EP1141364A1 - Ausnutzung zelleigener transportsysteme zum transfer von nukleinsäuren durch die kernhülle - Google Patents

Ausnutzung zelleigener transportsysteme zum transfer von nukleinsäuren durch die kernhülle

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EP1141364A1
EP1141364A1 EP00903497A EP00903497A EP1141364A1 EP 1141364 A1 EP1141364 A1 EP 1141364A1 EP 00903497 A EP00903497 A EP 00903497A EP 00903497 A EP00903497 A EP 00903497A EP 1141364 A1 EP1141364 A1 EP 1141364A1
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EP
European Patent Office
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dna
transport agent
module
agent according
nls
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00903497A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Gregor Siebenkotten
Rainer Christine
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Lonza Cologne GmbH
Original Assignee
Amaxa AG
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1141364A1 publication Critical patent/EP1141364A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a core transport agent, a gene transfer system comprising the core transport agent, a method for transporting DNA into the nucleus of eukaryotic cells, using the core transport agent and the use of the core transport agent in gene therapy for the treatment of cancer, viral infections, diseases of the nervous system, transplant rejection, as well as monogenic or polygenic hereditary diseases.
  • the active transport into the nucleus is necessary for the transfer of genetic material in all cells that do not divide in the period up to the desired expression of the genetic material.
  • a core transport system for nucleic acids is very important because it enables the efficient transfer of DNA into cells that do not or only rarely divide (Dowty et al., 1995, Wilke et al., 1996). Most primary cells fall into this group. Primary cells are of the highest scientific interest because, on the one hand, these freshly isolated cells from an organism reflect the functional state of the cell type much better than cell lines derived from them, and on the other hand, they are target cells for gene therapies.
  • a core transport system also increases the efficiency of DNA transfer to established cell lines by allowing cells that have not divided in the period from the start of the transfer to analysis to express transferred genetic material.
  • the place of action of the genetic material is the cell nucleus.
  • the double membrane that surrounds the cell nucleus has pores. Small molecules can diffuse through these pores. Proteins that are larger than approx. 50 kDa require a nuclear localization signal (NLS), which must be recognized by a transport machine so that they can get into the nucleus. A sufficient signal typically consists of four to eight amino acids and is rich in positively charged amino acids arginine and lysine and has proline. It is evolutionarily highly conserved, so that NLS from mammalian proteins also work in yeast. Heterologous NLS can also be used as a tool to transport target molecules into the cell nucleus. For this purpose, NLS can be built into the sequence of cytoplasmic proteins at a relatively arbitrary point or chemically coupled as a peptide to proteins or even to gold particles (review article: Görlich, 1998).
  • HIV and other lentiviruses that are able to infect resting cells use viral proteins and the cell's own transport machinery to transfer their DNA to the nucleus.
  • the NLS in the Vpr and in the matrix protein of the HIV pre-integration complex are essential for the infection of cells that do not divide (Naldini et. Al., 1996). Although little is known about how viruses bring their genome into the nucleus, the help of viral structural proteins with NLS could be a general principle. The following observations also support this.
  • a specific mutation in the HSV capsid protein prevents the transport of viral DNA into the nucleus (Batterson et al., 1983).
  • Adenovirus DNA is transported into the nucleus together with the hexon protein of the dissolved capsid (Greber et al., 1993).
  • SV40 DNA is transported into the cell nucleus by a viral protein (most likely Vp3) that remains associated with the DNA (Nakanishi et al., 1996).
  • Vp3 viral protein
  • Two bacterial proteins with NLS are responsible for the import of T-DNA from Agrobacterium tumefaciens into plant cell nuclei (Citovsky et al., 1994).
  • mutant variants of, e.g. B., HIV, adenovirus and herpes virus used as a DNA transfer vehicle for the development of gene therapy approaches.
  • helper cell lines are used in such systems in which the release of less strongly mutated virus genomes is not excluded.
  • the handling of these systems is complex.
