DE4412629A1

DE4412629A1 - Nukleinsäure-transferpeptide und deren Verwendung zur Einschleusung von Nukleinsäuren in eukaryontische Zellen

Info

Publication number: DE4412629A1
Application number: DE4412629A
Authority: DE
Inventors: Jens Dr Dannull; Guenther Prof Jung; Karin Prof Dr Moelling; Andrej Dr Surovoy
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1993-04-14
Filing date: 1994-04-13
Publication date: 1995-01-26

Description

Die Erfindung betrifft Nukleinsäure-transferpeptide und ein Verfahren zur Einschleusung von Nukleinsäuren in euka ryontische Zellen sowie Komplexe, in denen Nukleinsäuren durch ionische Wechselwirkung an die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-transferpeptide gebunden sind und deren Ver wendung zur Herstellung von Therapeutica.

Zur Einführung von Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen und insbesondere in Säugerzellen ist eine Vielzahl von Verfahren, beispielsweise die Calciumphosphat-Transfek tion, Polybren-Transfektion, Protoplasten-Fusion, Elektro poration, Lipofektion und Mikroinjektion bekannt. Die Anwendung dieser Verfahren ist jedoch auf die in vitro- Transfektion beschränkt. Zudem haben diese Methoden oft mals eine geringe Effizienz und es fehlt die Zellspezifi tät.

Die Effizienz der Einschleusung von Nukleinsäuren in Zel len kann verbessert werden durch Bindung der Nukleinsäure an Polykationen, wie Polylysin (Lemaitre Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 648) oder an amphiphilen Molekülen, wie Polyethylenglykol (WO 88/0981). Auch mit derartigen Komplexen kann jedoch ebenfalls keine Zellspezifität er reicht werden.

In der WO 91/17173 sind Konjugate beschrieben, die kova lent gekoppelt eine Bindedomäne und eine Effektordomäne enthalten. Beide Domänen können über einen Linker verbun den sein. Dabei ist die Bindedomäne beispielsweise ein Zelloberflächenrezeptor und die Effektordomäne eine anti sense composition. Dabei kann der Linker spezifisch für eine subzellulare Region, wie beispielsweise für den Kern, sein. Ein derartiges Konjugat ist jedoch für eine gen therapeutische Anwendung nicht geeignet, da durch die kovalente Kopplung der antisense composition keine brauch bare Beeinflussung der Expression von zelleigenen Genen erreicht werden kann.

Um Zellspezifität zu erreichen, können Nukleinsäuren nicht-kovalent an Konjugate aus Proteinen und Polykationen gekoppelt werden (Wu und Wu, J. Biol. Chem. (1987), 4429- 4432, J. Biol. Chem. 263 (1988), 14621-14624). Danach erfolgt die Einschleusung von fremder DNA in Zellen mit Hilfe eines löslichen DNA-Trägersystems, das aus einem chemisch synthetisierten Konjugat mit Mannose und Lactose als Liganden (P. Midoux et al, Nucleic Acid Res. 21 (1993) 871-878) besteht. In der EP-A 0 388 758 werden chemisch synthetisierte Transferrin Polykation-Konjugate offenbart, die mit polyanionischen Nukleinsäuren Komplexe bilden. Durch Bindung an den Transferrinrezeptor können diese Komplexe in Zielzellen eingeschleust werden.

Die Verwendung von Konjugaten aus Polylysin und Asialo glycoprotein (Wu et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 14621 -14624) oder mit einem Galactoseliganden (Plank et al., Bioconjugate Chem., 3, (1992), 533-539) ist ebenfalls bekannt. Als Liganden wurden auch inaktivierte Adenoviren (Cotten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, (1992), 6094-6098, Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 6099-6103) oder Hämagglutininfusionspeptide (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, (1992), 7934-7938) verwendet. Wesentliche Nachteile dieser Konjugate sind jedoch, daß sie schwierig in reproduzierba rer Form herzustellen sind, ausgeprägte Immunreaktionen hervorrufen und keine befriedigende Effizienz, insbesonde re zum Transfer von größeren Nukleinsäuren, wie Vektoren, zeigen. In der WO 93/07283 wird ebenfalls zum nichtviralen Gentransfer ein "′2-Liganden-System" aus DNA-bindendem (polykationischen)-Anteil (Nukleinsäure-affine Substanz) und einem Internalisierungsfaktor zur Aufnahme der DNA in die Zelle beschrieben. Als Beispiel wird ein Polylysin-Transferrin-Komplex genannt. Diese DNA-haltigen Komplexe werden über Endozytose in die Zellen aufgenommen. Die Effektivität des Verfahrens ist jedoch nicht befriedi gend. Außerdem besteht die Möglichkeit, daß die Komplexe bei der Internalisierung in Lysosomen gelangen und abge baut werden, bevor die DNA den Zellkern erreicht.

Zur Freisetzung der Komplexe aus den Endosomen ins Cyto plasma wird in der WO 93/07283 diesen Komplexen ein soge nanntes endosomolytisches Mittel zugesetzt, welches beispielsweise einem Virus oder einer Viruskomponente ent spricht (z. B. Adenovirus oder Influenza-Hämagglutinin).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es somit, Nukleinsäure-transferpeptide zur Verfügung zu stellen, welche einfach herzustellen sind, Nukleinsäuren mit hoher Effizienz in Zellen transportieren können, die Effizienz der stabilen Gentransformation verbessern, geringe Immun reaktionen hervorrufen und in der Zielzelle gut abbaubar sind.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein Nukleinsäure-transferpeptid, welches enthält:

a) einen ersten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid, Steroid, Kohlenhydrat, Lipid oder Vitamin, welcher an einen Bindepartner auf der Zellober fläche von eukaryontischen Zellen bindet und dabei eine Endozytose des Komplexes aus dem genannten Nukleinsäure-transferpeptid und einer Nukleinsäure auslöst,
b) einen zweiten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid, Steroid, Kohlenhydrat, Lipid oder Vitamin, welcher an einen Bindepartner auf der äußeren Kernmembran von eukaryontischen Zellen bindet,
c) einen dritten Liganden, welcher ein basisches Pep tid ist und durch ionische Wechselwirkung an Nukleinsäuren bindet.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Komplex, der ein erfindungsgemäßes Peptid und eine durch ionische Wechselwirkung gebundene Nukleinsäure enthält. Die Nukleinsäure, die einen Komplex mit dem Protein bildet, kann eine lineare, zirkuläre, einzel- oder doppelsträngige DNA oder RNA, triple-helix DNA, ein DNA-RNA-Hybrid oder PNA sein. Ferner kann die Nukleinsäure auch chemisch modi fiziert sein, sofern die negative Ladung der Phosphat gruppen soweit erhalten bleibt, daß die ionische Bindung zum erfindungsgemäßen Fusionspolybindepeptid erhalten bleibt. Derartige Nukleinsäurederivate sind beispielsweise Thioate und Dithioate. Weitere Derivate sind beschrieben in Uhlmann und Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 544- 584, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.

Nukleinsäuren mit chemisch modifizierten Nukleotidbasen, z. B. RNA-Moleküle, bei denen die 2′-OH-Gruppe in einem oder mehreren Nukleotiden durch eine O-Alkylgruppe, O-Allylgruppe, Halogengruppe oder andere Modifizierungs gruppen ersetzt ist, sind ebenfalls geeignet.

Vorzugsweise ist die in die eukaryontische Zielzellen einzuschleusende Nukleinsäure eine DNA oder eine ggf. modifizierte RNA. Die in die Zielzelle eingeschleuste Nukleinsäure kann beispielsweise genetische Informationen enthalten, die in der Zielzelle zur Beseitigung von gene tisch bedingten Defekten exprimiert werden können. Ebenso kann die in die Zielzelle einzuschleusende Nukleinsäure auch Antisenseeigenschaften (Komplementarität zu einer in der Zielzelle vorliegenden mRNA) zur Hemmung der Expres sion von spezifischen Genen in der Zielzelle besitzen. Ebenso kann die einzuschleusende Nukleinsäure ein Ribozym sein, welches in spezifischer Weise RNA der Zielzellen spaltet. Derartige Ribozyme sind beispielsweise in Rossy und Sarver, TIBtech 8 (1990) 179-183 beschrieben, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenba rung ist. Die Einführung von Antisense- oder Ribozymnu kleinsäuren in spezifische Zielzellen kann, insbesondere bei der Therapie viraler Erkrankungen, wie z. B. AIDS, eine wichtige Rolle spielen. Die Einführung der Nuklein säure kann dabei mit dem Ziel erfolgen, eine dauerhafte oder transiente Expression des eingeführten Gens bzw. mehrerer Gene oder einer Antisense-Sequenz zu erreichen. Zur weiteren Verbesserung der Einschleusung der Nuklein säure in eukaryontische Zellen können Hilfsmittel zur Zellfusion zugesetzt werden.

Bevorzugt werden die Nukleinsäure-Transferpeptide zur Einschleusung von Nukleinsäuren verwendet, mit denen eine Regulation der endogenen Genexpression in der eukaryonti schen Zielzelle sowohl in vivo als auch in vitro erfolgen kann. Diese Regulation erfolgt durch Insertion von geeigneten Nukleinsäureelementen in das Genom durch homo loge Rekombination. Eine hierfür geeignete Nukleinsäure enthält ein DNA-Regulationssegment, welches in der Lage ist, die Expression des zu regulierenden Gens zu modulie ren, wenn es operativ an dieses Gen gekoppelt ist, sowie ein DNA-Targeting-Segment, welches homolog zu einer Region innerhalb oder in der Nähe des zu modulierenden Gens ist. Bei der homologen Rekombination wird dieses Konstrukt in das Genom so insertiert, daß das Regulationssegment opera tiv mit dem zu modulierenden Gen verbunden ist. Verfahren zur homologen Rekombination sind beispielsweise in der WO 91/09955 und bei Thomas und Capecchi, Cell 51 (1987), 503 -513 beschrieben, wobei der Gegenstand dieser Publika tionen Gegenstand der Offenbarung ist. Es hat sich gezeigt, daß bei Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Transferpeptide die homologe Rekombination effektiv erfolgt.

