CN102112148A

CN102112148A - Jnk信号转导通路的细胞可渗透性肽抑制剂用于治疗慢性或非慢性炎性消化病的应用

Info

Publication number: CN102112148A
Application number: CN2009801300655A
Authority: CN
Inventors: C·邦尼
Original assignee: Xigen SA
Current assignee: Xigen SA
Priority date: 2008-05-30
Filing date: 2009-06-02
Publication date: 2011-06-29
Also published as: EP2224941B1; WO2009143864A1; JP5547719B2; US9180159B2; ATE547113T1; DK2224941T3; AR071977A1; CA2725547A1; JP2011521919A; ES2383495T3; US20110207677A1; AU2009253347A1; AU2009253347B2; WO2009144038A1; PL2224941T3; EP2489362A1; EP2224941A1

Abstract

本发明涉及蛋白激酶抑制剂用于治疗非慢性或慢性炎性消化病的应用，更具体地涉及蛋白激酶c-Jun氨基末端激酶、JNK抑制剂序列、嵌合肽或者编码它们的核酸以及包含它们的药物组合物用于治疗非慢性或慢性炎性消化病的应用，所述疾病诸如结肠炎，包括例如溃疡性结肠炎、克罗恩病、改道性结肠炎、缺血性结肠炎、传染性结肠炎、暴发性结肠炎、化学性结肠炎、显微镜性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和非典型结肠炎等。

Description

JNK信号转导通路的细胞可渗透性肽抑制剂用于治疗慢性或非慢性炎性消化病的应用

本发明涉及蛋白激酶抑制剂用于治疗非慢性或慢性炎性消化病的应用，更具体地涉及蛋白激酶c-Jun氨基末端激酶的抑制剂、JNK抑制剂序列、嵌合肽或者编码它们的核酸以及包含它们的药物组合物用于治疗非慢性或慢性炎性消化病的应用，所述非慢性或慢性炎性消化病，诸如结肠炎，包括例如溃疡性结肠炎、克罗恩结肠炎、改道性结肠炎(diversion colitis)、缺血性结肠炎、传染性结肠炎、暴发性结肠炎、化学性结肠炎、显微镜性结肠炎(microscopic colitis)、淋巴细胞性结肠炎(lymphocytic colitis)和非典型结肠炎(atypical colitis)等。

消化病的数量，特别是非慢性和慢性消化病的数量在最近数十年中在西方文明中显著地增加，并对它们的公共保健系统提出了相当大的挑战。消化病是关于胃肠道的疾病。这包括食道、胃、十二指肠的第一、二、三和四部分、空肠、回肠、回盲肠的复合体(ileo-cecal complex)、大肠、(升结肠、横结肠和降结肠)乙状结肠和直肠的疾病。慢性炎性消化病频繁发生并且以结肠的炎症为特征，诸如结肠炎，包括例如溃疡性结肠炎(Colitis ulcerosa)(溃疡性结肠炎)、克罗氏症(MorbusCrohn)(克罗恩病)、改道性结肠炎、缺血性结肠炎、传染性结肠炎、暴发性结肠炎、化学性结肠炎、显微镜性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎(collageneouscolitis)、未定型结肠炎和非典型结肠炎等，其中溃疡性结肠炎(溃疡性结肠炎)和克罗氏症(克罗恩病)代表两种主要的慢性炎性消化病和两种主要类型的炎性肠病。克罗氏症和溃疡性结肠炎两者是在最近数十年当中发生快速增加的疾病。例如，在德国估计约0.01％至约0.1％的人群，即，约100,000中大约10至100个人，患有克罗氏症或溃疡性结肠炎。此外，克罗氏症或溃疡性结肠炎每年以约1至约8发生率的增加速度发生。女性稍微更多地受克罗氏症的影响，而溃疡性结肠炎的男性∶女性的比例是大约1∶1。溃疡性结肠和克罗氏症发作的高峰年龄是在15和30岁之间。第二高峰出现在60和80岁之间。

溃疡性结肠炎是炎性肠病(IBD)的一种形式，作为肠炎的亚型，其是一种肠疾病，特别是大肠或结肠的疾病。溃疡性结肠炎的症状典型地包括结肠中特有的溃疡或疮口。溃疡性结肠炎通常在直肠中开始并连续地蔓延进入大肠或直肠的近端部分，其中上胃肠道通常不受影响。活动性疾病的主要症状通常是逐渐发作的混合有血的腹泻，其中患者典型地患有痉挛性腹部疼痛(cramplike abdominal pain)。溃疡性结肠炎与多种肠外表现(extraintestinal manifestations)(皮肤风湿病(dermatologic rheumatology)、眼和其它)相关。它是间歇性疾病，具有恶化症状的周期和相对无症状的周期。虽然溃疡性结肠炎不知道病因，但是有易感性的推测遗传组分。此外，假定该病可以在易感性的人中由环境因素诱发。然而，溃疡性结肠炎的症状很少自行减小，而是需要治疗以变得好转，特别是当疾病转化成为慢性病状态的时候。

溃疡性结肠炎的治疗取决于疾病的程度和分布，并且通常包括用消炎药、免疫抑制和靶向免疫反应的特定成分的生物疗法进行治疗。在小的或中等的炎性活性的疾病状态(轻度和中度末端结肠炎)中，一般地，如果疾病限制于直肠，则普通的治疗通常包括给予5-氨基水杨酸盐类，诸如

或

可选地，可以运用使用栓剂或灌肠剂的局部药物。另外，可以使用给予包含类固醇的药物，特别是在急性治疗中，所述药物包括例如氢化可的松、丁地去炎松(Budenosid)、氯地米松(Beclomethason)

或强的松

在高炎性活性的疾病状态中，一般而言，如果溃疡性结肠炎蔓延进入大肠或结肠的近端部分，一般使用：应用静脉内注射或者直肠或者口服形式给药，给予糖皮质激素诸如氯地米松

或强的松

或者它们的衍生物，或者例如给予免疫抑制剂，诸如，硫唑嘌呤、甲氨喋啉(methothrexat)(MTX)或环孢霉素A。在少数情况下，可以运用使用抗体的抗体疗法，例如抗TNF-α(INFLIXIMAB)或抗-CD4。在严重的慢性病状态——其对药物治疗不应答——的情况下，结肠切除术，即通过手术部分或完全去除大肠，有时候是必须的，并被认为是这种情况下的疾病的治愈手段。这些疗法一般减少由于溃疡性结肠炎引起的急性发作的症状。然而，这些疗法中没有一种表现对这种疾病有效和持久的治愈。

克罗氏症或克罗恩病(也称为局限性肠炎)也是一种重要的慢性炎性消化病。它是影响整个肠壁和肠的一种慢性、发作性、炎性肠病(IBD)的亚型。与溃疡性结肠炎相比，克罗氏症可以影响整个胃肠道的任何部分，并且因此，克罗氏症的症状在患病个体中不同。该疾病的特征为在称为跳跃性病变(skip lesion)的症状中炎症区和正常区之间存在界限(lining)。主要的肠胃症状是腹部疼痛、腹泻、便秘、呕吐以及重量减轻或增加。克罗氏症也可以引起胃肠道外的并发症，诸如皮疹、关节炎和眼睛的炎症。克罗氏症在北美影响400,000和600,000之间的人(Loftus，E.V.；P.Schoenfeld，W.J.Sandborn(January 2002).″The epidemiology and natural history of Crohn′s disease in population-based patient cohorts from North America：a systematic review″.Alimentary Pharmacology&Therapeutics 16(1)：51-60.)。北欧的患病率估计范围为每100,000人27-48人(Bernstein，Charles N.(July 2006)。″The Epidemiology of Inflammatory Bowel Disease in Canada：A Population-Based Study″.The American Journal of Gastroenterology 101(7)：1559-1568)。此外，克罗氏症往往在十多岁和二十多岁中最初出现，另一个高峰发病期在五十多岁到七十多岁，但是该病可以在任何年龄出现(Hanauer，Stephen B.(March 1996).″Inflammatory bowel disease″.New England Journal of Medicine 334(13)：841-848；Gopal，Latha；Senthil Nachimuthu(2006-05-23).Chrohns Disease，eMedicine)。克罗氏症的原因不清楚，但是相信为与遗传联系的自身免疫性疾病。最高的相对危险在兄弟姐妹中出现，稍微更加频繁地影响女性，其中吸烟者更可能患克罗氏症的频率为三倍。出于使疾病缓解和保持缓解的目标，使用了多种药物治疗。这些药物治疗包括5-氨基水杨酸(5-ASA)制剂(

胶囊、Asacol片剂、Lialda片剂、Rowasa保留灌肠剂)、类固醇药物、服用免疫调节剂(诸如，例如，硫唑嘌呤、巯基嘌呤(6-MP)和甲氨喋啉)以及新的生物药品诸如，抗-TNA-α抗体(例如，

和)等等。类似于对于溃疡性结肠炎的以上讨论，这些疗法一般减少由于克罗氏症引起的急性发作的症状。然而，这些疗法中没有一种表现对克罗恩病有效和持久的治愈(除了抗-TNF-α之外，然而其显示增加的副作用风险)。

其它形式的结肠炎包括，例如改道性结肠炎、缺血性结肠炎、传染性结肠炎、暴发性结肠炎、化学性结肠炎、显微镜性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、未定型结肠炎和非典型结肠炎等。然而，对于任一的这些疾病，不存在有效和长时间持久的治愈而没有副作用的风险。因此，在本领域中存在提供替代或者改进的药品的现行紧急需要，其允许以上疾病的新和优选改进的疗法。

因此，本发明的目的是提供替代的或者改进的疗法，其允许非慢性或慢性(炎性)消化病的新的和优选改进的治愈，所述消化病诸如结肠炎，包括例如溃疡性结肠炎、克罗恩结肠炎、改道性结肠炎、缺血性结肠炎、传染性结肠炎、暴发性结肠炎、化学性疾病、显微镜性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和非典型结肠炎等。

该目的通过如下进行解决：在制备用于治疗对象中的非慢性或慢性炎性消化病的药物组合物中应用包括长度小于150个氨基酸的JNK抑制剂序列。

如本文使用的，术语“非慢性或慢性炎性消化病”一般表示关于胃肠道的非慢性或慢性炎性疾病。这包括食道、胃、十二指肠的第一、二、三和四部分、空肠、回肠、回盲肠的复合体、大肠、(升结肠、横结肠和降结肠)乙状结肠和直肠的疾病。在这方面优选地包括慢性炎性消化病，该病以结肠的炎症为特征，诸如结肠炎，其包括例如溃疡性结肠炎(溃疡性结肠炎)、克罗氏症(克罗恩病)、改道性结肠炎、缺血性结肠炎、传染性结肠炎、暴发性结肠炎、化学性结肠炎、显微镜性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、未定型结肠炎和非典型结肠炎等。

本发明人惊奇地发现这类JNK抑制剂序列适合于治疗对象中的这类慢性或非慢性炎性消化病。这对于现有技术不是显而易见的，也没有被现有技术暗示，即使一般而言，JNK抑制剂序列根据现有技术是已知的。

JNK是“c-Jun氨基末端激酶”的缩写，其是促分裂原活化蛋白(MAP)激酶的应激激活组的成员。这些激酶涉及控制细胞的生长和分化，更一般地说，涉及细胞对环境刺激的应答。应答环境应激(environmental stress)和通过若干类别的细胞表面受体的参与，JNK信号转导通路被激活。这些细胞表面受体可以包括细胞因子受体、蛇形受体(serpentine)和受体酪氨酸激酶。在哺乳动物细胞中，JNK也涉及生物过程，例如致癌性转化和调节对环境应激的适应性应答。JNK也与调节免疫应答相关，包括免疫细胞的成熟和分化，以及影响被免疫系统识别进行破坏的细胞中的程序性细胞死亡。这种特有的性质使得JNK信号传导成为开发药物干涉的有希望的靶标。然而，直到现在，JNK抑制剂序列的药理学作用只对有限数量的疾病显示，所述疾病包括若干神经障碍诸如缺血性发作和帕金森病，其中这些JNK抑制剂序列可以包括上游激酶抑制剂(例如，CEP-1347)、小的化学JNK抑制剂(SP600125和AS601245)——其例如通过与蛋白激酶的ATP结合位点竞争直接影响激酶活性、以及JNK与其底物(D-JNKI和I-JIP)之间的相互作用的肽抑制剂(参见，例如，Kuan等人，Current Drug Targets-CNS & Neurological Disorders，February 2005，vol.4，no.1，pp.63-67(5))。在这种情况下，上游激酶抑制剂CEP-1347(KT7515)是混合谱系激酶家族的半合成抑制剂。在抑制营养停止后原代胚培养物和分化的PC12细胞中以及在用1-甲基-4-苯基-四氢吡啶处理的小鼠中的C-Jun氨基末端激酶(JNK)活化的剂量下，CEP-1347(KT7515)促进神经元存活。进一步地，观察到CEP-1347(KT7515)促进培养的鸡胚背根神经节、交感神经、睫状和运动神经元的长期存活(参见，例如，Borasio等人，Neuroreport.9(7)：1435-1439，May 11^th 1998)。发现小的化学JNK抑制剂SP600125降低C-Jun磷酸化的水平，以防止多巴胺能神经元凋亡，并部分恢复C57BL/6N小鼠中MPTP诱导的PD中的多巴胺的水平(Wang等人，Neurosci Res.2004Feb；48(2)；195-202)。这些结果表明JNK通路是MPTP体内的神经毒性作用的主要介体，并且抑制JNK的活性可为治疗PD提供新的和有效的策略。小的化学抑制剂的进一步实例是前述的JNK-抑制剂AS601245。在脑缺血后，AS601245抑制了JNK信号传导通路，并促进细胞的存活。在体内，AS601245对在暂时性全面缺血的沙鼠模型中的海马CA1神经元的延迟损失提供了重要的保护。这种作用通过JNK抑制以及因此c-Jun表达和磷酸化作用进行调节(参见，例如Carboni等人，J Pharmacol Exp Ther.2004 Jul；310(1)：25-32.Epub 2004Feb 26^th)。然而，概括以上所述，显示的那些JNK抑制剂序列的药理作用只证明对有限数量疾病的可用性，特别是若干神经障碍诸如缺血性发作和帕金森病。因此，JNK抑制剂序列可以用于治疗非慢性或慢性炎性消化病是令人惊奇的结果。

在本发明的内容中，如以上限定的JNK抑制剂序列可以一般源于人或大鼠IB1序列，优选地源自于由依照SEQ ID NO：102(描述大鼠的IB1cDNA序列和其预测的氨基酸序列)、SEQ ID NO：103(描述由rIB1基因的外显子-内含子边界——剪接供体——编码的大鼠的IB1蛋白质序列)、SEQ ID NO：104(描述智人(Homo sapiens)的IB1蛋白质序列)或SEQ ID NO：105(描述智人的IB1 cDNA序列)的序列的任一种限定或编码的氨基酸序列，更优选地来自于由依照SEQ ID NO：104(描述智人的IB1蛋白质序列)或SEQ ID NO：105(描述智人的IB1 cDNA序列)的序列任一种限定或编码的氨基酸序列，或者来自其任何片段或者变体。换句话说，JNK抑制剂序列包括人或大鼠IB1序列的片段、变体或者这类片段的变体。人或大鼠IB序列分别由依照SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ IDNO：105的序列限定或编码。

优选地，如本文使用的这种JNK抑制剂序列包括小于150个氨基酸残基的总长度，优选地为5个到150个氨基酸残基的范围，更优选地为10个到100个氨基酸残基，特别更优选地为10个到75个氨基酸残基，和最优选地为15个到50个氨基酸残基，例如10个至30个、10个至20个或者10个至15个氨基酸残基。

更优选地，这种JNK抑制剂序列和以上的范围可以选自任一的上述序列，特别更优选地选自根据SEQ ID NO：104限定的或者由SEQ ID NO：105编码的氨基酸序列，特别更优选地为在SEQ ID NO：105的第420和第980位核苷酸之间的区域中，或者SEQ ID NO：104的第105和第291位氨基酸之间的区域中，最优选地为在SEQ ID NO：105的第561和647位核苷酸之间的区域中，或者SEQ ID NO：104的第152和第180位氨基酸之间的区域中。

根据具体的实施方式，如本文使用的JNK抑制剂序列一般结合JNK和/或抑制至少一种JNK活性转录因子的活化，例如c-Jun或ATF2(分别参见例如SEQ IDNOs：15和16)或Elk1。

同样地，如本文使用的JNK抑制剂序列优选地包括或者由根据SEQ ID NO：1至4、13至20和33至100、或者其片段、衍生物或者变体的任一个的至少一种氨基酸序列组成。更优选地，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含根据SEQ IDNO：1至4、13至20和33至100或者其变体、片段、或衍生物的1个、2个、3个、4个或甚至更多个拷贝的氨基酸序列。如果以多于一个拷贝存在，那么如本使用的根据SEQ ID NO：1至4、13至20和33至100或者其变体、片段、或衍生物的这些氨基酸序列可在没有任何连接序列情况下或经过连接序列直接地彼此连接，所述连接序列包括1至10、优选1至5个氨基酸。形成连接序列的氨基酸优选地选自甘氨酸或脯氨酸作为氨基酸残基。更优选地，如本使用的，根据SEQ IDNO：1至4、13至20和33至100或者其片段、变体或者衍生物的这些氨基酸序列可通过二个、三个或更多个的脯氨酸残基的铰合部彼此分开。

