DE4412629A1 - Nukleinsäure-transferpeptide und deren Verwendung zur Einschleusung von Nukleinsäuren in eukaryontische Zellen - Google Patents
Nukleinsäure-transferpeptide und deren Verwendung zur Einschleusung von Nukleinsäuren in eukaryontische ZellenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft Nukleinsäure-transferpeptide und
ein Verfahren zur Einschleusung von Nukleinsäuren in euka
ryontische Zellen sowie Komplexe, in denen Nukleinsäuren
durch ionische Wechselwirkung an die erfindungsgemäßen
Nukleinsäure-transferpeptide gebunden sind und deren Ver
wendung zur Herstellung von Therapeutica.
Zur Einführung von Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen
und insbesondere in Säugerzellen ist eine Vielzahl von
Verfahren, beispielsweise die Calciumphosphat-Transfek
tion, Polybren-Transfektion, Protoplasten-Fusion, Elektro
poration, Lipofektion und Mikroinjektion bekannt. Die
Anwendung dieser Verfahren ist jedoch auf die in vitro-
Transfektion beschränkt. Zudem haben diese Methoden oft
mals eine geringe Effizienz und es fehlt die Zellspezifi
tät.
Die Effizienz der Einschleusung von Nukleinsäuren in Zel
len kann verbessert werden durch Bindung der Nukleinsäure
an Polykationen, wie Polylysin (Lemaitre Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84 (1987), 648) oder an amphiphilen Molekülen,
wie Polyethylenglykol (WO 88/0981). Auch mit derartigen
Komplexen kann jedoch ebenfalls keine Zellspezifität er
reicht werden.
In der WO 91/17173 sind Konjugate beschrieben, die kova
lent gekoppelt eine Bindedomäne und eine Effektordomäne
enthalten. Beide Domänen können über einen Linker verbun
den sein. Dabei ist die Bindedomäne beispielsweise ein
Zelloberflächenrezeptor und die Effektordomäne eine anti
sense composition. Dabei kann der Linker spezifisch für
eine subzellulare Region, wie beispielsweise für den Kern,
sein. Ein derartiges Konjugat ist jedoch für eine gen
therapeutische Anwendung nicht geeignet, da durch die
kovalente Kopplung der antisense composition keine brauch
bare Beeinflussung der Expression von zelleigenen Genen
erreicht werden kann.
Um Zellspezifität zu erreichen, können Nukleinsäuren
nicht-kovalent an Konjugate aus Proteinen und Polykationen
gekoppelt werden (Wu und Wu, J. Biol. Chem. (1987), 4429-
4432, J. Biol. Chem. 263 (1988), 14621-14624). Danach
erfolgt die Einschleusung von fremder DNA in Zellen mit
Hilfe eines löslichen DNA-Trägersystems, das aus einem
chemisch synthetisierten Konjugat mit Mannose und Lactose
als Liganden (P. Midoux et al, Nucleic Acid Res. 21 (1993)
871-878) besteht. In der EP-A 0 388 758 werden chemisch
synthetisierte Transferrin Polykation-Konjugate offenbart,
die mit polyanionischen Nukleinsäuren Komplexe bilden.
Durch Bindung an den Transferrinrezeptor können diese
Komplexe in Zielzellen eingeschleust werden.
Die Verwendung von Konjugaten aus Polylysin und Asialo
glycoprotein (Wu et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 14621
-14624) oder mit einem Galactoseliganden (Plank et al.,
Bioconjugate Chem., 3, (1992), 533-539) ist ebenfalls
bekannt. Als Liganden wurden auch inaktivierte Adenoviren
(Cotten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, (1992),
6094-6098, Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89
(1992) 6099-6103) oder Hämagglutininfusionspeptide
(Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, (1992),
7934-7938) verwendet. Wesentliche Nachteile dieser
Konjugate sind jedoch, daß sie schwierig in reproduzierba
rer Form herzustellen sind, ausgeprägte Immunreaktionen
hervorrufen und keine befriedigende Effizienz, insbesonde
re zum Transfer von größeren Nukleinsäuren, wie Vektoren,
zeigen. In der WO 93/07283 wird ebenfalls zum nichtviralen
Gentransfer ein "′2-Liganden-System" aus DNA-bindendem
(polykationischen)-Anteil (Nukleinsäure-affine Substanz)
und einem Internalisierungsfaktor zur Aufnahme der DNA in
die Zelle beschrieben. Als Beispiel wird ein
Polylysin-Transferrin-Komplex genannt. Diese DNA-haltigen
Komplexe werden über Endozytose in die Zellen aufgenommen.
Die Effektivität des Verfahrens ist jedoch nicht befriedi
gend. Außerdem besteht die Möglichkeit, daß die Komplexe
bei der Internalisierung in Lysosomen gelangen und abge
baut werden, bevor die DNA den Zellkern erreicht.
Zur Freisetzung der Komplexe aus den Endosomen ins Cyto
plasma wird in der WO 93/07283 diesen Komplexen ein soge
nanntes endosomolytisches Mittel zugesetzt, welches
beispielsweise einem Virus oder einer Viruskomponente ent
spricht (z. B. Adenovirus oder Influenza-Hämagglutinin).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es somit,
Nukleinsäure-transferpeptide zur Verfügung zu stellen,
welche einfach herzustellen sind, Nukleinsäuren mit hoher
Effizienz in Zellen transportieren können, die Effizienz
der stabilen Gentransformation verbessern, geringe Immun
reaktionen hervorrufen und in der Zielzelle gut abbaubar
sind.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein
Nukleinsäure-transferpeptid, welches enthält:
- a) einen ersten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid, Steroid, Kohlenhydrat, Lipid oder Vitamin, welcher an einen Bindepartner auf der Zellober fläche von eukaryontischen Zellen bindet und dabei eine Endozytose des Komplexes aus dem genannten Nukleinsäure-transferpeptid und einer Nukleinsäure auslöst,
- b) einen zweiten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid, Steroid, Kohlenhydrat, Lipid oder Vitamin, welcher an einen Bindepartner auf der äußeren Kernmembran von eukaryontischen Zellen bindet,
- c) einen dritten Liganden, welcher ein basisches Pep tid ist und durch ionische Wechselwirkung an Nukleinsäuren bindet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Komplex, der
ein erfindungsgemäßes Peptid und eine durch ionische
Wechselwirkung gebundene Nukleinsäure enthält. Die
Nukleinsäure, die einen Komplex mit dem Protein bildet,
kann eine lineare, zirkuläre, einzel- oder doppelsträngige
DNA oder RNA, triple-helix DNA, ein DNA-RNA-Hybrid oder
PNA sein. Ferner kann die Nukleinsäure auch chemisch modi
fiziert sein, sofern die negative Ladung der Phosphat
gruppen soweit erhalten bleibt, daß die ionische Bindung
zum erfindungsgemäßen Fusionspolybindepeptid erhalten
bleibt. Derartige Nukleinsäurederivate sind beispielsweise
Thioate und Dithioate. Weitere Derivate sind beschrieben
in Uhlmann und Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 544-
584, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand
der Offenbarung ist.
Nukleinsäuren mit chemisch modifizierten Nukleotidbasen,
z. B. RNA-Moleküle, bei denen die 2′-OH-Gruppe in einem
oder mehreren Nukleotiden durch eine O-Alkylgruppe,
O-Allylgruppe, Halogengruppe oder andere Modifizierungs
gruppen ersetzt ist, sind ebenfalls geeignet.
Vorzugsweise ist die in die eukaryontische Zielzellen
einzuschleusende Nukleinsäure eine DNA oder eine ggf.
modifizierte RNA. Die in die Zielzelle eingeschleuste
Nukleinsäure kann beispielsweise genetische Informationen
enthalten, die in der Zielzelle zur Beseitigung von gene
tisch bedingten Defekten exprimiert werden können. Ebenso
kann die in die Zielzelle einzuschleusende Nukleinsäure
auch Antisenseeigenschaften (Komplementarität zu einer in
der Zielzelle vorliegenden mRNA) zur Hemmung der Expres
sion von spezifischen Genen in der Zielzelle besitzen.
Ebenso kann die einzuschleusende Nukleinsäure ein Ribozym
sein, welches in spezifischer Weise RNA der Zielzellen
spaltet. Derartige Ribozyme sind beispielsweise in Rossy
und Sarver, TIBtech 8 (1990) 179-183 beschrieben, wobei
der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenba
rung ist. Die Einführung von Antisense- oder Ribozymnu
kleinsäuren in spezifische Zielzellen kann, insbesondere
bei der Therapie viraler Erkrankungen, wie z. B. AIDS,
eine wichtige Rolle spielen. Die Einführung der Nuklein
säure kann dabei mit dem Ziel erfolgen, eine dauerhafte
oder transiente Expression des eingeführten Gens bzw.
mehrerer Gene oder einer Antisense-Sequenz zu erreichen.
Zur weiteren Verbesserung der Einschleusung der Nuklein
säure in eukaryontische Zellen können Hilfsmittel zur
Zellfusion zugesetzt werden.
Bevorzugt werden die Nukleinsäure-Transferpeptide zur
Einschleusung von Nukleinsäuren verwendet, mit denen eine
Regulation der endogenen Genexpression in der eukaryonti
schen Zielzelle sowohl in vivo als auch in vitro erfolgen
kann. Diese Regulation erfolgt durch Insertion von
geeigneten Nukleinsäureelementen in das Genom durch homo
loge Rekombination. Eine hierfür geeignete Nukleinsäure
enthält ein DNA-Regulationssegment, welches in der Lage
ist, die Expression des zu regulierenden Gens zu modulie
ren, wenn es operativ an dieses Gen gekoppelt ist, sowie
ein DNA-Targeting-Segment, welches homolog zu einer Region
innerhalb oder in der Nähe des zu modulierenden Gens ist.
Bei der homologen Rekombination wird dieses Konstrukt in
das Genom so insertiert, daß das Regulationssegment opera
tiv mit dem zu modulierenden Gen verbunden ist. Verfahren
zur homologen Rekombination sind beispielsweise in der WO
91/09955 und bei Thomas und Capecchi, Cell 51 (1987), 503
-513 beschrieben, wobei der Gegenstand dieser Publika
tionen Gegenstand der Offenbarung ist. Es hat sich
gezeigt, daß bei Verwendung der erfindungsgemäßen
Nukleinsäure-Transferpeptide die homologe Rekombination
effektiv erfolgt.
