WO1994023751A1 - Nukleinsäure-transferpeptide und deren verwendung zur einschleusung von nukleinsäuren in eukaryontische zellen - Google Patents

Nukleinsäure-transferpeptide und deren verwendung zur einschleusung von nukleinsäuren in eukaryontische zellen Download PDF

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WO1994023751A1
WO1994023751A1 PCT/EP1994/001147 EP9401147W WO9423751A1 WO 1994023751 A1 WO1994023751 A1 WO 1994023751A1 EP 9401147 W EP9401147 W EP 9401147W WO 9423751 A1 WO9423751 A1 WO 9423751A1
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peptide
nucleic acid
ligand
gly
seq
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PCT/EP1994/001147
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Andrej Surovoy
Jens Dannull
Karin Moelling
Günther-Gerhard JUNG
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Boehringer Mannheim Gmbh
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT

Definitions

  • nucleic acid transfer peptides and their use for introducing nucleic acids into eukaryotic cells
  • the invention relates to nucleic acid transfer peptides and a method for introducing nucleic acids into eukaryotic cells as well as complexes in which nucleic acids are bound to the nucleic acid transfer peptides according to the invention by ionic interaction and their use for the production of therapeutics.
  • a large number of methods are known for introducing nucleic acids into eukaryotic cells and in particular into mammalian cells, for example calcium phosphate transfection, polybrene transfection, protoplast fusion, electroporation, lipofection and microinjection.
  • these methods are limited to in vitro transfection.
  • these methods often have a low efficiency and the cell specificity is missing.
  • WO 91/17173 describes conjugates which contain a binding domain and an effector domain when covalently coupled. Both domains can be connected via a linker.
  • the binding domain is, for example, a cell surface receptor and the effector domain is an antisense composition.
  • the linker can be specific for a subcellular region, such as for the nucleus.
  • such a conjugate is not suitable for gene therapy use, since the covalent coupling of the antisense composition cannot have a useful effect on the expression of cell genes.
  • nucleic acids can be coupled non-covalently to conjugates of proteins and polycations (Wu and Wu, J. Biol. Chem. (1987), 4429-4432, J. Biol. Chem. 263 (1988), 14621- 14624). Then foreign DNA is introduced into cells with the aid of a soluble DNA carrier system consisting of a chemically synthesized conjugate with mannose and lactose as ligands (P. Midoux et al, Nucleic Acid Res. 21 (1993) 871-878).
  • EP-A 0 388 758 discloses chemically synthesized transferrin-polycation conjugates which form complexes with polyanionic nucleic acids. By binding to the transferrin receptor, these complexes can be introduced into target cells.
  • conjugates of polylysine and asialoglycoprotein Wang et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 14621-14624) or with a galactose ligand (Plank et al., Bioconjugate Chem., 3, (1992), 533 - 539) is also known.
  • Inactivated adenoviruses Cotten et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, (1992), 6094-6098, Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei.
  • WO 93/07283 also describes a “2-ligand system” consisting of DNA-binding (polycationic) portion (nucleic acid-affine substance) and an internalization factor for the uptake of DNA into the cell for non-viral gene transfer.
  • a 2-ligand system consisting of DNA-binding (polycationic) portion (nucleic acid-affine substance) and an internalization factor for the uptake of DNA into the cell for non-viral gene transfer.
  • Called polylysine-transferrin complex These DNA-containing complexes are absorbed into the cells via endocytosis. However, the effectiveness of the method is not satisfactory. There is also the possibility that the complexes get into lysosomes during internalization and are broken down before the DNA reaches the cell nucleus.
  • a so-called endosomolytic agent is added to these complexes in WO 93/07283, which, for example, corresponds to a virus or a virus component (e.g. adenovirus or influenza hemagglutinin).
  • a virus or a virus component e.g. adenovirus or influenza hemagglutinin
  • the object of the present invention was therefore to
  • nucleic acid transfer peptides which are easy to prepare, can transport nucleic acids with high efficiency into cells, improve the efficiency of stable gene transformation, elicit low immune reactions and are readily degradable in the target cell.
  • Nucleic acid transfer peptide which contains: a) a first ligand, selected from the group peptide, steroid, carbohydrate, lipid or vitamin, which binds to a binding partner on the cell surface of eukaryotic cells and thereby an endocytosis of the complex from said nucleic acid transfer peptide and a nucleic acid triggers, b) a second ligand selected from the group peptide, steroid, carbohydrate, lipid or
  • Vitamin which is linked to a binding partner
  • a third ligand which is a basic peptide and binds to nucleic acids through ionic interaction.
  • Another object of the invention is a complex comprising a peptide according to the invention and an ionic
  • Interaction contains bound nucleic acid.
  • Nucleic acid that complexes with the protein can be linear, circular, single or double stranded DNA or RNA, triple-helix DNA, a DNA-RNA hybrid or PNA. Furthermore, the nucleic acid can also be chemically modified, provided that the negative charge of the phosphate groups is retained to the extent that the ionic bond to the fusion polybindepeptide according to the invention is retained. Such nucleic acid derivatives are, for example, thioates and dithioates. Further derivatives are described in Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 544-584, the content of this publication being the subject of the disclosure. Nucleic acids with chemically modified nucleotide bases, e.g. B. RNA molecules in which the 2'-OH group in one or more nucleotides by an O-alkyl group,
  • O-allyl group, halogen group or other modification groups are also suitable.
  • the nucleic acid to be introduced into the eukaryotic target cells is preferably a DNA or a possibly
  • the nucleic acid introduced into the target cell can contain, for example, genetic information which can be expressed in the target cell in order to eliminate genetically caused defects.
  • the nucleic acid to be introduced into the target cell can also have antisense properties (complementary to an mRNA present in the target cell) for inhibiting the expression of specific genes in the target cell.
  • the nucleic acid to be introduced can also be a ribozyme which cleaves RNA of the target cells in a specific manner. Such ribozymes are described, for example, in Rossy and Sarver, TIBtech 8 (1990) 179-183, the content of this publication being the subject of the disclosure.
  • the introduction of antisense or Ribozymnu small acids in specific target cells can, especially in the therapy of viral diseases, such as. B. AIDS, play an important role.
  • the nucleic acid can be introduced with the aim of permanent or transient expression of the introduced gene or
  • Aids for cell fusion can be added to further improve the introduction of the nucleic acid into eukaryotic cells.
  • nucleic acid transfer peptides are preferred Introduced nucleic acids used to regulate endogenous gene expression in the eukaryotic target cell both in vivo and in vitro. This regulation takes place by inserting
  • nucleic acid suitable for this contains a DNA regulation segment which is able to modulate the expression of the gene to be regulated when it is operatively linked to this gene, and a DNA targeting segment which is homologous to a region within or in is close to the gene to be modulated.
  • this construct is inserted into the genome in such a way that the regulation segment is operatively linked to the gene to be modulated.
  • Suitable genes are preferably marker genes (e.g. resistance genes for neomycin, HPRT, tk), selection genes (e.g. for methotrexate) or functionally active genes which can be expressed in eukaryotic cells.
  • marker genes e.g. resistance genes for neomycin, HPRT, tk
  • selection genes e.g. for methotrexate
  • functionally active genes which can be expressed in eukaryotic cells.
  • the nucleic acid to be introduced is preferably a vector which carries an exogenous nucleic acid (for example plasmids or cosmids).
  • the three ligands of the nucleic acid transfer peptide are usually covalently bound to one another.
  • the ligands are connected to one another via the nucleic acid to be transferred. So here is the nucleic acid a bi- or multifunctional binding partner for the ligands. This means that, for example, one compound, which consists of the first and third ligand, and another compound, which consists of the second and third
  • Ligand exists, via ionic interactions between the third ligand and nucleic acid are complexly bound.
  • Other variants such as complexes of nucleic acid with a compound from ligands 1/2/3 and a compound from ligands 3/4 are also suitable. Accordingly, at least two ligands are bound via the nucleic acid.
  • nucleic acid transfer peptides according to the invention are particularly preferably suitable for introducing RNA, ribozymes and short-chain oligonucleotides (eg antisense sequences) up to approximately 30 nucleotides in length.
  • nucleic acid transfer peptides without the second nucleus-binding ligand are also suitable for complexing DNA and for use according to the invention.
  • Such complexes have a surprisingly high serum stability and
  • RNA, ribozymes and short-chain oligonucleotides eg antisense sequences
  • the cells preferably tumor cells
  • the number of cells formed or the amount of DNA is determined by methods familiar to the person skilled in the art.
  • the amount of DNA is determined, for example, by staining with ethidium bromide or MTT (Example 6)
  • the ligands used in the nucleic acid transfer peptide according to the invention and which bind to binding partners on cell surfaces or to the outer nuclear membrane are peptides, Steroids, carbohydrates, lipids or vitamins.
  • the task of the ligands is "to bind the complex of nucleic acid and peptide to cell surface receptors, cell surface molecules, cell adhesion molecules, cell membranes or the outer core membrane.
  • Peptides with short sequences are particularly preferably used as the first ligands, for example the peptide RGD, which represents a binding site for the integrin receptor on cell surfaces or the gp120 binding site.
  • first ligands are, for example, the binding domains of growth factors, hormones, viral antigens, toxins, lipoproteins and their short-chain fragments, which also bind to binding partners on cell surfaces.
  • growth factors are CSF (colony stimulating factors), NGF (nerve growth
  • EGF epidermal growth factor
  • peptides are lectins and their short-chain fragments that bind to carbohydrate structures on cell surfaces and nuclear membranes (for an overview, see J. C. Paulson, The Receptors, Vol. 2 (1985), P.M. Conn, Ed., Academic Press N.Y.).
  • Preferred steroids are progesterone, androgen,
  • Preferred carbohydrates are galactose, mannose-6-phosphate, mannose, Lewis-X-carbohydrates, glucose, fucose.
  • Preferred lipids are fatty acids and arachidonic acid.
  • Preferred vitamins are vitamin A or D 3 .
  • Peptides, steroids, carbohydrates, lipids or vitamins are suitable as the second ligand, which mediate binding of the nucleic acid transfer peptide to the outer core membrane of eukaryotic cells.
  • Suitable peptides are described, for example, by De Robertis, Nature 272, 1978, 254-256 and Dingwall, Cell 30 (1982), 449-458, the content of these publications being the subject of the disclosure.
  • PKKKRKV SEQ ID No. 1
  • SEQ ID No. 1 is known as a sequence motif
  • Another peptide motif which is suitable as a second ligand is the sequence KRPAATKKAGQAKKKKL (SEQ ID NO.2) and modifications thereof, cf. Table 2 (Robbins, Cell 64 (1991), 615-623).
  • Other suitable proteins are the H3 / H4 binding protein N1 from Xenopus (Kleinschmidt and Mamar, EMBO J. 7 (1988), 1605-1614, the content of which of this publication is the subject of the disclosure.) and polymerase 1 of the influenza virus (Nath and Nayak, Mol. Cell Biol. 10 (1990), 4139-4145, the content of this publication being the subject of the disclosure.).
  • Further peptide motifs suitable as second ligand are listed in Table 1.
  • An essential feature of peptide motifs which are suitable as a second ligand is that these peptides should contain a large number of basic amino acids.
  • VSKRPRP SEQ ID NO. 3
  • Other suitable motifs can be found in the influenza virus non-structural protein (Greenspan, J. Virol. 62 (1988), 3020-3026, the content of which
  • the peptide motif is preferably contained several times in the nucleic acid transfer peptide.
  • the glucocorticoid receptor is a protein with a zinc finger that can bind to DNA and mediates binding to the outer nuclear membrane, preferably in the presence of glucocorticoid.
  • motifs from the glucocorticoid receptor it is therefore preferred to add glucocorticoids, which can also be covalently coupled to the peptide according to the invention.
  • the glucocorticoid receptor contains two suitable motifs (nuclear localizing sequence (NLS1, NLS2), Picard and Yamamoto, EMBO J. 6 (1987), 3333-3340, the content of this publication being the subject of the disclosure).
  • NLSl consists of 28 amino acids.
  • the domain of amino acids 256-303 is preferred as the second ligand.
  • nucleoplasmin E1A and SV40 large T antigen are basic ligands.
  • Nucleoplasmin contains a motif consisting of two basic amino acid residues, followed by a spacer of ten other residues and a cluster of 5 amino acids, 4 of which are basic.
  • the third ligand is to be understood as a polyamino acid (hereinafter also referred to as a motif) which specifically or nonspecifically recognizes nucleic acids in small defined domains and independently of the other structure of the nucleic acid. Some of these recognition motifs are contained in transcription factors and chromosomal proteins.
  • Such motifs which contain serine, proline and basic amino acids, can be found several times at the amino and carboxy end of the histone Hl and at the amino terminus of the histone H2B from sea urchin sperm.
  • Such a motif is, for example, STPKRKR (SEQ ID NO. 4).
  • TPKRPRGRPKK (SEQ ID NO. 5) binds to AT-rich DNA sequences.
  • a truncated version of this peptide (KRPRGRPK, SEQ ID NO. 6, but not PRGRP, SEQ ID NO. 7) also binds to DNA.
  • a 24-amino acid protein of the amino terminus from RecA has an ⁇ -helical structure and preferably binds to single-stranded DNA.
  • Histon's H1 occurs is the alanine / lysine motif.
  • a variant of the histone H1 from sea urchin sperm has a 57-amino acid segment which is rich in alanine and lysine and free of proline residues. It is located at the carboxy terminus immediately after the globular domain and is described in Wells and McBride, Nucleic Acids Res. 17 (1989) r311-r346 and Hill et al., EMBO J. 8 (1989), 2591-2599, the content of which Publications
  • SAP Serumamyloid P
  • pentraxin family a member of the pentraxin family (Turnell et al., FEBS Lett. 232 (1988), 263-268, whereby the content of this publication is the subject of the disclosure.).