如本文使用的JNK抑制剂序列可由L-氨基酸、D-氨基酸或两者的组合组成。优选地，如本文使用的JNK抑制剂序列包括至少1个或者甚至2个D-氨基酸和/或L-氨基酸，优选至少3、4或5个，更优选至少6、7、8或9个，和甚至更优选至少10个或更多个D-和/或L-氨基酸，其中，在如本文使用的JNK抑制剂序列中，D-和/或L-氨基酸可以以模块(blockwise)、非模块或交替的方式排列。

根据一个优选的实施方式，如本文使用的JNK抑制剂序列可完全地由L-氨基酸组成。如本文使用的JNK抑制剂序列然后可包括或由根据SEQ ID NO：1或3的至少一种“天然的JNK抑制剂序列”组成。在该情况中，术语“天然的”或“天然的JNK抑制剂序列(一个或多个)”是指如本文使用的根据SEQ ID NO：1或3任一个的未改变的JNK抑制剂序列，完全地由L-氨基酸组成。

因此，如本文使用的JNK抑制剂序列可包括或者由以下组成：至少一种(天然的)氨基酸序列NH₂-X_n ^b-X_n ^a-RPTTLXLXXXXXXXQD-X_n ^b-COOH(L-IB通用的(s))[SEQ ID NO：3]和/或IB 1XRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX(L-IB(通用的))[SEQ IDNO：19]的JNK结合结构域(JBD)。在该情况下，每一个X一般表示一个氨基酸残基，优选地选自任何的(天然)氨基酸残基。X_n ^a一般表示一种氨基酸残基，优选地选自除了丝氨酸或苏氨酸之外的任何氨基酸残基，其中n(X的重复数量)是0或1。此外，每一个X_n ^b可选自任何的氨基酸残基，其中n(X的重复数量)是0-5、5-10、10-15、15-20、20-30或更多，条件是如果X_n ^a的n(X的重复数量)是0，那么X_n ^b优选地在其C-末端不包括丝氨酸或苏氨酸，以避免丝氨酸或苏氨酸在该位置。优选地，X_n ^b代表衍生自SEQ ID NO：1或3的肽残基的连续的一段序列(contiguousstretch)。X_n ^a和X_n ^b可以表示D或L氨基酸。另外，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包括或由选自以下的至少一种(天然)氨基酸序列组成：IB1DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT(L-IB1)[SEQ ID NO：17]的JNK结合结构域。更优选地，如本文使用的JNK抑制剂序列进一步可以包括或由至少一种(天然)氨基酸序列NH₂-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH(L-IB 1(s))[SEQ ID NO：1]组成。此外，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包括或由选自以下的至少一种(天然)氨基酸序列组成：IB1L-IB1(s1)(NH₂-TLNLFPQVPRSQD-COOH，SEQ ID NO：33)；L-IB1(s2)(NH₂-TTLNLFPQVPRSQ-COOH，SEQ ID NO：34)；L-IB1(s3)(NH₂-PTTLNLFPQVPRS-COOH，SEQ ID NO：35)；L-IB1(s4)(NH₂-RPTTLNLFPQVPR-COOH，SEQ ID NO：36)；L-IB1(s5)(NH₂-KRPTTLNLFPQVP-COOH，SEQ ID NO：37)；L-IB1(s6)(NH₂-PKRPTTLNLFPQV-COOH，SEQ ID NO：38)；L-IB1(s7)(NH₂-RPKRPTTLNLFPQ-COOH，SEQ ID NO：39)；L-IB1(s8)(NH₂-LNLFPQVPRSQD-COOH，SEQ ID NO：40)；L-IB1(s9)(NH₂-TLNLFPQVPRSQ-COOH，SEQ ID NO：41)；L-IB1(s10)(NH₂-TTLNLFPQVPRS-COOH，SEQ ID NO：42)；L-IB1(s11)(NH₂-PTTLNLFPQVPR-COOH，SEQ ID NO：43)；L-IB1(s12)(NH₂-RPTTLNLFPQVP-COOH，SEQ ID NO：44)；L-IB1(s13)(NH₂-KRPTTLNLFPQV-COOH，SEQ ID NO：45)；L-IB1(s14)(NH₂-PKRPTTLNLFPQ-COOH，SEQ ID NO：46)；L-IB1(s15)(NH₂-RPKRPTTLNLFP-COOH，SEQ ID NO：47)；L-IB1(s16)(NH₂-NLFPQVPRSQD-COOH，SEQ ID NO：48)；L-IB1(s17)(NH₂-LNLFPQVPRSQ-COOH，SEQ ID NO：49)；L-IB1(s18)(NH₂-TLNLFPQVPRS-COOH，SEQ ID NO：50)；L-IB1(s19)(NH₂-TTLNLFPQVPR-COOH，SEQ ID NO：51)；L-IB1(s20)(NH₂-PTTLNLFPQVP-COOH，SEQ ID NO：52)；L-IB1(s21)(NH₂-RPTTLNLFPQV-COOH，SEQ ID NO：53)；L-IB1(s22)(NH₂-KRPTTLNLFPQ-COOH，SEQ ID NO：54)；L-IB1(s23)(NH₂-PKRPTTLNLFP-COOH，SEQ ID NO：55)；L-IB1(s24)(NH₂-RPKRPTTLNLF-COOH，SEQ ID NO：56)；L-IB1(s25)(NH₂-LFPQVPRSQD-COOH，SEQ ID NO：57)；L-IB1(s26)(NH₂-NLFPQVPRSQ-COOH，SEQ ID NO：58)；L-IB1(s27)(NH₂-LNLFPQVPRS-COOH，SEQ ID NO：59)；L-IB1(s28)(NH₂-TLNLFPQVPR-COOH，SEQ ID NO：60)；L-IB1(s29)(NH₂-TTLNLFPQVP-COOH，SEQ ID NO：61)；L-IB1(s30)(NH₂-PTTLNLFPQV-COOH，SEQ ID NO：62)；L-IB1(s31)(NH₂-RPTTLNLFPQ-COOH，SEQ ID NO：63)；L-IB1(s32)(NH₂-KRPTTLNLFP-COOH，SEQ ID NO：64)；L-IB1(s33)(NH₂-PKRPTTLNLF-COOH，SEQ ID NO：65)；和L-IB1(s34)(NH₂-RPKRPTTLNL-COOH，SEQ ID NO：66)的JNK结合结构域。

另外，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包括或者由选自以下的至少一种(天然)氨基酸序列组成：IB1 PGTGCGDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT(IB1-长)[SEQID NO：13]的(长)JNK结合结构域(JBD)、IB2IPSPSVEEPHKHRPTTLRLTLGAQDS(IB2-长)[SEQ ID NO：14]的(长)JNK结合结构域、c-Jun GAYGYSNPKILKQSMTLNLADPVGNLKPH(c-Jun)[SEQ ID NO：15]的JNK结合结构域、ATF2TNEDHLAVHKHKHEMTLKFGPARNDSVIV(ATF2)[SEQ ID NO：16]的JNK结合结构域(参见，例如，图1A-1C)。在该内容中，比对显示部分保守的8个氨基酸序列(参见，例如，图1A)，而IB1和IB2的JBDs的进一步比较显示两个序列之间高度保守的7个和3个氨基酸的两个区段。

根据另一优选实施方式，如本文使用的JNK抑制剂序列可部分地或全部地由D-氨基酸组成，如上限定的。更优选地，由D-氨基酸组成的这些JNK抑制剂序列是上述(天然的)JNK抑制剂序列的非天然的D逆反(retro-inverso)序列。术语“逆反序列”是指线性肽序列的异构体，其中序列的方向是相反并且每一个氨基酸残基的手性颠倒(参见，例如Jameson等人，Nature，368，744-746(1994)；Brady等人，Nature，368，692-693(1994))。结合D-对映体和反向合成的优点是在每一个酰胺键中羰基和氨基的位置被交换，同时在每一个α碳处的侧链基团的位置被保留。除非另外具体说明，假定通过合成相应的天然L-氨基酸序列或肽的逆向的序列或肽，根据本发明使用的任何给定L-氨基酸序列或肽可以转化成为D逆反序列或肽。

如本文使用的和如上所定义的D逆反序列具有许多有用的特性。例如，本文使用的D逆反序列与本文使用的L-氨基酸序列一样有效地进入细胞，然而，本文使用的D-逆反序列比相应的L-氨基酸序列更稳定。

因此，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包括或者由至少一种根据氨基酸序列NH₂-X_n ^b-DQXXXXXXXLXLTTPR-X_n ^a-X_n ^b-COOH(D-IB1通用的(s))[SEQ ID NO：4]和/或XS/TDQXXXXXXXLXLTTPRX(D-IB(通用))[SEQ ID NO：20]的D逆反序列组成。如在该内容中使用的，X、X_n ^a和X_n ^b是如上所定义的(优选地，表示D氨基酸)，其中，X_n ^b优选地表示衍生自SEQ ID NO：2或4的连续一段的残基。另外，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包括或由根据包括IB1TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD(D-IB1)[SEQ ID NO：18]的JNK结合结构域(JBD)的氨基酸序列的至少一种D逆反序列组成。更优选地，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包括或由根据氨基酸序列NH₂-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH(D-IB1(S))[SEQ ID NO：2]的至少一种D逆反序列组成。此外，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包括或者由根据如此氨基酸序列的至少一种D逆反序列组成，所述氨基酸序列包括以下序列的JNK结合结构域(JBDs)：IB1D-IB1(s1)(NH₂-QPFLNLTTPRKPR-COOH，SEQ ID NO：67)；D-IB1(s2)(NH₂-VQPFLNLTTPRKP-COOH，SEQ ID NO：68)；D-IB1(s3)(NH₂-PVQPFLNLTTPRK-COOH，SEQ ID NO：69)；D-IB1(s4)(NH₂-RPVQPFLNLTTPR-COOH，SEQ ID NO：70)；D-IB1(s5)(NH₂-SRPVQPFLNLTTP-COOH，SEQ ID NO：71)；D-IB1(s6)(NH₂-QSRPVQPFLNLTT-COOH，SEQ ID NO：72)；D-IB1(s7)(NH₂-DQSRPVQPFLNLT-COOH，SEQ ID NO：73)；D-IB1(s8)(NH₂-PFLNLTTPRKPR-COOH，SEQ ID NO：74)；D-IB1(s9)(NH₂-QPFLNLTTPRKP-COOH，SEQ ID NO：75)；D-IB1(s10)(NH₂-VQPFLNLTTPRK-COOH，SEQ ID NO：76)；D-IB1(s11)(NH₂-PVQPFLNLTTPR-COOH，SEQ ID NO：77)；D-IB1(s12)(NH₂-RPVQPFLNLTTP-COOH，SEQ ID NO：78)；D-IB1(s13)(NH₂-SRPVQPFLNLTT-COOH，SEQ ID NO：79)；D-IB1(s14)(NH₂-QSRPVQPFLNLT-COOH，SEQ ID NO：80)；D-IB1(s15)(NH₂-DQSRPVQPFLNL-COOH，SEQ ID NO：81)；D-IB1(s16)(NH₂-FLNLTTPRKPR-COOH，SEQ ID NO：82)；D-IB1(s17)(NH₂-PFLNLTTPRKP-COOH，SEQ ID NO：83)；D-IB1(s18)(NH₂-QPFLNLTTPRK-COOH，SEQ ID NO：84)；D-IB1(s19)(NH₂-VQPFLNLTTPR-COOH，SEQ ID NO：85)；D-IB1(s20)(NH₂-PVQPFLNLTTP-COOH，SEQ ID NO：86)；D-IB1(s21)(NH₂-RPVQPFLNLTT-COOH，SEQ ID NO：87)；D-IB1(s22)(NH₂-SRPVQPFLNLT-COOH，SEQ ID NO：88)；D-IB1(s23)(NH₂-QSRPVQPFLNL-COOH，SEQ ID NO：89)；D-IB1(s24)(NH₂-DQSRPVQPFLN-COOH，SEQ ID NO：90)；D-IB1(s25)(NH₂-DQSRPVQPFL-COOH，SEQ ID NO：91)；D-IB1(s26)(NH₂-QSRPVQPFLN-COOH，SEQ ID NO：92)；D-IB1(s27)(NH₂-SRPVQPFLNL-COOH，SEQ ID NO：93)；D-IB1(s28)(NH₂-RPVQPFLNLT-COOH，SEQ ID NO：94)；D-IB1(s29)(NH₂-PVQPFLNLTT-COOH，SEQ ID NO：95)；D-IB1(s30)(NH₂-VQPFLNLTTP-COOH，SEQ ID NO：96)；D-IB1(s31)(NH₂-QPFLNLTTPR-COOH，SEQ ID NO：97)；D-IB1(s32)(NH₂-PFLNLTTPRK-COOH，SEQ ID NO：98)；D-IB1(s33)(NH₂-FLNLTTPRKP-COOH，SEQ ID NO：99)；和D-IB1(s34)(NH₂-LNLTTPRKPR-COOH，SEQ ID NO：100)。

如本文使用的和如以上公开的JNK抑制剂序列在表1中提供(SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100)。该表提供如本文使用的JNK抑制剂序列的名称、以及它们的序列标识号、它们的长度以及氨基酸序列。此外，表1分别显示序列以及它们的通式，例如SEQ ID NO：1、2、5、6、9和11以及SEQ ID NO：3、4、7、8、10和12。表1进一步地公开嵌合序列SEQ ID NO：9-12和23-32(参见以下)、L-IB1序列SEQ ID NO：33至66以及D-IB1序列SEQ ID NOs：67至100。

表1

根据另一个优选的实施方式，如本文使用的JNK抑制剂序列包括或由至少一种如上定义的根据SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的天然的或非天然的氨基酸序列的变体、片段和/或衍生物组成。优选地，这些变体、片段和/或衍生物保留了如本文使用的以上公开的天然的或非天然的JNK抑制物序列的生物学活性，特别是根据SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的天然或非天然氨基酸序列的生物学活性，即，结合JNK和/或抑制至少一种JNK活性转录因子例如c-Jun、ATF2或Elk1的活化。可通过多种试验或通过生物物理方法测试功能性，所述试验例如，肽与其靶分子的结合试验，所述生物物理方法例如光谱、计算机模拟、结构分析等。特别地，通过亲水性分析(参见，例如，Hopp和Woods，1981.Proc Natl Acad Sci USA 78：3824-3828)可分析如上所限定的JNK抑制剂序列或其变体、片段和/或衍生物，该亲水性分析可用于识别肽的疏水和亲水区域，因此有助于实验操纵例如结合实验或抗体合成的底物的设计。也可进行二级结构分析，以识别如本文使用的呈现特异性结构模体的JNK抑制剂序列或其变体、片段和/或衍生物(参见，例如Chou and Fasman，1974，Biochem 13：222-223)的区域。使用本领域中可用的计算机软件程序，可实现操纵、翻译、二级结构预测、亲水性和疏水性分布图、开放读框预测和绘图、以及序列同一性的确定。也可以使用结构分析的其它方法，其包括例如X射线结晶学(参见，例如Engstrom，1974.Biochem Exp Biol 11：7-13)、质谱和气相色谱法(参见，例如METHODS IN PROTEIN SCIENCE，1997，J.Wiley and Sons，New York，NY)和计算机模拟(参见，例如Fletterick和Zoller，eds.，1986.Computer Graphics and Molecular Modeling，In：CURRENT COMMUNICATIONS IN MOLECULARBIOLOGY，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。

因此，如本文使用的JNK抑制剂序列可包括或由至少一种根据SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的变体组成。在本发明的内容中，“根据SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的变体”优选为衍生自根据SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的任一序列，其中所述变体包括根据SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的氨基酸序列的氨基酸替代。这些替代一般包括根据SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的氨基酸的1到20、优选的1到10、以及更优选的1到5的氨基酸的置换、加成和/或缺失，其中变体显示出与根据SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的任一序列的至少大约30％、50％、70％、80％、90％、95％、98％或甚至99％的序列同一性。

如果通过特定氨基酸的置换获得如上定义和本文使用的根据SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的变体，则这种置换优选地包括保守氨基酸置换。保守氨基酸置换可包括具有十分类似的物理化学性质的一组内的同义氨基酸残基，使得该组成员之间的置换将保留分子的生物学活性(参见，例如Grantham，R.(1974)，Science 185，862-864)。对于本领域的技术人员显而易见的是，在上面所定义的序列中也可插入和/或缺失氨基酸而不会改变它们的功能，特别是，如果插入和/或缺少仅仅涉及到少量的氨基酸，例如少于20，和优选的少于10，并且不会去除或取代对于功能活性非常关键的氨基酸。而且，如本文使用的变体中将避免置换，该置换将导致在容易接近磷酸化酶——优选为激酶——的氨基酸位置处产生另外的苏氨酸，以便避免在体内或体外失活如本文使用的JNK抑制剂序列或失活如本文使用的嵌合肽。