Als Gene sind vorzugsweise Markergene (z. B. Resistenzgene für Neomycin, HPRT, tk), Selektionsgene (z. B. für Metho trexat) oder funktionell aktive, in eukaryontischen Zellen exprimierbare Gene geeignet.

Vorzugsweise ist die einzuschleusende Nukleinsäure ein Vektor, der eine exogene Nukleinsäure trägt (z. B. Plasmide oder Cosmide). Üblicherweise sind die drei Liganden des Nukleinsäure-transferpeptides kovalent aneinander gebun den. In einer bevorzugten Ausführungsform des Komplexes sind die Liganden über die zu transferierende Nukleinsäu re miteinander verbunden. Dabei ist die Nukleinsäure also ein bi- oder multifunktioneller Bindepartner für die Liganden. Dies bedeutet, daß beispielsweise eine Verbin dung, welche aus erstem und drittem Ligand besteht, und eine weitere Verbindung, die aus zweitem und drittem Ligand besteht, über ionische Wechselwirkungen zwischen drittem Ligand und Nukleinsäure komplex gebunden sind. Weitere Varianten wie Komplexe aus Nukleinsäure mit einer Verbindung aus den Liganden 1/2/3 und einer Verbindung aus den Liganden 3/4 sind ebenfalls geeignet. Dabei sind demnach mindestens zwei Liganden über die Nukleinsäure gebunden.

Besonders bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäu retransferpeptide zur Einschleusung von RNA, Ribozymen und kurzkettigen Oligonukleotiden (z. B. Antisense-Sequenzen) bis ca. 30 Nukleotiden Länge geeignet. In diesen Fällen sind auch Nukleinsäuretransferpeptide ohne den zweiten, kernbindenden Liganden zur Komplexierung von DNA und zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet. Derartige Komplexe besitzen eine überraschend hohe Serumstabilität und Stabilität in Säugerzellen. Mit diesen Komplexen ist vorzugsweise ein Verfahren zur Bestimmung der Prolifera tionshemmung durch RNA, Ribozyme und kurzkettige Oligonu kleotide (z. B. Antisense-Sequenzen) möglich. Bei diesem Verfahren werden die Zellen, vorzugsweise Tumorzellen, mit den Komplexen inhibiert und nach Weiterkultivierung der Zellen (mehrere Stunden oder Tage) die Anzahl der gebilde ten Zellen oder DNA-Menge nach dem Fachmann geläufigen Verfahren bestimmt. Die Bestimmung der DNA-Menge erfolgt beispielsweise über Anfärbung mit Ethidiumbromid oder MTT (Beispiel 6).

Die im erfindungsgemäßen Nukleinsäure-transferpeptid ver wendeten und an Bindepartner auf Zelloberflächen bzw. an die äußere Kernmembran bindende Liganden sind Peptide, Steroide, Kohlenhydrate, Lipide oder Vitamine. Die Aufgabe der Liganden besteht darin, den Komplex aus Nukleinsäure und Peptid an Zelloberflächenrezeptoren, Zelloberflächen moleküle, Zelladhäsionsmoleküle, Zellmembranen bzw. die äußere Kernmembran zu binden.

Besonders bevorzugt werden als erste Liganden Peptide mit kurzen Sequenzen verwendet, beispielsweise das Peptid RGD, welches eine Bindungsstelle für den Integrinrezeptor an Zelloberflächen darstellt oder die gp120-Bindungsstelle.

Weitere geeignete erste Liganden sind beispielsweise die Bindedomänen von Wachstumsfaktoren, Hormonen, viralen Antigenen, Toxinen, Lipoproteinen und deren kurzkettige Fragmente, welche ebenfalls an Bindepartner an Zellober flächen binden. Bevorzugt als Wachstumsfaktoren werden CSF (Colony stimulierende Faktoren), NGF (nerve growth nactor), PDGF (platelet derived growth factor), EGF (epi dermal growth factor) verwendet. EGF-analoge Bindedomänen finden sich in einer Vielzahl von Proteinen (R.F. Doolittle, CSH Symp. 51 (1986), 447), wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.

Ebenfalls bevorzugt als Peptide sind Lectine und deren kurzkettige Fragmente, die an Kohlenhydratstrukturen an Zelloberflächen und Kernmembranen binden (Übersicht vgl. J. C. Paulson, The Receptors, Vol. 2 (1985), P. M. Conn, Ed., Academic Press N. Y.).

Als Steroide sind bevorzugt Progesteron, Androgen, Östrogen.

Als Kohlenhydrate sind bevorzugt Galactose, Mannose-6- phosphat, Mannose, Lewis-X-Kohlenhydrate, Glucose, Fucose.

Als Lipide sind bevorzugt Fettsäuren und Arachidonsäure. Als Vitamine sind bevorzugt Vitamin A oder D3.

Als zweiter Ligand sind Peptide, Steroide, Kohlenhydrate, Lipide oder Vitamine geeignet, welche eine Bindung des Nukleinsäure-transferpeptides an die äußere Kernmembran von eukaryontischen Zellen vermitteln.

Geeignete Peptide sind beispielsweise von De Robertis, Nature 272, 1978, 254-256 und Dingwall, Cell 30 (1982), 449-458 beschrieben, wobei der Inhalt dieser Publika tionen Gegenstand der Offenbarung ist. Als Sequenzmotiv bekannt ist beispielsweise PKKKRKV (SEQ ID No. 1), (Lanford und Butel, Cell 37 (1984), 801-813). Die Effektivität eines Nukleinsäurebindepeptids, welches dieses Motiv als zweiten Liganden enthält, kann noch gesteigert werden durch Ergänzung um 15 Aminosäuren, welche unmittelbar an dieses Motiv im SV40 T-Antigen anschließen (Rihs und Peters, EMBO J. 1989, 1479-1484), wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist. Es ist ebenfalls bevorzugt, Modifika tionen, wie beispielsweise eine Phosphorylierung, in diesen Motiven anzubringen, wodurch die Effektivität gesteigert werden kann (McVey, Nature 341 (1989) 503-507 und Rihs et al., EMBO J. 10 (1991) 633-639), wobei der Inhalt dieser Publikationen Gegenstand der Offenbarung ist.

Ein weiteres Peptidmotiv, welches als zweiter Ligand geeignet ist, ist die Sequenz KRPAATKKAGQAKKKKL (SEQ ID NO. 2) sowie Modifikationen davon, vgl. Tabelle 2 (Robbins, Cell 64 (1991), 615-623). Weiter geeignete Proteine sind das H3/H4-Bindeprotein N1 von Xenopus (Kleinschmidt und Seiter, EMBO J. 7 (1988), 1605-1614, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.) und Polymerase 1 des Influenzavirus (Nath und Nayak, Mol. Cell Biol. 10 (1990), 4139-4145, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.). Weitere als zweiter Ligand geeignete Peptidmotive sind in Tabelle 1 genannt. Ein wesentliches Merkmal von Peptidmotiven, welches als zweiter Ligand geeignet sind, ist, daß diese Peptide eine Vielzahl von basischen Aminosäuren enthalten sollten.

Eine weitere von dem SV40 T-Antigen abgeleitete Sequenz ist VSKRPRP (SEQ ID NO. 3) (Richardson, Cell 44 (1986), 77 -85). Weitere geeignete Motive finden sich im Influenza virus non structural protein (Greenspan, J. Virol. 62 (1988), 3020-3026, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.), Adeno virus DNA-Bindeprotein (Morin, Mol. Cell Biol. 9 (1989), 4372-4380, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.), Hefe MATa2, Glucokorti koidrezeptor (Garcia-Bustos, Biochim. Biophys. Acta, 1071 (1991) 83-101, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.)
Vorzugsweise ist das Peptidmotiv im Nukleinsäure-transfer peptid mehrfach enthalten.

Der Glucokortikoidrezeptor ist ein Protein mit einem Zink finger, welches an DNA binden kann und vorzugsweise in Gegenwart von Glucokortikoid die Bindung an die äußere Kernmembran vermittelt. Bei Verwendung von Motiven aus dem Glucokortikoidrezeptor ist es also bevorzugt, Glucokorti koide, welche auch kovalent an das erfindungsgemäße Peptid gekoppelt sein können, zuzusetzen. Der Glucokortikoidre zeptor enthält zwei geeignete Motive (nuclear localizing sequence (NLS1, NLS2), Picard und Yamamoto, EMBO J. 6 (1987), 3333-3340, wobei der Inhalt dieser Veröffentli chung Gegenstand der Offenbarung ist). NLS1 besteht aus 28 Aminosäuren.

Aus dem humanen Östrogenrezeptor (Picard, Cell Regul. 1 (1990), 291-299, wobei der Inhalt dieser Veröffentli chung Gegenstand der Offenbarung ist.) ist die Domäne der Aminosäuren 256-303 als zweiter Ligand bevorzugt.

Weiter bevorzugt ist, als zweiter Ligand die targeting- Signale von Nucleoplasmin E1A und SV40 large T-Antigen zu verwenden (Yamasaki, Mol. Cell Biol. 9 (1989) 3028- 3036, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist). Nucleoplasmin enthält ein Motiv, welches aus zwei basischen Aminosäureresten besteht, gefolgt von einem Spacer von zehn anderen Resten und einem Cluster von 5 Aminosäuren von denen 4 basisch sind.

Unter dem dritten Ligand ist eine Polyaminosäure (im weiteren auch mit Motiv bezeichnet) zu verstehen, welche spezifisch oder unspezifisch Nukleinsäuren in kleinen definierten Domänen und unabhängig vom sonstigen Aufbau der Nukleinsäure erkennt. Einige dieser Erkennungsmotive sind in Transkriptionsfaktoren und chromosomalen Proteinen enthalten.