  • Kaneda et. al. (1989) and Dzau and Kaneda, (1997, Patent EP or US 5,631,237) describe a gene transfer system which is based on the use of Sendai viruses, liposomes and added proteins which are intended to support the nuclear transport of the DNA.
  • the working group uses HMG-1 ("high mobility group 1 protein"), a basic non-histone protein of chromatin, which binds to DNA.
  • HMG-1 binds DNA over a long basic range. It is localized in the core, but has no known NLS.
  • HMG-1 protein forms complexes in vitro with vector DNA. The production of cleaned HMG-1 is complex.
  • HMG-1 is used here as a DNA-complexing transfection reagent for the passage of DNA through the cell membrane. The efficiency is low.
  • Wako BioProducts (Richmond, VA, USA) (1997) offered the proteins HMG-1 and -2 to mediate nuclear transport as an additive to lipofection reagents.
  • Gopal (US Pat. No. 5,670,347) describes a peptide which consists of a DNA-binding basic region, a flexible “hinge” region and an NLS. Since the DNA binding is also achieved here via positive charges of the amino acids, the reagent forms with the DNA complexes, which are also supposed to serve for the transport through the cell membrane. It is not clear why the NLS sequence should not be involved in the DNA binding, so the actual signal for the nuclear transport proteins is probably again masked by the DNA, how the DNA is linked to the peptide.
  • Gerhard et al. (DE-OS 195 41 679) propose NLS-polylysine conjugates for gene transfer.
  • the resulting complexes of cationic polylysine, cationic NLS and DNA mask the actual nuclear transport signal as long as it is connected to the DNA.
  • Szoka (PCT from 1993 Claim 23-27) couples NLS peptides to DNA via an intercalating agent. After a pre-incubation of vector and peptide (in a ratio of 1: 300), the
  • the SV40 peptide used is able to complex DNA due to its strong positive charge. Complexation of DNA with cationic peptides leads to an increase in the efficiency of lipofection by improving the efficiency of the passage through the cell membrane (Sorgi et al., 1997, cf. Hawley-Nelson et. Al., 1997). Kerat transport is at least hampered by this, at least when large complexes are formed (see above). Since the NLS peptides used themselves due to their charge to the
  • NLS peptide binds itself to the DNA as before and complexes it.
  • the problem of a direct binding of the NLS peptide to the DNA is not dealt with.
  • Hawley-Nelson et al. (US Patent 5736392) describe a comparable system.
  • An NLS peptide is mixed with vector DNA either directly or after covalent coupling to a DNA-binding molecule.
  • the resulting complexes are then used for lipofection (or other transfections).
  • the addition of a polycationic peptide without NLS increases the transfection efficiency even more than the addition of a cationic NLS.
  • the coupling of spermidine to the NLS peptide does not further increase the transfection efficiency. So here too the amplification effect can be explained solely by the complexation of the DNA via cationic peptides. Since that The presence of NLS does not further increase the transfection efficiency, it can be assumed that the recognition sequence for the core transport machinery is also masked here.
  • the company TIB Molbiol (brochure 1998) describes the transport of PNA oligonucleotides with a C-terminal NLS (nuclear localization signal) peptide in order to specifically suppress the gene expression of selected genes.
  • the NLS is used here to transport the PNA oligonucleotides into the nucleus so that they can hybridize there with the target sequence.
  • a core transport agent consisting of two modules A and B, module A specifically binding to DNA and not by unspecific binding leading to the formation of complexes with more than one DNA molecule and module B a nuclear localization signal or a non-NLS Contains signal that does not bind non-specifically to DNA.
  • a preferred core transport agent according to the invention comprises a module A which binds sequence-specifically to the DNA and / or binds specifically to DNA ends.
  • a core transport agent in which module A is a synthetic peptide, a protein or a PNA (peptide nucleic acid) is particularly preferred.
  • module B contains an expanded nuclear localization signal which, owing to its charges, does not form any complexes with DNA.
  • a core transport agent in which module B contains an expanded nuclear localization signal which has an approximately neutral total charge is preferred.