  • SAP binds to both DNA and nucleosome core regions. Protein sequences from other pentraxins and histones can also be identified as DNA binding domains. A consensus sequence that is contained in both pentraxins and histones is
  • Zinc-ligated proteins are also known as nucleic acid binding proteins. So far, at least four different groups of zinc-binding protein domains are known. The first is the group of the classic "zinc finger", an approximately 30 amino acid module with a zinc ion, which is ligated via two cysteines and two histidines (Miller et al., EMBO J. 4 (1985), 1609-1614, Brown et al., FEBS Lett. 186 (1985), 271-274, the content of these
  • the second zinc-containing domain is an approximately 80 amino acid domain which is bound in the receptors for steroids and hormone-like molecules. This domain contains two zinc ions. Each zinc ion is over four Cysteine ligated (Freedman et al., Nature 334 (1988), 543-546, the content of this publication being the subject of the disclosure.). In contrast to the C 2 -H 2 zinc finger motif, conserved hydrophobic residues are missing and the distance between the two motifs is somewhat larger (15 residues compared to approx. 4 to 8 in TFIIA).
  • the third domain is in yeast activators, such as. B. GAL4. These domains contain two closely adjacent zinc ions complexed over 6 cysteines (Pan and Coleman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 2077-2081, the content of this publication being the subject of the disclosure.).
  • the DNA binding domain is located at the amino terminus. Residues 1-74 are sufficient for recognition and a somewhat larger fragment (1-147) contains further sites which increase the specific affinity.
  • GATA binding proteins which include the hemotopoietic regulatory factor GATA-1, contain a fourth class of zinc-containing domains which recognize and bind DNA (Orkin, Cell 63 (1990), 665-672, the content of this publication being the subject of the disclosure is.).
  • RNA DNA sequence binds to viral genomic RNA.
  • the first type is found in the retroviral gag proteins that bind to viral genomic RNA (Surovoy et al., J. Mol.
  • nucleic acid-binding proteins which cannot be classified into these classes, but whose nucleic acid-binding motifs are suitable for the invention.
  • these are the heat shock factor, viral activators, nucleocapsid proteins of viruses.
  • Another group are the so-called genome-linked proteins (VPg), which are contained in picornaviruses and short peptides (20 - 25 amino acids), e.g. B. VPg3 from the foot and mouth disease virus,
  • GPYEGPVKKPVALKVKAKNLIVTE (SEQ ID NO. 8), which covalently binds to RNA, where N is also suitable instead of M.
  • N is also suitable instead of M.
  • these peptides are also able to interact ionically with nucleic acids.
  • first and second ligand are peptides, it is advantageous if the first ligand is 2-100, the second ligand 2-20, the third ligand 3-100 and the nucleic acid transfer peptide are 10-250 amino acids long.
  • the nucleic acid transfer peptide according to the invention can contain a fourth peptide or lipid which accelerates the dissolution of the endosomes formed during endocytosis and is preferably 10-40 amino acids long.
  • Suitable peptides are for example, described in Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA 89 (1992), 7934-7938 and Kamata et al., Nucl. Acid. Res. 22 (1994), 536-537, the content of these publications being the subject of the disclosure.
  • nucleic acid transfer peptides are prepared by the methods familiar to the person skilled in the art. If it is a pure peptide, the usual methods for peptide synthesis can be used, usually the amino acid forming the C-terminal end is bound to a support, the peptide is built up step by step from the C-terminus and this is then cleaved from the support.
  • an amino acid is bound to an insoluble, easily filterable polymer, for example via its carboxy group, and the peptide chain is then built up step by step from the C-terminal end.
  • an N-protected amino acid is reacted with a reactive group of a synthetic resin.
  • the N- ⁇ protecting group is removed from the amino acid covalently anchored to the carrier particle and the resulting aminoacyl polymer is reacted with the next N-protected amino acid.
  • the N- ⁇ protecting group is removed dipeptide and the resulting aminoacyl polymer is reacted with the next N-protected amino acid. All excess reagents and by-products are removed by simple filtration. Once the desired peptide sequence has been produced in this way, the covalent bond between the C-terminal amino acid and the anchor group of the polymeric carrier is cleaved.
  • the insoluble carrier becomes simple
  • the peptide can be determined by means of chrozetographic methods getting cleaned. Such methods are described, for example, in Merryfield, JACS 85 (1964) 2146, the content of this publication being the subject of the disclosure.
  • the desired peptide can also be synthesized in fragments and the fragments through
  • Peptide bonds are ligated.
  • the peptides can be recombinantly, by which the
  • non-peptide ligands and cell surface integrating substances e.g. carbohydrates, lipids, vitamins, steroids
  • binding to peptides the ligands and substances are appropriately activated beforehand. Suitable activation reagents are known to the person skilled in the art, for example di-cyclohexylcarbodiimide can be used. Carbonyl groups of the ligands and substances in active esters are expediently modified.
  • a complex according to the invention can be used for the production of a therapeutic agent for the treatment of viral infections, for gene therapy, for stimulating the immune response against malignant cells or tumors, for
  • the complex of nucleobinding peptide and DNA is converted into an applicable form by the methods familiar to the person skilled in the art. If the complex is given intramuscularly or subcutaneously should be dissolved, for example, in physiological saline.
  • the therapeutic agent can be used, for example, in the form of a spray or an aqueous solution.
  • Such temporary protection can be achieved, for example, by encapsulating the peptides (complexes) according to the invention.
  • the encapsulation can be carried out, for example, by covering it with a protective jacket (microencapsulation or embedding a large number of peptides (complexes) according to the invention in a protective carrier (macroencapsulation)).
  • the encapsulation material can be semipermeable or become semipermeable when introduced into the human or animal body, usually a biodegradable substance is used as the carrier for the encapsulation.
  • peptides (complexes) according to the invention can be applied by the methods familiar to the person skilled in the art, for example intradermally, intramuscularly, intraperitoneally, intravenously, subcutaneously, intranasally, into the cerebrospinal fluid spaces or directly into tumor tissue.
  • Table 3 shows various peptides that were produced in partial sequences and then ligated, and their binding constants for various nucleic acids. Tab. 3
  • the individual peptides correspond to the following SEQ ID NO:
  • Table 4 shows preferred peptides which are suitable as ligands (according to Robbins, Cell 64 (1991), 615-623).
  • Table 5 shows further examples of peptide ligands (1 + 3).
  • SEQ ID NO: 30 shows an estrogen-coupled peptide (SEQ ID NO: 30) which is suitable as a ligand (1 + 3).
  • Aldovini A. & Young, RA (1990). Mutations of RNA and protein sequences involved in HIV-1 packaging in production of noninfectious virus. J. Virol. 64, 1920-1926.
  • NCp7 Recombinant human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid
  • Small finger protein of avian and murine retroviruses has nucleic acid annealing activity and positions the replication primer tRNA onto genomic RNA. EMBOJ. 7, 1777-1783.
  • nucleocapsid protein isolated from HTV-1 particles binds zinc and forms retroviral-type zinc fingers.
  • C-te ⁇ ninal retroviral-type zinc finger domain from the HTV-1 nucleocapsid protein is structurally similar to the N-terminal zinc finger domain.
  • the rate of nuclear cytoplasmic protein transport is determined by the casein kinase II site flanking the nuclear localization sequence of the SV40 T-antigen. EMBOJ. 10, 633-639.
  • 90kD non-steroid binding phosphoprotein that binds to the untransformed glucocorticoid receptor in molybdate-stabilized L-cell cytosol is the murine 90kD heat shock protein. J. Biol. Chem. 260, 12398-12401.
  • the peptides were prepared using FMOC (fluorenyloxycarbonyl) solid phase synthesis. The synthesis takes place on an ABI 430A peptide synthesizer (Applied Biosystems). The peptide was performed on 0.4 g SASRIN resin, starting with FMOC-derivatized glycine. The FMOC groups were each split off with 25% piperidine in DMF. The binding of the other FMOC-protected amino acids (5th
  • the peptide was released from the resin with 1% trifluoroacetic acid in dichloromethane in 15 minutes at room temperature. The filtrates are collected, washed with dichloromethane and precipitated by adding diethyl ether. Precipitation from ethyl acetate / diethyl ether gives the FMOC-protected peptide.
  • the N-terminal fragment of Fmoc-1-19 was synthesized on an Fmoc-Gly-Sasrin resin (0.4 g, 0.7mmol / g; Bachern). After treating the resin with 25% piperidine in dimethylformamide (DMF) to split off the Fmoc group, each Fmoc amino acid (5 equivalents) was sequentially removed using O- (1H-benzotriazol-1-yl) - 1,1,3, 3-tetramethyl-uronium tetrafluoroborate (TBTU) / 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) / diisopropylethylamine (DIPEA) (5: 5: 7.5 equiv.) Concentrated.
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • the middle fragment Fmoc-20-35 was synthesized according to the same synthesis plan.
  • a double clutch was used to introduce Fmoc-Ala 30 .
  • the protected fragment was cleaved with 1% trifluoroacetic acid (TFA) in dichloromethane (CH2C12) (6 ⁇ 15 min).
  • the filtrates were collected, neutralized with pyridine and precipitated from diethyl ether.
  • the following repeated precipitations from the ethyl acetate / diethyl ether mixture gave the desired protected fragments with a yield of 63% and 65%, respectively.
  • the N-terminal fragment Fmoc-1-19 (0.08 mmol, 390 mg in 1 ml DMF) was preactivated under the same conditions and coupled with the 20-55 peptide resin overnight. Finally, 0.52 g of the Fmoc-1-55 peptide resin was obtained. Part of this peptide resin was used for peptide cleavage.
  • the 1-55 peptide was mixed with a mixture of m-cresol: dimethyl sulfide: ethanedithiol: TFA
  • Fmoc Gly-Sasrin resin (100mg, 0.65mmol / g) was sequentially treated with 7 equivalents (0.45mmol) of each Fmoc amino acid using the TBTU / HOBt / DIPEA activation method
  • the peptide was lyophilized from tert-butyl alcohol / water (4: 1, v / v).
  • 1-35-peptide-resin 32 mg, 0.0032 mmol was protected within 15 h with 0.0064 mmol (8.1 mg in 100 ml DMF) of the Ac-GRGDSPGSG-OH-protected fragment containing TBTU / HOBt was preactivated, coupled.
  • the peptide resin was worked up as described in Ib.
  • Fmoc-136-156-Gly-1-Sp-35 peptide a) Fmoc-Gly-Wang resin (210 mg, 0.52 mmol / g; Novabiochem) was sequentially with 10 equivalents. (1 mmol) of each Fmoc amino acid activated by the TBTU / HOBt / DIPEA method, acylated. A sample of 1-SP-35 peptide resin (40 mg) was cleaved as in 1.a. described. After HPLC purification, 10.5 mg of l-SP-35 peptide were obtained (yield: 73%).
  • the Fmoc group was cleaved and the peptide-resin was treated with 2 equivalents of Ac-GRGDSPGSG-OH (17 mg, 0.0134 mmol) for 15 h as in 3.b. described implemented. After cleavage and purification, HPLC-pure peptide resulted.
  • the peptide was cleaved from the resin as described above and purified by HPLC. Yield: 4.5 mg, 22.5% of theory.
  • Fmoc-FIENGWEGMIDG-OH (25.5 mg, 0.012 mmol) was activated with TBTU / HOBT in DMF (500 ml) and coupled to the 1-Sp-35-peptide resin (30 mg, 0.004 mmol) within 15 h .
  • Fmoc-GLFEAIAG-OH (12.6 mg, 0.012 mmol) was activated and coupled with TBTU / HOBT in DMF / NMP (1: 1) (1 ml). Part of the peptide resin thus obtained was converted into a peptide and protective spin-off used.
  • HPLC-pure peptide was obtained by cleavage and purification.
  • NC protein nucleic acid binding of the protein (NC protein), fragments of the NC protein as well as the
  • Increasing amounts of protein are incubated with a constant amount of radiolabeled nucleic acid in 100 ⁇ l binding buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 100 ⁇ M ZnCl 2 ) for 15 min at 25oC and then filtered through nitrocellulose filters with a pore size of 0.45 ⁇ m . The nitrocellulose filters are then washed twice with 1 ml of binding buffer and the radioactivity bound is determined by scintillation counting.
  • 100 ⁇ l binding buffer 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 100 ⁇ M ZnCl 2
  • HIV-1 RNA (cf. J. Mol. Biol. 229 (1993), 94-104) serves as test nucleic acids and is radioactively labeled during the in vitro transcription by incorporation of ⁇ - [ 32 P] -UTP. In addition, 5'- 32 P are end-marked
  • Oligodeoxynucleotide used.
  • the dissociation constants are determined by analyzing the binding data in double reciprocal plots (cf. J. Mol. Biol. 34 (1968), 361-364) by plotting the reciprocal relative saturation (ordinate) and the reciprocal protein concentration (abscissa).
  • RNA with a concentration of 1.4 ⁇ 10 -11 M single-stranded deoxynucleotide with a concentration of 1.7 ⁇ 10 -10 M and
  • double-stranded deoxynucleotide with a concentration of 0.85 ⁇ 10 -10 M used.
  • the radioactively labeled nucleic acid and increasing amounts of unlabeled competitor nucleic acid are incubated with a constant protein concentration, the protein being added last.
  • the nucleic acids to be bound were: ms2-RNA (30-fold excess), ssM13-DNA (70-fold), dsM13-Rf-DNA (265-fold).
  • NCp7 protein T.L. South, Biochemistry 30 (1991) 6342-6349
  • nucleic acid-binding part of the peptide according to the invention is used as the nucleic acid-binding part of the peptide according to the invention.
  • This peptide is extended by 22 amino acids of the viral protein vpl (F136), which interacts with the integrore receptor (Hynes, RO Cell 69 (1992) 11-25).
  • vpl the viral protein
  • integrore receptor Hynes, RO Cell 69 (1992) 11-25.