Als Gene sind vorzugsweise Markergene (z. B. Resistenzgene
für Neomycin, HPRT, tk), Selektionsgene (z. B. für Metho
trexat) oder funktionell aktive, in eukaryontischen Zellen
exprimierbare Gene geeignet.
Vorzugsweise ist die einzuschleusende Nukleinsäure ein
Vektor, der eine exogene Nukleinsäure trägt (z. B. Plasmide
oder Cosmide). Üblicherweise sind die drei Liganden des
Nukleinsäure-transferpeptides kovalent aneinander gebun
den. In einer bevorzugten Ausführungsform des Komplexes
sind die Liganden über die zu transferierende Nukleinsäu
re miteinander verbunden. Dabei ist die Nukleinsäure also
ein bi- oder multifunktioneller Bindepartner für die
Liganden. Dies bedeutet, daß beispielsweise eine Verbin
dung, welche aus erstem und drittem Ligand besteht, und
eine weitere Verbindung, die aus zweitem und drittem
Ligand besteht, über ionische Wechselwirkungen zwischen
drittem Ligand und Nukleinsäure komplex gebunden sind.
Weitere Varianten wie Komplexe aus Nukleinsäure mit einer
Verbindung aus den Liganden 1/2/3 und einer Verbindung aus
den Liganden 3/4 sind ebenfalls geeignet. Dabei sind
demnach mindestens zwei Liganden über die Nukleinsäure
gebunden.
Besonders bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäu
retransferpeptide zur Einschleusung von RNA, Ribozymen und
kurzkettigen Oligonukleotiden (z. B. Antisense-Sequenzen)
bis ca. 30 Nukleotiden Länge geeignet. In diesen Fällen
sind auch Nukleinsäuretransferpeptide ohne den zweiten,
kernbindenden Liganden zur Komplexierung von DNA und zur
erfindungsgemäßen Verwendung geeignet. Derartige Komplexe
besitzen eine überraschend hohe Serumstabilität und
Stabilität in Säugerzellen. Mit diesen Komplexen ist
vorzugsweise ein Verfahren zur Bestimmung der Prolifera
tionshemmung durch RNA, Ribozyme und kurzkettige Oligonu
kleotide (z. B. Antisense-Sequenzen) möglich. Bei diesem
Verfahren werden die Zellen, vorzugsweise Tumorzellen, mit
den Komplexen inhibiert und nach Weiterkultivierung der
Zellen (mehrere Stunden oder Tage) die Anzahl der gebilde
ten Zellen oder DNA-Menge nach dem Fachmann geläufigen
Verfahren bestimmt. Die Bestimmung der DNA-Menge erfolgt
beispielsweise über Anfärbung mit Ethidiumbromid oder MTT
(Beispiel 6).
Die im erfindungsgemäßen Nukleinsäure-transferpeptid ver
wendeten und an Bindepartner auf Zelloberflächen bzw. an
die äußere Kernmembran bindende Liganden sind Peptide,
Steroide, Kohlenhydrate, Lipide oder Vitamine. Die Aufgabe
der Liganden besteht darin, den Komplex aus Nukleinsäure
und Peptid an Zelloberflächenrezeptoren, Zelloberflächen
moleküle, Zelladhäsionsmoleküle, Zellmembranen bzw. die
äußere Kernmembran zu binden.
Besonders bevorzugt werden als erste Liganden Peptide mit
kurzen Sequenzen verwendet, beispielsweise das Peptid RGD,
welches eine Bindungsstelle für den Integrinrezeptor an
Zelloberflächen darstellt oder die gp120-Bindungsstelle.
Weitere geeignete erste Liganden sind beispielsweise
die Bindedomänen von Wachstumsfaktoren, Hormonen, viralen
Antigenen, Toxinen, Lipoproteinen und deren kurzkettige
Fragmente, welche ebenfalls an Bindepartner an Zellober
flächen binden. Bevorzugt als Wachstumsfaktoren werden CSF
(Colony stimulierende Faktoren), NGF (nerve growth
nactor), PDGF (platelet derived growth factor), EGF (epi
dermal growth factor) verwendet. EGF-analoge Bindedomänen
finden sich in einer Vielzahl von Proteinen (R.F.
Doolittle, CSH Symp. 51 (1986), 447), wobei der Inhalt
dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.
Ebenfalls bevorzugt als Peptide sind Lectine und deren
kurzkettige Fragmente, die an Kohlenhydratstrukturen an
Zelloberflächen und Kernmembranen binden (Übersicht vgl.
J. C. Paulson, The Receptors, Vol. 2 (1985), P. M. Conn,
Ed., Academic Press N. Y.).
Als Steroide sind bevorzugt Progesteron, Androgen,
Östrogen.
Als Kohlenhydrate sind bevorzugt Galactose, Mannose-6-
phosphat, Mannose, Lewis-X-Kohlenhydrate, Glucose, Fucose.
Als Lipide sind bevorzugt Fettsäuren und Arachidonsäure.
Als Vitamine sind bevorzugt Vitamin A oder D3.
Als zweiter Ligand sind Peptide, Steroide, Kohlenhydrate,
Lipide oder Vitamine geeignet, welche eine Bindung des
Nukleinsäure-transferpeptides an die äußere Kernmembran
von eukaryontischen Zellen vermitteln.
Geeignete Peptide sind beispielsweise von De Robertis,
Nature 272, 1978, 254-256 und Dingwall, Cell 30 (1982),
449-458 beschrieben, wobei der Inhalt dieser Publika
tionen Gegenstand der Offenbarung ist. Als Sequenzmotiv
bekannt ist beispielsweise PKKKRKV (SEQ ID No. 1),
(Lanford und Butel, Cell 37 (1984), 801-813). Die
Effektivität eines Nukleinsäurebindepeptids, welches
dieses Motiv als zweiten Liganden enthält, kann noch
gesteigert werden durch Ergänzung um 15 Aminosäuren,
welche unmittelbar an dieses Motiv im SV40 T-Antigen
anschließen (Rihs und Peters, EMBO J. 1989, 1479-1484),
wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der
Offenbarung ist. Es ist ebenfalls bevorzugt, Modifika
tionen, wie beispielsweise eine Phosphorylierung, in
diesen Motiven anzubringen, wodurch die Effektivität
gesteigert werden kann (McVey, Nature 341 (1989) 503-507
und Rihs et al., EMBO J. 10 (1991) 633-639), wobei der
Inhalt dieser Publikationen Gegenstand der Offenbarung
ist.
Ein weiteres Peptidmotiv, welches als zweiter Ligand
geeignet ist, ist die Sequenz KRPAATKKAGQAKKKKL (SEQ ID
NO. 2) sowie Modifikationen davon, vgl. Tabelle 2 (Robbins,
Cell 64 (1991), 615-623). Weiter geeignete Proteine sind
das H3/H4-Bindeprotein N1 von Xenopus (Kleinschmidt und
Seiter, EMBO J. 7 (1988), 1605-1614, wobei der Inhalt
dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.)
und Polymerase 1 des Influenzavirus (Nath und Nayak, Mol.
Cell Biol. 10 (1990), 4139-4145, wobei der Inhalt dieser
Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.). Weitere
als zweiter Ligand geeignete Peptidmotive sind in Tabelle
1 genannt. Ein wesentliches Merkmal von Peptidmotiven,
welches als zweiter Ligand geeignet sind, ist, daß diese
Peptide eine Vielzahl von basischen Aminosäuren enthalten
sollten.
Eine weitere von dem SV40 T-Antigen abgeleitete Sequenz
ist VSKRPRP (SEQ ID NO. 3) (Richardson, Cell 44 (1986), 77
-85). Weitere geeignete Motive finden sich im Influenza
virus non structural protein (Greenspan, J. Virol. 62
(1988), 3020-3026, wobei der Inhalt dieser
Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.), Adeno
virus DNA-Bindeprotein (Morin, Mol. Cell Biol. 9 (1989),
4372-4380, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung
Gegenstand der Offenbarung ist.), Hefe MATa2, Glucokorti
koidrezeptor (Garcia-Bustos, Biochim. Biophys. Acta, 1071
(1991) 83-101, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung
Gegenstand der Offenbarung ist.)
Vorzugsweise ist das Peptidmotiv im Nukleinsäure-transfer peptid mehrfach enthalten.
Vorzugsweise ist das Peptidmotiv im Nukleinsäure-transfer peptid mehrfach enthalten.
Der Glucokortikoidrezeptor ist ein Protein mit einem Zink
finger, welches an DNA binden kann und vorzugsweise in
Gegenwart von Glucokortikoid die Bindung an die äußere
Kernmembran vermittelt. Bei Verwendung von Motiven aus dem
Glucokortikoidrezeptor ist es also bevorzugt, Glucokorti
koide, welche auch kovalent an das erfindungsgemäße Peptid
gekoppelt sein können, zuzusetzen. Der Glucokortikoidre
zeptor enthält zwei geeignete Motive (nuclear localizing
sequence (NLS1, NLS2), Picard und Yamamoto, EMBO J. 6
(1987), 3333-3340, wobei der Inhalt dieser Veröffentli
chung Gegenstand der Offenbarung ist). NLS1 besteht aus 28
Aminosäuren.
Aus dem humanen Östrogenrezeptor (Picard, Cell Regul. 1
(1990), 291-299, wobei der Inhalt dieser Veröffentli
chung Gegenstand der Offenbarung ist.) ist die Domäne der
Aminosäuren 256-303 als zweiter Ligand bevorzugt.
Weiter bevorzugt ist, als zweiter Ligand die targeting-
Signale von Nucleoplasmin E1A und SV40 large T-Antigen zu
verwenden (Yamasaki, Mol. Cell Biol. 9 (1989) 3028-
3036, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand
der Offenbarung ist). Nucleoplasmin enthält ein Motiv,
welches aus zwei basischen Aminosäureresten besteht,
gefolgt von einem Spacer von zehn anderen Resten und einem
Cluster von 5 Aminosäuren von denen 4 basisch sind.
Unter dem dritten Ligand ist eine Polyaminosäure (im
weiteren auch mit Motiv bezeichnet) zu verstehen, welche
spezifisch oder unspezifisch Nukleinsäuren in kleinen
definierten Domänen und unabhängig vom sonstigen Aufbau
der Nukleinsäure erkennt. Einige dieser Erkennungsmotive
sind in Transkriptionsfaktoren und chromosomalen Proteinen
enthalten.
