NO342272B1

NO342272B1 - JNK-inhibitorsekvens, kimært peptid, farmasøytisk sammensetning og anvendelse av disse.

Info

Publication number: NO342272B1
Application number: NO20081664A
Authority: NO
Inventors: Christophe Bonny
Original assignee: Xigen Inflammation Ltd
Priority date: 2005-09-12
Filing date: 2008-04-04
Publication date: 2018-04-30
Also published as: RS54701B1; US20200062805A1; EP3012266A1; WO2007031098A1; BRPI0616824A2; US20170320917A1; JP5386169B2; PL1928903T3; IL189133A0; CN101263157B; EP1928903A2; ES2567708T3; ME02426B; BRPI0616824B1; IL237984A0; DK1928903T3; EP2418217B1; HRP20160379T1; EP2418217A1; AU2006291541A1

Abstract

Den foreliggende oppfinnelsen angår proteinkinaseinhibitorer og mer spesifikt inhibitorer av proteinkinase c-Jun-aminoterminal kinase. I tillegg tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen JNK- inhibitorsekvenser, kimære peptider, nukleinsyrer som koder det samme så vel som farmasøytiske sammensetninger for å behandle patofysiologier assosiert med JNK-signalisering.

Description

Den foreliggende oppfinnelsen angår proteinkinaseinhibitorer og mer spesifikt inhibitorer av proteinkinase c-jun aminoterminal kinase. I tillegg tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen JNK-inhibitorsekvenser, kimære peptider, så vel som farmasøytiske sammensetninger for å behandle patofysiologier assosiert med JNK-signalisering. Oppfinnelsen er definert i patentkravene.

c-Jun aminoterminalkinase (JNK) er et medlem av den stressaktiverte gruppen av mitogenaktiverte protein (MAP) -kinaser. Disse kinasene er blitt implisert i kontroll av cellevekst og differensiering og mer generelt i reaksjonen til celler overfor omgivelsesstimuli. JNK-signaltransduksjonsveien blir aktivert som en respons til omgivelsesstress og ved engasjement av flere klasser av celleoverflatereseptorer. Disse reseptorene kan inkludere cytokinreseptorer, serpentinreseptorer og reseptortyrosinkinaser. I pattedyrceller har JNK blitt implisert i biologiske prosesser så som onkogen transformasjon og mediering av adaptive responser til omgivelsesstress. JNK er også blitt assosiert med modulering av immunresponser inkludert modning og differensiering av immunceller så vel som å utføre programmert celledød i celler identifisert for destruksjon av immunsystemet. Denne unike egenskapen gjør JNK-signalisering til et lovende mål for utvikling av farmakologisk intervensjon. Blant flere nevrologiske lidelser, er JNK-signalisering spesielt implisert i iskemisk slag og Parkinsons sykdom.

En tilnærming ved bekjempelse av lidelser som er sterkt relatert t il JNK-signalisering, er tilveiebringelse av inhibitorer i JNK-signaliseringsveien. Slike inhibitorer inkluderer, som allerede kjent i teknikken, spesielt for eksempel oppstrøms kinaseinhibitorer (for eksempel CEP-1347), små kjemiske inhibitorer av JNK (SP600125 og AS601245) som direkte påvirker kinaseaktiviteten, for eksempel ved å konkurrere med ATP-bindingssetet til proteinkinasen og peptidinhibitorer av interaksjonen mellom JNK og dens substrater (D-JNKI og I-JIP) (se for eksempel Kuan et al., Current Drug Targets - CNS & Neurological Disorders, februar 2005, vol. 4, nr.1, sidene 63-67(5)).

Oppstrøms kinaseinhibitoren CEP-1347 (KT7515) er en halvsyntetisk inhibitor av kinasefamilien med blandet avstamning. CEP-1347 (KT7515) fremmer nevronal overlevelse i doser som inhiberer aktivering av c-Jun aminoterminale kinaser (JNKer) i primære embryone kulturer og differensierte PC12-celler etter trofisk tilbaketrekning og hos mus behandlet med 1-metyl-4-fenyltetrahydropyridin. Videre kan CEP-1347 (KT7515) fremme langtids overlevelse av dyrkede kyllingembryonisk dorsal rotganglion, sympatiske, ciliære og motoriske nevroner (se for eksempel Borasio et al., Neuroreport. 9(7): 1435-1439, 11. mai 1998.).

Den lille kjemiske JNK-inhibitoren SP600125 ble funnet å redusere nivåene av c-Jun-fosforylering, å beskytte dopaminerge nevroner fra apoptose og delvis å gjenopprette nivået av dopamin i MPTP-indusert PD i C57BL/6N-mus (Wang et al., Neurosci Res. 2004 Feb; 48(2); 195-202). Disse resultatene angir ytterligere at JNK-veien er den viktigste mediator av de nevrotoksiske virkningene av MPTP in vivo og å inhibere JNK-aktivitet kan representere en ny og effektiv strategi for å behandle PD.

Et ytterligere eksempel på små kjemiske inhibitorer er den ovennevnte JNK-inhibitoren AS601245. AS601245 inhiberer JNK-signaliseringsveien og fremmer celleoverlevelse etter cerebral iskemi. In vivo tilveiebrakte AS601245 signifikant beskyttelse mot det forsinkede tap av hippocampus CA1-nevroner i en ørkenrottemodell av transient global iskemi. Denne effekten ble mediert av JNK-inhibisjon og derfor ved c-Jun-ekspresjon og fosforylering (se for eksempel Carboni et al., J Pharmacol Exp Ther.2004 Jul; 310(1): 25-32. Epub 2004 Feb 26<th>).

En tredje klasse av inhibitorer av JNK-signaliseringsveien representerer peptidinhibitorer av interaksjonen mellom JNK og dets substrat som nevnt ovenfor. Som et utgangspunkt for konstruksjon av slike JNK-inhibitorpeptider, kan en sekvenssammenstilling av naturlig forekommende JNK-proteiner anvendes. Typisk omfatter disse proteinene JNK-bindende domener (JBDer) og opptrer i forskjellige insulinbindende (IB) proteiner så som IB1 eller IB2. Resultatene av en slik eksempelvis sekvenssammenstilling er for eksempel en sekvenssammenstilling mellom JNK-bindende domener i IB1 [SEKV.ID. NR. 13], IB2 [SEKV.ID. NR. 14], c-Jun [SEKV.ID. NR. 15] og ATF2 [SEKV.ID. NR. 16] (se for eksempel figurene 1A-1C). En slik sammenstilling gir en delvis konservert 8 aminosyresekvens (se for eksempel figur 1A). En sammenligning mellom JBDer til IB1 og IB2 gir videre to blokker på syv og tre aminosyrer som er i høy grad konservert mellom de to sekvensene.

I Barr et al; Identification of the critical features of a small peptide inhibitor of JNK activity; J. Biol. Chem., vol. 277, nr. 13, år, s.10987-10997, ISSN 0021-9258 er det identifisert et peptid på 21 aminosyrer som inhiberer aktiverte JNKer. Dette peptidet, I-JIP (Inhibitor av JNK-basert på JIP-1 (JNK-interacting protein -1)), inhiberte JNK aktivitet in vitro mot rekombinant c-Jun, Elk, og ATF2.

Sekvenser konstruert på basis av en slik sammenstilling er for eksempel beskrevet i WO 01/27268. Særlig beskriver WO 01/27268 små cellepermeable fusjonspeptider som omfatter en såkalt TAT-cellegjennomtrengningssekvens avledet fra den basale transportsekvensen til HIV-TAT-protein en minimal 20 aminosyrer inhibitorisk sekvens av IB1. Begge komponentene er kovalent koblet til hverandre. Eksempelvis (og for tiden de eneste) inhibitorer av MAPK-JNK-signaliseringsveien beskrevet i WO 01/27268 er for eksempel L-JNKI1 (JNK-inhibitorpeptid sammensatt av L-aminosyrer) eller de protease resistente D-JNKI1-peptidene (JNK-inhibitorpeptid sammensatt av ikke-native D-aminosyrer). Disse JNK-inhibitor (JNKI) -peptidene er spesifikke for JNK (JNK1, JNK2 og JNK3). I motsetning til disse små forbindelsesinhibitorer som diskutert ovenfor, inhiberer inhibitorsekvensene i WO 01/27268, for eksempel JNKI1 interaksjonen mellom JNK og dets substrat. Ved transportsekvensen avledet fra TAT, blir fusjonspeptidet effektivt transporte rt inn i cellene. På grunn av de nye egenskapene oppnådd ved transportkomponenten, blir fusjonspeptidene aktivt transportert inn i cellene hvor de forblir effektive inntil proteolytisk degradering.

Peptider i henhold til WO 01/27268 er imidlertid fremdeles tilgjengelige for fosforylaser (kinaser). Enhver aminosyre i et peptid som tjener som et mål for kinaser og derfor kan utsettes for fosforylering, representerer en viktig faktor for inaktivering av slike peptider. Der for er en første hensikt med den fore liggende oppfinnelsen å tilveiebringe nye inhibitorsekvenser for JNK-signaliseringsveien som bibeholder de funksjonelle egenskapene til peptider som beskrevet i WO 01/27268 men som tilveiebringer forsterket stabilitet mot fosforylase (kinaser).

Videre krever inhibitorsekvenser i henhold til WO 01/27268 et kostbart gjenvinnings- og rensetrinn, særlig hvis det fremstilles i storskalamengder (for industriell produksjon). Således er det en andre hensikt ved den foreliggende oppfinnelsen å tilveiebringe inhibitorsekvenser som tillater lettere og mer kostnadseffektiv produksjon og gjenvinning enn de i den kjente teknikk.

Disse hensikter er oppnådd ved JNK-inhibitorsekvensen som består av aminosyresekvensen i henhold til SEKV.ID. NR. 2.

Fortrinnsvis binder JNK-inhibitorsekvensen i henhold til oppfinnelsen JNK og/eller inhiberer aktiveringen av minst én JNK-aktivert transkripsjonsfaktor, for eksempel c-Jun eller ATF2 (se for eksempel SEKV.ID. NR. 15 og 16 henholdsvis) eller Elk1.

JNK-inhibitorsekvensen i henhold til oppfinnelsen inneholder fortrinnsvis eller består i det minste av én aminosyresekvens i henhold til SEKV.ID. NR. 1, 2, 3 eller 4 eller et fragment, derivat eller variant derav. Mer fortrinnsvis kan JNK-inhibitorsekvensen i henhold til oppfinnelsen inneholde 1, 2, 3, 4 eller flere kopier av en aminosyresekvens i henhold til SEKV.ID. NR. 1, 2, 3 eller 4 eller en variant, fragment eller derivat derav. Hvis tilstede i mer enn én kopi, kan disse aminosyresekvensene ifølge oppfinnelsen i henhold til SEKV.ID. NR. 1, 2, 3 eller 4 eller varianter, fragmenter eller derivater derav, være direkte koblet med hverandre uten noen koblingssekvens eller via en koblingssekvens som omfatter 1 til 10, fortrinnsvis 1 til 5 aminosyrer. Aminosyrer som danner koblingssekvensen er fortrinnsvis valgt fra glysin eller prolin som aminosyrerester. Mer fortrinnsvis kan disse aminosyresekvensene ifølge oppfinnelsen i henhold til SEKV.ID. NR.1, 2, 3 eller 4 eller fragmenter, varianter eller derivater derav atskilles fra hverandre ved et hengselledd på to, tre eller flere prolinrester.

JNK-inhibitorsekvensene i henhold til oppfinnelsen som definert ovenfor kan være sammensatt av L-aminosyrer, D-aminosyrer eller en kombinasjon av begge.

Fortrinnsvis omfatter JNK-inhibitorsekvensen i henhold til oppfinnelsen minst 1, fortrinnsvis minst 3, mer fortrinnsvis minst 6 og enda mer fortrinnsvis minst 10 D-og/eller L-aminosyrer hvori D- og/eller L-aminosyrene kan anordnes i JNK-inhibitorsekvensene i henhold til oppfinnelsen på en blokkvis, en ikke-blokkvis eller en alternativ måte.

I henhold til en foretrukket utforming kan JNK-inhibitorsekvensene i henhold til oppfinnelsen være eksklusivt sammensatt av L-aminosyrer. JNK-inhibitorsekvensene i henhold til oppfinnelsen kan da omfatte eller bestå av mins t én "nativ JNK-inhibitorsekvens" i henhold til SEKV.ID. NR. 1 eller 3. I denne sammenhengen er "nativ" eller "nativ JNK-inhibitorsekvens" referert til som ikke forandrede JNK-inhibitorsekvenser i henhold til oppfinnelsen som angitt enhver av SEKV.ID. NR. 1 eller 3, i sin helhet sammensatt av L-aminosyrer.

