ES2567708T3

ES2567708T3 - Inhibidores peptídicos de la vía de transducción de la señal de JNK con permeabilidad celular

Info

Publication number: ES2567708T3
Application number: ES11003985.6T
Authority: ES
Inventors: Christophe Bonny
Original assignee: Xigen Inflammation Ltd
Current assignee: Xigen Inflammation Ltd
Priority date: 2005-09-12
Filing date: 2006-09-12
Publication date: 2016-04-26
Anticipated expiration: 2026-09-12
Also published as: UA98101C2; EP3012266A1; NO20081664L; US20160264630A1; HK1118841A1; US20140200187A1; KR20080052586A; EP2418217B1; HRP20160379T1; SI2418217T1; PL2418217T3; EA200800680A1; CN101263157A; DK2418217T3; US20170320917A1; WO2007031280A3; US9290538B2; HK1223948A1; NO342272B1; BRPI0616824B1

Abstract

Péptido quimérico que consiste en un primer dominio y un segundo dominio, y opcionalmente una secuencia enlazante, consistiendo el primer dominio en una secuencia de tráfico y consistiendo el segundo dominio en una secuencia inhibidora de JNK, donde el primer dominio consiste en la secuencia de aminoácidos todos retro-inverso D de acuerdo con la SEQ ID NO: 6 y donde el segundo dominio consiste en la secuencia de aminoácidos todos retro-inverso D de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, estando unido el primer dominio al extremo C-terminal del segundo dominio tanto directamente como mediante dicha secuencia enlazante que consiste en 1 a 10 aminoácidos.

Description

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estado anterior de la técnica de acuerdo con el documento WO 01/27268 (SEQ ID Nº: 17-26) con fines comparativos.

Tabla 1

Nombre Seq./ péptido: SEQ ID Nº aa Secuencia

L-IB1 (s): 1 19 RPKRPTTLNL FPQVPRSQD (NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)

D-IB1 (s): 2 19 DQSRPVQPFL NLTTPRKPR (NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH)

L-IB (genérico) (s): 3 18 XRPTTLXLXX XXXXXQDX (NH2-Xn b-xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH)

D-IB (genérico) (s): 4 18 XDQXXXXXXX LXLTTPRX (NH2-Xn b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn a-Xn b-COOH)

L-TAT: 5 10 GRKKRRQRRR (NH2-GRKKRRQRRR-COOH)

D-TAT: 6 10 RRRQRRKKRG (NH2-RRRQRRKKRG-COOH)

L-genérico-TAT (s): 7 17 XXXXRKKRRQ RRRXXXX (NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-COOH)

D-genérico-TAT (s): 8 17 XXXXRRRQRR KKRXXXX (NH2-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH)

L-TAT-IB1 (s): 9 31 GRKKRRQRRR PPRPKRPTTL NLFPQVPRSQ D (NH2-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)

L-TAT-IB (genérico) (s): 10 38 XXXXXXXRKK RRQRRRXXXX XRPTTLXLXX XXXXXQDX (NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-Xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH)

D-TAT-IB1 (s): 11 31 DQSRPVQPFL NLTTPRKPRP PRRRQRRKKR G (NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH)

D-TAT-IB (genérico) (s): 12 38 XDQXXXXXXX LXLTTPRXXX XXRRRQRRKK RXXXXXXX (NH2-Xn b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH)

IB1-largo: 13 29 PGTGCGDTYR PKRPTTLNLF PQVPRSQDT

IB2-largo: 14 27 IPSPSVEEPH KHRPTTLRLT TLGAQDS

c-Jun: 15 29 GAYGYSNPKI LKQSMTLNLA DPVGNLKPH

ATF2: 16 29 TNEDHLAVHK HKHEMTLKFG PARNDSVIV

L-IB1: 17 23 DTYRPKRPTT LNLFPQVPRS QDT

D-IB1: 18 23 TDQSRPVQPF LNLTTPRKPR YTD

L-IB (genérico): 19 9 XRPTTLXLXX XXXXXQDS/TX

D-IB (genérico): 20 19 XS/TDQXXXXXX XLXLTTPRX

L-genérico-TAT: 21 17 XXXXRKKRRQ RRRXXXX

D-genérico-TAT: 22 17 XXXXRRRQRR KKRXXXX

L-TAT-IB1: 23 35 GRKKRRQRRR PPDTYRPKRP TTLNLFPQVP RSQDT

L-TAT-IB (genérico): 24 42 XXXXXXXRKK RRQRRRXXXX XXXXRPTTLX LXXXXXXXQD S/TX

D-TAT-IB1: 25 35 TDQSRPVQPF LNLTTPRKPR YTDPPRRRQR RKKRG

D-TAT-IB (genérico): 26 42 XT / SDQXXXXXX XLXLTTPRXX XXXXXXRRRQ RRKKRXXXXX XX

(En la Tabla 1 se muestran ejemplos de secuencia y sus fórmulas genéricas para SEQ ID Nº: 1, 2, 5, 6, 9 y 11 y SEQ ID Nº: 3, 4, 7, 8, 10 y 12, respectivamente).

5 Cualquiera de los péptidos aquí descritos puede presentar una modificación en sus extremos, en el Cterminal o en el N-terminal o en ambos. Preferentemente el extremo C-terminal se puede modificar con una modificación amida, mientras que el extremo N-terminal se puede modificar por cualquier grupo protector de NH2 adecuado, por ejemplo por acilación.

