ES2383495T3 - Utilización de inhibidores de péptidos con permeabilidad celular de la vía de transducción de señales de JNK para el tratamiento de enfermedades digestivas inflamatorias, crónicas o no crónicas - Google Patents

Abstract

Utilización de un péptido inhibidor de JNK consistente en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con laSEQ ID Nº: 2 o de un péptido quimérico consistente en un primer dominio y un segundo dominio unidos mediante unenlace covalente, comprendiendo el primer dominio una secuencia de tráfico y consistiendo el segundo dominio en unasecuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2, donde el primer dominio está unido al extremo C-terminaldel segundo dominio, para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades digestivasinflamatorias crónicas o no crónicas en un sujeto.

Description

Utilización de inhibidores de péptidos con permeabilidad celular de la vía de transducción de señales de JNK para el tratamiento de enfermedades digestivas inflamatorias, crónicas o no crónicas

La presente invención se refiere al uso de inhibidores de la proteína-quinasa y más específicamente al uso de inhibidores de la proteína quinasa c-Jun amino terminal, secuencias inhibidoras de JNK, péptidos quiméricos, así como de composiciones farmacéuticas que los contienen, para el tratamiento de enfermedades digestivas inflamatorias, crónicas o no crónicas, tales como colitis, incluyendo por ejemplo colitis ulcerosa, colitis de Crohn, colitis por derivación, colitis isquémica, colitis infecciosa, colitis fulminante, colitis química, colitis microscópica, colitis linfocítica y colitis atípica, etc.

Durante las últimas décadas ha aumentado significativamente la cantidad de enfermedades digestivas, en particular de enfermedades digestivas crónicas y no crónicas, en las civilizaciones occidentales, lo que representa un desafío considerable para su sistema de asistencia sanitaria pública. Las enfermedades digestivas son enfermedades pertenecientes al tracto gastrointestinal. Esto incluye enfermedades del esófago, del estómago, de la primera, segunda, tercera y cuarta parte del duodeno, del yeyuno, del íleon, del complejo ileocecal, del intestino grueso (colon ascendente, transversal y descendente), del colon sigmoideo y del recto. Las enfermedades digestivas inflamatorias crónicas se producen con frecuencia y se caracterizan por una inflamación del colon, tal como una colitis, incluyendo por ejemplo colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, colitis por derivación, colitis isquémica, colitis infecciosa, colitis fulminante, colitis química, colitis microscópica, colitis linfocítica, colitis colagenosa, colitis indeterminada y colitis atípica, etc. La colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn constituyen las dos principales enfermedades digestivas inflamatorias crónicas y los dos tipos principales de enfermedades intestinales inflamatorias. Tanto la enfermedad de Crohn como la colitis ulcerosa son enfermedades cuya incidencia ha aumentado rápidamente durante las últimas décadas. Por ejemplo, se estima que en Alemania entre aproximadamente un 0,01% y aproximadamente un 0,1% de la población, es decir, entre aproximadamente 10 y 100 personas de cada 100.000, padecen enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. Además, cada año se producen entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 incidencias de enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, con un ritmo creciente. Las mujeres padecen la enfermedad de Crohn de forma ligeramente más frecuente, siendo la relación hombre:mujer de la colitis ulcerosa de aproximadamente 1:1. La edad de máxima aparición de colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn oscila entre los 15 y los 30 años. La segunda edad de máxima aparición oscila entre los 60 y los 80 años.

La colitis ulcerosa es una forma de enfermedad intestinal inflamatoria (inflammatory bowel disease - IBD) y, como subtipo de la colitis, una enfermedad del intestino, específicamente del intestino grueso o del colon. Los síntomas de la colitis ulcerosa incluyen típicamente úlceras características o llagas abiertas en el colon. La colitis ulcerosa comienza normalmente en el recto y se propaga continuamente por las secciones proximales del intestino grueso o del colon. El tracto gastrointestinal superior normalmente no resulta afectado. Los síntomas principales de la enfermedad activa consisten habitualmente en diarrea mezclada con sangre, de aparición gradual, y los pacientes sufren típicamente dolor abdominal espasmódico. La colitis ulcerosa se asocia a diversas manifestaciones extraintestinales (dermatológicas, reumatológicas, oculares y otras). Se trata de una enfermedad intermitente, con períodos de síntomas exacerbados y períodos relativamente exentos de síntomas. Aunque la colitis ulcerosa no tiene causa conocida, se supone que existe un componente de sensibilidad genética. Además se supone que, en una persona susceptible, la enfermedad puede desencadenarse por factores ambientales. No obstante, los síntomas de la colitis ulcerosa raras veces disminuyen por sí mismos, sino que al contrario requieren tratamiento para remitir, especialmente cuando la enfermedad pasa a un estado crónico.

En general, la terapia de la colitis ulcerosa depende del grado y la distribución de la enfermedad y normalmente incluye el tratamiento con fármacos antiinflamatorios, inmunosupresión y terapia biológica dirigida a componentes específicos de la respuesta inmunitaria. En estados de la enfermedad con una actividad inflamatoria menor o media (colitis distal leve y moderada), típicamente cuando la enfermedad se limita al recto, una terapia común normalmente incluye la administración de 5-aminosalicilatos, como Pentasa® o Salofalk®. Alternativamente se puede administrar una medicación local empleando supositorios o enemas. Además se pueden administrar medicaciones que contienen esteroides, incluyendo, por ejemplo, hidrocortisona, budenosida, beclometasona (Betnesol®) o prednisona (Rectodelt®), especialmente en caso de terapia aguda. En estados de la enfermedad con una actividad inflamatoria alta, típicamente cuando la colitis ulcerosa se propaga por las secciones proximales del intestino grueso o del colon, en general se administran glucocorticoides tales como beclometasona (Betnesol®) o prednisona (Rectodelt®) o derivados de los mismos, por inyección intravenosa o administración en formas rectales u orales, o se administran inmunosupresores, por ejemplo azatioprina, metotrexato (MTX) o ciclosporina A. En algunos casos se puede aplicar una terapia con anticuerpos utilizando por ejemplo anticuerpos contra TNF-alfa (INFLIXIMAB) o anti-CD4. En casos de estados de enfermedad crónica grave, que no responden a la terapia con medicación, a veces es necesaria una colorrectomía, es decir la extirpación quirúrgica parcial o total del intestino grueso, lo que, en algunos casos, se considera una cura para la enfermedad. Normalmente estas terapias disminuyen los síntomas de ataque agudo debido a colitis ulcerosa. Sin embargo, ninguna de ellas parece ofrecer una cura eficaz y duradera de esta enfermedad.

La enfermedad de Crohn (también conocida como enteritis regional) es otra enfermedad digestiva inflamatoria crónica importante. Se trata de un subtipo de enfermedad intestinal inflamatoria (inflammatory bowel disease - IBD) episódica crónica que afecta a toda la pared intestinal. A diferencia de la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn puede afectar a cualquier parte del tracto gastrointestinal completo y, en consecuencia, los síntomas de la enfermedad de Crohn varían entre los individuos que la padecen. La enfermedad se caracteriza por áreas de inflamación con zonas de pared normal entre ellas en un síntoma conocido como lesiones “intermitentes”. Los síntomas gastrointestinales principales consisten en dolor abdominal, diarrea, estreñimiento, vómitos y pérdida o aumento de peso. La enfermedad de Crohn también puede causar complicaciones fuera del tracto gastrointestinal tales como erupciones cutáneas, artritis e inflamación ocular. La enfermedad de Crohn afecta a entre 400.000 y 600.000 personas en Norteamérica (Loftus, E. V.; P. Schoenfeld, W. J. Sandborn (enero de 2002), "The epidemiology and natural history of Crohn’s disease in populationbased patient cohorts from North America: a systematic review", Alimentary Pharmacology & Therapeutics 16 (1): 5160.). Las estimaciones de prevalencia en el norte de Europa oscilan entre 27 y 48 por cada 100.000 (Bernstein, Charles

N. (julio de 2006), "The Epidemiology of Inflammatory Bowel Disease in Canada: A Population-Based Study", The American journal of Gastroenterology 101 (7): 1559-1568). Además, la enfermedad de Crohn tiende a aparecer inicialmente entre los 10 y los 30 años de edad, con otro pico de incidencia en las edades entre 50 y 80 años, aunque la enfermedad se puede producir a cualquier edad (Hanauer, Stephen B. (marzo de 1996), "Inflammatory bowel disease", New England Journal of Medicine 334 (13): 841-848; Gopal, Latha; Senthil Nachimuthu (2006-05-23), Chrohns Disease, eMedicine). La causa de la enfermedad de Crohn es desconocida, no obstante se cree que se trata de una enfermedad autoinmune de relación genética. El mayor riesgo relativo tiene lugar en hermanos, afectando con una frecuencia ligeramente mayor a las mujeres. Los fumadores tienen tres veces más probabilidades de padecer la enfermedad de Crohn. Para hacer remitir la enfermedad y mantener esta remisión se utiliza una serie de tratamientos médicos. Estos tratamientos médicos incluyen, entre otros, formulaciones de ácido 5-aminosalicílico (5-ASA) (cápsulas de Pentasa®, pastillas de Asacol, pastillas de Lialda, enemas de retención Rowasa), medicaciones de esteroides, la administración de inmunomoduladores (por ejemplo azatioprina, mercaptopurina (6-MP) y metotrexato) y nuevas medicaciones biológicas, tales como anticuerpos anti-TNA-alfa (por ejemplo INFLIXIMAB® y ADALIMUMAB®). De modo similar al arriba descrito en relación con la colitis ulcerosa, en general estas terapias disminuyen los síntomas de un ataque agudo por la enfermedad de Crohn. Sin embargo, ninguna de ellas parece posibilitar una cura eficaz y duradera de la enfermedad de Crohn (a excepción del anti-TNF-alfa, pero éste muestra un riesgo elevado de efectos secundarios).

Otras formas de colitis incluyen, por ejemplo, colitis por derivación, colitis isquémica, colitis infecciosa, colitis fulminante, colitis química, colitis microscópica, colitis linfocítica, colitis colagenosa, colitis indeterminada y colitis atípica, etc. Sin embargo, no existe ninguna cura eficaz y duradera sin riesgo de efectos secundarios para ninguna de estas enfermedades. Por consiguiente, en la técnica existe una necesidad urgente de medicamentos alternativos o mejorados que posibiliten terapias nuevas, y preferentemente mejoradas, para las enfermedades arriba indicadas.

Así, el objeto de la presente invención es proporcionar terapias alternativas o mejoradas que posibiliten una cura nueva y preferentemente mejorada de enfermedades digestivas (inflamatorias) crónicas o no crónicas tales como colitis, incluyendo por ejemplo colitis ulcerosa, colitis de Crohn, colitis por derivación, colitis isquémica, colitis infecciosa, colitis fulminante, colitis química, colitis microscópica, colitis linfocítica y colitis atípica, etc.

Este objeto se resuelve mediante la utilización de una secuencia inhibidora de JNK tal como se define en la reivindicación 1 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar enfermedades digestivas inflamatorias crónicas o no crónicas en un sujeto.

Tal como se utiliza aquí, el concepto “enfermedad digestiva inflamatoria crónica o no crónica” significa típicamente enfermedades inflamatorias crónicas o no crónicas pertenecientes al tracto gastrointestinal. Esto incluye enfermedades del esófago, el estómago, la primera, segunda, tercera y cuarta parte del duodeno, el yeyuno, el íleon, el complejo ileocecal, el intestino grueso (colon ascendente, transversal y descendente), el colon sigmoideo y el recto. En este contexto están incluidas preferentemente enfermedades digestivas inflamatorias crónicas, que se caracterizan por una inflamación del colon tal como colitis, incluyendo por ejemplo colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, colitis por derivación, colitis isquémica, colitis infecciosa, colitis fulminante, colitis química, colitis microscópica, colitis linfocítica, colitis colagenosa, colitis indeterminada y colitis atípica, etc.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que estas secuencias inhibidoras de JNK son adecuadas para tratar dichas enfermedades digestivas inflamatorias crónicas o no crónicas en un sujeto. Esto no era obvio ni el estado anterior de la técnica lo sugería, aunque de la técnica se conocen en general secuencias inhibidoras de JNK.

JNK es la abreviatura de “quinasa c-Jun amino terminal”, un miembro del grupo activado por estrés de las proteínaquinasas activadas por mitógeno (MAP). Estas quinasas se han relacionado con el control del crecimiento y la diferenciación celular y, más generalmente, con las respuestas elulares a estímulos ambientales. La vía de transducción de las señales de JNK se activa en respuesta al estrés ambiental y mediante la intervención de diversas clases de receptores de la superficie celular. Estos receptores de la superficie celular pueden incluir receptores de citoquina, receptores de serpentina y tirosina-quinasas receptoras. En células de mamíferos, la JNK se ha relacionado con procesos biológicos tales como la transformación oncogénica y la mediación de respuestas de adaptación al estrés ambiental. La JNK también se ha asociado a la modulación de las respuestas inmunitarias, incluyendo la maduración y diferenciación de inmunocitos, y con la ejecución de la muerte celular programada en células identificadas para la destrucción por el sistema inmunológico. Esta propiedad única hacía que las señales de JNK fueran un objetivo prometedor para el desarrollo de una intervención farmacológica. Sin embargo, hasta la fecha sólo se ha demostrado un efecto farmacológico de las secuencias inhibidoras de JNK para una cantidad limitada de enfermedades, incluyendo varios trastornos neurológicos tales como ataques isquémicos y la enfermedad de Parkinson, pudiendo incluir estas

secuencias inhibidoras de JNK inhibidores de quinasa aguas arriba (por ejemplo CEP-1347), inhibidores químicos pequeños de JNK (SP600125 y AS601245) que afectan directamente a la actividad quinasa, por ejemplo competiendo con el sitio de unión de ATP de la proteína-quinasa, e inhibidores peptídicos de la interacción entre JNK y sus sustratos (D-JNKI e I-JIP) (véase, por ejemplo, Kuan y col., Current Drug Targets - CNS & Neurological Disorders, febrero de 2005, vol. 4, nº 1, pp. 63-67(5)). En este contexto, el inhibidor de quinasa aguas arriba CEP-1347 (KT7515) es un inhibidor semisintético de la familia de las quinasas de linaje mixto. El CEP-1347 (KT7515) promueve la supervivencia neuronal en dosis que inhiben la activación de las quinasas c-Jun amino terminales (JNK) en cultivos embrionarios primarios y células PC12 diferenciadas después de retirada trófica y en ratones tratados con 1-metil-4feniltetrahidropiridina. Además se ha observado que el CEP-1347 (KT7515) promueve la supervivencia a largo plazo de neuronas cultivadas simpáticas, ciliares y motoras del ganglio de la raíz dorsal embrional de pollo (véase, por ejemplo, Borasio y col., Neuroreport. 9(7): 1435-1439, 11 de mayo de 1998). Se ha comprobado que el inhibidor químico pequeño de JNK SP600125 reduce los niveles de fosforilación de c-Jun protegiendo a las neuronas dopaminérgicas frente a la apoptosis y restaura en parte el nivel de dopamina en caso de enfermedad de Parkinson inducida por MPTP en ratones C57BL/6N (Wang y col., Neurosci Res. Febrero de 2004; 48(2); 195-202). Estos resultados indicaban que la vía de JNK es la principal mediadora de los efectos neurotóxicos del MPTP in vivo y que la inhibición de la actividad de JNK puede constituir una estrategia nueva y eficaz para tratar la enfermedad de Parkinson. Otro ejemplo de inhibidores químicos pequeños es el inhibidor de JNK AS601245 arriba mencionado. El AS601245 inhibe la vía de señales de JNK y promueve la supervivencia celular después de una isquemia cerebral. El AS601245 ha proporcionado in vivo una protección significativa contra la pérdida retrasada de neuronas CA1 del hipocampo en un modelo de jerbo de isquemia global transitoria. Este efecto está mediado por la inhibición de JNK y, por consiguiente, por la expresión y fosforilación de c-Jun (véase, por ejemplo, Carboni y col., J Pharmacol Exp Ther. Julio de 2004; 310(1):25-32. Epub 26 de febrero de 2004). Sin embargo, resumiendo lo arriba expuesto, los efectos farmacológicos demostrados de estas secuencias inhibidoras de JNK sólo han mostrado ser útiles para una cantidad limitada de enfermedades, en particular diversos trastornos neurológicos tales como ataques isquémicos y la enfermedad de Parkinson. Por consiguiente, resulta sorprendente que se puedan utilizar secuencias inhibidoras de JNK para el tratamiento de enfermedades digestivas inflamatorias crónicas o no crónicas.

En general, la secuencia inhibidora de JNK tal como se utiliza aquí se une a JNK y/o inhibe la activación de al menos un factor de transcripción activado por JNK, por ejemplo c-Jun o ATF2 (véanse, por ejemplo, las SEQ ID Nº: 15 y 16, respectivamente) o Elk1.