JNK-inhibitorsekvensene i henhold til oppfinnelsen er sammensatt eksklusivt av D-aminosyrer. JNK-inhibitorsekvensen som er sammensatt av D-aminosyrer er en ikke-nativ D-retroinvers sekvens av en (nativ) JNK-inhibitorsekvens. Betegnelsen "retroinverse sekvenser" refererer seg til en isomer av en lineær peptidsekvens hvori retningen av sekvensen blir reversert og kiraliteten til hver aminosyrerest er invertert (se for eksempel Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994)). Fordelen med å kombinere D-enantiomerer og revers syntese er at posisjonene til karbonyl- og aminogruppene i hver amidbinding blir byttet, mens posisjonen til sidekjedegruppene på hvert alfakarbon blir preservert. Med mindre noe annet er spesifikt angitt, er det antatt at enhver gitt L-aminosyresekvens eller peptid i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan være konvertert til en D-retroinvers sekvens eller peptid ved syntetisering av en revers av sekvensen eller peptidet for den tilsvarende native L-aminosyresekvensen eller peptidet.

D-retroinverse sekvenser som definert ovenfor har et utvalg av nyttige egenskaper. For eksempel trenger D-retroinverse sekvenser i henhold til oppfinnelsen inn i celler like effektivt som L-aminosyresekvenser i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, mens D-retroinverse sekvenser i henhold til oppfinnelsen er mer stabile enn tilsvarende L-aminosyresekvenser.

JNK-inhibitorsekvensen i henhold til oppfinnelsen består av en D-retroinvers sekvens i henhold til aminosyresekvensen NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH [SEKV.ID. NR. 2].

JNK-inhibitorsekvensen i henhold til oppfinnelsen som beskrevet ovenfor, er presentert i tabell 1 (SEKV.ID. NR. 2). Tabellen presenterer navnet til JNK-inhibitorsekvensene i henhold til oppfinnelsen så vel som deres sekvensidentifiserende nummer, deres lengde og aminosyresekvens. I tillegg er sekvenser fra kjent teknikk i henhold til WO 01/27268 (SEKV.ID. NR. 17-26) også gitt for å kunne sammenligne. Disse sekvensene i kjent teknikk er ikke beskrevet heri som JNK-inhibitorsekvenser i henhold til oppfinnelsen eller som kimære peptider i henhold til oppfinnelsen og er derfor eksplisitt ekskludert fra området i den foreliggende oppfinnelsen ved hjelp av en disclaimer.

JNK-inhibitorsekvensene som består av SEKV.ID.NR. 1, 3 og 4 er ikke innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.

TABELL 1

(I tabell 1 er eksempelsekvenser så vel som deres generiske formler vist for henholdsvis SEKV.ID. NR. 1, 2, 5, 6, 9 og 11 og SEKV.ID. NR. 3, 4, 7, 8, 10 og 12).

Ethvert av peptidene beskrevet heri kan ha en modifikasjon på sine termini, enten C- eller N-terminus eller begge. C-terminus kan fortrinnsvis være modifisert av en amidmodifikasjon, mens N-terminus kan være modifisert av enhver egnet NH2-beskyttende gruppe så som for eksempel acylering.

"En modifisert aminosyre" i denne forbindelsen kan være enhver aminosyre som er forandret, for eksempel ved forskjellig glykosylering i forskjellige organismer, ved fosforylering eller ved merking av spesifikke aminosyrer. Et slikt merke blir derved typisk valgt fra gruppen av merker som omfatter:

(i) radioaktive merker, det vil si radioaktiv fosforylering eller et radioaktivt merke med svovel, hydrogen, karbon, nitrogen, osv.;

(ii) merkede fargestoffer (for eksempel digoksygenin, osv.);

(iii) fluorescerende grupper (for eksempel fluorescein, osv.);

(iv) kjemiluminescerende grupper;

(v) grupper for immobilisering på en vast fase (for eksempel His-merke, biotin, strep-merke, flag-merke, antistoffer, antigen, osv.); og

(vi) en kombinasjon av merker av to eller flere av merkene nevnt under (i) til (v).

JNK-inhibitorsekvenser i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan oppnås eller fremstilles ved fremgangsmåter som er velkjente på området, for eksempel ved kjemisk syntese eller ved genetiske konstruksjonsmetoder som diskutert nedenfor. For eksempel et peptid som tilsvarer en del av JNK-inhibitorsekvensen i henhold til oppfinnelsen som inkluderer en ønsket region av nevnte JNK-inhibitorsekvens eller som medierer den ønskede aktiviteten in vitro eller in vivo, syntetiseres ved anvendelse av en peptidsyntetiseringsanordning.

I henhold til et andre aspekt, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen et kimært peptid som består av et første domene og et andre domene, hvori det første domenet omfatter en transportsekvens, mens det andre domenet består av en JNK-inhibitorsekvens i henhold til oppfinnelsen som definert ovenfor, og hvori det første domenet er bundet til den C-terminale enden av det andre domenet.

Typisk har kimære peptider i henhold til den foreliggende oppfinnelsen en lengde på minst 25 aminosyrerester, for eksempel 25 til 250 aminosyrerester, mer fortrinnsvis 25 til 200 aminosyrerester, enda mer fortrinnsvis 25 til 150 aminosyrerester, 25 til 100 og mest fortrinnsvis 25 til 50 aminosyrerester.

Som et første domene, omfatter det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen fortrinnsvis en transportsekvens som typisk er valgt fra enhver sekvens av aminosyrer som styrer et peptid (i hvilket det er tilstede) til et ønsket cellulært bestemmelsessted. Således styrer transportsekvensen som brukt heri typisk peptidet over plasmamembranen, for eksempel fra yttersiden av cellen, gjennom plasmamembranen og inn i cytoplasmaet. Alternativt, eller i tillegg, kan transportsekvensen styre peptidet til en ønsket lokalisering i cellen, for eksempel nukleus, ribosom, endoplasmatisk retikulum (ER), et lysosom eller peroksisom, ved for eksempel å kombinere to komponenter (for eksempel en komponent for cellepermeabilitet og en komponent for nukleær lokalisering) eller ved en enkelt komponent som har for eksempel egenskapene til cellemembrantransport og målretting av for eksempel intranukleær transport. Transportsekvensen kan i tillegg omfatte en annen komponent som er i stand til å binde en cytoplasmatisk komponent eller enhver annen komponent eller del av cellen (for eksempel endoplasmatisk retikulum, mitokondria, "gloom"-apparat, lysosomale vesikler). Følgelig kan for eksempel transportsekvensen til det første domene og JNK-inhibitorsekvensen til det andre domenet være lokalisert i cytoplasmaet eller i enhver annen avdeling av cellen. Dette tillater at lokalisering av det kimære peptidet i cellen etter opptak kan bestemmes.

Fortrinnsvis har transportsekvensen (som er inkludert i det første domenet i det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen) en lengde på 5 til 150 aminosyresekvenser, mer fortrinnsvis en lengde på 5 til 100 og mest fortrinnsvis en lengde på 5 til 50, 5 til 30 eller til og med 5 til 15 aminosyrer.

Mer fortrinnsvis kan transportsekvensen (inneholdt i det første domenet i det første kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen) opptre som en kontinuerlig aminosyresekvensstrekning i det første domenet. Alternativt kan transportsekvensen i det første domenet være spaltet i to eller flere fragmenter hvori alle disse fragmentene ligner hele transportsekvensen og kan atskilles fra hverandre ved 1 til 10, fortrinnsvis 1 til 5 aminosyrer, forutsatt at transportsekvensen som sådan bibeholder sine bæreregenskaper som beskrevet ovenfor. Disse aminosyrene som separerer fragmentene i transportsekvensen kan for eksempel være valgt fra aminosyresekvenser som atskiller seg fra transportsekvensen. Alternativt kan det første domenet inneholde en transportsekvens sammensatt av mer enn en komponent hvor hver komponent med sin egen funksjon for transport av lasten JNK-inhibitorsekvens i det andre domenet til for eksempel en spesifikk celleavdeling.

Transportsekvensen som definert ovenfor kan være sammensatt av L-aminosyrer, D-aminosyrer eller en kombinasjon av begge. Fortrinnsvis omfatter transportsekvensen i henhold til oppfinnelsen minst 1, fortrinnsvis minst 3, mer fortrinnsvis minst 6 og enda mer fortrinnsvis minst 10 L-aminosyrer og/eller D-aminosyrer hvori D- og/eller L-aminosyrene kan være anordnet i JNK-transportsekvensene i henhold til oppfinnelsen på en blokkvis, ikke blokkvis eller på en alternativ måte.

I henhold til en alternativ utforming, kan transportsekvensen i det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen være eksklusivt sammensatt av L-aminosyrer. Mer fortrinnsvis omfatter transportsekvensen i det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen eller består av minst én "nativ" transportsekvens som definert ovenfor. I denne sammenhengen blir betegnelsen "nativ" referert til som ikke forandrede transportsekvenser, fullstendig sammensatt av L-aminosyrer.

I henhold til en annen alternativ utforming, kan transportsekvensen i det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen eksklusivt være sammensatt av D-aminosyrer. Mer fortrinnsvis kan transportsekvensen i det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen omfatte et D-retroinvers peptid av sekvensene presentert ovenfor.

Transportsekvensen i det første domenet i det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen kan oppnås fra naturlig forekommende kilder eller kan fremstilles ved å bruke genetiske konstruksjonsteknikker eller kjemisk syntese (se for eksempel Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Kilder for transportsekvensen i det første domenet kan anvendes inkludert for eksempel native proteiner så som for eksempel TAT-proteinet (for eksempel som beskrevet i U.S. patent nr.5,804,604 og 5,674,980, VP22 (beskrevet i for eksempel WO 97/05265; Elliott og O'Hare, Cell 88: 223-233 (1997)), ikke-virale proteiner (Jackson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10691-10695 (1992)), transportsekvenser avledet fra antennapedia (for eksempel antennapediabærersekvens) eller fra basale peptider, for eksempel peptider som har en lengde på 5 til 15 aminosyrer, fortrinnsvis 10 til 12 aminosyrer og som omfatter minst 80%, mer fortrinnsvis minst 80% og til og med 90% basale aminosyrer så som for eksempel arginin, lysin og/eller histidin. Videre er varianter, fragmenter og derivater av et av de native proteinene brukt som transportsekvenser beskrevet heri. Med hensyn på varianter, fragmenter og derivater, er det referert til definisjonen gitt ovenfor for JNK-inhibitorsekvenser. Varianter, fragmenter så vel som derivater er tilsvarende som fremsatt ovenfor for JNK-inhibitorsekvenser. Særlig i sammenheng med transportsekvensen, kan en variant, fragment eller derivat defineres som en sekvens som deler en sekvensidentitet med et av de native proteinene bruks om transportsekvenser som definert ovenfor på minst omtrent 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% eller til og med 99%.

I en foretrukket utforming av det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen, omfatter eller består transportsekvensen i det første domenet av en sekvens avledet fra humant immunsviktvirus (HIV)1 TAT-protein, særlig noen eller alle av de 86 aminosyrene som utgjør TAT-proteinet.

For en transportsekvens i henhold til oppfinnelsen, kan delsekvenser av det fullengde TAT-proteinet anvendes som danner et funksjonelt effektivt fragment av et TAT-protein, det vil si et TAT-peptid som inkluderer regionen som medierer inntrengning og opptak i celler. I hvilken grad en slik sekvens er et funksjonelt effektivt fragment av TAT-proteinet, kan bestemmes ved å bruke kjente teknikker (se for eksempel Franked et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86: 7397-7401 (1989)). Således kan transportsekvensen i det første domenet i det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen avledes fra et funksjonelt effektivt fragment el ler del av en TAT-proteinsekvens som omfatter mindre enn 86 aminosyrer og som utviser opptak i celler og eventuelt opptak i cellekjernen. Mer fortrinnsvis er delsekvenser (fragmenter) av TAT som skal anvendes som bærer for å mediere inntrengning av kimært peptid over cellemembranen ment å omfatte den basale regionen (aminosyrene 48 til 57 eller 49 til 57) i fullengde TAT.

I henhold til en mer foretrukket utforming, kan transportsekvensen i henhold til oppfinnelsen omfatte eller bestå av en aminosyresekvens som inneholder TAT-restene 48-57 eller 49-57 og mest fortrinnsvis en generisk TAT-sekvens NH2-Xn-RKKRRQRRR-Xn-COOH [SEKV.ID. NR. 7] hvori Xner som definert ovenfor. Alternativt kan transportsekvensen i henhold til oppfinnelsen omfatte eller bestå av et peptid som for eksempel inneholder aminosyresekvensen NH2-GRKKRRQRRR-COOH [SEKV.ID. NR. 5].

I henhold til en annen mer foretrukket utforming, kan transportsekvensen i henhold til oppfinnelsen omfatte et D-retroinvers peptid med sekvensen som presentert ovenfor, det vil si D-retroinverssekvensen til den generiske TAT-sekvensen som har sekvensen NH2-Xn-RRRQRRKKR-Xn-COOH [SEKV.ID. NR. 8]. Også her er Xnb definert ovenfor (representerer fortrinnsvis D aminosyrer). Videre er antallet "Xn"rester i enhver av SEKV.ID. NR. 7-8 ikke begrenset til det som er illustrert, men kan variere som beskrevet ovenfor. Mest fortrinnsvis kan transportsekvensen i henhold til oppfinnelsen omfatte D-retroinverssekvensen NH2-RRRQRRKKRG-COOH [SEKV.ID. NR. 6].