  • a core transport agent in which module B contains an expanded nuclear localization signal which comprises a nuclear localization signal and flanking negatively charged amino acids is particularly preferred.
  • An NLS sequence does not have to be identical to a natural one occurring NLS sequence, it can also be an amino acid sequence based on theoretical considerations, as long as it functions as an NLS.
  • Module B may further contain peptide sequences or non-peptide components that are not to be counted directly to the nuclear localization signal or extended nuclear localization signal. Preferably a component that increases the distance between the core localization signal and module A.
  • the invention further relates to a gene transfer system comprising a core transport agent according to the invention and a cationic lipid, peptide, polyamine or cationic polymer.
  • the invention relates to a method for the transport of DNA into the nucleus of eukaryotic cells, preferably primary cells, the cells being transfected with the DNA to be transported and the core transport agent according to the invention according to the prior art methods.
  • An additional embodiment relates to the use of the core transport agent according to the invention in gene therapy, in particular for the treatment of cancer, viral infections, diseases of the nervous system, transplant rejection and monogenic or polygenic hereditary diseases.
  • unspecific binding of the key localization signal to DNA means a binding which has the consequence that the nuclear localization signal is no longer completely recognizable by the nuclear transport machinery.
  • module A means on the one hand a sequence-specific binding, in which the sequence of the DNA nucleotides is decisive for the binding, on the other hand a covalent binding to DNA by DNA single or double stranded ends is conveyed.
  • extended core localization signal means that a core localization signal additional, flanking Has amino acids.
  • An extended nuclear localization signal is preferred which has 2-40, preferably 4-20, additional, flanking amino acids.
  • extended nuclear localization signal which due to its charges does not form a complex with DNA
  • module B contains a nuclear localization signal, the charge of which is distributed in such a way that it does not interact non-specifically with DNA and therefore remains fully accessible to the core transport machinery.
  • approximately neutral total charge means that the extended part of the core localization signal has negatively charged amino acids in order to balance the positive charge of the actual core localization signal, so that no more than three positive charges in excess occur in the entire area of the extended core localization signal.
  • the core transport agent according to the invention has the advantage that it does not lead to complexation of the DNA. Another advantage is that the core localization signal remains freely accessible to the core transport machinery. The avoidance of large DNA complexes which hinder nuclear transport and the absence of the nuclear localization signals for the nuclear transport machinery when using the nuclear transport agents according to the invention lead to a significantly more efficient transport of the DNA into the nucleus.
  • Module A binds specifically to DNA and does not lead to the formation of complexes with more than one DNA molecule.
  • Module A binds either sequence-specifically (ie not unspecifically due to positive charges alone) or covalently to DNA ends.
  • Module A can be a peptide of different lengths or a protein or a PNA sequence (Nielson et al., 1991) or another substance which binds to nucleic acids in a sequence-specific manner.
  • Module A can also be a recombinant protein that is sequence-specific to DNA binds such.
  • lac repressor or a high affinity mutant thereof (Kolkhof, 1992, Fieck et al., 1992) or a retroviral integrase that binds sequence-specifically to DNA ends (with an LTR core sequence) (Ellison and Brown, 1994) .
  • Covalent attachment to a strand end can be biological, e.g. through the topoisomerase I of the poxyvirus, if the strand end of a linear DNA carries a sequence which as a "suicide substrate" enables a topoisomerase cut but no religation (Shuman, 1994).
  • Module B is a nuclear localization signal or a non-NLS signal that does not bind non-specifically to DNA.
  • non-NLS signals means signals which are not nuclear localization signals, but which, in the context of transfection, gene therapy or DNA vaccination, serve to transport the DNA into the cell or to transport DNA within the cell.
  • Non-NLS signals include: ligands for cellular surface structures, DNA uptake, e.g. the receptor-mediated can mediate; Peptides that destabilize membranes, e.g. to promote the early release of DNA from the endosomes; Signals that mediate binding to transport structures in the cell in order to promote intracellular transport to the nucleus.
  • the nuclear localization signal is preferably an extended nuclear localization signal (as defined above) which, owing to its charges or spatial orientation in relation to the DNA-binding module A, does not form any complexes with DNA.