Beispielsweise zu finden sind derartige Motive, welche
Serin, Prolin und basische Aminosäuren enthalten, mehrfach
am Amino- und Carboxyende des Histons H1 und am Aminoter
minus des Histons H2B aus Seeigelsperma. Ein derartiges
Motiv ist beispielsweise STPKRKR (SEQ ID NO. 4). Von
Suzuki, EMBO J. 8 (1989), 797-804 (wobei der Inhalt
dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung
ist) wurde beispielsweise gezeigt, daß ein Fragment des
Aminoterminus des A1-Histons von Seeigelsperma 6 SPKK-
repeats (S6-Peptid) sowie ein S2-Peptid, welches zwei
repeats enthält, an AT-reiche DNA-Sequenzen bindet.
Reeves und Nissen, J. Biol. Chem. 265 (1990), 8573-8582,
wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der
Offenbarung ist, zeigten, daß ein Konsensuspeptid aus HMG-
1 non-Histon-chromosomales Protein A mit der Sequenz
TPKRPRGRPKK (SEQ ID NO. 5) an AT-reiche DNA-Sequenzen
bindet. Eine verkürzte Version dieses Peptids (KRPRGRPK,
SEQ ID NO. 6, nicht jedoch PRGRP, SEQ ID NO. 7) bindet
ebenfalls an DNA.
Ebenso bekannt sind α-helicale Elemente von Proteinen, die
an DNA binden. Eine derartige Region des E.coli-Proteins
RecA ist in Zlotnick und Brenner, J. Mol. Biol. 209 (1989)
6551-6561 beschrieben, wobei der Inhalt dieser
Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist. Ein 24-
Aminosäurenprotein des Aminoterminus von RecA hat eine α-
helicale Struktur und bindet vorzugsweise an einzelsträn
gige DNA.
Eine Sequenzfolge, die häufig am Carboxyterminus des
Histons H1 auftritt, ist das Alanin/Lysin-Motiv. Eine
Variante des Histons H1 aus Seeigelsperma hat ein 57-
Aminosäure großes Segment, welches Alanin und Lysin reich
und frei von Prolinresten ist. Es ist am Carboxyterminus
unmittelbar nach der globulären Domäne lokalisiert und bei
Wells and McBride, Nucleic Acids Res. 17 (1989) r311-
r346 und Hill et al., EMBO J. 8 (1989), 2591-2599
beschrieben, wobei der Inhalt dieser Publikationen
Gegenstand der Offenbarung ist. CD-Experimente haben
gezeigt, daß dieses Segment in Lösung helical strukturiert
ist und an doppelstrangige DNA bindet (Hill 1989). Die
Verteilung basischer Reste in der α-Helix unterscheidet
sich von der Verteilung im RecA-Peptid. Die basischen
Reste sind an zwei gegenüberliegenden Seiten der Helix
lokalisiert. Dazwischen, insbesondere auf einer Seite,
sind cluster von Alanin-Resten zu finden. Da damit auf
gegenüberliegenden Seiten basische Reste konzentriert
sind, verbrückt dieses Motiv bevorzugt zwei doppelsträngi
ge helicale DNA-Segmente.
Ein weiteres DNA-Bindeprotein, welches ein α-helicales
Segment zur DNA-Erkennung verwendet, ist Serumamyloid P
(SAP), ein Mitglied der Pentraxin-Familie (Turnell et al.,
FEBS Lett. 232 (1988), 263-268, wobei der Inhalt dieser
Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist.). SAP
bindet sowohl an DNA als auch Nukleosomen-Core-Regionen.
Proteinsequenzen aus anderen Pentraxinen und Histonen
können ebenfalls identifiziert werden als DNA-
Bindedomänen. Eine Konsensussequenz, welche sowohl in
Pentraxinen als auch Histonen enthalten ist, ist
P-V(RK) (KR)(SGA)L(RK) (KNQ)G.
Dieser Konsensus ist bei Turnell (1988) beschrieben. Es
wird vermutet, daß die drei oder vier basischen Reste,
welche auf einer Seite der Helix liegen, so positioniert
sind, daß sie mit zwei Phosphatresten der DNA eines
Strangs binden können und zwei andere Reste an einen ande
ren Strang binden, so daß eine käfigartige Struktur ent
steht. Diese Peptide binden bevorzugt an AT-reiche
Sequenzen (Churchill and Travers, Trends Biochem. Sci. 16
(1991), 92-97, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung
Gegenstand der Offenbarung ist.).
Schließlich finden sich Basissequenzen in einigen regula
torischen DNA-Bindeproteinen, wie z. B. GCN4 (Leucin-
Zipper und Helix-loop-Helixmotive), die eine α-helicale
Struktur besitzen (Talanian et al., FEBS Lett. 232 (1988),
263-268, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung
Gegenstand der Offenbarung ist.).
Ebenfalls als Nukleinsäurebindeproteine sind Zink-ligierte
Proteine bekannt. Bisher sind mindestens vier verschiedene
Gruppen zinkbindender Proteindomänen bekannt. Die erste
ist die Gruppe des klassischen "Zinkfingers", ein etwa 30
Aminosäure großer Modul mit einem Zinkion, welches über
zwei Cysteine und zwei Histidine ligiert ist (Miller et
al., EMBO J. 4 (1985), 1609-1614, Brown et al., FEBS
Lett. 186 (1985), 271-274, wobei der Inhalt dieser
Publikationen Gegenstand der Offenbarung ist.). Beispiels
weise ist in TFIIA ein Sequenzmotiv von 30 Aminosäuren
neunmal wiederholt. Das Zinkfingermotiv ist durch vier
Metalliganden definiert (Konsensus Cys-X2-5, Cys-X12,13-
His-X2-5-His) und drei konservierten hydrophoben Resten.
Zweidimensionale NMR-Studien (Lee et al., Science 245
(1989), 635-637, Neuhaus et al., FEBS Lett. 262 (1990),
179-184, wobei der Inhalt dieser Publikationen
Gegenstand der Offenbarung ist.
) zeigten, daß jedes der 30 Reste großen Motive zu einer
unabhängigen Domäne mit einem einzigen Zinkion, vierfach
komplexgebunden, faltet, welches zwischen ein antiparalle
les β-Sheet und eine kurze α-Helix eingelagert werden
kann.
Die zweite zinkenthaltende Domäne ist eine etwa 80 Amino
säure große Domäne, welche in den Rezeptoren für steroide
und hormonähnliche Moleküle gebunden wird. Diese Domäne
enthält zwei Zinkionen. Jedes Zinkion ist über vier
Cysteine ligiert (Freedman et al., Nature 334 (1988), 543
-546, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand
der Offenbarung ist.). Im Gegensatz zu dem C₂-H₂-Zinkfin
germotiv fehlen konservierte hydrophobe Reste, und der
Abstand zwischen den zwei Motiven ist etwas größer (15
Reste im Vergleich zu ca. 4 bis 8 bei TFIIA).
Ein Vergleich der Strukturen der DNA-Bindedomänen des Glu
cokortikoid und Estrogenrezeptors (Härd et al., Science
249 (1990), 157-160), Schwabe et al., Nature 348 (1990)
458-461 wobei der Inhalt dieser Publikationen Gegenstand
der Offenbarung ist.) mit dem klassischen C₂-H₂-Zinkfin
gern zeigt, daß die sekundäre und tertiäre Struktur sich
unterscheiden.
Die dritte Domäne wird in Hefeaktivatoren, wie z. B. GAL4,
gefunden. Diese Domänen enthalten zwei engbenachbarte
Zinkionen, die über 6 Cysteine komplexiert sind (Pan und
Coleman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 2077-
2081, wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand
der Offenbarung ist.). Die DNA-Bindedomäne ist am Amino
terminus lokalisiert. Die Reste 1-74 sind ausreichend
für die Erkennung und ein etwas größeres Fragment (1-
147) enthält weitere Stellen, welche die spezifische Affi
nität erhöhen.
Die sog. GATA-Bindeproteine, welche den hämotopoetischen
Regulationsfaktor GATA-1 einschließen, enthalten eine
vierte Klasse von zinkhaltigen Domänen, welche DNA erken
nen und binden (Orkin, Cell 63 (1990), 665-672, wobei
der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenba
rung ist.).
Weiter sind zwei verschiedene Klassen von zinkhaltigen
Proteindomänen bekannt, welche RNA erkennen. Der erste Typ
wird in den retroviralen gag-Proteinen gefunden, welche an
virale genomische RNA bindet (Surovoy et al., J. Mol.
Biol. 229 (1993), 94-104, wobei der Inhalt dieser
Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist). Analoges
gilt für das tat-Protein von verschiedenen Retroviren, wie
z. B. HIV (Frankel et al., Science 249 (1988), 70-73,
wobei der Inhalt dieser Veröffentlichung Gegenstand der
Offenbarung ist).
Schließlich ist eine Vielzahl weiterer nukleinsäurebinden
der Proteine bekannt, welche nicht in diese Klassen einor
denbar sind, deren nukleinsäurebindenden Motive jedoch für
die Erfindung geeignet sind. Beispielsweise sind dies der
Heat-shock-factor, virale Aktivatoren, Nukleokapsidpro
teine von Viren. Eine weitere Gruppe sind die sog. Genom
linked-Proteine (VPg), welche in Pikornaviren enthalten
sind und kurze Peptide (20-25 Aminosäuren), z. B. VPg3
aus dem Maul- und Klauenseuchenvirus,
GPYEGPVKKPVALKVKAKNLIVTE (SEQ ID NO. 8), welches kovalent
an RNA bindet, wobei statt M auch N geeignet ist. Diese
Peptide sind jedoch auch in der Lage, mit Nukleinsäuren
ionisch zu wechselwirken.
Falls erster und zweiter Ligand Peptide sind, ist es
vorteilhaft, wenn der erste Ligand 2-100, der zweite
Ligand 2-20, der dritte Ligand 3-100 und das Nukle
insäure-transferpeptid 10-250 Aminosäuren lang sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungs
gemäße Nukleinsäure-transferpeptid ein viertes Peptid oder
Lipid enthalten, welches die Auflösung der bei der Endozy
tose entstandenen Endosomen beschleunigt und vorzugsweise
10-40 Aminosäuren lang ist. Geeignete Peptide sind
beispielsweise beschrieben in Wagner et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89 (1992), 7934-7938 und Kamata et al.,
Nucl. Acid. Res. 22 (1994), 536-537, wobei der Inhalt
dieser Publikationen Gegenstand der Offenbarung ist.