A este respecto, un “aminoácido modificado” puede ser cualquier aminoácido modificado, por ejemplo por

10 glicosilación diferente en diversos organismos, por fosforilación o marcado de aminoácidos específicos. En este caso, el marcador se selecciona típicamente de entre el grupo de marcadores que incluye:

i) marcadores radiactivos, es decir, fosforilación radiactiva o un marcador radiactivo con azufre, hidrógeno, carbono, nitrógeno, etc.;

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El acoplamiento del primer y segundo dominios también se puede llevar a cabo a través de un agente de acoplamiento o conjugación. Se pueden emplear diversos reactivos de reticulación intermolecular (véase, por ejemplo, Means y Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, pp. 39-43). Entre estos reactivos se encuentran, por ejemplo, 3-(2-pirridiltio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) o N,N’-(1,3fenilen)-bismaleimida (ambos altamente específicos con respecto a los grupos sulfhidrilo, forman enlaces irreversibles); N,N’-etilen-bis-(yodoacetamida) u otros reactivos de este tipo con 6 a 11 puentes de carbono metilénicos (que son relativamente específicos con respecto a los grupos sulfhidrilo); y 1,5-difluor-2,4dinitrobenceno (que forma enlaces irreversibles con los grupos amino y tirosina). Otros reactivos de reticulación útiles para este fin incluyen: p,p’-difluor-m,m’-dinitrodifenilsulfona (que forma reticulaciones irreversibles con grupos amino y fenólicos); adipimidato de dimetilo (que es específico con respecto a los grupos amino); fenol-1,4-disulfonilcloruro (que reacciona principalmente con grupos amino); diisocianato o diisotiocianato de hexametileno o azofenil-p-diisocianato (que reacciona principalmente con grupos amino); glutaraldehído (que reacciona con diversas cadenas laterales diferentes) y disdiazobencidina (que reacciona principalmente con tirosina e histidina).

Los reactivos de reticulación pueden ser homobifuncionales, esto es con dos grupos funcionales que experimentan la misma reacción. Un reactivo de reticulación homobifuncional preferente es bismaleimidohexano (“BMH”). El BMH contiene dos grupos funcionales maleimida que reaccionan específicamente con compuestos que contienen sulfhidrilo bajo condiciones suaves (pH 6,5-7,7). Los dos grupos maleimida están unidos por una cadena hidrocarburo. Por consiguiente, el BMH es útil para la reticulación irreversible de polipéptidos que contienen residuos cisteína.

Los reactivos de reticulación también pueden ser heterobifuncionales. Los agentes de reticulación heterobifuncionales tienen dos grupos funcionales diferentes, por ejemplo un grupo reactivo frente a amina y otros a tiol, que reticularán dos proteínas que tengan aminas y tioles libres, respectivamente.

Como ejemplos de agentes de reticulación heterobifuncionales se mencionan: 4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (“SMCC”), éster de m-maleimidobenzoil-Nhidroxisuccinimida (“MBS”) y 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimida (“SMPB”), un análogo de MBS de cadena prolongada. El grupo succinimidilo de estos reticulantes reacciona con una amina primaria y la maleimida reactiva frente a tiol forma un enlace covalente con el tiol de un residuo cisteína.

Con frecuencia, los reactivos de reticulación son poco solubles en agua. Para mejorar la solubilidad en agua del reactivo de reticulación se le puede añadir una fracción hidrófila, por ejemplo un grupo sulfonato. A este respecto, el sulfo-MBS y el sulfo-SMCC son ejemplos de reactivos de reticulación modificados para aumentar su solubilidad en agua que pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención.

Muchos reactivos reticulantes producen un conjugado que esencialmente no es segmentable bajo condiciones celulares. Sin embargo, algunos reactivos de reticulación contienen un enlace covalente, tal como disulfuro, que es segmentable bajo condiciones celulares. Por ejemplo, el reactivo de Traut, ditiobis(succinimidilpropionato) (“DPS”) y 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (“SPDP”) son reticulantes segmentables bien conocidos. El uso de un reactivo de reticulación segmentable permite que la fracción de carga se separe del polipéptido de transporte después de su suministro al interior de la célula diana. También puede resultar útil un enlace directo disulfuro.

Numerosos reactivos de reticulación, incluyendo los arriba descritos, son comerciales. Las instrucciones detalladas para su uso se pueden obtener fácilmente de los proveedores comerciales. Una referencia general de la reticulación de proteínas y la preparación de conjugados es: Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press (1991).

La reticulación química puede incluir el uso de brazos separadores. Los brazos separadores proporcionan flexibilidad intramolecular o ajustan las distancias intramoleculares entre fracciones conjugadas, ayudando así a conservar la actividad biológica. Un brazo separador puede tener la forma de una fracción polipeptídica que incluye aminoácidos separadores, por ejemplo prolina. Alternativamente, un brazo separador puede formar parte del reactivo de reticulación, por ejemplo en un “SPDP de cadena larga” (Pierce Chem. Co., Rockford, IL., cat. No. 21651 H).

Los péptidos quiméricos se pueden utilizar como inmunógenos para generar anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a dichos compuestos peptídicos. Estos anticuerpos incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab policlonales, monoclonales, quiméricos de cadena simple y una librería de expresión de Fab. Para producir estos anticuerpos se pueden utilizar diversos procedimientos conocidos en la técnica.

A modo de ejemplo, se pueden inmunizar diversos animales huésped para producir anticuerpos policlonales mediante inyección con un péptido quimérico de la invención tal como se ha definido arriba. Para ello se

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ésta suficiente para beneficiar al individuo. La cantidad exacta administrada y la velocidad y la evolución temporal de la administración dependerán de la naturaleza y la gravedad de la enfermedad tratada.

En general, la prescripción de un tratamiento, por ejemplo las decisiones sobre la dosificación, etc., es responsabilidad del médico y de otros clínicos, debiendo tenerse en cuenta el trastorno a tratar, el estado del paciente individual, el lugar de suministro, el método de administración y otros factores conocidos por los médicos. En REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16 edición, Osol, A. (ed.) 1980, se pueden encontrar ejemplos de las técnicas y protocolos arriba mencionados.