  • the nuclear localization signal can be produced synthetically or as part of a protein.
  • a nuclear localization signal as is used in the core transport agent according to the invention, those signal sequences - with and without flanking regions - are used which do not bind to the DNA via their positive charges in such a way that these charges, the one make up an essential part of most nuclear transport signals as masked signals for the nuclear transport machinery.
  • module B can contain peptide sequences or non-peptide components which are not attributable to the core localization signal or the extended core localization signal. They are preferably used to improve the steric alignment of the core localization signal, in particular to increase the distance from the DNA.
  • IgM immunoglobulin M
  • NLS is part of a sequence-specific protein that binds to the DNA, the risk of this sequence (s) being masked by the DNA is relatively low.
  • extended NLS sequences can also be used here because of the higher efficiency.
  • non-classical NLS such as an NLS from the influenza Vs "nucleoprotein” (Wang et al., 1997, Neumann et al., 1997) that does not have a large excess of positive charges or does not get into the nucleus via the classic transport route can be used.
  • a non-NLS signal is bound to existing vector sequences via PNA (as module A).
  • PNA as module A
  • the binding between PNA and vector is sequence specific. This makes it possible to couple such non-NLS signals to almost all common expression vectors without having to change them.
  • sequence-specific binding of PNA to the DNA only those DNA sequences of the vector are used whose masking by PNA does not significantly damage the later intended use of the DNA.
  • expression vectors mainly sequences in the plasmid backbone are used, especially those that are found in most common expression vectors (e.g. promoter of the ampicillin resistance gene), but binding in the non-coding strand in the expression area is also possible.
  • An advantage of sequence-specific binding is that simple and rapid binding of the PNA-peptide hybrid to the DNA takes place. In example 2, e.g. a simple and fast binding reaction (5 min., 65 ° C.) of PNA-peptide hybrids to double-stranded DNA was shown. A spacer can lie between the PNA portion and the actual signal.
  • the spacer can serve to increase the distance from signal to DNA, e.g. to reduce steric disabilities.
  • the spacer can also serve to introduce a predetermined breaking point, e.g. to allow the separation of a ligand in the endosomal milieu via which the DNA is bound to an endocytosed cell surface receptor.
  • the present invention makes resting and weakly dividing active cells transfectable to a percentage, which enables a subsequent analysis.
  • Most cells (primary cells) freshly isolated from the body of an animal or human do not divide or so rarely that DNA that has been successfully transported across the cell membrane is inactivated before it can get into the nucleus and be expressed. Until now, this has resulted in these primary cells being untransfectable unless they were artificially stimulated to divide in culture. However, this always has the consequence that they differ from remove original condition.
  • a technique for transfection of primary cells enables the analysis of genetic material under the original conditions of a body cell, which is of great importance for the research of the mode of action of genes and for the research of processes within a body cell.
  • the teaching according to the invention which makes primary cells transfectable, also represents an essential step towards a completely artificial gene transfer system for gene therapy.
  • a gene transfer system must have three functional components: a component for the passage of DNA through the cell membrane, for which cationic lipids and other cationic polymers have proven to be relatively well suited, another for the transfer of the DNA into the nucleus of the (mostly division-inactive) target cells and a third, which ensures the integration of the DNA into the genome.
  • an efficient agent that can serve as a second component is described here for the first time.
  • a completely artificial gene transfer vehicle that can be used in gene therapy is expected to be easier and cheaper to manufacture and easier to handle than the viral systems currently in use and is not subject to the inherent risks of these systems.
  • Gene therapy approaches are e.g. for the treatment of cancer, AIDS and various inherited diseases have been proposed and will play a very large role in medicine.
  • the nuclear transport agents described according to the invention increase the efficiency of the transfection into those culture cells which were previously transfectable, since those cells can now also incorporate DNA into the nucleus which do not divide in the time window between the passage of the DNA through the cell membrane and analysis. This is important because even with many established cell lines, increasing the transfection efficiency would make the analysis easier and would reduce costs due to the lower need for cell material. Of course, this also applies to all intermediate stages between primary cells and established cell lines.