Die Herstellung der Nukleinsäure-transferpeptide erfolgt
nach den dem Fachmann geläufigen Methoden. Falls es sich
um ein reines Peptid handelt, können die üblichen Methoden
zur Peptidsynthese angewendet werden. Üblicherweise wird
hierzu die das C-terminale Ende bildende Aminosäure an
einen Träger gebunden, vom C-Terminus das Peptid schritt
weise aufgebaut und dieses anschließend vom Träger abge
spalten.
Im einzelnen wird dazu eine Aminosäure, beispielsweise
über ihre Carboxygruppe an ein unlösliches, leicht fil
trierbares Polymer gebunden und dann vom C-terminalen Ende
her die Peptidkette schrittweise aufgebaut. Zu diesem
Zweck wird eine N-geschützte Aminosäure mit einer reakti
ven Gruppe eines Kunstharzes zur Reaktion gebracht. Von
der am Trägerpartikel kovalent verankerten Aminosäure wird
die N-α-Schutzgruppe entfernt und das resultierende Amino
acylpolymer mit der nächsten N-geschützten Aminosäure
umgesetzt. Von dem am Trägerharz kovalent gebundenen
Dipeptid wird die N-α-Schutzgruppe entfernt und das resul
nierende Aminoacylpolymer mit der nächsten N-geschützten
Aminosäure umgesetzt. Alle überschüssigen Reagentien und
Beiprodukte werden durch einfaches Filtrieren entfernt.
Ist die gewünschte Peptidsequenz auf diese Weise herge
stellt, wird die kovalente Bindung zwischen der C-termina
len Aminosäure und der Ankergruppe des polymeren Trägers
gespalten. Der unlösliche Träger wird durch einfache
Filtration von dem in Lösung befindlichen Peptid entfernt.
Das Peptid kann mittels chromatographischer Methoden
gereinigt werden. Derartige Verfahren sind beispielsweise
bei Merryfield, JACS 85 (1964) 2146, wobei der Inhalt
dieser Veröffentlichung Gegenstand der Offenbarung ist,
beschrieben. Dabei kann das gewünschte Peptid auch in
Fragmenten synthetisiert und die Fragmente durch
Peptidbindungen ligiert werden.
Ebenso können die Peptide rekombinant, durch die dem
Fachmann geläufigen Methoden, hergestellt werden.
Die Bindung von nicht peptidischen Liganden und Zell
oberflächen-integrierenden Substanzen (z. B. Kohlenhydra
te, Lipide, Vitamine, Steroide) kann nach Synthese des
Peptidanteils des erfindungsgemäßen Peptids oder während
der Synthese des Peptidanteils erfolgen. Zur Bindung an
Peptide werden die Liganden und Substanzen vorher zweck
mäßig aktiviert. Geeignete Aktivierungsreagentien sind dem
Fachmann bekannt, beispielsweise kann Di-cyclohexyl
carbodiimid verwendet werden. Zweckmäßig werden Carbonyl
gruppen der Liganden und Substanzen in Aktivester modifi
ziert.
Ein erfindungsgemäßer Komplex kann verwendet werden zur
Herstellung eines Therapeutikums zur Behandlung von vira
len Infektionen, zur Gentherapie, zur Stimulierung der
Immunreaktion gegen maligne Zellen bzw. Tumoren, zur
Expression von Faktoren (Proteine), zur Zellmarkierung und
zur Zell-Integration von Genen, welche für Proteine codie
ren, die in die Zelloberfläche integriert werden.
Zur Herstellung eines Therapeutikums wird der Komplex aus
nukleinbindendem Peptid und DNA nach den dem Fachmann
geläufigen Methoden in eine applizierbare Form überführt.
Falls der Komplex intramuskulär oder subkutan gegeben
werden soll, kann er beispielsweise in physiologischer
Kochsalzlösung gelöst sein. Zur intranasalen oder intra
okularen Applikation kann das Therapeutikum beispielsweise
in Form eines Sprays oder einer wäßrigen Lösung angewendet
werden. Für lokale oder orale Gaben ist es häufig erfor
derlich, das Therapeutikum gegen Inaktivierung zu schüt
zen, beispielsweise gegen proteolytische Enzyme in der
Mundhöhle oder im Magen. Ein derartiger vorübergehender
Schutz kann beispielsweise durch Verkapselung der erfin
dungsgemäßen Peptide (Komplexe) erfolgen. Die Verkapselung
kann beispielsweise durch Überziehen mit einem Schutzman
tel (Mikroverkapselung oder Einbettung einer Vielzahl von
erfindungsgemäßen Peptiden (Komplexen) in einen schützen
den Träger (Makroverkapselung)) erfolgen.
Das Verkapselungsmaterial kann semipermeabel sein oder
beim Einbringen in den menschlichen oder tierischen Körper
semipermeabel werden. Üblicherweise wird für die Verkapse
lung eine biologisch abbaubare Substanz als Träger verwen
det.
Die Applikation der erfindungsgemäßen Peptide (Komplexe)
kann durch die dem Fachmann geläufigen Methoden erfolgen,
beispielsweise intradermal, intramuskulär, intraperito
neal, intravenös, subkutan, intranasal, in die Liquorräume
oder direkt in Tumorgewebe.
Die nachfolgenden Publikationen, Beispiele, Tabellen, das
Sequenzprotokoll und die Abbildung erläutern die Erfindung
weiter.
Tabelle 3 zeigt verschiedene Peptide, die in Teilsequenzen
hergestellt und anschließend ligiert wurden, und deren
Bindungskonstanten für verschiedene Nukleinsäuren.
Die einzelnen Peptide entsprechen folgenden SEQ ID NO:
F136-NCp7 | |
SEQ ID NO: 17 | |
F136-1-35 | SEQ ID NO: 18 |
AcRGD-1-35 | SEQ ID NO: 19 |
F136-1-Sp-35 | SEQ ID NO: 20 |
AcRGD-1-Sp5 | SEQ ID NO: 21 |
AcRGD-branched-1-Sp-35- | SEQ ID NO: 22 |
CD4-1-Sp-35 | SEQ ID NO: 23 |
AcRGD-VPg | SEQ ID NO: 24 |
Tabelle 4 zeigt bevorzugte Peptide, die als Liganden
geeignet sind (nach Robbins, Cell 64 (1991), 615-623).
Tabelle 5 zeigt weitere Beispiele für Peptidliganden
(1 + 3).
Fusion-1-Sp-35 | |
SEQ ID NO: 25 | |
AcRGD-Fusion-1-Sp-35 | SEQ ID NO: 26 |
AcRGD-NLS-1-Sp-35 | SEQ ID NO: 27 |
Galactoxyl-branched-1-Sp-35- | SEQ ID NO: 29 |
Fig. 1 zeigt ein an Östrogen gekoppeltes Peptid (SEQ ID
NO: 30), das als Ligand (1 + 3) geeignet ist.
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Die Peptide wurden mittels FMOC (Fluorenyloxycarbonyl)-
Festphasensynthese hergestellt. Die Synthese erfolgt an
einem Peptidsynthesizer ABI 430A (Applied Biosystems). Das
Peptid wurde an 0,4 g SASRIN-Harz, beginnend mit FMOC-
derivatisiertem Glycin durchgeführt. Die FMOC-Gruppen
wurden jeweils mit 25% Piperidin in DMF abgespalten. Die
Bindung der weiteren FMOC-geschützten Aminosäuren (5
Äquivalente) wurden schrittweise durchgeführt.
Die Freisetzung des Peptids vom Harz erfolgte mit 1%
Trifluoressigsäure in Dichlormethan in 15 Minuten bei
Raumtemperatur. Die Filtrate werden gesammelt, mit Di
chlormethan gewaschen und durch Zugabe von Diethylether
präzipitiert. Eine Nachfällung aus Ethylace
tat/Diethylether ergibt das FMOC-geschützte Peptid.
Das N-terminale Fragment von Fmoc-1-19 wurde an einem
Fmoc-Gly-Sasrin-Harz (0.4 g, 0.7 mmol/g; Bachem)
synthetisiert. Nach Behandlung des Harzes mit 25%
Piperidin in Dimethylformamid (DMF) zur Abspaltung der
Fmoc Gruppe, wurde jede Fmoc-Aminosäure (5 Äquivalent)
nacheinander mit Hilfe von O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-
1,1,3,3-tetramethyl-uronium-tetrafluorborate (TBTU)/
1-Hydroxybenzotriazol (HOBt)/Diisopropylethylamin
(DIPEA) (5 : 5 : 7.5 Äquiv.) eingeengt. Das mittlere
Fragment Fmoc-20-35 wurde nach dem gleichen Synthese
plan synthetisiert. Zur Einführung von Fmoc-Ala³⁰
wurde eine Doppelkupplung benutzt. Das geschützte
Fragment wurde mit 1% Trifluoressigsäure (TFA) in
Dichlormethan (CH2Cl2) (6 × 15 min) abgespalten. Die
Filtrate wurden gesammelt, mit Pyridin neutralisiert
und aus Diethylether gefällt. Die folgenden erneuten
Fällungen aus dem Ethylacetat/ Diethylethergemisch
ergaben die gewünschten geschützten Fragmente mit
einer Ausbeute von 63% bzw. 65%. Ein vollgeschütztes
C-terminales Fragment Fmoc-36-55 wurde am Fmoc-
Asn(Trt)-Wang-Harz (0.64 g, 0.39 mmol/g) aufgebaut. Es
wurden 6 Äquivalente jeder Aminosäure und die
TBTU/HOBt-Aktivierungsmethode benutzt. Doppelkupplun
gen wurden für Fmoc-Gln(Trt)-OH in Position 45 und
Fmoc-Arg(Pmc)-OH in Position 52 angewandt. Das mittle
re Fragment Fmoc-20-35 (0.1 mmol, 360 mg) wurde zusam
men mit äquivalenten Mengen von TBTU und HOBt und 0.15
mmol DIPEA wurden in 1 ml DMF gelöst. Nach 20 min
wurde das Reaktionsgemisch zu dem 36-55-Peptid-Harz
(0.036 mmol, 250 mg) gegeben. Nach 4 Stunden wurde das
Harz vorsichtig gewaschen. Das N-terminale Fragment
Fmoc-1-19 (0.08 mmol, 390 mg in 1 ml DMF) wurde unter
gleichen Bedingungen voraktiviert und über Nacht mit
dem 20-55-Peptid-Harz gekuppelt. Schließlich wurden
0.52 g des Fmoc-1-55-Peptid-Harzes erhalten. Ein Teil
dieses Peptid-Harzes wurde für eine Peptidabspaltung
verwendet. Das 1-55-Peptid wurde mit einer Mischung
von m-Cresol:Dimethylsulfid:Ethandithiol:TFA
(Trifluoressigsäure) (3 : 3 : 3 : 91 v/v) für 2 Stunden bei
20°C abgespalten. Das erhaltene Peptid wurde aus der
Mischung gefällt, mit Diethylether (× 5) gewaschen, in
Wasser gelöst und lyophilisiert. Weitere halbpräpara
tive HPLC Reinigung (HPLC an Nucleosil C18-Säule 8 ×
250 mm, Gradientenelution) des Rohpeptids resultierte
in HPLC reinem NCp7-1-55 Peptid mit der Ausbeute von
40% der Theorie (ausgehend von Asn⁵⁵ Harzbeladung).