Alternativamente, se pueden utilizar terapias dirigidas para suministrar los péptidos quiméricos de la invención de forma más específica a determinados tipos de célula, mediante el uso de sistemas dirigidos, tales como anticuerpos (dirigidos) o ligandos celulares específicos. Los anticuerpos utilizados para la dirección son típicamente específicos con respecto a proteínas de la superficie celular de células asociadas a cualquiera de las enfermedades arriba definidas. Por ejemplo, estos anticuerpos pueden estar dirigidos a anticuerpos de la superficie celular, por ejemplo proteínas superficiales asociadas a células B, tales como proteína DR MHC de clase II, CD18 (LFA-1 cadena beta), CD45RO, CD40 o Bgp95, o proteínas de la superficie celular seleccionadas por ejemplo entre CD2, CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD13, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD39, CD4, CD43, CD45, CD52, CD56, CD68, CD71, CD138, etc. Los constructos diana se pueden preparar típicamente mediante unión covalente de los péptidos quiméricos de la invención con un anticuerpo específico con respecto a una proteína de la superficie celular o por unión a un ligando celular específico. Las proteínas se pueden unir a un anticuerpo de este tipo o se pueden fijar al mismo mediante un enlace peptídico o mediante acoplamiento químico, reticulación, etc. La terapia diana se puede llevar a cabo administrando a un paciente el constructo diana en una cantidad farmacéuticamente eficaz a través de cualquiera de las vías de administración definidas más abajo, por ejemplo, vía de administración intraperitoneal, nasal, intravenosa, oral y en parche. Preferentemente, los péptidos quiméricos de la invención unidos a los anticuerpos dirigidos

o a ligandos celulares específicos tal como se definen más arriba se pueden liberar in vitro o in vivo, por ejemplo por hidrólisis del enlace covalente, mediante peptidasas o mediante cualquier otro método adecuado. Alternativamente, si los péptidos quiméricos de la invención están unidos a un ligando celular específico de células pequeñas, la liberación del ligando puede no llevarse a cabo. Si están presentes en la superficie celular, los péptidos quiméricos de la invención pueden entrar en la célula por la actividad de su secuencia de tráfico. La dirección puede ser deseable por diversas razones, por ejemplo cuando las secuencias inhibidoras de JNK de la invención y los péptidos quiméricos de la invención son inaceptablemente tóxicos o si, en otro caso, se requiriese una dosis demasiado alta.

Los péptidos quiméricos de la invención se podrían administrar en una forma precursora mediante el uso de un anticuerpo o un virus. Entonces, los péptidos quiméricos de la invención se pueden convertir en la forma activa mediante un agente de activación producido en las células a tratar o dirigido a las mismas. Este tipo de enfoque se conoce a veces como ADEPT (antibody-directed enzyme prodrug therapy -terapia con profármaco enzimático dirigido a anticuerpos). El ADEPT implica dirigir el agente activador a las células mediante conjugación con un anticuerpo específico celular.

La presente invención también incluye el uso de péptidos quiméricos de la invención para preparar una composición farmacéutica, por ejemplo tal como se describe más arriba, para prevenir y/o tratar trastornos de la proliferación celular asociados a la activación de JNK en un sujeto (“trastornos asociados con JNK”). En general, una composición farmacéutica de este tipo de acuerdo con la presente invención incluye como componente activo por ejemplo: (i) cualquiera o cualesquiera de los péptidos quiméricos de la invención.

La prevención y/o el tratamiento de acuerdo con la presente invención incluye típicamente la administración de una composición farmacéutica de la invención tal como se define más arriba. El término “modular” incluye la supresión de la expresión de JNK en caso de sobreexpresión de la misma. También incluye la supresión o fosforilación de c-jun, ATF2 o NFAT4, por ejemplo, empleando un péptido de cualquiera o cualesquiera de las SEQ ID Nº: 1-4 y/o 9-12 como inhibidor competitivo del sitio de unión natural de c-jun, ATF2 y NFAT4 en una célula. El término “modular” también incluye la supresión de complejos heteroméricos y homoméricos de factores de transcripción formados por c-jun, ATF2 o NFAT4 y sus compañeros relacionados, por ejemplo el complejo AP-1, que está formado por c-jun, AFT2 y c-fos. Cuando un trastorno de proliferación celular está asociado a una sobreexpresión de JNK, dichas secuencias inhibidoras de JNK supresoras se pueden introducir en una célula. En algunos casos, “modular” puede incluir el aumento de la expresión de JNK, por ejemplo mediante el uso de un anticuerpo específico del péptido IB que bloquea la unión de un péptido IB con JNK, evitando así la inhibición de JNK mediante el péptido relacionado con IB.

La prevención y/o el tratamiento de un sujeto con la composición farmacéutica de la invención tal como se describe más arriba se puede llevar a cabo típicamente administrando (in vivo) una cantidad (“terapéuticamente eficaz”) de dicha composición farmacéutica a un sujeto, pudiendo ser este sujeto por

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ejemplo cualquier mamífero, por ejemplo humano, primate, ratón, rata, perro, gato, vaca, caballo o cerdo. El concepto “terapéuticamente eficaz” significa que la cantidad del componente activo de la composición farmacéutica es suficiente para mejorar el trastorno asociado a la JNK.

Los conceptos “trastorno de proliferación celular” o “trastorno asociado con JNK” tal como se utilizan más arriba indican poblaciones celulares malignas y no malignas in vivo e in vitro que, con frecuencia, parecen ser diferentes morfológica y funcionalmente al tejido circundante y que se caracterizan típicamente por niveles aberrantes de JNK. Un “nivel aberrante de JNK” significa un nivel elevado o reducido de JNK en una parte del sujeto a tratar en comparación con el nivel presente en una parte análoga no afectada de un sujeto que no padece el trastorno.

Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser útiles para prevenir y/o tratar tumores malignos de los diversos sistemas de órganos en los que se ha venido demostrando la activación de JNK, por ejemplo de pulmón, de mama, linfoide, del tracto gastrointestinal y genitourinario y también adenocarcinomas, incluyendo tumores malignos como la mayor parte de los cánceres de colon, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de intestino delgado y cáncer de esófago. También están incluidos leucemia, trastornos o fisiopatologías asociados a la transformación oncogénica, así como cánceres con transformaciones oncogénicas Bcr-Abl que claramente requieren la activación de JNK.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden utilizar para prevenir y/o tratar trastornos de la proliferación celular no malignos o relacionados con la inmunología, tales como psoriasis, pénfigo vulgar, síndrome de Behcet, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (SDRA), enfermedad cardíaca isquémica, síndrome posdiálisis, artritis reumatoide, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, vasculitis, shock séptico y otros tipos de inflamación aguda, e histiocitosis lipídica. Los trastornos inmunopatológicos son especialmente preferentes. Esencialmente cualquier trastorno relacionado etiológicamente con la actividad de la quinasa JNK se considera susceptible de prevención o tratamiento, por ejemplo trastornos o fisiopatologías asociados a la activación de JNK en una o más células tal como se define más arriba, por ejemplo restenosis, pérdida de audición, traumas del oído, isquemia, apoplejía y/o trastornos

o fisiopatologías asociados con la maduración y diferenciación de inmunocitos, lesiones de reperfusión, hipoxia, enfermedades relacionadas con la apoptosis (por ejemplo en caso de infecciones virales (por ejemplo SIDA), enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo apoplejía, traumatismo encefálico, lesiones de la médula espinal, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson), enfermedades cardiovasculares, osteoporosis y envejecimiento), respuesta a estímulos estresantes y con efectos secundarios debidos a tratamientos, por ejemplo con citoquinas proinflamatorias. La composición farmacéutica de la invención también se puede utilizar para tratar o prevenir los efectos asociados a la diabetes o al esfuerzo de cizalladura celular, por ejemplo en estados patológicos inducidos por hipertensión arterial, incluyendo hipertrofia del corazón y cardíaca y lesiones arterioscleróticas, y en bifurcaciones de vasos sanguíneos, y similares, mediante radiación ionizante tal como se utiliza en la radioterapia y luz ultravioleta (luz UV), mediante radicales libres, agentes perjudiciales para el ADN, incluyendo fármacos quimioterapéuticos, por lesiones de isquemia/reperfusión, por hipoxia, y/o hipotermia e hipertermia. Por último, en el contexto de las enfermedades, trastornos o fisiopatologías arriba mencionadas, la composición farmacéutica de la invención se puede utilizar para inhibir la expresión de genes cuya expresión aumenta en presencia de un polipéptido de JNK activo. Generalmente, estos genes y productos genéticos incluyen por ejemplo citoquinas proinflamatorias. Estas citoquinas se encuentran en todas las formas de enfermedades inflamatorias, autoinflamatorias, inmunes y autoinmunes, enfermedades degenerativas, miopatías, cardiomiopatías y rechazo de injertos.

Los péptidos quiméricos de la invención se pueden utilizar en cualquier situación donde se desee una inhibición de la actividad de JNK, dado que las JNK y todas sus isoformas participan en el desarrollo y establecimiento de estados patológicos o en vías de los mismos. Este uso puede incluir administraciones in vitro, ex vivo e in vivo.

De acuerdo con otra realización, los péptidos quiméricos de la invención se pueden utilizar en ensayos (in vitro) (por ejemplo inmunoensayos) para detectar, pronosticar, diagnosticar o controlar diversas afecciones, enfermedades y/o trastornos tal como se definen más arriba, o para controlar el tratamiento de los mismos. El inmunoensayo se puede llevar a cabo mediante un método que consiste en poner en contacto una muestra procedente de un paciente con un anticuerpo para un péptido quimérico de la invención, bajo condiciones de unión inmunoespecífica, y a continuación detectar o medir la cantidad de la eventual unión inmunoespecífica por el anticuerpo. En una realización específica se puede utilizar un anticuerpo específico con respecto a un péptido quimérico de la invención para analizar un tejido o una muestra de suero de un paciente en cuanto a la presencia de JNK o una secuencia inhibidora de JNK. En este caso, un nivel aberrante de JNK es indicativo de una enfermedad. Los inmunoensayos a utilizar incluyen, de forma no exclusiva, sistemas de

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ensayo competitivos y no competitivos empleando técnicas tales como Western Blot, radioinmunoensayo (RIA), ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA), inmunoensayos en “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, inmunoensayos fluorescentes, ensayos de fijación de complemento, ensayos inmunorradiométricos e inmunoensayos de proteína A, etc. Alternativamente se pueden realizar ensayos (in vitro) mediante el suministro de los péptidos quiméricos de la invención a células diana seleccionadas típicamente por ejemplo entre células animales cultivadas, células humanas o microorganismos, y controlar la respuesta celular por métodos biofísicos bien conocidos por los especialistas. Las células diana utilizadas típicamente pueden consistir en células cultivadas (in vitro) o células in vivo, es decir, células que componen los órganos o tejidos de animales o humanos vivos, o microorganismos que se encuentran en animales o humanos vivos.

La presente invención proporciona adicionalmente kits para fines diagnósticos o terapéuticos que incluyen uno o más recipientes que péptidos quiméricos de la invención, y opcionalmente un compañero de unión marcado para el anticuerpo. El marcador así incorporado al anticuerpo puede incluir, de forma no exclusiva, una fracción quimioluminiscente, enzimática, fluorescente, colorimétrica o radiactiva. En otra realización específica, se proporcionan kits para uso diagnóstico que comprenden uno o más recipientes que contienen ácidos nucleicos que codifican péptidos quiméricos de la invención, o alternativamente que son complementarios a éstos. Opcionalmente, el kit también puede incluir una cantidad determinada de un péptido quimérico de la invención para su uso como diagnóstico, patrón o control en los ensayos.

El alcance de la presente invención no se limita a las realizaciones específicas aquí descritas. De hecho, a partir de la anterior descripción y las figuras adjuntas, para los expertos en la técnica serán evidentes diversas modificaciones de la invención además de las aquí descritas.

A no ser que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen el significado entendido habitualmente por el experto medio en la técnica a la que pertenece esta invención. Más abajo se describen métodos y materiales adecuados, aunque en la práctica o la prueba de la presente invención se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos. En caso de conflicto prevalecerá la presente especificación, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no establecen ninguna limitación. Otras características y ventajas de la invención se desprenden claramente de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.