I henhold til en annen utforming, kan transportsekvensen i henhold til oppfinnelsen omfatte eller bestå av varianter av transportsekvenser definert ovenfor. En "variant av en transportsekvens" er fortrinnsvis en sekvens avledet fra en transportsekvens som definert ovenfor hvori varianten omfatter en modifikasjon, for eksempel tilføyelse (indre), delesjon (som fører til fragmenter) og/eller substitusjon av minst én aminosyre tilstede i transportsekvensen som definert ovenfor. Slike modifikasjoner omfatter typisk 1 til 20, fortrinnsvis 1 til 10 og mer fortrinnsvis 1 til 5 substitusjoner, tilføyelser og/eller delesjoner av aminosyrer. Videre utviser varianten fortrinnsvis en sekvensidentitet med transportsekvensen som definert ovenfor med fortrinnsvis enhver av SEKV.ID. NR. 5 til 8 på minst omtrent 30%, 50%, 70%, 80%,90%, 95%, 98% eller til og med 99%.

Fortrinnsvis fører en slik modifikasjon av transportsekvensen til en transportsekvens med økt eller redusert stabilitet. Alternativt kan varianter av transportsekvensen konstrueres slik at intracellulær lokalisering moduleres av det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen. Når de tilsettes eksogent, er slike varianter som definert ovenfor typisk konstruert slik at evnen til transportsekvensen til å trenge inn i cellen blir bibeholdt (det vil si opptak av varianten av transportsekvensen i cellen er hovedsakelig lik den til det native proteinet bruk som transportsekvens). For eksempel kan forandring av den basale regionen ment å være viktig for kjernelokalisering (se for eksempel Dang og Lee, J. Biol. Chem. 264: 18019-18023 (1989); Hauber et al., J. Virol. 63: 1181-1187 (1989); et al., J. Virol.

63: 1-8 (1989)) resultere i en cytoplasmatisk lokalisering eller delvis cytoplasmatisk lokalisering av transportsekvensen og derfor av JNK-inhibitorsekvensen som komponent av det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen. I tillegg til det ovennevnte, kan ytterligere modifikasjoner innføres i varianten, for eksempel ved å koble for eksempel kolesterol eller andre lipidrester til transportsekvensen for å fremstille en transportsekvens som har økt membranoppløselighet. Enhver av de ovenfor beskrevne varianter av transportsekvensene i henhold til oppfinnelsen kan fremstilles ved å bruke teknikker typisk kjent for en fagperson på området (se for eksempel Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. 2. utgave. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Som et andre domene omfatter det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen en JNK-inhibitorsekvens i henhold til oppfinnelsen som definert ovenfor.

Begge domener, det vil si det første og det andre domenet, av det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen kan kobles slik at det dannes en funksjonell enhet. Enhver fremgangsmåte for å koble første og andre domener som generelt er kjent på området kan anvendes.

I henhold til en utforming, er det første og andre domenet i det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen fortrinnsvis koblet med en kovalent binding. En kovalent binding som definert heri kan for eksempel være en peptidbinding som kan oppnås ved å uttrykke det kimære proteinet i henhold til oppfinnelsen som et fusjonsprotein. Fusjonsproteiner som beskrevet heri kan dannes og brukes på måter som er analoge til eller lett adapterbare fra standard rekombinante DNA-teknikker som beskrevet nedenfor. Begge domener kan imidlertid også kobles ved hjelp av en kjemisk koblingsrest.

Det første og/eller andre domenet i det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen kan opptre i en eller flere kopier i det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen. Hvis begge domener er tilstede i en enkelt kopi, er det første domenet koblet til den C-terminale enden av det andre domenet.

Fortrinnsvis kan de første og andre domener være direkte koblet med hverandre uten noe koblingselement. Alternativt kan de være koblet til hverandre via en koblingssekvens som omfatter 1 til 10, fortrinnsvis 1 til 5 aminosyrer. Aminosyrer som danner koblingssekvensen er fortrinnsvis valgt fra glysin eller prolin som aminosyrerester. Mer fortrinnsvis kan første og andre domener være atskilt fra hverandre med en hengsel på to, tre eller flere prolinrester mellom første og andre domener.

Det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen som definert ovenfor består av et første og et andre domene som kan være sammensatt av D-aminosyrer eller en kombinasjon av begge. Deri kan det første L- og D-aminosyre domenet (så vel som koblingselementene anvendt) være sammensatt av L-aminosyrer, D-aminosyrer eller en kombinasjon av begge (for eksempel D-TAT og L-IB1(s) eller L-TAT og D-IB1(s), osv.). Fortrinnsvis omfatter det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen minst 1, fortrinnsvis minst 3, mer fortrinnsvis minst 6 og enda mer fortrinnsvis minst 10 L-aminosyrer og/eller D-aminosyrer, hvori D- og/eller L-aminosyrene kan anordnes i det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen på en blokkvis, en ikke blokkvis eller en alternativ måte.

I henhold til en spesifikk utforming, omfatter eller består det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen av D-aminosyrekimære peptider i henhold til TAT-IB1-peptidet [NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH, SEKV.ID. NR. 11]. Koblingsdelen av det første og andre domenet (i stedet for PP) kan imidlertid være sammensatt av -Xn<a>-Xn-, som er definert ovenfor.

De første og andre domener i det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen som definert ovenfor kan kobles til hverandre ved kjemisk eller biokjemisk kobling utført på enhver egnet måte kjent på området, for eksempel ved å etablere en peptidbinding mellom første og andre domener, for eksempel ved å uttrykke første og andre domener som et fusjonsprotein eller for eksempel ved å tverrbinde første og andre domener i det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen.

Mange kjente kjemiske tverrbindingsmetoder er ikke-spesifikke, det vil si at de ikke styrer koblingspunktet til et spesielt sete på transportpolypeptidet eller lastemakromolekylet. Som et resultat kan anvendelse av ikke-spesifikke tverrbindingsmidler angripe funksjonelle seter eller steriske blokkaktive seter og gjør de konjugerte proteinene biologisk inaktive. Således er fortrinnsvis slike tverrbindingsmetoder anvendt som tillater en mer spesifikk kobling av første og andre domener.

En måte til å øke koblingsspesifisiteten er en direkte kjemisk kobling til en funksjonell gruppe som er tilstede bare en gang eller noen få ganger i en eller begge av det første og andre domene som skal tverrbindes. For eksempel opptrer cystein, som er den eneste proteinaminosyren som inneholder en tiolgruppe, i mange proteiner bare noen få ganger. I tillegg vil for eksempel hvis et polypeptid ikke inneholder lysinrester, en tverrbindingsreagens som er spesifikk for primære aminer være selektiv for aminoterminus til det polypeptidet. Vellykket utnyttelse av denne tilnærmingen for å øke koblingsspesifisiteten krever at polypeptidet har de egnede sjeldne og reaktive restene i områder på molekylet som kan forandres uten tap av molekylets biologiske aktivitet.

Cysteinrester kan erstattes når de opptrer i deler av en polypeptidsekvens hvor deres deltakelse i en tverrbindingsreaksjon ellers ville være sannsynlig å interferere med biologisk aktivitet. Når en cysteinrest er erstattet, er det typisk ønskelig å minimalisere de resulterende forandringene i polypeptidfolding. Forandringer i polypeptidfolding blir minimalisert når erstatningen er kjemisk og sterisk lik cysteinet. Av disse grunnene er serin foretrukket som en erstatning for cystein. Som vist i eksemplene nedenfor, kan en cysteinrest bli innført i aminosyresekvensen til et polypeptid for tverrbindingshensikter.

Når en cysteinrest blir innført, er innføring på eller nær amino- eller karboksyterminus foretrukket. Konvensjonelle metoder er tilgjengelige for slike aminosyresekvensmodifikasjoner, hvori polypeptidet av interesse blir fremsti lt ved kjemisk syntese eller via ekspresjon av rekombinant DNA.

Kobling av første og andre domener kan også utføres ved hjelp av et koblings- eller konjugerende middel. Det er flere intermolekylære tverrbindingsreagenser som kan benyttes (se for eksempel Means og Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, sidene 39-43). Blant disse reagenser er for eksempel N-succinimidyl 3-(2-pyridylditio)propionat (SPDP) eller N,N'-(1,3-fenylen)bismaleimid (hvorav begge er meget spesifikke for sulfhydrylgrupper og danner irreversible koblinger); N, N'-etylen-bis-(jodacetamid) eller andre slike reagenser som har 6 til 11 karbonmetylenbroer (relativt spesifikk for sulfhydrylgrupper); og 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen (som danner irreversible koblinger med amino- og tyrosingrupper). Andre tverrbindingsreagenser som er nyttige for denne hensikt inkluderer: p,p'-difluor-m,m'-dinitrodifenylsulfon (som danner irreversible tverrbindinger med amino- og fenolgrupper); dimetyladipimidat (som er spesifikk for aminogrupper); fenol-1,4 disulfonylklorid (som reagerer prinsipielt med aminogrupper); heksametylendiisocyanat eller diisotiocyanat eller azofenyl-p-diisocyanat (som reagerer prinsipielt med aminogrupper); glutaraldehyd (som reagerer med flere forskjellige sidekjeder); og disdiazobenzidin (som primært reagerer med tyrosin og histidin).

Tverrbindingsreagenser kan være homobifunksjonelle, det vil si at de har to funksjonelle grupper som gjennomgår samme reaksjon. Et foretrukket homobifunksjonelt tverrbindingsmiddel er bismaleimidoheksan ("BMH"). BMH inneholder to maleimidfunksjonelle grupper som reagerer spesifikt med sulfhydrylholdige forbindelser under milde betingelser (pH 6,5-7,7). De to maleimidgruppene er koblet ved en hydrokarbonkjede. Derfor er BMH nyttig for irreversibel tverrbinding av polypeptider som inneholder cysteinrester.

Tverrbindingsmidler kan også være heterobifunksjonelle. Heterobifunksjonelle tverrbindingsmidler har to forskjellige funksjonelle grupper, for eksempel en aminreaktiv gruppe og en tiolreaktiv gruppe som vil tverrbinde to proteiner som har henholdsvis frie aminer og tioler.

Eksempler på heterobifunksjonelle tverrbindingsmidler er succinimidyl 4-(N-maleimidometyl)sykloheksan-1-karboksylat ("SMCC"), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester ("MBS") og succinimid 4-(p-maleimidofenyl)butyrat ("SMPB"), en utstrakt kjedeanalog av MBS. Succinimidylgruppen til disse tverrbindingsmidlene reagerer med et primært amin og det tiolreaktive maleimidet danner en kovalent binding med tiolen i en cysteinrest.

Tverrbindingsreagenser har ofte lav oppløselighet i vann. En hydrofil rest så som en sulfonatgruppe kan tilsettes til tverrbindingsmiddelet for å forbedre dets vannløselighet. I denne forbindelsen er sulfo-MBS og sulfo-SMCC eksempler på tverrbindingsmidler som er modifisert for vannløselighet som kan anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelsen.

Mange tverrbindingsreagenser gir et konjugat som er i alt vesentlig ikke spaltbart under cellulære betingelser. Noen tverrbindingsreagenser inneholder imidlertid en kovalent binding så som et disulfid, som er spaltbar under cellulære betingelser. For eksemspell er Trauts reagens, ditiobis(succinimidylpropionat) ("DSP") og Nsuccinimidyl 3-(2-pyridylditio)propionat ("SPDP") velkjente spaltbare tverrbindere. Anvendelse av en spaltbar tverrbindingsreagens tillater at lasteresten blir separert fra transportpolypeptidet etter levering i målcellen. Direkte disulfidkobling kan også være nyttig.

Tallrike tverrbindingsreagenser inkludert de diskutert ovenfor, er kommersielt tilgjengelige. Detaljerte instruksjoner for deres anvendelse er lett tilgjengelige fra de kommersielle leverandørene. En generell referanse på proteintverrbinding og konjugatfremstilling er: Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press (1991).

Kjemisk tverrbinding kan inkludere anvendelse avstandsarmer. Avstandsarmer tilveiebringer intramolekylær fleksibilitet og justerer intramolekylære avstander mellom konjugerte rester og kan derved hjelpe til å preservere biologisk aktivitet. En avstandsarm kan være i form av en polypeptidrest som inkluderer avstandsaminosyrer, for eksempel prolin. Alternativt kan en avstandsarm være en del av tverrbindingsreagensen så som i "langkjedet SPDP" (Pierce Chem. Co., Rockford, IL., katalog nr. 21651 H).