Analyse:ES-MS-6443.5 (calc. 6444.54); RP HPLC Rt-
13.32 min (Nucleosil C18 4.6*150 mm; Gradient 10-70% B
in A in 30 min; B = 0.1% TFA in AcN; A = 0.1% TFA in
H₂O).
b) Das geschützte Peptidfragment Fmoc-136-156-Gly-OH
wurde auf die gleiche Weise wie das oben beschriebene
Fragment erhalten (1.a). 0.011 mmol (50 mg in 300 ml
DMF) von Fmoc-136-156-Gly-OH wurde innerhalb von 15
Stunden in einem DMF-Medium, dem TBTU/HOBt zugemischt
wurde, an das 1-55-Peptid-Harz (0.0034 mmol, 50 mg)
gekuppelt. Schließlich wurden 63 mg des Fmoc-136-156-
Gly-1-55-Peptid-Harz erhalten. Das erhaltene Peptid
wurde unter den gleichen Bedingungen abgespalten und
gereinigt, so daß HPLC-reines Peptid (11.5 mg;
Ausbeute: 38%) erhalten wurde.
Analyse: ES-MS-9044.8+1.5 (calc.: 9046.53); RP HPLC
Rt-21.22 min (Nucleosil C18 4.6+150 mm; Gradient 10-70%
B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA
in H₂O).
Fmoc Gly-Sasrin-Harz (100 mg, 0.65 mmol/g) wurde nacheinan
der mit 7 Äquivalent (0.45 mmol) von jeder Fmoc-Aminosäure
mit Hilfe der TBTU/HOBt/DIPEA Aktivierungsmethode
acyliert. Ein Teil des 1-35-Peptid-Harz wurde wie in
1.a. abgespalten. 1-35-Peptid wurde HPLC gereinigt
(Ausbeute: 55%).
Analyse: ES-MS-4109.19+0.2 (calc.: 4109.86); RP HPLC Rt- 12.89 min (Nucleosil C18 4.6+150 mm; Gradient 10-70% B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H₂O).
Analyse: ES-MS-4109.19+0.2 (calc.: 4109.86); RP HPLC Rt- 12.89 min (Nucleosil C18 4.6+150 mm; Gradient 10-70% B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H₂O).
b) 1-35-Peptid-Harz (50 mg, 0.005 mmol) wurde mit 3 Äqui
valent (0.015 mmol, 67 mg) von Fmoc-136-156-Gly-OH
geschütztem Peptidfragment nach der Methode wie in
1.b. beschrieben, acyliert. Nach HPLC-Reinigung wurde
des HPLC reines Peptid erhalten (Ausbeute: 13 mg,
52%).
Analyse: ES-MS-6709+1.5 (calc.: 6710.83); RP HPLC Rt-21.2 min (Nucleosil C18 4.6*150 mm; Gradient 10-70% B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H₂O).
Analyse: ES-MS-6709+1.5 (calc.: 6710.83); RP HPLC Rt-21.2 min (Nucleosil C18 4.6*150 mm; Gradient 10-70% B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H₂O).
a) 10 g von 2-Chlortritylchlorid-Harz (1.4 mmol/g;
Novabiochem) wurde mit 1.5 äquiv. Fmoc-Gly-OH unter
Standardbedingungen acyliert. Der Substitutionsgrad
war 0.65 mmol/g. 200 mg (0.13 mmol) des erhaltenen
Harzes wurde nacheinander wie in 2.a. beschrieben
acyliert. Die Fmoc-Gruppe wurde entfernt und das
Peptid-Harz mit Acetanhydrid acyliert. Das geschützte
Peptidfragment Ac-GRGDSPGSG wurde vom Harz abgespal
ten, indem es 1 Stunde mit einem Gemisch aus Essigsäu
re/Trifluorethanol/CH₂Cl₂ (1 : 2 : 7 v/v) behandelt wurde.
Die Filtrate wurden gesammelt und das Lösungsmittel
wurde zur Trockene im Vakuum eingedampft. Das Peptid
wurde aus tert.-Butylalkohol/Wasser (4 : 1, v/v) lyophi
lisiert.
b) 1-35-Peptid-Harz (32 mg, 0.0032 mmol) wurde innerhalb
von 15 h mit 0.0064 mmol (8.1 mg in 100 ml DMF) des
Ac-GRGDSPGSG-OH geschützten Fragments, das mit
TBTU/HOBt voraktiviert wurde, gekuppelt. Das Peptid-
Harz wurde wie in 1.b beschrieben aufgearbeitet.
Schließlich wurden 8.6 mg HPLC reines Peptid erhalten
(Ausbeute: 55%).
Analyse: ES-MS-4920.91+1.75 (calc.: 4922.65); RP HPLC Rt-13 min (Nucleosil C18 4.6*150 mm; Gradient 10- 70% B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H₂O).
Analyse: ES-MS-4920.91+1.75 (calc.: 4922.65); RP HPLC Rt-13 min (Nucleosil C18 4.6*150 mm; Gradient 10- 70% B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H₂O).
a) Fmoc-Gly-Wang-Harz (210 mg, 0.52 mmol/g; Novabiochem)
wurde nacheinander mit 10 Äquival. (1 mmol) von jeder
Fmoc-Aminosäure, die nach der TBTU/HOBt/DIPEA Methode
aktiviert wurde, acyliert. Eine Substanzprobe von 1-
SP-35-Peptid-Harz (40 mg) wurde abgespalten wie in
1.a. beschrieben. Nach der HPLC-Reinigung wurden 10.5
mg 1-SP-35-Peptid erhalten (Ausbeute: 73%).
Analyse: ES-MS-2701.14+1 (calc.: 2702); RP HPLC Rt- 13.7 min (Nucleosil C18 4.6*150 mm; Gradient 10-70% B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H₂O).
Analyse: ES-MS-2701.14+1 (calc.: 2702); RP HPLC Rt- 13.7 min (Nucleosil C18 4.6*150 mm; Gradient 10-70% B in A in 30 min; B = 0.1% TFA in ACN; A = 0.1% TFA in H₂O).
b) 1-Sp-35-Peptid-Harz (30 mg, 0.004 mmol) wurde mit 3
Äquivalenten des geschützten Fragments Fmoc-136-156-
Gly-OH acyliert wie unter 1.b beschrieben. Das erhal
tene Peptid wurde abgespalten und aufgearbeitet wie
unter 1.a beschrieben. Ausbeute: 12.7 mg, 60% der
Theorie; HPLC reines Produkt.
Analyse: ES-MS-5302.4 + 1.5 (berechnet 5303.21); RP HPLC Rt-21.29 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm Gradient 10-70% B in A in 30 min; B=0.1% Trifluores sigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
Analyse: ES-MS-5302.4 + 1.5 (berechnet 5303.21); RP HPLC Rt-21.29 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm Gradient 10-70% B in A in 30 min; B=0.1% Trifluores sigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
1-Sp-35-Peptid-Harz (50 mg, 0.0067 mmol), wie beschrieben
unter 4.a, wurde mit 2 Äquivalenten (17 mg, 0.0135 mmol)
Ac-GRGDSPGSG wie unter 3.b beschrieben, umgesetzt. Das
resultierende Peptid wurde abgespalten vom Harz, von den
Schutzgruppen befreit und aufgearbeitet wie oben beschrie
ben. Ausbeute:14 mg, 61% der Theorie, BPLC-rein.
Analyse: ES-MS-3514.5+0.7 (berechnet 3515.24); Rp HPLC Rt-14.9 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 10-40% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
Analyse: ES-MS-3514.5+0.7 (berechnet 3515.24); Rp HPLC Rt-14.9 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 10-40% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
a) Ausgehend von Fmoc-Gly-Sasrin-Harz (200 mg) wurde das
in den Seitenkettenfunktionen geschützte Fragment
Fmoc-PKKKRKVPGSG-OH (SEQ ID NO. 10) schrittweise
aufgebaut wie unter 2.a. beschrieben. Die Abspaltung
vom Harz erfolgte wie unter 1.b. beschrieben.
b) 1-Sp-35-Harz (50 mg, 0.0067 mmol) wurde mit 3 Äquiva
lenten geschützem Fragment Fmoc-PKKKRKVPGSG-OH (42 mg,
0.02 mmol) voraktiviert mit TBTU/HOBt in Dimethyl
formamid 150 ml innerhalb von 5 h acyliert. Die Fmoc-
Gruppe wurde abgespalten und das Peptid-Harz wurde mit
2 Äquivalenten Ac-GRGDSPGSG-OH (17 mg, 0.0134 mmol) 15
h wie unter 3.b. beschrieben umgesetzt. Nach Abspal
tung und Reinigung resultierte HPLC-reines Peptid.
Ausbeute: 25 mg, 80% der Theorie.