  • NLS-PNA core transport reagents were used. Such PNA sequences were used which are able to migrate into the DNA double strand (Nielson et al., 1991, Nielson, US Pat. No. 5,539,082).
  • the peptides used contain as peptide components: either 1) "SV21": NH 2 -GKPTADDQHSTPPKKKRKVED-COOH (peptide 1; SEQ ID NO: 1), or
  • the cuvette was incubated for a further 10 min at 37 ° C. before the cells were plated out in preheated medium.
  • pMACS4.1 an expression vector for human CD4
  • the cells were transfected with pMACS4.1 (an expression vector for human CD4) using the method described and the cell division was measured as follows.
  • CFDA carboxyfluorescein diacetate succinimide ester
  • the flow cytometer (FACSCalibur) was then used to determine at the single cell level that cells which had not divided (full green fluorescence) expressed the transfected gene (dark red fluorescence after staining with Cy5-coupled anti-CD4 antibody).
  • PNA-peptide hybrids were bound to double-stranded DNA.
  • An existing vector sequence can be labeled almost quantitatively (> 90%) via PNA with an NLS peptide within 5 min.
  • For the binding of heat-labile components via PNA an incubation at 37 ° C for one hour is sufficient to label most of the DNA (Table 1).
  • 100 ng of an expression vector were incubated in TE (pH 7.8) with 25 ⁇ M different PNA-peptide hybrids at 65 ° C. or 37 ° C. for five minutes to three hours.
  • the PNA sequence NH2-CTCTTCCTTTTTC-COOH (SEQ ID NO: 6) used binds in the promoter region of the ampicillin resistance gene.
  • the binding mixtures were then implemented with the restriction endonuclease Earl.
  • the cleaved DNA was stained with YOYO (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA), separated on an agarose gel and with a fluorescence reader (Image Plate Reader FLA 2000, evaluation software L-Process, version 1.6, Fuji Photo Film Co ., Ltd., Tokyo).
  • YOYO Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA
  • the binding reaction of the PNA to the DNA is simple, robust and fast.
  • the binding is practically irreversible and therefore suitable for cellular transport processes.
  • Peptides and PNA are cheaper to manufacture and store longer and easier than proteins.
  • active nuclear transport of transfected DNA means that it can be expressed earlier than DNA that is not transported. Assuming that transfected DNA persists in the cytoplasm long enough, the expression rates of transfected DNA with and without a nuclear transport reagent should gradually approach each other in strongly dividing cells. This is due to the fact that transfected DNA present in the cytoplasm can get into the nucleus during cell division. With aphidicolin, the division activity and thus also the transfectability can be greatly reduced, active nuclear transport cancels this effect of the reduced transfection efficiency.
  • a high-affinity binding mutant of the lac repressor from E. coli was used as the sequence-specific DNA-binding protein. This mutant has a binding constant of 10 "15 M for the lac operator sequence (Kolkhof, 1992). The high affinity is achieved by an amino acid exchange serine 61 to leucine.
  • the nuclear transport proteins used here have a deletion of the last thirty C-terminal amino acids (positions 331-360) and an exchange of the leucine in position 330 to a serine. These mutant proteins form homodimers instead of homotetramers and therefore have only one DNA binding site instead of two. However, tetramers can also be used for a core transport agent according to the invention.
  • the dimer variants were extended by one NLS each at the N-terminus:
  • NLS 1 MPKKKRKV-MKP VTLYDVA
  • N2D NLS2 MEEDTPPKKKRKVEDL-KPVTLYDVA
  • NLS1 corresponds to the NLS of the SV40 Vim's large T antigen.
  • NLS2 is a total charge neutral hybrid of the SV40-NLS and the N-terminal flanking region of the NLS of the polyoma virus VP2 protein.
  • Lac operator sequences occur in a number of expression vectors and can easily be linked to any sequence as an overhang of a PCR primer.