优选地，表2中定义了同义氨基酸残基，其可被分类为同一组并通过保守氨基酸置换一般是可交换的。

表2

如本文使用的SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的变体的特定形式是根据如本文使用的SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的片段，与SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100相比较，其一般通过至少一个缺失进行进行改变。优选地，片段包括SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的任一的至少4个连续的氨基酸，这是通常足以允许特异性识别来自任一的这些序列表位的长度。甚至更优选地，片段包括SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的任一的4到18、4到15、或最优选4到10个连续的氨基酸，其中范围的下限可以是4或5、6、7、8、9或10。缺失的的氨基酸可发生在SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的任意位置，优选地在N-或C-末端。

此外，如上所述的根据SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的片段可定义为如此序列，所述序列与如本文使用的根据SEQ IDNO：1-4、13-20和33-100的任一序列共有至少大约30％、50％、70％、80％、90％、95％、98％、或甚至99％的序列同一性。

如本文使用的JNK抑制剂序列可进一步包括或由至少一种如以上定义的根据SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的衍生物组成。在该内容中，“根据SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的衍生物”优选为衍生自根据SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的任一序列的氨基酸序列，其中该衍生物包括至少一种修饰的L-或D-氨基酸(形成非天然的氨基酸(一种或多种))，优选为1至20个、更优选地为1到10个、和甚至更优选地为1至5个修饰的L-或D-氨基酸。变体或片段的衍生物也落入本发明的范围内。

在该方面中的“修饰的氨基酸”可以是任意的氨基酸，该氨基酸可例如通过在各种不同的有机体中的不同的糖基化、通过磷酸化、或通过标记特定的氨基酸进行改变。然后，这种标记通常选自包括以下的标记：

(i)放射性标记，即，放射性磷酸化或使用硫、氢、碳、氮等的放射性标记；

(ii)有色染料(例如地高辛等)；

(iii)荧光基团(例如荧光素等)；

(iv)化学发光基团；

(v)用于在固相上固定化的基团(例如His-标签、生物素、strep-标签、flag-标签、抗体、抗原等等)；和

(vi)(i)到(v)所述的两种或更多种标记的标记组合。

在上文中，具有与本发明的查询氨基酸序列“共有”例如至少95％“序列同一性”的序列的氨基酸序列意欲指目标氨基酸序列的序列与查询序列完全一样，除了目标氨基酸序列可包括查询氨基酸序列的每100个氨基酸的多达5个氨基酸改变。换句话说，为了得到与查询氨基酸序列具有至少95％同一性的序列的氨基酸序列，目标序列中多达5％(100中的5个)氨基酸残基可用别的氨基酸插入或取代、或被缺失。

对于不具有准确对应的序列，第一序列的“同一性％”可以相对于第二序列进行确定。一般而言，待比较的这两个序列进行比对以给出序列之间的最大相关性。这可包括在一个或两个序列中插入“缺口”，以增强比对的程度。然后，可在被比较的每一个序列的全长度范围上确定同一性％(所谓的总体对比)，这特别适合于相同或类似长度的序列，或在较短、限定的长度上确定同一性(所谓局部对比)，其更适合于不相等长度的序列。

用于比较两个或更多个序列——特别是如在本文使用的——的同一性和同源性的方法本领域是熟知的。因此，作为例子，在Wisconsin Sequence Analysis Package，version 9.1(Devereux et al.，1984，Nucleic Acids Res.12，387-395.)中可获得的程序，例如程序BESTFIT和GAP，可用于确定两个多核苷酸之间的同一性％，以及两个多肽序列之间的同一性％和同源性％。BESTFIT使用(Smith和Waterman(1981)，J.Mol.Biol.147，195-197.)的“局部同源性”算法，并发现两个序列之间的相似性最好的单区域。用于确定序列之间的同一性和/或相似性的其他程序也是本领域熟知的，例如BLAST家族的程序(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215，403-410)，通过万维网站ncbi.nlm.nih.gov的NCBI的主页可进入)和FASTA(Pearson(1990)，Methods Enzymol.183，63-98；Pearson和Lipman(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 85，2444-2448.)。

通过本领域熟知的方法，例如通过如下所讨论的化学合成或通过基因工程方法，可得到或生成根据本发明使用的和如上定义的JNK-抑制剂序列。例如，通过使用多肽合成仪，可合成与本文使用的JNK抑制剂序列的一部分相应的肽——其包括所述JNK抑制剂序列的期望区域，或在生物体外或体内调节期望的活性的肽。

如本文使用的和如以上定义的JNK抑制剂序列可以通过运输序列(trafficking sequence)进一步地修饰，这允许如本文使用和如以上定义的JNK抑制剂序列被更有效地转运进入细胞中。这种修饰的JNK抑制剂序列被优选地提供和被用作为嵌合序列。

因此，根据本发明的第二方面提供一种嵌合肽——其包括至少一个第一结构域和至至少一个第二结构域——在制备用于治疗对象中的非慢性或慢性炎性消化病的药物组合物中的应用，其中嵌合肽的第一结构域包括运输序列，而嵌合肽的第二结构域包括如上所定义的JNK抑制剂序列，优选地为根据SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的任一序列或者其衍生物或片段的JNK抑制剂序列。

一般地，如使用的根据本发明的嵌合肽具有至少25个氨基酸残基的长度，例如25至250氨基酸残基，更优选为25至200个氨基酸残基，甚至更优选为25至150个氨基酸残基，25到100个氨基酸残基，以及最优选为25至50个氨基酸残基。

作为第一结构域，如本文使用的嵌合肽优选地包括运输序列，其一般选自如此的任意氨基酸序列，该序列指引肽(在该肽中它存在)进入期望的细胞目的地。因此，如本文使用的运输序列一般指引该肽越过质膜，例如，从细胞外部通过质膜并进入细胞质。可选地或另外地，通过例如结合两个成分(例如细胞渗透性成分和细胞核定位成分)或通过具有例如细胞膜转运和靶向例如细胞核内转运的性质的一个单一成分，该运输序列可指引该肽到细胞内期望的位置，例如细胞核、核糖体、内质网(ER)、溶酶体、或过氧化物酶体。该运输序列可附加地包括另外的成分，其能够结合细胞质成分或细胞的任何其它成分或区室(例如内质网、线粒体、高尔基体、溶酶体囊泡)。因此，例如，第一结构域的运输序列和第二结构域的JNK抑制剂序列可位于细胞质或细胞的任何其它区室中。这允许在摄取后确定嵌合肽在细胞中的位置。

优选地，运输序列(被包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中)具有5到150个氨基酸序列的长度，更优选地具有5到100个氨基酸的长度，以及最优选地为5到50个氨基酸的长度、5到30个氨基酸的长度或甚至5到15个氨基酸的长度。

更优选地，运输序列(包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中)可作为第一结构域中连续的氨基酸序列延伸中出现。可选地，第一结构域中的运输序列可被分裂成两个或更多个片段，其中所有这些片段与整个运输序列类似，并可以通过1到10、优选为1到5氨基酸彼此分隔开，条件是这些运输序列同样地保留如上所公开的其载体性质。分隔开运输序列片段的这些氨基酸可以例如选自与运输序列不同的氨基酸序列。可选地，第一结构域可包含由多于一个成分组成的运输序列，每一成分具有其自身的用于将第二结构域的货物JNK抑制剂序列转运到例如特定的细胞区室的功能。

如上所定义的运输序列可以由L-氨基酸、D-氨基酸、或两者的组合组成。优选地，运输序列(包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中)可以包括至少1个或甚至2个，优选为至少3、4或5个，更优选地为至少6、7、8或9个，以及甚至更优选为至少10个或更多个D-和/或L-氨基酸，其中，D-和/或L-氨基酸在JNK运输序列中可以以模块化、非模块化或交替的方式排列。

根据一个可选的实施方式，如本文使用的嵌合肽的运输序列可以完全地由L-氨基酸组成。更优选地，如本文使用的嵌合肽的运输序列包括或由至少一种如上所定义的“天然的”运输序列组成。在本文中，术语“天然的”是指未改变的运输序列，完全地由L-氨基酸组成。

根据另一可选的实施方式，如本文使用的嵌合肽的运输序列可完全地由D-氨基酸组成。更优选地，如本文使用的嵌合肽的运输序列可包括如上所陈述序列的D逆反肽。

从天然出现的来源可以获得、或通过使用基因工程技术或化学合成可生产如本文使用的嵌合肽的第一结构域的运输序列(参见，例如，Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.(1989)Molecular cloning：A laboratory manual.2nd edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。

可以使用的第一结构域的运输序列的来源包括例如天然蛋白质例如TAT蛋白质(例如，如在美国专利5,804,604和5,674,980中描述的，这些文献中的每一篇通过引用被并入本文)、VP22(例如在WO 97/05265；Elliott和O′Hare，Cell 88：223-233(1997)中描述的)、非病毒蛋白(Jackson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10691-10695(1992))、衍生自触角足的运输序列(例如触角足载体序列)或衍生自碱性肽的运输序列，例如该肽具有5至15个氨基酸、优选为10到12个氨基酸的长度，并包括至少80％、更优选85％或甚至更优选90％的碱性氨基酸，例如，诸如精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸。此外，用作运输序列的天然蛋白质之一的变体、片段和衍生物一并公开。关于变体、片段和衍生物，其是指本文使用的JNK抑制剂序列的以上给出的定义。根据上述的如本文使用的JNK抑制剂序列，相应地定义变体、片段以及衍生物。特别地，在运输序列的内容中，变体或片段或衍生物可以被定义为如此序列，其与用作为如上定义的运输序列的天然蛋白质之一共有至少约30％、50％、70％、80％、90％、95％、98％、或甚至99％的序列同一性。

在如本文使用的嵌合肽的优选实施方式中，第一结构域的运输序列包括或由衍生自人类免疫缺陷病毒(HIV)1TAT蛋白的序列组成，特别是组成TAT蛋白的-些或所有的86个氨基酸。

对于运输序列(其被包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中)，全长TAT蛋白的部分序列可以用于形成TAT蛋白的功能有效的片段，即，包括调节进入和摄取入细胞的区域的TAT肽。至于该序列是否是TAT蛋白的功能有效的片段，可以使用已知的技术进行确定(例如Franked等人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 86：7397-7401(1989))。因此，在如本文使用的嵌合肽的第一结构中的运输序列可衍生自TAT蛋白序列的功能有效的片段或部分，其包括小于86个氨基酸，并且其显示摄取进入细胞，甚至任选地摄取进入细胞核。更优选地，被用作载体以调节嵌合肽跨越细胞膜的渗透性的TAT的部分序列(片段)意欲包括全长TAT的碱性区域(氨基酸48到57或49到57)。

根据一个更优选的实施方式，运输序列(被包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中)可包括或由包含TAT残基48到57或49到57的氨基酸序列组成，和最优选为通用的TAT序列NH₂-X_n ^b-RKKRRQRRR-X_n ^b-COOH(L-通用-TAT(s))[SEQID NO：7]和/或XXXXRKKRRQ RRRXXXX(L-通用-TAT)[SEQ ID NO：21]，其中X或X_n ^b为如上所定义的。此外，SEQ ID NO：8中的“X_n ^b”的数量不限于所描述的，并且可以如上所述地变化。可选地，如本文使用的嵌合肽的第一结构域中包括的运输序列可以包括或由包含例如氨基酸序列NH₂-GRKKRRQRRR-COOH(L-TAT)[SEQ ID NO：5]的肽组成。

根据另一更优选的实施方式，运输序列(被包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中)可包括如上所述的序列的D逆反肽，即，具有序列NH₂-X_n ^b-RRRQRRKKR-X_n ^b-COOH(D-通用-TAT(s))[SEQ ID NO：8]和/或XXXXRRRQRRKKRXXXX(D-通用-TAT)[SEQ ID NO：22]的通用的TAT序列的D逆反序列。在此，X_n ^b也如上所定义(优选地表示D氨基酸)。此外，在SEQ ID NO：8中，“X_n ^b”残基的数目不限于所描述的，并且可如上所述地变化。最优选地，本文使用的运输序列可包括D逆反序列NH₂-RRRQRRKKRG-COOH(D-TAT)[SEQID NO：6]。

根据另一优选实施方式，被包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中的运输序列可以包括或由如上所定义的运输序列的变体组成。“运输序列的变体”优选地是衍生自如上所定义的运输序列的序列，其中所述变体包括修饰，例如，如上所定义的运输序列中存在的至少一个氨基酸的添加、(内部的)缺失(产生片段)和/或取代。这种修饰(一种或多种)一般包括1到20，优选地为1到10，以及最优选地为1到5个氨基酸的取代、添加和/或缺失。此外，所述变体优选显示出与如上所定义的运输序列的序列同一性，更优选地与SEQ ID NO：5至8或21-22中的任一个显示出至少大约30％、50％、70％、80％、90％、95％、98％或甚至99％的序列同一性。

优选地，被包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中的运输序列的这种修饰导致了运输序列增加或降低稳定性。可选地，可设计运输序列的变体以调节本文使用的嵌合肽的细胞内位置。当外源地添加时，一般设计如上所定义的这种变体，使得运输序列进入细胞的能力被保留(即，运输序列的变体摄取进入细胞与使用运输序列的天然蛋白质基本相似)。例如，被认为对于核定位很重要的碱性区域的改变(参见，例如Dang和Lee，J.Biol.Chem.264：18019-18023(1989)；Hauber等人，J.Virol.63：1181-1187(1989)；等人，J.Virol.63：1-8(1989))可导致运输序列的胞质定位或部分胞质定位，和因此作为本文使用的嵌合肽的成分的JNK抑制剂序列的胞质定位或部分胞质定位。除了以上之外，进一步的修饰也可被引入所述变体中，例如通过连接诸如胆固醇或其它脂质部分到运输序列以产生具有增加的膜溶解性的运输序列。被包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中的运输序列的以上公开的任一变体，可以使用技术人员一般熟知的技术产生(参见，例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.(1989)Molecular cloning：A laboratory manual.2nd edition.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)。

作为第二结构域，如本文使用的嵌合肽一般包括JNK抑制剂序列，其选自如上定义的任一的JNK抑制剂序列，包括这些JNK抑制剂序列的变体、片段和/或衍生物。

两个结构域，即，如本文使用的嵌合肽的第一和第二结构域，可连接，诸如以形成功能单元。本领域熟知的连接第一和第二结结构域的任何方法可以被应用。

根据一个实施方式，如本文使用的嵌合肽的第一和第二结构域优选地通过共价键连接。如本文定义的共价键可以是诸如肽键，其可通过表达如上定义的嵌入蛋白作为融合蛋白获得。可以形成如本文描述的融合蛋白，并且以类似于如下所描述的标准重组DNA技术或者从其容易改进的方式进行使用。然而，两个结构域也可以经过侧链连接或可以通过化学连接体部分进行连接。

如本文使用的嵌合肽的第一和/或第二结构域可以在所述嵌合肽中以一个或多个拷贝出现。如果两个结构域都以单拷贝存在，那么第一结构域可连接到第二结构域的N-末端或C-末端。如果以多拷贝存在，则第一和第二结构域可以以任何可能的顺序排列。例如，第一结构域可以在本文使用的嵌合肽中以多拷贝数量存在，例如以2、3或更多拷贝，其优选地以连续的顺序排列。那么，第二结构域可以单拷贝存在，出现包括第一结构域的序列的N-或C-末端。可选地，第二结构域可以多拷贝存在，例如以2、3或更多的拷贝，并且第一结构域可以以单拷贝存在。根据两种可选择的方法，第一和第二结构域可以以连续排列置于任何位置。示例性的排列下述方式显示：例如，第一结构域-第一结构域-第一结构域-第二结构域；第一结构域-第一结构域-第二结构域-第一结构域；第一结构域-第二结构域-第一结构域-第一结构域；或例如，第二结构域-第一结构域-第一结构域-第一结构域。本领域的技术人员将很好理解，这些实例仅用于说明的目的，而不限制本发明的范围于此。因此，拷贝的数目和排列可以如最初定义地变化。

优选地，第一和第二结构域可以直接地彼此连接，而没有任何连接体。可选地，它们可以经由连接体序列互相连接，所述连接体序列包括1到10个、优选地1到5个氨基酸。形成连接体序列的氨基酸优选地选择甘氨酸或脯氨酸作为氨基酸残基。更优选地，第一和第二结构域可通过在第一和第二结构域之间的2、3或更多个脯氨酸残基的铰合部彼此分隔开。