JNK-inhibitorsekvenser og/eller kimære peptider i så vel som fragmenter, varianter eller derivater derav kan utnyttes som immunogener for å danne antistoffer som immunspesifikt binder disse peptidkomponentene. Slike antistoffer inkluderer for eksempel polyklonale, monoklonale, kimære, enkeltkjedede, Fab-fragmenter og et Fab-ekspresjonsbibliotek. Forskjellige fremgangsmåter kjent på området kan anvendes for fremstilling av disse antistoffene.

JNK-inhibitorsekvensen i henhold til oppfinnelsen og/eller kimære peptider i henhold til oppfinnelsen kan formuleres i farmasøytiske sammensetninger, også omfattet hermed. Disse sammensetningene kan omfatte, i tillegg til et av disse stoffene, en farmasøytisk akseptabel eksipient, bærer, buffer, stabilisator eller andre materialer velkjente for de med kunnskap på området. Slike materialer bør være ikke-toksiske og bør ikke interferere med effektiviteten til den aktive ingrediensen. Den presise naturen til bæreren eller andre materialer kan avhenge av administrasjonsruten, for eksempel oral, intravenøs, kutan eller subkutan, nasal, intramuskulær, intraperitoneal eller plasterruter.

Farmasøytiske sammensetninger for oral administrering kan være i form av tabletter, kapsler, pulvere eller væsker. En tablett kan inkludere en fast bærer så som gelatin eller en adjuvans. Flytende farmasøytiske sammensetninger inkluderer generelt en flytende bærer så som vann, petroleum, animalske eller vegetabilske oljer, mineralolje eller syntetisk olje. Fysiologisk saltløsning, dekstrose eller andre sakkaridløsninger eller glykoler så som etylenglykol, propylenglykol eller polyetylenglykol kan inkluderes.

For intravenøs, kutan eller subkutan injeksjon eller injeksjon på det påvirkede stedet, vil den aktive ingrediensen være i form av en parenteralt akseptabel vandig løsning som er pyrogenfri og har egnet pH, isotonisitet og stabilitet. De med relevant kunnskap på området er godt i stand til å fremstille egnede løsninger ved å bruke for eksempel isotone bærere så som natriumkloridinjeksjon, Ringers injeksjon, laktat Ringers injeksjon. Preserverende midler, stabiliserende midler, buffere, antioksidanter og/eller andre tilsetninger kan inkluderes hvis nødvendig. Uavhengig om det er et polypeptid, peptid eller nukleinsyremolekyl, annen farmasøytisk nyttig forbindelse i henhold til den foreliggende oppfinnelsen som skal gis et individ, er administrering fortrinnsvis i en "profylaktisk effektiv mengde" eller en "terapeutisk effektiv mengde" (som tilfellet må være), idet dette er tilstrekkelig til å gi en gunstig virkning for personen. Den virkelige mengden administrert og hastigheten og tidsforløpet for administreringen vil avhenge av typen og alvorligheten av de som blir behandlet.

Foreskriving av behandling, for eksempel beslutninger med hensyn på dosering, osv., er innenfor ansvarsområdet til allmennlegen og andre medisinske doktorer og er typisk avhengig av lidelsen som skal behandles, den individuelle pasients tilstand, leveringssted, administreringsmetode og andre faktorer kjent for den praktiserende legen. Eksempler på teknikker og protokoller nevnt ovenfor kan finnes i REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16. utgave, Osol, A. (red.), 1980.

Alternativt kan målrettede terapier anvendes for å levere JNK-inhibitorsekvensene i henhold til oppfinnelsen og kimære peptider i henhold til oppfinnelsen mer spesifikt til visse typer av celler ved å anvende målrettende systemer så som (et målrettende) antistoff eller cellespesifikke ligander. Antistoffer brukt for å målrette er typisk spesifikke for celleoverflateproteiner av celler assosiert med enhver av sykdommene definert nedenfor. Eksempelvis kan disse antistoffene rettes mot celleoverflateantistoffer så som for eksempel B-celleassosiert overflateprotein så som MHC klasse II-DR-protein, CD18 (LFA-1-betakjede), CD45RO, CD40 eller Bgp95 eller celleoverflateproteiner valgt fra for eksempel CD2, CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD13, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD39, CD4, CD43, CD45, CD52, CD56, CD68, CD71, CD138, osv. Målrettende konstrukter kan typisk fremstilles ved kovalent binding av JNK-inhibitorsekvensene i henhold til oppfinnelsen og kimære peptider i henhold til oppfinnelsen til et antistoff som er spesifikt for et celleoverflateprotein eller ved binding til en cellespesifikk ligand. Proteiner kan for eksempel bindes til et slikt antistoff eller kan festes dertil ved peptidbinding eller ved kjemisk kobling, tverrbinding, osv. Den målrettende terapien kan deretter utføres ved å administrere det målrettende konstruktet i en farmasøytisk effektiv mengde til en pasient ved enhver av administrasjonsrutene definert nedenfor, for eksempel intraperitoneal, nasal, intravenøs, oral eller plasterleveringsruter. Fortrinnsvis kan JNK-inhibitorsekvensene i henhold til oppfinnelsen eller kimære peptider i henhold til oppfinnelsen festet til de målrettende antistoffer eller cellespesifikke ligander som definert ovenfor, frigjøres in vitro eller in vivo, for eksempel ved hydrolyse av den kovalente bindingen, ved peptidaser eller ved enhver annen egnet metode.

Alternativ, hvis JNK-inhibitorsekvensene i henhold til oppfinnelsen eller kimære peptider i henhold til oppfinnelsen er festet til en liten cellespesifikk ligand, behøver ikke frigjøring av liganden utføres. Hvis tilstede på celleoverflaten, kan kimære peptider i henhold til oppfinnelsen trenge inn i cellen ved aktiviteten til dens transportsekvens. Målretting kan være ønsket for et utvalg av årsaker; for eksempel hvis JNK-inhibitorsekvensen i henhold til oppfinnelsen og kimære peptider i henhold til oppfinnelsen er uakseptabelt toksiske eller hvis de på annen måte vil kreve en alt for høy dosering.

JNK-inhibitorsekvensen i henhold til oppfinnelsen og/eller kimære peptider i henhold til oppfinnelsen kan administreres i en forløperform ved anvendelse av et antistoff eller et virus. JNK-inhibitorsekvensene i henhold til oppfinnelsen og/eller kimære peptider kan deretter konverteres til den aktive formen ved et aktiverende middel fremstilt i, eller målrettet på, cellene som skal behandles. Denne type tilnærming er noen ganger kjent som ADEPT (antistoffstyrt enzympromedikamentterapi) eller VDEPT (virusstyrt enzympromedikamentterapi); hvor den første involverer målretting av det aktiverende middelet til cellene ved konjugering til et cellespesifikt antistoff, mens det siste involverer produksjon av det aktiverende middelet, for eksempel en JNK-inhibitorsekvens eller kimært peptid, i en vektor ved ekspresjon fra kodende DNA i en viral vektor (se for eksempel EP-A-415731 og WO 90/07936).

Den foreliggende oppfinnelsen omfatter ytterligere anvendelse av JNK-inhibitorsekvenser i henhold til oppfinnelsen og/eller kimære peptider i henhold til oppfinnelsen til å fremstille en farmasøytisk sammensetning, for eksempel som definert ovenfor, til å forhindre og/eller behandle celleprolifererende lidelser assosiert med JNK-aktivering i et individ ("JNK-assosiert lidelse"). Typisk inkluderer en slik farmasøytisk sammensetning brukt i henhold til den foreliggende oppfinnelsen som en aktiv komponent for eksempel: (i) Enhver av en eller flere JNK-inhibitorsekvensene i henhold til oppfinnelsen og/eller kimære peptider i henhold til oppfinnelsen; og/eller (ii) celler som omfatter enhver av en eller flere av JNK-inhibitorsekvensene i henhold til oppfinnelsen og/eller kimære peptider i henhold til oppfinnelsen.

Forhindring og/eller behandling i henhold til den foreliggende oppfinnelsen inkluderer typisk administrering av en farmasøytisk sammensetning i henhold til oppfinnelsen som definert ovenfor. Betegnelsen "modulere" inkluderer undertrykkelse av ekspresjon av JNK når den er overuttrykt. Det inneholder også undertrykkelse av fosforylering av c-jun, ATF2 eller NFAT4, for eksempel ved å bruke et peptid av enhver eller flere av SEKV.ID. NR. 1-4 og/eller 9-12 som en konkurrerende inhibitor av det naturlige c-jun-, ATF2- og NFAT4-bindingssetet i en celle. Betegnelsen "modulere" inkluderer også undertrykkelse av hetero- og homomere komplekser av transkripsjonsfaktorer sammensatt av c-jun, ATF2 eller NFAT4 og deres beslektede partnere så som for eksempel AP-1-komplekset som er sammensatt av c-jun, AFT2 og c-fos. Når en celleprolifererende lidelse er assosiert med JNK-overekspresjon, kan slike undertrykkende JNK-inhibitorsekvenser innføres i en celle. I noen tilfeller kan "modulere" inkludere økning av JNK-ekspresjon, for eksempel ved anvendelse av et IB-peptidspesifikt antistoff som blokkerer bindingen av et IB-peptid til JNK for således å forhindre JNK-inhibisjon ved det IB-relaterte peptidet.

Forhindring og/eller behandling av et individ med den farmasøytiske sammensetningen i henhold til oppfinnelsen som beskrevet ovenfor, kan typisk utføres ved å administrere (in vivo) en ("terapeutisk effektiv") mengde av nevnte farmasøytiske sammensetning til et individ, hvori individet for eksempel kan være ethvert pattedyr, for eksempel et menneske, en primat, mus, rotte, hund, katt, ku, hest eller gris. Betegnelsen "terapeutisk effektiv" betyr at den aktive komponenten i den farmasøytiske sammensetningen har en tilstrekkelig mengde til å forbedre den JNK-assosierte lidelsen.

Betegnelsen "celleproliferende lidelse" eller "JNK-assosiert lidelse" som brukt ovenfor, angir typisk ondartede så vel som ikke ondartede cellepopulasjoner in vivo og in vitro som ofte synes å atskille seg morfologisk og funksjonelt fra det omgivende vev og som typisk er kjennetegnet av avvikende nivåer for JNK. Et "avvikende nivå for JNK" er ment å bety et økt eller redusert nivå av JNK i en del av individet som skal behandles relativt til det som er tilstede i en analog upåvirket del av individet som ikke har lidelsen.

For eksempel kan farmasøytiske sammensetninger i henhold til oppfinnelsen være nyttige til å forhindre og/eller behandle ondartetheter av forskjellige organsystemer, hvori aktivering av JNK ofte er blitt vist, for eksempel lunge, bryst, lymfoid, gastrointestinal og genito-urinær trakt så vel som adenokarsinomer som inkluderer ondartetheter så som de fleste kolonkreftformer, renalt cellekarsinom, prostatakreft, ikke småcellet karsinom i lungen, kreft i tynntarmen og kreft i øsofagus. Leukemi, lidelser eller patofysiologier assosiert med onkogen transformasjon så vel som kreftformer med Bcr-Abl-onkogene transformasjoner som klart krever aktivering av JNK er også inkludert.

Sammensetningene i henhold til oppfinnelsen er også anvendbare til å forhindre og/eller behandle ikke ondartede eller immunologisk relaterte celleproliferative sykdommer så som psoriasis, pemfigus vulgaris, Bechets syndrom, akutt lungesviktsyndrom (ARDS), iskemisk hjertesykdom, postdialysesyndrom, revmatoid artritt, ervervet immunsviktsyndrom, vaskulitt, septisk sjokk og andre typer akutt inflammasjon og lipidhistiocytose. Særlig foretrukket er immunpatologiske lidelser. Essensielt er enhver lidelse som er etiologisk koblet til JNK-kinaseaktivitet vurder til å være utsatt for forhindring eller behandling, for eksempel lidelser eller patofysiologier assosiert med aktivering av JNK i en celle eller celler som definert ovenfor, for eksempel restenose, hørselstap, øretraumer , iskemi, slag og/eller lidelser eller patofysiologier assosiert med modning og differensiering av immunceller, reperfusjonsskader, hypoksi, apoptoserelaterte sykdommer (som for eksempel forekommer ved virale infeksjoner (for eksempel AIDS), autoimmune sykdommer, nevrodegenerative sykdommer (for eksempel slag, hjernetraume, ryggmargsskade, amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Huntingtons sykdom, Alzheimers sykdom og Parkinsons sykdom), kardiovaskulær sykdom, osteoporose og aldring), reaksjon på stressende stimuli og med sekundære virkninger på grunn av behandling med for eksempel proinflammatoriske cytokiner. Den farmasøytiske sammensetningen i henhold til oppfinnelsen kan også anvendes til å behandle eller forhindre effekter assosiert med diabetes eller med cellulært skjærstress så som i patologiske tilstander indusert av arteriell hypertensjon inkludert hjerte og hjertehypertrofi og arteriosklerotiske lesjoner og ved forgreningen av blodkar og lignende, ved ioniserende stråling som brukt i radioterapi og ultrafiolett lys (UV-lys), av frie radikaler, DNA-ødeleggende midler inkludert kjemoterapeutiske medikamenter, ved iskemi/reperfusjonsskader, ved hypoksi; og/eller hypo- og hypertermi. Endelig, i sammenheng med ovennevnte sykdommer, lidelser eller patofysiologier, kan den farmasøytiske sammensetningen i henhold til oppfinnelsen anvendes for å inhibere ekspresjon av gener hvis ekspresjon øker i nærvær av et aktivt JNK-polypeptid. Disse gener og genprodukter inkluderer typisk for eksempel proinflammatoriske cytokiner. Slike cytokiner er funnet i alle former av inflammatoriske, autoinflammatoriske, immun- og autoimmunsykdommer, degenerative lidelser, myopatier, kardiomyopatier og graftavstøtning.