Del mismo modo, la secuencia inhibidora de JNK tal como se utiliza aquí consiste en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2.

La secuencia inhibidora de JNK tal como se utiliza aquí está compuesta por D-aminoácidos.

La secuencia D retro-inversa tal como se utiliza aquí y tal como se define más arriba tiene diversas propiedades útiles. Por ejemplo, la secuencia D retro-inversa tal como se utiliza aquí entra en las células tan eficientemente como las secuencias de L-aminoácidos, mientras que la secuencia D retro-inversa tal como se utiliza aquí es más estable que las secuencias de L-aminoácidos correspondientes.

Adicionalmente, las secuencias inhibidoras de JNK tal como se utilizan aquí pueden comprender o consistir en al menos una secuencia D retro-inversa de acuerdo con la secuencia de aminoácidos que comprende el dominio de unión de JNK (JBD) de IB1 TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD (D-IB1) (SEQ ID Nº: 18). La secuencia inhibidora de JNK tal como se utiliza aquí comprende la secuencia D retro-inversa de acuerdo con la secuencia de aminoácidos NH2-DQSRPVQPFLNlTTPRKPR-COOH (D-IB1(s)) [SEQ ID Nº: 2].

En la Tabla 1 se presentan secuencias inhibidoras de JNK comparativas tal como se utiliza aquí y tal como se describen más arriba (SEQ ID Nº: 1, 3, 4, 13-20 y 33-100). La tabla muestra el nombre de las secuencias inhibidoras de JNK tal como se utilizan aquí y también su número identificador de secuencia, su longitud y la secuencia de aminoácidos. Además, la Tabla 1 muestra secuencias y sus fórmulas genéricas, por ejemplo para las SEQ ID Nº: 1, 2, 5, 6, 9 y 11 y las SEQ ID Nº: 3, 4, 7, 8, 10 y 12, respectivamente. La Tabla 1 también presenta las secuencias quiméricas SEQ ID Nº: 9-12 y 23-32 (véase más abajo), las secuencias de L-IB1 SEQ ID Nº: 33 a 66 y las secuencias de D-IB1 SEQ ID Nº: 67 a 100.

Tabla 1

NOMBRE DE PÉPTIDO/ SECUENCIA

SEQ ID Nº AA SECUENCIA

L-IB1(s)

1 19

NOMBRE DE PÉPTIDO/ SECUENCIA

SEQ ID Nº AA SECUENCIA

D-IB1(s)

2 19

L-IB (genérico) (s)

3 19 NH2-Xn b-Xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH

D-IB (genérico) (s)

4 19 NH2-Xn b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn a-Xn b-COOH

L-TAT

5 10

D-TAT

6 10

L-genérico-TAT (s)

7 11 NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-COOH

D-genérico-TAT (s)

8 11 NH2-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH

L-TAT-IB1 (s)

9 31

L-TAT-IB (genérico) (s)

10 29 NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-Xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH

D-TAT-IB1 (s)

11 31

D-TAT-IB (genérico) (s)

12 29 NH2-Xn b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH

IB1-largo

13 29

IB2-largo

14 27

c-Jun

15 29

ATF2

16 29

L-IB1

17 23

D-IB1

18 23

L-IB (genérico)

19 19

D-IB (genérico)

20 19

L-genérico-TAT

21 17

D-genérico-TAT

22 17 XXXXRRRQRRKKRXXXX

(NH2- XXXXRRRQRRKKRXXXX -COOH)

NOMBRE DE PÉPTIDO/ SECUENCIA

SEQ ID Nº AA SECUENCIA

L-TAT-IB1

23 35

L-TAT-IB (genérico)

24 42

D-TAT-IB1

25 35

D-TAT-IB (genérico)

26 42

L-TAT-IB1 (s1)

27 30

L-TAT-IB1 (s2)

28 30

L-TAT-IB1 (s3)

29 29

D-TAT-IB1 (s1)

30 30

D-TAT-IB1 (s2)

31 30

D-TAT-IB1 (s3)

32 29

L-IB1 (s1)

33 13

L-IB1 (s2)

34 13

L-IB1 (s3)

35 13

L-IB1 (s4)

36 13

L-IB1 (s5)

37 13

L-IB1 (s6)

38 13

L-IB1 (s7)

39 13

L-IB1 (s8)

40 12

NOMBRE DE PÉPTIDO/ SECUENCIA

SEQ ID Nº AA SECUENCIA

L-IB1 (s9)

41 12

L-IB1 (s10)

42 12

L-IB1 (s11)

43 12

L-IB1 (s12)

44 12

L-IB1 (s13)

45 12

L-IB1 (s14)

46 12

L-IB1 (s15)

47 12

L-IB1 (s16)

48 11

L-IB1 (s17)

49 11

L-IB1 (s18)

50 11

L-IB1 (s19)

51 11

L-IB1 (s20)

52 11

L-IB1 (s21)

53 11

L-IB1 (s22)

54 11

L-IB1 (s23)

55 11

L-IB1 (s24)

56 11

L-IB1 (s25)

57 10

L-IB1 (s26)

58 10

L-IB1 (s27)

59 10

NOMBRE DE PÉPTIDO/ SECUENCIA

SEQ ID Nº AA SECUENCIA

L-IB1 (s28)

60 10

L-IB1 (s29)

61 10

L-IB1 (s30)

62 10

L-IB1 (s31)

63 10

L-IB1 (s32)

64 10

L-IB1 (s33)

65 10

L-IB1 (s34)

66 10

D-IB1 (s1)

67 13

D-IB1 (s2)

68 13

D-IB1 (s3)

69 13

D-IB1 (s4)

70 13

D-IB1 (s5)

71 13

D-IB1 (s6)

72 13

D-IB1 (s7)

73 13 DQSRPVQPFLNLT (NH2-DQSRPVQPFLNLT-COOH)

D-IB1 (s8)

74 12

D-IB1 (s9)

75 12

D-IB1 (s10)

76 12

D-IB1 (s11)

77 12

D-IB1 (s12)

78 12

NOMBRE DE PÉPTIDO/ SECUENCIA

SEQ ID Nº AA SECUENCIA

D-IB1 (s13)

79 12

D-IB1 (s14)

80 12

D-IB1 (s15)

81 12

D-IB1 (s16)

82 11

D-IB1 (s17)

83 11

D-IB1 (s18)

84 11

D-IB1 (s19)

85 11

D-IB1 (s20)

86 11

D-IB1 (s21)

87 11

D-IB1 (s22)

88 11

D-IB1 (s23)

89 11

D-IB1 (s24)

90 11

D-IB1 (s25)

91 10

D-IB1 (s26)

92 10

D-IB1 (s27)

93 10

D-IB1 (s28)

94 10

D-IB1 (s29)

95 10

D-IB1 (s30)

96 10

D-IB1 (s31)

97 10

D-IB1 (s32)

98 10

NOMBRE DE PÉPTIDO/ SECUENCIA

SEQ ID Nº AA SECUENCIA

D-IB1 (s33)

99 10

D-IB1 (s34)

100 10

Las secuencias inhibidoras de JNK tal como se utilizan aquí pueden consistir además en un derivado de secuencias de aminoácidos (no nativos) de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2 tal como se define más arriba. En este contexto, un “derivado de una secuencia de aminoácidos (no nativos) de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2” consiste preferentemente en una secuencia de aminoácidos derivada de la SEQ ID Nº: 2, incluyendo el derivado al menos un D-aminoácido (que forma aminoácido(s) no natural(es)), preferentemente de 1 a 20, de forma especialmente preferente de 1 a 10 y de forma particularmente preferente de 1 a 5 D-aminoácidos modificados. A este respecto, un “aminoácido modificado” puede ser cualquier aminoácido que está alterado, por ejemplo por una glicosilación diferente en diversos organismos, por fosforilación o por marcado de aminoácidos específicos. En este caso, el marcador se selecciona típicamente de entre el grupo de marcadores que incluye:

i) marcadores radiactivos, es decir, fosforilación radiactiva o un marcador radiactivo con azufre, hidrógeno, carbono, nitrógeno, etc.;

ii)

tintes colorantes (por ejemplo digoxigenina, etc.);

iii)

grupos fluorescentes (por ejemplo fluoresceína, etc.);

iv)

grupos quimioluminiscentes;

v)

grupos para la inmovilización en fase sólida (por ejemplo His-tag, biotina, strep-tag, flag-tag, anticuerpos,

antígeno, etc.); y

vi) combinaciones de dos o más de los marcadores mencionados en los puntos (i) a (v).

Las secuencias inhibidoras de JNK tal como se utilizan de acuerdo con la presente invención y tal como se definen más arriba se pueden obtener o producir mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante síntesis química tal como se describe más abajo. Por ejemplo, un péptido correspondiente a una porción de una secuencia inhibidora de JNK tal como se utiliza aquí que incluye una región deseada de dicha secuencia inhibidora de JNK, o que media en la actividad deseada in vitro o in vivo, se puede sintetizar mediante el uso de un sintetizador peptídico.

Una secuencia inhibidora de JNK tal como se utiliza aquí y tal como se define más arriba se puede modificar además con una secuencia de tráfico que posibilita un tráfico eficaz de la secuencia inhibidora de JNK tal como se utiliza aquí y tal como se define más arriba hasta el interior de las células. Preferentemente, estas secuencias inhibidoras de JNK modificadas se proporcionan y utilizan en forma de secuencias quiméricas.

Por consiguiente, de acuerdo con un segundo aspecto, la presente invención proporciona el uso de un péptido quimérico que consiste en un primer dominio y un segundo dominio, para preparar una composición farmacéutica para tratar enfermedades digestivas inflamatorias crónicas y no crónicas en un sujeto, comprendiendo el primer dominio del péptido quimérico una secuencia de tráfico, mientras que el segundo dominio del péptido quimérico consiste en una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2, y estando unido el primer dominio al extremo C-terminal del segundo dominio.

En general, los péptidos quiméricos utilizados de acuerdo con la presente invención tienen una longitud de al menos 24 residuos aminoácidos, por ejemplo de 25 a 250, preferentemente de 25 a 200, de forma especialmente preferente de 25 a 150, con particular preferencia de 25 a 100 y de forma totalmente preferente de 25 a 50 residuos aminoácidos.

Preferentemente, el péptido quimérico tal como se utiliza aquí comprende, como primer dominio, una secuencia de tráfico, que consiste típicamente en cualquier secuencia de aminoácidos que dirija un péptido (en el que dicha secuencia está presente) a un destino celular deseado. Por consiguiente, la secuencia de tráfico, tal como se utiliza aquí, dirige típicamente el péptido a través de la membrana plasmática, por ejemplo desde el exterior de la célula a través de la membrana plasmática hasta el interior del citoplasma. Alternativa o adicionalmente, la secuencia de tráfico puede dirigir el péptido a un lugar deseado dentro de la célula, por ejemplo el núcleo, el ribosoma, el retículo endoplásmico (RE), un lisosoma o peroxisoma, por ejemplo combinando dos componentes (por ejemplo un componente para la permeabilidad celular y un componente para la localización del núcleo) o mediante un único componente que tenga por ejemplo las propiedades de transporte a través de la membrana celular y de transporte dirigido, por ejemplo intracelular. La secuencia de tráfico puede comprender adicionalmente otro componente que se pueda unir a un componente citoplásmico o a cualquier otro componente o compartimento de la célula (por ejemplo retículo endoplásmico, mitocondria, aparato de gloom, vesículas lisosomales). Por consiguiente, por ejemplo la secuencia de tráfico del primer dominio y la secuencia inhibidora de JNK del segundo dominio se pueden localizar en el citoplasma o en cualquier otro compartimento celular. Esto permite determinar la localización del péptido quimérico en la célula después de la absorción.

Preferentemente, la secuencia de tráfico (incluida en el primer dominio del péptido quimérico tal como se utiliza aquí) tiene una longitud de 5 a 150 secuencias de aminoácido, de forma especialmente preferente una longitud de 5 a 100 y de forma totalmente preferente una longitud de 5 a 50, de 5 a 30 o incluso de 5 a 15 aminoácidos.

De forma especialmente preferente, la secuencia de tráfico (contenida en el primer dominio del péptido quimérico tal como se utiliza aquí) puede consistir en un tramo continuo de secuencia de aminoácidos del primer dominio. Alternativamente, la secuencia de tráfico del primer dominio se puede dividir en dos o más fragmentos, pareciéndose todos estos fragmentos a la secuencia de tráfico completa y pudiendo estar separados entre sí por 1 a 10, preferentemente 1 a 5 aminoácidos, siempre que la secuencia de tráfico como tal conserve sus propiedades de transporte arriba descritas. Estos aminoácidos que separan los fragmentos de la secuencia de tráfico se pueden seleccionar por ejemplo entre secuencias de aminoácidos diferentes a la secuencia de tráfico. Alternativamente, el primer dominio puede incluir una secuencia de tráfico compuesta por más de un componente, teniendo cada componente su propia función para el transporte de la secuencia inhibidora de JNK de carga del segundo dominio por ejemplo a un compartimento celular específico.

La secuencia de tráfico tal como se define más arriba puede estar compuesta por L-aminoácidos, D-aminoácidos o combinaciones de ambos. Preferentemente, las secuencias de tráfico (incluidas en el primer dominio del péptido quimérico tal como se utiliza aquí) pueden comprender al menos 1 o incluso 2, preferiblemente al menos 3, 4 o 5, de forma especialmente preferente al menos 6, 7, 8 o 9 y de forma particularmente preferente al menos 10 o más D- y/o Laminoácidos, pudiendo estar dispuestos los D- y/o L-aminoácidos en las secuencias de tráfico de JNK por bloques, no por bloques o de forma alterna.

De acuerdo con una realización alternativa, la secuencia de tráfico del péptido quimérico tal como se utiliza aquí puede estar compuesta exclusivamente por L-aminoácidos. De forma especialmente preferente, la secuencia de tráfico del péptido quimérico tal como se utiliza aquí comprende o consiste en al menos una secuencia de tráfico “nativa” tal como se define más arriba. En este contexto, el término “nativo” se refiere a secuencias de tráfico no alteradas compuestas totalmente por L-aminoácidos.

De acuerdo con otra realización alternativa, la secuencia de tráfico del péptido quimérico tal como se utiliza aquí puede estar compuesta exclusivamente por D-aminoácidos. De forma especialmente preferente, la secuencia de tráfico del péptido quimérico tal como se utiliza aquí puede comprender un péptido D retro-inverso de las secuencias arriba presentadas.

La secuencia de tráfico del primer dominio del péptido quimérico tal como se utiliza aquí se puede obtener de fuentes naturales o se puede producir utilizando técnicas de ingeniería genética o síntesis química (véase, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Se pueden emplear fuentes para la secuencia de tráfico del primer dominio, incluyendo, por ejemplo, proteínas nativas tales como la proteína TAT (Patentes US Nº 5.804.604 y 5.674.980, documentos incorporados aquí por referencia), VP22 (descrita por ejemplo en WO 97/05265; Elliott y O’Hare, Cell 88: 223-233 (1997)), proteínas no virales (Jackson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10691-10695 (1992)), secuencias de tráfico derivadas de Antennapedia (por ejemplo la secuencia portadora de antennapedia) o de péptidos básicos, por ejemplo péptidos con una longitud de 5 a 15 aminoácidos, preferentemente de 10 a 12 aminoácidos, y que comprenden al menos un 80%, de forma especialmente preferente un 85% o incluso un 90% de aminoácidos básicos, por ejemplo arginina, lisina y/o histidina. Además, aquí se dan a conocer variantes, fragmentos y derivados de una de las proteínas nativas utilizadas como secuencias de tráfico. Con respecto a las variantes, fragmentos y derivados, se hace referencia a la definición dada más arriba para las secuencias inhibidoras de JNK tal como se utilizan aquí. Las variantes, fragmentos y derivados se definen correspondientemente tal como se expone más arriba para las secuencias inhibidoras de JNK tal como se utilizan aquí. En particular, en el contexto de la secuencia de tráfico, una variante, fragmento o derivado se puede definir como una secuencia que comparte una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o incluso 99% con una de las proteínas nativas utilizadas como secuencias de tráfico tal como se definen más arriba.

En una realización preferente del péptido quimérico tal como se utiliza aquí, la secuencia de tráfico del primer dominio comprende o consiste en una secuencia derivada de la proteína TAT 1 del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), en particular algunos o todos los 86 aminoácidos que componen la proteína TAT.