如上所定义和本文使用的嵌合肽——包括至少一个第一结构域和至少一个第二结构域——可由L-氨基酸、D-氨基酸或两者的组合组成。因此，每一个结构域(以及使用的连接体)可以由L-氨基酸、D-氨基酸或两者的组合(例如D-TAT和L-IB1(s)或L-TAT和D-IB1(s)等)组成。优选地，如本文使用的嵌合肽可包括至少1或甚至2个，优选地为至少3、4或5个，更优选地为至少6、7、8或9个和甚至更优选地为至少10个或更多个D-氨基酸和/或L-氨基酸，其中，D-和/或L-氨基酸在如本文使用的嵌合肽中可以以模块、非模块或交替的方式排列。

根据一个具体实施方式，如本文使用的嵌合肽包括或由根据通用的L-TAT-IB肽NH₂-X_n ^b-RKKRRQRRR-X_n ^b-X_n ^a-RPTTLXLXXXXXXXQD-X_n ^b-COOH(L-TAT-IB(通用的)(s))[SEQ ID NO：10]的L-氨基酸嵌合肽组成，其中X、X_n ^a和X_n ^b优选地为如上所定义的。更优选地，如本文使用的嵌合肽包括或由L-氨基酸嵌合肽NH₂-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH(L-TAT-IB1(s))[SEQID NO：9]组成。可选地或附加地，本文使用的嵌合肽包括或由L-氨基酸嵌合肽序列GRKKRRQRRR PPDTYRPKRP TTLNLFPQVP RSQDT(L-TAT-IB1)[SEQ ID NO：23]、或XXXXXXXRKK RRQRRRXXXX XXXXRPTTLX LXXXXXXXQD S/TX(L-TAT-IB通用)[SEQ ID NO：24]组成，其中X也优选为如上定义，或者如本文使用的嵌合肽包括或由L-氨基酸嵌合肽序列RKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD(L-TAT-IB1(s1))[SEQ ID NO：27]、GRKKRRQRRRX_n ^cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD(L-TAT-IB1(s2))[SEQ ID NO：28]或RKKRRQRRRX_n ^cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD(L-TAT-IB1(s3))[SEQ ID NO：29]组成。在该内容中，每个X一般表示如上定义的氨基酸残基，更优选地X_n ^c表示肽残基的连续一段序列，每个X彼此独立地选自甘氨酸或脯氨酸，例如单调的甘氨酸一段序列或者单调的脯氨酸一段序列，其中n(X_n ^c的重复数量)一般为0-5、5-10、10-15、15-20、20-30或者甚至更多，优选地为0-5或5-10。X_n ^c可以表示D或L氨基酸。

根据一个可选的具体实施方式，如本文使用的嵌合肽包括或由以上公开的L-氨基酸嵌合肽的D-氨基酸嵌合肽组成。根据本发明的示例性D逆反嵌合肽是诸如通用的D-TAT-IB肽NH₂-X_n ^b-DQXXXXXXXLXLTTPR-X_n ^a-X_n ^b-RRRQRRKKR-X_n ^b-COOH(D-TAT-IB(通用)(s))，[SEQ ID NO：12]。在此，X、X_n ^a和X_n ^b优选为如上所定义(优选地表示D氨基酸)。更优选地，本文使用的嵌合肽包括或由根据TAT-IB1肽NH₂-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH(D-TAT-IB1(s))[SEQID NO：11]的D-氨基酸嵌合肽组成。可选地或附加地，如本文使用的嵌合肽包括或由D-氨基酸嵌合肽序列TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTDPPRRRQRRKKRG(D-TAT-IB1)[SEQ ID NO：25]、或XT/SDQXXXXXXXLXLTTPRXXXXXXXXRRRQRRKKRXXXXXXX(D-TAT-lB通用的)[SEQ ID NO：26]组成，其中X也优选为如上定义，或者如本文使用的嵌合肽包括或由D-氨基酸嵌合肽序列DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKR(D-TAT-lB1(s1))[SEQ ID NO：30]、DQSRPVQPFLNLTTPRKPRX_n ^cRRRQRRKKRG(D-TAT-IB1(s2))[SEQ ID NO：31]或DQSRPVQPFLNLTTPRKPRX_n ^cRRRQRRKKR(D-TAT-IB1(s3))[SEQ ID NO：32]组成。X_n ^c可以是如上定义的。

如上定义的嵌合肽的第一和第二结构域可以通过化学或生物化学偶联彼此连接，以本领域中已知的任何合适的方式进行，例如通过在第一和第二域之间建立肽键，例如通过将第一和第二结构域表达为融合蛋白，或例如通过交联如上定义的嵌合肽的第一和第二结构域。

许多已知的适合于如上定义的嵌合肽的第一和第二结构域的化学交联的方法是非特异性的，即，它们不引导偶联点到运输多肽或货物大分子上的任何具体位置。结果，非特异性交联剂的使用可能攻击功能位点或空间阻碍活性位点，这使得缀合蛋白质生物失活。因此，优选地，使用这种交联方法，其允许第一和第二结构域更特异的偶联。

在该内容中，增加偶联特异性的一种方式是直接化学偶联到在被交联的第一和第二结构域中的一个或两个都仅出现一次或几次的官能团。例如，半胱氨酸——其是唯一的包含巯基的蛋白质氨基酸——在许多蛋白质中只出现几次。同样地，例如，如果多肽不包含赖氨酸残基，那么对伯胺特异性的交联剂对于该多肽的氨基末端将是选择性的。增加偶联特异性的这种方法的成功应用要求该多肽在分子区域中具有可以被改变而不丧失分子的生物学活性的适当少且有活性的残基。当半胱氨酸残基出现在多肽序列部分中——在该部分中它们参与交联反应将另外可能地干扰生物学活性——的时候，该半胱酸胺残基可以被置换。当半胱酸胺残基被置换时，一般期望最小化所引起的多肽折叠变化。当置换与半胱氨酸在化学上和空间上类似时，多肽折叠中的变化将最小化。由于这些原因，丝氨酸优选作为半胱氨酸的置换物。如在以下的实施例中阐述的，出于交联的目的，半胱氨酸残基可以被引入多肽的氨基酸序列中。当半胱氨酸残基被引入时，优选在氨基或羧基末端或附近引入。可使用常规的方法用于该氨基酸序列修饰，其中，通过化学合成或重组DNA表达产生感兴趣的多肽。

如上定义和本文使用的嵌合肽的第一和第二结构域的偶联也可以经过偶联剂或结合剂实现。有多种可使用的分子间交联剂(参见，例如，Means和Feeney，CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS，Holden-Day，1974，pp.39-43)。在这些当中，试剂是诸如：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)或N，N′-(1，3-亚苯基)双马来酰亚胺(两者对于巯基都是高度特异性的，并且形成不可逆的键合)；N，N′-1，2-亚乙基-(碘代乙酰胺)或具有6到11个碳亚甲桥的其它这种试剂(它们对于巯基是相对特异性的)；和1，5-二氟-2，4-二硝基苯(其与氨基和酪氨酸基团形成不可逆的键合)。用于该目的其它交联剂包括：p，p′-二氟-m，m′-二硝基二苯砜(其与氨基和酚基团形成不可逆的交联)；二甲基己二亚酰胺化物(dimethyl adipimidate)(其对于氨基是特异性的)；苯酚-1，4-二磺酰氯(其主要与氨基反应)；1，6-己二异氰酸酯或二异硫代氰酸酯、或苯偶氮基-对-二异氰酸盐(其主要与氨基反应)；戊二醛(其与几个不同的侧链反应)和去重氮联苯胺(disdiazobenzidine)(其主要与酪氨酸和组氨酸反应)。

用于交联如上定义的嵌合肽的第一和第二结构域的交联剂可以是同双功能的，即具有进行相同反应的两个官能团。优选的同双功能交联剂是二马来酰亚胺基己烷(“BMH”)。BMH包括两个马来酰亚胺官能团，其在温和条件(pH 6.5-7.7)下与包含巯基的化合物特异性地反应。该两个马来酰亚胺基团通过烃链连接。因此，BMH对于包含半胱氨酸残基的多肽的不可逆交联是有用的。

用于交联如上定义的嵌合肽的第一和第二结构域的交联剂也可以是异双功能的。异双功能交联剂具有两个不同的官能团，例如氨反应性基团和硫烃反应性基团，其将分别交联具有自由氨和硫烃的两种蛋白质。异双功能交联剂的实例是琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(“SMCC”)、间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(“MBS”)和琥珀酰亚胺4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(“SMPB”)、和MBS延伸链类似物。这些交联剂的琥珀酰亚胺基团与伯胺反应，并且硫烃反应性的马来酰亚胺与半胱胺酸残基的硫烃形成共价键。

适合于交联如上定义的嵌合肽的第一和第二结构域的交联剂在水中通常具有低溶解性。亲水部分例如磺酸盐基团因此可加入到交联剂中，以提高其水溶性。在这方面，Sulfo-MBS和Sulfo-SMCC是水溶性修饰的交联剂的实例，其可以根据本发明进行使用。

同样地，许多交联剂生成在细胞条件下基本上是不可切割的偶联物。然而，一些特别适合于交联如上定义的嵌合肽的第一和第二结构域的交联剂包含共价键，例如二硫键，其在细胞条件下是可切割的。例如，Traut试剂、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(“DSP”)以及N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(“SPDP”)都是熟知的可切割的交联剂。可切割交联剂的使用允许货物部分与运输多肽在递送进入靶细胞后分离。直接的二硫键同样可以是有用的。

包括如上讨论的许多交联剂都是商业可获得的。它们使用的详细说明书从商业供应商是容易获得的。蛋白质交联和偶联物制备的通常参考文献是：Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING，CRC Press(1991)。

如上定义的嵌合肽的第一和第二结构域的化学交联可以包括间隔臂的使用。间隔臂提供分子内的柔性或调节偶联部分之间的分子内距离，并因此有助于保持生物学活性。间隔臂可以为多肽部分的形式，其包括间隔氨基酸，例如脯氨酸。可选地，间隔臂可以是交联剂的一部分，例如在“长链SPDP”中(Pierce Chem.Co.，Rockford，IL.，cat.No.21651 H)。

此外，以上所公开的嵌合肽之一的变体、片段或衍生物可以在本文中使用。相对于片段和变体，它通常是指上面对JNK抑制剂序列所给出的定义。

具体地，在本发明的内容中，“嵌合肽的变体”优选地为衍生自根据SEQ IDNO：9到12和23到32的任一序列的序列，其中嵌合变体包括如本文使用的根据SEQ ID NO：9到12和23到32的嵌合肽的氨基酸的改变。这种改变一般包括根据SEQ ID NO：9到12和23到32的氨基酸的1到20、优选为1到10和更优选为1到5个的取代、添加和/或缺失(产生片段)，其中如本文使用的改变的嵌合肽显示出与根据SEQ ID NO：9到12和23到32的任一序列至少大约30％、50％、70％、80％、或95％、98％、或甚至99％的序列同一性。优选地，这些变体保留了如在本文使用的嵌合肽包含的第一和第二结构域的生物学活性，即，如上所公开的第一结构域的运输活性，以及第二结构域的结合JNK和/或抑制至少一个JNK活性转录因子活化的活性。

因此，如本文使用的嵌合肽也可包括在前所公开的嵌合肽的片段，特别地是本发明的根据SEQ ID NO：9到12和23到32的任一的嵌合肽序列的片段。因此，在本发明的内容中，“嵌合肽的片段”优选为衍生自根据SEQ ID NO：9到12和23到32的任一序列的序列，其中该片段包括SEQ ID NO：9到12和23到32的任一的至少4个连续的氨基酸。该片段优选地包括足以允许从任一的这些序列中特异性识别表位和转运该序列进入细胞、核或者进一步优选的位置中的长度。甚至更优选地，该片段包括SEQ ID NO：9到12和23到32的任一的4到18、4到15、或最优选地为4到10个连续的氨基酸。如本文使用的嵌合肽的片段进一步可定义为与根据SEQ ID NO：99到12和23到32的任一的任何序列共有至少大约30％、50％、70％、80％、或95％、98％、或甚至99％的序列同一性的序列。

最后，如本文使用的嵌合肽也包括在前所公开的嵌合肽的衍生物，特别为根据SEQ ID NO：9到12和23到32的任一的嵌合肽序列的衍生物。

本发明另外涉及到编码如上定义的JNK抑制剂序列的核酸序列、所有如上定义的嵌合肽或它们的片段、变体或衍生物在制备用于治疗如本文定义的对象中非慢性或慢性炎性消化病的药物组合物中的应用。编码如本文使用的JNK抑制剂序列的优选合适的核酸一般选自人类IB1核酸(GenBank登录号(AF074091)、大鼠IB1核酸(GenBank登录号AF 108959)、人IB2(GenBank登录号AF218778)或选自编码如上定义的任一序列的任何核酸序列，即，根据SEQ ID NO：1-26的任何序列。

通过本领域已知的任何方法(例如，通过使用可杂交到序列的3′-和5′-末端的合成引物的PCR扩增，和/或通过使用对特定的基因序列特异性的寡核苷酸序列从cDNA或基因组文库克隆)，可得到编码如本文使用的JNK抑制剂序列或如本文使用的嵌合肽的核酸。

另外，本文也公开了如此核酸序列，其在严格条件下与编码如上所定义的(天然的)JNK抑制剂序列或嵌合肽的合适的链杂交。优选地，这些核酸序列包括至少6个(连续的)核酸，其具有足以允许特异性杂交的长度。更优选地，这些核酸序列包括6到38个、甚至更优选地为6到30个、以及最优选地6到20或6到10个(连续的)核酸。

“严格条件”是序列依赖的，并且在不同的环境下将是不同的。一般而言，严格的条件可选择为在限定的离子强度和PH下低于特定序列的热熔点(TM)大约5℃。该TM是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和PH下)。一般地，严格条件将是其中在PH为7下，盐浓度为至少大约0.02摩尔以及温度至少大约为60℃的那些。由于其他的因素可影响杂交的严格性(包括碱基组成和互补链的大小等)、有机溶剂的存在和碱基错配的程度，所以参数的组合比任何一个的绝对量度更重要。

“高度严格性条件”可以包括以下：例如，步骤1：对包含DNA的滤膜在65℃、在缓冲液中预处理8小时至过夜，该缓冲液由6×SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％菲可、0.02％BSA和500μg/ml变性的鲑精DNA组成。步骤2：滤膜在如上预杂交的混合物中，65℃下杂交48小时，在所述预杂交的混合物中加入100mg/ml变性的鲑精DNA和5-20×10⁶cpm的³²P标记探针。步骤3：滤膜在包含2×SSC、0.01％PVP、0.01％菲可和0.01％BSA的溶液中，在37℃下清洗1小时。在这之后，在0.1×SSC中、在50℃下清洗45分钟。步骤4：滤膜被放射自显影。可使用的其它的高度严格性条件在本领域中是熟知的(参见，例如，Ausubel等人，(eds.)，1993，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，NY；and Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，a Laboratory Manual，Stockton Press，NY)。

“中等严格性条件”可包括如下：步骤1：对包含DNA的滤膜在55℃、在溶液中预处理6小时，所述溶液包含6×SSC、5×Denhardt′s溶液、0.5％SDS和100mg/ml变性鲑精DNA。步骤2：滤膜在添加有5-20×10⁶cpm的³²P-标记探针的相同溶液中，在55℃下杂交18-20小时。步骤3：滤膜在包含有2×SSC、0.1％SDS的溶液中、在37℃下清洗1小时，接着，在包含有1×SSC和0.1％SDS的溶液中、在60℃下、清洗两次共30分钟。步骤4：滤膜进行印迹干燥并且曝光进行放射自显影。可使用的其它的中等严格性条件在本领域中是熟知的(参见例如，Ausubel等人，(eds.)，1993，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，NY；and Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，a Laboratory Manual，Stockton Press，NY)。

最后，“低严格性条件”可包括：步骤1：对包含DNA的滤膜在40℃、在溶液中预处理6小时，所述溶液包含35％甲酰胺、5×SSC、50mM Tris-HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％菲可、1％BSA、以及500μg/ml变性的鲑精DNA。步骤2：在添加有0.02％PVP、0.02％菲可、0.2％BSA、100μg/ml鲑精DNA、10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯和5-20×10⁶cpm的³²P-标记探针的相同溶液中，在40℃条件下杂交滤膜18-20小时。步骤3：滤膜在包含2×SSC、25mM Tris-HCl(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中，在55℃下清洗1.5小时。可用新的溶液替换该清洗溶液，并在60℃下温育额外的1.5小时。步骤4：滤膜进行印迹干燥并曝光进行放射自显影。如果需要，滤膜可在65-68℃条件下进行第三次清洗，并重新对胶片曝光。可使用的其它的低严格性条件在本领域中是熟知的(例如，应用于跨种杂交)。参见，例如，Ausubel等人，(eds.)，1993，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley and Sons，NY；and Kriegler，1990，GENETRANSFER AND EXPRESSION，A LABORATORY MANUAL，Stockton Press，NY。

根据本发明如上定义的核酸序列可用于表达肽，即，如本文使用的JNK抑制剂序列或本文使用的嵌合肽，进行分析、表征或治疗应用；以及用作组织标记，在所述组织中相应的肽(如本文使用的)被优先地表达(组成型的或在组织分化或发育的特定阶段或在疾病状态中)。这些核酸的其它应用包括，例如核酸的凝胶电泳基的分析中的分子量标记。