Analyse: ES-MS-4677+2 (berechnet 4678.43); RP HPLC Rt-15.16 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 10- 40% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressig säure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
Analyse: ES-MS-4677+2 (berechnet 4678.43); RP HPLC Rt-15.16 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 10- 40% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressig säure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
a) Die geschützte Peptidsäure Fmoc-GNQGSFLTKGPSKLDRAPGSG-
OH wurde ausgehend von Fmoc-Gly-Sasrin-Harz
hergestellt wie unter 1.a beschrieben.
b) Die Peptidsäure (31 mg, 0.08 mmol) wurde in Dimethyl
formamid (500 ml) aktiviert mit TBTU und innerhalb von
15 h an 1-Sp-35-Peptid-Harz (30 mg, 0.04 mmol) gekup
pelt.
Das Peptid wurde wie oben beschrieben vom Harz abge
spalten und mit HPLC gereinigt. Ausbeute: 4.5 mg,
22.5% der Theorie.
Analyse: ES-MS-4979+2.2 (berechnet 4980.75); RP HPLC Rt-18.5 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressig säure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
Analyse: ES-MS-4979+2.2 (berechnet 4980.75); RP HPLC Rt-18.5 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressig säure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
a) 1-Sp-35-Peptid-Harz (353 mg, 0.047 mmol) wurde
nacheinander acyliert mit jeweils 0.5 mmol Fmoc-Gly-OH
(zwei Kupplungen), Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (zwei Kupplungen)
und Boc-Lys(Fmoc)-OH mit Hilfe der TBTU/HOBT-Methode.
Die Fmoc-Gruppe wurde zuerst abgespalten und dann das
Peptid von einem Teil des Peptid-Harzes (35 mg,
0.00385 mmol). Nach Reinigung resultierte ein HPLC-
reines Peptid. Ausbeute: 15 mg, 75% der Theorie.
Analyse: ES-MS-3711+1.4 (berechnet 3711); RP HPLC Rt- 10.5 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 10-70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitri1; A = 0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
Analyse: ES-MS-3711+1.4 (berechnet 3711); RP HPLC Rt- 10.5 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 10-70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitri1; A = 0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
b) [Na-Boc-Lys]₄-Lys₂-Lys-Gly₂-1-Sp-35 Peptid-Harz wurde
mit Ac-GRGDSPGSG-OH (60.4 mg, 0.048 mmol) in Dimethyl
formamid (200 ml) mit Hilfe der TBTU/HOBT-Methode
innerhalb von 15 h acyliert. Nach Abspaltung des
Peptids vom Harz und Entfernung der Schutzgruppen
wurde nach Reinigung ein HPLC-reines Produkt erhalten.
Ausbeute: 12.5 mg, 75% der Theorie.
Analyse: ES-MS-6962.5+2.1 (berechnet 6963); RP HPLC Rt- 11 min (Nucleosil C 18; 4.6*150 mm; Gradient 10-70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
Analyse: ES-MS-6962.5+2.1 (berechnet 6963); RP HPLC Rt- 11 min (Nucleosil C 18; 4.6*150 mm; Gradient 10-70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
a) Es wurden zuerst die geschützten Peptidsäuren Fmoc-
GLFEAIAG-OH (SEQ ID NO. 13) und Fmoc-FIENGWEGMIDG-OH (SEQ
ID NO. 14) hergestellt. Diese entsprechen Teilen der
Sequenz des "Fusions-peptids" des Influenza Virus
Hämagglutinins. Die Peptidsäuren wurden analog zu den
Methoden hergestellt, die für das Peptid GRGDSPGSG verwen
det wurden.
b) Fmoc-FIENGWEGMIDG-OH (25.5 mg, 0.012 mmol) wurde mit
TBTU/HOBT in DMF (500 ml) aktiviert und innerhalb
von 15 h an das 1-Sp-35-Peptid-Harz (30 mg, 0.004
mmol) gekuppelt. Nach Abspaltung der Fmoc- Gruppe von
dem harzgebundenen Peptid wurde Fmoc-GLFEAIAG-OH (12.6
mg, 0.012 mmol) mit TBTU/HOBT in DMF/NMP (1 : 1) (1 ml)
aktiviert und angekuppelt. Ein Teil des so erhaltenen
Peptid-Harzes wurde zu einer Peptid- und Schutz
gruppenabspaltung eingesetzt.
Analyse: ES-MS-5175.2+0.8 (berechnet 5176.6); RP HPLC Rt-29.5 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressig säure in Acetonitril; A = 0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
Analyse: ES-MS-5175.2+0.8 (berechnet 5176.6); RP HPLC Rt-29.5 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressig säure in Acetonitril; A = 0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
c) Nach Abspaltung der Fmoc-Gruppe von der Hauptmenge des
Peptidharzes (nach 9.b.) wurde mit Ac-GRGDSPGSG-OH
(10.2 mg, 0.008 mmol) acyliert wie beschrieben. Nach
Abspaltung und Reinigung konnte ein HPLC-reines Peptid
erhalten werden.
Ausbeute: 4.2 mg.
Analyse: ES-MS-5766.11+0.8 (berechnet 5767.39); RP HPLC Rt-24 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 10-70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluores sigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
Ausbeute: 4.2 mg.
Analyse: ES-MS-5766.11+0.8 (berechnet 5767.39); RP HPLC Rt-24 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 10-70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluores sigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
a) Fmoc-Lys(Dde)-OH (Novabiochem) (29.8 mg, 0.056 mmol)
wurde zusammen mit äquivalenten Mengen an TBTU (18
mg), HOBT (8.4 mg) und Diisopropylethylamin (19.2 mg,
0.11 mmol) in DMF (150 ml) gelöst. Nach 20 min wurde
die Reaktionsmischung zu 1-Sp-35-Peptid-Harz (83 mg,
0.0112 mmol) gegeben. Nach 2 h wurde die Fmoc-Gruppe
abgespalten und an das resultierende Peptid-Harz wurde
das seitenkettengeschützte Ac-GRGDSPGSG (42mg, 0.0336
mmol) in DMF (200 ml) gekuppelt mit Hilfe von
TBTU/HOBT. Die Dde-Gruppe wurde mit 2% Hydrazin in DMF
innerhalb von 1 h entfernt.
b) β-Östradiol-6-on-6-(O-carboxymethyloxim) (4.6 mg,
0.0121 mmol; Fluka) wurde mit äquivalenten Mengen an
HOBT (1.8 mg), Diisopropylcarbodiimid (2 ml) in DMF
(100 ml) an Ac-GRGDSPGSG-Lys-1-Sp-35-Peptid-Harz
gekuppelt. Nach Abspaltung vom Harz und Entfernung der
Schutzgruppen wurde nach Reinigung ein HPLC reines
Steroid-Peptid erhalten. Ausbeute 6 mg.
Analyse: ES-MS-3984.2+0.7 (berechnet 3984); RP HPLC Rt-15.5 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressig säure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
Analyse: ES-MS-3984.2+0.7 (berechnet 3984); RP HPLC Rt-15.5 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressig säure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
Die freie Aminogruppe von Ac-GRGDSPGSG-Lys-1-Sp-35-Peptid-
Harz (50 mg, hergestellt nach 10.a) wurde acyliert mit 3
Äquivalenten Fmoc-PKKKRKVPGSG-OH (42 mg) in DMF (150 ml)
nach der Vorschrift in 6.6 und abgespalten.
Analyse: ES-MS-4846.09+0.8 (berechnet 4849.2); RP HPLC Rt-11.6 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 10-70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
Analyse: ES-MS-4846.09+0.8 (berechnet 4849.2); RP HPLC Rt-11.6 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 10-70% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluoressigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
a) D(+)Lactose Monohydrat (Fluka) (1.8 g, 5 mmol) wurden
mit gesättigter Ammoniumcarbonatlösung (40 ml) auf
30°C 6 Tage erwärmt. Dann wurde mit Wasser (20 ml)
verdünnt und die Lösung auf die Hälfte des Volumens
eingeengt. Dieser Vorgang wurde jedesmal wiederholt um
das überschüssige Ammoniumcarbonat zu entfernen.
Schließlich wurde lyophilisiert und der resultierende
Aminozucker wurde ohne weitere Reinigung zur Synthese
von Fmoc-Asn(Lactose)-OtBu eingesetzt. Dazu wurde
Fmoc-Asp-OtBu (Bachem) (480 mg, 1.17 mmol) und HOBT
(228 mg, 1.52 mmol) in DMF (5 ml) gelöst, dann wurde
bei 4°C Diisopropylcarbodiimid (205 mg, 1.63 mmol)
zugegeben. Nach 15 min Rühren bei 4°C und 20 min bei
25°C wurde 1-Aminolactose (5.85 mmol) in DMF/Wasser
(2 : 1, v/v, 6 ml) zu der Lösung des Aktivesters gege
ben. Nach 6 h Rühren wurde im Vakuum das Solvens
entfernt und Ether zugegeben. Das Produkt wurde abfil
triert, mit kaltem Ether und kaltem Wasser gewaschen.
Die tBu-Gruppe wurde mit TFA/Wasser (7 : 3, v/v) inner
halb von 20 min bei Raumtemperatur abgespalten. Nach
Verdampfen der Lösungsmittel in Vakuum wurde in tert-
Butylalkohol/Wasser (4 : 1, v/v) gelöst und lyophili
siert. Die Reinigung von Fmoc-Asn(Lactose)-OH erfolgte
über RP MPLC (LiChroprep C18, 25*310 mm, Merck;
isokratisch in 30% Acetonitril/Wasser/0.1% TFA).
Ausbeute: 280 mg, 35% der Theorie bezogen auf Fmoc- Asp-OtBu.
Analyse: (+)FAB-MS: MH+ 679 (berechnet 679), RP HPLC Rt-6.59 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 30- 100% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluores sigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
Ausbeute: 280 mg, 35% der Theorie bezogen auf Fmoc- Asp-OtBu.
Analyse: (+)FAB-MS: MH+ 679 (berechnet 679), RP HPLC Rt-6.59 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 30- 100% B in A innerhalb von 30 min; B=0.1% Trifluores sigsäure in Acetonitril; A=0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
b) Fmoc-Asn(Lactose)-OH (32.5 mg, 0.048 mmol) und HOBT
(7.25 mg, 0.05 mmol) wurden in DMF (200 ml) gelöst und
Diisopropylcarbodiimide (6.31 mg, 0.05 mmol) zugege
ben. Nach 30 min wurde die Aktivesterlösung zu Lys₄-
Lys₂-Lys-Gly₂-1-Sp-35-Peptid-Harz (30 mg, 0.0162
mmol) gegeben. Nach 15 h wurde das Peptid-Harz
gewaschen, das N-lactosylierte Peptid abgespalten und
mit semipräparativer HPLC gereinigt. Ausbeute 10.6
mg.