Para una secuencia de tráfico (incluida en el primer dominio del péptido quimérico tal como se utiliza aquí) se pueden utilizar secuencias parciales de la proteína TAT de longitud completa que forman un fragmento funcionalmente efectivo de una proteína TAT, es decir un péptido TAT que incluye la región que media en la entrada y la absorción celular. Se puede determinar utilizando técnicas conocidas si una frecuencia consiste en un fragmento funcionalmente efectivo de la proteína TAT (véase, por ejemplo, Franked y col., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86: 7397-7401 (1989)). Por consiguiente, la secuencia de tráfico en el primer dominio del péptido quimérico tal como se utiliza aquí se puede derivar de un fragmento o porción funcionalmente efectivos de una secuencia de proteína TAT que comprende menos de 86 aminoácidos y que demuestra una absorción en las células y opcionalmente una absorción en el núcleo celular. De forma especialmente preferente está previsto que las secuencias parciales (fragmentos) de TAT a utilizar como vehículo para mediar en la permeabilidad del péptido quimérico a través de la membrana celular comprendan la región básica (aminoácidos 48 a 57 o 49 a 57) de la TAT de longitud completa.

De acuerdo con una realización especialmente preferente, la secuencia de tráfico (incluida en el primer dominio del péptido quimérico tal como se utiliza aquí) puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos que contiene los residuos TAT 48-57 o 49 a 57, y de forma totalmente preferente una secuencia TAT genérica NH2-XnbRKKRRQRRR-Xnb-COOH (L-genérico-TAT (s)) [SEQ ID Nº: 7] y/o XXXXRKKRRQ RRRXXXX (L-genérico-TAT) [SEQ ID Nº: 21], donde X o Xnb tienen el significado arriba definido. Además, la cantidad de residuos “Xnb” en la SEQ ID Nº: 8 no está limitada a la cantidad representada, pudiendo variar tal como se describe más arriba. Alternativamente, la secuencia de tráfico incluida en el primer dominio del péptido quimérico tal como se utiliza aquí puede comprender o consistir en un péptido que contiene por ejemplo la secuencia de aminoácidos NH2-GRKKRRQRRR-COOH (L-TAT) [SEQ ID Nº: 5].

De acuerdo con otra realización especialmente preferente, la secuencia de tráfico (incluida en el primer dominio del péptido quimérico tal como se utiliza aquí) puede comprender un péptido retroinverso-D de las secuencias arriba mostradas, es decir, la secuencia retroinversa-D de la secuencia TAT genérica de secuencia NH2-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH (D-genérico-TAT (s)) [SEQ ID Nº: 8] y/o XXXXRRRQRRKKRXXXX (D-genérico-TAT) [SEQ ID Nº: 22]. También en este caso Xnb tiene el significado arriba definido (preferentemente representa D-aminoácidos). Además, la cantidad de residuos “Xnb” en la SEQ ID Nº: 8 no está limitada a la cantidad indicada y puede variar tal como se ha descrito anteriormente. De forma totalmente preferente, la secuencia de tráfico tal como se utiliza aquí puede comprender la secuencia retroinversa-D NH2-RRRQRRKKRG-COOH (D-TAT) [SEQ ID Nº: 6].

De acuerdo con otra realización, la secuencia de tráfico incluida en el primer dominio del péptido quimérico tal como se utiliza aquí puede comprender o consistir en variantes de las secuencias de tráfico arriba definidas. Una “variante de una secuencia de tráfico” consiste preferentemente en una secuencia derivada de una secuencia de tráfico tal como se ha definido, comprendiendo la variante una modificación, por ejemplo por adición, deleción (interna) (que conduce a fragmentos) y/o sustitución de al menos un aminoácido presente en la secuencia de tráfico definida. En general, esta o estas modificaciones comprenden de 1 a 20, preferentemente de 1 a 10 y de forma especialmente preferente de 1 a 5 sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos. Además, la variante presenta preferentemente una identidad de secuencia preferentemente con cualquiera de las SEQ ID Nº: 5 a 8 o 21-22 de al menos aproximadamente un 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o incluso 99% con la secuencia de tráfico tal como se ha definido más arriba.

Preferentemente, tal modificación de la secuencia de tráfico incluida en el primer dominio del péptido quimérico tal como se utiliza aquí conduce a una secuencia de tráfico que presenta una estabilidad aumentada o reducida. Alternativamente se pueden diseñar variantes de la secuencia de tráfico para modular la localización intracelular del péptido quimérico tal como se utiliza aquí. Cuando se añaden de forma exógena, estas variantes arriba definidas se diseñan típicamente de modo que conservan la capacidad de la secuencia de tráfico de penetrar en las células (es decir, la absorción de la variante de la secuencia de tráfico en la célula es esencialmente similar a la de la proteína nativa utilizada como secuencia de tráfico). Por ejemplo, la alteración de la región básica considerada importante para la localización nuclear (véase, por ejemplo, Dang y Lee, J. Biol. Chem. 264: 18019-18023 (1989); Hauber y col., J. Virol. 63: 1181-1187 (1989); y col., J. Virol. 63: 1-8 (1989)) puede conducir a una localización citoplásmica o una localización parcialmente citoplásmica de la secuencia de tráfico y, en consecuencia, de la secuencia inhibidora de JNK como componente del péptido quimérico tal como se utiliza aquí. Además de lo arriba expuesto, también se pueden introducir otras modificaciones en la variante, por ejemplo uniendo por ejemplo colesterol u otras fracciones lipídicas a la secuencia de tráfico para producir una secuencia de tráfico de mayor solubilidad de membrana. Cualquiera de las variantes arriba descritas de las secuencias de tráfico incluidas en el primer dominio del péptido quimérico tal como se utiliza aquí se puede producir utilizando técnicas generalmente conocidas por los especialistas (véase, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual. 2ª edición. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

En general, el péptido quimérico tal como se utiliza aquí comprende como segundo dominio cualquiera de las secuencias inhibidoras de JNK arriba definidas, incluyendo variantes, fragmentos y/o derivados de estas secuencias inhibidoras de JNK.

Los dos dominios, es decir, el primer y el segundo dominio del péptido quimérico tal como se utiliza aquí, están unidos de modo que forman una unidad funcional. Para unir el primer y el segundo dominio se puede emplear cualquier método bien conocido en la técnica.

De acuerdo con una realización, el primer y el segundo dominio del péptido quimérico tal como se utiliza aquí están unidos preferentemente por un enlace covalente. Un enlace covalente, tal como se define aquí, puede consistir por ejemplo en un enlace peptídico.

No obstante, los dos dominios también pueden estar unidos mediante cadenas laterales o por una fracción de un enlazante químico.

El primer y el segundo dominio del péptido quimérico tal como se utiliza aquí están presentes en una copia simple, el primer dominio unido al extremo C-terminal del segundo dominio.

Preferentemente, el primer y el segundo dominio pueden estar unidos directamente entre sí sin ningún enlazante. Alternativamente pueden estar unidos entre sí a través de una secuencia de enlace que incluye de 1 a 10, preferentemente de 1 a 5 aminoácidos. Los aminoácidos que forman la secuencia de enlace se seleccionan preferentemente entre glicina o prolina como residuos de aminoácido. De forma especialmente preferente, el primer y el segundo dominio pueden estar separados entre sí por una bisagra de dos, tres o más residuos prolina entre el primer y el segundo dominio.

De acuerdo con una realización específica alternativa, el péptido quimérico tal como se utiliza aquí consiste en péptidos quiméricos de D-aminoácidos de acuerdo con el péptido TAT-IB1:

NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH (DTAT-IB1(s))

[SEQ ID Nº: 11].

El primer y el segundo dominio del péptido quimérico tal como se define más arriba pueden estar unidos entre sí mediante acoplamiento químico o bioquímico realizado de cualquier forma adecuada conocida en la técnica, por ejemplo estableciendo un enlace peptídico entre el primer y el segundo dominio, por ejemplo reticulando el primer y el segundo dominio del péptido quimérico tal como se define más arriba.

Muchos de los métodos conocidos adecuados para la reticulación química del primer y el segundo dominio del péptido quimérico tal como se define más arriba no son específicos, es decir no dirigen el punto de acoplamiento a ningún sitio particular del polipéptido de transporte o de la macromolécula de carga. En consecuencia, el uso de agentes reticulantes no específicos puede atacar sitios funcionales o bloquear estéricamente sitios activos, volviendo a las proteínas conjugadas biológicamente inactivas. Por consiguiente, preferentemente se utilizan métodos de reticulación que permiten un acoplamiento más específico del primer y el segundo dominio.

En este contexto, un modo de incrementar la especificidad de acoplamiento consiste en un acoplamiento químico directo con un grupo funcional presente sólo una vez o unas pocas veces en el primer o en el segundo dominio a reticular, o en ambos. Por ejemplo, la cisteína, que es el único aminoácido proteínico que contiene un grupo tiol, aparece en muchas proteínas sólo unas pocas veces. También por ejemplo, si un polipéptido no contiene ningún residuo de lisina, un reactivo de reticulación específico con respecto a aminas primarias será selectivo para el extremo amino de dicho polipéptido. La utilización con éxito de este método para aumentar la especificidad de acoplamiento requiere que el polipéptido tenga los residuos reactivos y poco frecuentes adecuados en zonas de la molécula que puedan alterarse sin que ésta pierda su actividad biológica. Los residuos de cisteína se pueden sustituir cuando están presentes en partes de una secuencia polipeptídica donde, de otro modo, su participación en una reacción de reticulación probablemente interferiría en la actividad biológica. Cuando se sustituye un residuo cisteína en general es deseable reducir al mínimo los cambios resultantes en el plegado del polipéptido. Los cambios en el plegado del polipéptido se reducen al mínimo cuando el sustitutivo es química y estéricamente similar a la cisteína. Por estas razones es preferible utilizar serina como sustitutivo de la cisteína. Tal como se demuestra en los ejemplos más abajo, en una secuencia de aminoácidos del polipéptido se puede introducir un residuo cisteína para la reticulación. Cuando se introduce un residuo cisteína, es preferible la introducción en el extremo amino o carboxilo o cerca del mismo. Son conocidos métodos convencionales para estas modificaciones de secuencias de aminoácidos en los que el polipéptido de interés se produce mediante síntesis química.

El acoplamiento del primer y el segundo dominio del péptido quimérico tal como se define más arriba y tal como se utiliza aquí también se puede llevar a cabo mediante un agente de acoplamiento o conjugación. Son conocidos diversos reactivos de reticulación intermolecular que pueden ser utilizados (véase, por ejemplo, Means y Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, pp. 39-43). Entre estos reactivos se encuentran, por ejemplo, Nsuccinimidil 3-(2-pirridiltio) propionato (SPDP) o N,N’-(1,3-fenilen)bismaleimida (ambos altamente específicos con respecto a los grupos sulfhidrilo, formando enlaces irreversibles); N,N’-etilen-bis(yodoacetamida) u otro reactivo de este tipo con 6 a 11 puentes de carbono metilénico (relativamente específicos con respecto a los grupos sulfhidrilo); y 1,5difluor-2,4-dinitrobenceno (que forma enlaces irreversibles con los grupos amino y tirosina). Otros reactivos de reticulación útiles para este fin incluyen: p,p’-difluor-m,m’-dinitrodifenilsulfona (que forma reticulaciones irreversibles con grupos amino y fenólicos); dimetil adipimidato (que es específico con respecto a los grupos amino); fenol-1,4disulfonilcloruro (que reacciona principalmente con grupos amino); diisocianato de hexametileno o diisotiocianato, o azofenil-p-diisocianato (que reacciona principalmente con grupos amino); glutaraldehído (que reacciona con diversas cadenas laterales diferentes) y disdiazobenzidina (que reacciona principalmente con tirosina e histidina).

Los reactivos de reticulación utilizados para reticular el primer y el segundo dominio del péptido quimérico tal como se define más arriba pueden ser homobifuncionales, es decir tienen dos grupos funcionales que experimentan la misma reacción. Un reactivo de reticulación homobifuncional preferente es bismaleimidohexano (“BMH”). El BMH contiene dos grupos funcionales de maleimida que reaccionan específicamente con compuestos que contienen sulfhidrilo bajo condiciones suaves (pH 6,5-7,7). Los dos grupos maleimido están unidos por una cadena hidrocarburo. Por consiguiente, el BMH es útil para la reticulación irreversible de polipéptidos que contienen residuos cisteína.

Los reactivos de reticulación utilizados para reticular el primer y el segundo dominio del péptido quimérico tal como se define más arriba también pueden ser heterobifuncionales. Los agentes de reticulación heterobifuncionales tienen dos grupos funcionales diferentes, por ejemplo un grupo reactivo con amina y un grupo reactivo con tiol, que reticularán dos proteínas que tengan aminas y tioles libres, respectivamente. Como ejemplos de agentes de reticulación heterobifuncionales se mencionan: succinimidil 4-(maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (“SMCC”), mmaleimidobenzoil-N éster de hidroxisuccinimida (“MBS”), y succinimida 4-(p-maleimidofenil)butirato (“SMPB”), un análogo de MBS de cadena prolongada. El grupo succinimidilo de estos reticulantes reacciona con una amina primaria y la maleimida reactiva con tiol forma un enlace covalente con el tiol de un residuo cisteína.

Con frecuencia, los reactivos de reticulación adecuados para reticular el primer y el segundo dominio del péptido quimérico tal como se define más arriba son poco solubles en agua. Por consiguiente, para mejorar la solubilidad en agua del reactivo de reticulación se puede añadir al mismo una fracción hidrófila, por ejemplo un grupo sulfonato. A este respecto, el sulfo-MBS y el sulfo-SMCC son ejemplos de reactivos de reticulación modificados para aumentar su solubilidad en agua que pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención. De forma similar, muchos reactivos reticulantes producen un conjugado que esencialmente no segmentable bajo condiciones celulares. Sin embargo, algunos reactivos de reticulación particularmente adecuados para la reticulación del primer y el segundo dominio del péptido quimérico tal como se define más arriba contienen un enlace covalente, tal como disulfuro, que es segmentable bajo condiciones celulares. Por ejemplo, el reactivo de Traut, ditiobis(succinimidilpropionato) (“DPS”) y N-succinimidil 3(2-piridilditio)propionato (“SPDP”) son reticulantes divisibles bien conocidos. El uso de un reactivo de reticulación divisible permite que la fracción de carga se separe del polipéptido de transporte después de su suministro al interior de la célula diana. También puede resultar útil un enlace directo disulfuro.

Numerosos reactivos de reticulación, incluyendo los arriba descritos, son comerciales. Las instrucciones detalladas para su uso se pueden obtener fácilmente de los proveedores comerciales. Una referencia general de la reticulación de proteínas y la preparación de conjugados es: Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press (1991).

La reticulación química del primer y el segundo dominio del péptido quimérico tal como se define más arriba puede incluir el uso de brazos separadores. Los brazos separadores proporcionan flexibilidad intramolecular o ajustan la distancia intramolecular entre fracciones conjugadas, ayudando así a conservar la actividad biológica. Un brazo separador puede tener la forma de una fracción de polipéptido que incluye aminoácidos separadores, por ejemplo prolina. Alternativamente, un brazo separador puede formar parte del reactivo de reticulación, por ejemplo en un “SPDP de cadena larga” (Pierce Chem. Co., Rockford, IL., cat. No. 21651 H).

Por último, el péptido quimérico tal como se utiliza aquí también comprende derivados de los péptidos quiméricos anteriormente descritos, en particular de la secuencia peptídica quimérica según la SEQ ID Nº: 11.

El péptido quimérico tal como se define aquí, al igual que los fragmentos del mismo, se pueden utilizar como inmunógenos para generar anticuerpos que se unen específicamente a dichos compuestos peptídicos. Estos anticuerpos incluyen, por ejemplo fragmentos Fab policlonales, monoclonales, quiméricos de cadena simple y una liberría de expresión de Fab. Para producir estos anticuerpos se pueden utilizar diversos procedimientos conocidos en la técnica.

A modo de ejemplo, se pueden inmunizar diversos animales huésped para producir anticuerpos policlonales mediante inyección con un péptido quimérico o con una secuencia inhibidora de JNK tal como se define más arriba. Se pueden utilizar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunitaria, incluyendo, de forma no exclusiva, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales (por ejemplo hidróxido de aluminio), sustancias tensioactivas (por ejemplo lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, dinitrofenol, etc.), CpG, polímeros, plurónicos y adyuvantes humanos tal como Bacille Calmette-Guerin y Corynebacterium parvum.