JNK-inhibitorsekvenser i henhold til oppfinnelsen eller kimære peptider i henhold til oppfinnelsen kan ytterligere anvendes i enhver situasjon hvori inhibering av JNK-aktivitet er ønsket, siden JNKer og alle dets isoformer deltar i utvikling og etablering av patologiske tilstander eller i ruter derav. Slik anvendelse kan inkludere in vitro applikasjoner, ex vivo og in vivo applikasjoner.

I henhold til en ytterligere utforming, kan JNK-inhibitorsekvensene i henhold til oppfinnelsen eller kimære peptider i henhold til oppfinnelsen utnyttes i ( in vitro) assayer (for eksempel immunassayer) for å detektere, forutsi, diagnostisere eller overvåke forskjellige tilstander, sykdommer og/eller lidelser som definert ovenfor, eller overvåke behandlingen derav. Immunassayet kan utføres ved en metode som omfatter å bringe prøven avledet fra en pasient i kontakt med et antistoff til en JNK-inhibitorsekvens i henhold til oppfinnelsen eller et kimært peptid i henhold til oppfinnelsen under betingelser slik at immunspesifikk binding kan skje og deretter detektere eller måle mengden av enhver immunspesifikk binding av antistoffet. I en spesifikk utforming kan antistoffet som er spesifikt for JNK-inhibitorsekvens i henhold til oppfinnelsen eller et kimært peptid i henhold til oppfinnelsen anvendes til å analysere et vev eller serumprøve fra en pasient for nærvær av en JNK eller JNK-inhibitorsekvens; hvori et avvikende nivå av JNK er indikerende for en sykdomstilstand. Immunassayene som kan benyttes inkluderer, men er ikke begrenset til, konkurrerende og ikke-konkurrerende assaysystemer ved å bruke teknikker så som Western Blot, radioimmunoassayer (RIA), enzymkoblede immusorbentassayer (ELISA), "sandwich" immunassayer, immunutfellingsassayer, presipitinreaksjoner, geldiffusjonspresipitinreaksjoner, immundiffusjonsassayer, agglutineringsassayer, fluorescensimmunassayer, komplementfikseringsassayer, immunradiometriske assayer og protein-A-immunassayer, osv. Alternativt kan (in vitro) assayer utføres ved å levere JNK-inhibitorsekvensene i henhold til oppfinnelsen, kimære peptider i henhold til oppfinnelsen, eller antistoffer til JNK-inhibitorsekvensene i henhold til oppfinnelsen eller til kimære peptider i henhold til oppfinnelsen for å målrette celler som typisk er valgt fra for eksempel dyrkede dyreceller, humane celler eller mikroorganismer og å overvåke cellereaksjonen ved biofysiske metoder typisk kjent for en med kunnskap på området. Målcellene typisk brukt heri kan være dyrkede celler (in vitro) eller in vivo celler, det vil si celler som utgjør organer eller vev hos levende dyr eller mennesker eller mikroorganismer funnet i levende dyr eller mennesker.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer i tillegg sett for diagnostisk eller terapeutisk anvendelse som inkluderer en eller flere beholdere som inneholder JNK-inhibitorsekvenser i henhold til oppfinnelsen eller kimære peptider i henhold til oppfinnelsen og eventuelt antistoffer til JNK-inhibitorsekvenser i henhold til oppfinnelsen eller til kimære peptider i henhold til oppfinnelsen, for eksempel et anti-JNK-inhibitorsekvensantistoff og eventuelt en merket bindingspartner til antistoffet. Merket inkorporert derved i antistoffet kan inkludere, men er ikke begrenset til, en kjemiluminescens, enzymatisk, fluorescerende, kolorimetrisk eller radioaktiv rest. I en annen spesifikk utforming er sett for diagnostisk anvendelse tilveiebrakt som omfatter en eller flere beholders om inneholder nukleinsyrer som koder, eller alternativt, som er komplementære til en JNK-inhibitorsekvens i henhold til oppfinnelsen og/eller et kimært peptid i henhold til oppfinnelsen, eventuelt en merket bindingspartner til disse nukleinsyrene, er også tilveiebrakt. I en alternativ spesifikk utforming kan settet omfatte, i en eller flere beholdere, et par av oligonukleotidprimere (for eksempel hver 6-30 nukleotider i lengde) som er i stand til å virke som amplifiseringsprimere for polymerasekjedereaksjon (PCR; se for eksempel Innis, et al., 1990. PCR PROTOCOLS, Academic Press, Inc., San Diego, CA), ligasekjedereaksjon, syklisk probereaksjon og lignende, eller andre metoder kjent på området brukt i sammenheng med nukleinsyrene i henhold til oppfinnelsen. Settet kan eventuelt ytterligere omfatte en forutbestemt mengde av renset JNK-inhibitorsekvens i henhold til oppfinnelsen, et kimært peptid i henhold til oppfinnelsen for anvendelse som et diagnostisk middel, standard eller kontroll i assayene.

Den foreliggende oppfinnelsen skal ikke begrenses i omfang av de spesifikke utforminger beskrevet heri. Forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til dem beskrevet heri, vil virkelig bli klart for dem med kunnskap på området ut fra ovenstående beskrivelse og påfølgende figurer. Med mindre noe annet er angitt, har alle tekniske og vitenskapelige betegnelser brukt heri den samme betydning som den som vanligvis forstås av en med vanlig kunnskap på området som denne oppfinnelsen tilhører. Skjønt fremgangsmåter og materialer lik eller tilsvarende de beskrevet heri kan anvendes ved praktisering eller testing av den foreliggende oppfinnelsen, er egnede metoder og materialer beskrevet nedenfor. I tilfelle av konflikt vil den foreliggende beskrivelsen inkludert definisjoner, kontrollere. I tillegg er materialer, fremgangsmåter og eksempler bare illustrerende. Andre trekk og fordeler ved oppfinnelsen vil nå være klart fra den følgende detaljerte beskrivelse og kravene.

BESKRIVELSE AV FIGURER

FIG. 1A-C er diagrammer som viser sammenstillinger av konserverte JBD-domeneregioner i de angitte transkripsjonsfaktorer. JNK-inhibitorsekvenser ble identifisert ved å inspisere disse sekvenssammenstillingene. Resultatene til denne sammenstillingen er vist som eksempler i FIG. 1A-1C. FIG. 1A viser regionen med høyest homologi mellom JBDer i IB1, IB2, c-Jun og ATF2. Panel B viser aminosyresekvensen til JBDer i L-IB1(s) og L-IB1 for sammenligning. Fullt konserverte rester er angitt ved stjerner, mens rester forandret til Ala i GFP-JBD23Mut-vektoren er angitt med åpne sirkler FIG. 1C viser aminosyresekvensene til kimære proteiner som inkluderer en JNK-inhibitorsekvens og en transportsekvens. I det viste eksempelet er transportsekvensen avledet fra humant immusviktvirus (HIV) TAT-polypeptid og JNK-inhibitorsekvenser er avledet fra et IB1(s)-polypeptid. Humane, muse og rottesekvenser er identiske i panelene B og C.

FIG. 2 er et diagram som viser sekvensene til generiske TAT-IB-fusjonspeptider fra menneske, mus og rotte.

FIG. 3 viser resultatene fra evaluering av nevrobeskyttelse mot fokal cerebral iskemi i en permanent MCAO-modell. Bestemmelse av effektiviteten til beskyttelsen ble utført ved forskjellige doser (se FIG. 3). Som det kan ses fra figur 3, bidrar minst dosene på 11 mg/kg, 3 mg/kg, 0,3 mg/kg og 0,03 mg/kg til en cerebral beskyttelse. Den beste beskyttelsen er observert ved dosen på 0,03 mg/kg.

FIG. 4 illustrerer evaluering av nevrobeskyttelse ved et kimært peptid i henhold til oppfinnelsen som angitt i SEKV.ID. NR.11 etter i.v. -administrering mot fokal cerebral iskemi, i en transient MCAO-modell. Etter å ha provosert iskemi i voksne mus, ble musene drept 48 timer etter reperfusjon. Seriekrystatsnitt ble fremstilt og infarktvolumer ble beregnet. Som det kan ses fra figur 4, gir det kimære peptidet i henhold til oppfinnelsen effektiv nevrobeskyttelse.

FIG. 5 viser resultatene av et assay på nevronale kulturer utført ved å måle LDH-frigjøring etter NMDA-stimulering. Resultatene angir klart en nevrobeskyttende virkning av det kimære D-JNKI1-peptidet i henhold til oppfinnelsen (SEKV.ID. NR. 11) siden degenerative forandringer på grunn av NMDA-eksponering ble fullstendig inhibert som angitt av fraværet av signifikant LDH-frigjøring over kontroller.

FIG. 6 viser resultatene av inhibering av endogen JNK-aktivitet i HepG2-celler ved å bruke fusjonspeptider i henhold til oppfinnelsen som angitt i SEKV.ID. NR. 9 og 11 i en enbrønns tilnærming. Som det kan ses fra figur 6, særlig i panel d i figur 6, inhiberer D-TAT-IB1(s) i henhold til SEKV.ID. NR. 11 (her forkortet som D-JNKI) effektivt JNK-aktivitet, til og med bedre enn L-TAT-IB1(s) i henhold til SEKV.ID. NR.9 (her forkortet som L-JNKI).

FIG. 7 viser den beskyttende virkningen av D-TAT-IB1(s)-beskyttelse mot permanent hørselstap. Forandring av hørselsterskelverdi (dB lydtrykknivå) i marsvin etter støytraume (120 dB ved 6 kHz i 30 minutter) ved 8 kHz, den maksimalt berørte frekvensen, ble målt 20 minutter (temporær terskelforskyvning, TTS, grå) og 15 dager etter støyeksponering (permanent terskelforskyvning). Marsvin som mottok D-TAT-IB1(s) i en hyaluronsyregel plassert på membranen til de runde vinduet i sneglehuset enten 30 minutter før, 30 minutter etter eller 4 timer etter støytraume; hvor ubehandlede ører tjente som kontroller. TTS ble målt 20 minutter støytraume, mens PTS (svart) som tilsvarer permanent hørselstap ble bestemt etter 15 dager. Som vist, ikke bare beskytter D-TAT-IB1(s) hovedsakelig mot permanent hørselstap fra støytraume hvis applisert preventivt før støyeksponeringen, men også på en tidsavhengig måte hvis det administreres etter traumet. PTS i behandlede ører var signifikant lavere for administrering av D-TATIB1(s) 30 minutter og 4 timer etter traume enn i ubehandlede kontrollører.

EKSEMPLER

Eksempel 1: Identifisering av JNK-inhibitorsekvenser

Aminosyresekvenser som er viktige for effektiv interaksjon med JNK ble identifisert ved sekvenssammenstilling mellom kjente JBDer. En sekvenssammenligning mellom JBDer til IB1 [SEKV.ID. NR. 13], IB2 [SEKV.ID. NR. 14], c-Jun [SEKV.ID. NR. 15] og ATF2 [SEKV.ID. NR. 16] definert en svakt konservert 8 aminosyrer lang sekvens (FIG. 1A). Siden JBDer til IB1 og IB2 er tilnærmet 100 ganger så effektiv som c-Jun eller ATF2 i binding av JNK (Dickens et al. Science 277: 693 (1997)), ble det vurdert slik at de konserverte restene mellom IB1 og IB2 må være viktige for å gi maksimal binding. Sammenligningen mellom JBDer til IB1 og IB2 definerte to blokker på syv og tre aminosyrer som er meget konserverte mellom de to sekvensene.

Disse to blokkene er inneholdt i en peptidsekvens på 19 aminosyrer i L-IB1(s) [SEKV.ID. NR. 1] og er også vist for sammenligning i en 23 aminosyrer lang peptidsekvens avledet fra IB1 [SEKV.ID. NR.17]. Disse sekvensene er vist i FIG.

1B, strekene i L-IB1-sekvensen angir et gap i sekvensen for å sammenstille de konservative restene med L-IB1(s).