  • a complex is produced between the peptide according to the invention and an 18mer DNA oligonucleotide, which is directed against the start of the second codon of human c-myb RNA.
  • the sequence of this antisense oligonucleotide (a-myb) is:
  • this oligonucleotide reduces the proliferation of the human promyelocytic cell line HL60 (G. Anfossi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3379-3383.
  • HL-60 cells ATCC CCL 240
  • RPMI medium with 10% FCS
  • peptide derivatives complexed with oligodeoxynucleotide.
  • This approach is incubated for 5 days at 37 * C / 5% CO 2.
  • the cell number is determined after three and five days.
  • 100 ⁇ l cells are removed and the corresponding volume is filled up with RPMI medium (10% FCS).
  • the peptide and nucleic acid are complexed in a volume of 10 ⁇ l binding buffer. After 15 minutes at room temperature, the mixture is added to the cells. On the second and third days, this treatment is repeated with a quarter of the starting dose.
  • plasmids contain indicator genes (luciferase, ⁇ -galactosidase, chloramphenicol transferase) under the control of viral promoters (eg SV40 early promoter or IE promoter / enhancer from MCMV. Tissue-specific cellular promoters can also be used).
  • viral promoters eg SV40 early promoter or IE promoter / enhancer from MCMV. Tissue-specific cellular promoters can also be used.
  • the enzymatic activity of the expressed indicator gene products was analyzed. The analysis can be carried out luminometrically, photometrically or by acetylation of chloramphenicol with 14 C-acetyl-CoA.
  • Example 3 In vitro transcribed RNAs from indicator genes are used here. The enzymatic activity of the expressed gene products is also analyzed.
  • Capan-1 cells (ATCC HTB 79, human pancreatic adenocarcinoma cell line) were grown in tissue culture dishes with 96
  • Capan-1 cells in 100 ⁇ l RPMI medium containing 10% fetal calf serum (FCS) were placed in each well. given. The cells were cultured in an incubator for 12 h and then treated as follows: (control) 10 ⁇ l
  • TN buffer 50 mM Tris HCl pH 8.0, 50 mM NaCl; (DOTAP) 1 ⁇ g DOTAP (N- [l- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethyl-ammonium methyl sulfate, Boehringer Mannheim) in 10 ⁇ l TN; (DOTAP + Rz mut) 1 ⁇ g DOTAP + 7.5 pmol mutated (mut) Rz (see overview 1) in 10 ⁇ l TN; (DOTAP + Rz wt) 1 ⁇ g DOTAP + 7.5 pmol Rz wt in 10 ⁇ l TN .
  • the cells were subjected to an MTT (3- [4,5 dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide) test.
  • MTT 3- [4,5 dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • the cells were aspirated for 3 h with 200 ⁇ l RPMI, 10% FCS, 1 mg / ml MTT in the incubator
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Rz wt ribozyme 2'-O-alkyl modified as in
  • Rz mut mutant of Rz wt in which the nucleotides
  • MOLECULE TYPE RNS (genomic)

Abstract

Nukleinsäure-transferpeptid enthaltend: a) einen ersten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid, Steroid, Kohlenhydrat, Lipid oder Vitamin, welcher an einen Bindepartner an der Zelloberfläche von eukaryontischen Zellen bindet und dabei eine Endozytose des Komplexes aus dem genannten Nukleinsäure-transferpeptid und einer Nukleinsäure auslöst, b) einen zweiten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid, Steroid, Kohlenhydrat, Lipid oder Vitamin, welcher an einen Bindepartner auf der äußeren Kernmembran von eukaryontischen Zellen bindet, c) einen dritten Liganden, welcher ein basisches Peptid ist und durch ionische Wechselwirkung an Nukleinsäuren bindet, sind zur Einschleusung von Nukleinsäuren in eukaryontische Zellen geeignet.

Description

Nukleinsäure-transferpeptide und deren Verwendung zur Einεchleusung von Nukleinsäuren in eukaryontische Zellen
Die Erfindung betrifft Nukleinsäure-transferpeptide und ein Verfahren zur Einschleusung von Nukleinsäuren in eukaryontische Zellen sowie Komplexe, in denen Nukleinsäuren durch ionische Wechselwirkung an die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-transferpeptide gebunden sind und deren Verwendung zur Herstellung von Therapeutica.
Zur Einführung von Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen und insbesondere in Säugerzellen ist eine Vielzahl von Verfahren, beispielsweise die Calciumphosphat-Transfektion, Polybren-Transfektion, Protoplasten-Fusion, Elektroporation, Lipofektion und Mikroinjektion bekannt. Die Anwendung dieser Verfahren ist jedoch auf die in vitro- Transfektion beschränkt. Zudem haben diese Methoden oftmals eine geringe Effizienz und es fehlt die Zellspezifität.
Die Effizienz der Einschleusung von Nukleinsäuren in Zellen kann verbessert werden durch Bindung der Nukleinsaure an Polykationen, wie Polylysin (Lemaitre Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 648) oder an amphiphilen Molekülen, wie Polyethylenglykol (WO 88/0981). Auch mit derartigen Komplexen kann jedoch ebenfalls keine Zellspezifität erreicht werden. In der WO 91/17173 sind Konjugate beschrieben, die kovalent gekoppelt eine Bindedomäne und eine Effektordomäne enthalten. Beide Domänen können über einen Linker verbunden sein. Dabei ist die Bindedomäne beispielsweise ein Zeiloberflächenrezeptor und die Effektordomäne eine antisense composition. Dabei kann der Linker spezifisch für eine subzellulare Region, wie beispielsweise für den Kern, sein. Ein derartiges Konjugat ist jedoch für eine gentherapeutische Anwendung nicht geeignet, da durch die kovalente Kopplung der antisense composition keine brauchbare Beeinflussung der Expression von zelleigenen Genen erreicht werden kann.
Um Zellspezifität zu erreichen, können Nukleinsäuren nicht-kovalent an Konjugate aus Proteinen und Polykationen gekoppelt werden (Wu und Wu, J. Biol. Chem. (1987), 4429 - 4432, J. Biol. Chem. 263 (1988), 14621 - 14624). Danach erfolgt die Einschleusung von fremder DNA in Zellen mit Hilfe eines löslichen DNA-Trägersystems, das aus einem chemisch synthetisierten Konjugat mit Mannose und Lactose als Liganden (P. Midoux et al, Nucleic Acid Res. 21 (1993) 871 - 878) besteht. In der EP-A 0 388 758 werden chemisch synthetisierte Transferrin Polykation-Konjugate offenbart, die mit polyanionischen Nukleinsäuren Komplexe bilden. Durch Bindung an den Transferrinrezeptor können diese Komplexe in Zielzellen eingeschleust werden.
Die Verwendung von Konjugaten aus Polylysin und Asialoglycoprotein (Wu et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 14621 - 14624) oder mit einem Galactoseliganden (Plank et al., Bioconjugate Chem., 3, (1992), 533 - 539) ist ebenfalls bekannt. Als Liganden wurden auch inaktivierte Adenoviren (Cotten et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, (1992), 6094 - 6098, Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89 (1992) 6099 - 6103) oder Hämagglutininfusionspeptide (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, (1992), 7934 - 7938) verwendet. Wesentliche Nachteile dieser
Konjugate sind jedoch, daβ sie schwierig in reproduzierbarer Form herzustellen sind, ausgeprägte Immunreaktionen hervorrufen und keine befriedigende Effizienz, insbesondere zum Transfer von größeren Nukleinsäuren, wie Vektoren, zeigen. In der WO 93/07283 wird ebenfalls zum nichtviralen Gentransfer ein "'2-Liganden-System" aus DNA-bindendem (polykationischen)-Anteil (Nukleinsäure-affine Substanz) und einem Internalisierungsfaktor zur Aufnahme der DNA in die Zelle beschrieben. Als Beispiel wird ein
Polylysin-Transferrin-Komplex genannt. Diese DNA-haltigen Komplexe werden über Endozytose in die Zellen aufgenommen. Die Effektivität des Verfahrens ist jedoch nicht befriedigend. Außerdem besteht die Möglichkeit, daβ die Komplexe bei der Internalisierung in Lysosomen gelangen und abgebaut werden, bevor die DNA den Zellkern erreicht.
Zur Freisetzung der Komplexe aus den Endosomen ins Cytoplasma wird in der WO 93/07283 diesen Komplexen ein sogenanntes endosomolytisches Mittel zugesetzt, welches beispielsweise einem Virus oder einer Viruskomponente entspricht (z. B. Adenovirus oder Influenza-Hämagglutinin).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es somit,
Nukleinsäure-transferpeptide zur Verfügung zu stellen, welche einfach herzustellen sind, Nukleinsäuren mit hoher Effizienz in Zellen transportieren können, die Effizienz der stabilen Gentransformation verbessern, geringe Immunreaktionen hervorrufen und in der Zielzelle gut abbaubar sind.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein Nukleinsäure-transferpeptid, welches enthält: a) einen ersten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid, Steroid, Kohlenhydrat, Lipid oder Vitamin, welcher an einen Bindepartner auf der Zelloberfläche von eukaryontischen Zellen bindet und dabei eine Endozytose des Komplexes aus dem genannten Nukleinsäure-transferpeptid und einer Nukleinsaure auslöst, b) einen zweiten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid, Steroid, Kohlenhydrat, Lipid oder
Vitamin, welcher an einen Bindepartner auf
der äußeren Kernmembran von eukaryontischen Zellen bindet, c) einen dritten Liganden, welcher ein basisches Peptid ist und durch ionische Wechselwirkung an Nukleinsäuren bindet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Komplex, der ein erfindungsgemäßes Peptid und eine durch ionische
Wechselwirkung gebundene Nukleinsaure enthält. Die
Nukleinsaure, die einen Komplex mit dem Protein bildet, kann eine lineare, zirkuläre, einzel- oder doppelstrangige DNA oder RNA, triple-helix DNA, ein DNA-RNA-Hybrid oder PNA sein. Ferner kann die Nukleinsaure auch chemisch modifiziert sein, sofern die negative Ladung der Phosphatgruppen soweit erhalten bleibt, daß die ionische Bindung zum erfindungsgemäßen Fusionspolybindepeptid erhalten bleibt. Derartige Nukleinsäurederivate sind beispielsweise Thioate und Dithioate. Weitere Derivate sind beschrieben in Uhlmann und Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 544 - 584, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist. Nukleinsäuren mit chemisch modifizierten Nukleotidbasen, z. B. RNA-Moleküle, bei denen die 2'-OH-Gruppe in einem oder mehreren Nukleotiden durch eine O-Alkylgruppe,
O-Allylgruppe, Halogengruppe oder andere Modifizierungsgruppen ersetzt ist, sind ebenfalls geeignet.
Vorzugsweise ist die in die eukaryontische Zielzellen einzuschleusende Nukleinsaure eine DNA oder eine ggf.
modifizierte RNA. Die in die Zielzelle eingeschleuste Nukleinsaure kann beispielsweise genetische Informationen enthalten, die in der Zielzelle zur Beseitigung von genetisch bedingten Defekten exprimiert werden können. Ebenso kann die in die Zielzelle einzuschleusende Nukleinsaure auch Antisenseeigenschaften (Komplementärität zu einer in der Zielzelle vorliegenden mRNA) zur Hemmung der Expression von spezifischen Genen in der Zielzelle besitzen. Ebenso kann die einzuschleusende Nukleinsaure ein Ribozym sein, welches in spezifischer Weise RNA der Zielzellen spaltet. Derartige Ribozyme sind beispielsweise in Rossy und Sarver, TIBtech 8 (1990) 179 -183 beschrieben, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist. Die Einführung von Antisense- oder Ribozymnu-kleinsäuren in spezifische Zielzellen kann, insbesondere bei der Therapie viraler Erkrankungen, wie z. B. AIDS, eine wichtige Rolle spielen. Die Einführung der Nukleinsaure kann dabei mit dem Ziel erfolgen, eine dauerhafte oder transiente Expression des eingeführten Gens bzw.
mehrerer Gene oder einer Antisense-Sequenz zu erreichen. Zur weiteren Verbesserung der Einschleusung der Nukleinsaure in eukaryontische Zellen können Hilfsmittel zur Zellfusion zugesetzt werden.
Bevorzugt werden die Nukleinsäure-Transferpeptide zur Einschleusung von Nukleinsäuren verwendet, mit denen eine Regulation der endogenen Genexpression in der eukaryontischen Zielzelle sowohl in vivo als auch in vitro erfolgen kann. Diese Regulation erfolgt durch Insertion von
geeigneten Nukleinsäureelementen in das Genom durch homologe Rekombination. Eine hierfür geeignete Nukleinsaure enthält ein DNA-Regulationssegment, welches in der Lage ist, die Expression des zu regulierenden Gens zu modulieren, wenn es operativ an dieses Gen gekoppelt ist, sowie ein DNA-Targeting-Segment, welches homolog zu einer Region innerhalb oder in der Nähe des zu modulierenden Gens ist. Bei der homologen Rekombination wird dieses Konstrukt in das Genom so insertiert, daß das Regulationssegment operativ mit dem zu modulierenden Gen verbunden ist. Verfahren zur homologen Rekombination sind beispielsweise in der WO 91/09955 und bei Thomas und Capecchi, Cell 51 (1987) , 503 - 513 beschrieben, wobei der Gegenstand dieser Publikationen Gegenstand der Offenbarung ist. Es hat sich
gezeigt, daß bei Verwendung der erfindungsgemäßen
Nukleinsäure-Transferpeptide die homologe Rekombination effektiv erfolgt.
Als Gene sind vorzugsweise Markergene (z.B. Resistenzgene für Neomycin, HPRT, tk), Selektionsgene (z.B. für Methotrexat) oder funktionell aktive, in eukaryontischen Zellen exprimierbare Gene geeignet.