Para preparar anticuerpos monoclonales dirigidos a un péptido quimérico o a una secuencia inhibidora de JNK tal como se define más arriba se puede utilizar cualquier técnica que permita producir moléculas de anticuerpo mediante cultivo continuo de líneas celulares. Estas técnicas incluyen, de forma no exclusiva, la técnica de hibridoma (véase Kohler y Milstein 1975. Nature 256: 495-497); la técnica de trioma; la técnica de hibridoma de células B humanas (véase Kozbor y col., 1983, Immunol Today 4: 72) y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (véase Cole y col., 1985. En: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). En la práctica de la presente invención se pueden utilizar anticuerpos monoclonales humanos, que se pueden producir mediante el uso de hibridomas humanos (véase Cote y col., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) o transformando células B humanas con virus de Epstein Barr in vitro (véase Cole y col., 1985. En: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

Se pueden adaptar técnicas para la producción de anticuerpos de cadena simple específicos con respecto a las secuencias inhibidoras de JNK y/o péptidos quiméricos (véase, por ejemplo, la Patente US Nº 4.946.778) tal como se definen aquí. Además se pueden adaptar métodos para construir liberrías de expresión Fab (véase, por ejemplo, Huse y col., 1989, Science 246: 1275-1281) para posibilitar una identificación rápida y eficaz de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada con respecto a estas secuencias inhibidoras de JNK y/o péptidos quiméricos. También es posible “humanizar” anticuerpos no humanos mediante técnicas bien conocidas (véase, por ejemplo, la Patente US 5.225.539). Se pueden producir fragmentos de anticuerpo que contienen los idiotipos para una secuencia inhibidora de JNK y/o un péptido quimérico tal como se define aquí mediante técnicas conocidas, incluyendo, por ejemplo, (i) un fragmento F(ab’)2 producido mediante digestión de pepsina de una molécula anticuerpo; (ii) un fragmento Fab generado por la reducción de los puentes de disulfuro en un fragmento F(ab’)2; (iii) un fragmento Fab generado por tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor; y (iv) fragmentos Fv.

Los métodos que pueden utilizarse para el "screening" de anticuerpos y que poseen la especificidad deseada incluyen, de forma no exclusiva, ensayos con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA) y otras técnicas de mediación inmunológica conocidas. En una realización específica, la selección de anticuerpos específicos con respecto a un epítope particular de una secuencia inhibidora de JNK y/o de un péptido quimérico tal como se define aquí (por ejemplo, en general, un fragmento del mismo que comprende una longitud de 5 a 20, preferentemente de 8 a 18 y de forma especialmente preferente de 8 a 11 aminoácidos) se facilita mediante la generación de hibridomas que se unen al fragmento de una secuencia inhibidora de JNK y/o un péptido quimérico, tal como se define aquí, que posee un epítope de dicho tipo. Aquí también están previstos los anticuerpos que son específicos para un epítope tal como se define más arriba.

Los anticuerpos tal como se definen aquí se pueden utilizar en métodos conocidos en la técnica referentes a la localización y/o cuantificación de una secuencia inhibidora de JNK (y/o correspondientemente a un péptido quimérico tal como se define más arriba), por ejemplo para medir los niveles del péptido dentro de muestras fisiológicas apropiadas, en métodos diagnósticos o para generar imágenes del péptido, y similares.

Las secuencias inhibidoras de JNK, los péptidos quiméricos y/o los anticuerpos tal como se definen de acuerdo con la invención se pueden formular en una composición farmacéutica que se puede emplear en la prevención o el tratamiento de cualquiera de las enfermedades aquí definidas, en particular en la prevención o el tratamiento de enfermedades digestivas inflamatorias crónicas y no crónicas tal como se definen aquí. En general, una composición farmacéutica de este tipo utilizada de acuerdo con la presente invención incluye como componente activo por ejemplo: (i) cualquiera o cualesquiera de las secuencias inhibidoras de JNK y/o péptidos quiméricos y/o péptidos quiméricos tal como se definen más arriba, y/o variantes, fragmentos o derivados de los mismos, en particular secuencias inhibidoras de JNK de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2 y/o péptidos quiméricos de acuerdo con la SEQ ID Nº: 11, y/o secuencias inhibidoras de JNK de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2 que comprenden una secuencia de tráfico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID Nº: 5 a 8 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de las mismas tal como se definen más arriba.

De acuerdo con una realización preferente, una composición farmacéutica de este tipo tal como se utiliza de acuerdo con la presente invención incluye típicamente una cantidad segura y eficaz de un componente tal como se define más arriba, preferentemente de al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2 y/o al menos un péptido quimérico de acuerdo con la SEQ ID Nº: 11, y/o al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2 que comprende una secuencia de tráfico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID Nº: 5 a 8 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de las mismas tal como se definen más arriba.

Los inventores de la presente invención han descubierto además que la secuencia inhibidora de JNK y el péptido quimérico, respectivamente, tal como se definen aquí, muestran una tasa de absorción particularmente buena en células implicadas en las enfermedades de la presente invención. Por ello, la cantidad de secuencia inhibidora de JNK y de péptido quimérico, respectivamente, en la composición farmacéutica a administrar a un sujeto puede ser de dosis muy baja, sin limitarse a ello. Por consiguiente, la dosis puede ser mucho más baja que en el caso de los fármacos peptídicos conocidos en la técnica, tal como DTS-108 (Florence Meyer-Losic y col., Clin Cancer Res., 2008, 2145-53). Esto tiene diversos aspectos positivos, por ejemplo la reducción de las reacciones secundarias potenciales y un menor gasto.

Preferentemente, la dosis (por kg de peso corporal) está en el intervalo de hasta 10 mmol/kg, preferiblemente de hasta 1 mmol/kg, de forma especialmente preferente de hasta 100 μmol/kg, de forma todavía más preferente de hasta 10 μmol/kg, en particular de hasta 1 μmol/kg, de forma particularmente preferente de hasta 100 nmol/kg y de forma totalmente preferente de hasta 50 nmol/kg.

Por consiguiente, el rango de dosis puede oscilar preferentemente entre aproximadamente 1 pmol/kg y aproximadamente 1 mmol/kg, entre aproximadamente 10 pmol/kg y aproximadamente 0,1 mmol/kg, entre aproximadamente 10 pmol/kg y aproximadamente 0,01 mmol/kg, entre aproximadamente 50 pmol/kg y aproximadamente 1 μmol/kg, entre aproximadamente 100 pmol/kg y aproximadamente 500 nmol/kg, entre aproximadamente 200 pmol/kg y aproximadamente 300 nmol/kg, entre aproximadamente 300 pmol/kg y aproximadamente 100 nmol/kg, entre aproximadamente 500 pmol/kg y aproximadamente 50 nmol/kg, entre aproximadamente 750 pmol/kg y aproximadamente 30 nmol/kg, entre aproximadamente 250 pmol/kg y aproximadamente 5 nmol/kg, entre aproximadamente 1 nmol/kg y aproximadamente 10 nmol/kg, o combinaciones de dos cualesquiera de estos valores.

En este contexto, en general, la prescripción de un tratamiento, por ejemplo decisiones sobre la dosificación, etc., cuando se utilizan las composiciones farmacéuticas arriba indicadas es responsabilidad del médico y otros clínicos, y habitualmente debe tenerse en cuenta el trastorno a tratar, el estado del paciente individual, el lugar de suministro, el método de administración y otros factores conocidos por los médicos. En REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16 edición, Osol, A. (ed.) 1980, se pueden encontrar ejemplos de las técnicas y protocolos arriba mencionados. Por consiguiente, una “cantidad segura y eficaz” tal como se define más arriba para los componentes de las composiciones farmacéuticas tal como se utilizan de acuerdo con la presente invención significa una cantidad de cada uno de estos componentes, o de todos ellos, que es suficiente para inducir de forma significativa una modificación positiva de una enfermedad digestiva inflamatoria crónica o no crónica tal como se define aquí. No obstante, al mismo tiempo, la “cantidad segura y eficaz” es lo suficientemente pequeña como para evitar efectos secundarios graves, es decir, para permitir una relación razonable entre las ventajas y los riesgos. La determinación de estos límites entra típicamente dentro del ámbito de un criterio médico sensato. Una “cantidad segura y eficaz” de un componente de este tipo variará en relación con la enfermedad particular a tratar y también con la edad y el estado físico del paciente a tratar, la gravedad de la enfermedad, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia complementaria, del vehículo farmacéuticamente aceptable particular utilizado y de factores similares, dentro de los conocimientos y la experiencia del clínico en cuestión. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se pueden utilizar de acuerdo con la invención para fines médicos y también veterinarios.

Adicionalmente, la composición farmacéutica utilizada de acuerdo con la presente invención puede comprender, además de una de dichas sustancias, un vehículo farmacéuticamente aceptable (compatible), excipiente, tampón o estabilizador u otros materiales conocidos por los especialistas.

En este contexto, la expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable (compatible)” incluye preferentemente la base líquida o no líquida de la composición. El término “compatible” significa que los constituyentes de la composición farmacéutica tal como se utiliza aquí pueden mezclarse con el componente farmacéuticamente activo tal como se define más arriba y con otro componente de tal modo que no se produce ninguna interacción que pueda reducir esencialmente la eficacia farmacéutica de la composición bajo condiciones de uso normales. Evidentemente, los vehículos farmacéuticamente aceptables deben tener una pureza lo suficientemente alta y una toxicidad lo suficientemente baja para que sean adecuados para su administración a una persona a tratar.

En general, cuando la composición farmacéutica tal como se utiliza aquí se proporciona en forma líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable comprenderá uno o más vehículos líquidos farmacéuticamente aceptables (compatibles). La composición puede comprender, como vehículos líquidos farmacéuticamente aceptables (compatibles), por ejemplo agua libre de pirógenos; soluciones (acuosas) salinas isotónicas o tamponadas, por ejemplo soluciones tamponadas con fosfato, citrato, etc.; aceites vegetales, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de teobroma; polioles, por ejemplo polipropilenglicol, glicerol, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ácido algínico, etc. También se puede emplear un tampón, preferentemente un tampón acuoso, en particular para la inyección de la composición farmacéutica tal como se utiliza aquí.

En general, cuando la composición farmacéutica tal como se utiliza aquí se proporciona en forma sólida, el vehículo farmacéuticamente aceptable comprenderá uno o más vehículos sólidos farmacéuticamente aceptables (compatibles). La composición puede comprender, como vehículos sólidos farmacéuticamente aceptables (compatibles), por ejemplo uno o más materiales de carga o diluyentes sólidos o líquidos compatibles o también se pueden utilizar compuestos de encapsulación adecuados para su administración a una persona. Algunos de estos vehículos sólidos farmacéuticamente aceptables (compatibles) son, por ejemplo, azúcares, por ejemplo lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, por ejemplo almidón o fécula de patata; celulosa y sus derivados, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa, acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; sebo; deslizantes sólidos, por ejemplo ácido esteárico, estearato de magnesio; sulfato de calcio, etc.

La naturaleza concreta del vehículo farmacéuticamente aceptable (compatible) u otro material puede depender de la vía de administración. Por consiguiente, la selección de un vehículo farmacéuticamente aceptable (compatible) se puede determinar en principio de acuerdo con el modo de administración de la composición farmacéutica tal como se utiliza de acuerdo con la invención. La composición farmacéutica tal como se utiliza de acuerdo con la invención se puede administrar, por ejemplo, de forma sistémica. Las vías de administración incluyen, por ejemplo, la vía parenteral (por ejemplo inyección), tal como vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica o transdérmica, etc.; vía enteral, tal como vía oral o rectal, etc.; vía tópica, tal como vía nasal o intranasal, etc.; u otras vías, por ejemplo vía epidérmica o administración en parche.

La cantidad adecuada de la composición farmacéutica a utilizar se puede determinar mediante experimentos rutinarios con modelos animales. Estos modelos incluyen, sin que esto implique ninguna limitación, modelos en conejos, oveja, ratón, rata, perro y primate no humano. Las formas de dosificación unitaria preferentes incluyen soluciones estériles de agua, solución salina fisiológica o mezclas de éstas. El pH de estas soluciones se debería ajustar a aproximadamente 7,4. Vehículos adecuados para inyección incluyen hidrogeles, dispositivos de liberación controlada o retardada, ácido poliláctico y matrices de colágeno. Vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración tópica incluyen aquellos adecuados para ser utilizados en lociones, cremas, geles y similares. Cuando el compuesto se ha de administrar vía peroral, las formas de dosificación unitaria consisten en tabletas, cápsulas y similares. Vehículos farmacéuticamente aceptables para preparar formas de dosificación unitaria a utilizar para la administración oral son bien conocidos en el estado actual de la técnica. La selección de los mismos dependerá de consideraciones secundarias tales como sabor, coste y capacidad de almacenamiento, que no son críticas para los objetivos de la presente invención, y puede ser realizada sin dificultad por una persona con experiencia en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas para la administración oral se pueden encontrar en forma de tabletas, cápsulas, polvos o líquidos. Una tableta puede incluir un vehículo sólido tal como se define más arriba, por ejemplo gelatina, y opcionalmente un adyuvante. En general, las composiciones farmacéuticas líquidas de administración oral pueden incluir un vehículo líquido tal como se define más arriba, por ejemplo agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. También pueden incluir una solución salina fisiológica, dextrosa u otras soluciones de sacáridos o glicoles, tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Para la inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o local en el lugar de la dolencia, el ingrediente activo estará en forma de solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos y con un pH, una isotonicidad y una estabilidad adecuados. Las personas con un conocimiento técnico relevante pueden preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Ringer Lactato. También se pueden incluir conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera. Independientemente de que se trate de un polipéptido, péptido o molécula de ácido nucleico, u otro compuesto farmacéuticamente útil de acuerdo con la presente invención, que deba ser administrado a un individuo, la administración se lleva a cabo en una “cantidad profilácticamente eficaz” o en una “cantidad terapéuticamente eficaz” (según sea aplicable), siendo ésta suficiente para beneficiar al individuo. La cantidad exacta administrada y la velocidad y la evolución temporal de la administración dependerán de la naturaleza y de la gravedad de la enfermedad tratada.

La prevención y/o el tratamiento de una enfermedad tal como se define aquí incluye típicamente la administración de una composición farmacéutica tal como se describe más arriba. El término “modular” incluye la supresión de la expresión de JNK cuando se sobreexpresa en cualquiera de las enfermedades arriba indicadas. También incluye, de forma no exclusiva, la supresión o fosforilación de c-jun, ATF2 o NFAT4 en cualquiera de las enfermedades arriba indicadas, por ejemplo mediante el uso de al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2 y/o al menos un péptido quimérico de acuerdo con la SEQ ID Nº: 11, y/o al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2 incluyendo una secuencia de tráfico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID Nº: 5 a 8 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de las mismas tal como se definen más arriba, como inhibidor competitivo del sitio de unión natural de c-jun, ATF2 y NFAT4 en una célula. El término “modular” también incluye la supresión de complejos heteroméricos y homoméricos de factores de transcripción formados, de forma no exclusiva, por c-jun, ATF2 o NFAT4 y sus compañeros relacionados, por ejemplo el complejo AP-1, que está formado por c-jun, AFT2 y c-fos. Cuando una enfermedad digestiva inflamatoria crónica o no crónica está asociada a una sobreexpresión de JNK, dichas secuencias inhibidoras de JNK supresoras se pueden introducir en una célula. En algunos casos, “modular” puede incluir el aumento de la expresión de JNK, por ejemplo empleando un anticuerpo específico de péptido IB que bloquea la unión de un péptido IB a JNK, evitando así la inhibición de JNK mediante el péptido relacionado con IB.

La prevención y/o el tratamiento de un sujeto con la composición farmacéutica tal como se describe más arriba se puede llevar a cabo típicamente administrando (in vivo) una cantidad (“terapéuticamente eficaz”) de dicha composición farmacéutica a un sujeto, pudiendo ser este sujeto, por ejemplo, cualquier mamífero tal como humano, primate, ratón, rata, perro, gato, vaca, caballo o cerdo. El concepto “terapéuticamente eficaz” significa que la cantidad del componente activo de la composición farmacéutica es suficiente para mejorar la enfermedad digestiva inflamatoria crónica o no crónica.

Por consiguiente, los péptidos tal como se definen más arriba, por ejemplo al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2 y/o al menos un péptido quimérico de acuerdo con la SEQ ID Nº: 11, y/o al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2 incluyendo una secuencia de tráfico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID Nº: 5 a 8 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de las mismas tal como se definen más arriba, se pueden utilizar en una realización específica de la presente invención para tratar enfermedades digestivas inflamatorias crónicas o no crónicas tal como se han definido anteriormente mediante la modulación de las vías de señales de JNK activadas.