Beispielsweise zu finden sind derartige Motive, welche Serin, Prolin und basische Aminosäuren enthalten, mehrfach am Amino- und Carboxyende des Histons H1 und am Aminoter minus des Histons H2B aus Seeigelsperma. Ein derartiges Motiv ist beispielsweise STPKRKR (SEQ ID NO. 4). Von Suzuki, EMBO J. 8 (1989), 797-804 (wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist) wurde beispielsweise gezeigt, daß ein Fragment des Aminoterminus des A1-Histons von Seeigelsperma 6 SPKK- repeats (S6-Peptid) sowie ein S2-Peptid, welches zwei repeats enthält, an AT-reiche DNA-Sequenzen bindet.

Reeves und Nissen, J. Biol. Chem. 265 (1990), 8573-8582, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist, zeigten, daß ein Konsensuspeptid aus HMG- 1 non-Histon-chromosomales Protein A mit der Sequenz TPKRPRGRPKK (SEQ ID NO. 5) an AT-reiche DNA-Sequenzen bindet. Eine verkürzte Version dieses Peptids (KRPRGRPK, SEQ ID NO. 6, nicht jedoch PRGRP, SEQ ID NO. 7) bindet ebenfalls an DNA.

Ebenso bekannt sind α-helicale Elemente von Proteinen, die an DNA binden. Eine derartige Region des E.coli-Proteins RecA ist in Zlotnick und Brenner, J. Mol. Biol. 209 (1989) 6551-6561 beschrieben, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist. Ein 24- Aminosäurenprotein des Aminoterminus von RecA hat eine α- helicale Struktur und bindet vorzugsweise an einzelsträn gige DNA.

Eine Sequenzfolge, die häufig am Carboxyterminus des Histons H1 auftritt, ist das Alanin/Lysin-Motiv. Eine Variante des Histons H1 aus Seeigelsperma hat ein 57- Aminosäure großes Segment, welches Alanin und Lysin reich und frei von Prolinresten ist. Es ist am Carboxyterminus unmittelbar nach der globulären Domäne lokalisiert und bei Wells and McBride, Nucleic Acids Res. 17 (1989) r311- r346 und Hill et al., EMBO J. 8 (1989), 2591-2599 beschrieben, wobei der Inhalt dieser Publikationen Gegenstand der Offenbarung ist. CD-Experimente haben gezeigt, daß dieses Segment in Lösung helical strukturiert ist und an doppelstrangige DNA bindet (Hill 1989). Die Verteilung basischer Reste in der α-Helix unterscheidet sich von der Verteilung im RecA-Peptid. Die basischen Reste sind an zwei gegenüberliegenden Seiten der Helix lokalisiert. Dazwischen, insbesondere auf einer Seite, sind cluster von Alanin-Resten zu finden. Da damit auf gegenüberliegenden Seiten basische Reste konzentriert sind, verbrückt dieses Motiv bevorzugt zwei doppelsträngi ge helicale DNA-Segmente.

Ein weiteres DNA-Bindeprotein, welches ein α-helicales Segment zur DNA-Erkennung verwendet, ist Serumamyloid P (SAP), ein Mitglied der Pentraxin-Familie (Turnell et al., FEBS Lett. 232 (1988), 263-268, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.). SAP bindet sowohl an DNA als auch Nukleosomen-Core-Regionen. Proteinsequenzen aus anderen Pentraxinen und Histonen können ebenfalls identifiziert werden als DNA- Bindedomänen. Eine Konsensussequenz, welche sowohl in Pentraxinen als auch Histonen enthalten ist, ist

P-V(RK) (KR)(SGA)L(RK) (KNQ)G.

Dieser Konsensus ist bei Turnell (1988) beschrieben. Es wird vermutet, daß die drei oder vier basischen Reste, welche auf einer Seite der Helix liegen, so positioniert sind, daß sie mit zwei Phosphatresten der DNA eines Strangs binden können und zwei andere Reste an einen ande ren Strang binden, so daß eine käfigartige Struktur ent steht. Diese Peptide binden bevorzugt an AT-reiche Sequenzen (Churchill and Travers, Trends Biochem. Sci. 16 (1991), 92-97, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.).

Schließlich finden sich Basissequenzen in einigen regula torischen DNA-Bindeproteinen, wie z. B. GCN4 (Leucin- Zipper und Helix-loop-Helixmotive), die eine α-helicale Struktur besitzen (Talanian et al., FEBS Lett. 232 (1988), 263-268, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.).

Ebenfalls als Nukleinsäurebindeproteine sind Zink-ligierte Proteine bekannt. Bisher sind mindestens vier verschiedene Gruppen zinkbindender Proteindomänen bekannt. Die erste ist die Gruppe des klassischen "Zinkfingers", ein etwa 30 Aminosäure großer Modul mit einem Zinkion, welches über zwei Cysteine und zwei Histidine ligiert ist (Miller et al., EMBO J. 4 (1985), 1609-1614, Brown et al., FEBS Lett. 186 (1985), 271-274, wobei der Inhalt dieser Publikationen Gegenstand der Offenbarung ist.). Beispiels weise ist in TFIIA ein Sequenzmotiv von 30 Aminosäuren neunmal wiederholt. Das Zinkfingermotiv ist durch vier Metalliganden definiert (Konsensus Cys-X_2-5, Cys-X_12,13- His-X_2-5-His) und drei konservierten hydrophoben Resten. Zweidimensionale NMR-Studien (Lee et al., Science 245 (1989), 635-637, Neuhaus et al., FEBS Lett. 262 (1990), 179-184, wobei der Inhalt dieser Publikationen Gegenstand der Offenbarung ist.

) zeigten, daß jedes der 30 Reste großen Motive zu einer unabhängigen Domäne mit einem einzigen Zinkion, vierfach komplexgebunden, faltet, welches zwischen ein antiparalle les β-Sheet und eine kurze α-Helix eingelagert werden kann.

Die zweite zinkenthaltende Domäne ist eine etwa 80 Amino säure große Domäne, welche in den Rezeptoren für steroide und hormonähnliche Moleküle gebunden wird. Diese Domäne enthält zwei Zinkionen. Jedes Zinkion ist über vier Cysteine ligiert (Freedman et al., Nature 334 (1988), 543 -546, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.). Im Gegensatz zu dem C₂-H₂-Zinkfin germotiv fehlen konservierte hydrophobe Reste, und der Abstand zwischen den zwei Motiven ist etwas größer (15 Reste im Vergleich zu ca. 4 bis 8 bei TFIIA).

Ein Vergleich der Strukturen der DNA-Bindedomänen des Glu cokortikoid und Estrogenrezeptors (Härd et al., Science 249 (1990), 157-160), Schwabe et al., Nature 348 (1990) 458-461 wobei der Inhalt dieser Publikationen Gegenstand der Offenbarung ist.) mit dem klassischen C₂-H₂-Zinkfin gern zeigt, daß die sekundäre und tertiäre Struktur sich unterscheiden.

Die dritte Domäne wird in Hefeaktivatoren, wie z. B. GAL4, gefunden. Diese Domänen enthalten zwei engbenachbarte Zinkionen, die über 6 Cysteine komplexiert sind (Pan und Coleman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 2077- 2081, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.). Die DNA-Bindedomäne ist am Amino terminus lokalisiert. Die Reste 1-74 sind ausreichend für die Erkennung und ein etwas größeres Fragment (1- 147) enthält weitere Stellen, welche die spezifische Affi nität erhöhen.

Die sog. GATA-Bindeproteine, welche den hämotopoetischen Regulationsfaktor GATA-1 einschließen, enthalten eine vierte Klasse von zinkhaltigen Domänen, welche DNA erken nen und binden (Orkin, Cell 63 (1990), 665-672, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenba rung ist.).

Weiter sind zwei verschiedene Klassen von zinkhaltigen Proteindomänen bekannt, welche RNA erkennen. Der erste Typ wird in den retroviralen gag-Proteinen gefunden, welche an virale genomische RNA bindet (Surovoy et al., J. Mol. Biol. 229 (1993), 94-104, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist). Analoges gilt für das tat-Protein von verschiedenen Retroviren, wie z. B. HIV (Frankel et al., Science 249 (1988), 70-73, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist).

Schließlich ist eine Vielzahl weiterer nukleinsäurebinden der Proteine bekannt, welche nicht in diese Klassen einor denbar sind, deren nukleinsäurebindenden Motive jedoch für die Erfindung geeignet sind. Beispielsweise sind dies der Heat-shock-factor, virale Aktivatoren, Nukleokapsidpro teine von Viren. Eine weitere Gruppe sind die sog. Genom linked-Proteine (VPg), welche in Pikornaviren enthalten sind und kurze Peptide (20-25 Aminosäuren), z. B. VPg3 aus dem Maul- und Klauenseuchenvirus, GPYEGPVKKPVALKVKAKNLIVTE (SEQ ID NO. 8), welches kovalent an RNA bindet, wobei statt M auch N geeignet ist. Diese Peptide sind jedoch auch in der Lage, mit Nukleinsäuren ionisch zu wechselwirken.

Falls erster und zweiter Ligand Peptide sind, ist es vorteilhaft, wenn der erste Ligand 2-100, der zweite Ligand 2-20, der dritte Ligand 3-100 und das Nukle insäure-transferpeptid 10-250 Aminosäuren lang sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungs gemäße Nukleinsäure-transferpeptid ein viertes Peptid oder Lipid enthalten, welches die Auflösung der bei der Endozy tose entstandenen Endosomen beschleunigt und vorzugsweise 10-40 Aminosäuren lang ist. Geeignete Peptide sind beispielsweise beschrieben in Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 7934-7938 und Kamata et al., Nucl. Acid. Res. 22 (1994), 536-537, wobei der Inhalt dieser Publikationen Gegenstand der Offenbarung ist.

