peptídeo apresenta uma modificação na terminação C.

8. Peptídeo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a terminação C é modificada por um grupo amida.

9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

10. Uso de um peptídeo quimérico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para tratar uma patofisi- ologia selecionada dentre malignidades do pulmão, de mama, linfói- des, e do trato gastrointestinal e genito-urinário, assim como adenocarcinomas, incluindo malignidades tais como cânceres de cólon, carcinoma de célula renal, câncer de próstata, carcinoma de células não pequenas do pulmão, câncer do intestino delgado e câncer do esôfa-go, assim como leucemia, cânceres com transformações oncogênicas de Bcr-Abl, psoríase, pênfigo vulgar, síndrome de Behcet, síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS), doença cardíaca isquêmica, síndrome pós-diálise, artrite reumatóide, síndrome da imunodeficiência adquirida, vasculite, choque séptico, reestenose, perda da audição, trauma do ouvido, isquemia, derrame, lesões de reperfusão, hipóxia, doenças auto-imunes, doenças neurodegenerativas, doenças cardiovasculares, osteoporose, resposta a estímulo estressante e com efeitos secundários devido à tratamento com citocinas pró-inflamatórias, diabetes hipertrofia do coração e cardíaca e lesões ateroscleróticas, estados patológicos induzidos por radiação ionizante como usada em radioterapia e luz ultravioleta (luzes UV), estados patológicos induzidos por agentes que danificam o DNA, incluindo fármacos quimioterá- picos, hipo- e hipertermia, doenças inflamatórias, autoinflamatórias, imunes e auto-imunes, doenças degenerativas, miopatias, cardiomio- patias e rejeição de enxerto.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que ser na preparação de uma composição farmacêutica para tratar derrame, trauma cerebral, lesão da medula espinal, escle- rose lateral amiotrófica, doença de Huntington, doença de Alzheimer e doença de Parkinson.

12. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica deve ser administrada por uma via de administração selecionada do grupo que consiste em intraperitoneal, nasal, intravenosa, oral e liberação por emplastro.

13. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um peptídeo quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.