Alternativa y/o adicionalmente, para tratar enfermedades tales como las aquí mencionadas se pueden utilizar terapias dirigidas para suministrar las secuencias inhibidoras de JNK, los péptidos quiméricos y/o los ácidos nucleicos tal como se definen más arriba de forma más específica a determinados tipos de célula, mediante el uso de sistemas dirigidos tales como anticuerpos (dirigidos) o ligandos celulares específicos. Los anticuerpos utilizados para la dirección son típicamente específicos con respecto a las proteínas superficiales celulares de las células asociadas a cualquiera de las enfermedades arriba definidas. Por ejemplo, estos anticuerpos pueden estar dirigidos a anticuerpos de superficie celular, por ejemplo proteínas superficiales asociadas a células, tales como proteína DR MHC de clase II, CD18 (LFA-1 cadena beta), CD45RO, CD40 o Bgp95, o proteínas de superficie celular seleccionadas por ejemplo entre CD2, CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD13, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD39, CD4, CD43, CD45, CD52, CD56, CD68, C071, CD138, etc. Los constructos dirigidos se pueden preparar típicamente por una unión covalente de las secuencias inhibidoras de JNK, los péptidos quiméricos y los ácidos nucleicos tal como se definen aquí de acuerdo con la invención con un anticuerpo específico con respecto a una proteína de superficie celular o mediante una unión a un ligando específico de una célula. Las proteínas se pueden unir a un anticuerpo de este tipo o se pueden fijar al mismo mediante un enlace peptídico o por acoplamiento químico, reticulación, etc. La terapia dirigida se puede llevar a cabo administrando a un paciente el constructo dirigido en una cantidad farmacéuticamente eficaz a través de cualquiera de las vías de administración definidas más abajo, por ejemplo, vía de administración intraperitoneal, nasal, intravenosa, oral y en parche. Preferentemente, las secuencias inhibidoras de JNK, los péptidos quiméricos o los ácidos nucleicos tal como se definen aquí de acuerdo con la invención, unidos a los anticuerpos dirigidos o ligandos específicos de células tal como se definen más arriba, se pueden liberar in vitro o in vivo, por ejemplo por hidrólisis del enlace covalente, mediante peptidasas o mediante cualquier otro método adecuado. Alternativamente, si las secuencias inhibidoras de JNK, los péptidos quiméricos o los ácidos nucleicos tal como se definen aquí de acuerdo con la invención están unidos a un ligando específico de células pequeñas, la liberación del ligando no se puede llevar a cabo. Si están presentes en la superficie celular, los péptidos quiméricos pueden entrar en la célula por la actividad de su secuencia de tráfico. La dirección puede ser deseable por diversas razones, por ejemplo si las secuencias inhibidoras de JNK, los péptidos quiméricos y los ácidos nucleicos tal como se definen aquí de acuerdo con la invención son inaceptablemente tóxicos o si se requiere una dosis demasiado alta.

En lugar de administrar directamente las secuencias inhibidoras de JNK y/o los péptidos quiméricos tal como se definen aquí de acuerdo con la invención, éstos se podrían producir en las células diana mediante expresión a partir de un gen codificador introducido en las células, por ejemplo a partir de un vector viral a administrar. El vector viral típicamente codifica las secuencias inhibidoras de JNK y/o los péptidos quiméricos tal como se definen aquí de acuerdo con la invención. El vector se podría dirigir a las células específicas a tratar. Además, el vector podría contener elementos reguladores activados de forma más o menos selectiva por las células diana después de la regulación definida. Esta técnica representa una variante de la técnica VDEPT (virus-directed enzyme prodrug therapy - terapia con profármaco enzimático dirigido a virus) que utiliza proteínas maduras en lugar de sus formas precursoras.

Alternativamente, las secuencias inhibidoras de JNK y/o los péptidos quiméricos tal como se definen aquí se podrían administrar en una forma precursora mediante el uso de un anticuerpo o un virus. Estas secuencias inhibidoras de JNK y/o péptidos quiméricos se pueden convertir en la forma activa mediante un agente de activación producido en las células a tratar o dirigido a las mismas. Este tipo de enfoque se conoce a veces como ADEPT (antibody-directed enzyme prodrug therapy - terapia con profármaco enzimático dirigido a anticuerpos) o VDEPT (virus-directed enzyme prodrug therapy - terapia con profármaco enzimático dirigido a virus). En el primer caso, el agente de activación se dirige a las células mediante conjugación con un anticuerpo específico en relación con la célula, mientras que en el segundo caso el agente de activación, por ejemplo una secuencia inhibidora de JNK o el péptido quimérico, se produce en un vector mediante expresión a partir de ADN codificador en un vector viral (véase, por ejemplo, EP-A-415731 y WO 90/07936).

De acuerdo con otra realización, las secuencias inhibidoras de JNK, los péptidos quiméricos o los anticuerpos para secuencias inhibidoras de JNK o para péptidos quiméricos tal como se definen aquí, por ejemplo una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2 y/o un péptido quimérico de acuerdo con la SEQ ID Nº: 11, y/o una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2 incluyendo una secuencia de tráfico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID Nº: 5 a 8 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de las mismas tal como se definen más arriba, se pueden utilizar en ensayos (in vitro) (por ejemplo inmunoensayos) para detectar, pronosticar, diagnosticar o controlar diversas afecciones y enfermedades seleccionadas entre las enfermedades digestivas inflamatorias crónicas o no crónicas arriba definidas, o para controlar el tratamiento de las mismas. El inmunoensayo se puede llevar a cabo mediante un método que consiste en poner en contacto una muestra procedente de un paciente con un anticuerpo para una secuencia inhibidora de JNK, un péptido quimérico o una secuencia de ácidos nucleicos, tal como se definen más arriba, bajo condiciones en las que se puede producir la unión inmunoespecífica, y a continuación detectar o medir la cantidad de la eventual unión inmunoespecífica por el anticuerpo. En una realización específica se puede utilizar un anticuerpo específico con respecto a una secuencia inhibidora de JNK, un péptido quimérico o una secuencia de ácidos nucleicos para analizar un tejido o muestra de suero de un paciente en cuanto a la presencia de JNK o una secuencia inhibidora de JNK. En este caso, un nivel aberrante de JNK es indicativo de enfermedad. Los inmunoensayos a utilizar incluyen, de forma no exclusiva, sistemas de ensayo competitivo y no competitivo mediante técnicas tales como Western Blot, radioinmunoensayo (RIA), ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA), inmunoensayo en “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, inmunoensayos fluorescentes, ensayos de fijación de complemento, ensayos inmunorradiométricos e inmunoensayos de proteína A, etc. Alternativamente se pueden realizar ensayos (in vitro) mediante el suministro de las secuencias inhibidoras de JNK, péptidos quiméricos, secuencias de ácidos nucleicos o anticuerpos para secuencias inhibidoras de JNK o para péptidos quiméricos, tal como se definen más arriba, a células diana, típicamente seleccionadas por ejemplo entre células animales cultivadas, células humanas

o microorganismos, y controlar la respuesta celular mediante métodos biofísicos habituales conocidos por los especialistas. Las células diana utilizadas típicamente pueden consistir en células cultivadas (in vitro) o células in vivo, es decir, células que componen los órganos o tejidos de animales o humanos vivos, o microorganismos que se encuentran en animales o humanos vivos.

La presente invención proporciona adicionalmente el uso de kits para fines diagnósticos o terapéuticos, en particular para el tratamiento, la prevención o el control de enfermedades digestivas inflamatorias crónicas o no crónicas tal como se definen más arriba. El kit incluye uno o más recipientes que contienen secuencias inhibidoras de JNK, péptidos químicos, secuencias de ácidos nucleicos y/o anticuerpos con respecto a dichas secuencias inhibidoras de JNK o a péptidos quiméricos tal como se definen más arriba, por ejemplo un anticuerpo anti-secuencia inhibidora de JNK con respecto a una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2, con respecto a un péptido quimérico de acuerdo con la SEQ ID Nº: 11, con respecto a una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2 incluyendo una secuencia de tráfico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID Nº: 5 a 8 y 21 a 22, o con respecto a variantes o fragmentos de las mismas tal como se definen más arriba, o un anticuerpo anti-secuencia inhibidora de JNK de este tipo y, opcionalmente, un compañero de unión marcado para el anticuerpo. El marcador así incorporado en el anticuerpo puede incluir, de forma no exclusiva, una fracción quimioluminiscente, enzimática, fluorescente, colorimétrica o radiactiva. En otra realización específica se proporcionan kits para uso diagnóstico en el tratamiento, la prevención o el control de enfermedades digestivas inflamatorias crónicas o no crónicas tal como se definen más arriba, que comprenden uno o más recipientes que contienen ácidos nucleicos que codifican una secuencia inhibidora de JNK y/o un péptido quimérico tal como se definen más arriba, o alternativamente que son complementarios a éstos, y opcionalmente también se proporciona un compañero de unión marcado para estos ácidos nucleicos. En una realización específica alternativa, el kit se puede utilizar para los fines arriba indicados en forma de un kit que comprende uno o más recipientes, un par de cebadores de oligonucleótido (por ejemplo, cada uno de 6-30 nucleótidos de longitud) que pueden actuar como cebadores de amplificación para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; véase, por ejemplo, Innis y col., 1990. PCR PROTOCOLS, Academic Press, Inc., San Diego, CA), la reacción en cadena de la ligasa, reacción de sonda cíclica y similares, u otros métodos conocidos en la técnica relacionada con los ácidos nucleicos tal como se describen más arriba. El kit puede incluir opcionalmente una cantidad predeterminada de una secuencia inhibidora de JNK tal como se define más arriba, un péptido quimérico tal como se define más arriba, o ácidos nucleicos que codifican los mismos, para su uso como diagnóstico, patrón o control en los ensayos para los fines arriba indicados.

A no ser que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen el significado entendido comúnmente por las personas expertas en la técnica a la que pertenece esta invención. Más abajo se describen métodos y materiales adecuados, aunque en la práctica o la prueba de la presente invención se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos. Además, los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no establecen ninguna limitación. Otras características y ventajas de la invención se desprenden claramente de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figuras 1A-C Diagramas mostrando alineaciones de regiones de dominio JBD conservadas en los factores de transcripción indicados. Las secuencias inhibidoras de JNK aquí utilizadas se identificaron llevando a cabo alineaciones de secuencias. Las Figuras 1A-C muestran los resultados de esta alineación a modo de ejemplo. La FIG. 1A representa la región de mayor homología entre los JBD de IB1, IB2, c-Jun y ATF2. El Panel B representa la secuencia de aminoácidos de los JBD de L-IB1(s) y L-IB1 con fines comparativos. Los residuos completamente conservados se indican con asteriscos, mientras que los residuos cambiados a Ala en el vector GFP-JBD23Mut se indican con círculos huecos. La FIG. 1C muestra las secuencias de aminoácidos de proteínas quiméricas que incluyen una secuencia inhibidora de JNK y una secuencia de tráfico. En el ejemplo mostrado, la secuencia de tráfico se deriva del polipéptido TAT del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y la secuencia inhibidora de JNK se deriva de un polipéptido IB1(s). Las secuencias de humano, ratón y rata son idénticas en los Paneles B y C.

Figura 2 Diagrama mostrando secuencias de péptidos de fusión TAT-IB genéricos de humano, ratón y rata.

Figura 3 Resultados clínicos después del tratamiento con XG-102 (SEQ ID Nº: 11) en un estudio de IBD con un tratamiento donde se emplea XG-102 a una concentración de 1 y 100 μg/kg SC diarios.

Figura 4 Curva dosis-respuesta después del tratamiento con XG-102 (SEQ ID Nº: 11) en un estudio de IBD con un tratamiento donde se emplea XG-102 a una concentración de 0,01, 0,1, 1, 10, 100 y 1000 μg/kg SC diarios.

Figura 5 Resultados clínicos después del tratamiento con XG-102 (SEQ ID Nº: 11) en un estudio de IBD con un tratamiento donde se emplea XG-102 (dosis única SC) a una concentración de 1 y 100 μg/kg SC como dosis única el día 0.

Figura 6 Resultados clínicos después del tratamiento con XG-102 (SEQ ID Nº: 11) en un estudio de IBD con un tratamiento donde se emplea XG-102 (diariamente, PO) a una concentración de 1 y 100 μg/kg PO como dosis repetida.

Figura 7 Resultados clínicos después del tratamiento con XG-102 (SEQ ID Nº: 11) en un estudio de IBD con un tratamiento donde se emplea XG-102 (dosis única, PO) a una concentración de 1 y 100 μg/kg PO como dosis única el día 0.

Figura 8 Macrófagos de cultivo primario se incubaron con XG-102 (SEQ ID Nº: 11) y se lavaron a fondo. La presencia de XG-102 (SEQ ID Nº:11) se reveló utilizando un anticuerpo específico contra XG-102. El XG-102 se incorpora claramente en los macrófagos primarios.

Figura 9 Se trataron ratones por tres vías de administración diferentes (s.c., i.v., i.p.) con péptidos C14-radiomarcados (1 mg/kg). Los ratones fueron sacrificados 72 horas después de la inyección y procesados para inmunorradiografía. Se expusieron secciones sagitales que revelaron la acumulación de péptidos XG-102 en el hígado, bazo y médula ósea predominantemente (XG-102: SEQ ID Nº: 11).

Figura 10 Inmunotinción contra XG-102 (SEQ ID Nº: 11) en el hígado de ratas que habían recibido una inyección

i.v. de 1 mg/kg de XG-102. Los animales fueron sacrificados 24 horas después de la inyección. La revelación se llevó a cabo con sustrato DAB. Esta figura muestra de nuevo la acumulación pronunciada de XG-102 en el hígado y especialmente en las células de Kupffer (macrófagos).

Figura 11 Inhibición de la Liberación de citoquina y quimiocina en dos líneas celulares. El XG-102 (SEQ ID Nº: 11) inhibe la liberación de citoquina en líneas celulares tanto mieloideas como linfoides, reduciendo la liberación de TNFa, IL-6 y MCP-1 inducida por LPS en células THP-1 (Paneles A-C) y la producción de IFNg, IL-6 e IL-2 inducida por PMA y ionomicina en células Jurkat (Paneles D-F). El control (XG-101) es menos eficaz debido a su menor estabilidad.

Figura 12 Inhibición de la liberación de citoquina en células primarias. La XG-102 (SEQ ID Nº: 11) también inhibe la liberación de citoquina en células primarias mieloideas y linfoides, reduciendo la liberación de TNFa, IL-6 y RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted - regulada tras activación, expresada por células T normales, y segregada) en macrófagos murinos (Paneles A-C) y la producción de TNFa e IFNg inducida por PMA y ionomicina en células T murinas (Paneles D-E). Se producen efectos a concentraciones no tóxicas de XG-102 (Panel F).

Figura 13 Efecto en colitis inducida por TNBS. La JNK se activa en macrófagos y linfocitos de pacientes con enfermedad intestinal inflamatoria, respuesta que está en correlación con un aumento de la producción de TNFa, IL-6 e IFNg en lesiones. La administración subcutánea de 50 y 100 mg/kg de XG-102 protege los ratones frente a la colitis inducida por TNBS (Paneles A-C), disminuyendo la DAI, la pérdida de peso y la hemorragia rectal.

Figura 14 Secuencia de ADNc IB1 de rata y su secuencia de aminoácidos prevista (SEQ ID Nº: 102).

Figura 15 Secuencia de proteína IB1 de rata codificada por el límite exón-intrón del donante de corte y empalme de gen rIB1 (SEQ ID Nº: 103).

Figura 16

Secuencia de proteína IB1 de Homo sapiens (SEQ ID Nº: 104).

Figura 17

Secuencia de ADNc IB1 de Homo sapiens (SEQ ID Nº: 105).

Ejemplos

Ejemplo 1:

Identificación de secuencias inhibidoras de JNK

Se identificaron secuencias de aminoácidos importantes para la interacción eficaz con JNK mediante alineaciones de secuencias entre JBD de dominio de unión a JNK conocidos. Una comparación de secuencias entre los JBD de IB1 [SEQ ID Nº: 13], IB2 [SEQ ID Nº: 14], c-Jun [SEQ ID Nº: 15] y ATF2 [SEQ ID Nº: 16] definió una secuencia de 8 aminoácidos débilmente conservada (FIG. 1A). Dado que los JBD de IB1 e IB2 son aproximadamente 100 veces más eficaces que c-Jun o ATF2 para unirse a JNK (Dickens y col., Science 277: 693 (1997), se razonó que los residuos conservados entre IB1 e IB2 debían ser importantes para permitir la máxima unión. La comparación entre los JBD de IB1 e IB2 definió dos bloques de siete y tres aminoácidos altamente conservados entre las dos secuencias.

Estos dos bloques están incluidos dentro de una secuencia peptídica de 19 aminoácidos en L-IB1 [SEQ ID Nº: 1] y también se muestran por razones de comparación en una secuencia de péptido de 23 aa derivada de IB1 [SEQ ID Nº: 17]. Estas secuencias se muestran en la FIG. 1B, las rayas en la secuencia LIB1 indican un hueco en la secuencia para alinear los residuos conservados con LIB1(s).

Ejemplo 2: Preparación de proteínas de fusión inhibidoras de INK

Se sintetizaron proteínas de fusión inhibidoras de JNK de acuerdo con LA SEQ ID Nº: 9 mediante enlace covalente del extremo C-terminal de la SEQ ID Nº: 1 con un péptido portador N-terminal de 10 aminoácidos de longitud derivado del VIH-TAT4g 57 (Vives y col., J Biol. Chem. 272: 16010 (1997)) de acuerdo con la SEQ ID Nº: 5 a través de un enlazante consistente en dos residuos de prolina. Este enlazante se utilizó para posibilitar una flexibilidad máxima y prevenir cambios estructurales secundarios no deseados. También se prepararon los constructos básicos, que se designaron LIB1(s) (SEQ ID Nº: 1) y L-TAT [SEQ ID Nº: 5], respectivamente.