Die Herstellung der Nukleinsäure-transferpeptide erfolgt nach den dem Fachmann geläufigen Methoden. Falls es sich um ein reines Peptid handelt, können die üblichen Methoden zur Peptidsynthese angewendet werden. Üblicherweise wird hierzu die das C-terminale Ende bildende Aminosäure an einen Träger gebunden, vom C-Terminus das Peptid schritt weise aufgebaut und dieses anschließend vom Träger abge spalten.

Im einzelnen wird dazu eine Aminosäure, beispielsweise über ihre Carboxygruppe an ein unlösliches, leicht fil trierbares Polymer gebunden und dann vom C-terminalen Ende her die Peptidkette schrittweise aufgebaut. Zu diesem Zweck wird eine N-geschützte Aminosäure mit einer reakti ven Gruppe eines Kunstharzes zur Reaktion gebracht. Von der am Trägerpartikel kovalent verankerten Aminosäure wird die N-α-Schutzgruppe entfernt und das resultierende Amino acylpolymer mit der nächsten N-geschützten Aminosäure umgesetzt. Von dem am Trägerharz kovalent gebundenen Dipeptid wird die N-α-Schutzgruppe entfernt und das resul nierende Aminoacylpolymer mit der nächsten N-geschützten Aminosäure umgesetzt. Alle überschüssigen Reagentien und Beiprodukte werden durch einfaches Filtrieren entfernt. Ist die gewünschte Peptidsequenz auf diese Weise herge stellt, wird die kovalente Bindung zwischen der C-termina len Aminosäure und der Ankergruppe des polymeren Trägers gespalten. Der unlösliche Träger wird durch einfache Filtration von dem in Lösung befindlichen Peptid entfernt. Das Peptid kann mittels chromatographischer Methoden gereinigt werden. Derartige Verfahren sind beispielsweise bei Merryfield, JACS 85 (1964) 2146, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist, beschrieben. Dabei kann das gewünschte Peptid auch in Fragmenten synthetisiert und die Fragmente durch Peptidbindungen ligiert werden.

Ebenso können die Peptide rekombinant, durch die dem Fachmann geläufigen Methoden, hergestellt werden.

Die Bindung von nicht peptidischen Liganden und Zell oberflächen-integrierenden Substanzen (z. B. Kohlenhydra te, Lipide, Vitamine, Steroide) kann nach Synthese des Peptidanteils des erfindungsgemäßen Peptids oder während der Synthese des Peptidanteils erfolgen. Zur Bindung an Peptide werden die Liganden und Substanzen vorher zweck mäßig aktiviert. Geeignete Aktivierungsreagentien sind dem Fachmann bekannt, beispielsweise kann Di-cyclohexyl carbodiimid verwendet werden. Zweckmäßig werden Carbonyl gruppen der Liganden und Substanzen in Aktivester modifi ziert.

Ein erfindungsgemäßer Komplex kann verwendet werden zur Herstellung eines Therapeutikums zur Behandlung von vira len Infektionen, zur Gentherapie, zur Stimulierung der Immunreaktion gegen maligne Zellen bzw. Tumoren, zur Expression von Faktoren (Proteine), zur Zellmarkierung und zur Zell-Integration von Genen, welche für Proteine codie ren, die in die Zelloberfläche integriert werden.

Zur Herstellung eines Therapeutikums wird der Komplex aus nukleinbindendem Peptid und DNA nach den dem Fachmann geläufigen Methoden in eine applizierbare Form überführt. Falls der Komplex intramuskulär oder subkutan gegeben werden soll, kann er beispielsweise in physiologischer Kochsalzlösung gelöst sein. Zur intranasalen oder intra okularen Applikation kann das Therapeutikum beispielsweise in Form eines Sprays oder einer wäßrigen Lösung angewendet werden. Für lokale oder orale Gaben ist es häufig erfor derlich, das Therapeutikum gegen Inaktivierung zu schüt zen, beispielsweise gegen proteolytische Enzyme in der Mundhöhle oder im Magen. Ein derartiger vorübergehender Schutz kann beispielsweise durch Verkapselung der erfin dungsgemäßen Peptide (Komplexe) erfolgen. Die Verkapselung kann beispielsweise durch Überziehen mit einem Schutzman tel (Mikroverkapselung oder Einbettung einer Vielzahl von erfindungsgemäßen Peptiden (Komplexen) in einen schützen den Träger (Makroverkapselung)) erfolgen.

Das Verkapselungsmaterial kann semipermeabel sein oder beim Einbringen in den menschlichen oder tierischen Körper semipermeabel werden. Üblicherweise wird für die Verkapse lung eine biologisch abbaubare Substanz als Träger verwen det.

Die Applikation der erfindungsgemäßen Peptide (Komplexe) kann durch die dem Fachmann geläufigen Methoden erfolgen, beispielsweise intradermal, intramuskulär, intraperito neal, intravenös, subkutan, intranasal, in die Liquorräume oder direkt in Tumorgewebe.

Die nachfolgenden Publikationen, Beispiele, Tabellen, das Sequenzprotokoll und die Abbildung erläutern die Erfindung weiter.

Tabelle 3 zeigt verschiedene Peptide, die in Teilsequenzen hergestellt und anschließend ligiert wurden, und deren Bindungskonstanten für verschiedene Nukleinsäuren.

Tabelle 3

Die einzelnen Peptide entsprechen folgenden SEQ ID NO:

F136-NCp7
SEQ ID NO: 17
F136-1-35	SEQ ID NO: 18
AcRGD-1-35	SEQ ID NO: 19
F136-1-Sp-35	SEQ ID NO: 20
AcRGD-1-Sp5	SEQ ID NO: 21
AcRGD-branched-1-Sp-35-	SEQ ID NO: 22
CD4-1-Sp-35	SEQ ID NO: 23
AcRGD-VPg	SEQ ID NO: 24

Tabelle 4 zeigt bevorzugte Peptide, die als Liganden geeignet sind (nach Robbins, Cell 64 (1991), 615-623).

Tabelle 5 zeigt weitere Beispiele für Peptidliganden (1 + 3).

Fusion-1-Sp-35
SEQ ID NO: 25
AcRGD-Fusion-1-Sp-35	SEQ ID NO: 26
AcRGD-NLS-1-Sp-35	SEQ ID NO: 27
Galactoxyl-branched-1-Sp-35-	SEQ ID NO: 29

Fig. 1 zeigt ein an Östrogen gekoppeltes Peptid (SEQ ID NO: 30), das als Ligand (1 + 3) geeignet ist.

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Beispiel 1 Peptidsynthese

Die Peptide wurden mittels FMOC (Fluorenyloxycarbonyl)- Festphasensynthese hergestellt. Die Synthese erfolgt an einem Peptidsynthesizer ABI 430A (Applied Biosystems). Das Peptid wurde an 0,4 g SASRIN-Harz, beginnend mit FMOC- derivatisiertem Glycin durchgeführt. Die FMOC-Gruppen wurden jeweils mit 25% Piperidin in DMF abgespalten. Die Bindung der weiteren FMOC-geschützten Aminosäuren (5 Äquivalente) wurden schrittweise durchgeführt.

Die Freisetzung des Peptids vom Harz erfolgte mit 1% Trifluoressigsäure in Dichlormethan in 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die Filtrate werden gesammelt, mit Di chlormethan gewaschen und durch Zugabe von Diethylether präzipitiert. Eine Nachfällung aus Ethylace tat/Diethylether ergibt das FMOC-geschützte Peptid.

1.1 Fmoc-136-156-Gly-1-55 Peptid a) Synthese des NCP7-1-55-Peptid

Das N-terminale Fragment von Fmoc-1-19 wurde an einem Fmoc-Gly-Sasrin-Harz (0.4 g, 0.7 mmol/g; Bachem) synthetisiert. Nach Behandlung des Harzes mit 25% Piperidin in Dimethylformamid (DMF) zur Abspaltung der Fmoc Gruppe, wurde jede Fmoc-Aminosäure (5 Äquivalent) nacheinander mit Hilfe von O-(1H-Benzotriazol-1-yl)- 1,1,3,3-tetramethyl-uronium-tetrafluorborate (TBTU)/ 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt)/Diisopropylethylamin (DIPEA) (5 : 5 : 7.5 Äquiv.) eingeengt. Das mittlere Fragment Fmoc-20-35 wurde nach dem gleichen Synthese plan synthetisiert. Zur Einführung von Fmoc-Ala³⁰ wurde eine Doppelkupplung benutzt. Das geschützte Fragment wurde mit 1% Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (CH2Cl2) (6 × 15 min) abgespalten. Die Filtrate wurden gesammelt, mit Pyridin neutralisiert und aus Diethylether gefällt. Die folgenden erneuten Fällungen aus dem Ethylacetat/ Diethylethergemisch ergaben die gewünschten geschützten Fragmente mit einer Ausbeute von 63% bzw. 65%. Ein vollgeschütztes C-terminales Fragment Fmoc-36-55 wurde am Fmoc- Asn(Trt)-Wang-Harz (0.64 g, 0.39 mmol/g) aufgebaut. Es wurden 6 Äquivalente jeder Aminosäure und die TBTU/HOBt-Aktivierungsmethode benutzt. Doppelkupplun gen wurden für Fmoc-Gln(Trt)-OH in Position 45 und Fmoc-Arg(Pmc)-OH in Position 52 angewandt. Das mittle re Fragment Fmoc-20-35 (0.1 mmol, 360 mg) wurde zusam men mit äquivalenten Mengen von TBTU und HOBt und 0.15 mmol DIPEA wurden in 1 ml DMF gelöst. Nach 20 min wurde das Reaktionsgemisch zu dem 36-55-Peptid-Harz (0.036 mmol, 250 mg) gegeben. Nach 4 Stunden wurde das Harz vorsichtig gewaschen. Das N-terminale Fragment Fmoc-1-19 (0.08 mmol, 390 mg in 1 ml DMF) wurde unter gleichen Bedingungen voraktiviert und über Nacht mit dem 20-55-Peptid-Harz gekuppelt. Schließlich wurden 0.52 g des Fmoc-1-55-Peptid-Harzes erhalten. Ein Teil dieses Peptid-Harzes wurde für eine Peptidabspaltung verwendet. Das 1-55-Peptid wurde mit einer Mischung von m-Cresol:Dimethylsulfid:Ethandithiol:TFA (Trifluoressigsäure) (3 : 3 : 3 : 91 v/v) für 2 Stunden bei 20°C abgespalten. Das erhaltene Peptid wurde aus der Mischung gefällt, mit Diethylether (× 5) gewaschen, in Wasser gelöst und lyophilisiert. Weitere halbpräpara tive HPLC Reinigung (HPLC an Nucleosil C18-Säule 8 × 250 mm, Gradientenelution) des Rohpeptids resultierte in HPLC reinem NCp7-1-55 Peptid mit der Ausbeute von 40% der Theorie (ausgehend von Asn⁵⁵ Harzbeladung). Analyse:ES-MS-6443.5 (calc. 6444.54); RP HPLC Rt- 13.32 min (Nucleosil C18 4.6_*150 mm; Gradient 10-70% B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in AcN; A = 0.1% TFA in H₂O).