  • lac operator sequences were used for binding studies: the naturally occurring operator: AATTGTGAGC GGATAACAATT and a perfectly palindromic operator sequence: AATTGTGAGC GCTCACAATT.
  • 0.7 ng of a radioactively labeled DNA fragment of 1 kb in length was broken down into fragments of 914 and 86 bp in length by restriction digestion and incubated with lac represor NLS-1 dimer or NLS-2 dimer for 30 min at room temperature .
  • the fragments were then separated on a polyacrylamide gel (FIG. 2).
  • the 86 bp fragment which contains a lac operator, is retarded by specific binding. Nonspecific binding leads to the retardation of the 914 bp fragment without a lac operator. With complete specific binding, almost no non-specific binding can be determined.
  • the binding takes place and is stable under very different conditions, e.g. in the RPMI cell culture medium, in 150 mM sodium chloride or a buffer of 10 mM Tris / HCl (pH 7.2), 10 mM potassium chloride and 3 mM magnesium acetate, with both operator sequences tested.
  • lac repressor NLS mutants were treated with 2 ⁇ g (100 pmol) of a double-stranded DNA of 30 bp length, which was labeled with the fluorescent molecule Cy5 at both ends, in 300 ⁇ l 10 mM Tris / Cl ( pH 7.2)), 10 mM KC1, 3 mM Mg acetate and 50 ⁇ g / ml BSA for 30 min at room temperature.
  • a mixture of DNA bound to lac repressor mutants and fluorescein-labeled BSA (BSA-FITC) was microinjected into the cytoplasm in 50 NIH3T3 cells in each case (Eppendorf Transjector 5246 with femtotips, 0.5 ⁇ m diameter, injection pressure 55 hPa, Injection time 0.5 sec).
  • a fluorescence microscopic evaluation was carried out 10 to 15 min after the injection (see FIG. 3). If the cytoplasmic injection is successful, (BSA-FITC) is only in the cytoplasm (la, 2a, 3a).
  • Lac-Repressor-NLS can increase transfection efficiency by a factor of 3-4 4 h after transfection.
  • adherent NIH3T3 were cultivated to confluence before the transfection, which leads to a major inhibition of division. 4 h after the transfection, very few cells have divided.
  • the period in which the already low division activity is relevant for the transfection in this example is further shortened by the fact that the transfected, endocytotically recorded DNA first has to leave the endosomes and then the complex with the cationic transfection reagent before it can enter the core can be transported and expressed.
  • Lipofectamine-DNA complexes probably last much longer than complexes with polyethylene imine, which means that the effect of lac repressor NLS with Lipofectamine is less pronounced.
  • lac repressor NLS with Lipofectamine is less pronounced.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Kerntransportagenz, ein Gentransfersystem umfassend das Kerntransportagenz, ein Verfahren zum Transport von DNA in den Kern eukaryontischer Zellen, mit Hilfe des Kerntransportagenz sowie die Verwendung des Kerntransportagenz in der Gentherapie zur Behandlung von Krebs, Virusinfektionen, Erkrankungen des Nervensystems, Transplantatabstossung sowie monogenen oder polygenen Erbkrankheiten.

Description

Ausnutzung zelleigener Transportsysteme zum Transfer von Nukleinsäuren durch die Kernhülle
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Kemtransportagenz, ein Gentransfersystem umfassend das Kemtransportagenz, ein Verfahren zum Transport von DNA in den Kern eukaryontischer Zellen, mit Hilfe des Kemtransportagenz sowie die Verwendung des Kemtransportagenz in der Gentherapie zur Behandlung von Krebs, Nirusinfektionen, Erkrankungen des Nervensystems, Transplantatabstoßung, sowie monogenen oder polygenen Erbkrankheiten.