Se sintetizaron correspondientemente los péptidos retro-inverso totalmente D de acuerdo con la SEQ ID Nº: 11. También se prepararon los constructos básicos, que se designaron D-IB1(s) [SEQ ID Nº: 2] y D-TAT [SEQ ID Nº: 6], respectivamente.

Se produjeron péptidos de fusión totalmente D y L de acuerdo con las SEQ ID Nº: 9, 10, 11 y 12 mediante síntesis Fmock clásica y además se analizaron mediante espectrometría de masas. Finalmente se purificaron mediante HPLC. Para determinar los efectos del enlazante de prolina se produjeron dos tipos de péptido TAT, uno con dos prolinas y otro sin ellas. La adición de las dos prolinas no parecía codificar la entrada o la localización del péptido TAT dentro de las células. La FIG. 2 muestra péptidos genéricos que presentan los residuos de aminoácidos conservados.

Ejemplo 3: Inhibición de la muerte celular por IBD19

Se estudiaron los efectos de la secuencia de JBD de IB1(s) de 19 aa de longitud en las actividades biológicas de la JNK. La secuencia de 19 aa se unió por el extremo N-terminal a la Proteína Verde Fluorescente (Green Fluorescent Protein) (constructo GFP JBP19), y se evaluó el efecto de este constructo en la apoptosis de células beta pancreáticas inducida por IL1. Previamente se había comprobado que este modo de apoptosis se bloqueaba mediante transfección con J8D1280, mientras que los inhibidores específicos de ERK1/2 o p38 no proporcionaban protección (véase Ammendrup y col., supra).

Se sintetizaron oligonucleótidos correspondientes a JBD19 que comprendían una secuencia conservada de 19 aminoácidos así como una secuencia mutada en las regiones completamente conservadas, y se insertaron direccionalmente en los sitios EcoRl y Sall del vector pEGFP-N1 que codifica la Proteína Verde Fluorescente (GFP -Green Fluorescent Protein) (de Clontech). Se cultivaron células TC-3 productoras de insulina en medio RPMI 1640 complementado con un 10% de suero bovino fetal, 100 μg/ml de estreptomicina, 100 unidades/ml de penicilina y glutamina 2 mM. Las células TC-3 productoras de insulina se sometieron a transfección con los vectores indicados y se añadió IL-1 (10 ng/ml) al medio de cultivo celular. Cuarenta y ocho horas después de la adición de IL-1 se contó el número de células apoptóticas utilizando un microscopio de fluorescencia de inversión. Las células apoptóticas se distinguieron de las células normales por la “vacuolización” característica del citoplasma y se contaron después de dos días.

GFP es el vector de expresión de Proteína Verde Fluorescente utilizado como control; JBD19 es el vector que expresa una GFP quimérica unida a la secuencia de 19 aa derivada del JBD de IB1; JBD19Mut es el mismo vector que GFP-JBD19, pero con un JBD mutado en cuatro residuos conservados tal como muestra la FIG. 1B; y JBO1-280 es el vector GFP unido a la IBD completa (aa 1-280). El constructo de expresión GFP-JBD19 prevenía la apoptosis de células pancreáticas con la misma eficiencia que el JBD1-280 completo.

Como controles adicionales, las secuencias mutadas en residuos IB1(s) completamente conservados tenían una capacidad muy reducida para prevenir la apoptosis.

Ejemplo 4: Importación celular de péptidos TAT-IB1 (s)

Se evaluó la capacidad de las formas enantioméricas L y D de los péptidos TAT y TAT-IB1 (“péptidos TAT-IB”) para entrar en las células. Los péptidos L-TAT, D-TAT, L-TAT-IB1(s) y D-TAT-IB1(s) [SEQ ID Nº: 5, 6, 9 y 12, respectivamente] se marcaron por adición N-terminal de un residuo de glicina conjugado con fluoresceína. Los péptidos marcados (1 μM) se añadieron a cultivos de células TC-3, que se mantuvieron tal como se describe en el Ejemplo 3. En momentos predeterminados, las células se lavaron con PBS y se fijaron durante cinco minutos en metanol-acetona (1:1) sumamente frío antes de examinarlas bajo un microscopio de fluorescencia. Como control se utilizó BSA marcado con fluoresceína (1 μM, 12 mol/mol de BSA). Los resultados demostraron que todos los péptidos marcados con fluoresceína arriba indicados habían entrado eficaz y rápidamente (menos de cinco minutos) en las células una vez añadidos al medio de cultivo. En cambio, la seroalbúmina bovina marcada con fluoresceína (BSA 1 μM, 12 mol de fluoresceína/mol de BSA) no entró en las células.

Un estudio de la evolución temporal demostró que la intensidad de la señal fluorescente para los péptidos enantioméricos L disminuía en un 70% después de un período de 24 horas. Después de 48 horas apenas había señal o no había señal en absoluto. En cambio, los péptidos D-TAT y D-TAT-IB1(s) eran extremadamente estables dentro de las células.

Las señales fluorescentes de estos péptidos retro-inverso totalmente D seguían siendo muy fuertes 1 semana después y la señal sólo disminuyó ligeramente 2 semanas después del tratamiento.

Ejemplo 5: Inhibición in vitro de la fosforilación de c-JUN, ATF2 y Elk1

Se investigaron in vitro los efectos de los péptidos en la fosforilación mediada por JNK de sus factores de transcripción diana. Se produjeron JNK1, JNK2 y JNK3 recombinadas y no activadas utilizando un kit de lisado de reticulocitos de conejo de TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN (Promega), y se utilizaron en ensayos de quinasa en fase sólida con c-Jun, ATF2 y Elk1, solos o fusionados con glutatión-S-transferasa (GST), como sustratos. Se llevaron a cabo estudios de dosis-respuesta donde se mezclaron péptidos L-TAT o L-TAT-IB1(s) (0-25 μM) con las quinasas JNK1, JNK2 o JNK3 recombinantes en tampón de reacción (Tris-acetato 20 mM, EGTA 1 mM, p-nitrofenilfosfato (pNPP) 10 mM, pirofosfato de sodio 5 mM, p-glicerofosfato 10 mM, ditiotreitol 1 mM) durante 20 minutos. Las reacciones de quinasa se iniciaron mediante la adición de MgCh 10 mM y 5 pCi33P- -dATP y 1 μg de GST-Jun (aa 1-89), GST-AFT2 (aa 1-96) o GST-ELK1 (aa 307-428). Las proteínas de fusión de GST se compraron en Stratagene (La Jolla, CA).

También se añadieron a la mezcla 10 μl de perlas de glutatión-agarosa. Después, los productos de reacción se separaron mediante SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 10% desnaturalizante. El gel se secó y a continuación de expuso a películas de rayos X (Kodak). Con dosis de péptido TAT-IB(s) de tan solo 2,5 μM ya se observó una inhibición prácticamente completa de la fosforilación de c-Jun, ATF2 y Elk1 por JNK. Sin embargo, una excepción notable fue la ausencia de inhibición por TAT-IB(s) de la fosforilación de Elk1 por la JNK3. En conjunto, el péptido TAT-IB1(s) mostró efectos superiores en la inhibición de la fosforilación de sus factores de transcripción diana por la familia JNK. La capacidad de los péptidos D-TAT, D-TAT-IB1(s) y L-TAT-IB1(s) (estudio con dosis de 0-250 μM) para inhibir la fosforilación de GST-Jun (aa 1-73) por JNK1, JNK2 y JNK3 recombinantes se analizaron tal como se describe más arriba. En conjunto, el péptido D-TAT-IB1(s) disminuyó la fosforilación de c-jun mediada por JNK, pero a niveles aproximadamente 10-20 veces menos eficaces que el L-TAT-IB1(s).

Ejemplo 6: Inhibición de la fosforilación de c-JUN por enlaces activados

Los efectos de los péptidos L-TAT o L-TAT-IB1(s) tal como se definen aquí en JNK activadas por estímulos estresantes se evaluaron utilizando GST-Jun para arrastrar JNK de células HeLa irradiadas con luz UV o células PTC tratadas con IL-1. Las células PTC se cultivaron tal como se describe más arriba. Las células HeLa se cultivaron en medio DMEM complementado con suero bovino fetal al 10%, 100 μg/ml de estreptomicina, 100 unidades/ml de penicilina y glutamina 2 mM. Una hora antes de utilizarlas para la preparación del extracto celular, las células PCT se activaron con IL-2 tal como se describe más arriba, mientras que las células HeLa se activaron con luz UV (20 J/m2). Los extractos celulares se prepararon a partir del control, células HeLa irradiadas con luz UV y células TC-3 tratadas con IL-1 raspando los cultivos celulares en tampón de lisis (Tris-acetato 20 mM, EGTA 1 mM, 1% Triton X-100, p-nitrofenilfosfato 10 mM, pirofosfato de sodio 5 mM, glicerofosfato 10 mMP, ditiotreitol 1 mM). Los desechos se retiraron por centrifugación durante cinco minutos a 15.000 rpm en un rotor SS-34 Beckman. Extractos de 100 μg se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con 1 μg de GST-jun (aminoácidos 1-89) y 10 μl de perlas de glutatión-agarosa (Sigma). Después de cuatro lavados con el tampón de raspado, las perlas se resuspendieron en el mismo tampón complementado con péptidos L-TAT o L-TAT-IB1(s) (25 μM) durante 20 minutos. Después se iniciaron las reacciones de la quinasa mediante la adición de MgCl2 10 mM y 5 pCi33P-gamma-dATP y se incubaron durante 30 minutos a 30ºC.

Después se separaron los productos de reacción mediante SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 10% desnaturalizante. Los geles se secaron y a continuación se expusieron a películas de rayos X (Kodak). En estos experimentos, los péptidos TAT-1B(s) previnieron eficientemente la fosforilación de c-Jun por JNK activadas.

Ejemplo 7: Inhibición in vivo de fosforilación de c-JUN mediante péptidos TAT-IB(s) tal como se definen aquí

Para determinar si los péptidos con permeabilidad celular tal como se definen aquí podían bloquear las señales de JNK in vivo, se utilizó un sistema GAL4 heterólogo. Células HeLa cultivadas como se describe más arriba se sometieron a cotransfección con el vector indicador 5XGAL-LUC junto con el constructo de expresión GAL-Jun (Stratagene) que incluía el dominio de activación de c-Jun (aminoácidos 1-89) enlazado al dominio de unión de ADN GAL4. La activación de la JNK se logró mediante la cotransfección de vectores que expresaban las quinasas situadas directamente aguas arriba MKK4 y MKK7 (véase Whitmarsh y col., Science 285: 1573 (1999)). En pocas palabras, 3x105 células se sometieron a transfección con los plásmidos en placas de 3,5 cm utilizando DOTAP (Boehringer Mannheim) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para los experimentos que implicaban GAL-Jun, 20 ng del plásmido se sometieron a transfección con 1 μg del plásmido indicador pFR-Luc (Stratagene) y 0,5 μg de plásmidos de expresión de MKK4 o MKK7. Tres horas después de la transfección, los medios celulares se cambiaron y se añadieron péptidos TAT y TATIB1(s) (1 μM). Dieciséis horas después se midieron las actividades de luciferasa utilizando el “Dual Reportes System” de Promega después de normalización al contenido proteínico. La adición del péptido TAT-IB1(s) bloqueaba la activación de c-Jun después de la activación de JNK mediada por MKK4 y MKK7. Dado que las células HeLa expresan las isoformas JNK1 y JNK2, pero no la isoforma JNK3, algunas células se sometieron a transfección con JNK3. De nuevo, el péptido TAT-IB1(s) inhibía la activación de c-Jun mediada por JUNK2.

Ejemplo 8: Síntesis de péptidos IB(s) retro-inversos totalmente D y variantes de los mismos

Los péptidos de la invención pueden ser péptidos de aminoácidos totalmente D sintetizados en inverso para prevenir la proteólisis natural (es decir, péptidos retro-inversos totalmente D). Un péptido retro-inverso totalmente D de la invención proporcionaría un péptido con propiedades funcionales similares a las del péptido nativo, donde los grupos laterales de los aminoácidos componentes corresponderían a la alineación del péptido nativo pero que conservaría un esqueleto resistente a la proteasa.

Los péptidos retro-inversos de la invención son análogos sintetizados utilizando D-aminoácidos por la unión de los aminoácidos a una cadena peptídica de tal modo que la secuencia de aminoácidos en el análogo del péptido retroinverso es exactamente opuesta a la del péptido seleccionado que sirve como patrón. Por ejemplo, si la proteína TAT natural (formada por aminoácidos L) tiene la secuencia GRKKRRQRRR [SEQ ID Nº: 5], el análogo de péptido retroinverso de este péptido (formado por aminoácidos D) tendría la secuencia RRRQRRKKRG [SEQ ID Nº: 6]. En la técnica se conocen procedimientos para sintetizar una cadena de D-aminoácidos para formar los péptidos retro-inversos (véase, por ejemplo, Jameson y col., Nature, 368,744-746 (1994); Brady y col., Nature, 368,692-693 (1994); Guichard y col., J. Med. Chem. 39,2030-2039 (1996)). Específicamente, los retro-péptidos de acuerdo con las SEQ ID Nº: 2, 4, 6, 8, 11-12, 18, 20, 22 y 25-26 se produjeron mediante síntesis Fmock clásica y se analizaron mediante Espectrometría de Masas. Finalmente se purificaron por HPLC.

Dado que un problema inherente de los péptidos nativos consiste en la degradación por proteasas naturales e inmunogenicidad inherente, los compuestos heterobivalentes o heteromultivalentes de esta invención se prepararán de modo que incluyan el “isómero retro-inverso” del péptido deseado. Por consiguiente, la protección del péptido frente a la proteólisis natural debería aumentar la eficacia del compuesto heterobivalente o heteromultivalente específico, tanto prolongando la vida media como disminuyendo la magnitud de la respuesta inmunitaria dirigida a la destrucción activa de los péptidos.

Ejemplo 9: Actividad biológica a largo plazo de los péptidos IB(s) retro-inversos totalmente D y de las variantes de los mismos

La actividad biológica a largo plazo se predice para el heteroconjugado peptídico que contiene el D-TAT-IB(s) retroinverso (véanse las secuencias quiméricas arriba mostradas) en comparación con el análogo de L-aminoácido nativo debido a la protección del péptido D-TAT-IB(s) frente a la degradación por proteasas nativas, como se muestra en el Ejemplo 5.

Se analizó la inhibición de la muerte de células beta pancreáticas inducida por IL-1 mediante el péptido D-TAT-IB1(s). Las células TC-3 se incubaron tal como se describe más arriba durante 30 minutos con una única adición de los péptidos indicados (1 μM). Después se añadió IL-1 (10 ng/ml).

Después de dos días de incubación con IL-1, las células apoptóticas se contaron mediante el uso de yoduro de propidio y tinción nuclear Hoechst 33342. En cada experimento se contó un mínimo de 1.000 células. El péptido D-TAT-IB1 disminuyó la apoptosis inducida por IL-1 en una magnitud similar a la disminución lograda con péptidos L-TAT-IB.

También se analizó la inhibición a largo plazo de la muerte celular inducida por IL-1P mediante el péptido D-TAT-IB1. Células TC-3 se incubaron durante 30 minutos tal como se describe más arriba con una única adición de los péptidos indicados (1 μM). Luego se añadió IL-1 (10 ng/ml), seguida de la adición de la citoquina cada dos días. Después de 15 días de incubación con IL-1 se contaron las células apoptóticas usando yoduro de propidio y tinción nuclear Hoechst 33342. Obsérvese que una única adición del péptido TAT-IB1 no confiere protección a largo plazo. En cada experimento se contó un mínimo de 1.000 células. De acuerdo con los resultados obtenidos, el D-TAT-IB1(s) proporcionó protección a largo plazo (15 días), pero el L-TAT-IB1(s) no lo hizo.

Ejemplo 10: Supresión de los factores de transcripción de INK por péptidos L-TAT-IB1(s) tal como se utilizan de acuerdo con la presente invención

Se llevaron a cabo ensayos de retardo en gel con una sonda doblemente marcada con AP-1 (5’-CGC TTG ATG ACT CAG CCG GAA-3’ (SEQ ID Nº: 101). Se trataron o no extractos nucleares de células HeLa durante una hora con 5 ng/ml TNF, tal como se ha indicado. Los péptidos TAT y L-TAT-IB1(s) utilizados de acuerdo con la presente invenciónse añadieron 30 minutos antes del TNF-alfa. Únicamente se muestra la parte del gel con el complejo de ADN específico de AP-1 (tal como se demuestra mediante experimentos de competición con competidores específicos y no específicos no marcados).

Los péptidos L-TAT-IB1(s) utilizados de acuerdo con la presente invención reducen la formación del complejo de unión AP-1 ADN en presencia de TNF-alfa.