Vorzugsweise ist die einzuschleusende Nukleinsaure ein Vektor, der eine exogene Nukleinsaure trägt (z.B. Plasmide oder Cosmide). üblicherweise sind die drei Liganden des Nukleinsäure-transferpeptides kovalent aneinander gebunden. In einer bevorzugten Ausführungsform des Komplexes sind die Liganden über die zu transferierende Nukleinsaure miteinander verbunden. Dabei ist die Nukleinsaure also ein bi- oder multifunktioneller Bindepartner für die Liganden. Dies bedeutet, daß beispielsweise eine Verbindung, welche aus erstem und drittem Ligand besteht, und eine weitere Verbindung, die aus zweitem und drittem
Ligand besteht, über ionische Wechselwirkungen zwischen drittem Ligand und Nukleinsaure komplex gebunden sind. Weitere Varianten wie Komplexe aus Nukleinsaure mit einer Verbindung aus den Liganden 1/2/3 und einer Verbindung aus den Liganden 3/4 sind ebenfalls geeignet. Dabei sind demnach mindestens zwei Liganden über die Nukleinsaure gebunden.
Besonders bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuretransferpeptide zur Einschleusung von RNA, Ribozymen und kurzkettigen Oligonukleotiden (z. B. Antisense-Sequenzen) bis ca. 30 Nukleotiden Länge geeignet. In diesen Fällen sind auch Nukleinsäuretansferpeptide ohne den zweiten, kernbindenden Liganden zur Komplexierung von DNA und zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet. Derartige Komplexe besitzen eine überraschend hohe Serumstabilität und
Stabilität in Säugerzellen. Mit diesen Komplexen ist vorzugsweise ein Verfahren zur Bestimmung der Proliferationshemmung durch RNA, Ribozyme und kurzkettige Oligonukleotide (z. B. Antisense-Sequenzen) möglich. Bei diesem Verfahren werden die Zellen, vorzugsweise Tumorzellen, mit den Komplexen inhibiert und n ach Weiterkultivierung der Zellen (mehrere Stunden oder Tage) die Anzahl der gebildeten Zellen oder DNA-Menge nach dem Fachmann geläufigen Verfahren bestimmt. Die Bestimmung der DNA-Menge erfolgt beispielsweise über Anfärbung mit Ethidiumbromid oder MTT (Beispiel 6)
Die im erfindungsgemäßen Nukleinsäure-transferpeptid verwendeten und an Bindepartner auf Zelloberflächen bzw. an die äußere Kernmembran bindende Liganden sind Peptide, Steroide, Kohlenhydrate, Lipide oder Vitamine. Die Aufgabe der Liganden besteht darin", den Komplex aus Nukleinsaure und Peptid an Zelloberflächenrezeptoren, Zelloberflächenmoleküle, Zeiladhäsionsmoleküle, Zellmembranen bzw. die äußere Kernmembran zu binden.
Besonders bevorzugt werden als erste Liganden Peptide mit kurzen Sequenzen verwendet, beispielsweise das Peptid RGD, welches eine Bindungsstelle für den Integrinrezeptor an Zelloberflächen darstellt oder die gp120-Bindungsstelle.
Weitere geeignete erste Liganden sind beispielsweise die Bindedomänen von Wachstumsfaktoren, Hormonen, viralen Antigenen, Toxinen, Lipoproteinen und deren kurzkettige Fragmente, welche ebenfalls an Bindepartner an Zelloberflächen binden. Bevorzugt als Wachstumsfaktoren werden CSF (Colony stimulierende Faktoren), NGF (nerve growth
nactor), PDGF (platelet derived growth factor), EGF (epidermal growth factor) verwendet. EGF-analoge Bindedomänen finden sich in einer Vielzahl von Proteinen (R.F.
Doolittle, CSH Symp. 51 (1986), 447), wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.
Ebenfalls bevorzugt als Peptide sind Lectine und deren kurzkettige Fragmente, die an Kohlenhydratstrukturen an Zelloberflächen und Kernmembranen binden (Übersicht vgl. J. C. Paulson, The Receptors, Vol. 2 (1985), P. M. Conn, Ed., Academic Press N. Y.).
Als Steroide sind bevorzugt Progesteron, Androgen,
östrogen.
Als Kohlenhydrate sind bevorzugt Galactose, Mannose-6-phosphat, Mannose, Lewis-X-Kohlenhydrate, Glucose, Fucose. Als Lipide sind bevorzugt Fettsäuren und Arachidonsaure. Als Vitamine sind bevorzugt Vitamin A oder D3.
Als zweiter Ligand sind Peptide, Steroide, Kohlenhydrate, Lipide oder Vitamine geeignet, welche eine Bindung des Nukleinsäure-transferpeptides an die äußere Kernmembran von eukaryontischen Zellen vermitteln.
Geeignete Peptide sind beispielsweise von De Robertis, Nature 272, 1978, 254 - 256 und Dingwall, Cell 30 (1982), 449 - 458 beschrieben, wobei der Inhalt dieser Publikationen Gegenstand der Offenbarung ist. Als Sequenzmotiv bekannt ist beispielsweise PKKKRKV (SEQ ID No. 1),
(Lanford und Butel, Cell 37 (1984), 801 - 813). Die
Effektivität eines Nukleinsäurebindepeptids, welches dieses Motiv als zweiten Liganden enthält, kann noch gesteigert werden durch Ergänzung um 15 Aminosäuren, welche unmittelbar an dieses Motiv im SV40 T-Antigen anschließen (Rihs und Peters, EMBO J. 1989, 1479 - 1484), wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist. Es ist ebenfalls bevorzugt, Modifikationen, wie beispielsweise eine Phosphorylierung, in diesen Motiven anzubringen, wodurch die Effektivität gesteigert werden kann (McVey, Nature 341 (1989) 503 - 507 und Rihs et al., EMBO J. 10 (1991) 633 - 639), wobei der Inhalt dieser Publikationen Gegenstand der Offenbarung ist.
Ein weiteres Peptidmotiv, welches als zweiter Ligand geeignet ist, ist die Sequenz KRPAATKKAGQAKKKKL (SEQ ID NO.2) sowie Modifikationen davon, vgl. Tabelle 2 (Robbins, Cell 64 (1991), 615 - 623). Weiter geeignete Proteine sind das H3/H4-Bindeprotein Nl von Xenopus (Kleinschmidt und Seiter, EMBO J. 7 (1988), 1605 -1614, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.) und Polymerase 1 des Influenzavirus (Nath und Nayak, Mol. Cell Biol. 10 (1990), 4139 - 4145, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.). Weitere als zweiter Ligand geeignete Peptidmotive sind in Tabelle 1 genannt. Ein wesentliches Merkmal von Peptidmotiven, welche als zweiter Ligand geeignet sind, ist, daß diese Peptide eine Vielzahl von basischen Aminosäuren enthalten sollten.
Eine weitere von dem SV40 T-Antigen abgeleitete Sequenz ist VSKRPRP (SEQ ID NO. 3) (Richardson, Cell 44 (1986), 77 - 85). Weitere geeignete Motive finden sich im Influenzavirus non structural protein (Greenspan, J. Virol. 62 (1988), 3020 - 3026, wobei der Inhalt dieser
Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.), Adenovirus DNA-Bindeprotein (Morin, Mol. Cell Biol. 9 (1989), 4372 - 4380, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.), Hefe MATa2, Glucokortikoidrezeptor (Garcia-Bustos, Biochim. Biophys. Acta, 1071 (1991) 83 - 101, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.)
Vorzugsweise ist das Peptidmotiv im Nukleinsäure-transferpeptid mehrfach enthalten.
Der Glucokortikoidrezeptor ist ein Protein mit einem Zinkfinger, welches an DNA binden kann und vorzugsweise in Gegenwart von Glucokortikoid die Bindung an die äußere Kernmembran vermittelt. Bei Verwendung von Motiven aus dem Glucokortikoidrezeptor ist es also bevorzugt, Glucokortikoide, welche auch kovalent an das erfindungsgemäße Peptid gekoppelt sein können, zuzusetzen. Der Glucokortikoidrezeptor enthält zwei geeignete Motive (nuclear localizing sequence (NLS1, NLS2), Picard und Yamamoto, EMBO J. 6 (1987), 3333 - 3340, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist). NLSl besteht aus 28 Aminosäuren.
Aus dem humanen östrogenrezeptor (Picard, Cell Regul. 1 (1990), 291 - 299, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.) ist die Domäne der Aminosäuren 256 - 303 als zweiter Ligand bevorzugt.
Weiter bevorzugt ist, als zweiten Liganden die targeting-Signale von Nucleoplasmin E1A und SV40 large T-Antigen zu verwenden (Yamasaki, Mol. Cell Biol. 9 (1989) 3028 - 3036, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist). Nucleoplasmin enthält ein Motiv, welches aus zwei basischen Aminosäureresten besteht, gefolgt von einem Spacer von zehn anderen Resten und einem Cluster von 5 Aminosäuren von denen 4 basisch sind.
Unter dem dritten Ligand ist eine Polyaminosäure (im weiteren auch mit Motiv bezeichnet) zu verstehen, welche spezifisch oder unspezifisch Nukleinsäuren in kleinen definierten Domänen und unabhängig vom sonstigen Aufbau der Nukleinsaure erkennt. Einige dieser Erkennungsmotive sind in Transkriptionsfaktoren und chromosomalen Proteinen enthalten.
Beispielsweise zu finden sind derartige Motive, welche Serin, Prolin und basische Aminosäuren enthalten, mehrfach am Amino- und Carboxyende des Histons Hl und am Aminoterminus des Histons H2B aus Seeigelsperma. Ein derartiges Motiv ist beispielsweise STPKRKR (SEQ ID NO. 4). Von
Suzuki, EMBO J. 8 (1989), 797 - 804 (wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist) wurde beispielsweise gezeigt, daß ein Fragment des Aminoterminus des A1-Histons von Seeigelsperma 6 SPKK-repeats (S6-Peptid) sowie ein S2-Peptid, welches zwei repeats enthält, an AT-reiche DNA-Sequenzen bindet.
Reeves und Nissen, J. Biol. Chem. 265 (1990), 8573 - 8582, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist, zeigten, daß ein Konsensuspeptid aus HMG-1 non-Histon-chromosomales Protein A mit der Sequenz
TPKRPRGRPKK (SEQ ID NO. 5) an AT-reiche DNA-Sequenzen bindet. Eine verkürzte Version dieses Peptids (KRPRGRPK, SEQ ID NO. 6, nicht jedoch PRGRP, SEQ ID NO. 7) bindet ebenfalls an DNA.
Ebenso bekannt sind α-helicale Elemente von Proteinen, die an DNA binden. Eine derartige Region des E.coli-Proteins RecA ist in Zlotnick und Brenner, J. Mol. Biol. 209 (1989) 6551 - 6561 beschrieben, wobei der Inhalt dieser
Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist. Ein 24-Aminosäurenprotein des Aminoterminus von RecA hat eine α-helicale Struktur und bindet vorzugsweise an einzelsträngige DNA.
Eine Sequenzfolge, die häufig am Carboxyterminus des
Histons H1 auftritt, ist das Alanin/Lysin-Motiv. Eine Variante des Histons H1 aus Seeigelsperma hat ein 57-Aminosäure großes Segment, welches Alanin und Lysin reich und frei von Prolinresten ist. Es ist am Carboxyterminus unmittelbar nach der globularen Domäne lokalisiert und bei Wells and McBride, Nucleic Acids Res. 17 (1989) r311 - r346 und Hill et al., EMBO J. 8 (1989), 2591 - 2599 beschrieben, wobei der Inhalt dieser Publikationen
Gegenstand der Offenbarung ist. CD-Experimente haben gezeigt, daß dieses Segment in Lösung helical strukturiert ist und an doppelstrangige DNA bindet (Hill 1989). Die Verteilung basischer Reste in der α-Helix unterscheidet sich von der Verteilung im RecA-Peptid. Die basischen Reste sind an zwei gegenüberliegenden Seiten der Helix lokalisiert. Dazwischen, insbesondere auf einer Seite, sind cluster von Alanin-Resten zu finden. Da damit auf gegenüberliegenden Seiten basische Reste konzentriert sind, verbrückt dieses Motiv bevorzugt zwei doppelstrangige helicale DNA-Segmente.
Ein weiteres DNA-Bindeprotein, welches ein α-helicales Segment zur DNA-Erkennung verwendet, ist Serumamyloid P (SAP), ein Mitglied der Pentraxin-Familie (Turnell et al., FEBS Lett. 232 (1988), 263 - 268, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.). SAP bindet sowohl an DNA als auch Nukleosomen-Core-Regionen. Proteinsequenzen aus anderen Pentraxinen und Histonen können ebenfalls identifiziert werden als DNA-Bindedomänen. Eine Konsensussequenz, welche sowohl in Pentraxinen als auch Histonen enthalten ist, ist
P-V(RK) (KR) (SGA)L(RK) (KNQ)G
Dieser Konsensus ist bei Turnell (1988) beschrieben. Es wird vermutet, daß die drei oder vier basischen Reste, welche auf einer Seite der Helix liegen, so positioniert sind, daß sie mit zwei Phosphatresten der DNA eines
Strangs binden können und zwei andere Reste an einen anderen Strang binden, so daß eine käfigartige Struktur entsteht. Diese Peptide binden bevorzugt an AT-reiche
Sequenzen (Churchill and Travers, Trends Biochem. Sci. 16 (1991), 92 - 97, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.).
Schließlich finden sich Basissequenzen in einigen regula torischen DNA-Bindeproteinen, wie z. B. GCN4 (Leucin-Zipper und Helix-loop-Helixmotive), die eine α-helicale Struktur besitzen (Talanian et al., FEBS Lett. 232 (1988), 263 - 268, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung
Gegenstand der Offenbarung ist.).