Descripción de las figuras

FIG. 1A-C Diagramas que muestran alineaciones de regiones de dominio JBD conservadas en los factores de transcripción indicados. Las secuencias inhibidoras de JNK se identificaron inspeccionando estas alineaciones de secuencias. Las Fig. 1A-C muestran los resultados de esta alineación a modo de ejemplo. La FIG. 1A representa la región de mayor homología entre los JBD de IB1, IB2, c-Jun y ATF2. El Panel B representa la secuencia de aminoácidos de los JBD de L-IB1(s) y L-IB1 con fines comparativos. Los residuos completamente conservados se indican con asteriscos, mientras que los residuos cambiados a Ala en el vector GFP-JBD23Mut se indican con círculos abiertos. La FIG. 1C muestra las secuencias de aminoácidos de proteínas quiméricas que incluyen una secuencia inhibidora de JNK y una secuencia de tráfico. En el ejemplo mostrado, la secuencia de tráfico se deriva del polipéptido TAT del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y la secuencia inhibidora de JNK se deriva de un polipéptido IB1(s). Las secuencias humano, ratón y rata son idénticas en los Paneles B y C.

FIG. 2 Esquema que muestra las secuencias de los péptidos de fusión TAT-IB genéricos de humano, ratón y rata.

FIG. 3 Resultados de evaluar la neuroprotección contra la isquemia cerebral focal en un modelo MCAO permanente. La eficacia de la protección se determinó a diferentes dosis (véase la Fig. 3). Como se observa en la Fig. 3, al menos las dosis de 11 mg/kg, 3 mg/kg, 0,3 mg/kg y 0,03 mg/kg contribuyen a una protección cerebral. La mejor protección se observa en caso de una dosis de 0,03 mg/kg.

FIG. 4 Evaluación de la neuroprotección por un péptido quimérico de la invención de SEQ ID Nº: 11 después de administración i.v. contra la isquemia cerebral focal en un modelo MCAO transitorio. Después de provocar una isquemia en ratones adultos, los ratones fueron sacrificados 48 horas después de la reperfusión. Como se observa en la Fig. 4, el péptido quimérico de la invención proporciona una neuroprotección eficaz.

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FIG. 5 Resultados de un ensayo de cultivo neuronal midiendo la liberación de LDH después de estimulación con NMDA. Los resultados indican claramente un efecto neuroprotector del péptido D-JNKI1 quimérico de la invención (SEQ ID Nº: 11), dado que los cambios degenerativos debido a la exposición a NMDA se inhibieron por completo como indica la ausencia de una liberación de LDH significativa por encima de los controles.

FIG. 6 Resultados de la inhibición de la actividad de JNK endógena en células HepG2 utilizando péptidos de fusión de la invención de acuerdo con las SEQ ID Nº: 9 y 11 en un método de un pocillo. Como se observa en la Fig. 6, en particular en el panel de la Fig. 6, el D-TAT-IB1 (s) de SEQ ID Nº: 11 (aquí abreviado como D-JNKI) inhibe efectivamente la actividad de JNK, incluso mejor que L-TAT-IB1(s) de SEQ ID Nº: 9 (aquí abreviado como L-JNKI).

FIG. 7 Efecto protector de la protección por D-TAT-IB1(s) contra la pérdida permanente de audición. Cambios en el nivel del umbral auditivo (nivel de presión acústica dB) en cobayas después de trauma por ruido (120 dB a 6 kHz durante 30 minutos) a 8 kHz, la frecuencia de impacto máximo, medidos 20 minutos (cambio temporal del umbral, TTS, gris) y 15 días después de la exposición al ruido (cambio permanente del umbral). Los cobayas recibieron D-TAT-IB1(s) en un gel de ácido hialurónico depositado sobre la membrana de la ventana redonda coclear 30 minutos antes, 30 minutos después o 4 horas después del trauma por ruido. Como control se utilizaron oídos no tratados. El TTS se midió 20 minutos después del trauma por ruido, mientras que la PTS (negro), que corresponde a la pérdida permanente de audición, se determinó 15 días después. Como se puede observar, el D-TAT-IB1(s) no sólo proporciona una protección sustancial contra la pérdida permanente de audición por trauma por ruido si se administra de forma preventiva antes de la exposición al ruido, sino también de forma dependiente del tiempo si se administra después del trauma. La PTS en oídos tratados era considerablemente menor en el caso de la administración de D-TAT-IB1(s) 30 minutos y 4 horas después del trauma que en el caso de los oídos de control no tratados.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación de las secuencias inhibidoras de JNK

Se identificaron secuencias de aminoácidos importantes para una interacción eficaz con JNK mediante alineaciones de secuencias entre JBD conocidos. Una comparación de secuencias entre los JBD de IB1 [SEQ ID Nº: 13], IB2 [SEQ ID Nº: 14], c-Jun [SEQ ID Nº: 15] y ATF2 [SEQ ID Nº: 16] definió una secuencia de 8 aminoácidos débilmente conservada (FIG. 1A). Dado que los JBD de IB1 e IB2 son aproximadamente 100 veces más eficaces que c-Jun o ATF2 para unirse a JNK (Dickens y col., Science 277: 693 (1997)), se razonó que los residuos conservados entre IB1 e IB2 deben ser importantes para conferir una unión máxima. La comparación entre los JBD de IB1 e IB2 definió dos bloques de siete y tres aminoácidos altamente conservados entre las dos secuencias.

Estos dos bloques están incluidos dentro de una secuencia peptídica de 19 aminoácidos en L-IB1 [SEQ ID Nº: 1] y también se muestran por razones comparativas en una secuencia pepetídica de 23 aa derivada de IB1 [SEQ ID Nº: 17]. Estas secuencias se muestran en la FIG. 1B, las rayas en la secuencia L-IB1 indican un hueco en la secuencia para alinear los residuos conservados con L-IB1(s).