根据本发明进一步的实施方式，出于上述目的，表达载体可以用于重组表达如上所定义的一种或多种本发明的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽。本文使用的术语“表达载体”指环形或线型的DNA或RNA，其是双链的或是单链的。其进一步包括至少一种如上定义的待被转移进入宿主细胞或进入单细胞或多细胞宿主生物的核酸。本文使用的表达载体优选地包括如上定义的核酸，其编码如本文使用的JNK抑制剂序列或其片段或变体、或如本文使用的嵌合肽或其片段或变体。另外地，根据本发明的表达载体优选地包括用于支持表达的合适元件，其包括多种调节元件，例如来自病毒、细菌、植物、哺乳动物和其它真核生物源的增强子/启动子——其驱动插入的多核苷酸在宿主细胞中表达，例如绝缘子、边界元件、LCR(例如，由Blackwood和Kadonaga(1998)，Science 281，61-63描述)或基质/支架附着区(例如，由Li，Harju和Peterson，(1999)，Trends Genet.15，403-408描述)。在一些实施方式中，调节元件是异源的(例如，不是天然基因启动子)。可选地，通过于基因和/或它们侧翼区的天然启动子也可提供必需的转录和翻译信号。

如本文使用的术语“启动子”指功能为控制一个或多个如上定义的核酸序列转录的DNA区域，并且该DNA区域通过DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点和其它DNA序列——它们相互作用以调节启动子功能——的存在结构上识别。启动子的功能表达促进片段是保留作为启动子活性的缩短的或截短的启动子序列。通过本领域已知的任何分析可测量启动子活性(参见，例如Wood，de Wet，Dewji，和DeLuca，(1984)，Biochem Biophys.Res.Commun.124，592-596；Seliger和McElroy，(1960)，Arch.Biochem.Biophys.88，136-141)，或者从

可以商业获得)。

在如本文定义的表达载体中使用的“增强子区”一般指功能为增加一个或多个基因的转录的DNA区域。更具体地，如本文使用的术语“增强子”是增强、增大、提高或改进基因表达的DNA调节元件，不论其相对于待表达的基因的位置和方位，并且可以增强、增大、提高或改进多于一种启动子的表达。

在如上所定义的表达载体中使用的启动子/增强子序列可使用植物、动物、昆虫或真菌调节序列。例如，可使用来自酵母或其它真菌的启动子/增强子元件(例如，GAL4启动子、醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子、碱性磷酸酶启动子)。可选地或另外地，它们可以包括动物转录控制区，例如，(i)胰腺β细胞内活化的胰岛素基因控制区(参见，例如，Hanahan等人，1985.Nature 315：115-122)；(ii)淋巴细胞内活化的免疫球蛋白基因控制区(参见，例如Grosschedl等人，1984，Cell 38：647-658)；(iii)肝内活化的白蛋白基因控制区(参见，例如，Pinckert等人，1987.Genesand Dev 1：268-276)；(iv)脑少突神经胶质细胞内活化的髓鞘碱性蛋白基因控制区(参见，例如，Readhead等人，1987，Cell 48：703-712)；以及(v)下丘脑内活化的促性腺激素-释放激素基因控制区(参见，例如，Mason等人，1986，Science 234：1372-1378)等。

另外，如本文定义的表达载体可包括扩增标记。该扩增标记可选自例如腺苷脱胺酶(ADA)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、多重抗药性基因(MDR)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)和N-(磷酸乙酰)-L-天冬氨酸酯耐性(CAD)。

适合于本发明的示例性的表达载体或它们的衍生物具体地包括：例如人类或动物病毒(例如，牛痘病毒或腺病毒)；昆虫病毒(例如，杆状病毒)；酵母载体；噬菌体载体(例如，λ噬菌体)；质粒载体和粘粒载体。

另外，本发明可以使用多种宿主载体系统，其能够表达编码如上定义的核酸的序列(一种或多种)的肽。这些包括但不限于：(i)牛痘病毒、腺病毒等感染的哺乳动物细胞系统；(ii)杆状病毒等感染的昆虫细胞系统；(iii)包含有酵母载体的酵母；或(iv)用噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。根据使用的宿主-载体系统，可使用多种合适的转录和翻译元件的任一种。

优选地，可以选择适合于这种宿主-载体系统的宿主细胞菌株，其调节插入的感兴趣序列的表达、或以期望的特定方式修饰或加工由该序列编码的表达肽。另外，在选择的宿主菌株中，在某些诱导剂存在下可以增强某些启动子的表达；因此便于控制基因工程肽的表达。而且，不同的宿主细胞具有特有和特定的用于表达肽的翻译和翻译后的加工和修饰机制(例如，糖基化、磷酸化等)。因此，选择合适的细胞系或宿主系统，以确保实现对外源肽的期望的修饰和加工。例如，在细菌系统内的肽表达可用于生成非糖基化的核心肽；然而，哺乳动物细胞内的表达确保了异源肽的“天然的”糖基化。

本发明进一步提供针对抗如上描述的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的抗体在制备用于治疗如本文定义的非慢性或慢性炎性消化病的药物组合物中的应用。此外，出于该目的，描述了对于根据本发明的JNK抑制剂序列、或包含这种抑制剂序列的嵌合肽特异性的抗体的生产的有效方法，并且可以使用该方法。

根据本发明，如本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽以及其片段、变体或衍生物可以用作免疫原，以生成免疫特异地结合这些肽成分的抗体。这些抗体包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库。在特定的实施方式中，本发明提供针对如上定义的嵌合肽或JNK抑制剂序列的抗体。本领域已知的多种方法可用于生产这些抗体。

作为实例，通过用如上定义的任何嵌合肽或JNK抑制剂序列注射，可对多种宿主动物进行免疫以生成多克隆抗体。可使用多种佐剂由此以增加免疫应答，其包括但不限于弗氏佐剂(完全的或不完全的)、矿物凝胶(例如，氢氧化铝)、表面活性物质(例如，溶血磷脂酰胆碱、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳化佐剂、二硝基酚等)、CpG、聚合物、Pluronics、以及人类佐剂例如卡介苗和短小棒状杆菌。

为了制备针对如上所定义的嵌合肽或JNK抑制剂序列的单克隆抗体，可使用通过连续的细胞系培养物提供抗体分子生成的任何技术。这些技术包括但不限于：杂交瘤技术(参见，Kohler和Milstein，1975.Nature 256：495-497)；三体杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(参见，Kozbor等人，1983，Immunol Today 4：72)和EBV杂交瘤技术，以生成人类单克隆抗体(参见，Cole等人，1985.In：Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。在本发明的实践中可使用人单克隆抗体，并且可通过使用人杂交瘤(参见，Cote等人，1983.Proc Natl Acad Sci USA80：2026-2030)或通过在体外用EB病毒转化人B-细胞(参见，Cole等人，1985.In：Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)产生。

根据本发明，可改进技术以产生对本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽特异的单链抗体(参见，例如美国专利4,946,778)。另外，可改进方法以构建Fab表达文库(参见，例如Huse等人，1989.Science 246：1275-1281)，以允许快速和有效的识别对于这些JNK抑制剂序列和/或嵌合肽具有期望特异性的单克隆Fab片段。通过本领域熟知的技术(参见，例如美国专利5,225,539)可将非人抗体“人源化”。通过本领域已知的技术，可以生成包含对如本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的独特型的抗体片段，例如(i)通过抗体分子的胃蛋白酶消化生成F(ab′)₂片段；(ii)通过减少F(ab′)₂片段的二硫键生成Fab片段；(iii)通过使用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子生成Fab片段；以及(iv)Fv片段。

在本发明的一个实施方式中，可以用于筛选具有期望特异性的抗体的方法包括但不限于：酶联免疫吸附测定(ELISA)和本领域内已知的其它免疫调节技术。在具体的实施方式中，通过生成杂交瘤有利于选择抗体，该抗体对于如本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的特定表位是特异的(例如，其片段一般包括从5到20、优选为8到18和最优选为8到11个氨基酸的长度)，所述杂交瘤与如本文定义的具有这些表位的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的片段结合。本文也提供对于以上定义的表位特异的这些抗体。

如本文定义的抗体可在涉及到JNK抑制剂序列(和/或相应地如上定义的嵌合肽)的定位和/或定量的领域中已知的方法中应用，例如，在合适的生理样品中测量肽的水平中的应用、在诊断方法中的应用、或在成像肽中的应用等。

根据本发明定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽、核酸、载体、宿主细胞和/或抗体可以在药物组合物中配制，所述药物组合物可以在预防或治疗如本文定义的疾病的任一种中应用，特别是在预防或治疗如本文定义的非慢性或慢性炎性消化病中应用。一般地，根据本发明使用的这些药物组合物包括活性成分，例如：(i)任意的一种或多种如以上定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽、和/或其变体、片段或衍生物，特别是根据SEQ ID NO：1至4和13至20和33-100任一序列的JNK抑制剂序列和/或根据SEQ ID NO：9至12和23至32的任一序列的嵌合肽，和/或包括根据SEQ ID NO：5至8和21至22任一的运输序列的根据SEQ ID NO：1至4和13至20以及33-100的任一序列的JNK抑制剂序列，或以上定义内的其变体或片段；和/或(ii)编码如上定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽和/或其变体或片段的核酸；和/或(iii)包括如上定义的任意一个或多个JNK抑制剂序列和/或嵌合肽、和/或其变体、片段或衍生物的细胞，和/或(iv)用编码如上定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽和/或其变体或片段的载体和/或核酸转染的细胞。

根据优选的实施方式，这种根据本发明使用的药物组合物一般包括安全和有效量的如上定义的成分，优选地为根据SEQ ID NO：1至4和13至20以及33-100的任一序列的至少一种JNK抑制剂序列和/或根据SEQ ID NO：9至12和23至32的任一序列的至少一种嵌合肽，和/或包括根据SEQ ID NO：5-8和21至22的任一的运输序列的根据SEQ ID NO：1至4和13至20和33-100的任一序列的至少一种JNK抑制剂序列，或以上定义内的其变体或片段，或编码其的至少一种核酸、或如上定义的至少一种载体、宿主细胞或抗体。

本发明的发明人另外地发现，如上定义的JNK抑制剂序列和嵌合肽分别显示特别良好的进入涉及本发明疾病的细胞的摄取率。因此，给予对象的药物组合物中的JNK抑制剂序列和嵌合肽的量各自可以——没有被限于此——具有非常低的剂量。因此，剂量可以比本领域已知的肽药物诸如DTS-108(Florence Meyer-Losic等人，Clin Cancer Res.，2008，2145-53)的剂量低得多。这具有数个积极的方面，例如潜在副作用的减少和成本的降低。

优选地，剂量(每公斤体重的)是在多至10mmol/kg的范围中，优选多至1mmol/kg，更优选多至100μmol/kg，甚至更优选为多至10μmol/kg，甚至更优选为多至1μmol/kg，甚至更优选为多至100nmol/kg，和最优选为多至50nmol/kg。

因此，剂量范围可以优选为约1pmol/kg至约1mmol/kg、约10pmol/kg至约0.1mmol/kg、约10pmol/kg至约0.01mmol/kg、约50pmol/kg至约1μmol/kg、约100pmol/kg至约500nmol/kg、约200pmol/kg至约300nmol/kg、约300pmol/kg至约100nmol/kg、约500pmol/kg至约50nmol/kg、约750pmol/kg至约30nmol/kg、约250pmol/kg至约5nmol/kg、约1nmol/kg至约10nmol/kg或所述值的任两个的组合。

在该内容中，当使用上述药物组合物的治疗时的处方例如剂量的决定等一般在全科医师和其它医生的职责内，并且特别地考虑待治疗的病症、个体患者的状况、递送部位、给药的方法和医生已知的其它因素。如上所提到的这些技术和方案的实例可在“REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，16th edition，Osol，A.(ed)，1980.”中找到。因此，根据本发明使用的药物组合物的成分的如上定义的“安全和有效的量”指这些成分的每一种或所有的量，其足以显著诱导如本文定义的非慢性或慢性炎性消化病的积极的变化。然而，在同时，“安全和有效量”小到足以避免严重的副作用，也就是说，使在益处和危险之间达到明智的关系。这种限定的确定一般在明智的医学判断的范围内。这种成分的“安全和有效量”将连同被治疗的特定状况而变化，并且也连同被治疗的患者的年龄和身体状况、状况的严重性、治疗的持续时间和辅助治疗的性质、使用的具体的药学上可接受载体的性质和类似的因素在陪伴医生的知识和经验内变化。根据本发明的药物组合物可以根据本发明用于人，也可以用于兽医药物的目的。

除了这些物质之一之外，根据本发明使用的药物组合物可以进一步地包括(相容的)药学上可接受的载体、赋形剂、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它材料。

在这种内容中，表述“(相容的)药学上可接受的载体”优选地包括组合物的液体或非液体基。术语“相容的”指如本文使用的药物组合物的组成能够与如上定义的药物活性成分和另一种成分以如此方式混合：使得将大量减小组合物的药学上效果的相互作用在通常使用情况下不会出现。药学上可接受的载体当然必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使它们适合于施用给待治疗的人。

如果本文使用的药物组合物以液体形式提供，那么药学上可接受的载体一般将包括一种或多种(相容的)药学上可接受的液体载体。组合物可以包括如(相容的)药学上可接受的液体载体，例如无热源的水；等渗盐水或者缓冲(水)溶液，例如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液，植物油，诸如，例如花生油、棉花籽油、麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，诸如，例如聚丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；褐藻酸等。具体地，对于本文使用的药物组合物的注射，可以使用缓冲液，优选为水性缓冲液。

如果本文使用的药物组合物以固体形式提供，那么药学上可接受的载体一般包括一种或多种(相容的)药学上可接受的固体载体。组合物可以包括如(相容的)药学上可接受的固体载体，例如一种或多种相容的固体或液体填料，或也可以使用稀释剂或包囊化合物(encapsulating compound)，其适合于施用给人。这种(相容的)药学上可接受的固体载体的一些实例为诸如糖类，诸如，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，诸如，例如，玉米淀粉或马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，诸如，例如，羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；动物脂；固体助流剂，诸如，例如硬脂酸、硬脂酸镁；硫酸钙等。

(相容的)药学上可接受的载体或其它材料的准确性质可以依赖于给药途径。(相容的)药学上可接受的载体的选择因此可以原则上通过如根据本发明使用的药物组合物的给药方式进行确定。根据本发明使用的药物组合物可以例如全身地给药。给药的途径包括例如肠胃外途径(例如，经过注射)，例如，静脉内、肌肉内、皮下、皮内或者经皮途径等，肠途径例如口服药，或者直肠途径等等，局部途径，诸如鼻途径或者鼻内途径等，或其它途径，诸如表皮途径或者贴剂递送。

使用的药物组合物的合适量可以通过使用动物模型的常规试验确定。这种模型包括——没有暗示任何限制——兔、绵羊、小鼠、大鼠、狗和非人的灵长类动物的模型。注射的优选的单位剂型包括水的灭菌溶液、生理盐水或者它们的混合物。这种溶液的pH应该调节到约7.4。注射用的合适载体包括水凝胶、控释或缓释设备、聚乳酸和胶原基质(collagen matrices)。局部施加的合适药学上可接受的载体包括适合于在洗剂、膏、凝胶等中使用的那些。如果化合物经口给药，片剂、胶囊剂等为优选的单位剂型。制备可以用于口服给药的单位剂型的药物学上可接受的载体在现有技术中是熟知的。其选择将根据次要的考虑因素，诸如味道、成本和储存能力，它们对于本发明的目的不是关键的，并且可以通过本领域技术人员没有困难地进行。

口服给药的药物组合物可以为片剂、胶囊剂、粉末或者液体的形式。片剂可以包括如上定义的固体载体例如明胶，和任选地包括辅助剂。口服给药的液体药物组合物一般包括如上定义的液体载体，诸如水、石油、动物或植物油，矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、葡聚糖或其它糖类溶液或者乙二醇类诸如1，2-亚乙基二醇、丙二醇或者聚乙二醇。

对于静脉内、皮肤或皮下注射、或痛处部位的注射，活性成分将是非肠胃可接受的水溶液，其是无热源的，并且具有合适的PH值、等渗性和稳定性。使用例如等渗载体例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液，本领域技术人员可完全能够制备合适的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。无论它是多肽、肽或核酸分子、以及根据本发明的施用给个体的其它药学上有用的化合物，给药优选地以“预防有效量”或“治疗有效量”(视情形而定)，这足够示出对个体的益处。实际给药的数量、以及给药的速率和时程将取决于治疗的性质和严重性。