Eksempel 2: Fremstilling av JNK-inhibitorfusjonsproteiner

JNK-inhibitorfusjonsproteiner i henhold til oppfinnelsen som angitt i SEKV.ID. NR. 9 ble syntetisert ved kovalent kobling av den C-terminale enden av SEKV.ID. NR. 1 til et N-terminalt 10 aminosyrer langt bærerpeptid avledet fra HIV-TAT4g 57 (Vives et al., J Biol. Chem. 272: 16010 (1997)) i henhold til SEKV.ID. NR. 5 via en linker som besto av to prolinrester. Denne linkeren ble brukt for å tillate maksimal fleksibilitet og forhindre uønskede sekundære strukturelle forandringer. Det basale konstruktet ble også fremstilt og designert henholdsvis L-IB1(s) (SEKV.ID. NR. 1) og L-TAT [SEKV.ID. NR. 5].

Alle D-retroinverspeptidene ifølge SEKV.ID. NR. 11 ble syntetisert i henhold til det foregående. Det basale konstruktet ble også fremstilt og desginert henholdsvis D-IB1(s) [SEKV.ID. NR. 2] og D-TAT [SEKV.ID. NR. 6].

Alle D- og L-fusjonspeptidene i henhold til oppfinnelsen som angitt i SEKV.ID. NR. 9, 10, 11 og 12 ble fremstilt ved klassisk Fmock-syntese og ytterligere analysert ved massespektrometri. De ble avslutningsvis renset med HPLC. For å bestemme virkningen av prolinlinkeren, ble to typer av TAT-peptid produsert, ett med og ett uten to proliner. Tilsetning av de to prolinene syntes ikke å modifisere inntrengning eller lokalisering av TAT-peptid i cellene. Generiske peptider som viser de konserverte aminosyrerestene er gitt i FIG. 2.

Eksempel 3: Inhibering av celledød ved JBD19

Effekter av den 19 aminosyrer lange JBD-sekvensen i IB1(s) på JNK-biologiske aktiviteter ble undersøkt. Den 19 aminosyrer lange sekvensen ble koblet N-terminalt til det grønne fluorescerende proteinet (GFP JBD19-konstrukt) og virkningen av dette konstruktet på pankreatisk β-celleapoptose indusert av IL1 ble evaluert. Denne apoptose modusen ble tidligere vist å bli blokkert ved transfeksjon med JBD1-280, mens spesifikke inhibitorer av ERK1/2 eller p38 beskyttet ikke (se Ammendrup et al., supra).

Oligonukleotider som tilsvarer JBD19 og som omfatter en konservert sekvens på 19 aminosyrer så vel som en sekvens mutert på de totalt konserverte regionene ble syntetisert og styrt innsatt i EcoRI- og SalI-setene til pEGFP-N1-vektoren som koder det grønne fluorescerende proteinet (GFP) (fra Clontech).

Insulinproduserende βTC-3-celler ble dyrket i RPMI 1640-medium supplert med 10% kalvefosterserum, 100 µg/ml streptomycin, 100 enheter/ml penicillin og 2 mM glutamin. Insulinproduserende βTC-3-celler ble transfektert med de angitte vektorer og IL-1 β (10 ng/ml) ble tilsatt cellekulturmediet. Antall apoptotiske celler ble telt ved 48 timer etter tilsetning av IL-1 β ved å bruke invertert fluorescensmikroskop. Apoptotiske celler ble diskriminert fra normale celler ved den karakteriserte "utbobling" av cytoplasmaet og ble telt etter to dager.

GFP er grønn fluorescensproteinekspresjonsvektor brukt som en kontroll ; JBD19 er vektoren som uttrykker et kimært GFP koblet til den 19 aminosyrer lange sekvensen avledet fra JBD i IB1; JBD19Mut er den samme vektoren som GFP-JBD19, men med en JBD mutert på fire konserverte rester vist som FIG. 1B; og JBD1-280er GFP-vektoren koblet til hele JBD (aminosyrene 1-280). Det GFP-JBD19-uttrykkende konstruktet forhindret IL-1 β-indusert pankreatisk β-celleapoptose like effektivt som hele JBD1-280.

Som ytterligere kontroller, hadde sekvenser mutert på fullt konserverte IB1(s) -rester meget redusert evne til å forhindre apoptose.

Eksempel 4: Cellulær import av TAT-IB1(s)-peptider

Evnen til L- og D-enantiomere former av TAT og TAT-IB1(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen ("TAT-IB-peptider") til å trenge inn i cellene ble evaluert. L-TAT, D-TAT, L-TAT-IB1(s) i henhold til oppfinnelsen, D-TAT-IB1(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen [henholdsvis SEKV.ID. NR. 5, 6, 9 og 12] ble merket med N-terminal tilsetning av en glysinrest konjugert til fluroescein. Merkede peptider (1 µM) ble tilsatt βTC-3-cellekulturer som ble opprettholdt som beskrevet i eksempel 3. På forutbestemte tidspunkter ble cellene vasket med PBS og fiksert i fem minutter i iskald metanol-aceton (1:1) før de ble undersøkt under et fluorescensmikroskop. Fluoresceinmerket BSA (1 µM, 12 mol/mol BSA) ble brukt som kontroll.

Resultatene viste at alle de ovennevnte fluoresceinmerkede peptidene hadde effektivt og hurtig (mindre enn fem minutter) trengt inn i cellene når de ble tilsatt kulturmediet. I motsatt fall trengte ikke fluoresceinmerket storfeserumalbumin (1 µM BSA, 12 mol fluorescein/mol BSA) inn i cellene.

En tidsforløpundersøkelse anga at intensiteten av fluorescenssignalet for L-enantiomere peptider økte med 70% etter en 24 timers periode. Lite til ingen signaler var tilstede etter 48 timer. I motsetning var D-TAT og D-TAT-IB1(s) i henhold til oppfinnelsen ekstremt stabile i cellene.

Fluorescerende signaler fra disse alle D-retroinverspeptider var fremdeles meget sterke 1 uke senere og signalet var bare lett redusert ved 2 uker etter behandling.

Eksempel 5: In vitro inhibering av c-JUN, ATF2 og Elk1-fosforylering

Virkningen av peptidene på JNK-mediert fosforylering av deres måltranskripsjonsfaktorer ble undersøkt in vitro. Rekombinante og ikke aktiverte JNK1, JNK2 og JNK3 ble fremstilt ved å bruke et TRANSCRIPTION AND TRANSLATION kanin retikulocyttlysatsett (Promega) og brukt i fastfase kinaseassayer med c-Jun, ATF2 og Elk1, enten alene eller fusjonert til glutation-S-transferase (GST) som substrater. Doseresponsundersøkelser ble utført hvori L-TAT- eller L-TAT-IB1(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen (0-25 µM) ble blandet med rekombinante JNK1-, JNK2- eller JNK3-kinaser i reaksjonsbuffer (20 mM Tris-acetat, 1 mM EGTA, 10 mM p-nitrofenylfosfat (pNPP), 5 mM natriumpyrofosfat, 10 mM p-glyserofosfat, 1 mM ditiotreitol) i 20 minutter.

Kinasereaksjonene ble deretter initiert ved tilsetning av 10 mM MgCl2og 5 pCi<33>P-γ-dATP og 1 µg av enten GST-Jun (aminosyrene 1-89), GST-AFT2 (aminosyrene 1-96) eller GST-ELK1 (aminosyrene 307-428). GST-fusjonsproteiner ble kjølt fra Stratagene (La Jolla, CA).

10 μl glutationagarosekuler ble også tilsatt blandingen. Reaksjonsproduktene ble deretter separert ved SDS-PAGE på en denaturerende 10% polyakrylamidgel.

Gelene ble tørket og deretter eksponert på røntgenfilmer (Kodak). Nesten fullstendig inhibering av c-Jun-, ATF2- og Elk1-fosforylering ved JNKer ble observert ved doser av TAT-IB(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen så lave som 2,5 µM. Et markert unntak var imidlertid fravær av TAT-IB(s)-inhibering av JNK3-fosforylering av Elk1. Totalt viste TAT-IB1(s)-peptidet i henhold til oppfinnelsen overlegne virkninger til å inhibere JNK-familiefosforylering av deres måltranskripsjonsfaktorer. Evnen til D-TAT, D-TAT-IB1(s) i henhold til oppfinnelsen og L-TAT-IB1(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen (0-250 µM doseringsundersøkelse) til å inhibere GST-Jun (aminosyrene 1-73) -fosforylering ved rekombinant JNK1, JNK2 og JNK3 ble analysert som beskrevet ovenfor. Totalt reduserte D-TAT-IB1(s)-peptidet JNK-mediert fosforylering av c-Jun, men på nivåer som var tilnærmet 10-20 ganger mindre effektive enn L-TAT-IB1(s).

Eksempel 6: Inhibering av c-JUN-fosforylering ved aktiverte JNKer

Virkningene av L-TAT eller L-TAT-IB1(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen på JNKer aktivert ved stressende stimuli ble evaluert ved å bruke GST-Jun for å trekke ned JNKer fra UV-lysbestrålte HeLa-celler eller IL-1 β-behandlede PTC-celler. PTC-cellene ble dyrket som beskrevet ovenfor. HeLa-cellene ble dyrket i DMEM-medium supplert med 10% kalvefosterserum, 100 μg/ml streptomycin, 100 enheter/ml penicillin og 2 mM glutamin. En time før de skal brukes til celleekstraktfremstilling, ble PTC-cellene aktivert med IL-1 β som beskrevet ovenfor, mens HeLa-cellene ble aktivert med UV-lys (20 J/m<2>). Celleekstrakter ble fremstilt fra kontroll, UV-lysbestrålte HeLa-celler og IL-1 β-behandlede βTC-3-celler ved å skrape cellekulturen i lysebuffer (20 mM Tris-acetat, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 10 mM p-nitrofenylfosfat, 5 mM natriumpyrofosfat, 10 mM P-glyserofosfat, 1 mM ditiotreitol). Nedbrutt materiale ble fjernet ved sentrifugering i fem minutter ved 15000 rpm i en SS-34 Beckman-rotor. 100 µg ekstrakter ble inkubert i en time ved romtemperatur med 1 µg GST-jun (aminosyrene 1-89) og 10 µl av glutationagarosekuler (Sigma). Etter fire vaskinger med skrapebuffer, ble kulene resuspendert i den samme bufferen supplert med L-TAT eller L-TAT-IB1(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen (25 µM) i 20 minutter. Kinasereaksjoner ble deretter initiert ved tilsetning av 10 mM MgCl2og 5 pCi<33>P- γ-dATP og inkubert i 30 minutter ved 30 ºC.

Reaksjonsproduktene ble deretter separert ved SDS-PAGE på en denaturerende 10% polyakrylamidgel. Gelene ble tørket og deretter eksponert for røntgenfilmer (Kodak). TAT-IB(s)-peptidene i henhold til oppfinnelsen forhindret effektivt fosforylering av c-Jun ved aktiverte JNKer i disse eksperimentene.

Eksempel 7: In vivo inhibering av c-JUN-fosforylering ved TAT-IB(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen

For å bestemme om de cellepermeable peptidene i henhold til oppfinnelsen kunne blokkere JNK-signalisering in vivo, brukte vi et heterologt GAL4-system. HeLaceller, dyrket som beskrevet ovenfor, ble samtransfektert med 5 x GAL-LUC-rapportørvektor sammen med GAL-Jun-ekspresjonskonstrukt (Stratagene) som omfatter aktiveringsdomenet til c-Jun (aminosyrene 1-89) koblet til GAL4 DNA-bindende domene. Aktivering av JNK ble utført ved samtransfeksjon av vektorer som uttrykker de direkte oppstrømskinasene MKK4 og MKK7 (se Whitmarsh et al., Science 285: 1573 (1999)). Kort fortalt ble 3 x 10<5>celler transfektert med plasmidene i 3,5 cm skåler ved å bruke DOTAP (Boehringer Mannheim) ved å følge instruksjonene fra produsenten. For eksperimenter som involverte GAL-Jun, ble 20 ng av plasmidet transfektert med 1 µg av rapportørplasmid pFR-Luc (Stratagene) og 0,5 µg av enten MKK4- eller MKK7-uttrykkende plasmider. Tre timer etter transfeksjon ble cellemedia forandret og TAT og TAT-IB1(s)-peptider (1 µM) ble tilsatt. Luciferaseaktiviteten ble målt 16 timer senere ved å bruke "Dual Reporter System" fra Promega etter normalisering til proteininnhold. Tilsetning av TAT-IB1(s)-peptid blokkerte aktivering av c-Jun etter MKK4- og MKK7-mediert aktivering av JNK. Fordi HeLa-celler uttrykker JNK1- og JNK2-isoformer men ikke JNK3, transfekterte vi cellene med JNK3. Igjen inhiberte TAT-IB(s)-peptidet JNK2-mediert aktivering av c-Jun.