Ejemplo 2: Preparación de proteínas de fusión inhibidoras de JNK

Se sintetizaron proteínas de fusión inhibidoras de JNK de acuerdo con SEQ ID Nº: 9 mediante enlace covalente del extremo C-terminal de la SEQ ID Nº: 1 con un péptido portador N-terminal de 10 aminoácidos de longitud derivado de VIH-TAT4g 57 (Vives y col., Biol. Chem. 272: 16010 (1997)) de acuerdo con SEQ ID Nº: 5 a través de un enlazante consistente en dos residuos prolina. Este enlazante se utilizó para posibilitar una flexibilidad máxima y prevenir cambios estructurales secundarios no deseados. También se prepararon los constructos básicos, que se designaron L-IB1(s) (SEQ ID Nº: 1) y L-TAT [SEQ ID Nº: 5], respectivamente. Correspondientemente se sintetizaron los péptidos retro-inversos totalmente D de SEQ ID Nº: 11. También se prepararon los constructos básicos, que se designaron D-IB1(s) [SEQ ID Nº: 2] y D-TAT [SEQ ID Nº: 6], respectivamente.

Se produjeron todos los péptidos de fusión de acuerdo con las SEQ ID Nº: 9, 10, 11 y 12 mediante síntesis Fmock clásica y además se analizaron mediante espectrometría de masas. Finalmente se purificaron por

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HPLC. Para determinar los efectos del enlace de prolina se produjeron dos tipos de péptidos TAT, uno con dos prolinas y otro sin ellas. La adición de las dos prolinas no parecía modificar la entrada o la localización del péptido TAT dentro de las células. La FIG. 2 muestra péptidos genéricos que presentan los residuos de aminoácidos conservados.

Ejemplo 3: Inhibición de la muerte celular por JBD19

Se estudiaron los efectos de la secuencia de JBD de IB1(s) de 19 aa de longitud sobre la actividad biológica de JNK. La secuencia de 19 aa se unió por el extremo N-terminal a la Proteína Verde Fluorescente (Green Fluorescent Protein) (constructo GFP JBP19), evaluándose el efecto de este constructo en la apoptosis de células  pancreáticas inducida por IL1. Previamente se había comprobado que este modo de apoptosis se bloqueaba mediante transfección con J8D1-280, mientras que los inhibidores específicos de ERK1/2 o p38 no proporcionaban protección (véase Ammendrup y col., supra).

Se sintetizaron los oligonucleótidos correspondientes a JBD19 que comprendían una secuencia conservada de 19 aminoácidos así como una secuencia mutada en las regiones completamente conservadas, y se insertaron direccionalmente en los sitios EcoRl y Sall del vector pEGFP-N1 que codifica la Proteína Verde Fluorescente (GFP -Green Fluorescent Protein) (de Clontech). Se cultivaron células TC-3 productoras de insulina en medio RPMI 1640 complementado con un 10% de suero bovino fetal, 100 µg/ml de estreptomicina, 100 unidades/ml de penicilina y glutamina 2 mM. Las células TC-3 productoras de insulina se sometieron a transfección con los vectores indicados y se añadió IL-1 (10 ng/ml) al medio de cultivo celular. Cuarenta y ocho horas después de la adición de IL-1 se contó el número de células apoptóticas utilizando un microscopio de fluorescencia invertido. Las células apoptóticas se distinguieron de las células normales por la “vacuolización” característica del citoplasma y se contaron después de dos días.

GFP es el vector de expresión de Proteína Verde Fluorescente utilizado como control; JBD19 es el vector que expresa una GFP quimérica unida a la secuencia de 19 aa derivada del JBD de IB1; JBD19Mut es el mismo vector que GFP-JBD19, pero con un JBD mutado en cuatro residuos conservados tal como muestra la FIG. 1B; y JBD1-280 es el vector GFP unido a la JBD completa (aa 1-280). El constructo de expresión GFP-JBD19 prevenía la apoptosis de células  pancreáticas  inducida por IL-1 con la misma eficiencia que el JBD1-280 completo. Como controles adicionales, las secuencias mutadas en residuos IB1(s) completamente conservados tenían una capacidad muy reducida para prevenir la apoptosis.

Ejemplo 4: Importación celular de péptidos TAT-IB1 (s)

Se evaluó la capacidad de las formas enantioméricas L y D de los péptidos TAT y TAT-IB1 (“péptidos TAT-IB”) de la invención para entrar en las células. Los péptidos L-TAT, D-TAT, L-TAT-IB1(s) de la invención y DTAT-IB1(s) de la invención [SEQ ID Nº: 5, 6, 9 y 12, respectivamente] se marcaron mediante adición Nterminal de un residuo de glicina conjugado con fluoresceína. Los péptidos marcados (1 µM) se añadieron a cultivos de células TC-3, que se mantuvieron tal como se describe en el Ejemplo 3. En momentos determinados, las células se lavaron con PBS y se fijaron durante cinco minutos en metanol:acetona (1:1) sumamente frío antes de examinarlas bajo microscopio de fluorescencia. Como control se utilizó BSA marcada con fluoresceína (1 µM, 12 mol/mol de BSA). Los resultados demostraron que todos los péptidos marcados con fluoresceína arriba indicados habían entrado eficaz y rápidamente (menos de cinco minutos) en las células una vez añadidos al medio de cultivo. En cambio, la seroalbúmina bovina marcada con fluoresceína (BSA 1 µM, 12 moles de fluoresceína/mol de BSA) no entró en las células.

Un estudio de la evolución temporal demostró que la intensidad de la señal fluorescente en el caso de los péptidos enantioméricos L disminuía en un 70% después de un período de 24 horas. Después de 48 horas apenas había señal o no había señal en absoluto. En cambio, los péptidos D-TAT y D-TAT-IB1(s) de la invención eran extremadamente estables dentro de las células.

Las señales fluorescentes de estos péptidos retro-inverso totalmente D seguían siendo muy fuertes una semana después, y la señal solo había disminuido ligeramente 2 semanas después del tratamiento.