如本文定义的疾病的预防和/或治疗一般包括给予如上定义的药物组合物。术语“调节”包括在以上任一的疾病中，当JNK过渡表达时，抑制其表达。它也包括——不限于此——例如通过使用根据SEQ ID NO：1至4和13至20和33-100的任一序列的至少一种JNK抑制剂序列和/或根据SEQ ID NO：9至12和23至32的任一序列的至少一种嵌合肽，和/或包括根据SEQ ID NO：5至8和21至22的任一的运输序列的根据SEQ ID NO：1至4和13至20和33-100的任一序列的至少一种JNK抑制剂序列，或在以上定义内的其变体或者片段——其作为细胞中天然的c-jun、ATF2和NFAT4结合位点的竞争抑制剂，在任一的上述疾病中抑制c-jun、ATF2或NFAT4的磷酸化。术语“调节”也包括抑制转录因子的异数或同数复合体，例如，诸如由c-jun、AFT2和c-fos组成AP-1复合体，所述转录因子——不限于此——由c-jun、ATF2或NFAT4以及它们的相关的配偶体组成。当非慢性或慢性炎性消化病与JNK过量表达相关联时，这些抑制性的JNK抑制剂序列可被引入到细胞中。在一些例子中，“调节”则可包括JNK表达的增加，例如通过使用阻断IB-肽与JNK结合的IB-肽特异性抗体，因此通过IB-相关的肽防止JNK抑制。

用如上公开的药物组合物预防和/或治疗对象一般通过(在体内)施用给对象(“治疗有效的”)量的所述药物组合物来实现，其中所述对象可以是例如任何哺乳动物诸如人类、灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马或猪。术语“治疗有效”是指药物组合物的活性成分为足够改善非慢性或慢性炎性消化病的量。

因此，如上定义的肽，例如，根据SEQ ID NO：1至4和13至20和33-100的任一序列的至少一种JNK抑制剂序列和/或根据SEQ ID NO：9至12和23至32的任一序列的至少一种嵌合肽，和/或包括根据SEQ ID NO：5至8和21至22的任一的运输序列的根据SEQ ID NO：1至4和13至20和33-100的任一序列的至少一种JNK抑制剂序列，或在以上定义内的其变体或者片段，可以在本发明的特定实施方式中使用，以通过调节活化的JNK信号传导通路治疗如上定义的非慢性或慢性炎性消化病。

如上定义和在本发明的药物组合物中包含的肽也可以通过核酸编码。如果上述的肽出于基因治疗的目的施用，这是特别有利的。在该内容中，基因治疗指通过给对象施用如上定义的具体核酸——例如作为如上定义的药物组合物——进行的治疗，其中所述核酸(一种或多种)全部包括L-氨基酸。在本发明的这种实施方式中，核酸生成其编码肽(一种或多种)，该编码肽然后通过调节疾病或病症的功能，用于发挥其治疗作用。本领域中可使用的与基因治疗相关的任一方法可用于实践本发明(参见，例如Goldspiel等人，1993.Clin Pharm 12：488-505)。

在一个优选的实施方式中，如上定义和用于基因治疗的核酸是如此表达载体的一部分，所述表达载体在合适的宿主内编码和表达任意一种或多种如上定义的IB相关肽，即，根据SEQ ID NO：1至4和13至20和33-100的任一序列的JNK抑制剂序列和/或根据SEQ ID NO：9至12和23至32的任一序列的嵌合肽，和/或包括根据SEQ ID NO：5至8和21至22的任一的运输序列的根据SEQ ID NO：1至4和13至20和33-100的任一序列的JNK抑制剂序列，或在以上定义内的其变体或者片段。在一个具体实施方式中，该表达载体具有可操作地连接到JNK抑制剂序列的编码区(一个或多个)的启动子。该启动子可以为如上定义，例如为诱导型的或组成型的、以及任选地为组织特异性的。

在另一具体的实施方式中，如上定义的核酸分子可用于基因治疗，其中如上定义的核酸分子的编码序列(以及其任何其它期望的序列)的侧翼为促进基因组内期望位置处同源重组的区域，因此提供这些核酸的染色体内的表达(参见，例如Koller和Smithies，1989.Proc Natl Acad Sci USA 86：8932-8935)。

出于基因治疗的目的，根据本发明的如上定义的核酸递送进入到患者内，特别是在如上定义的上述非慢性或慢性炎性消化疾病的情况中，其可以直接(即，患者直接暴露于核酸或包含核酸的载体)或间接(即，首先在体外用核酸转化细胞，接着将细胞移植到患者内)。这两种方法分别已知为体内或体外基因治疗。在本发明的具体实施方式中，在体内直接地给予核酸，在其中核酸表达以生成编码产物。这可通过本领域已知的多种方法中的任一种实现，包括：例如将核酸构建为合适的核酸表达载体的一部分并以如此方式将其给予，使其变为分子内的(例如，通过使用有缺陷的或灭活的逆转录病毒或其他的病毒载体进行感染；参见美国专利4,980,286)；直接注射裸DNA；使用微粒轰击(例如“基因枪”；生物射弹，DuPont)；用脂质包被核酸；使用相关的细胞表面受体/转染剂；在脂质体、微粒或微胶囊中胶囊化；以与已知进入核的肽键合将其给予；或以与易于受体介导的细胞内吞作用的配体键合将其给予(参见，例如，Wu和Wu，1987.J Biol Chem 262：4429-4432)，这可用于“靶向”特异性表达感兴趣的受体等的细胞类型。

在本发明的实践中，基因治疗的另外的方法包括通过方法如电穿孔、脂质转染、磷酸钙介导的转染、病毒感染等，将如上定义的核酸转化入体外组织培养物的细胞中。一般而言，转化的方法包括可选择的标记对细胞的伴随转化。接着，该细胞被置于选择压力下(例如抗生素抗性)，以便促进已摄取转化基因并表达转化基因的那些细胞的分离。然后那些细胞被递送到患者。在具体的实施方式中，在体内给予得到的重组细胞之前，通过本领域已知的任何方法，包括例如转染、电穿孔、显微注射、用包含有感兴趣的核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转化、微细胞介导的基因转化、原生质球融合、以及确保受体细胞必要的发育和生理学功能不被转化破坏的类似方法，将核酸引入到细胞中。参见，例如，Loeffler和Behr，1993.Meth Enzymol 217：599-618。该选择的技术应该可将核酸稳定转化到细胞，使得核酸是通过细胞可表达的。优选地，转化的核酸是通过细胞后代可遗传和可表达的。

在本发明的优选实施方式中，通过本领域已知的多种方法可将得到的重组细胞递送到患者，所述方法包括例如注射上皮细胞(例如皮下地)、施加作为皮肤移植物的重组皮肤细胞到患者、以及静脉内注射重组血液细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)。预想要使用的细胞的总量取决于期望的效果、患者的状态等，并可由本领域的技术人员决定。出于基因治疗的目的，可引入核酸的细胞包括任何期望的、可用的细胞类型，并且可以是异源的、异种的、同种的或自体的。细胞的类型包括但不限于：分化的细胞例如上皮细胞、内皮细胞、角化细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞和血细胞、或各种干细胞或祖细胞，特别是胚胎心肌细胞、肝干细胞(国际专利公开WO 94/08598)、神经干细胞(Stemple和Anderson，1992，Cell 71：973-985)、造血干细胞或祖细胞——例如从骨髓、脐带血、外周血、胎儿肝脏等得到的。在优选的实施方式中，用于基因治疗的细胞是患者自体的。

可选地和/或另外地，为了治疗本文上述疾病，可使用靶向治疗以通过使用靶向系统例如(靶向)抗体或细胞特异性配体，递送如上定义的、对某些细胞类型更特异性的JNK抑制剂序列、嵌合肽和/或核酸。用于靶向的抗体一般对于与如下定义的疾病相关的细胞的细胞表面蛋白是特异的。作为实例，这些抗体可以涉及到细胞表面抗体例如，诸如B细胞相关的表面蛋白例如MHC II类DR蛋白、CD18(LFA-1β链)、CD45RO、CD40或Bgp95，或细胞表面蛋白，其选自例如CD2、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD10、CD13、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD39、CD4、CD43、CD45、CD52、CD56、CD68、CD71、CD138等。靶向构建物一般可以通过共价地结合如本文定义的根据本发明的JNK抑制剂序列、嵌合肽和核酸到对细胞表面蛋白特异性的抗体，或通过结合到细胞特异性配体进行制备。例如，蛋白可结合到这类抗体，或通过肽键或通过化学偶联、交联等连接于此。然后，通过如下定义的任一给药途径，例如腹膜内、鼻、静脉内、口的或贴剂递送途径，给予患者药学上有效量的靶向构建物，来进行靶向治疗。优选地，例如通过共价键的水解、通过肽酶或通过任何其它合适的方法，结合到如上所定义的靶向抗体或细胞特异性配体的根据本发明如本文定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽或核酸可在体外或体内释放。可选地，如果根据本发明如本文定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽或核酸结合到小的细胞特异性配体，那么可以不进行该配体的释放。如果存在于细胞表面，那么在其运输序列活化后，嵌合肽可进入细胞。由于多种原因，可能期望靶向；例如，如果根据本发明如本文定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽或核酸是不可接受的毒性的或如果其另外需要太高的剂量。

代替直接给予根据本发明的如本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽，通过从引入细胞的编码基因——例如从被给予的病毒载体——进行表达，在靶细胞中可生成它们。该病毒载体一般编码根据本发明的如本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽。该载体可被靶向待治疗的特定细胞。而且，该载体可包含调节元件，并可依据限定的调控，通过靶细胞或多或少地选择性地打开调节元件。该技术代表了VDEPT技术(病毒定向酶前药治疗(virus-directed enzyme prodrug therapy，VDEPT)的变体，其使用成熟蛋白而不是它们的前体形式。

可选地，通过使用抗体或病毒，可以以前体形式给予如本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽。然后通过在待治疗的细胞中生成或靶向到治疗的细胞的活化剂，可将这些JNK抑制剂序列和/或嵌合肽转化为活化形式。该类方法有时称为ADEPT(抗体定向酶的药物前体治疗(antibody-directed enzyme prodrug therapy)或病毒定向酶前药治疗；前者包括通过结合到细胞特异性抗体将活化剂靶向细胞，而后者包括通过从病毒载体中的编码DNA的表达，在载体中生成活化剂，例如JNK抑制剂序列或嵌合肽(参加，例如，EP-A-415731和WO 90/07936)。

根据进一步的实施方式，如本文定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽、核酸序列或JNK抑制剂序列或嵌合肽的抗体，例如，根据SEQ ID NO：1至4和13至20和33-100的任一序列的JNK抑制剂序列和/或根据SEQ ID NO：9至12和23至32的任一序列的嵌合肽，和/或包括根据SEQ ID NO：5至8和21至22的任一的运输序列的根据SEQ ID NO：1至4和13至20和33-100的任一序列的JNK抑制剂序列，或在以上定义内的其变体或者片段，可以在(体外)测定(例如免疫测定)中使用，以检测、预测、诊断或监测选自如上定义的非慢性或慢性炎性消化病的各种状况和疾病状态，或监测其治疗。通过包括以下的方法，可进行免疫测定：使源自患者的样品与如上定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽或核酸序列的抗体在使得免疫特异结合可以发生的条件下接触，并且随后检测或测量任何被抗体免疫特异结合的量。在具体的实施方式中，对JNK抑制剂序列、嵌合肽或核酸序列特异性的抗体可用于分析患者的组织或血清样品中JNK或JNK抑制剂序列的存在，其中JNK的异常水平表示疾病状况。可使用的免疫测定包括但不限于竞争性和非竞争性测定系统，其使用技术，例如蛋白质印迹、放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、“夹心”免疫测定(“sandwish”immunoassay)、免疫沉淀测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、凝集测定、荧光免疫测定、补体结合测定、免疫放射测定、以及蛋白质-A免疫测定等。可选地，通过递送如上定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽、核酸序列或JNK抑制剂序列或者嵌合肽的抗体至例如一般选自培养的动物细胞、人细胞或微生物的靶细胞，可以进行(体外)测定，并通过本领域的技术人员熟知的生物物理方法监控细胞的应答。本文一般使用的靶细胞可以为培养细胞(体外)或者体内细胞，即构成活的动物或人的器官或组织的细胞、或在活的动物或人体中发现的微生物。

本发明另外提供用于诊断或治疗目的试剂盒的用途，特别用于治疗、预防或监测如上定义的非慢性或慢性炎性消化病，其中所述试剂盒包括一个或多个容器，其包含如上定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽、核酸序列和/或这些JNK抑制剂序列或嵌合肽的抗体，例如以下的抗JNK抑制剂序列抗体：根据SEQ ID NO：1至4和13至20和33-100的任一序列的JNK抑制剂序列，根据SEQ ID NO：9至12和23至32的任一序列的嵌合肽，包括根据SEQ ID NO：5至8和21至22的任一的运输序列的根据SEQ ID NO：1至4和13至20和33-100的任一序列的JNK抑制剂序列，或在以上定义内的其变体或者片段，或者这种抗JNK抑制剂序列抗体以及任选地所述抗体的标记结合配偶体。本文并入抗体的标记包括但不限于：化学发光的、酶的、荧光的、比色的(酶显色的，colorimetric)或放射性的部分。在另一个具体的实施方式中，提供了试剂盒，其在治疗、预防或监测如上定义的非慢性或慢性消化病中用于诊断，包括一个或多个包含核酸的容器，所述核酸编码或者可选地互补于如上定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽，任选地，也提供这些核酸的标记结合配偶体。在可选的具体实施方式中，所述试剂盒可以为用于以上目的的一种试剂盒，其包括一个或多个容器、一对寡核苷酸引物(例如，每个长度为6到30个核苷酸)，所述引物能够作为扩增引物用于聚合酶链反应(PCR；参见，例如Innis等人，1990.PCR PROTOCOLS，Academic Press，Inc.，San Diego，CA)、连接酶链反应、循环探针反应等，或者本领域已知的在如上定义的核酸内容中使用的其它方法。任选地，所述试剂盒可以进一步可包括预先确定量的如上定义的纯化JNK抑制剂序列、如上定义的嵌合肽或编码这些的核酸，用作出于上述目的的测定中的诊断、标准或对照。

本发明不限于本文描述的具体实施方式的范围。实际上，除了在本文描述的那些外，本发明的各种修改根据前述描述和附图对于本领域技术人员将是显而易见的。这些修改落入所附权利要求的范围内。

在此所引用的各种出版物，其公开内容通过引用整体并入。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与在此描述的那些方法和材料的类似或相同的方法和材料可在本发明的实践或测试中应用，但是下面将描述合适的方法和材料。在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其它文献通过引用整体并入。在冲突的情况下，本说明书包括定义为主。另外，材料、方法和实施例仅是说明性，而不意欲是限制性的。本发明的其它特征和优点根据以下详细描述和权利要求将是显而易见的。

附图说明

图1A-C是显示在示出的转录因子中保守JBD结构域区域的比对的图。通过进行序列比对，鉴定本文使用的JNK抑制剂序列。这种比对的结果在图1A-1C中示例性显示。图1A描述了在IB1、IB2、c-Jun和ATF2的JBD之间的最高同源性区域。图1B出于比较原因，描述了L-IB1(s)和L-IB1的JBD的氨基酸序列。完全保守的残基用星号示出，而在GFP-JBD_23Mut载体中改变为Ala的残基通过开圆示出。图1C示出包括JNK抑制剂序列和运输序列的嵌入蛋白的氨基酸序列。在显示的实例中，运输序列衍生自人类免疫缺陷病毒(HIV)TAT多肽，而JNK抑制剂序列衍生自IB1(s)多肽。在图B和C中，人类、小鼠和大鼠序列是相同的。

图2是示出来自人类、小鼠和大鼠的通用TAT-IB融合肽的序列的图。

图3示出在IBD研究中用XG-102(SEQ ID NO：11)治疗时的临床分数，使用XG-102以每天1和100μg/kg SC的浓度进行治疗。

图4显示在IBD研究中用XG-102(SEQ ID NO：11)治疗时的剂量应答曲线，使用XG-102每天以0.01、0.1、1、10、100和1000μg/kg SC的浓度进行治疗。

图5显示在IBD研究中用XG-102(SEQ ID NO：11)治疗时的临床分数，使用XG-102(单剂量SC)以在0天为单剂量，以1和100μg/kg SC的浓度进行治疗。

图6显示在IBD研究中当用XG-102(SEQ ID NO：11)治疗时的临床分数，使用XG-102(每天，PO)以作为重复剂量，以1和100μg/kg PO的浓度进行治疗。

图7显示IBD研究中当用XG-102(SEQ ID NO：11)治疗时的临床分数，使用XG-102(单剂量PO)以在0天为单剂量，以1和100μg/kg PO的浓度进行治疗。

图8原代培养的巨噬细胞用XG-102(SEQ ID NO：11)温育并且充分地清洗。使用对XG-102特异的抗体显示XG-102(SEQ ID NO：11)的存在。XG-102被良好地掺入原代巨噬细胞中。

图9小鼠经过三种不同途径给药(s.c.、i.v.、i.p.)用具有C14的放射性标记的肽(1mg/kg)进行治疗。动物在注射后72小时被杀死并进行免疫放射自显影处理。矢状部分进行曝光并显示XG-102肽主要在肝、脾和骨髓中的积累(XG-102：SEQ IDNO：11)。