Eksempel 8: Inhibering av IL-1 β-indusert pankreatisk β-celledød ved TAT-IB-peptider

Vi undersøkte virkningene av L-TAT-IB(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen på fremmingen av β-celleapoptose utløst av IL-1. βTC-3-cellekulturer ble inkubert i 30 minutter med 1 µM av L-TAT-IB1(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen etterfulgt av 10 ng/ml IL-1. En andre tilsetning av peptid (1 µM) ble utført 24 timer senere. Apoptotiske celler ble telt etter to dagers inkubering med IL-1 β ved å bruke propidiumjodid (rødfargede celler er døde celler) og Hoechst 33342 (blåfargede celler er celler med intakt plasmamembran) nukleær farging. Tilsetning av TAT-IB(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen inhiberte IL-1-indusert apoptose av βTC-3-celler dyrket i nærvær av IL1 β i to dager.

Langtids inhibisjon av IL-1-indusert celledød ble undersøkt ved å behandle βTC-3-celler som beskrevet ovenfor, med unntak av at inkubasjon av cellene med peptidene og IL-1 β ble opprettholdt i 12 dager. Ytterligere peptider (1 μM) ble tilsatt hver dag og ytterligere IL-1 β (10 ng/ml) ble tilsatt hver 2. dag. TAT-IB1(s)-peptid i henhold til oppfinnelsen gir sterk beskyttelse mot apoptose under disse betingelsene. Tatt sammen, tilveiebringer disse eksperimentene bevismateriale på at TAT-IB(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen er biologisk aktive molekyler som er i stand til å forhindre virkningene av JNK-signalisering på celleutfallet.

Eksempel 9: Syntese av totalt D-retroinverse IB(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen

Peptider i henhold til oppfinnelsen kan være totalt D-aminosyrepeptider syntetisert i revers for å forhindre naturlig proteolyse (det vil si totalt D-retroinverse peptider). Et totalt D-retroinvers peptid i henhold til oppfinnelsen ville tilveiebringe et peptid med funksjonelle egenskaper lik dem til det native peptidet, hvori sidegruppene av komponentaminosyrer ville tilsvare den native peptidsammenstillingen, men ville bibeholde en proteaseresistent ryggrad.

Retroinverse peptider i henhold til oppfinnelsen er analoger syntetisert ved å bruke D-aminosyrer ved å teste aminosyrene til en peptidkjede slik at sekvensen til aminosyrene i den retroinverse peptidanalogen er nøyaktig motsatt av den i det valgte peptidet som tjener som en modell. For å illustrere hvis det naturlig forekommende TAT-protein (dannet av L-aminosyrer) har sekvensen GRKKRRQRRR [SEKV.ID. NR. 5], ville den retroinverse peptidanalogen til dette peptidet (dannet av D-aminosyrer) ha sekvensen RRRQRRKKRG [SEKV.ID. NR.

6]. Fremgangsmåtene for å syntetisere en kjede av D-aminosyrer for å danne de retroinverse peptidene er kjent på området (se for eksempel Jameson et al., Nature, 368, 744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994); Guichard et al., J. Med. Chem. 39, 2030-2039 (1996)). Spesifikt ble retropeptidene fremstilt ved klassisk F-mock-syntese og ytterligere analysert ved massespektrometri. De ble avslutningsvis renset ved HPLC.

Siden et innebygget problem med native peptider er degradering ved naturlige proteaser og innebygget immunogenisitet, vil de heterobivalente eller heteromultivalente forbindelsene i henhold til oppfinnelsen fremstilles for å inkludere "retroinvers isomer" av det ønskede peptidet. Beskyttelse av peptidet fra naturlig proteolyse bør derfor øke effektiviteten til den spesifikke heterobivalente eller heteromultivalente forbindelsen, begge ved å forlenge halveringstiden og redusere utstrekningen av immunrespons rettet mot aktivt å ødelegge peptidene.

Eksempel 10: Langtids biologisk aktivitet til totalt D-retroinvers IB(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen

Langtids biologisk aktivitet er forutsagt for det D-TAT-IB(s) retroinversholdige peptidheterokonjugatet når det sammenlignes med native L-aminosyreanalogen på grunn av beskyttelse av D-TAT-IB(s)-peptid i henhold til oppfinnelsen fra degradering ved native proteaser, som vist i eksempel 5.

Inhibering av IL-1 β-indusert pankreatisk β-celledød ved D-TAT-IB1(s)-peptid i henhold til oppfinnelsen ble analysert. βTC3-celler ble inkubert som beskrevet ovenfor i 30 minutter med en enkelt tilsetning av de angitte peptidene (1 μM), deretter ble IL-1 (10 ng/ml) tilsatt.

Apoptotiske celler ble deretter telt etter to dagers inkubasjon med IL-1 β ved anvendelse av propidiumjodid og Hoechst 33342 kjernefarging. Minimum 1000 celler ble telt i hvert eksperiment. Standardfeil av middelverdien (SEM) er angitt, n = 5. D-TAT-IB1-peptidet reduserte IL-1-indusert apoptose i en lignende utstrekning som L-TAT-IB-peptider.

Langtids inhibering av IL-1P-indusert celledød ved D-TAT-IB1-peptid ble også analysert. βTC-3-celler ble inkubert som ovenfor i 30 minutter med en enkelt tilsetning av de angitte peptider (1 µM), deretter ble IL-1 β (10 ng/ml) tilsatt etterfulgt av tilsetning av cytokinet hver andre dag. Apoptotiske celler ble deretter telt etter 15 dagers inkubasjon med IL-1 ved anvendelse av propidiumjodid og Hoechst 33342 kjernefarging. Bemerk at en enkelt tilsetning av TAT-IB1-peptidet ikke ga langtidsbeskyttelse. Et minimum på 1000 celler ble telt i hvert eksperiment. Som et resultat var D-TAT-IB1(s) i henhold til oppfinnelsen, men ikke L-TAT-IB1(s) i henhold til oppfinnelsen, i stand til å langtids (15 dagers) beskyttelse.

Eksempel 11: Inhibering av bestrålingsindusert pankreatisk β-celledød ved TAT-IB(s)-peptider

JNK blir også aktivert ved ioniserende stråling. For å bestemme om TAT-IB(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen ville tilveiebringe beskyttelse mot strålingsindusert JNK-skade, ble "WiDr"-celler bestrålt (30 Gy) i nærvær eller fravær av D-TAT, L-TAT-IB1(s) i henhold til oppfinnelsen eller D-TAT-IB1(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen (1 µM tilsatt 30 minutter før bestråling).

Kontrollcellene (CTRL) ble ikke bestrålt. Cellene ble analysert 48 timer senere ved hjelp av PI og Hoechst 3342-farging som beskrevet ovenfor. N = 3, SEM er angitt. L-TAT-IB1(s) og D-TAT-IB1(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen var begge i stand til å forhindre bestrålingsindusert apoptose i denne humane kolonkreftlinjen.

Eksempel 12: Radiobeskyttelse for ioniserende stråling ved TAT-IB(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen

For bestemme de radiobeskyttende virkningene av TAT-IB(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen, ble C57B1/6-mus (2 til 3 måneder gamle) bestrålt med en Phillips RT 250 R-stråling med en dosegrad på 0,74 Gy/min (17 mA, 0,5 mm Cu-filter). 30 minutter før bestråling ble dyrene injisert i.p. med enten TAT, L-TAT-IB1(s) i henhold til oppfinnelsen eller D-TAT-IB1(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen (301 av en 1 mM løsning). Kort fortalt ble musene bestrålt som følger: Musene ble plassert i små plastbokser med hodet hvilende utenfor boksen. Dyrene ble plassert på ryggen under bestrålingen og halsen fiksert i en liten plasttunell for å holde hodet i korrekt posisjon. Kroppen ble beskyttet med bly.

Før bestråling ble musene opprettholdt på standard pellet musefôr, etter bestråling ble imidlertid musene fôret med et halvflytende fôr som ble fornyet hver dag.

Reaksjonen på leppeslim ble deretter scoret av 2 uavhengige observatører i henhold til et scoringssystem utviklet av Parkins et al. (Parkins et al, Radiotherapy & Oncology, 1: 165-173, 1983), hvori erytemstatus så vel som nærvær av ødem, avskjelling og eksudering ble sitert. I tillegg ble dyrene veid før hver registrering av deres erytem/ødemstatus.

Resultatene av disse eksperimentene angir at TAT-IB(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen kan beskytte mot vekttap og erytem/ødem assosiert med ioniserende stråling.

Eksempel 13: Undertrykkelse av JNK-transkripsjonsfaktorer ved L-TAT-IB1(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen

Gelretardasjonsassayer ble utført med en AP-1 dobbeltmerket probe (5'-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3' (SEKV.ID. NR. 27). HeLa-cellenukleære ekstrakter ble deretter behandlet eller ikke i en time med 5 ng/mlTNF- α, som angitt. TAT og L-TAT-IB1(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen ble tilsatt 30 minutter før TNF- α. Bare den delen av gelen med det spesifikke AP-1 DNA-komplekset (som vist ved konkurranseeksperimenter med ikke-merkede spesifikke og ikke-spesifikke konkurrenter) er vist.

L-TAT-IB1(s)-peptider i henhold til oppfinnelsen reduserer dannelsen av AP-1 DNA-bindende kompleks i nærvær av TNF- α.

Eksempel 14: Evaluering av nevrobeskyttelse mot fokal cerebral iskemi i en permanent MCAO-modell - bestemmelse av effektiviteten til beskyttelsen ved forskjellige doser (se figur 3)

Fokal cerebral iskemi ble indusert i 12 dager gamle rotter. Ungene ble anestesert i et induksjonskammer med 2% isofluran og under operasjonen ble anestesi opprettholdt ved å bruke en maske under 2% isofluran. MCAO ble indusert ved å elektrokoagulere en hovedgren av den midtre cerebrale arterien (MCA). Rottene ble plassert på høyre side og et skrått utsnitt ble gjort mellom øret og øyet. Etter uttak av temporal muskel, ble kraniebenet fjernet fra den frontale sutur til et nivå under den zygomatiske buen. Venstre MCA, eksponert like etter dens tilsynekomst over den rinale fissuren, ble permanent elektrokoagulert på det indre cerebrale venenivået før MCA atskilte seg til frontale og parietale grener. Det kraniale hudsnittet ble deretter lukket. Rotteungene ble deretter plassert i en inkubator som opprettholdt 37 ºC inntil de våknet opp og de ble deretter overført til sin mor.

6 timer senere ble et kimært D-TAT-IB1(s)-peptid i henhold til oppfinnelsen som angitt i SEKV.ID. NR. 11 injisert intraperitonealt. 24 timer etter koagulering ble rottene anestesert med kloralhydrat og perfundert gjennom den oppadstigende aorta med 4% paraformaldehyd i PBS. Hjernene ble deretter fjernet og holdt i 2 timer i den samme fikserende løsningen og plassert i en gradient på 30% sukrose i PBS i omtrent 15 timer ved 4 °C. Hjernene ble frosset i isopentan (-40 °C) og lagret ved -20 °C. Ringkryostatsnitt på 50 μm ble oppsamlet på objektglass. Snittene ble farget med kresylfiolett. Hvert tiende snitt ble analysert og det totale volumet av lesjonen ble beregnet ved å bruke Neuroleucida-programmet. I kontrollgruppe A var gjennomsnittlig lesjonsvolum 21,47 mm<3>. Alle de behandlede gruppene har en lavere middelverdi enn kontrollgruppen. En signifikant statistisk forskje ll er observert mellom gruppe A og gruppene C, E og F (enhalet t-test, p = 0,030, p = 0,002, p = 0,001 henholdsvis). Resultatene er vist i figur 4.

Som et resultat understøtter disse data den konklusjonen at kimært D-TAT-IB1(s)-peptidet i henhold til oppfinnelsen som angitt i SEKV.ID. NR. 11 administrert i en dose på 11 mg/kg, 3 mg/kg, 0,3 mg/kg og 0,03 mg/kg bidrar til en cerebral beskyttelse. Resultater med en dose på 1 mg/kg, 0,003 mg/kg og 0,0003 sammenlignet med saltløsningsgruppen, antyder at den totale prøven ikke var stor nok til å nå en signifikant differanse. Den beste beskyttelsen er observert med en dose på 0,03 mg/kg.

Eksempel 15: Evaluering av nevrobeskyttelse ved kimære peptider i henhold til oppfinnelsen etter iv-administrering mot fokal cerebral iskemi i en transient MCAO-modell (se figur 4)

Transient iskemi i voksne mus. Ved å bruke ICR-CD1 hannmus (6 uker gamle; 18-37 g; Harlan), provoserte vi iskemi ved å innføre et filament fra den felles karotidarterien inn i den interne karotiden og forskyve den inn i den arterielle sirkel for derved å okkludere den midtre cerebrale arterien. Vi målte regional cerebral blodgjennomstrømning ved lader Doppler gjennomstrømningsmålinger med en probe fiksert på skallen gjennom iskemien inntil 10 minutter etter reperfusjon.