Der aktive Transport in den Kern ist beim Transfer genetischen Materials in allen Zellen nötig, die sich in der Zeitspanne bis zur angestrebten Ausprägung des genetischen Materials nicht teilen. Ein Kerntransportsystem für Nukleinsäuren ist deshalb sehr wichtig, weil es den effizienten Transfer von DNA in solche Zellen ermöglicht, die sich nicht oder nur selten teilen (Dowty et al., 1995, Wilke et al., 1996). In diese Gruppe fallen die meisten primären Zellen. Primäre Zellen sind von höchstem wissenschaftlichen Interesse, weil diese frisch aus einem Organismus isolierten Zellen einerseits den funktioneilen Zustand des Zelltyps viel besser wiedergeben als daraus abgeleitete Zellinien, und weil sie andererseits Zielzellen für Gentherapien sind. Ein Kerntransportsystem erhöht außerdem die Effizienz des DNA-Transfers in etablierte Zellinien, indem auch die Zellen, die sich in der Zeitspanne von Beginn des Transfers bis zur Analyse nicht geteilt haben, transferiertes genetisches Material ausprägen können.
Der Wirkort des genetische Materials ist der Zellkern. Der Transfer dorthin kann zufällig während der Zellteilung auftreten, wenn sich die Kernhülle während der Mitose vorübergehend auflöst, oder er muß aktiv erfolgen.
1) Kemproteine werden durch Kerntransportsignale in den Kern transportiert
Die Doppelmembran, die den Zellkern umschließt, besitzt Poren. Durch diese Poren können kleine Moleküle per Diffusion hindurchtreten. Proteine, die größer als ca. 50 kDa sind, benötigen ein Kernlokalisationssignal (nuclear localisation signal, NLS), das von einer Transportmaschinerie erkannt werden muß, damit sie in den Kern gelangen können. Ein ausreichendes Signal besteht typischerweise aus vier bis acht Aminosäuren, ist reich an den positiv geladenen Aminosäuren Arginin und Lysin und besitzt Proline. Es ist evolutionär stark konserviert, so daß NLS von Säugetierproteinen auch in der Hefe funktionieren. Heterologe NLS können auch als Werkzeug eingesetzt werden, um Zielmoleküle in den Zellkern zu transportieren. Hierzu können NLS an relativ beliebiger Stelle in die Sequenz zytoplasmatischer Proteine eingebaut oder als Peptid chemisch an Proteine oder sogar an Goldpartikel gekoppelt werden (Übersichtsartikel: Görlich, 1998).
2) Viele Viren nutzen die zelleigene Kerntransportmaschinerie für Proteine zum Transport ihrer DNA in den Zellkern
HIV und andere Lentiviren, die in der Lage sind, ruhende Zellen zu infizieren, benutzen virale Proteine und die zelleigene Transportmaschinerie, um ihre DNA in den Kern zu transferieren. Die NLS im Vpr- und im Matrix-Protein des HlV-Präintegrationskomplexes (Gallay et al., 1996) sind essentiell für die Infektion von Zellen, die sich nicht teilen (Naldini et. al., 1996). Obwohl wenig über den Weg bekannt ist, wie Viren ihr Genom in den Nukleus bringen, könnte die Hilfe viraler Strukturproteine mit NLS geradezu ein generelles Prinzip sein. Dafür sprechen auch die folgenden Beobachtungen. Eine spezifische Mutation im HSV Kapsidprotein verhindert den Transport viraler DNA in den Nukleus (Batterson et al., 1983). Adenovirus- DNA wird zusammen mit dem Hexon-Protein des aufgelösten Kapsids in den Kern transportiert (Greber et al., 1993). Der Transport von SV40 DNA in den Zellkern wird durch ein virales Protein (höchstwahrscheinlich Vp3) bewirkt, das dafür mit der DNA assoziiert bleibt (Nakanishi et al., 1996). Zwei bakterielle Proteine mit NLS sind verantwortlich für den Import der T-DNA des Agrobacterium tumefaciens in Pflanzenzellkerne (Citovsky et al., 1994).