Ejemplo 5: Inhibición in vitro de la fosforilación de c-JUN, ATF2 y Elk1

Los efectos de los péptidos en la fosforilación mediada por JNK de sus factores de transcripción diana se investigaron in vitro. Se produjeron JNK1, JNK2 y JNK3 recombinantes y no activadas utilizando un kit de lisado de reticulocitos de conejo de TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN (Promega), y se utilizaron en ensayos de quinasa en fase sólida con c-Jun, ATF2 y Elk1, solos o fusionados con glutatión-S-transferasa (GST), como sustrato. Se llevaron a cabo estudios dosis-respuesta donde se mezclaron los péptidos L-TAT o L-TAT-IB1(s) de la invención (0-25 µM) con las quinasas JNK1, JNK2 o JNK3 recombinantes en un tampón de reacción (Tris-acetato 20 mM, EGTA 1 mM, p-nitrofenil-fosfato (pNPP) 10 mM, pirofosfato de sodio 5 mM,

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Se investigaron los efectos de los péptidos L-TAT-IB(s) en la promoción de la apoptosis de células  provocada por IL-1. Se incubaron cultivos de células TC-3 durante 30 minutos con 1 µM del L-TAT-IB1 (s) de la invención seguido de 10 ng/ml de IL-1. Veinticuatro horas después se realizó una segunda adición de péptido (1 µM). Las células apoptóticas se contaron después de dos días de incubación con IL-1  utilizando yoduro de propidio (las células teñidas de rojo son células muertas) y tinción nuclear Hoechst 33342 (las células teñidas de azul son células con la membrana plasmática intacta). La adición de péptidos TAT-IB(s) inhibía la apoptosis inducida por IL-1 de células TC-3 cultivadas en presencia de IL-1  durante dos días.

La inhibición a largo plazo de la muerte celular inducida por IL-1 se examinó tratando células TC-3 tal como se describe más arriba, excepto que la incubación de las células con los péptidos e IL-1  se mantuvo durante 12 días. Cada día se añadieron péptidos adicionales (1 µM) y cada 2 días se añadió IL-1  adicional (10 ng/ml). El péptido TAT-IB1(s) de la invención confiere una fuerte protección contra la apoptosis en estas condiciones. En conjunto, estos experimentos demuestran que los péptidos TAT-IB(s) son moléculas biológicamente activas capaces de prevenir los efectos de las señales de JNK en el destino de las células.

Ejemplo 9: Síntesis de los péptidos IB(s) retro-inversos totalmente D de la invención

Los péptidos de la invención pueden ser péptidos de aminoácidos totalmente D sintetizados en inverso para prevenir la proteólisis natural (es decir, péptidos retro-inverso totalmente D). Un péptido retro-inverso totalmente D de la invención proporcionaría un péptido con propiedades funcionales similares a las del péptido nativo donde los grupos laterales de los aminoácidos componentes corresponderían a la alineación del péptido nativo, pero que conservaría un esqueleto resistente a la proteasa.

Los péptidos retro-inversos de la invención son análogos sintetizados utilizando aminoácidos D mediante la unión de los aminoácidos en una cadena peptídica de modo que la secuencia de aminoácidos en el análogo del péptido retro-inverso es exactamente opuesta a la del péptido seleccionado que sirve como modelo. Por ejemplo, si la proteína TAT natural (formada por aminoácidos L) tiene la secuencia GRKKRRQRRR [SEQ ID Nº: 5], el análogo de péptido retro-inverso de este péptido (formado por aminoácidos D) tendría la secuencia RRRQRRKKRG [SEQ ID Nº: 6]. En la técnica se conocen procedimientos para sintetizar una cadena de aminoácidos D para formar los péptidos retro-inversos (véase, por ejemplo, Jameson y col., Nature, 368,744746 (1994); Brady y col., Nature, 368,692-693 (1994); Guichard y col., J. Med. Chem. 39,2030-2039 (1996)). Específicamente, los retro-péptidos se produjeron mediante síntesis F-mock clásica y se analizaron mediante espectrometría de masas. Finalmente se purificaron por HPLC.

Dado que un problema inherente de los péptidos nativos es la degradación por proteasas naturales e inmunogenicidad inherente, los compuestos heterobivalentes o heteromultivalentes de esta invención se prepararán de modo que incluyan el “isómero retro-inverso” del péptido deseado. Por consiguiente, la protección del péptido frente a la proteólisis natural debería aumentar la eficacia del compuesto heterobivalente o heteromultivalente específico, tanto prolongando la vida media como disminuyendo la magnitud de la respuesta inmunitaria dirigida a la destrucción activa de los péptidos.

Ejemplo 10: Actividad biológica a largo plazo de los péptidos IB(s) retro-inversos totalmente D de la invención

La actividad biológica a largo plazo se predice para el heteroconjugado de péptido que contiene el D-TATIB(s) retro-inverso de la invención en comparación con el análogo de aminoácido L nativo debido a la protección del péptido D-TAT-IB(s) de la invención frente a la degradación por proteasas nativas, como se muestra en el Ejemplo 5.

Se analizó la inhibición de la muerte de células  pancreáticas inducida por IL-1  mediante el péptido D-TATIB1(s) de la invención. Las células TC-3 se incubaron tal como se describe más arriba durante 30 minutos con una única adición de los péptidos indicados (1 µM). Después se añadió IL-1 (10 ng/ml).

Después de dos días de incubación con IL-1 , las células apoptóticas se contaron empleando yoduro de propidio y tinción nuclear Hoechst 33342. En cada experimento se contó un mínimo de 1.000 células. Se indica el error estándar de la media (EEM), n=5. El péptido D-TAT-IB1 disminuyó la apoptosis inducida por IL1 en una magnitud similar a la disminución lograda con los péptidos L-TAT-IB.