图10显示用1mg/kg的XG-102i.v.注射的大鼠的肝中的XG-102(SEQ ID NO：11)的免疫染色。动物在注射24小时后被杀死。使用DAB底物进行显示。该图再次显示XG-102在肝中显著的积累，特别是在Kupffer细胞(巨噬细胞)中。

图11显示在两个细胞系中细胞因子和趋化因子释放的抑制。XG-102(SEQ IDNO：11)抑制骨髓和淋巴细胞系中的细胞因子的释放，减少THP-1细胞中LPS-诱导的TNF-α、IL-6和MCP-1的释放(图A-C)和Jurkat细胞中的PMA和离子霉素诱导的IFNγ、IL-6和IL-2的生成(图D-F)。对照(XG-101)由于其较小的稳定性而较不有效。

图12显示初级细胞中细胞因子释放的抑制。XG-102(SEQ ID NO：11)也抑制初级淋巴细胞和骨髓细胞中的细胞因子的释放，减少了鼠科动物巨噬细胞中的LPS-诱导的TNF-α、IL-6和Rantes释放(图A-C)和鼠科动物T细胞中的PMA和离子霉素-诱导的TNFα和IFNγ生成(图D-E)。效果在XG-102的非细胞毒性浓度处出现(图F)。

图13显示在TNBS-诱导的结肠炎中的效果。JNK在炎症性肠病的患者的巨噬细胞和淋巴细胞中被激活，应答与损害中增加的TNF-α、IL-6和IFNγ生成相关。皮下给予50和100mg/kg XG-102保护小鼠免于TNBS-诱导的结肠炎(图A-C)，减小DAI、体重减轻和直肠出血。

图14显示大鼠的IB1cDNA序列和其预测的氨基酸序列(SEQ ID NO：102)。

图15显示通过rIB1基因的外显子内含子边界——剪接供体——编码的大鼠的IB1蛋白质序列(SEQ ID NO：103)。

图16显示智人的IB1蛋白质序列(SEQ ID NO：104)。

图17显示智人IB1cDNA序列(SEQ ID NO：105)。

实施例

实施例1：JNK抑制剂序列的鉴定

通过已知的JNK结合结构域JBD之间的序列比对，鉴定对与JNK进行有效相互作用重要的氨基酸序列。IB1[SEQ ID NO：13]、IB2[SEQ ID NO：14]、c-Jun[SEQ ID NO：15]和ATF2[SEQ ID NO：16]的JBD之间的序列比较限定了弱保守的8个氨基酸序列(图1A)。由于IB1和IB2的JBD在结合JNK方面如c-Jun或ATF2的大约100倍一样有效(Dickens等人，Science 277：693(1997)，说明了IB1和IB2之间的保守残基对于赋予最大结合是重要的。IB1和IB2的JBD之间的比较限定了在两个序列之间是高度保守的7个氨基酸和3个氨基酸的两个区段。

这两个区段被包含在L-IB1(s)[SEQ ID NO：1]中的19个氨基酸的肽序列内，并由于比较的原因也已知在衍生自IB1[SEQ ID NO：17]的23个氨基酸肽序列中示出。图1B中示出这些序列，L-IB1序列中的虚线指出序列中的缺口，以与L-IB1(S)比对保守残基。

实施例2：JNK抑制剂融合蛋白的制备

通过经过由两个脯氨酸残基组成的连接体共价地将SEQ ID NO：1的C-末端连接到10氨基酸长的载体肽的N-末端，合成根据SEQ ID NO：9的JNK抑制剂融合蛋白，所述载体肽衍生自根据SEQ ID NO：5的HIV-TAT4g 57(等人，J Biol.Chem.272：16010(1997))。该连接体用于允许最大的柔性，并防止不想要的二级结构的变化。也制备了基本构建物并分别被命名L-IB1(s)(SEQ ID NO：1)和L-TAT[SEQ IDNO：5]。

从而，合成根据SEQ ID NO：11的所有-D逆反肽。基本构建物也被制备并分别被命名D-IB1(s)[SEQ ID NO：2]和D-TAT[SEQ ID NO：6]。

通过经典的Fmock合成生成根据SEQ ID NOs：9，10，11和12的所有的D和L融合肽，并通过质谱进一步分析。最后通过HPLC进行纯化。为了确定脯氨酸连接体的影响，可制备两种类型的TAT肽，一个具有两个脯氨酸，另一个不具有两个脯氨酸。这两个脯氨酸的添加没有示出修饰进入细胞内或在细胞内的TAT肽的定位。图2中给出显示保守的氨基酸残基的通用肽。

实施例3：通过JBD19抑制细胞死亡

研究了IB1(s)的19个氨基酸长的JBD序列对JNK生物学活性的作用。该19个氨基酸序列的N-末端被连接到绿荧光蛋白(GFP JBD19构建物)，并估计该构建物对由IL1诱导的胰腺β细胞凋亡的作用。以前显示这种凋亡模式被用JBD_1-280转染所阻断，而ERK1/2或p38的特异性抑制剂没有保护(参见，Ammendrup等人，同上)。

合成与JBD相应并包括19个氨基酸的保守序列以及在完全保守区域突变的序列的寡核苷酸，并且将其直接插入到编码绿荧光蛋白(GFP)(来自Clontech)的pEGFP-N1载体的EcoRI和SalI位点。在补充有10％胎牛血清、100μg/mL链霉素、100单位/mL青霉素和2mM谷氨酰胺的RPMI1640培养液中，培养产生胰岛素的TC-3细胞。使用指出的载体转染产生胰岛素的TC-3细胞，并添加IL-1(10ng/mL)到该细胞培养基中。在添加IL-1后48小时，使用倒置荧光显微镜计数凋亡细胞的数量。通过细胞质特征性的“胞膜空泡化(blebbing out)”区分凋亡细胞和正常细胞，并在两天后进行计数。

GFP是用作对照的绿荧光蛋白表达载体；JBD19是表达连接到衍生自IB1的JBD的19个氨基酸序列的嵌合GFP的载体；JBD19Mut是与GFP-JBD19相同的载体，但如在图1B示出在四个保守残基具有突变的JBD；而JBD_1-280是连接到整个JBD(氨基酸1-280)的GFP载体。GFP-JBD19表达构建物阻止IL-1诱导的胰腺细胞凋亡，其与整个JBD_1-280一样有效。

作为另外的对照，在完全保守的IB1(s)残基处突变的序列极大地降低了阻止凋亡的能力。

实施例4：TAT-IB1(s)肽的细胞输入

评估TAT和TAT-IB1(s)肽(“TAT-IB肽”)的L-和D-对映异构形式进入细胞的能力。通过与荧光素结合的甘氨酸的N-末端添加，标记L-TAT、D-TAT、L-TAT-IB1(s)和D-TAT-IB1(s)肽[分别为SEQ ID NO：5、6、9和12]。将标记的肽(1μM)添加到TC-3细胞培养物中，其如在实施例3中描述地进行保持。在预定的时间，用PBS清洗细胞，并在冰冷的甲醇-丙酮(1∶1)中固定5分钟，之后在荧光显微镜下对其进行检查。荧光素标记的BSA(1μM，12摩尔/摩尔BSA)用作对照。结果证明在加入到培养基后，所有的上述荧光素标记的肽高效、快速地(少于5分钟)进入细胞。相反地，荧光素标记的牛血清白蛋白(1μM BSA，12摩尔荧光素/摩尔BSA)不进入细胞中。

时程研究指出，在24小时时期后，L-对映异构的肽的荧光信号的强度降低70％。在48小时很少至没有信号存在。相比较，在细胞内D-TAT和D-TAT-IB1(s)非常稳定。

一个星期后，所有的D逆反肽的荧光信号仍然很强，并且在处理两星期后，该信号仅少许地减弱。

实施例5：c-JUN、ATF2和Elk1磷酸化的体外抑制

在体外研究肽对于它们的靶转录因子的JNK介导的磷酸化的作用。使用转录和翻译兔网织红细胞裂解物试剂盒(Promega)生成重组和未活化的JNK1、JNK2和JNK3，并其将与单独的c-Jun、ATF2和Elk1或者融合到谷胱甘肽-S-转移酶(GST)作为底物的c-Jun、ATF2和Elk1一起在固相激酶测定中使用。进行剂量应答研究，其中L-TAT或L-TAT-IB1(s)肽(0-25μM)与重组的JNK1、JNK2、或JNK3激酶在反应缓冲液(20mM Tris-乙酸、1mM EGTA、10mM对-硝基苯基磷酸盐(pNPP)、5mM焦磷酸钠、10mM对-甘油磷酸盐、1mM二硫苏糖醇)中混合20分钟。然后通过添加10mM MgCl₂和5pCi³³P-dATP和1μg的GST-Jun(氨基酸1-89)、GST-AFT2(氨基酸1-96)或GST-ELK1(氨基酸307-428)引发激酶反应。可从Stratagene(La Jolla，CA)购得GST融合蛋白。

也添加10μL的谷胱甘肽琼脂糖珠子到该混合物中。然后在变性的10％聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分离反应产物。干燥该凝胶，接着对X射线胶片(Kodak)曝光。在TAT-IB(s)肽剂量低至2.5μM下，观察到通过JNK几乎完全抑制c-Jun、ATF2和Elk1的磷酸化。然而，一个明显的例外是不存在Elk1的JNK3磷酸化的TAT-IB(s)抑制。总之，TAT-IB1(s)肽在抑制它们的靶转录因子的JNK家族的磷酸化方面显示了很好的效果。如上所述，分析D-TAT、D-TAT-IB1(s)和L-TAT-IB1(s)肽(0-250μM剂量研究)通过重组JNK1、JNK2和JNK3抑制GST-Jun(氨基酸1-73)磷酸化的能力。总之，D-TAT-IB1(s)肽降低了c-Jun的JNK介导的磷酸化，但其水平比L-TAT-IB1(s)小大约10至20倍。

实施例6：通过活化的JNK抑制c-JUN磷酸化

使用GST-Jun降低UV光照射的海拉细胞(Hela cell)或IL-1处理的PTC细胞的JNK，评估如本文定义的L-TAT或L-TAT-IB1(s)肽对压力刺激活化的JNK的作用。PTC细胞如上所述进行培养。海拉细胞在补充有10％胎牛血清、100μg/mL链霉素、100单位/ml青霉素和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基中培养。在用于细胞提取制备之前1小时，如上所述用IL-1活化PTC细胞，而海拉细胞通过UV-光(20J/m²)活化。通过刮除在裂解缓冲液(20mM Tris-乙酸、1mM EGTA、1％TritonX-100、10mM P-硝基苯基磷酸盐、5mM焦磷酸钠、10mM对-甘油磷酸盐、1mM二硫苏糖醇)中的细胞培养物，从对照、UV-光照射海拉细胞和IL-1处理的TC-3细胞制备细胞提取物。通过在SS-34Beckman转子中以15,000rpm离心5分钟去除碎片。在室温将100μg的提取物与1μg GST-jun(氨基酸1到89)和10μL谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma)温育1小时。在使用刮除缓冲液清洗4次后，该珠重新悬浮在补充有L-TAT或L-TAT-IB1(s)肽(25μM)的同样的缓冲液中20分钟。然后通过添加10mM MgCl₂和5pCi ³³P-γ-dATP引发激酶反应并在30℃下温育30分钟。

然后通过在变性的10％聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE分离反应产物。干燥该凝胶，随后将其对X摄像胶片(Kodak)曝光。在这些实验中，TAT-IB(s)肽有效地防止了活化JNK磷酸化c-Jun。

实施例7：通过本文定义的TAT-IB(s)肽体内抑制c-JUN磷酸化

为了确定本文定义的能透过细胞的肽是否能阻断体内JNK信号传导，我们使用异源的GAL4系统。如上所述培养的海拉细胞用5×GAL-LUC报道载体连同GAL-Jun表达构建物(Stratagene)一起共转染，所述GAL-Jun表达构建物包括连接到GAL4DNA结合结构域的c-Jun(氨基酸1到89)的活化结构域。通过共转染表达紧邻上游激酶MKK4和MKK7的载体，实现JNK的活化(参见，Whitmarsh等人，Science 285：1573(1999))。简单地说，依照制造商的指示使用DOTAP(BoehringerMannheim)，在3.5-cm盘中，使用质粒转染3×10⁵个细胞。对于涉及GAL-Jun的实验，使用1μg报道质粒pFR-Luc(Stratagene)和0.5μg MKK4或MKK7表达质粒转染20ng的质粒。在转染3小时后，改变细胞培养基并添加TAT和TAT-IB1(s)肽(1μM)。16小时后，使用来自Promega的“双报道系统”在蛋白质含量归一化后测量荧光素酶的活性。在MKK4和MKK7介导的JNK活化后，添加TAT-IB1(s)肽阻断c-Jun的活化。因为海拉细胞表达JNK1和JNK2同种型而不表达JNK3，所以使用JNK3转染细胞。同样地，TAT-IB(s)肽抑制JNK2介导的c-Jun的活化。

实施例8：所有-D逆反IB(s)肽和其变体的合成

本发明肽可以是反向合成的全-D氨基酸肽，以防止天然的蛋白质水解(即，全-D逆反肽)。本发明的全D逆反肽将提供具有类似于天然肽的功能属性的肽，其中组成氨基酸的侧基将对应于天然肽比对，但保留抗蛋白酶抗性主链。

本发明的逆反肽是通过在肽链中连接述氨基酸使用D氨基酸合成的类似物，使得逆反肽类似物中氨基酸的序列正好与作为模型的选择肽中的序列相反。为了说明，如果天然产生的TAT蛋白(由L氨基酸形成)具有序列GPRKKRRQRRR[SEQID NO：5]，那么该肽的逆反肽类似物(由D氨基酸形成)将具有序列RRRQRRKKRG[SEQ ID NO：6]。合成D氨基酸链以形成逆反肽的方法在本领域是已知的(参见，例如Jameson等人，Nature，368，744-746(1994)；Brady等人，Nature，368，692-693(1994)；Guichard等人，J.Med.Chem.39，2030-2039(1996))。具体地，通过经典的F-mock合成生成根据SEQ ID NO：2、4、6、8、11-12、18、20、22和25-26的逆反肽，并通过质谱进一步分析。最后通过HPLC纯化它们。

因为天然肽的固有问题是被天然蛋白酶降解和固有的免疫原性，因此本发明的异形二价(heterobivalent)或异形多价(heteromultivalent)化合物将被制备以包括期望肽的“逆反异构体”。因此，保护肽免于天然蛋白质水解因此应该增加特定的异形二价或异形多价化合物的效力，两者都通过延长半衰期和降低旨在积极地破坏肽的免疫应答的程度实现。

实施例9：全D逆反IB(s)肽和其变体的长期生物活性

如实施例5中所示，由于为了保护D-TAT-IB(s)肽免于由天然蛋白酶降解，在与天然L氨基酸类似物比较时，预测包含D-TAT-IB(s)逆反的肽异源偶联物(heteroconjugate)(参见上述嵌合序列)的长期生物活性。

分析D-TAT-IB1(s)肽对IL-1诱导的胰腺β细胞死亡的抑制。将TC-3细胞与单一添加的指示肽(1μM)如上所述温育30分钟，然后加入IL-1(10ng/ml)。

然后，在使用IL-1温育两天后，通过使用碘化丙啶和Hoechst 33342核染色计数凋亡细胞。每次实验计数1,000个细胞的最小值。D-TAT-IB1肽降低IL-1诱导的凋亡与L-TAT-IB肽的程度类似。

也分析D-TAT-IB1肽对IL-1P诱导的细胞死亡的长期抑制。将TC-3细胞与单一添加的指示肽(1μM)如上温育30分钟，然后加入IL-1(10ng/ml)，之后每两天添加细胞因子。然后，在使用IL-1温育15天后，通过使用碘化丙啶和Hoechst 33342核染色计数凋亡细胞。需要说明的是，单一添加的TAT-IB1肽不给予长期保护。每次实验计数1000个细胞的最小值。结果，D-TAT-IB1(s)而不是L-TAT-IB1(s)能够给予长期(15天)的保护。

实施例10：通过根据本发明使用的L-TAT-IB1(s)肽抑制JNK转录因子

使用AP-1双标记探针(5′-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3′(SEQ ID NO：27)进行凝胶阻滞试验。如指出，用5ng/ml TNF-α处理海拉细胞核提取物1小时或没有处理。在TNF-α之前30分钟，加入根据本发明使用的TAT和L-TAT-IB1(s)肽。仅显示具有特定的AP-1DNA复合物的部分凝胶(通过使用未标记特异性的和非特异性的竞争剂的竞争实验证明)。