Analyse: ES-MS-5463.71+0.7 (berechnet 5463); RP HPLC Rt-11.6 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B-0.1% Trifluoressig säure in Acetonitril; A-0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
Analyse: ES-MS-5463.71+0.7 (berechnet 5463); RP HPLC Rt-11.6 min (Nucleosil C18; 4.6*150 mm; Gradient 10- 70% B in A innerhalb von 30 min; B-0.1% Trifluoressig säure in Acetonitril; A-0.1% Trifluoressigsäure in Wasser).
Die Analyse der Nukleinsäure-Bindung des Proteins (NC-
Protein), von Fragmenten des NC-Proteins sowie der
entsprechenden Peptidderivate erfolgte in Filterbindungs
tests (vgl. J. Mol. Biol. 34 (1968), 361-364, Nature 342
(1989), 816-819).
Es werden steigende Mengen Protein mit einer konstanten
Menge radioaktiv markierter Nukleinsäure in 100 µl Bin
dungspuffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 100 µM
ZnCl₂) 15 min bei 25°C inkubiert und anschließend über
Nitrozellulosefilter mit einer Porenweite von 0.45 µm
filtriert. Die Nitrozellulosefilter werden anschließend
zweimal mit je 1 ml Bindungspuffer gewaschen und die
gebundene Radioaktivität durch Szintillationszählung
bestimmt.
Als Test-Nukleinsäuren dient HIV-1 RNA (vgl. J. Mol. Biol.
229 (1993), 94-104), die während der in vitro Transkrip
tion durch Inkorporation von α-[³²P)-UTP radioaktiv mar
kiert wird. Außerdem werden 5′-³²P endmarkierte
Oligodesoxynukleotide verwendet.
Die Bestimmung der Dissoziationskonstanten erfolgt durch
Analyse der Bindungsdaten in doppelt reziproken Plots
(vgl. J. Mol. Biol. 34 (1968), 361-364) durch Auftrag
der reziproken relativen Sättigung (Ordinate) und der
reziproken Proteinkonzentration (Abszisse).
In einem typischen Experiment wird RNA mit einer Konzen
tration von 1.4 × 10-11 M, einzelsträngiges Desoxynukleo
tid mit einer Konzentration von 1.7 × 10-10 M und
doppelsträngiges Desoxynukleotid mit einer Konzentration
von 0.85 × 10-10 M eingesetzt. In kompetitiven Filterbin
dungstests werden die radioaktiv markierte Nukleinsäure
und steigende Mengen unmarkierter Kompetitor-Nukleinsäure
mit einer konstanten Protein-Konzentration inkubiert,
wobei die Proteinzugabe zuletzt erfolgt.
Als zu bindende Nukleinsäuren wurden verwendet:
ms2-RNA (30facher Überschuß), ssM13-DNA (70fach), dsM13- Rf-DNA (265fach).
ms2-RNA (30facher Überschuß), ssM13-DNA (70fach), dsM13- Rf-DNA (265fach).
Als nukleinsäurebindender Anteil des erfindungsgemäßen
Peptids wird eine Teilsequenz des NCp7-Proteins (T.L.
South, Biochemistry 30 (1991) 6342-6349) verwendet.
Dieses Peptid wird durch 22 Aminosäuren des viralen Pro
teins vp1 (F136), welches mit dem Integrinrezeptor inter
agiert, verlängert (Hynes, R.O. Cell 69 (1992) 11-25).
Zur Überprüfung der Integration von DNA mit Hilfe des
erfindungsgemäßen Peptids wird ein Komplex hergestellt
zwischen dem erfindungsgemäßen Peptid und einem 18mer-DNA
Oligonukleotid, welches gegen den Start des zweiten Codons
des humanen c-myb-RNA gerichtet ist. Die Sequenz dieses
Antisenseoligonukleotides (a-myb) ist:
5′GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3′(SEQ ID NO. 15)
Es ist bekannt, daß dieses Oligonukleotid die Prolifera
tion der humanen promyelocytischen Zellinie HL60 redu
ziert (G. Anfossi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86
(1989) 3379-3383.
Pro Test werden 1 × 10⁴ HL-60-Zellen (ATCC CCL 240) in
einem Volumen von 0.5 ml RPMI-Medium (mit 10% FKS) mit
Peptidderivaten, komplexiert mit Oligodesoxynukleotid,
versetzt. Dieser Ansatz wird für 5 Tage bei 37°C/5% CO2
inkubiert. Zur Auswertung wird die Zellzahl nach drei und
fünf Tagen bestimmt. Hierzu werden 100 µl Zellen entnommen
und das entsprechende Volumen mit RPMI-Medium (10% FKS)
aufgefüllt. Die Komplexierung von Peptid und Nukleinsäure
erfolgt in einem Volumen von 10 µl Bindungspuffer. Nach 15
min bei Raumtemperatur wird die Mischung zu den Zellen
gegeben. Am zweiten und am dritten Tag wird diese Behand
lung mit einem Viertel der Ausgangsdosis wiederholt.
Zur Analyse des Transports von Plasmid DNA in eukaryoti
sche Zellen werden Peptide und DNA komplexiert wie in
Beispiel 2 beschrieben. Die Plasmide enthalten Indikator-
Gene (Luziferase, β-Galaktosidase, Chloramphenikol-Trans
ferase) unter Kontrolle viraler Promotoren (z. B. SV40
early promotor oder IE Promotor/Enhancer von MCMV. Es
können auch gewebespezifische zelluläre Promotoren einge
setzt werden). 48 h nach Zugabe der komplexierten DNA zu
den eukaryotischen Zellen wird die enzymatische Aktivität
der exprimierten Indikator-Genprodukte analysiert. Die
Analyse kann luminometrisch, photometrisch oder durch
Acetylierung von Chloramphenicol mit ¹⁴C-Acetyl-CoA
erfolgen.
Der Test erfolgt wie in Beispiel 3 beschrieben. Hier
werden in vitro transkribierte RNAs von Indikator-Genen
verwendet. Analysiert wird ebenfalls die enzymatische
Aktivität der exprimierten Genprodukte.
Capan-1 Zellen (ATCC HTB 79, humane Adenocarcinom-Zellinie
des Pancreas) wurden in Gewebekulturschalen mit 96
Vertiefungen bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert. Dabei wurden
in jede Vertiefung 5 × 10³ Capan-1 Zellen in 100 µl RPMI
Medium, das 10% foetales Kälberserum (FKS) enthielt,
gegeben. Die Zellen wurden 12 h im Brutschrank kultiviert
und daraufhin wie folgt behandelt: (control) 10 µl
TN-Puffer (50 mM Tris HCl pH 8.0, 50 mM NaCl; (DOTAP) 1 µg
DOTAP (N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethyl
ammoniummethylsulfat, Boehringer Mannheim) in 10 µl TN;
(DOTAP + Rz mut) 1 µg DOTAP + 7.5 pmol mutiertes (mut) Rz
(siehe Übersicht 1) in 10 µl TN; (DoTAP + Rz wt) 1 µg
DOTAP + 7.5 pmol Rz wt in 10 µl TN.
Die Komplexierungsreaktion erfolgte für 20 min bei
Raumtemperatur. Nach 2 Tagen im Brutschrank wurden die
Zellen einem MTT (3-[4,5 Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-
diphenyltetrazolium bromide) Test unterzogen. Hierzu
wurden die Zellen nach Absaugen des Mediums für 3 h mit
200 µl RPMI, 10% FKS, 1 mg/ml MTT im Brutschrank
inkubiert. Nach Absaugen des Mediums wurden die Zellen
dann in 400 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) lysiert und der MTT
Umsatz photometrisch bei 507 nm als optische Dichte (OD)
bestimmt. Alle Bestimmungen erfolgten als Triplikate.
Es wurde exakt wie in Beispiel 6 verfahren. Hier wurden
die Zellen wie folgt behandelt:
(control) 10 µl TN; (Rz mut) 7.5 pmol Rz mut in 10 µl TN; (Rz wt) 7.5 pmol Rz wt in 10 µl TN; (Int) 150 pmol AcRGD- 1-35 in 10 µl TN; (Int + Rz mut) 7.5 pmol Rz mut + 150 pmol AcRGD-1-35 in 10 µl TN; (Int + Rz wt) 7.5 pmol Rz wt + 150 pmol AcRGD-1-35 in 10 µl TN.
(control) 10 µl TN; (Rz mut) 7.5 pmol Rz mut in 10 µl TN; (Rz wt) 7.5 pmol Rz wt in 10 µl TN; (Int) 150 pmol AcRGD- 1-35 in 10 µl TN; (Int + Rz mut) 7.5 pmol Rz mut + 150 pmol AcRGD-1-35 in 10 µl TN; (Int + Rz wt) 7.5 pmol Rz wt + 150 pmol AcRGD-1-35 in 10 µl TN.
Die Ergebnisse zeigt Tabelle 1:
Die Durchführung der Tests erfolgte unter Standardbedin
gungen (Beispiel 3). (a-myb + Int) 0.43 PM AcRGD-1-35 + 1
µg/ml myb -antisense; (DOTAP + a-myb) 10 µg/ml DOTAP + 1
µg/ml myb -antisense; (Int-Komp) 0.43 µM AcRGD-1-35 + 0,43
µm F136-1-35 (FMDV Integrin Bindestelle) + 1 µg/ml myb-
antisense; (5 µg DOTAP) 10 µg/ml DOTAP; (a-myb) 1 µg/ml
DOTAP.