b) Das geschützte Peptidfragment Fmoc-136-156-Gly-OH wurde auf die gleiche Weise wie das oben beschriebene Fragment erhalten (1.a). 0.011 mmol (50 mg in 300 ml DMF) von Fmoc-136-156-Gly-OH wurde innerhalb von 15 Stunden in einem DMF-Medium, dem TBTU/HOBt zugemischt wurde, an das 1-55-Peptid-Harz (0.0034 mmol, 50 mg) gekuppelt. Schließlich wurden 63 mg des Fmoc-136-156- Gly-1-55-Peptid-Harz erhalten. Das erhaltene Peptid wurde unter den gleichen Bedingungen abgespalten und gereinigt, so daß HPLC-reines Peptid (11.5 mg; Ausbeute: 38%) erhalten wurde.

Analyse: ES-MS-9044.8+1.5 (calc.: 9046.53); RP HPLC Rt-21.22 min (Nucleosil C18 4.6+150 mm; Gradient 10-70% B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H₂O).

1.2. Fmoc-136-156-Gly-1-35 Peptid

Fmoc Gly-Sasrin-Harz (100 mg, 0.65 mmol/g) wurde nacheinan der mit 7 Äquivalent (0.45 mmol) von jeder Fmoc-Aminosäure mit Hilfe der TBTU/HOBt/DIPEA Aktivierungsmethode acyliert. Ein Teil des 1-35-Peptid-Harz wurde wie in 1.a. abgespalten. 1-35-Peptid wurde HPLC gereinigt (Ausbeute: 55%).
Analyse: ES-MS-4109.19+0.2 (calc.: 4109.86); RP HPLC Rt- 12.89 min (Nucleosil C18 4.6+150 mm; Gradient 10-70% B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H₂O).

b) 1-35-Peptid-Harz (50 mg, 0.005 mmol) wurde mit 3 Äqui valent (0.015 mmol, 67 mg) von Fmoc-136-156-Gly-OH geschütztem Peptidfragment nach der Methode wie in 1.b. beschrieben, acyliert. Nach HPLC-Reinigung wurde des HPLC reines Peptid erhalten (Ausbeute: 13 mg, 52%).
Analyse: ES-MS-6709+1.5 (calc.: 6710.83); RP HPLC Rt-21.2 min (Nucleosil C18 4.6_*150 mm; Gradient 10-70% B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H₂O).

1.3 Ac-GRGDSPGSG-1-35 Peptid (SEQ ID NO: 9)

a) 10 g von 2-Chlortritylchlorid-Harz (1.4 mmol/g; Novabiochem) wurde mit 1.5 äquiv. Fmoc-Gly-OH unter Standardbedingungen acyliert. Der Substitutionsgrad war 0.65 mmol/g. 200 mg (0.13 mmol) des erhaltenen Harzes wurde nacheinander wie in 2.a. beschrieben acyliert. Die Fmoc-Gruppe wurde entfernt und das Peptid-Harz mit Acetanhydrid acyliert. Das geschützte Peptidfragment Ac-GRGDSPGSG wurde vom Harz abgespal ten, indem es 1 Stunde mit einem Gemisch aus Essigsäu re/Trifluorethanol/CH₂Cl₂ (1 : 2 : 7 v/v) behandelt wurde.

Die Filtrate wurden gesammelt und das Lösungsmittel wurde zur Trockene im Vakuum eingedampft. Das Peptid wurde aus tert.-Butylalkohol/Wasser (4 : 1, v/v) lyophi lisiert.

b) 1-35-Peptid-Harz (32 mg, 0.0032 mmol) wurde innerhalb von 15 h mit 0.0064 mmol (8.1 mg in 100 ml DMF) des Ac-GRGDSPGSG-OH geschützten Fragments, das mit TBTU/HOBt voraktiviert wurde, gekuppelt. Das Peptid- Harz wurde wie in 1.b beschrieben aufgearbeitet.

Schließlich wurden 8.6 mg HPLC reines Peptid erhalten (Ausbeute: 55%).
Analyse: ES-MS-4920.91+1.75 (calc.: 4922.65); RP HPLC Rt-13 min (Nucleosil C18 4.6_*150 mm; Gradient 10- 70% B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H₂O).

1.4 Fmoc-136-156-Gly-1-Sp-35 Peptid

a) Fmoc-Gly-Wang-Harz (210 mg, 0.52 mmol/g; Novabiochem) wurde nacheinander mit 10 Äquival. (1 mmol) von jeder Fmoc-Aminosäure, die nach der TBTU/HOBt/DIPEA Methode aktiviert wurde, acyliert. Eine Substanzprobe von 1- SP-35-Peptid-Harz (40 mg) wurde abgespalten wie in 1.a. beschrieben. Nach der HPLC-Reinigung wurden 10.5 mg 1-SP-35-Peptid erhalten (Ausbeute: 73%).
Analyse: ES-MS-2701.14+1 (calc.: 2702); RP HPLC Rt- 13.7 min (Nucleosil C18 4.6_*150 mm; Gradient 10-70% B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H₂O).

b) 1-Sp-35-Peptid-Harz (30 mg, 0.004 mmol) wurde mit 3 Äquivalenten des geschützten Fragments Fmoc-136-156- Gly-OH acyliert wie unter 1.b beschrieben. Das erhal tene Peptid wurde abgespalten und aufgearbeitet wie unter 1.a beschrieben. Ausbeute: 12.7 mg, 60% der Theorie; HPLC reines Produkt.
Analyse: ES-MS-5302.4 + 1.5 (berechnet 5303.21); RP HPLC Rt-21.29 min (Nucleosil C18; 4.6_*150 mm Gradient 10-70% B in A in 30 min; B=0.1% Trifluores sigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).

1.5 Ac-GRGDSPGSG-1-Sp-35 Peptid

1-Sp-35-Peptid-Harz (50 mg, 0.0067 mmol), wie beschrieben unter 4.a, wurde mit 2 Äquivalenten (17 mg, 0.0135 mmol) Ac-GRGDSPGSG wie unter 3.b beschrieben, umgesetzt. Das resultierende Peptid wurde abgespalten vom Harz, von den Schutzgruppen befreit und aufgearbeitet wie oben beschrie ben. Ausbeute:14 mg, 61% der Theorie, BPLC-rein.
Analyse: ES-MS-3514.5+0.7 (berechnet 3515.24); Rp HPLC Rt-14.9 min (Nucleosil C18; 4.6_*150 mm; Gradient 10-40% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).

1.6 Ac-GRGDSPGSG-PKKKRKVPGSG-1-SP-35 Peptid

a) Ausgehend von Fmoc-Gly-Sasrin-Harz (200 mg) wurde das in den Seitenkettenfunktionen geschützte Fragment Fmoc-PKKKRKVPGSG-OH (SEQ ID NO. 10) schrittweise aufgebaut wie unter 2.a. beschrieben. Die Abspaltung vom Harz erfolgte wie unter 1.b. beschrieben.

b) 1-Sp-35-Harz (50 mg, 0.0067 mmol) wurde mit 3 Äquiva lenten geschützem Fragment Fmoc-PKKKRKVPGSG-OH (42 mg, 0.02 mmol) voraktiviert mit TBTU/HOBt in Dimethyl formamid 150 ml innerhalb von 5 h acyliert. Die Fmoc- Gruppe wurde abgespalten und das Peptid-Harz wurde mit 2 Äquivalenten Ac-GRGDSPGSG-OH (17 mg, 0.0134 mmol) 15 h wie unter 3.b. beschrieben umgesetzt. Nach Abspal tung und Reinigung resultierte HPLC-reines Peptid. Ausbeute: 25 mg, 80% der Theorie.
Analyse: ES-MS-4677+2 (berechnet 4678.43); RP HPLC Rt-15.16 min (Nucleosil C18; 4.6_*150 mm; Gradient 10- 40% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressig säure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).

1.7 Fmoc-GNQGSFLTKGPSKLDRAPGSG-1-Sp-35 Peptid (SEQ ID NO. 11)

a) Die geschützte Peptidsäure Fmoc-GNQGSFLTKGPSKLDRAPGSG- OH wurde ausgehend von Fmoc-Gly-Sasrin-Harz hergestellt wie unter 1.a beschrieben.

b) Die Peptidsäure (31 mg, 0.08 mmol) wurde in Dimethyl formamid (500 ml) aktiviert mit TBTU und innerhalb von 15 h an 1-Sp-35-Peptid-Harz (30 mg, 0.04 mmol) gekup pelt.