在TNF-α存在的情况下，根据本发明使用的L-TAT-IB1(s)肽减少了AP-1DNA结合复合物的形成。

实施例11：使用合入一孔的方法(all-in one well approach)抑制HepG2细胞中内源性JNK的活性。

实验的前一天，以3000个细胞/孔接种HepG2细胞。然后，加入增加浓度的白细胞介素-1[IL-1β)]或肿瘤坏死因子[TNFα)]。(a)以活化JNK 30分钟。细胞在20mM Hepes、0.5％吐温pH 7.4中裂解并进行AlphaScreen JNK处理。(b)Z’为通过10ng/ml IL-1诱导和在384孔/板(n＝96)中测量的JNK活性。(c)使用化学JNK抑制剂[星形孢菌素和SP600125]抑制内源的IL-1β诱导的JNK活性。(d)根据SEQ ID NO：9的肽抑制剂L-TAT-IB1(s)(在此缩写为L-JNKi)、根据SEQ ID NO：11的肽抑制剂D-TAT-IB1(s)(在此缩写为D-JNKi)和肽抑制剂JBD(相当于没有TAT序列的L-JNKI)对于IL-1依赖的JNK活性的影响。所有图表示3个独立的实验(n＝3)。

方法：Alphascreen激酶测定

原理：AlphaScreen是一种基于非放射珠的技术，其用于以微量培养板形式研究生物分子的相互作用。缩写ALPHA代表放大的发光接近同质测定(Amplified Luminescence Proximity Homogenous Assay)。其包括使“供体”和“受体”珠子紧密接近，然后级联的化学反应作用以生成放大的信号的生物相互作用。当激光在680nm处激发时，“供体”珠子中的光敏剂(酞菁染料)将周围的氧转换成激发单重态。在其4μsec的半衰期内，单重态氧分子在溶液中扩散多至200nm，而如果受体珠子在那接近内时，单重态氧将与“受体”珠子中的二甲基噻吩衍生物发生反应，生成在370nm化学发光，其进一步活化在同一“受体”珠中包含的荧光团。激发的荧光团随后发出520-620nm的光。不存在受体珠的情况下，单重态氧降为基态并不产生信号。

首先在激酶缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.6、10mM MgCl₂、1mM DTT、100μMNa₃VO₄、0.01％吐温-20)中稀释激酶试剂(B-GST-cJun、抗P-cJun抗体和活性JNK3)，并加到孔中(15μl)。然后，反应在10μMATP存在下在23℃下温育1小时；通过加入10μl珠混合物(蛋白A受体20μg/ml和链亲和素供体20μg/ml)、在检测缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.4、20mM NaCl、80mM EDTA、0.3％BSA)中稀释，然后在黑暗中23℃下再温育1小时进行检测。为了测量JNK内源性活性，如上描述进行激酶测定，除了用细胞裂解产物取代活性JNK3，在细胞裂解后加入反应激酶成分。以相同的浓度使用B-GST-cjun和P-cJun抗体，但是以50μM而不是10μM使用ATP。在Fusion或En Vision装置上直接分析AlphaScreen信号。

实施例12：：根据本发明使用的D-和L-TAT-IB1(s)肽的治疗活性的评估

a)试验系统：

i)种类/菌株：小鼠/BALB/c

ii)来源：Harlan Israel，Ltd.

iii)性别：雌性

iv)动物总的数量：n＝150

v)年龄：年轻成年，在研究开始为7周龄

vi)体重：在治疗开始时的动物体重差别不超过平均体重的±20％。

vii)动物健康情况：在研究中使用的动物的健康状况在到达时检查，只有健康良好的动物被用于适应实验室条件(至少7天)和在研究中使用。

viii)随机化：动物根据随机数表被随机分至试验组。

ix)终止：在研究结束时，存活的动物通过颈椎脱臼法(cercical dislocation)安乐死。

b)试验组的组成和剂量水平

下表列出包括研究的试验组。

XG-102＝SEQ ID NO：11

IP＝腹膜内给药

PO＝经口给药

SC＝皮下给药

c)试验步骤

结肠炎通过给予在50％乙醇中溶解的TNBS进行诱导

所有的动物然后用0.1至1000μg/kg的范围内剂量的XG-102腹膜内给药或皮下给药作为单剂量或者每天重复的剂量进行治疗(参见以上)。

d)观察和检查

i)临床体征

在以上试验的整个期间，进行仔细的临床检查并进行记录。观察包括外观变化，例如皮肤、毛皮、眼睛、粘膜、分泌物和排泄物的出现(例如，腹泻)和自主活动。也记录步态、姿势和触摸应答的变化以及奇异行为、震颤、惊厥、睡眠和昏迷的存在。

ii)体重

以每天为基础进行动物的个体体重的测定。

iii)结肠炎的临床评估

体重、大便一致性和经过直肠的出血每天都被记录并且作为疾病严重性分数的参数：

iv)结肠的宏观病理学

在试验的最后一天，动物进行安乐死和结肠被移出用于根据以下分数的宏观病理学评估：

e)结果

i)i)临床体征

在用XG-102(SEQ ID NO：11)处理后，在临床检查期间没有观察到异常。

ii)死亡率

没有记录死亡。

iii)体重

在第一天上，TNBS导致了显著的体重减轻。XG-102(SEQ ID NO：11)给予阻止了体重减轻或者缓解了症状和支持了回复。

iv)临床分数

TNBS注射载体处理的动物在研究的第1天达到最大分数和在第5天或在研究5天后完全恢复。柳氮吡啶处理导致了临床分数的减小。使用如上定义的任何剂量、途径或时间安排给药(单剂量或每天剂量)的XG-102(SEQ ID NO：11)产生了与用通常使用的参考药物柳氮吡啶所观察到的效果相等或者更好的效果。

v)宏观病理分数

在研究的结束时的宏观病理分数显示TNBS注射载体处理的动物在沿着结肠受到浮肿和溃疡的伤害。柳氮吡啶在完全地减轻宏观病理方面是有效的。

vi)结肠长度

在结肠长度上没有观察到疾病诱导或治疗的作用。

vii)结肠重量

在结肠重量上没有观察到疾病诱导或治疗的作用。

f)结论

由于在以上试验条件下获得和限于活着的数据的以上发现，SC或PO施用根据SEQ ID NO：11的示例性序列XG-102在增强疾病恢复方面是能起作用的。

实施例13：优选的实施方式

在以下当中，列出了根据本发明的一些优选的实施方式：

1.包括长度小于150个氨基酸的JNK抑制剂序列在制备用于治疗对象中慢性或非慢性炎性消化病的药物组合物中的应用。

2.根据实施方式1的所述JNK抑制剂序列的应用，其中所述JNK抑制剂序列衍生自由根据SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105任一序列限定或者编码的人或大鼠的IB1序列或者其片段或者变体。

3.根据实施方式1或2所述的JNK抑制剂序列的应用，其中所述JNK抑制剂序列包括范围为5个至150个的氨基酸残基，更优选为10个至100个氨基酸残基，甚至更优选为10个至75个氨基酸残基，和最优选为范围为10个至50个的氨基酸残基。

4.根据实施方式1至3任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中所述JNK抑制剂序列结合c-jun氨基末端激酶(JNK)。

5.根据实施方式1至4任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中当所述JNK抑制剂序列在JNK表达细胞中存在的时候，所述JNK抑制剂序列抑制至少一种JNK靶向转录因子的活化。

6.根据实施方式1至5任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中所述JNK靶向转录因子选自c-Jun、ATF2和Elk1。

7.根据实施方式1至6任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中当所述肽在JNK表达细胞中存在的时候，所述JNK抑制剂序列改变JNK作用。

8.根据实施方式1至7任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中所述JNK抑制剂序列由L-氨基酸、D-氨基酸或者两者的组合组成，优选包括至少1个或者甚至2个，优选至少3、4或5个，更优选至少6、7、8或9个和甚至更优选至少10个或更多个D-和/或L-氨基酸，其中在所述JNK抑制剂序列中所述D-和/或L-氨基酸可以以模块化、非模块化或交替的方式排列。

9.根据实施方式1至8任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中所述抑制剂序列包括或由以下组成：根据SEQ ID NO：1至4、13至20和33至100的至少一种氨基酸序列，或其片段、衍生物或者变体。

10.包括通过共价键连接的至少一个第一结构域和至少一个第二结构域的嵌合肽在制备用于治疗对象中慢性或非慢性炎性消化病的药物组合物中的应用，所述第一结构域包括运输序列，和所述第二结构域包括在实施方式1至9任一项定义的JNK抑制剂序列。

11.根据实施方式10所述的嵌合肽的应用，其中所述嵌合肽由L-氨基酸、D-氨基酸或者两者的组合组成，优选包括至少1个或者甚至2个，优选至少3、4或5个，更优选至少6、7、8或9个和甚至更优选至少10个或更多个D-和/或L-氨基酸，其中所述D-和/或L-氨基酸在所述嵌合肽中可以以模块化、非模块化或交替的方式排列。

12.根据实施方式10或11所述的嵌合肽的应用，其中所述运输序列包括人免疫缺陷病毒TAT多肽的氨基酸序列。

13.根据实施方式10至12任一项所述的嵌合肽的应用，其中所述运输序列包括或由SEQ ID NO：5、6、7、8、21或22的氨基酸序列组成。

14.根据实施方式10至13任一项所述的嵌合肽的应用，其中所述运输序列增加所述肽的细胞摄取。

15.根据实施方式10至14任一项所述的嵌合肽的应用，其中所述运输序列指引所述肽的核定位。

16.根据实施方式10至15任一项所述的嵌合肽的应用，其中所述嵌合肽包括或由以下组成：SEQ ID NO：9至12和23至32任一的氨基酸序列，或其片段，或其变体。

17.编码实施方式1至9任一项中定义的JNK抑制剂序列或者实施方式10至16任一项中定义的嵌合肽的分离的核酸在制备用于治疗对象中慢性或非慢性炎性消化病的药物组合物中的应用。

18.包括实施方式17中定义的所述核酸的载体在制备用于治疗对象中慢性或非慢性炎性消化病的药物组合物中的应用。

19.包括实施方式18中定义的所述载体的细胞在制备用于治疗对象中慢性或非慢性炎性消化病的药物组合物中的应用。

20.与根据实施方式1至9任一项的JNK抑制剂序列或者根据实施方式10至16任一项的嵌合肽免疫特异性地结合的抗体在制备用于治疗对象中慢性或非慢性炎性消化病的药物组合物中的应用。

21.根据前述实施方式任一项的应用，其中所述药物组合物通过选自以下的给药途径施用：肠胃外途径，包括静脉内的、肌肉内的、皮下的、皮内的或者经皮的；肠途径，包括口服的或者直肠的；局部途径，包括鼻的或者鼻内的；和其它途径，包括表皮的或者贴剂递送。

22.根据前述实施方式任一项的应用，其中所述非慢性或者慢性炎性病选自：胃肠道的疾病，所述胃肠道的疾病包括食道、胃、十二指肠的第一、二和三部分、空肠、回肠、回盲肠的复合体、大肠、升结肠、横结肠和降结肠乙状结肠和直肠的疾病；以结肠的炎症为特征的慢性炎性消化病，包括结肠炎，其选自溃疡性结肠炎(溃疡性结肠炎)、克罗氏症(克罗恩病)、改道性结肠炎、缺血性结肠炎、传染性结肠炎、暴发性结肠炎、化学性结肠炎、显微镜性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、未定型结肠炎和非典型结肠炎。

Claims

2.根据权利要求1所述的JNK抑制剂序列的应用，其中所述JNK抑制剂序列包括范围为5至150个的氨基酸残基，更优选为10至100个氨基酸残基，甚至更优选为10个至75个氨基酸残基，和最优选范围为10至50个的氨基酸残基。

3.根据权利要求1或2任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中所述JNK抑制剂序列结合c-jun氨基末端激酶(JNK)。

4.根据权利要求1至3任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中当所述JNK抑制剂序列存在于JNK表达细胞时，所述JNK抑制剂序列抑制至少一种JNK靶向转录因子的活化。

5.根据权利要求1至4任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中所述JNK靶向转录因子选自c-Jun、ATF2和Elk1。

6.根据权利要求1至5任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中当所述肽存在于JNK表达细胞时，所述JNK抑制剂序列改变JNK作用。

7.根据权利要求1至6任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中所述JNK抑制剂序列由L-氨基酸、D-氨基酸或者两者的组合组成，优选包括至少1个或者甚至2个，优选至少3、4或5个，更优选至少6、7、8或9个和甚至更优选至少10个或更多个D-和/或L-氨基酸，其中在所述JNK抑制剂序列中所述D-和/或L-氨基酸可以以模块化、非模块化或交替的方式排列。

8.根据权利要求1至7任一项所述的应用，其中所述JNK抑制剂序列包括由根据SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104或SEQ ID NO：105的任一序列定义或编码的人或大鼠IB1序列的片段、变体或者这类片段的变体。

9.根据权利要求1至8任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中所述抑制剂序列包括或由以下组成：根据SEQ ID NO：1至4、13至20和33至100的至少一种氨基酸序列，或其片段、衍生物或者变体。

10.包括通过共价键连接的至少一个第一结构域和至少一个第二结构域的嵌合肽在制备用于治疗对象中慢性或非慢性炎性消化病的药物组合物中的应用，所述第一结构域包括运输序列，和所述第二结构域包括在权利要求1至9任一项中定义的JNK抑制剂序列。

11.根据权利要求10所述的嵌合肽的应用，其中所述嵌合肽由L-氨基酸、D-氨基酸或者两者的组合组成，优选包括至少1个或者甚至2个，优选至少3、4或5个，更优选至少6、7、8或9个和甚至更优选至少10个或更多个D-和/或L-氨基酸，其中所述D-和/或L-氨基酸在所述嵌合肽中可以以模块化、非模块化或交替的方式排列。

12.根据权利要求10或11所述的嵌合肽的应用，其中所述运输序列包括人免疫缺陷病毒TAT多肽的氨基酸序列。

13.根据权利要求10至12任一项所述的嵌合肽的应用，其中所述运输序列包括或由SEQ ID NO：5、6、7、8、21或22的氨基酸序列组成。

14.根据权利要求10至13任一项所述的嵌合肽的应用，其中所述运输序列增加所述肽的细胞摄取。

15.根据权利要求10至14任一项所述的嵌合肽的应用，其中所述运输序列指引所述肽的核定位。

16.根据权利要求10至15任一项所述的嵌合肽的应用，其中所述嵌合肽包括或由以下组成：SEQ ID NO：9至12和23至32任一的氨基酸序列，或其片段或变体。

17.根据权利要求10至15任一项所述的嵌合肽的应用，其中所述嵌合肽包括或由以下组成：SEQ ID NO：9或11的氨基酸序列。

18.编码权利要求1至9任一项中定义的JNK抑制剂序列或者权利要求10至17任一项中定义的嵌合肽的分离的核酸在制备用于治疗对象中慢性或非慢性炎性消化病的药物组合物中的应用。

19.包括权利要求18中定义的所述核酸的载体在制备用于治疗对象中慢性或非慢性炎性消化病的药物组合物中的应用。

20.包括权利要求19中定义的所述载体的细胞在制备用于治疗对象中慢性或非慢性炎性消化病的药物组合物中的应用。

21.与根据权利要求1至9任一项所述的JNK抑制剂序列或者根据权利要求10至17任一项所述的嵌合肽免疫特异性地结合的抗体在制备用于治疗对象中慢性或非慢性炎性消化病的药物组合物中的应用。

22.根据前述权利要求任一项的应用，其中所述药物组合物通过选自以下给药途径施用：肠胃外途径，包括静脉内的、肌肉内的、皮下的、皮内的或者经皮的；肠途径，包括口服的或者直肠的；局部途径，包括鼻的或者鼻内的；和其它途径，包括表皮的或者贴剂递送。

23.根据前述权利要求任一项的应用，其中所述非慢性或者慢性炎性疾病选自：胃肠道疾病，所述胃肠道疾病包括食道、胃、十二指肠的第一、二和三部分、空肠、回肠、回盲肠的复合体、大肠、升结肠、横结肠和降结肠乙状结肠和直肠的疾病；以结肠的炎症为特征的慢性炎性消化病，包括结肠炎，其选自溃疡性结肠炎(溃疡性结肠炎)、克罗氏症(克罗恩病)、改道性结肠炎、缺血性结肠炎、传染性结肠炎、暴发性结肠炎、化学性结肠炎、显微镜性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、胶原性结肠炎、未定型结肠炎和非典型结肠炎。

24.据前述权利要求任一项的应用，其中所述JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的剂量(每千克体重)在以下的范围：多至10mmol/kg、优选多至1mmol/kg、更优选多至100μmol/kg、甚至更优选多至10μmol/kg、甚至更优选多至1μmol/kg、甚至更优选多至100nmol/kg、最优选多至50nmol/kg。

25.据前述权利要求任一项的应用，其中所述JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的剂量在以下的范围：约1pmol/kg至约1mmol/kg、约10pmol/kg至约0.1mmol/kg、约10pmol/kg至约0.01mmol/kg、约50pmol/kg至约1μmol/kg、约100pmol/kg至约500nmol/kg、约200pmol/kg至约300nmol/kg、约300pmol/kg至约100nmol/kg、约500pmol/kg至约50nmol/kg、约750pmol/kg至约30nmol/kg、约250pmol/kg至约5nmol/kg、约1nmol/kg至约10nmol/kg、或者所述值的任两个的组合。