Ebenfalls als Nukleinsaurebindeproteine sind Zink-ligierte Proteine bekannt. Bisher sind mindestens vier verschiedene Gruppen zinkbindender Proteindomänen bekannt. Die erste ist die Gruppe des klassischen "Zinkfingers", ein etwa 30 Aminosäure großer Modul mit einem Zinkion, welches über zwei Cysteine und zwei Histidine ligiert ist (Miller et al., EMBO J. 4 (1985), 1609 - 1614, Brown et al., FEBS Lett. 186 (1985), 271 - 274, wobei der Inhalt dieser
Publikationen Gegenstand der Offenbarung ist.). Beispielsweise ist in TFIIA ein Sequenzmotiv von 30 Aminosäuren neunmal wiederholt. Das Zinkfingermotiv ist durch vier Metalliganden definiert (Konsensus Cys-X2-5, Cys-X12,13-His-X2-5-His) und drei konservierten hydrophoben Resten. Zweidimensionale NMR-Studien (Lee et al., Science 245 (1989), 635 - 637, Neuhaus et al., FEBS Lett. 262 (1990), 179 - 184, wobei der Inhalt dieser Publikationen
Gegenstand der Offenbarung ist.
) zeigten, daß jedes der 30 Reste großen Motive zu einer unabhängigen Domäne mit einem einzigen Zinkion, vierfach komplexgebunden, faltet, welches zwischen ein antiparalleles ß-Sheet und eine kurze α-Helix eingelagert werden kann.
Die zweite zinkenthaltende Domäne ist eine etwa 80 Aminosäure große Domäne, welche in den Rezeptoren für Steroide und hormonähnliche Moleküle gebunden wird. Diese Domäne enthält zwei Zinkionen. Jedes Zinkion ist über vier Cysteine ligiert (Freedman et al., Nature 334 (1988), 543 - 546, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.). Im Gegensatz zu dem C2-H2-Zinkfingermotiv fehlen konservierte hydrophobe Reste, und der Abstand zwischen den zwei Motiven ist etwas größer (15 Reste im Vergleich zu ca. 4 bis 8 bei TFIIA).
Ein Vergleich der Strukturen der DNA-Bindedomänen des Glucokortikoid und Estrogenrezeptors (Härd et al., Science 249 (1990), 157 - 160), Schwabe et al., Nature 348 (1990) 458 - 461wobei der Inhalt dieser Publikationen Gegenstand der Offenbarung ist.) mit dem klassischen C2-H2-Zinkfingern zeigt, daß die sekundäre und tertiäre Struktur sich unterscheiden.
Die dritte Domäne wird in Hefeaktivatoren, wie z. B. GAL4, gefunden. Diese Domänen enthalten zwei engbenachbarte Zinkionen, die über 6 Cysteine komplexiert sind (Pan und Coleman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990), 2077 - 2081, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.). Die DNA-Bindedomäne ist am Aminoterminus lokalisiert. Die Reste 1 - 74 sind ausreichend für die Erkennung und ein etwas größeres Fragment (1 - 147) enthält weitere Stellen, welche die spezifische Affinität erhöhen.
Die sog. GATA-Bindeproteine, welche den hämotopoetischen Regulationsfaktor GATA-1 einschließen, enthalten eine vierte Klasse von zinkhaltigen Domänen, welche DNA erkennen und binden (Orkin, Cell 63 (1990), 665 - 672, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.).
Weiter sind zwei verschiedene Klassen von zinkhaltigen Proteindomänen bekannt, welche RNA erkennen. Der erste Typ wird in den retroviralen gag-Proteinen gefunden, welche an virale genomische RNA bindet (Surovoy et al., J. Mol.
Biol. 229 (1993), 94 - 104, wobei der Inhalt dieser
Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist). Analoges gilt für das tat-Protein von verschiedenen Retroviren, wie z. B. HIV (Frankel et al., Science 249 (1988), 70 - 73, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist).
Schließlich ist eine Vielzahl weiterer nukleinsäurebindender Proteine bekannt, welche nicht in diese Klassen einordenbar sind, deren nukleinsäurebindenden Motive jedoch für die Erfindung geeignet sind. Beispielsweise sind dies der Heat-shock-factor, virale Aktivatoren, Nukleokapsidproteine von Viren. Eine weitere Gruppe sind die sog. Genom-linked-Proteine (VPg), welche in Pikornaviren enthalten sind und kurze Peptide (20 - 25 Aminosäuren), z. B. VPg3 aus dem Maul- und Klauenseuchenvirus,
GPYEGPVKKPVALKVKAKNLIVTE (SEQ ID NO. 8), welches kovalent an RNA bindet, wobei statt M auch N geeignet ist. Diese Peptide sind jedoch auch in der Lage, mit Nukleinsäuren ionisch zu wechselwirken.
Falls erster und zweiter Ligand Peptide sind, ist es vorteilhaft, wenn der erste Ligand 2 - 100, der zweite Ligand 2 - 20, der dritte Ligand 3 - 100 und das Nukleinsäure-transferpeptid 10 - 250 Aminosäuren lang sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Nukleinsäure-transferpeptid ein viertes Peptid oder Lipid enthalten, welches die Auflösung der bei der Endozytose entstandenen Endosomen beschleunigt und vorzugsweise 10 - 40 Aminosäuren lang ist. Geeignete Peptide sind beispielsweise beschrieben in Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992), 7934 - 7938 und Kamata et al., Nucl. Acid. Res. 22 (1994), 536 - 537, wobei der Inhalt dieser Publikationen Gegenstand der Offenbarung ist.
Die Herstellung der Nukleinsäure-transferpeptide erfolgt nach den dem Fachmann geläufigen Methoden. Falls es sich um ein reines Peptid handelt, können die üblichen Methoden zur Peptidsynthese angewendet werden, üblicherweise wird hierzu die das C-terminale Ende bildende Aminosäure an einen Träger gebunden, vom C-Terminus das Peptid schrittweise aufgebaut und dieses anschließend vom Träger abgespalten.
Im einzelnen wird dazu eine Aminosäure, beispielsweise über ihre Carboxygruppe an ein unlösliches, leicht filtrierbares Polymer gebunden und dann vom C-terminalen Ende her die Peptidkette schrittweise aufgebaut. Zu diesem Zweck wird eine N-geschützte Aminosäure mit einer reaktiven Gruppe eines Kunstharzes zur Reaktion gebracht. Von der am Trägerpartikel kovalent verankerten Aminosäure wird die N-α-Schutzgruppe entfernt und das resultierende Aminoacylpolymer mit der nächsten N-geschützten Aminosäure umgesetzt. Von dem am Trägerharz kovalent gebundenen
Dipeptid wird die N-α-Schutzgruppe entfernt und das resulnierende Aminoacylpolymer mit der nächsten N-geschützten Aminosäure umgesetzt. Alle überschüssigen Reagentien und Beiprodukte werden durch einfaches Filtrieren entfernt. Ist die gewünschte Peptidsequenz auf diese Weise hergestellt, wird die kovalente Bindung zwischen der C-terminalen Aminosäure und der Ankergruppe des polymeren Trägers gespalten. Der unlösliche Träger wird durch einfache
Filtration von dem in Lösung befindlichen Peptid entfernt. Das Peptid kann mittels chromätographischer Methoden gereinigt werden. Derartige Verfahren sind beispielsweise bei Merryfield, JACS 85 (1964) 2146, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist, beschrieben. Dabei kann das gewünschte Peptid auch in Fragmenten synthetisiert und die Fragmente durch
Peptidbindungen ligiert werden.
Ebenso können die Peptide rekombinant, durch die dem
Fachmann geläufigen Methoden, hergestellt werden.
Die Bindung von nicht peptidischen Liganden und Zelloberflächen-integrierenden Substanzen (z. B. Kohlenhydrate, Lipide, Vitamine, Steroide) kann nach Synthese des Peptidanteils des erfindungsgemäßen Peptids oder während der Synthese des Peptidanteils erfolgen. Zur Bindung an Peptide werden die Liganden und Substanzen vorher zweckmäßig aktiviert. Geeignete Aktivierungsreagentien sind dem Fachmann bekannt, beispielsweise kann Di-cyclohexylcarbodiimid verwendet werden. Zweckmäßig werden Carbonylgruppen der Liganden und Substanzen in Aktivester modifiziert.
Ein erfindungsgemäßer Komplex kann verwendet werden zur Herstellung eines Therapeutikums zur Behandlung von viralen Infektionen, zur Gentherapie, zur Stimulierung der Immunreaktion gegen maligne Zellen bzw. Tumoren, zur
Expression von Faktoren (Proteine), zur Zellmarkierung und zur Zeil-Integration von Genen, welche für Proteine codieren, die in die Zelloberfläche integriert werden.
Zur Herstellung eines Therapeutikums wird der Komplex aus nukleinbindendem Peptid und DNA nach den dem Fachmann geläufigen Methoden in eine applizierbare Form überführt. Falls der Komplex intramuskulär oder subkutan gegeben werden soll, kann er beispielsweise in physiologischer Kochsalzlösung gelöst sein. Zur intranasalen oder intraokularen Applikation kann das Therapeutikum beispielsweise in Form eines Sprays oder einer wäßrigen Lösung angewendet werden. Für lokale oder orale Gaben ist es häufig erforderlich, das Therapeutikum gegen Inaktivierung zu schützen, beispielsweise gegen proteolytische Enzyme in der Mundhöhle oder im Magen. Ein derartiger vorübergehender Schutz kann beispielsweise durch Verkapselung der erfindungsgemäßen Peptide (Komplexe) erfolgen. Die Verkapselung kann beispielsweise durch überziehen mit einem Schutzmantel (Mikroverkapselung oder Einbettung einer Vielzahl von erfindungsgemäßen Peptiden (Komplexen) in einen schützenden Träger (Makroverkapselung)) erfolgen.
Das Verkapselungsmaterial kann semipermeabel sein oder beim Einbringen in den menschlichen oder tierischen Körper semipermeabel werden, üblicherweise wird für die Verkapselung eine biologisch abbaubare Substanz als Träger verwendet.
Die Applikation der erfindungsgemäßen Peptide (Komplexe) kann durch die dem Fachmann geläufigen Methoden erfolgen, beispielsweise intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, subkutan, intranasal, in die Liquorräume oder direkt in Tumorgewebe.
Die nachfolgenden Publikationen, Beispiele, Tabellen, das Sequenzprotokoll und die Abbildung erläutern die Erfindung weiter.
Tabelle 3 zeigt verschiedene Peptide, die in Teilsequenzen hergestellt und anschließend ligiert wurden, und deren Bindungskonstanten für verschiedene Nukleinsäuren. Tab . 3
Die einzelnen Peptide entsprechen folgenden SEQ ID NO:
F136-NCp7 - SEQ ID NO: 17
F136-1-35 - SEQ ID NO: 18
AcRGD-1-35 - SEQ ID NO: 19
F136-1-Sp-35 - SEQ ID NO: 20
AcRGD-1-Sp5 - SEQ ID NO: 21
AcRGD-branched-1-Sp-35- - SEQ ID NO: 22
CD4-1-Sp-35 - SEQ ID NO: 23
AcRGD-VPg - SEQ ID NO: 24
Tabelle 4 zeigt bevorzugte Peptide, die als Liganden geeignet sind (nach Robbins, Cell 64 (1991), 615 - 623).
Tabelle 5 zeigt weitere Beispiele für Peptidliganden (1 + 3).
Tab. 5
Fusion-1-Sp-35 - SEQ ID NO: 25
AcRGD-Fusion-1-Sp-35 - SEQ ID NO: 26
AcRGD-NLS-1-Sp-35 - SEQ ID NO: 27
branched-AcRGD-NLS-1-Sp-35 - SEQ ID NO: 28
Galactoxyl-branched-1-Sp-35- - SEQ ID NO: 29
Fig. 1 zeigt ein an östrogen gekoppeltes Peptid (SEQ ID NO: 30), das als Ligand (1 + 3) geeignet ist. Aldovini, A. & Young, R. A. (1990). Mutations of RNA and protein sequences involved in HIV-1 packaging in production of noninfectious virus. J. Virol. 64, 1920 - 1926.
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Cell. Biol. 9, 3028 - 3036. Beispiel 1
Peptidsynthese
Die Peptide wurden mittels FMOC (Fluorenyloxycarbonyl)-Festphasensynthese hergestellt. Die Synthese erfolgt an einem Peptidsynthesizer ABI 430A (Applied Biosystems). Das Peptid wurde an 0,4 g SASRIN-Harz, beginnend mit FMOC-derivatisiertem Glycin durchgeführt. Die FMOC-Gruppen wurden jeweils mit 25 % Piperidin in DMF abgespalten. Die Bindung der weiteren FMOC-geschützten Aminosäuren (5
Äquivalente) wurden schrittweise durchgeführt.
Die Freisetzung des Peptids vom Harz erfolgte mit 1 % Trifluoressigsäure in Dichlormethan in 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die Filtrate werden gesammelt, mit Dichlormethan gewaschen und durch Zugabe von Diethylether präzipitiert. Eine Nachfällung aus Ethylacetat/Diethylether ergibt das FMOC-geschützte Peptid.