Rektal temperatur ble målt og opprettholdt på 37 ºC. Musene ble drept 48 timer etter reperfusjon. Seriekryostatsnitt 20 μm tykke ble sporet ved å bruke et datamaskinmikroskopsystem utstyrt med Neurolucida-programmet (MicroBrightField) og volumene av det iskemiske området hele hjernen ble beregnet (blindt) med Neuroexplorer-programmet.

XG-102 0,3 = 0,3 mg/kg, XG-102 1 = 1 mg/kg, XG-102 5 = 5 mg/kg

Infarktvolumstørrelsene (mm<3>) etter bolus iv-administrering av placebo og XG-102 0,3, 1,3 mg/kg 6 timer etter reperfusjon (30 minutters klemming) i en voksen musemodell var som følger.

infarkter middel avvikende type

kontroll n = 5 72 17

XG102 0,3 n = 5 16 4

XG102 1 n = 1 16

XG102 3 n = 5 15 5

Eksempel 16: Assay for nevronale kulturer ved å måle LDH-frigjøring etter NMDA-stimulering (se figur 5)

Den nevrobeskyttende virkningen av D-TAT-IB (generisk)(s)/D-JNKI1-peptidet (SEKV.ID. NR. 12) ble evaluert i søsterkulturer forbehandlet i 30 minutter med de angitte konsentrasjoner av peptider eller MK-801 før kontinuerlig eksponering til 100 µM NMDA. Etter 12 timer med NMDA-behandling, var de degenerative forandringene som skyldes NMDA-eksponering i kulturer forbehandlet med 5 μM D-TAT-IB (generisk)(s)/D-JNKI1 fullstendig inhibert som angitt ved fravær av signifikant LDH-frigjøring over kontrollene (figur 5). Det morfologiske utseende, antall og fordeling av nevronene var ikke mulig å atskille fra kontrollene.

Kortikal nevronal kultur. Vi dissekerte små stykker av cortex fra hjernene til to dager gamle rotteunger, inkuberte dem med 200 enheter papain i 30 minutter ved 34 ºC, og platet deretter nevronene med tetthet på tilnærmet 1 x 10<6>celler/plate på skåler forbelagt med 100 µg/ml poly-D-lysin. Platemediet besto av B27/neurobasal (Life Technologies, Gaithersburg, MD) supplert med 0,5 mM glutamin, 100 U/ml penicillin og 100 ug/ml streptomycin.

Laktatdehydrogenase (LDH) cytotoksisitetsassay. LDH frigjort i bademedium 12, 24 og 48 timer etter NMDA-administrering ble målt ved å bruke Cytotox 96 ikkeradioaktivt cytotoksisitetsassaysett (Promega, WI) (se figur 5).

Eksempel 17: Inhibering av endogen JNK-aktivitet i HepG2-celler ved å bruke en alle i en brønn-tilnærming (se figur 6)

HepG2-celler ble sådd med 3000 celler/brønn dagen før eksperimentet. Deretter ble økende konsentrasjoner av enten interleukin-1 β [IL-1 β( v)] eller tumornekrosefaktor α [TNF α(•)] (a) tilsatt for å aktivere JNK i 30 minutter. Cellene ble lysert i 20 mM Hepes, 0,5% Tween pH 7,4 og bearbeidet for AlphaScreen JNK. (b) Z' for JNK-aktivitet indusert av 10 ng/ml IL-1 β og målt i 384-brønners plate (n = 96). (c) Inhibering av endogen IL-1 β-indusert JNK-aktivitet med kjemiske JNK-inhibitorer [staurosporin ( º) og SP600125 (•)]. (d) Virkning av peptidiske inhibitorer L-TAT-IB1(s) i henhold til SEKV.ID. NR. 9 [her forkortet som L-JNKi ( v)) og D-TAT-IB1(s) i henhold til SEKV.ID. NR. 11 (her forkortet som D-JNKi ( ♦)) og JBDer (•) (tilsvarer L-JNKI uten TAT-sekvensen)] på IL-1 α-avhengig JNK-aktivitet. Alle panelene er representative for tre uavhengige eksperimenter (n = 3).

Fremgangsmåter: AlphaScreen kinaseassay

Prinsipp: AlpaScreen er en ikke-radioaktiv kulebasert teknologi brukt til å undersøke biomolekylære interaksjoner i et mikroplateformat. Akronymet ALPHA står for Amplified Luminescence Proximity Homogenous Assay. Det involverer en biologisk interaksjon som bringer en "donor"- og en "akseptor"-kule i nær tetthet, deretter virker en kaskade av kjemiske reaksjoner slik at det produserer et forsterket signal. Ved lasereksitasjon på 680 nm konverterer et fotosensitiverende middel (ftalocyanin) i "donor"-kulen omgivelsesoksygen til en eksitert singlett tilstand. Innenfor dens 4 µsek halveringstid, kan singlett oksygenmolekylet diffundere opptil omtrent 200 nm i løsning og hvis en akseptorkule er innenfor denne nærheten, reagerer singlett oksygenet med et tioksenderivat i "akseptor"-kulen og danner kjemiluminescens ved 370 nm som ytterligere aktiverer fluoroforer inneholdt i den samme "akseptor"-kulen. De eksiterte fluoroforene emitterer deretter lys på 520-620 nm. I fravær av en akseptorkule, faller singlett oksygenet ned til grunntilstanden og intet signal blir produsert.

Kinasereagenser (B-GST-cJun, anti-P-cJun-antistoff og aktivt JNK3) ble først fortynnet i kinasebuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 100 μM Na3VO4, 0,01% Tween-20) og tilsatt til brønner (15 µl). Reaksjonene ble deretter inkubert i nærvær av 10 µM ATP i 1 time ved 23 °C. Deteksjon ble utført ved tilsetning av 10 μl kuleblanding (protein A akseptor 20 µg/ml og streptavidin donor 20 µg/ml), fortynnet i deteksjonsbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 20 mM NaCl, 80 mM EDTA, 0,3% BSA) etterfulgt av en annen en times inkubasjon ved 23 °C i mørke. For måling av JNK-endogen aktivitet ble kinaseassayer utført som beskrevet ovenfor med unntak av at aktivt JNK3 ble erstattet med cellelysater og reaksjonskinasekomponenter ble tilsatt etter cellelyse. B-GST-cjun- og P-cJunantistoff ble brukt i samme konsentrasjoner, mens ATP ble brukt ved 50 µM i stedet for 10 µM. AlphaScreen-signalet ble analysert direkte på Fusion- eller En Visionapparater.

Eksempel 18: Behandling av støytraume

D-TAT-IB1(s) ble anvendt på membranen til det runde vinduet i sneglehuset i 3 grupper av marsvin (hver gruppe med 6 dyr) i 2 mikroliter av en gelformulering av 2,6% bufret hyaluronsyre (Hylumed, Genzyme Corp.) i en konsentrasjon på 100 μM enten 30 minutter før støytraume (120 dB ved 6 kHz i 30 minutter) eller 30 minutter eller 4 timer deretter. Ubehandlede ører tjente som kontroll.

Øreterskelforskyvninger ble evaluert ved auditoriske hjernestammeresponsmålinger 20 minutter etter støytraume (temporært terskelskift, TTS) og 15 dager etter traume (permanent terskelskift, PTS). Administrering av D-TAT-IB1(s) beskyttet mot permanent hørselstap selv om den ble påført etter eksponering for utstrakt støy sammenlignet med ikke-behandlede ører. Den beskyttende virkningen var sterkere desto tidligere D- TAT-IB1(s) ble administrert etter støytraumet. Således er D-TAT-IB1(s) en meget effektiv otobeskyttende forbindelse i forbindelse med støytraume.

Fra den foregående detaljerte beskrivelsen av spesifikke utforminger av oppfinnelsen, skal det være klart at unike cellepermeable bioaktive kimære peptider og JNK-inhibitorsekvenser er blitt beskrevet. Skjønt spesielle utforminger er blitt beskrevet heri i detalj, er dette blitt gjort ved hjelp av eksempler i den hensikt bare å illustrere .

Claims

PATENTKRAV

1. JNK-inhibitorsekvens,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den består av en D-retroinvers aminosyresekvens som angitt i SEKV.ID. NR.2.

2. JNK-inhibitorsekvens som angitt i krav 1,

k a r a k t e r i s e r t v e d at JNK-inhibitorsekvensen binder c-jun aminoterminal kinase (JNK).

3. JNK-inhibitorsekvens som angitt i ethvert av kravene 1 til 2,

k a r a k t e r i s e r t v e d at JNK-inhibitorsekvensen inhiberer aktivering av minst én JNK målrettet transkripsjonsfaktor når JNK-inhibitorsekvensen er tilstede i en JNK-uttrykkende celle.

4. JNK-inhibitorsekvens som angitt i ethvert av kravene 1 til 3,

k a r a k t e r i s e r t v e d at JNK-målrettet transkripsjonsfaktor er valgt fra gruppen som består av c-Jun, ATF2 og Elkl.

5. JNK-inhibitorsekvens som angitt i ethvert av kravene 1 til 4,

k a r a k t e r i s e r t v e d at JNK-inhibitorsekvensen forandrer en JNK-virkning når peptidet er tilstede i en JNK-uttrykkende celle.

6. Kimært peptid,

k a r a k t e r i s e r t v e d at det består av første domene og et andre domene koblet ved kovalent binding, hvor det første domenet omfatter en transportsekvens og det andre domenet består av en JNK-inhibitorsekvens som angitt i ethvert av kravene 1-5, der det første domenet er bundet til dem C-terminale enden av det andre domenet.

7. Peptid som angitt i krav 6,

k a r a k t e r i s e r t v e d at transportsekvensen omfatter aminosyresekvensen til et humant immunsviktvirus TAT-polypeptid.

8. Peptid som angitt i ethvert av kravene 6 til 7,

k a r a k t e r i s e r t v e d at transportsekvensen omfatter L-aminosyresekvensen til SEKV.ID. NR. 5 eller 7, eller D-retroinverssekvensen som angitt i SEKV.ID.NR.

6 eller 8.

9. Peptid som angitt i ethvert av kravene 6 til 8,

k a r a k t e r i s e r t v e d at transportsekvensene forsterker cellulært opptak av peptidet.

10. Peptid som angitt i ethvert av kravene 6 til 9,

k a r a k t e r i s e r t v e d at transportsekvensen styrer nukleær lokalisering av peptidet.

11. Peptid som angitt i ethvert av kravene 6 til 10,

k a r a k t e r i s e r t v e d at JNK-inhibitorsekvensen omfatter D-retroinvers aminosyresekvensen som angitt i SEKV.ID.NR. 11.

12. Peptid som angitt i ethvert av kravene 6 til 11,

k a r a k t e r i s e r t v e d at peptidet omfatter eller består av D-retroinvers aminosyresekvensen som angitt i SEKV.ID.NR. 11.

13. Farmasøytisk sammensetning,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter en JNK-inhibitorsekvens som består av en sekvens som angitt i ethvert av kravene 1 til 5 eller et kimært peptid som angitt i ethvert av kravene 6 til 12, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

14. Anvendelse av en JNK-inhibitorsekvens som angitt i ethvert av kravene 1 til 5 eller et kimært peptid som angitt i ethvert av kravene 6 til 12 til fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for å behandle en patofysiologi valgt fra ondartetheter i lunge, bryst, lymfoid, gastrointestinale og urogenitaleveier så vel som adenokarsinom inkludert ondartetheter så som kolonkreft, renalt cellekarsinom, prostatakreft, ikke småcellet karsinom i lungen, kreft i tynntarmen og kreft i øsofagus så vel som leukemi, kreft med Bcr-Abl-onkogene transformasjoner, psoriasis, pemfigus vulgaris, Bechets syndrom, akutt lungesviktsyndrom (ARDS), iskemisk hjertesykdom, postdialysesyndrom, revmatoid artritt, ervervet immunsviktsyndrom, vaskulitt, septisk sjokk, restenose, hørselstap, øretraumer, iskemi, slag, reperfusjonsskader, hypoksi, sekundære virkninger på grunn av behandling med proinflammatoriske cytokiner, diabetes hjerte og hjertehypertrofi og arteriosklerotiske lesjoner, patologiske tilstander indusert ved ioniserende stråling brukt i radioterapi og ultrafiolett lys (UV-lys), patologiske tilstander indusert av DNA-skadende midler inkludert kjemoterapeutiske medikamenter, ved hypo- og hypertermi, inflammatoriske, autoinflammatoriske, immun- og autoimmunsykdommer, degenerative sykdommer, myopatier, kardiomyopatier og graftavstøtning.

15. Anvendelse som angitt i krav 14,

hvori den farmasøytiske sammensetningen skal administreres ved en administrasjonsrute valgt fra gruppen som består av intraperitoneal, nasal, intravenøs, oral og plasterlevering.

16. Sett,

k a r a k t e r i s e r t v e d at det omfatter en JNK-inhibitorsekvens som angitt i ethvert av kravene 1 til 5 og/eller et kimært peptid som angitt i ethvert av kravene 6 til 12.