También se analizó la inhibición a largo plazo de la muerte celular inducida por IL-1P mediante el péptido D-TAT-IB1. Células TC-3 se incubaron durante 30 minutos tal como se describe más arriba con una única adición de los péptidos indicados (1 µM). Luego se añadió IL-1  (10 ng/ml), seguida de la adición de la citoquina cada dos días. Después de 15 días de incubación con IL-1 se contaron las células apoptóticas usando yoduro de propidio y tinción nuclear Hoechst 33342. Obsérvese que una única adición del péptido TAT-IB1 no confiere protección a largo plazo. En cada experimento se contó un mínimo de 1.000 células. De

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El día antes del experimento se sembraron células HepG2 a razón de 3.000 células/pocillo. Después se añadieron concentraciones crecientes de interleucina-1 [IL-1()] o de factor de necrosis tumoral  [TNF(•)]

(a) para activar JNK durante 30 minutos. Las células se sometieron a lisis en Hepes 20 mM, 0,5% Tween pH 7,4 y se procesaron para AlphaScreen JNK. (b) Z’ para la actividad de JNK inducida por 10 ng/ml IL-1 y medida en 384 pocillos/placa (n=96). (c) Inhibición de actividad de JNK endógena inducida por IL-1 mediante inhibidores de JNK químicos [staurosporina (º) y SP600125 (•)]. (d) Efecto de los inhibidores peptídicos L-TAT-IB1 (s) de SEQ ID Nº: 9 [abreviada aquí como L-JNKi()] y D-TAT-IB1 (s) de acuerdo con SEQ ID Nº: 11 (abreviada aquí como D-JNKi(♦) y JBD () (corresponde a L-JNKI sin la secuencia TAT) en la actividad de JNK dependiente de IL-1. Todos los paneles son representativos de tres experimentos independientes (n=3).

Métodos: Ensayo de quinasa AlphaScreen

Principio: AlphaScreen es una tecnología basada en perlas no radiactivas utilizada para estudiar interacciones biomoleculares en un formato de microplaca. El acrónico ALPHA significa Amplified Luminiscence Proximity Homogeneus Assay (ensayo homogéneo de proximidad por luminiscencia amplificada). Este ensayo implica una interacción biológica que acerca estrechamente una perla “donante” y una perla “aceptadora”. Después tiene lugar una cascada de reacciones químicas que producen una señal amplificada. Tras excitación por láser a 680 nm, un fotosensibilizador (ftalocianina) en la perla “donante” convierte el oxígeno ambiental en estado singlete excitado. En sus 4 µs de vida media, la molécula de oxígeno singlete se puede difundir hasta aproximadamente 200 nm en solución y, si hay una perla “aceptadora” dentro de ese margen de proximidad, el oxígeno singlete reacciona con un derivado de tioxeno en la perla “aceptadora”, generando una quimioluminiscencia a 370 nm que activa adicionalmente los fluoróforos contenidos en la misma perla “aceptadora”. A continuación, los fluoróforos excitados emiten luz a 520-620 nm. En ausencia de perla “aceptadora”, el oxígeno singlete cae al estado básico y no se produce ninguna señal.

En primer lugar se diluyeron reactivos de quinasa (B-GST-cJun, anticuerpo anti-P-cJun y JNK3 activa) en tampón de quinasa (Tris-HCl 20 mM pH 7,6, MgCl2 10 mM, DTT 1 mM, Na3VO4 100 µM, 0,01% Tween-20) y se añadieron a pocillos (15 µl). Después se incubaron las reacciones en presencia de 10 µM de ATP durante 1 h a 23ºC. La detección se llevó a cabo mediante adición de 10 µl de mezcla de perlas (aceptador de Proteína A 20 µg/ml y donante de Estreptavidina 20 µg/ml), diluida en tampón de detección (Tris-HCl 20 mM pH 7,4, NaCl 20 mM, EDTA 80 mM, 0,3% BSA), seguida de otra hora de incubación a 23ºC en oscuridad. Para medir la actividad endógena de JNK se llevaron a cabo ensayos de quinasa tal como se describe más arriba, excepto que la JNK3 activa se sustituyó por lisados celulares y los componentes reactivos de quinasa se añadieron después de la lisis celular. El B-GST-cjun y el anticuerpo P-cJun se utilizaron en las mismas concentraciones, mientras que el ATP se utilizó en una concentración de 50 µM en lugar de 10 µM. La señal AlphaScreen se analizó directamente en el aparato Fusion o En Vision.

Ejemplo 18: Tratamiento de trauma por ruido

Se aplicó D-TAT-IB1(s) sobre la membrana de la ventana redonda de la cóclea de 3 grupos de cobayas (cada grupo con 6 animales) en 2 microlitros de una formulación de gel de un 2,6% de ácido hialurónico tamponado (Hylumed, Genzime Corp.) en una concentración de 100 µM bien 30 minutos antes del trauma por ruido (120 dB a 6 kHz durante 30 minutos), bien o 30 minutos o 4 horas después. Como control se utilizaron oídos no tratados. Los cambios en el umbral de audición se evaluaron mediante medida de la respuesta auditiva del tronco encefálico 20 minutos después del trauma por ruido (cambio temporal del umbral, TTS) y 15 días después del trauma (cambio permanente del umbral, PTS). La administración de D-TAT-IB1(s) protegió contra la pérdida permanente de audición incluso cuando se realizó después de la exposición a un ruido excesivo, en comparación con oídos no tratados. El efecto protector era más fuerte cuanto menor era el tiempo entre el trauma por ruido y la administración de D-TAT-IB1(s). Por consiguiente, D-TAT-IB1(s) es un compuesto otoprotector muy eficaz en caso de trauma por ruido.

A partir de la anterior descripción detallada de las realizaciones específicas de la invención, es evidente que se han descrito péptidos quiméricos bioactivos con permeabilidad celular y secuencias inhibidoras de JNK únicos. Aunque aquí se han dado a conocer detalladamente realizaciones particulares, se ha hecho a modo de ejemplo únicamente con fines ilustrativos, y no se ha de considerar que éstas limitan el alcance de las siguientes reivindicaciones adjuntas. En particular, el inventor cuenta con que se pueden realizar diversas sustituciones, alteraciones y modificaciones de la invención sin salirse del espíritu y el alcance de la misma tal como se define en las reivindicaciones.

Claims

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