Das Peptid wurde wie oben beschrieben vom Harz abge spalten und mit HPLC gereinigt. Ausbeute: 4.5 mg, 22.5% der Theorie.
Analyse: ES-MS-4979+2.2 (berechnet 4980.75); RP HPLC Rt-18.5 min (Nucleosil C18; 4.6_*150 mm; Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressig säure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).

1.8 [H-Lys(Ac-GRGDSPGSG)]₄-a,e-Lys₂-a,e-Lys-Gly₂-1-Sp-35 Peptid

a) 1-Sp-35-Peptid-Harz (353 mg, 0.047 mmol) wurde nacheinander acyliert mit jeweils 0.5 mmol Fmoc-Gly-OH (zwei Kupplungen), Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (zwei Kupplungen) und Boc-Lys(Fmoc)-OH mit Hilfe der TBTU/HOBT-Methode.

Die Fmoc-Gruppe wurde zuerst abgespalten und dann das Peptid von einem Teil des Peptid-Harzes (35 mg, 0.00385 mmol). Nach Reinigung resultierte ein HPLC- reines Peptid. Ausbeute: 15 mg, 75% der Theorie.
Analyse: ES-MS-3711+1.4 (berechnet 3711); RP HPLC Rt- 10.5 min (Nucleosil C18; 4.6_*150 mm; Gradient 10-70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitri1; A = 0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).

b) [Na-Boc-Lys]₄-Lys₂-Lys-Gly₂-1-Sp-35 Peptid-Harz wurde mit Ac-GRGDSPGSG-OH (60.4 mg, 0.048 mmol) in Dimethyl formamid (200 ml) mit Hilfe der TBTU/HOBT-Methode innerhalb von 15 h acyliert. Nach Abspaltung des Peptids vom Harz und Entfernung der Schutzgruppen wurde nach Reinigung ein HPLC-reines Produkt erhalten. Ausbeute: 12.5 mg, 75% der Theorie.
Analyse: ES-MS-6962.5+2.1 (berechnet 6963); RP HPLC Rt- 11 min (Nucleosil C 18; 4.6_*150 mm; Gradient 10-70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).

1.9 Ac-GRGDSPGSG-GLFEAIAGFIENGWEGMIDG-1-SP-35 Peptid (GLF . . . = SEQ ID NO 12)

a) Es wurden zuerst die geschützten Peptidsäuren Fmoc- GLFEAIAG-OH (SEQ ID NO. 13) und Fmoc-FIENGWEGMIDG-OH (SEQ ID NO. 14) hergestellt. Diese entsprechen Teilen der Sequenz des "Fusions-peptids" des Influenza Virus Hämagglutinins. Die Peptidsäuren wurden analog zu den Methoden hergestellt, die für das Peptid GRGDSPGSG verwen det wurden.

b) Fmoc-FIENGWEGMIDG-OH (25.5 mg, 0.012 mmol) wurde mit TBTU/HOBT in DMF (500 ml) aktiviert und innerhalb von 15 h an das 1-Sp-35-Peptid-Harz (30 mg, 0.004 mmol) gekuppelt. Nach Abspaltung der Fmoc- Gruppe von dem harzgebundenen Peptid wurde Fmoc-GLFEAIAG-OH (12.6 mg, 0.012 mmol) mit TBTU/HOBT in DMF/NMP (1 : 1) (1 ml) aktiviert und angekuppelt. Ein Teil des so erhaltenen Peptid-Harzes wurde zu einer Peptid- und Schutz gruppenabspaltung eingesetzt.
Analyse: ES-MS-5175.2+0.8 (berechnet 5176.6); RP HPLC Rt-29.5 min (Nucleosil C18; 4.6_*150 mm; Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressig säure in Acetonitril; A = 0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).

c) Nach Abspaltung der Fmoc-Gruppe von der Hauptmenge des Peptidharzes (nach 9.b.) wurde mit Ac-GRGDSPGSG-OH (10.2 mg, 0.008 mmol) acyliert wie beschrieben. Nach Abspaltung und Reinigung konnte ein HPLC-reines Peptid erhalten werden.
Ausbeute: 4.2 mg.
Analyse: ES-MS-5766.11+0.8 (berechnet 5767.39); RP HPLC Rt-24 min (Nucleosil C18; 4.6_*150 mm; Gradient 10-70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluores sigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).

1.10 Ac-GRGDSPGSG-Lys (Oestrogen)-1-Sp-35 Peptid

a) Fmoc-Lys(Dde)-OH (Novabiochem) (29.8 mg, 0.056 mmol) wurde zusammen mit äquivalenten Mengen an TBTU (18 mg), HOBT (8.4 mg) und Diisopropylethylamin (19.2 mg, 0.11 mmol) in DMF (150 ml) gelöst. Nach 20 min wurde die Reaktionsmischung zu 1-Sp-35-Peptid-Harz (83 mg, 0.0112 mmol) gegeben. Nach 2 h wurde die Fmoc-Gruppe abgespalten und an das resultierende Peptid-Harz wurde das seitenkettengeschützte Ac-GRGDSPGSG (42mg, 0.0336 mmol) in DMF (200 ml) gekuppelt mit Hilfe von TBTU/HOBT. Die Dde-Gruppe wurde mit 2% Hydrazin in DMF innerhalb von 1 h entfernt.

b) β-Östradiol-6-on-6-(O-carboxymethyloxim) (4.6 mg, 0.0121 mmol; Fluka) wurde mit äquivalenten Mengen an HOBT (1.8 mg), Diisopropylcarbodiimid (2 ml) in DMF (100 ml) an Ac-GRGDSPGSG-Lys-1-Sp-35-Peptid-Harz gekuppelt. Nach Abspaltung vom Harz und Entfernung der Schutzgruppen wurde nach Reinigung ein HPLC reines Steroid-Peptid erhalten. Ausbeute 6 mg.
Analyse: ES-MS-3984.2+0.7 (berechnet 3984); RP HPLC Rt-15.5 min (Nucleosil C18; 4.6_*150 mm Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressig säure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).

1.11 Ac-GRGDSPGSG-Lys(Ac-PKKKRKVPGSG)-1-Sp-35 Peptid

Die freie Aminogruppe von Ac-GRGDSPGSG-Lys-1-Sp-35-Peptid- Harz (50 mg, hergestellt nach 10.a) wurde acyliert mit 3 Äquivalenten Fmoc-PKKKRKVPGSG-OH (42 mg) in DMF (150 ml) nach der Vorschrift in 6.6 und abgespalten.
Analyse: ES-MS-4846.09+0.8 (berechnet 4849.2); RP HPLC Rt-11.6 min (Nucleosil C18; 4.6_*150 mm; Gradient 10-70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).

1.12 [Lys (Asn-Lactose)]₄-Lys₂-Lys-Gly₂-1-Sp-35 Peptid

a) D(+)Lactose Monohydrat (Fluka) (1.8 g, 5 mmol) wurden mit gesättigter Ammoniumcarbonatlösung (40 ml) auf 30°C 6 Tage erwärmt. Dann wurde mit Wasser (20 ml) verdünnt und die Lösung auf die Hälfte des Volumens eingeengt. Dieser Vorgang wurde jedesmal wiederholt um das überschüssige Ammoniumcarbonat zu entfernen.

Schließlich wurde lyophilisiert und der resultierende Aminozucker wurde ohne weitere Reinigung zur Synthese von Fmoc-Asn(Lactose)-OtBu eingesetzt. Dazu wurde Fmoc-Asp-OtBu (Bachem) (480 mg, 1.17 mmol) und HOBT (228 mg, 1.52 mmol) in DMF (5 ml) gelöst, dann wurde bei 4°C Diisopropylcarbodiimid (205 mg, 1.63 mmol) zugegeben. Nach 15 min Rühren bei 4°C und 20 min bei 25°C wurde 1-Aminolactose (5.85 mmol) in DMF/Wasser (2 : 1, v/v, 6 ml) zu der Lösung des Aktivesters gege ben. Nach 6 h Rühren wurde im Vakuum das Solvens entfernt und Ether zugegeben. Das Produkt wurde abfil triert, mit kaltem Ether und kaltem Wasser gewaschen. Die tBu-Gruppe wurde mit TFA/Wasser (7 : 3, v/v) inner halb von 20 min bei Raumtemperatur abgespalten. Nach Verdampfen der Lösungsmittel in Vakuum wurde in tert- Butylalkohol/Wasser (4 : 1, v/v) gelöst und lyophili siert. Die Reinigung von Fmoc-Asn(Lactose)-OH erfolgte über RP MPLC (LiChroprep C18, 25_*310 mm, Merck; isokratisch in 30% Acetonitril/Wasser/0.1% TFA).
Ausbeute: 280 mg, 35% der Theorie bezogen auf Fmoc- Asp-OtBu.
Analyse: (+)FAB-MS: MH+ 679 (berechnet 679), RP HPLC Rt-6.59 min (Nucleosil C18; 4.6_*150 mm; Gradient 30- 100% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluores sigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).

b) Fmoc-Asn(Lactose)-OH (32.5 mg, 0.048 mmol) und HOBT (7.25 mg, 0.05 mmol) wurden in DMF (200 ml) gelöst und Diisopropylcarbodiimide (6.31 mg, 0.05 mmol) zugege ben. Nach 30 min wurde die Aktivesterlösung zu Lys₄- Lys₂-Lys-Gly₂-1-Sp-35-Peptid-Harz (30 mg, 0.0162 mmol) gegeben. Nach 15 h wurde das Peptid-Harz gewaschen, das N-lactosylierte Peptid abgespalten und mit semipräparativer HPLC gereinigt. Ausbeute 10.6 mg.
Analyse: ES-MS-5463.71+0.7 (berechnet 5463); RP HPLC Rt-11.6 min (Nucleosil C18; 4.6_*150 mm; Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B-0.1% Trifluoressig säure in Acetonitril; A-0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).