1.1 Fmoc-136-156-Gly-1-55 Peptid a) Synthese des NCP7-1-55-Peptid
Das N-terminale Fragment von Fmoc-1-19 wurde an einem Fmoc-Gly-Sasrin-Harz (0.4 g, 0.7mmol/g; Bachern) synthetisiert. Nach Behandlung des Harzes mit 25% Piperidin in Dimethylformamid (DMF) zur Abspaltung der Fmoc Gruppe, wurde jede Fmoc-Aminosäure (5 Äquivalent) nacheinander mit Hilfe von O-(1H-Benzotriazol-1-yl)- 1,1,3,3-tetramethyl-uronium tetrafluorborate (TBTU) / 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt)/ Diisopropylethylamin (DIPEA) (5:5:7.5 Äquiv.) eingeengt. Das mittlere Fragment Fmoc-20-35 wurde nach dem gleichen Syntheseplan synthetisiert. Zur Einführung von Fmoc-Ala30 wurde eine Doppelkupplung benutzt. Das geschützte Fragment wurde mit 1% Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (CH2C12) (6 × 15 min) abgespalten. Die Filtrate wurden gesammelt, mit Pyridin neutralisiert und aus Diethylether gefällt. Die folgenden erneuten Fällungen aus dem Ethylacetat/ Diethylethergemisch ergaben die gewünschten geschützten Fragmente mit einer Ausbeute von 63% bzw. 65%. Ein vollgeschütztes C-terminales Fragment Fmoc-36-55 wurde am Fmoc-Asn(Trt)-Wang-Harz (0.64 g, 0.39 mmol/g) aufgebaut. Es wurden 6 Äquivalente jeder Aminosäure und die
TBTU/HOBt-Aktivierungsmethode benutzt. Doppelkupplungen wurden für Fmoc-Gln(Trt)-OH in Position 45 und Fmoc-Arg(Pmc)-OH in Position 52 angewandt. Das mittlere Fragment Fmoc-20-35 (0.1 mmol, 360 mg) wurde zusammen mit äquivalenten Mengen von TBTU und HOBt und 0.15 mmol DIPEA wurden in 1 ml DMF gelöst. Nach 20 min wurde das Reaktionsgemisch zu dem 36-55-Peptid-Harz (0.036 mmol, 250 mg) gegeben. Nach 4 Stunden wurde das Harz vorsichtig gewaschen. Das N-terminale Fragment Fmoc-1-19 (0.08 mmol, 390 mg in 1 ml DMF) wurde unter gleichen Bedingungen voraktiviert und über Nacht mit dem 20-55-Peptid-Harz gekuppelt. Schließlich wurden 0.52 g des Fmoc-1-55-Peptid-Harzes erhalten. Ein Teil dieses Peptid-Harzes wurde für eine Peptidabspaltung verwendet. Das 1-55-Peptid wurde mit einer Mischung von m-Cresol:Dimethylsulfid:Ethandithiol:TFA
(Trifluoressigsäure) (3:3:3:91 v/v) für 2 Stunden bei 20°C abgespalten. Das erhaltene Peptid wurde aus der Mischung gefällt, mit Diethylether (x 5) gewaschen, in Wasser gelöst und lyophilisiert. Weitere halbpräparative HPLC Reinigung (HPLC an Nucleosil C18-Säule 8 x 250 mm, Gradientenelution) des Rohpeptids resultierte in HPLC reinem NCp7-1-55 Peptid mit der Ausbeute von 40% der Theorie (ausgehend von Asn55 Harzbeladung). Analyse:ES-MS - 6443.5 (calc. 6444.54); RP HPLC Rt- 13.32 min (Nucleosil C18 4.6*150 mm; Gradient 10-70% B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in AcN; A = 0.1% TFA in H2O). b) Das geschützte Peptidfragment Fmoc-136-156-Gly-OH
wurde auf die gleiche Weise wie das oben beschriebene Fragment erhalten (1.a). 0.011 mmol (50 mg in 300 ml DMF) von Fmoc-136-156-Gly-OH wurde innerhalb von 15 Stunden in einem DMF-Medium, dem TBTU/HOBt zugemischt wurde, an das 1-55-Peptid-Harz (0.0034 mmol, 50 mg) gekuppelt. Schließlich wurden 63 mg des Fmoc-136-156- Gly-1-55-Peptid-Harz erhalten. Das erhaltene Peptid wurde unter den gleichen Bedingungen abgespalten und gereinigt, sodaß HPLC-reines Peptid (11.5 mg;
Ausbeute: 38%) erhalten wurde.
Analyse: ES-MS - 9044.8+1.5 (calc: 9046.53); RP HPLC Rt-21.22 min (Nucleosil C18 4.6*150 mm; Gradient 10-70 % B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H2O).
1.2. Fmoc-136-156-Gly-1-35 Peptid
Fmoc Gly-Sasrin-Harz (100mg, 0.65mmol/g) wurde nacheinander mit 7 Äquivalent (0.45 mmol) von jeder Fmoc-Aminosäure mit Hilfe der TBTU/HOBt/DIPEA Aktivierungsmethode
acyliert. Ein Teil des 1-35- Peptid- Harz wurde wie in 1.a. abgespalten. 1-35-Peptid wurde HPLC gereinigt
(Ausbeute: 55%).
Analyse: ES-MS - 4109.19+0.2 (calc: 4109.86); RP HPLC Rt- 12.89 min (Nucleosil C18 4.6+150 mm; Gradient 10-70 % B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H2O). b) 1-35-Peptid-Harz (50 mg, 0.005 mmol) wurde mit 3 Äquivalent (0.015 mmol, 67 mg) von Fmoc-136-156-Gly-OH geschütztem Peptidfragment nach der Methode wie in 1.b. beschrieben, acyliert. Nach HPLC-Reinigung wurde des HPLC reines Peptid erhalten (Ausbeute: 13 mg, 52%).
Analyse: ES-MS - 6709+1.5 (calc: 6710.83); RP HPLC Rt-21.2 min (Nucleosil C18 4.6*150 mm; Gradient 10-70 % B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H2O).
1.3 Ac-GRGDSPGSG-1-35 Peptid (SEQ ID NO: 9) a) 10 g von 2-Chlortritylchlorid-Harz (1.4 mmol/g;
Novabiochem) wurde mit 1.5 äquiv. Fmoc-Gly-OH unter Standardbedingungen acyliert. Der Substitutionsgrad war 0.65 mmol/g. 200 mg (0.13 mmol) des erhaltenen Harzes wurde nacheinander wie in 2.a. beschrieben acyliert. Die Fmoc-Gruppe wurde entfernt und das Peptid-Harz mit Acetanhydrid acyliert. Das geschützte Peptidfragment Ac-GRGDSPGSG wurde vom Harz abgespalten, indem es 1 Stunde mit einem Gemisch aus Essigsäure/Trifluorethanol/CH2Cl2 (1:2:7 v/v) behandelt wurde. Die Filtrate wurden gesammelt und das Lösungsmittel wurde zur Trockene im Vakuum eingedampft. Das Peptid wurde aus tert.-Butylalkohol/Wasser (4:1, v/v) lyophilisiert. b) 1-35-Peptid-Harz (32 mg, 0.0032 mmol) wurde innerhalb von 15 h mit 0.0064 mmol (8.1 mg in 100 ml DMF) des Ac-GRGDSPGSG-OH geschützten Fragments, das mit TBTU/HOBt voraktiviert wurde, gekuppelt. Das Peptid- Harz wurde wie in l.b. beschrieben aufgearbeitet.
Schließlich wurden 8.6 mg HPLC reines Peptid erhalten (Ausbeute: 55%).
Analyse: ES-MS - 4920.91+1.75 (calc: 4922.65); RP HPLC Rt-13 min (Nucleosil C18 4.6*150 mm; Gradient 10- 70 % B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H2O).
1.4 Fmoc-136-156-Gly-1-Sp-35 Peptid a) Fmoc-Gly-Wang-Harz (210 mg, 0.52 mmol/g; Novabiochem) wurde nacheinander mit 10 Äquival. (1 mmol) von jeder Fmoc-Aminosäure , die nach der TBTU/HOBt/DIPEA Methode aktiviert wurde, acyliert. Eine Substanzprobe von 1- SP-35-Peptid-Harz (40 mg) wurde abgespalten wie in 1.a. beschrieben. Nach der HPLC-Reinigung wurden 10.5 mg l-SP-35-Peptid erhalten (Ausbeute: 73%).
Analyse: ES-MS - 2701.14+1 (calc: 2702); RP HPLC Rt- 13.7 min (Nucleosil C18 4.6*150 mm; Gradient 10-70 % B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H2O). b) 1-Sp-35-Peptid-Harz (30 mg, 0.004 mmol) wurde mit 3 Äquivalenten des geschützten Fragments Fmoc-136-156- Gly-OH acyliert wie unter 1.b. beschrieben.Das erhaltene Peptid wurde abgespalten und aufgearbeited wie unter 1.a.beschrieben. Ausbeute: 12.7 mg, 60% der Theorie; HPLC reines Produkt.
Analyse: ES-MS-5302.4 + 1.5 ( berechnet 5303.21 );RP HPLC Rt-21.29 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm ;
Gradient 10-70% B in A in 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in
Wasser ). 1.5 Ac-GRGDSPGSG-1-Sp-35 Peptid
1-Sp-35-Peptid-Harz (50 mg, 0.0067 mmol), wie beschrieben unter 4.a., wurde mit 2 Äquivalenten (17 mg, 0.0135 mmol) Ac-GRGDSPGSG wie unter 3.b. beschrieben, umgesetzt. Das resultierende Peptid wurde abgespalten vom Harz, von den Schutzgruppen befreit und aufgearbeitet wie oben beschrieben. Ausbeute: 14 mg, 61% der Theorie, HPLC-rein.
Analyse: ES-MS-3514.5+0.7 ( berechnet 3515.24 );Rp HPLC Rt-14.9 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm ; Gradient 10-40% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser ).
1.6 Ac-GRGDSPGSG-PKKKRKVPGSG-1-Sp-35 Peptid a) Ausgehend von Fmoc-Gly-Sasrin-Harz (200 mg) wurde das in den Seitenkettenfunktionen geschützte Fragment Fmoc-PKKKRKVPGSG-OH (SEQ ID NO.10) schrittweise aufgebaut wie unter 2.a. beschrieben. Die Abspaltung vom Harz erfolgte wie unter 1.b. beschrieben. b) 1-Sp-35-Harz (50 mg, 0.0067 mmol) wurde mit 3 Äquivalenten geschützem Fragment Fmoc-PKKKRKVPGSG-OH (42 mg, 0.02 mmol) voraktiviert mit TBTU/HOBt in Dimethyl- formamid 150 ml innerhalb von 5 h acyliert. Die Fmoc- Gruppe wurde abgespalten und das Peptid-Harz wurde mit 2 Äquivalenten Ac-GRGDSPGSG-OH (17 mg, 0.0134 mmol) 15 h wie unter 3.b. beschrieben umgesetzt. Nach Abspaltung und Reinigung resultierte HPLC-reines Peptid.
Ausbeute: 25 mg, 80% der Theorie.
Analyse: ES-MS-4677+2 ( berechnet 4678.43); RP HPLC Rt-15.16 min (Nucleosil C18; 4.6*150 m ; Gradient 10- 40% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in
Wasser ). 1.7 Fmoc-GNQGSFLTKGPSKLDRAPGSG-1-Sp-35 Peptid (SEQ ID NO 11) a) Die geschützte Peptidsaure Fmoc-GNQGSFLTKGPSKLDRAPGSG- OH wurde ausgehend von Fmoc-Gly-Sasrin-Harz
hergestellt wie unter 1.a. beschrieben. b) Die Peptidsaure (31 mg, 0.08 mmol) wurde in Dimethyl- formamid (500 ml) aktiviert mit TBTU und innerhalb von 15 h an 1-Sp-35-Peptid-Harz (30 mg, 0.04 mmol) gekuppelt.
Das Peptid wurde wie oben beschrieben vom Harz abgespalten und mit HPLC gereinigt. Ausbeute: 4.5 mg, 22.5% der Theorie..
Analyse: ES-MS-4979+2.2 ( berechnet 4980.75); RP HPLC Rt-18.5 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm ; Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser ).
1.8 [H-Lys(Ac-GRGDSPGSG)]4-a,e-Lys2-a,e-Lys-Gly2-1-Sp-35 Peptid a) 1-Sp-35-Peptid-Harz (353 mg, 0.047 mmol) wurde
nacheinander acyliert mit jeweils 0.5 mmol Fmoc-Gly-OH (zwei Kupplungen), Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (zwei Kupplungen) und Boc-Lys(Fmoc)-OH mit Hilfe der TBTU/HOBT-Methode. Die Fmoc-Gruppe wurde zuerst abgespalten und dann das Peptid von einem Teil des Peptid-Harzes (35 mg,
0.00385 mmol). Nach Reinigung resultierte ein HPLC- reines Peptid. Ausbeute: 15 mg, 75% der Theorie..
Analyse: ES-MS-3711+1.4 ( berechnet 3711);RP HPLC Rt- 10.5 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm ; Gradient 10-70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser). b) [Na-Boc-Lys]4-Lys2-Lys-Gly2-1-Sp-35 Peptid-Harz wurde mit Ac-GRGDSPGSG-OH (60.4 mg, 0.048 mmol) in Dimethyl- formamid (200 ml) mit Hilfe der TBTU/HOBT-Methode innerhalb von 15 h acyliert. Nach Abspaltung des
Peptids vom Harz und Entfernung der Schutzgruppen wurde nach Reinigung ein HPLC-reines Produkt erhalten. Ausbeute: 12.5 mg, 75% der Theorie..
Analyse: ES-MS-6962.5+2.1 (berechnet 6963);RP HPLC Rt- 11 min ( Nucleosil C 18; 4.6*150 mm ; Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser ).
1.9 Ac-GRGDSPGSG-GLFEAIAGFIENGWEGMIDG-1-Sp-35 Peptid
(GLF .. . .. .. . .= SEQ ID NO 12) a) Es wurden zuerst die geschützten Peptidsäuren Fmoc-GLFEAIAG-OH (SEQ ID NO.13) und Fmoc-FIENGWEGMIDG-OH (SEQ ID NO.14) hergestellt. Diese entsprechen Teilen der
Sequenz des "Fusions-peptids" des Influenza Virus
Hämagglutinins. Die Peptidsäuren wurden analog zu den Methoden hergestellt, die für das Peptid GRGDSPGSG verwendet wurden. b) Fmoc-FIENGWEGMIDG-OH ( 25.5 mg, 0.012 mmol ) wurde mit TBTU/HOBT in DMF ( 500 ml ) aktiviert und innerhalb von 15 h an das 1-Sp-35-Peptid-Harz ( 30 mg, 0.004 mmol ) gekuppelt. Nach Abspaltung der Fmoc- Gruppe von dem harzgebundenen Peptid wurde Fmoc-GLFEAIAG-OH (12.6 mg, 0.012 mmol) mit TBTU/HOBT in DMF/NMP (1:1) (1ml) aktiviert und angekuppelt. Ein Teil des so erhaltenen Peptid-Harzes wurde zu einer Peptid- und Schutz- gruppenabspaltung eingesetzt.