Die Ergebnisse zeigt Tabelle 2:
- (i) Anmelder:
(A) Name: Boehringer Mannheim GmbH
(B) Straße: Sandhofer Str. 116
(C) Ort: Mannheim
(E) Land: Germany
(F) Postleitzahl: D-68305
(G) Telephon: 08856/2 23 446
(H) Telefax: 08856/2 23 451 - (ii) Anmeldetitel: Nukleinsäure-transferpeptide und deren Verwendung zur Einschleusung von Nukleinsäuren in eukaryontische Zellen
- (iii) Anzahl der Sequenzen: 30
- (iv) Computer-lesbare Form:
(A) Datenträger: Floppy disk
(B) Computer: IBM PC compatible
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release 1.0, Version 1.25 (EPA) - (vi) Frühere Anmeldedaten:
(A) Anmeldenummer: DE-P 43 12 131.4
(B) Anmeldedatum: 14-Apr-1993 - (vi) Frühere Anmeldedaten:
(A) Anmeldenummer: DE-P 43 18 470.7
(B) Anmeldedatum: 03-Jun-1993
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 7 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 1:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 17 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 2
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 7 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 3
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 7 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 4
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 11 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 5
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 8 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 6
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 5 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 7
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 24 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 8
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 9 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 9:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 11 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 10:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 21 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 11:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 12:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 8 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 13:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 12 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 14:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 18 Basenpaare
(B) Art: Nukleinsäure
(C) Strangform: Einzel
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: cDNS
- (iii) Antisense: Ja
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 15: GTGCCGGGGT CTTCGGGC 18
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 36 Basenpaare
(B) Art: Nukleinsäure
(C) Strangform: Einzel
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: RNS (genomisch)
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 16: CUACGCCCUG AUGAGUCCGU GAGGACGAAA CAGCUC 36
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 77 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 17:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 57 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 18:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 44 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 19:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 45 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 20:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 32 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 21:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 37 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: Peptide
(B) Lage: 11
(D) Sonstige Angaben: /note= "Seitenketten an den AS 11 + 12 (Lysin) gem. Tabelle 3" - (ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: Peptide
(B) Lage: 12
(D) Sonstige Angaben: /note= "Seitenketten an den AS 11 + 12 (Lysin) gem. Tabelle 3" - (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 22:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 44 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 23:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 33 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 24:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 43 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 25:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 52 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 26:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 43 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 27:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 35 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: Peptide
(B) Lage: 12
(D) Sonstige Angaben: /note= "Seitenkette an der AS 12 (Lysin) gem. Tabelle 5" - (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 28:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 28 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: Peptide
(B) Lage: 2
(D) Sonstige Angaben: /note= "Seitenketten an den AS 2 + 3 (Lysin) und Galactose-Derivatisierung gem. Tabelle 5" - (ix) Merkmale:
(A) Name/Schlüssel: Peptide
(B) Lage: 3
(D) Sonstige Angaben: /note= "Seitenketten an den AS 2 + 3 (Lysin) und Galactose-Derivatisierung gem. Tabelle 5" - (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 29:
- (i) Sequenz Charakteristika:
(A) Länge: 27Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear - (ii) Art des Moleküls: Peptid
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 30:
Claims (25)
1. Nukleinsäure-transferpeptid enthaltend
- a) einen ersten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid, Steroid, Kohlenhydrat, Lipid oder Vitamin, welches an einen Bindepartner an der Zelloberflä che von eukaryontischen Zellen bindet und dabei eine Endozytose des Komplexes aus dem genannten Nukleinsäure-transferpeptid und einer Nukleinsäure auslöst,
- b) einen zweiten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid, Steroid, Kohlenhydrat, Lipid oder Vitamin, welches an einen Bindepartner auf der äußeren Kern membran von eukaryontischen Zellen bindet,
- c) einen dritten Liganden, welcher ein basisches Pep tid ist und durch ionische Wechselwirkung an Nukleinsäuren bindet.
2. Nukleinsäure-transferpeptid nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß der erste Ligand als Peptid eine
Länge von 2-100 Aminosäuren, der zweite Ligand als
Peptid eine Länge von 2-20 Aminosäuren und der drit
te Ligand als Peptid eine Länge von 3-100 Amino
säuren besitzt.
3. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1 oder
2, dadurch gekennzeichnet, daß es als
- a) Steroid: Progesteron, Androgen, Östrogen
- b) als Kohlenhydrat: Galactose, Mannose-6-Phosphat, Lewis-X-Kohlenhydrate
- c) als Lipid: Fettsäuren, Arachidonsäure
- d) als Vitamin: Vitamin A oder D3
enthält.
4. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1-3,
dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen vier
ten Liganden, ausgewählt aus der Gruppe Peptid oder
Lipid enthält, welcher die Auflösung der bei der Endo
zytose entstandenen Endosomen beschleunigt.
5. Nukleinsäure-transferpeptid nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, daß der vierte Ligand als Peptid eine
Länge von 10-40 Aminosäuren hat.
6. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1-
5, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Ligand ein
peptidischer Ligand für den Integrinrezeptor oder eine
gp120-Bindungsstelle ist.
7. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1-5,
dadurch gekennzeichnet, daß der erste Ligand ein
peptidischer Ligand für den Östrogen-Rezeptor ist.
8. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1-5,
dadurch gekennzeichnet, daß der erste Ligand ein
peptidischer Ligand für den Galactose-Rezeptor ist.
9. Nukleinsäure-transferpeptid nach den Ansprüchen 1-8,
dadurch gekennzeichnet, daß die Gesamtlänge des
Nukleinsäure-transferpeptids 10-250 Aminosäuren
beträgt.
10. Komplex enthaltend, über ionische Wechselwirkung
gebunden, eine Nukleinsäure und mindestens ein
Nukleinsäure-transferpeptid gem. den Ansprüchen 1-9.
11. Komplex nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß
die Nukleinsäure eine DNA oder RNA ist.
12. Komplex nach den Ansprüchen 10 oder 11, dadurch ge
kennzeichnet, daß die Nukleinsäure ein Ribozym oder
eine Antisensenukleinsäure ist.
13. Komplex nach den Ansprüchen 10-12, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Nukleinsäure ein eine exogene
Nukleinsäure tragender Vektor ist.
14. Komplex nach den Ansprüchen 10-13, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Nukleinsäure mindestens ein funktio
nell aktives, in eukaryontischen Zellen exprimierbares
Gen enthält.
15. Komplex nach den Ansprüchen 10-14, dadurch gekenn
zeichnet, daß an die Nukleinsäure ionisch gebunden ein
Peptid gemäß den Ansprüchen 1-9 und zusätzlich,
ebenfalls ionisch gebunden, ein basisches Peptid,
welches durch ionische Wechselwirkung an Nukleinsäure
bindet und kovalent mit einem Peptid oder Lipid ver
bunden ist, welche die Auflösung der Endosomen, welche
bei der durch das genannte Nukleinsäure-transferpeptid
verursachten Endozytose entstanden sind, beschleu
nigt.
16. Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäure-transfer
peptiden nach den Ansprüchen 1-9, dadurch gekenn
zeichnet, daß die das C-terminale Ende bildende
Aminosäure an einen Träger gebunden wird, vom C-termi
nalen Ende das Nukleinsäure-transferpeptid schrittwei
se aufgebaut, vom Träger abgespalten und
gegebenenfalls mit Kohlenhydraten, Lipiden, Vitaminen
oder Steroiden kovalent gekoppelt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,
daß das Nukleinsäure-transferpeptid in Fragmenten
synthetisiert und die Fragmente durch Peptidbindungen
ligiert werden.
18. Verfahren zur Transfektion von eukarayontischen Zellen
mit Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß ein
Komplex nach den Ansprüchen 10-15 und 22 mit
eukaryontischen Zellen in Kontakt gebracht und
inkubiert wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet,
daß Hilfsmittel zur Zellfusion zugegeben werden.
20. Verwendung eines Komplexes nach den Ansprüchen 10-15
und 22 zur Herstellung eines Therapeutikums zur
Behandlung von viralen Infektionen, zur Gentherapie,
zur Stimulierung der Immunreaktion gegen maligne
Zellen bzw. Tumoren, zur Expression von Faktoren, zur
Stimulierung der Immunreaktion gegen maligne Zellen
bzw. Tumoren, zur Expression von Faktoren, zur
Zellmarkierung und
zur Zell-Integration von Genen, welche für Proteine
codieren, die in die Zelloberfläche integriert
werden.
21. Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäure-transfer
peptiden gemäß den Ansprüchen 1-9, dadurch gekenn
zeichnet, daß der Peptidanteil durch Genexpression
rekombinant hergestellt wird und anschließend ggf. mit
Kohlehydraten, Lipiden, Vitaminen oder Steroiden kova
lent gekoppelt wird.
22. Komplex nach den Ansprüchen 10-15, dadurch
gekennzeichnet, daß die Bindung von mindestens
zwei Liganden untereinander über die Nukleinsäure
als bi- oder multifunktioneller Bindepartner
erfolgt.
23. Komplex nach den Ansprüchen 10-15, dadurch
gekennzeichnet, daß das Nukleinsäuretransferpeptid
keinen zweiten, kernbindenden Liganden enthält und als
Nukleinsäure ein Ribozym oder eine Antisensesequenz
bis etwa 30 Nukleotide Länge enthält.
24. Verwendung eines Komplexes nach Anspruch 23 zur
Herstellung eines Therapeutikums zur Behandlung von
viralen Infektionen, zur Gentherapie, zur Stimulierung
der Immunreaktion gegen maligne Zellen bzw. Tumoren,
zur Expression von Faktoren, zur Stimulierung der
Immunreaktion gegen maligne Zellen bzw. Tumoren, zur
Expression von Faktoren, zur Zellmarkierung und
zur Zell-Integration von Genen, welche für Proteine
codieren, die in die Zelloberfläche integriert
werden.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4412629A DE4412629A1 (de) | 1993-04-14 | 1994-04-13 | Nukleinsäure-transferpeptide und deren Verwendung zur Einschleusung von Nukleinsäuren in eukaryontische Zellen |
Applications Claiming Priority (3)
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DE4312131 | 1993-04-14 | ||
DE4318470 | 1993-06-03 | ||
DE4412629A DE4412629A1 (de) | 1993-04-14 | 1994-04-13 | Nukleinsäure-transferpeptide und deren Verwendung zur Einschleusung von Nukleinsäuren in eukaryontische Zellen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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DE4412629A1 true DE4412629A1 (de) | 1995-01-26 |
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ID=27204961
Family Applications (1)
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DE4412629A Withdrawn DE4412629A1 (de) | 1993-04-14 | 1994-04-13 | Nukleinsäure-transferpeptide und deren Verwendung zur Einschleusung von Nukleinsäuren in eukaryontische Zellen |
Country Status (1)
Country | Link |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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DE19605279A1 (de) * | 1996-02-13 | 1997-08-14 | Hoechst Ag | Zielzellspezifische Vektoren für die Einschleusung von Genen in Zellen, Arzneimittel enthaltend derartige Vektoren und deren Verwendung |
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