Ejemplo 11: Inhibición de la actividad de INK endógena en células HepG2 utilizando un método de pocillo “todo en uno”

El día antes del experimento se sembraron células HepG2 a razón de 3.000 células/pocillo. Después se añadieron concentraciones crecientes de interleucina-1 [IL-1 beta)] o de factor de necrosis tumoral [TNF alfa)] (a) para activar JNK durante 30 minutos. Las células se sometieron a lisis en Hepes 20 mM, 0,5% Tween pH 7,4 y se procesaron para AlphaScreen JNK. (b) Z’ para la actividad de JNK inducida por 10 ng/ml IL-1 y media en 384 pocillos/placa (n=96). (c) Inhibición de actividad de JNK inducida por IL-1 beta endógena mediante inhibidores de JNK químicos [staurosporina y SP600125]. (d) Efecto de inhibidores peptídicos L-TAT-IB1 (s) de acuerdo con la SEQ ID Nº: 9 (abreviada aquí como L-JNKi) y D-TAT-IB1 (s) de acuerdo con la SEQ ID Nº: 11 (abreviada aquí como D-JNKi) y JBD (corresponde a L-JNKI sin la secuencia TAT) en la actividad de JNK dependiente de IL-1. Todos los paneles son representativos de tres experimentos independientes (n=3).

Métodos: Ensayo de quinasa Alphascreen

Principio: AlphaScreen es una tecnología basada en perlas no radiactivas utilizada para estudiar interacciones biomoleculares en un formato de microplaca. El acrónico ALPHA significa Amplified Luminiscence Proximity Homogeneus Assay (ensayo homogéneo de proximidad por luminiscencia amplificada). Este ensayo implica una interacción biológica que acerca estrechamente una perla “donante” y una perla “receptora”. Después tiene lugar una cascada de reacciones químicas que producen una señal amplificada. Tras una excitación por láser a 680 nm, un fotosensibilizador (ftalocianina) en la perla “donante” convierte el oxígeno ambiente a un estado singlete excitado. En sus 4 μsec de vida media, la molécula de oxígeno singlete se puede difundir hasta aproximadamente 200 nm en solución y, si hay una perla “receptora” dentro de ese margen de proximidad, el oxígeno singlete reacciona con un derivado de tioxeno en la perla “receptora”, generando quimioluminiscencia a 370 nm, que activa adicionalmente los fluoróforos contenidos en la misma perla “receptora”. A continuación, los fluoróforos excitados emiten luz a 520-620 nm. En ausencia de perla “receptora”, el oxígeno singlete cae al estado fundamental y no se produce ninguna señal.

En primer lugar se diluyeron reactivos de quinasa (B-GST-cjun, anticuerpo anti-P-cJun y JNK3 activa) en tampón de quinasa (Tris-HCl 20 mM pH 7,6, MgCl2 10 mM, DTT 1 mM, Na3VO4 100 mM, 0,01% Tween-20) y se añadieron a pocillos (15 μl). Después se incubaron las reacciones en presencia de 10 μM de ATP durante 1 h a 23ºC. La detección se llevó a cabo mediante adición de 10 μl de mezcla de perlas (aceptador de Proteína A 20 μg/ml y donante de 5 Estreptavidina 20 μg/ml), diluida en tampón de detección (Tris-HCl 20 mM pH 7,4, NaCl 20 mM, EDTA 80 mM, 0,3% BSA), seguida de otra hora de incubación a 23ºC en oscuridad. Para medir la actividad endógena de JNK se llevaron a cabo ensayos de quinasa tal como se describe más arriba, excepto que la JNK3 activa se sustituyó por lisados celulares y que los componentes reactivos de quinasa se añadieron después de la lisis celular. El B-GST-cjun y el anticuerpo PcJun se utilizaron en las mismas concentraciones, mientras que el ATP se utilizó en una concentración de 50 μM en

10 lugar de 10 μM. La señal AlphaScreen se analizó directamente en el aparato Fusion o En Vision.

Ejemplo 12: Evaluación de la actividad terapéutica de los péptidos D- y L-TAT-IB1 (s) de acuerdo con la presente invención

a) Sistema de ensayo:

i) Especie/raza: Ratón 1 BALB/c.

15 ii) Procedencia: Harlan Israel, Ltd.

iii) Sexo: Hembra.

iv) Número total de animales: n=150.

v) Edad: Adultos jóvenes, 7 semanas de edad al comienzo del estudio.

vi) Peso corporal: La variación de peso de los animales en el momento del comienzo del tratamiento no sobrepasa el ± 20 20% del peso medio.

vii) Salud de los animales: El estado de salud de los animales utilizados en este estudio se examina a su llegada.Únicamente los animales con buena salud se aclimatan a las condiciones de laboratorio (al menos siete días) y se utilizan en el estudio.

viii) Aleatorización: Los animales se asignan aleatoriamente a los grupos experimentales de acuerdo con una Tabla de 25 Números Aleatorios.

ix) Terminación: Al final del estudio, los animales supervivientes se sacrifican por dislocación cervical.

b) Constitución de grupos de ensayo y niveles de dosis.

La siguiente tabla muestra los grupos experimentales incluidos en el estudio.

Grupo nº

Tamaño del grupo Elemento de ensayo Vía Dosis Volumen (ml/kg) Régimen

1F

N = 10 Vehículo PO 0 5 Una vez al día durante 7 días

2F

N = 10 Sulfasalazina PO 10 mg/kg 5 Una vez al día durante 7 días

3F

N = 10 Remicade IP 5 mg/kg 5 Una vez al día durante 7 días

4F

N = 10 XG-102 SC 0,01 μg/kg 5 Una vez al día durante 7 días

5F

N = 10 XG-102 SC 0,1 μg/kg 5 Una vez al día durante 7 días

6F

N = 10 XG-102 SC 1 μg/kg 5 Una vez al día durante 7 días

7F

N = 10 XG-102 SC 10 μg/kg 5 Una vez al día durante 7 días

Grupo nº

Tamaño del grupo Elemento de ensayo Vía Dosis Volumen (ml/kg) Régimen

8F

N = 10 XG-102 SC 100 μg/kg 5 Una vez al día durante 7 días

9F

N = 10 XG-102 SC 1000 μg/kg 5 Una vez al día durante 7 días

10F

N = 10 XG-102 SC 1 μg/kg 5 Una sola dosis

11F

N = 10 XG-102 SC 100 μg/kg 5 Una sola dosis

12F

N = 10 XG-102 PO 1 μg/kg 5 Una vez al día durante 7 días

13F

N = 10 XG-102 PO 100 μg/kg 5 Una vez al día durante 7 días

14F

N = 10 XG-102 PO 1 μg/kg 5 Una sola dosis

15F

N = 10 XG-102 PO 100 μg/kg 5 Una sola dosis

XG-102 = SEQ ID Nº: 11; IP = administración intraperitoneal; PO = administración peroral; SC = administración subcutánea

c) Procedimientos de ensayo Se indujo colitis mediante administración de TNBS disuelto en 50% etanol. Después, todos los animales fueron tratados con dosis de XG-102 entre 0,1 y 1000 μg/kg, vía intraperitoneal o

5 subcutánea, en forma de dosis única o como dosis diarias reiteradas (véase más arriba). d) Observaciones y exámenes i) Síntomas clínicos A lo largo de todo el experimento arriba indicado se llevaron a cabo y se registraron exámenes clínicos meticulosos. Las

observaciones incluían cambios en el aspecto exterior, por ejemplo en la piel, pelo, ojos, membranas mucosas, la

10 presencia de secreciones y excreciones (por ejemplo diarrea) y la actividad autónoma. También se anotaron los cambios en el modo de andar, la postura y la respuesta a la manipulación, así como la presencia de comportamientos extraños, temblores, convulsiones, sueño y coma.

ii) Peso corporal El peso corporal individual de los animales se determinó diariamente. 15 iii) Evaluación clínica de la colitis Todos los días se registraron el peso corporal, la consistencia de las deposiciones y la hemorragia per rectum, y estos datos se utilizaron como parámetros para calificar la gravedad de la enfermedad:

Calificación

Pérdida de peso (%) Consistencia de las deposiciones Presencia de sangre per rectum

0

Ninguna Normal Negativo

1

1-5 Enrojecimiento, hinchazón del ano Negativo

2

5-10 Deposiciones sueltas Negativo

3

10-15 Diarrea Negativo

4

> 15 Diarrea Hemorragia

5

Muerte

iv) Patología gruesa del colon

El último día del experimento, los animales fueron sacrificados y se les extirpó el colon para evaluar la patología gruesa de acuerdo con la siguiente calificación:

Grado

Síntomas

0

Ninguna anomalía detectada.

1

Edema y enrojecimiento en un solo lugar.

2

Edema y enrojecimiento en más de un lugar, o edema y enrojecimiento masivo que ocupa más del 50% del colon.

3

Una úlcera

4

Más de una úlcera o una úlcera grave grande.

5 e) Resultados i) Síntomas clínicos Durante los exámenes clínicos subsiguientes al tratamiento con XG-102 (SEQ ID Nº: 11) no se observó ninguna

anomalía. ii) Tasa de mortalidad

10 No se registró ninguna muerte. iii) Peso corporal El TNBS indujo una pérdida de peso significativa el día 1. La administración de XG-102 (SEQ ID Nº: 11) previno la

pérdida de peso o mejoró los síntomas y ayudó a la recuperación. iv) Calificación clínica 15 Los animales tratados con vehículo inyectado con TNBS alcanzaron una calificación máxima el día de estudio 1 y sólo se recuperaron por completo el día 5 o después de éste. El tratamiento con sulfasalazina dio como resultado una reducción de la calificación clínica. El XG-102 (SEQ ID Nº: 11), administrado utilizando cualquier dosis, vía o programa de administración tal como se define más arriba (una sola dosis o dosis diarias), produjo un efecto equivalente o mejor que el observado en el caso de la sulfasalazina, que es el fármaco de referencia habitualmente utilizado. 20 v) Calificación de patologías cruzadas

El análisis grueso al final del estudio reveló que los animales tratados con vehículo inyectado con TNBS presentaban edemas y úlceras a lo largo del colon. La sulfasalazina redujo por completo la patología gruesa con eficacia. vi) Longitud del colon No se observó ningún efecto de la inducción o el tratamiento de la enfermedad en la longitud del colon.

25 vii) Peso del colon No se observó ningún efecto de la inducción o el tratamiento de la enfermedad en el peso del colon. f) Conclusiones En vista de los resultados arriba indicados, obtenidos bajo las condiciones del experimento arriba descrito y limitados a

los datos en vida, la secuencia ejemplo XG-102 de acuerdo con la SEQ ID Nº: 11 administrada por vía SC o PO 30 presentaba una actividad que mejoraba la recuperación de la enfermedad.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> xigen S.A.

<120> utilización de inhibidores de péptidos con permeabilidad celular de la vía de transducción de señales de JNK para el tratamiento de enfermedades digestivas inflamatorias crónicas o no crónicas

5 <130> CX01P021w01

<160> 105

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 19 10 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido L-IB1(s) (véase la Tabla 1) 15 <400> 1

<210> 2

<211> 19

<212> PRT 20 <213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido D-IB1(s) (véase la Tabla 1)

25 <220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(19)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

30 <400> 2

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido L-IB (genérico) (s) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> misc_feature

<223> Descripción de la secuencia: fórmula general: NH2-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQDXnb-COOH (véase la Tabla 1)

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1) .. (1)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo aminoácido (nativo);

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para Xnb

<220>

<221> VARIANTE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa es Xna tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo) excepto serina y treonina

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (2)..(2)

<223> Xaa es Xna tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0 o 1

<220>

<221> VARIANTE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa representa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> VARIANTE

<222> (10)..(16)

5 <223> Xaa representa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> REPETICIÓN 10 <222> (19)..(19)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para Xnb

<220> 15 <221> VARIANTE

<222> (19)..(19)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

20 <400> 3

<210> 4

<211> 19

<212> PRT 25 <213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido D-IB (genérico) (s) (véase la Tabla 1)

30 <220>

<221> misc_feature

<223> Descripción de la secuencia: fórmula general: NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-COOH,

<220> 35 <221> MUTÁGENO

<222> (1)..(19)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)..(11)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para Xnb

<220>

<221> VARIANTE

<222> (4)..(10)

<223> Xaa representa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> VARIANTE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa representa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (18)..(18)

<223> Xaa es Xna tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0 o 1

<220>

<221> VARIANTE

<222> (18)..(18)

<223> Xaa es Xna tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo) excepto serina y treonina

<220>

<221> VARIANTE <222> (18)..(18)

<223> Xaa es Xna tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo) excepto serina y treonina

5 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (19)..(19)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para Xnb

<220>

<221> VARIANTE

<222> (19)..(19)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, 15 preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<400> 4

<210> 5 20 <211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 25 <223> Descripción de la secuencia: Péptido L-TAT (véase la Tabla 1)

<400> 5

<210> 6 30 <211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 35 <223> Descripción de la secuencia: Péptido D-TAT (véase la Tabla 1) <220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(10)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 6

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido L-genérico-TAT (s) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> misc_feature

<223> Fórmula general: NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-COOH (véase la Tabla 1)

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para Xnb

<220>

<221> VARIANTE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (11)..(11)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para Xnb

<400> 7

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido D-genérico-TAT (s) (véase Tabla 1)

<220>

<221> misc_feature

<223> Fórmula general: NH2-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(10)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para Xnb

<220>

<221> VARIANTE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (11)..(11)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para 10 Xnb

<400> 8

<210> 9 15 <211> 31

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 20 <223> Descripción de la secuencia: L-TAT-IB1 (s) (véase la Tabla 1)

<400> 9

<210> 10 25 <211> 29

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

30 <223> Descripción de la secuencia: Péptido L-TAT (genérico) (s) (véase Tabla 1)

<220>

<221> misc_feature

<223> Descripción de la secuencia: Fórmula general: NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-COOH

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para Xnb

<220>

<221> VARIANTE

<222> (11)..(11)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (11)..(11)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para Xnb

<220>

<221> VARIANTE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa es Xna tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo) excepto serina y treonina

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (12)..(12)

<223> Xaa es Xna tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0 o 1

<220>

<221> VARIANTE

<222> (18)..(18)

<223> Xaa representa un residuo de aminoácido, (nativo);

<220>

5 <221> VARIANTE

<222> (20)..(26)

<223> Xaa representa un residuo de aminoácido, (nativo);

10 <220>

<221> VARIANTE

<222> (29)..(29)

preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido

preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (29)..(29)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para 20 Xnb

<400> 10

<210> 11 25 <211> 31

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 30 <223> Descripción de la secuencia: Péptido D-TAT-IB1 (s) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(31)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 11 <210> 12

<211> 29

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido: D-TAT (genérico) (s) (véase Tabla 1)

<220>

<221> misc_feature

<223> Fórmula general: NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH,

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(19)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (1)..(1)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para Xnb

<220>

<221> VARIANTE

<222> (4)..(10)

<223> Xaa representa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> VARIANTE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa representa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> VARIANTE

<222> (18)..(18)

<223> Xaa es Xna tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo) excepto serina y treonina

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (18)..(18)

<223> Xaa es Xna tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0 o 1

<220>

<221> VARIANTE

<222> (19)..(19)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (19)..(19)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para Xnb

<220>

<221> VARIANTE

<222> (29)..(29)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, representando Xaa un residuo de aminoácido, preferentemente consistente en cualquier residuo de aminoácido (nativo);

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (29)..(29)

<223> Xaa es Xnb tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para Xnb

<400> 12

<210> 13

<211> 29

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido IB1-largo (véase la Tabla 1)

<400> 13

15 <210> 14

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 20 <223> Descripción de la secuencia: Péptido IB2-largo (véase la Tabla 1)

<400> 14

<210> 15

<211>

29 25 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido derivado de c-Jun (véase la Tabla 1)

<400> 15

<210> 16

<211>

29 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido derivado de ATF2 (véase la Tabla 1) 10 <400> 16

<210> 17

<211> 23

<212>

PRT 15 <213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido L-IB1 (véase la Tabla 1)

<400> 17

<210> 18

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido D-IB1 (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(23)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 18

<210> 19

<211> 19

<212>

PRT 10 <213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido L-IB (genérico) (véase la Tabla 1)

<220>

15 <221> VARIANTE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa puede consistir en cualquier residuo de aminoácido,

<220>

20 <221> VARIANTE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa puede consistir en cualquier residuo de aminoácido,

<220>

25 <221> VARIANTE

<222> (9)..(15)

<223> Xaa puede consistir en cualquier residuo de aminoácido,

<220>

30 <221> VARIANTE

<222> (18)..(18)

<223> Xaa se selecciona entre serina y treonina,

<220>

<221> VARIANTE

<222> (19)..(19)

<223> Xaa puede consistir en cualquier residuo de aminoácido,

<400> 19

<210> 20

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido D-IB (genérico) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(19)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa puede consistir en cualquier residuo de aminoácido

<220>

<221> VARIANTE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa se selecciona entre serina y treonina

<220>

<221> VARIANTE

<222> (5)..(11)

<223> Xaa puede consistir en cualquier residuo de aminoácido

<220>

<221> VARIANTE

<222> (13)..(13)