Analyse: ES-MS-5175.2+0.8 (berechnet 5176.6 ); RP HPLC Rt-29.5 min ( Nucleosil C18; 4.6*150 mm ; Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser ). c) Nach Abspaltung der Fmoc-Gruppe von der Hauptmenge des Peptidharzes (nach 9.b.) wurde mit Ac-GRGDSPGSG-OH (10.2 mg, 0.008 mmol) acyliert wie beschrieben. Nach
Abspaltung und Reinigung konnte ein HPLC-reines Peptid erhalten werden.
Ausbeute: 4.2 mg.
Analyse: ES-MS- 5766.11+0.8 (berechnet 5767.39); RP HPLC Rt-24 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm ; Gradient 10-70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
1.10 Ac-GRGDSPGSG-Lys (Oestrogen)-1-Sp-35 Peptid a) Fmoc-Lys(Dde)-OH (Novabiochem) (29.8 mg, 0.056 mmol) wurde zusammen mit äquivalenten Mengen an TBTU (18 mg), HOBT (8.4 mg) und Diisopropylethylamin (19.2 mg, 0.11 mmol) in DMF (150 ml) gelöst. Nach 20 min wurde die Reaktionsmischung zu 1-Sp-35-Peptid-Harz (83 mg, 0.0112 mmol) gegeben. Nach 2 h wurde die Fmoc-Gruppe abgespalten und an das resultierende Peptid-Harz wurde das seitenkettengeschützte Ac-GRGDSPGSG (42mg, 0.0336 mmol) in DMF (200 ml) gekuppelt mit Hilfe von
TBTU/HOBT. Die Dde-Gruppe wurde mit 2% Hydrazin in DMF innerhalb von 1 h entfernt. b) ß-östradiol-6-on-6-(O-carboxymethyloxim) (4.6 mg,
0.0121 mmol; Fluka) wurde mit äquivalenten Mengen an HOBT (1.8 mg), Diisopropylcarbodiimid (2 ml) in DMF (100 ml) an Ac-GRGDSPGSG-Lys-1-Sp-35-Peptid-Harz gekuppelt. Nach Abspaltung vom Harz und Entfernung der Schutzgruppen wurde nach Reinigung ein HPLC reines Steroid-Peptid erhalten. Ausbeute 6 mg.
Analyse: ES-MS- 3984.2+0.7 (berechnet 3984); RP HPLC Rt-15.5 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm ; Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
1.11 Ac-GRGDSPGSG-Lys(Ac-PKKKRKVPGSG)-1-Sp-35 Peptid
Die freie Aminogruppe von Ac-GRGDSPGSG-Lys-1-Sp-35-Peptid-Harz (50 mg, hergestellt nach 10.a.) wurde acyliert mit 3 Äquivalent en Fmoc-PKKKRKVPGSG-OH (42 mg) in DMF (150 ml) nach der Vorschrift in 6.6 und abgespalten.
Analyse: ES-MS- 4846.09+0.8 (berechnet 4849.2); RP HPLC Rt-ll.6 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm ; Gradient 10-70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
1.12 [Lys(Asn-Lactose)]4-Lys2-Lys-Gly2-1-Sp-35 Peptid
a) D(+)Lactose Monohydrat (Fluka) (1.8 g, 5 mmol) wurden mit gesättigter Ammoniumcarbonatiosung (40 ml) auf 30°C 6 Tage erwärmt. Dann wurde mit Wasser (20 ml) verdünnt und die Lösung auf die Hälfte des Volumens eingeengt. Dieser Vorgang wurde jedesmal wiederholt um das überschüssige Ammoniumcarbonat zu entfernen.
Schließlich wurde lyophilisiert und der resultierende Aminozucker wurde ohne weitere Reinigung zur Synthese von Fmoc-Asn(Lactose)-OtBu eingesetzt. Dazu wurde Fmoc-Asp-OtBu (Bachern) (480 mg, 1.17 mmol) und HOBT (228 mg, 1.52 mmol) in DMF (5 ml) gelöst, dann wurde bei 4°C Diisopropylcarbodiimid (205 mg, 1.63 mmol) zugegeben. Nach 15 min Rühren bei 4°C und 20 min bei 25°C wurde 1-Aminolactose (5.85 mmol) in DMF/Wasser (2:1, v/v, 6 ml) zu der Lösung des Aktivesters gegeben. Nach 6 h Rühren wurde im Vakuum das Solvens entfernt und Ether zugegeben. Das Produkt wurde abfiltriert, mit kaltem Ether und kaltem Wasser gewaschen. Die tBu-Gruppe wurde mit TFA/Wasser (7:3, v/v) innerhalb von 20 min bei Raumtemperatur abgespalten. Nach Verdampfen der Lösungsmittel in Vakuum wurde in tert- Butylalkohol/Wasser (4:1, v/v) gelöst und lyophilisiert. Die Reinigung von Fmoc-Asn(lactose)-OH erfolgte über RP MPLC (LiChroprep C18, 25*310 mm, Merck;
isokratisch in 30% Acetonitril/Wasser/0.1% TFA).
Ausbeute: 280 mg, 35% der Theorie bezogen auf Fmoc- Asp-OtBu.
Analyse: (+)FAB-MS: MH+ 679 (berechnet 679), RP HPLC Rt-6.59 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm ; Gradient 30-100% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser). Fmoc-Asn(Lactose)-OH (32.5 mg, 0.048 mmol) und HOBT
(7.25 mg, 0.05 mmol) wurden in DMF (200 ml) gelöst und Diisopropylcarbodiimide (6.31 mg, 0.05 mmol) zugegeben. Nach 30 min wurde die Aktivesterlösung zu Lys4-Lys2-Lys-Gly2- 1-Sp-35-Peptid-Harz (30 mg, 0.0162 mmol) gegeben. Nach 15 h wurde das Peptid-Harz gewaschen, das N-lactosylierte Peptid abgespalten und mit semipräparativer HPLC gereinigt. Ausbeute 10.6 mg.
Analyse: ES-MS- 5463.71+0.7 (berechnet 5463); RP HPLC Rt-11.6 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm ; Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
Beispiel 2
Nachweis der Bindung an Nukleinsäuren
Die Analyse der Nukleinsäure-Bindung des Proteins (NC-Protein), von Fragmenten des NC-Proteins sowie der
entsprechenden Peptidderivate erfolgte in Filterbindungstests (vgl. J. Mol. Biol. 34 (1968), 361 - 364, Nature 342 (1989), 816 - 819).
Es werden steigende Mengen Protein mit einer konstanten Menge radioaktiv markierter Nukleinsaure in 100 μl Bindungspuffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 100 μM ZnCl2) 15 min bei 25ºC inkubiert und anschließend über Nitrozellulosefilter mit einer Porenweite von 0.45 μm filtriert. Die Nitrozellulosefilter werden anschließend zweimal mit je 1 ml Bindungspuffer gewaschen und die gebundene Radioaktivität durch Szintillationszählung bestimmt.
Als Test-Nukleinsäuren dient HIV-1 RNA (vgl. J. Mol. Biol. 229 (1993), 94 - 104), die während der in vitro Transkription durch Inkorporation von α-[32P]-UTP radioaktiv markiert wird. Außerdem werden 5'-32P endmarkierte
Oligodesoxynukleotide verwendet. Die Bestimmung der Dissoziationskonstanten erfolgt durch Analyse der Bindungsdaten in doppelt reziproken Plots (vgl. J. Mol. Biol. 34 (1968), 361 - 364) durch Auftrag der reziproken relativen Sättigung (Ordinate) und der reziproken Proteinkonzentration (Abszisse).
In einem typischen Experiment wird RNA mit einer Konzentration von 1.4 × 10-11 M, einzelsträngiges Desoxynukleotid mit einer Konzentration von 1.7 × 10-10 M und
doppelsträngiges Desoxynukleotid mit einer Konzentration von 0.85 × 10-10 M eingesetzt. In kompetitiven Filterbindungstests werden die radioaktiv markierte Nukleinsaure und steigende Mengen unmarkierter Kompetitor-Nukleinsäure mit einer konstanten Protein-Konzentration inkubiert, wobei die Proteinzugabe zuletzt erfolgt.
Als zu bindende Nukleinsäuren wurden verwendet: ms2-RNA (30facher Überschuß), ssM13-DNA (70fach), dsM13-Rf-DNA (265fach).
Beispiel 3
Nachweis der Bindung von Komplexen an Zellen und deren Integration in Zellen
Als nukleinsäurebindender Anteil des erfindungsgemäßen Peptids wird eine Teilsequenz des NCp7-Proteins (T.L. South, Biochemistry 30 (1991) 6342 - 6349) verwendet.
Dieses Peptid wird durch 22 Aminosäuren des viralen Proteins vpl (F136), welches mit dem Integrmrezeptor interagiert, verlängert (Hynes, R.O. Cell 69 (1992) 11 - 25). Zur Überprüfung der Integration von DNA mit Hilfe des erfindungsgemäßen Peptids wird ein Komplex hergestellt zwischen dem erfindungsgemäßen Peptid und einem 18mer-DNA Oligonukleotid, welches gegen den Start des zweiten Codons des humanen c-myb-RNA gerichtet ist. Die Sequenz dieses Antisenseoligonukleotides (a-myb) ist:
5 'GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3 ' (SEQ ID NO.15)
Es ist bekannt, daß dieses Oligonukleotid die Proliferation der humanen promyelocytischen Zellinie HL60 reduziert (G. Anfossi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 3379 - 3383.
Durchführung des Tests:
Pro Test werden 1 × 104 HL-60-Zellen (ATCC CCL 240) in einem Volumen von 0.5 ml RPMI-Medium (mit 10 % FKS) mit Peptidderivaten, komplexiert mit Oligodesoxynukleotid, versetzt. Dieser Ansatz wird für 5 Tage bei 37*C/5 % C02 inkubiert. Zur Auswertung wird die Zellzahl nach drei und fünf Tagen bestimmt. Hierzu werden 100 μl Zellen entnommen und das entsprechende Volumen mit RPMI-Medium (10 % FKS) aufgefüllt. Die Komplexierung von Peptid und Nukleinsaure erfolgt in einem Volumen von 10 μl Bindungspuffer. Nach 15 min bei Raumtemperatur wird die Mischung zu den Zellen gegeben. Am zweiten und am dritten Tag wird diese Behandlung mit einem Viertel der Ausgangsdosis wiederholt.
Beispiel 4
Test zur Bestimmung des Transports von Plasmid-DNA in eukaryotischen Zellen in Anwesenheit von Derivaten des NC-Proteins Zur Analyse des Transports von Plasmid DNA in eukaryotische Zellen werden Peptide und DNA komplexiert wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Plasmide enthalten IndikatorGene (Luziferase, ß-Galaktosidase, Chloramphenikol-Trans- ferase) unter Kontrolle viraler Promotoren (z. B. SV40 early promotor oder IE Promotor/Enhancer von MCMV. Es können auch gewebespezifische zelluläre Promotoren eingesetzt werden). 48 h nach Zugabe der komplexierten DNA zu den eukaryotischen Zellen wid die enzymatische Aktivität der exprimierten Indikator-Genprodukte analysiert. Die Analyse kann luminometrisch, photometrisch oder durch Acetylierung von Chloramphenicol mit 14C-Acetyl-CoA erfolgen.
Beispiel 5
Test zur Bestimmung des Transports von RNA in eukaryotische Zellen in Anwesenheit von Derivaten des NC-Proteins
Der Test erfolgt wie in Beispiel 3 beschrieben. Hier werden in vitro transkribierte RNAs von Indikator-Genen verwendet. Analysiert wird ebenfalls die enzymatische Aktivität der exprimierten Genprodukte.
Beispiel 6
Hemmung der Proliferation von Capan-1 Zellen durch Ki-Ras Ribozym-DOTAP Komplexe
Capan-1 Zellen (ATCC HTB 79, humane Adenocarcinom-Zellinie des Pancreas) wurden in Gewebekulturschalen mit 96
Vertiefungen bei 37ºC und 5 % CO2 kultiviert. Dabei wurden in jede Vertiefung 5 × 103 Capan-1 Zellen in 100 μl RPMI Medium, das 10 % foetales Kälberserum (FKS) enthielt, gegeben. Die Zellen wurden 12 h im Brutschrank kultiviert und daraufhin wie folgt behandelt: (control) 10 μl
TN-Puffer (50 mM Tris HCl pH 8.0, 50 mM NaCl; (DOTAP) 1 μg DOTAP (N-[l-(2,3-Dioleoyloxy) propyl]-N, N, N-trimethyl-ammoniummethylsulfat, Boehringer Mannheim) in 10 μl TN; (DOTAP + Rz mut) 1 μg DOTAP + 7.5 pmol mutiertes (mut) Rz (siehe Übersicht 1) in 10 μl TN; (DOTAP + Rz wt) 1 μg DOTAP + 7.5 pmol Rz wt in 10 μl TN.
Die Komplexierungsreaktion erfolgte für 20 min bei
Raumtemperatur. Nach 2 Tagen im Brutschrank wurden die Zellen einem MTT (3-[4,5 Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) Test unterzogen. Hierzu wurden die Zellen nach Absaugen des Mediums für 3 h mit 200 μl RPMI, 10 % FKS, 1 mg/ml MTT im Brutschrank
inkubiert. Nach Absaugen des Mediums wurden die Zellen dann in 400 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) lysiert und der MTT Umsatz photometrisch bei 507 nm als optische Dichte (OD) bestimmt. Alle Bestimmungen erfolgten als Triplikate.