Beispiel 2 Nachweis der Bindung an Nukleinsäuren

Die Analyse der Nukleinsäure-Bindung des Proteins (NC- Protein), von Fragmenten des NC-Proteins sowie der entsprechenden Peptidderivate erfolgte in Filterbindungs tests (vgl. J. Mol. Biol. 34 (1968), 361-364, Nature 342 (1989), 816-819).

Es werden steigende Mengen Protein mit einer konstanten Menge radioaktiv markierter Nukleinsäure in 100 µl Bin dungspuffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 100 µM ZnCl₂) 15 min bei 25°C inkubiert und anschließend über Nitrozellulosefilter mit einer Porenweite von 0.45 µm filtriert. Die Nitrozellulosefilter werden anschließend zweimal mit je 1 ml Bindungspuffer gewaschen und die gebundene Radioaktivität durch Szintillationszählung bestimmt.

Als Test-Nukleinsäuren dient HIV-1 RNA (vgl. J. Mol. Biol. 229 (1993), 94-104), die während der in vitro Transkrip tion durch Inkorporation von α-[³²P)-UTP radioaktiv mar kiert wird. Außerdem werden 5′-³²P endmarkierte Oligodesoxynukleotide verwendet.

Die Bestimmung der Dissoziationskonstanten erfolgt durch Analyse der Bindungsdaten in doppelt reziproken Plots (vgl. J. Mol. Biol. 34 (1968), 361-364) durch Auftrag der reziproken relativen Sättigung (Ordinate) und der reziproken Proteinkonzentration (Abszisse).

In einem typischen Experiment wird RNA mit einer Konzen tration von 1.4 × 10^-11 M, einzelsträngiges Desoxynukleo tid mit einer Konzentration von 1.7 × 10^-10 M und doppelsträngiges Desoxynukleotid mit einer Konzentration von 0.85 × 10^-10 M eingesetzt. In kompetitiven Filterbin dungstests werden die radioaktiv markierte Nukleinsäure und steigende Mengen unmarkierter Kompetitor-Nukleinsäure mit einer konstanten Protein-Konzentration inkubiert, wobei die Proteinzugabe zuletzt erfolgt.

Als zu bindende Nukleinsäuren wurden verwendet:
ms2-RNA (30facher Überschuß), ssM13-DNA (70fach), dsM13- Rf-DNA (265fach).

Beispiel 3 Nachweis der Bindung von Komplexen an Zellen und deren Integration in Zellen

Als nukleinsäurebindender Anteil des erfindungsgemäßen Peptids wird eine Teilsequenz des NCp7-Proteins (T.L. South, Biochemistry 30 (1991) 6342-6349) verwendet.

Dieses Peptid wird durch 22 Aminosäuren des viralen Pro teins vp1 (F136), welches mit dem Integrinrezeptor inter agiert, verlängert (Hynes, R.O. Cell 69 (1992) 11-25).

Zur Überprüfung der Integration von DNA mit Hilfe des erfindungsgemäßen Peptids wird ein Komplex hergestellt zwischen dem erfindungsgemäßen Peptid und einem 18mer-DNA Oligonukleotid, welches gegen den Start des zweiten Codons des humanen c-myb-RNA gerichtet ist. Die Sequenz dieses Antisenseoligonukleotides (a-myb) ist:

5′GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3′(SEQ ID NO. 15)

Es ist bekannt, daß dieses Oligonukleotid die Prolifera tion der humanen promyelocytischen Zellinie HL60 redu ziert (G. Anfossi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3379-3383.

Durchführung des Tests

Pro Test werden 1 × 10⁴ HL-60-Zellen (ATCC CCL 240) in einem Volumen von 0.5 ml RPMI-Medium (mit 10% FKS) mit Peptidderivaten, komplexiert mit Oligodesoxynukleotid, versetzt. Dieser Ansatz wird für 5 Tage bei 37°C/5% CO2 inkubiert. Zur Auswertung wird die Zellzahl nach drei und fünf Tagen bestimmt. Hierzu werden 100 µl Zellen entnommen und das entsprechende Volumen mit RPMI-Medium (10% FKS) aufgefüllt. Die Komplexierung von Peptid und Nukleinsäure erfolgt in einem Volumen von 10 µl Bindungspuffer. Nach 15 min bei Raumtemperatur wird die Mischung zu den Zellen gegeben. Am zweiten und am dritten Tag wird diese Behand lung mit einem Viertel der Ausgangsdosis wiederholt.

Beispiel 4 Test zur Bestimmung des Transports von Plasmid-DNA in eukaryotischen Zellen in Anwesenheit von Derivaten des NC- Proteins

Zur Analyse des Transports von Plasmid DNA in eukaryoti sche Zellen werden Peptide und DNA komplexiert wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Plasmide enthalten Indikator- Gene (Luziferase, β-Galaktosidase, Chloramphenikol-Trans ferase) unter Kontrolle viraler Promotoren (z. B. SV40 early promotor oder IE Promotor/Enhancer von MCMV. Es können auch gewebespezifische zelluläre Promotoren einge setzt werden). 48 h nach Zugabe der komplexierten DNA zu den eukaryotischen Zellen wird die enzymatische Aktivität der exprimierten Indikator-Genprodukte analysiert. Die Analyse kann luminometrisch, photometrisch oder durch Acetylierung von Chloramphenicol mit ¹⁴C-Acetyl-CoA erfolgen.

Beispiel 5 Test zur Bestimmung des Transports von RNA in eukaryoti sche Zellen in Anwesenheit von Derivaten des NC-Proteins

Der Test erfolgt wie in Beispiel 3 beschrieben. Hier werden in vitro transkribierte RNAs von Indikator-Genen verwendet. Analysiert wird ebenfalls die enzymatische Aktivität der exprimierten Genprodukte.

Beispiel 6 Hemmung der Proliferation von Capan-1 Zellen durch Ki-Ras Ribozym-DOTAP Komplexe

Capan-1 Zellen (ATCC HTB 79, humane Adenocarcinom-Zellinie des Pancreas) wurden in Gewebekulturschalen mit 96 Vertiefungen bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert. Dabei wurden in jede Vertiefung 5 × 10³ Capan-1 Zellen in 100 µl RPMI Medium, das 10% foetales Kälberserum (FKS) enthielt, gegeben. Die Zellen wurden 12 h im Brutschrank kultiviert und daraufhin wie folgt behandelt: (control) 10 µl TN-Puffer (50 mM Tris HCl pH 8.0, 50 mM NaCl; (DOTAP) 1 µg DOTAP (N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethyl ammoniummethylsulfat, Boehringer Mannheim) in 10 µl TN; (DOTAP + Rz mut) 1 µg DOTAP + 7.5 pmol mutiertes (mut) Rz (siehe Übersicht 1) in 10 µl TN; (DoTAP + Rz wt) 1 µg DOTAP + 7.5 pmol Rz wt in 10 µl TN.

Die Komplexierungsreaktion erfolgte für 20 min bei Raumtemperatur. Nach 2 Tagen im Brutschrank wurden die Zellen einem MTT (3-[4,5 Dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide) Test unterzogen. Hierzu wurden die Zellen nach Absaugen des Mediums für 3 h mit 200 µl RPMI, 10% FKS, 1 mg/ml MTT im Brutschrank inkubiert. Nach Absaugen des Mediums wurden die Zellen dann in 400 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) lysiert und der MTT Umsatz photometrisch bei 507 nm als optische Dichte (OD) bestimmt. Alle Bestimmungen erfolgten als Triplikate.

Beispiel 7 Hemmung der Proliferation von Capan-1 Zellen durch Ki-Ras Ribozym-Transferpeptidkomplexe

Es wurde exakt wie in Beispiel 6 verfahren. Hier wurden die Zellen wie folgt behandelt:
(control) 10 µl TN; (Rz mut) 7.5 pmol Rz mut in 10 µl TN; (Rz wt) 7.5 pmol Rz wt in 10 µl TN; (Int) 150 pmol AcRGD- 1-35 in 10 µl TN; (Int + Rz mut) 7.5 pmol Rz mut + 150 pmol AcRGD-1-35 in 10 µl TN; (Int + Rz wt) 7.5 pmol Rz wt + 150 pmol AcRGD-1-35 in 10 µl TN.

Die Ergebnisse zeigt Tabelle 1:

Beispiel 8 Vergleich der Transfereffizienz von DOTAP und Transferpep tid bei HL60 Zellen, Kompetition des Transfers

Die Durchführung der Tests erfolgte unter Standardbedin gungen (Beispiel 3). (a-myb + Int) 0.43 PM AcRGD-1-35 + 1 µg/ml myb -antisense; (DOTAP + a-myb) 10 µg/ml DOTAP + 1 µg/ml myb -antisense; (Int-Komp) 0.43 µM AcRGD-1-35 + 0,43 µm F136-1-35 (FMDV Integrin Bindestelle) + 1 µg/ml myb- antisense; (5 µg DOTAP) 10 µg/ml DOTAP; (a-myb) 1 µg/ml DOTAP.