<223> Xaa puede consistir en cualquier residuo de aminoácido

5 <220>

<221> VARIANTE

<222> (19)..(19)

<223> Xaa puede consistir en cualquier residuo de aminoácido

10 <400> 20

<210> 21

<211> 17

<212> PRT 15 <213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido L-genérico-TAT (véase la Tabla 1)

20 <220>

<221> VARIANTE

<222> (1)..(17)

<223> Xaa puede consistir en cualquier residuo de aminoácido

25 <400> 21

<210> 22

<211> 17

<212> PRT 30 <213> Artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia: Péptido D-genérico-TAT (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222>

(1)..(17) 5 <223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<220>

<221> VARIANTE

<222>

(1)..(17) 10 <223> Xaa puede consistir en cualquier residuo de aminoácido

<400> 22

<210> 23 15 <211> 35

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 20 <223> Descripción de la secuencia: Péptido L-TAT-IB1 (véase la Tabla 1)

<400> 23

<210> 24

<211> 42 25 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido L-TAT IB (genérico) (véase Tabla 1) 30 <220>

<221> VARIANTE

<222> (1)..(40)

<223> Xaa puede consistir en cualquier residuo de aminoácido

5 <220>

<221> VARIANTE

<222> (41)..(41)

<223> Xaa se selecciona entre serina y treonina

10 <220>

<221> VARIANTE

<222> (42)..(42)

<223> Xaa puede consistir en cualquier residuo de aminoácido

15 <400> 24

<210> 25

<211> 35 20 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido D-TAT-IB1 (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(35)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 25 <210> 26

<211> 42

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: Péptido D-TAT IB (genérico) (véase Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(42)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa puede consistir en cualquier residuo de aminoácido

<220>

<221> VARIANTE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa se selecciona entre serina o treonina

<220>

<221> VARIANTE

<222> (3)..(42)

<223> Xaa puede consistir en cualquier residuo de aminoácido

<400> 26 <210> 27

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: secuencia de péptido quimérico L-TAT-IB1(s1) (véase la Tabla 1)

<400> 27

<210> 28

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: secuencia de péptido quimérico L-TAT-IB1(s2) (véase la Tabla 1)

<220>

<221>

VARIANTE 20 <222> (11)..(11)

<223> Xaa se selecciona entre glicina o prolina

<220>

<221>

REPETICIÓN 25 <222> (11)..(11)

<223> Xaa es Xnc tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para Xnc

<400> 28

<210> 29

<211> 29

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: secuencia de péptido quimérico L-TAT-IB1(s3) (véase la Tabla 1)

10 <220>

<221> VARIANTE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa se selecciona entre glicina o prolina

15 <220>

<221> REPETICIÓN

<222> (10)..(10)

<223> Xaa es Xnc tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para Xnc

<400> 29

<210> 30

<211> 30 25 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: secuencia de péptido quimérico D-TAT-IB1(s1) (véase la Tabla 1) 30 <220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(30)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 30

5 <210> 31

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

10 <220>

<223> Descripción de la secuencia: secuencia de péptido quimérico D-TAT-IB1(s2) (véase la Tabla 1)

<220>

<221>

MUTÁGENO 15 <222> (1)..(30)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<220>

<221>

VARIANTE 20 <222> (20)..(20)

<223> Xaa se selecciona entre glicina o prolina

<220>

<221>

REPETICIÓN 25 <222> (20)..(20)

<223> Xaa es Xnc tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para Xnc

<400> 31

<210> 32

<211> 29

<212> PRT

<213> Artificial

5 <220>

<223> Descripción de la secuencia: secuencia de péptido quimérico D-TAT-IB1(s3) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222>

(1)..(29) 10 <223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<220>

<221> VARIANTE

<222>

(20)..(20) 15 <223> Xaa se selecciona entre glicina o prolina

<220>

<221> REPETICIÓN

<222> (20)..(20)

20 <223> Xaa es Xnc tal como se define en la fórmula general, siendo n igual a 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o más para Xnc

<400> 32

25 <210> 33

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

30 <220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s1) (véase la Tabla 1)

<400> 33

<210> 34

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s2) (véase la Tabla 1)

<400> 34

<210> 35

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s3) (véase la Tabla 1)

<400> 35

<210> 36

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s4) (véase la Tabla 1)

<400> 36

<210> 37

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s5) (véase la Tabla 1)

<400> 37

<210> 38

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s6) (véase la Tabla 1)

<400> 38

<210> 39

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s7) (véase la Tabla 1)

<400> 39

<210> 40

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s8) (véase la Tabla 1)

<400> 40

<210> 41

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-181(s9) (véase la Tabla 1)

<400> 41

<210> 42

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s10) (véase la Tabla 1)

<400> 42

<210> 43

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s11) (véase la Tabla 1)

<400> 43

<210> 44

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s12) (véase la Tabla 1)

<400> 44

<210> 45

<211> 12 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s13) (véase la Tabla 1)

<400> 45

<210> 46

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s14) (véase la Tabla 1)

<400> 46

<210> 47

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s15) (véase la Tabla 1)

<400> 47

<210> 48

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s16) (véase la Tabla 1)

<400> 48 <210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s17) (véase la Tabla 1)

<400> 49

<210> 50

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s18) (véase la Tabla 1)

<400> 50

<210> 51

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s19) (véase la Tabla 1)

<400> 51

<210> 52

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s20) (véase la Tabla 1)

<400> 52

<210> 53

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s21) (véase la Tabla 1)

<400> 53

<210> 54

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s22) (véase la Tabla 1)

<400> 54

<210> 55

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s23) (véase la Tabla 1)

<400> 55 <210> 56

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s24) (véase la Tabla 1)

<400> 56

<210> 57

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s25) (véase la Tabla 1)

<400> 57

<210> 58

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s26) (véase la Tabla 1)

<400> 58 <210> 59

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s27) (véase la Tabla 1)

<400> 59

<210> 60

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s28) (véase la Tabla 1)

<400> 60

<210> 61

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s29) (véase la Tabla 1)

<400> 61

<210> 62

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s30) (véase la Tabla 1)

<400> 62

<210> 63

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s31) (véase la Tabla 1)

<400> 63

<210> 64

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s32) (véase la Tabla 1)

<400> 64

<210> 65

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s33) (véase la Tabla 1)

<400> 65

<210> 66

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: L-IB1(s34) (véase la Tabla 1)

<400> 66

<210> 67

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s1) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(13)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 67

<210> 68

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s2) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(13)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 68

<210> 69

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s3) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(13)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 69

<210> 70

<211> 13

<212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s4) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(13)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 70

<210> 71

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s5) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(13)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 71

<210> 72

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s6) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(13)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 72

<210> 73

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s7) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(13)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 73

<210> 74

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s8) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO <222> (1)..(12)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 74

<210> 75

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s9) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(12)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 75

<210> 76

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s10) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(12)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 76

<210> 77

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s11) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(12)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 77

<210> 78

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s12) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(12)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 78 <210> 79

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s13) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(12)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 79

<210> 80

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s14) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(12)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 80

<210> 81

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s15) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(12)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 81

<210> 82

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s16) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(11)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 82

<210> 83

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s17) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(11)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 83

<210> 84

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s18) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(11)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 84

<210> 85

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s19) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(11)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 85

<210> 86

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s20) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(11)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 86

<210> 87

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s21) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(11)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 87

<210> 88

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s22) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(11)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 88

<210> 89

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IBl(s23) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(11)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 89 <210> 90

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s24) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(11)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 90

<210> 91

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s25) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(10)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 91

<210> 92

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s26) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(10)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 92

<210> 93

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s27) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(10)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 93

<210> 94

<211> 10

<212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s28) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(10)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 94

<210> 95

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s29) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(10)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 95

<210> 96

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s30) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(10)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 96

<210> 97

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s31) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(10)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 97

<210> 98

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s32) (véase la Tabla 1)

<220> <221> MUTÁGENO

<222> (1)..(10)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 98

<210> 99

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s33) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(10)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 99

<210> 100

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: D-IB1(s34) (véase la Tabla 1)

<220>

<221> MUTÁGENO

<222> (1)..(10)

<223> todos los aminoácidos son D-aminoácidos

<400> 100

<210> 101

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia: sonda marcada doblemente con ap-1 (ver p. 60)

<400> 101 cgcttgatga gtcagccgga a 21

<210> 102

<211> 2953

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia: secuencia de ADNc IB1 de rata y su secuencia de aminoácidos prevista (véase la Figura 1)

<220>

<221> CDS

<222> (108)..(2252)

<400> 102

<210> 103

<211> 714

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia: Proteína IB1 codificada por Límite Exón-Intrón del donante de corte y empalme de gen rIB1

<400> 103

<210> 104

<211> 711

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <220>

<223> Descripción de la secuencia: secuencia de proteína IB1 humana

<400> 104

<210> 105

<211> 2136

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> descripción de la secuencia: secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína IB1 humana

<400> 105

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Utilización de un péptido inhibidor de JNK consistente en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2 o de un péptido quimérico consistente en un primer dominio y un segundo dominio unidos mediante un enlace covalente, comprendiendo el primer dominio una secuencia de tráfico y consistiendo el segundo dominio en una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2, donde el primer dominio está unido al extremo C-terminal del segundo dominio, para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades digestivas inflamatorias crónicas o no crónicas en un sujeto.

2. 2.

   Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido quimérico consiste en la secuencia de aminoácidos correspondiente a la SEQ ID Nº: 11.

3. 3.

   Utilización según la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque la composición farmacéutica se administra por una vía de administración seleccionada de entre el grupo consistente en vía parenteral, incluyendo vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica y transdérmica; vías enteral, incluyendo las vías oral y rectal; vía tópica, incluyendo las vías nasal o intranasal; y otras vías, incluyendo la vía epidérmica o la administración en parches.

4. 4.

   Utilización según la reivindicación 1, 2 o 3, donde las enfermedades inflamatorias crónicas o no crónicas se seleccionan de entre enfermedades del tracto gastrointestinal, incluyendo enfermedades del esófago, el estómago, la primera, segunda y tercera parte del duodeno, el yeyuno, el íleon, el complejo ileocecal, el intestino grueso, del colon ascendente, transverso y descendente, el colon sigmoideo y el recto, enfermedades digestivas inflamatorias crónicas, caracterizada por una inflamación del colon, incluyendo colitis seleccionadas entre colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, colitis por derivación, colitis isquémica, colitis infecciosa, colitis fulminante, colitis química, colitis microscópica, colitis linfocítica, colitis colagenosa, colitis indeterminada y colitis atípica.

5. 5.

   Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la dosis (por kg de peso corporal) del péptido inhibidor de JNK o del péptido quimérico se sitúa en el intervalo de hasta 10 mmol/kg, preferentemente hasta 1 mmol/kg, de forma especialmente preferente hasta 100 μmol/kg, de forma todavía más preferente hasta 10 μmol/kg, de forma particularmente preferente hasta 1 μmol/kg, de forma más particularmente preferente hasta 100 nmol/kg y de forma totalmente preferente hasta 50 nmol/kg.

6. 6.

   Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la dosis del péptido inhibidor de JNK o del péptido quimérico está en el intervalo de aproximadamente 1 pmol/kg a aproximadamente 1 mmol/kg, de aproximadamente 10 pmol/kg a aproximadamente 0,1 mmol/kg, de entre aproximadamente 10 pmol/kg a aproximadamente 0,01 mmol/kg, de entre aproximadamente 50 pmol/kg a aproximadamente 1 μmol/kg, de entre aproximadamente 100 pmol/kg a aproximadamente 500 nmol/kg, de entre aproximadamente 200 pmol/kg a aproximadamente 300 nmol/kg, de entre aproximadamente 300 pmol/kg a aproximadamente 100 nmol/kg, de entre aproximadamente 500 pmol/kg a aproximadamente 50 nmol/kg, de entre aproximadamente 750 pmol/kg a aproximadamente 30 nmol/kg, de entre aproximadamente 250 pmol/kg a aproximadamente 5 nmol/kg, de entre aproximadamente 1 nmol/kg a aproximadamente 10 nmol/kg, o una combinación de dos cualesquiera de estos valores.

7. 7.

   Péptido inhibidor de JNK consistente en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2 o péptido quimérico consistente en un primer dominio y un segundo dominio unidos mediante un enlace covalente, comprendiendo el primer dominio una secuencia de tráfico y consistiendo el segundo dominio en una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEQ ID Nº: 2, donde el primer dominio está unido al extremo C-terminal del segundo dominio, para su uso en un método de tratamiento de enfermedades digestivas inflamatorias crónicas o no crónicas en un organismo humano o animal mediante una terapia.

8. 8.

   Péptido quimérico para su uso según la reivindicación 7, caracterizado porque consiste en la secuencia de aminoácidos correspondiente a la SEQ ID Nº: 11.

9. 9.

   Péptido inhibidor de JNK para su uso según la reivindicación 7 o péptido quimérico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, caracterizado porque el péptido inhibidor de JNK o el péptido quimérico se administra por una vía de administración seleccionada de entre el grupo consistente en vía parenteral, incluyendo las vías intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica y transdérmica; vía enteral, incluyendo las vías oral y rectal; vía tópica, incluyendo las vías nasal o intranasal; y otras vías, incluyendo la vía epidérmica o la administración en parches.

10. 10.

    Péptido inhibidor de JNK para su uso según la reivindicación 7 o la reivindicación 9, o péptido quimérico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde las enfermedades inflamatorias crónicas o no crónicas se seleccionan entre enfermedades del tracto gastrointestinal, incluyendo enfermedades del esófago, el estómago, la primera, segunda y tercera parte del duodeno, el yeyuno, el íleon, el complejo ileocecal, el intestino grueso, del colon ascendente, transverso y descendente, el colon sigmoideo y el recto, enfermedades digestivas inflamatorias crónicas, caracterizado por una inflamación del colon, incluyendo colitis seleccionadas entre colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, colitis por derivación, colitis isquémica, colitis infecciosa, colitis fulminante, colitis química, colitis microscópica, colitis linfocítica, colitis colagenosa, colitis indeterminada y colitis atípica.

11. 11.

    Péptido inhibidor de JNK para su uso según la reivindicación 7 o según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, o péptido quimérico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque la dosis (por kg de peso corporal) del péptido inhibidor de JNK o del péptido quimérico está en el intervalo de hasta 10 mmol/kg, preferentemente hasta 1 mmol/kg, de forma especialmente preferente hasta 100 μmol/kg, de forma todavía más

    5 preferente hasta 10 μmol/kg, de forma particularmente preferente hasta 1 μmol/kg, de forma más particularmente preferente hasta 100 nmol/kg y de forma totalmente preferente hasta 50 nmol/kg.
12. 12. Péptido inhibidor de JNK para su uso según la reivindicación 7 o según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, o péptido quimérico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, caracterizado porque la dosis del péptido inhibidor de JNK o del péptido quimérico está en el intervalo de aproximadamente 1 pmol/kg a10 aproximadamente 1 mmol/kg, entre aproximadamente 10 pmol/kg a aproximadamente 0,1 mmol/kg, entre aproximadamente 10 pmol/kg a aproximadamente 0,01 mmol/kg, entre aproximadamente 50 pmol/kg a aproximadamente 1 μmol/kg, entre aproximadamente 100 pmol/kg a aproximadamente 500 nmol/kg, entre aproximadamente 200 pmol/kg a aproximadamente 300 nmol/kg, entre aproximadamente 300 pmol/kg a aproximadamente 100 nmol/kg, entre aproximadamente 500 pmol/kg a aproximadamente 50 nmol/kg, entre

    15 aproximadamente 750 pmol/kg a aproximadamente 30 nmol/kg, entre aproximadamente 250 pmol/kg a aproximadamente 5 nmol/kg, entre aproximadamente 1 nmol/kg a aproximadamente 10 nmol/kg, o una combinación de dos cualesquiera de estos valores.

    Secuencias de péptidos, humano, ratón y rata

    Fig. 1

    Secuencias genéricas, humano, ratón y rata

    Fig. 2

    Calificación

    Vehículo clínica Sulfasalazina

    Días

    Fig. 3

    Vehículo

    Calificaciónclínica

    Días

    Fig. 4

    Calificación Vehículo clínica Una dosis SCUna dosis SC

    Días

    Fig. 5

    Calificación Vehículo clínica

    Dosis diarias PODosis diarias PO

    Días

    Fig. 6

    Vehículo Calificaciónclínica Una dosis POUna dosis PO

    Días

    Fig. 7

    Macrófago

    rata

    Liberación de IL-6 en células THP1

    Liberación de TNF en células THP1 Liberación de MCP-1 en células THP1

    Liberación de IL-2 en células Jurkat

    Liberación de IL-6 en células Jurkat

    Liberación de IFN en células Jurkat

    Vehículo Vehículo Vehículo Fig. 11

    Producción de IL-6 en Producción de RANTES en

    Producción de TNF

    Índice de actividad de la enfermedadEfecto en la pérdida de peso