Beispiel 7
Hemmung der Proliferation von Capan-1 Zellen durch Ki-Ras Ribozym-Transferpeptidkomplexe
Es wurde exakt wie in Beispiel 6 verfahren. Hier wurden die Zellen wie folgt behandelt:
(control) 10 μl TN; (Rz mut) 7.5 pmol Rz mut in 10 μl TN; (Rz wt) 7.5 pmol Rz wt in 10 μl TN; (Int) 150 pmol AcRGD-1-35 in 10 μl TN; (Int + Rz mut) 7.5 pmol Rz mut + 150 pmol AcRGD-1-35 in 10 μl TN; (Int + Rz wt) 7.5 pmol Rz wt + 150 pmol AcRGD-1-35 in 10 μl TN.
Figure imgf000044_0001
Rz wt: Ribozym 2'-O-alkylmodifiziert wie in
G. Paoella, EMBO J. 11 (1992) 1913 - 1919 beschrieben (SEQ ID NO: 16)
Rz mut: Mutante von Rz wt, in der die Nukleotide
11 - 13 deletiert sind.
Int: AcRGD1-35 entspricht SEQ ID NO: 19, Tabelle 3
Beispiel 8
Vergleich der Transfereffizienz von DOTAP und Transferpeptid bei HL60 Zellen, Kompetition des Transfers
Die Durchführung der Tests erfolgte unter Standardbedingungen (Beispiel 3). (a-myb + Int) 0.43 μM AcRGD-1-35 + 1 μg/ml myb - antisense; (DOTAP + a-myb) 10 μg/ml DOTAP + 1 μg/ml myb -antisense; (Int-Komp) 0.43 μM AcRGD-1-35 + 0,43 μm F136-1-35 (FMDV Integrin Bindestelle) + 1 μg/ml myb-antisense; (5 μg DOTAP) 10 μg/ml DOTAP; (a-myb) 1 μg/ml DOTAP.
Die Ergebnisse zeigt Tabelle 2:
Zeilzahl nach 5 Tagen
Int + a-myb 15
DOTAP + a-myb 44
Int + Komp 50
Dotap 58
a-myb 72
Int: Ac RGD-1-35 (SEQ ID NO: 19)
a-myb: SEQ ID NO: 15
Komp: F 136 (die ersten N-terminalen 22 AS von
SEQ ID NO: 17), Tabelle 3
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000048_0001
SEQUENZPROTOKOLL
( 1) ALGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
(B) STRASSE: Sandhofer Str. 116
(C) ORT: Mannheim
(E) LAND: Germany
(F) POSTLEITZAHL: D-68305
(G) TELEPHON: 08856/223446
(H) TELEFAX: 08856/223451
(ii) ANMELDETITEL: Nukleinsaeure-transferpeptide und deren
Verwendung zur Einschleusung von Nukleinsaeuren in eukaryontische Zellen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 30
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(vi) FRÜHERE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: DE P 43 12 131.4
(B) ANMELDEDATUM: 14-APR-1993
(vi) FRÜHERE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: DE P 43 18 470.7
(B) ANMELDEDATUM: 03-JUN-1993
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gin Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15
Leu
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
Val Ser Lys Arg Pro Arg Pro
1 5
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
Ser Thr Pro Lys Arg Lys Arg
1 5 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
Thr Pro Lys Arg Pro Arg Gly Arg Pro Lys Lys 1 5 10
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
Lys Arg Pro Arg Gly Arg Pro Lys
1 5
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
Pro Arg Gly Arg Pro
1 5 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys 1 5 10 15
Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu
20
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
Gly Arg Gly Asp Ser Pro Gly Ser Gly
1 5
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Pro Gly Ser Gly
1 5 10 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asp Arg 1 5 10 15
Ala Pro Gly Ser Gly
20
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15
Met Ile Asp Gly
20
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Gly
1 5 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly
1 5 10
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsaure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(Ü) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(iii) ANTISENSE: JA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
GTGCCGGGGT CTTCGGGC 18
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsaure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: RNS (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
CUACGCCCUG AUGAGUCCGU GAGGACGAAA CAGCUC 36 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 77 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
Tyr Asn Arg Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu 1 5 10 15
Ala Gln Lys Val Ala Gly Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg
20 25 30
Lys Met Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg
35 40 45
Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu 50 55 60
Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn
65 70 75
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 57 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
Tyr Asn Arg Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu 1 5 10 15
Ala Gln Lys Val Ala Gly Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg
20 25 30
Lys Met Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg
35 40 45
Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly
50 55 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 44 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
Gly Arg Gly Asp Ser Pro Gly Ser Gly Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg 1 5 10 15
Asn Gln Arg Lys Met Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His
20 25 30
Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly
35 40
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 45 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
Tyr Asn Arg Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu 1 5 10 15
Ala Gln Lys Val Ala Gly Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg
20 25 30
Lys Met Val Lys Gly Gly Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly
35 40 45 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 32 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
Gly Arg Gly Asp Ser Pro Gly Ser Gly Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg 1 5 10 15
Asn Gln Arg Lys Met Val Lys Gly Gly Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly
20 25 30
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 37 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptide
(B) LAGE: 11
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Seitenketten an den AS 11 +
12 (Lysin) gem. Tabelle 3"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptide
(B) LAGE: 12
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Seitenketten an den AS 11 +
12 (Lysin) gem. Tabelle 3"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
Gly Arg Gly Asp Ser Pro Gly Ser Gly Lys Lys Lys Gly Gly Met Gln 1 5 10 15
Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Met Val Lys Gly Gly Arg Ala
20 25 30
Pro Arg Lys Lys Gly
35 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 44 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:
Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asp Arg 1 5 10 15
Ala Pro Gly Ser Gly Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys
20 25 30
Met Val Lys Gly Gly Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly
35 40
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 33 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
Gly Arg Gly Asp Ser Pro Gly Ser Gly Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val 1 5 10 15
Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr
20 25 30
Glu (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 43 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:
Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15
Met Ile Asp Gly Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Met
20 25 30
Val Lys Gly Gly Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly
35 40
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 52 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:
Gly Arg Gly Asp Ser Pro Gly Ser Gly Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala 1 5 10 15
Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Met Gln Arg
20 25 30
Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Met Val Lys Gly Gly Arg Ala Pro
35 40 45
Arg Lys Lys Gly
50 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 27:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 43 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:
Gly Arg Gly Asp Ser Pro Gly Ser Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 10 15
Pro Gly Ser Gly Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Met
20 25 30
Val Lys Gly Gly Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly
35 40
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 35 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptide
(B) LAGE : 12
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Seitenkette an der AS 12
(Lysin) gem. Tabelle 5"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Pro Gly Ser Gly Lys Met Gln Arg Gly 1 5 10 15
Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Met Val Lys Gly Gly Arg Ala Pro Arg
20 25 30
Lys Lys Gly
35 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 29:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 28 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptide
(B) LAGE: 2
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Seitenketten an den AS 2 +
3 (Lysin) und Galactose-Derivatisierung gem.
Tabelle 5"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptide
(B) LAGE: 3
(D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Seitenketten an den AS 2 +
3 (Lysin) und Galactose-Derivatisierung gem.
Tabelle 5"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:
Lys Lys Lys Gly Gly Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys 1 5 10 15
Met Val Lys Gly Gly Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly
20 25
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 27 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:
Lys Gly Ser Gly Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Met 1 5 10 15
Val Lys Gly Gly Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly
20 25

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e 1. Nukleinsäure-transferpeptid enthaltend : a) einen ersten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid, Steroid, Kohlenhydrat, Lipid oder Vitamin, welches an einen Bindepartner an der Zelloberfläche von eukaryontischen Zellen bindet und dabei eine Endozytose des Komplexes aus dem genannten Nukleinsäure-transferpeptid und einer Nukleinsaure auslöst,
b) einen zweiten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid, Steroid, Kohlenhydrat, Lipid oder Vitamin, welches an einen Bindepartner auf der äußeren Kernmembran von eukaryontischen Zellen bindet,
c) einen dritten Liganden, welcher ein basisches Peptid ist und durch ionische Wechselwirkung an
Nukleinsäuren bindet.
Nukleinsäure-transferpeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Ligand als Peptid eine Länge von 2 - 100 Aminosäuren, der zweite Ligand als Peptid eine Länge von 2 - 20 Aminosäuren und der dritte Ligand als Peptid eine Länge von 3 - 100 Aminosäuren besitzt.
3. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daβ es als a) Steroid: Progesteron, Androgen, östrogen b) als Kohlenhydrat: Galactose, Mannose-6-Phosphat, Lewis-X-Kohlenhydrate c) als Lipid: Fettsäuren, Arachidonsaure d) als Vitamin: Vitamin A oder D3 enthält.
4. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen vierten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid oder Lipid enthält, welcher die Auflösung der bei der Endozytose entstandenen Endosomen beschleunigt.
5. Nukleinsäure-transferpeptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daβ der vierte Ligand als Peptid eine Länge von 10 - 40 Aminosäuren hat.
6. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, daβ der erste Ligand ein peptidischer Ligand für den Integrinrezeptor oder eine gp120-Bindungsstelle ist.
7. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, daβ der erste Ligand ein peptidischer Ligand für den Östrogen-Rezeptor ist.
8. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, daβ der erste Ligand ein peptidischer Ligand für den Galactose-Rezeptor ist.
9. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1 - 8, dadurch gekennzeichnet, daβ die Gesamtlänge des
Nukleinsäure-transferpeptids 10 - 250 Aminosäuren beträgt.
10. Komplex enthaltend, über ionische Wechselwirkung
gebunden, eine Nukleinsaure und mindestens ein
Nukleinsäure-transferpeptid gem. den Ansprüchen 1 - 9.
11. Komplex nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daβ die Nukleinsaure eine DNA oder RNA ist.
12. Komplex nach den Ansprüchen 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daβ die Nukleinsaure ein Ribozym oder eine Antisensenukleinsäure ist.
13. Komplex nach den Ansprüchen 10 - 12, dadurch gekennzeichnet, daβ die Nukleinsaure ein eine exogene
Nukleinsaure tragender Vektor ist.
14. Komplex nach den Ansprüchen 10 - 13, dadurch gekennzeichnet, daβ die Nukleinsaure mindestens ein funktionell aktives, in eukaryontischen Zellen exprimierbares Gen enthält.
15. Komplex nach den Ansprüchen 10 - 14, dadurch gekennzeichnet, daβ an die Nukleinsaure ionisch gebunden ein Peptid gemä/3 den Ansprüchen 1 - 9 und zusätzlich, ebenfalls ionisch gebunden, ein basisches Peptid, welches durch ionische Wechselwirkung an Nukleinsaure bindet und kovalent mit einem Peptid oder Lipid verbunden ist, welche die Auflösung der Endosomen, welche bei der durch das genannte Nukleinsäure-transferpeptid verursachten Endozytose entstanden sind, beschleunigt.
16. Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäure-transferpeptiden nach den Ansprüchen 1 - 9, dadurch gekennzeichnet, daβ die das C-terminale Ende bildende
Aminosäure an einen Träger gebunden wird, vom C-terminalen Ende das Nukleinsäure-transferpeptid schrittweise aufgebaut, vom Träger abgespalten und
gegebenenfalls mit Kohlenhydraten, Lipiden, Vitaminen oder Steroiden kovalent gekoppelt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daβ das Nukleinsäure-transferpeptid in Fragmenten synthetisiert und die Fragmente durch Peptidbindungen ligiert werden.
18. Verfahren zur Transfektion von eukarayontischen Zellen mit Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß ein Komplex nach den Ansprüchen 10 - 15 und 22 mit
eukaryontischen Zellen in Kontakt gebracht und
inkubiert wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, da/S Hilfsmittel zur Zellfusion zugegeben werden.
20. Verwendung eines Komplexes nach den Ansprüchen 10 - 15 und 22 zur Herstellung eines Therapeutikums zur
Behandlung von viralen Infektionen, zur Gentherapie, zur Stimulierung der Immunreaktion gegen maligne Zellen bzw. Tumoren, zur Expression von Faktoren, zur
Stimulierung der Immunreaktion gegen maligne Zellen bzw. Tumoren, zur Expression von Faktoren, zur
Zellmarkierung und
zur Zeil-Integration von Genen, welche für Proteine codieren, die in die Zelloberfläche integriert werden.
21. Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäure-transferpeptiden gemäß den Ansprüchen 1 - 9, dadurch gekennzeichnet, daβ der Peptidanteil durch Genexpression rekombinant hergestellt wird und anschließend ggf. mit Kohlehydraten, Lipiden, Vitaminen oder Steroiden kovalent gekoppelt wird.
22. Komplex nach den Ansprüchen 10 - 15, dadurch
gekennzeichnet, daß die Bindung von mindestens zwei Liganden untereinander über die Nukleinsaure als bi- oder multifunktioneller Bindepartner
erfolgt.
23. Komplex nach den Ansprüchen 10 - 15, dadurch
gekennzeichnet, daß das Nukleinsäuretransferpeptid keinen zweiten, kernbindenden Liganden enthält und als Nukleinsaure ein Ribozym oder eine Antisensesequenz bis etwa 30 Nukleotide Länge enthält.
24. Verwendung eines Komlexes nach Anspruch 23 zur
Herstellung eines Therapeutikums zur Behandlung von viralen Infektionen, zur Gentherapie, zur Stimulierung der Immunreaktion gegen maligne Zellen bzw. Tumoren, zur Expression von Faktoren, zur Stimulierung der Immunreaktion gegen maligne Zellen bzw. Tumoren, zur Expression von Faktoren, zur Zellmarkierung und zur Zeil-Integration von Genen, welche für Proteine codieren, die in die Zelloberfläche integriert werden.
PCT/EP1994/001147 1993-04-14 1994-04-13 Nukleinsäure-transferpeptide und deren verwendung zur einschleusung von nukleinsäuren in eukaryontische zellen WO1994023751A1 (de)

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