Die Ergebnisse zeigt Tabelle 2:

Tabelle 4

Sequenzprotokoll (1) Allgemeine Information

(i) Anmelder:
(A) Name: Boehringer Mannheim GmbH
(B) Straße: Sandhofer Str. 116
(C) Ort: Mannheim
(E) Land: Germany
(F) Postleitzahl: D-68305
(G) Telephon: 08856/2 23 446
(H) Telefax: 08856/2 23 451
(ii) Anmeldetitel: Nukleinsäure-transferpeptide und deren Verwendung zur Einschleusung von Nukleinsäuren in eukaryontische Zellen
(iii) Anzahl der Sequenzen: 30
(iv) Computer-lesbare Form:
(A) Datenträger: Floppy disk
(B) Computer: IBM PC compatible
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release 1.0, Version 1.25 (EPA)
(vi) Frühere Anmeldedaten:
(A) Anmeldenummer: DE-P 43 12 131.4
(B) Anmeldedatum: 14-Apr-1993
(vi) Frühere Anmeldedaten:
(A) Anmeldenummer: DE-P 43 18 470.7
(B) Anmeldedatum: 03-Jun-1993

(2) Information zu SEQ ID NO 1

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 7 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 1:

(2) Information zu SEQ ID NO: 2

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 17 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 2

Information zu SEQ ID NO:3

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 7 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 3

(2) Information zu SEQ ID NO: 4

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 7 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 4

(2) Information zu SEQ ID NO: 5

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 11 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 5

(2) Information zu SEQ ID NO: 6

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 8 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 6

(2) Information zu SEQ ID NO: 7

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 5 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 7

(2) Information zu SEQ ID NO: 8

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 24 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 8

(2) Information zu SEQ ID NO: 9

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 9 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 9:

(2) Information zu SEQ ID NO: 10

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 11 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 10:

(2) Information zu SEQ ID NO: 11

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 21 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 11:

(2) Information zu SEQ ID NO: 12

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 12:

(2) Information zu SEQ ID NO: 13

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 8 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 13:

(2) Information zu SEQ ID NO: 14

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 12 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 14:

(2) Information zu SEQ ID NO: 15

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 18 Basenpaare
(B) Art: Nukleinsäure
(C) Strangform: Einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: cDNS
(iii) Antisense: Ja
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 15: GTGCCGGGGT CTTCGGGC 18

(2) Information zu SEQ ID NO: 16

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 36 Basenpaare
(B) Art: Nukleinsäure
(C) Strangform: Einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: RNS (genomisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 16: CUACGCCCUG AUGAGUCCGU GAGGACGAAA CAGCUC 36

(2) Information zu SEQ ID NO: 17

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 77 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 17:

(2) Information zu SEQ ID NO: 18

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 57 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 18:

(2) Information zu SEQ ID NO: 19

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 44 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 19:

(2) Information zu SEQ ID NO: 20

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 45 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 20:

(2) Information zu SEQ ID NO: 21

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 32 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 21:

(2) Information zu SEQ ID NO: 22

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 37 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: Peptide
(B) Lage: 11
(D) Sonstige Angaben: /note= "Seitenketten an den AS 11 + 12 (Lysin) gem. Tabelle 3"
(ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: Peptide
(B) Lage: 12
(D) Sonstige Angaben: /note= "Seitenketten an den AS 11 + 12 (Lysin) gem. Tabelle 3"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 22:

(2) Information zu SEQ ID NO: 23

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 44 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 23:

(2) Information zu SEQ ID NO: 24

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 33 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 24:

(2) Information zu SEQ ID NO: 25

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 43 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 25:

(2) Information zu SEQ ID NO: 26

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 52 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 26:

(2) Information zu SEQ ID NO: 27

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 43 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 27:

(2) Information zu SEQ ID NO: 28

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 35 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: Peptide
(B) Lage: 12
(D) Sonstige Angaben: /note= "Seitenkette an der AS 12 (Lysin) gem. Tabelle 5"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 28:

(2) Information zu SEQ ID NO: 29

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 28 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: Peptide
(B) Lage: 2
(D) Sonstige Angaben: /note= "Seitenketten an den AS 2 + 3 (Lysin) und Galactose-Derivatisierung gem. Tabelle 5"
(ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: Peptide
(B) Lage: 3
(D) Sonstige Angaben: /note= "Seitenketten an den AS 2 + 3 (Lysin) und Galactose-Derivatisierung gem. Tabelle 5"
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 29:

(2) Information zu SEQ ID NO: 30

(i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 27Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 30:

Claims

1. Nukleinsäure-transferpeptid enthaltend

a) einen ersten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid, Steroid, Kohlenhydrat, Lipid oder Vitamin, welches an einen Bindepartner an der Zelloberflä che von eukaryontischen Zellen bindet und dabei eine Endozytose des Komplexes aus dem genannten Nukleinsäure-transferpeptid und einer Nukleinsäure auslöst,
b) einen zweiten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid, Steroid, Kohlenhydrat, Lipid oder Vitamin, welches an einen Bindepartner auf der äußeren Kern membran von eukaryontischen Zellen bindet,
c) einen dritten Liganden, welcher ein basisches Pep tid ist und durch ionische Wechselwirkung an Nukleinsäuren bindet.

2. Nukleinsäure-transferpeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Ligand als Peptid eine Länge von 2-100 Aminosäuren, der zweite Ligand als Peptid eine Länge von 2-20 Aminosäuren und der drit te Ligand als Peptid eine Länge von 3-100 Amino säuren besitzt.

3. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es als

a) Steroid: Progesteron, Androgen, Östrogen
b) als Kohlenhydrat: Galactose, Mannose-6-Phosphat, Lewis-X-Kohlenhydrate
c) als Lipid: Fettsäuren, Arachidonsäure
d) als Vitamin: Vitamin A oder D3

enthält.

4. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen vier ten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid oder Lipid enthält, welcher die Auflösung der bei der Endo zytose entstandenen Endosomen beschleunigt.

5. Nukleinsäure-transferpeptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der vierte Ligand als Peptid eine Länge von 10-40 Aminosäuren hat.

6. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1- 5, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Ligand ein peptidischer Ligand für den Integrinrezeptor oder eine gp120-Bindungsstelle ist.

7. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Ligand ein peptidischer Ligand für den Östrogen-Rezeptor ist.

8. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Ligand ein peptidischer Ligand für den Galactose-Rezeptor ist.

9. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtlänge des Nukleinsäure-transferpeptids 10-250 Aminosäuren beträgt.

10. Komplex enthaltend, über ionische Wechselwirkung gebunden, eine Nukleinsäure und mindestens ein Nukleinsäure-transferpeptid gem. den Ansprüchen 1-9.

11. Komplex nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA oder RNA ist.

12. Komplex nach den Ansprüchen 10 oder 11, dadurch ge kennzeichnet, daß die Nukleinsäure ein Ribozym oder eine Antisensenukleinsäure ist.

13. Komplex nach den Ansprüchen 10-12, dadurch gekenn zeichnet, daß die Nukleinsäure ein eine exogene Nukleinsäure tragender Vektor ist.

14. Komplex nach den Ansprüchen 10-13, dadurch gekenn zeichnet, daß die Nukleinsäure mindestens ein funktio nell aktives, in eukaryontischen Zellen exprimierbares Gen enthält.

15. Komplex nach den Ansprüchen 10-14, dadurch gekenn zeichnet, daß an die Nukleinsäure ionisch gebunden ein Peptid gemäß den Ansprüchen 1-9 und zusätzlich, ebenfalls ionisch gebunden, ein basisches Peptid, welches durch ionische Wechselwirkung an Nukleinsäure bindet und kovalent mit einem Peptid oder Lipid ver bunden ist, welche die Auflösung der Endosomen, welche bei der durch das genannte Nukleinsäure-transferpeptid verursachten Endozytose entstanden sind, beschleu nigt.

16. Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäure-transfer peptiden nach den Ansprüchen 1-9, dadurch gekenn zeichnet, daß die das C-terminale Ende bildende Aminosäure an einen Träger gebunden wird, vom C-termi nalen Ende das Nukleinsäure-transferpeptid schrittwei se aufgebaut, vom Träger abgespalten und gegebenenfalls mit Kohlenhydraten, Lipiden, Vitaminen oder Steroiden kovalent gekoppelt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäure-transferpeptid in Fragmenten synthetisiert und die Fragmente durch Peptidbindungen ligiert werden.

18. Verfahren zur Transfektion von eukarayontischen Zellen mit Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß ein Komplex nach den Ansprüchen 10-15 und 22 mit eukaryontischen Zellen in Kontakt gebracht und inkubiert wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß Hilfsmittel zur Zellfusion zugegeben werden.

20. Verwendung eines Komplexes nach den Ansprüchen 10-15 und 22 zur Herstellung eines Therapeutikums zur Behandlung von viralen Infektionen, zur Gentherapie, zur Stimulierung der Immunreaktion gegen maligne Zellen bzw. Tumoren, zur Expression von Faktoren, zur Stimulierung der Immunreaktion gegen maligne Zellen bzw. Tumoren, zur Expression von Faktoren, zur Zellmarkierung und zur Zell-Integration von Genen, welche für Proteine codieren, die in die Zelloberfläche integriert werden.

21. Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäure-transfer peptiden gemäß den Ansprüchen 1-9, dadurch gekenn zeichnet, daß der Peptidanteil durch Genexpression rekombinant hergestellt wird und anschließend ggf. mit Kohlehydraten, Lipiden, Vitaminen oder Steroiden kova lent gekoppelt wird.

22. Komplex nach den Ansprüchen 10-15, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung von mindestens zwei Liganden untereinander über die Nukleinsäure als bi- oder multifunktioneller Bindepartner erfolgt.

23. Komplex nach den Ansprüchen 10-15, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäuretransferpeptid keinen zweiten, kernbindenden Liganden enthält und als Nukleinsäure ein Ribozym oder eine Antisensesequenz bis etwa 30 Nukleotide Länge enthält.

24. Verwendung eines Komplexes nach Anspruch 23 zur Herstellung eines Therapeutikums zur Behandlung von viralen Infektionen, zur Gentherapie, zur Stimulierung der Immunreaktion gegen maligne Zellen bzw. Tumoren, zur Expression von Faktoren, zur Stimulierung der Immunreaktion gegen maligne Zellen bzw. Tumoren, zur Expression von Faktoren, zur Zellmarkierung und zur Zell-Integration von Genen, welche für Proteine codieren, die in die Zelloberfläche integriert werden.