Wegen der Fähigkeit mancher Viren zur Infektion ruhender Zellen werden mutierte Varianten von, z. B., HIV, Adenovirus und Herpesvirus als DNA-Transfervehikel für die Entwicklung von Gentherapieansätzen eingesetzt. Dies birgt zum einen das Risiko immunologischer Reaktionen gegenüber Virusbestandteilen (Friedmann 1994, 1996), zum anderen werden in solchen Systemen Helferzellinien eingesetzt, bei denen die Freisetzung weniger stark mutierter Virusgenome nicht ausgeschlossen ist. Schließlich ist die Handhabung dieser Systeme aufwendig. Es sind einige künstliche Systeme beschrieben worden, die mit Hilfe von Peptiden oder Proteinen mit Kerntransportsignalen die Transfektionseffizienz erhöhen sollen.
A) Proteine
Kaneda et. al. (1989) und Dzau und Kaneda, (1997, Patent EP oder US 5,631,237) beschreiben ein Gentransfer- System, das auf der Verwendung von Sendai- Viren, Liposomen und hinzugefugten Proteinen beruht, welche den Kerntransport der DNA unterstützen sollen. Die Arbeitsgruppe setzt dazu HMG-1 ("high mobility group 1 protein") ein, ein basisches Nicht-Histon-Protein des Chromatins, das an DNA bindet. HMG-1 bindet DNA über einen langen basischen Bereich. Es ist im Kern lokalisiert, hat aber kein bekanntes NLS. HMG-1 Protein bildet in vitro mit Vektor-DNA Komplexe. Die Herstellung gereinigten HMG-1 ist aufwendig.
Mistry et al. (1997) beschreiben Versuche zum HMG-1 -vermittelten Keratransport. Hier wird HMG-1 wegen seiner positiven Ladung als DNA-komplexierendes Transfektionsreagenz auch zum Durchtritt der DNA durch die Zellmembran benutzt. Die Effizienz ist gering. Die Firma Wako BioProducts (Richmond, VA, USA) bot (1997) die Proteine HMG-1 und -2 zur Vermittlung des Kerntransportes als Zusatz zu Lipofektionsreagenzien an.
Einen ähnlichen Ansatz verfolgten Fritz et al. (1996) mit Kalbsthymus-Histonen oder einem rekombinanten Protein aus dem NLS von SV40 und humanem Histon Hl. Beide bilden mit der DNA offensichtlich große Komplexe, die zwar, wie in der Veröffentlichung gezeigt, für den Zellmembran-Durchtritt, nicht aber für den Kerntransport geeignet sind.
B) Wegen der einfacheren und preiswerteren Herstellbarkeit wurden auch synthetische Peptide mit NLS-Sequenz eingesetzt.
Die Arbeitsgruppe von P. Aleström (Collas et al., 1996, Collas und Aleström, 1996, 1997a, b) benutzt das NLS Peptid von SV40, um damit DNA zu komplexieren und diese von der Zelle in den Kern transportieren zu lassen. Diese DNA-Bindung findet allein über die für die Funktion essentiellen, positiv geladenen Aminosäuren im NLS statt. Das führt dazu, daß das eigentliche Signal für die Kerntransportproteine so lange von der DNA maskiert ist, wie die DNA mit dem Peptid verbunden ist. In isolierten in vitro gebildeten männlichen Vorkemen aus Seeigelspermien konnte in Lysat befruchteter Zebrafischeier ein NLS-abhängiger Transport Fluoreszenz-markierter DNA beobachtet werden. Bei einem molaren Verhältnis von ≥ 100:1 (NLS-Peptid:Vector) und ≥IOOO Vektorkopien pro Zelle konnte in Zebrafischembryonen eine Erhöhung der Expression von Luziferase beobachtet werden, wenn die Vektor-DNA ins Zytoplasma der Zellen microinjiziert wurde (bei 100 Peptiden/Vektor und 1000 injizierten Vektoren eine 6-fache Erhöhung im Vergleich zu 0 Peptid). Daß überhaupt ein Effekt zu beobachten ist, könnte daran liegen, daß bei hoher Dichte nicht alle NLS vollständig an die DNA binden und so Teile für die Transportmaschinerie zugänglich bleiben (vergl. Sebastyen et al., 1998). Die Transportmaschinerie ist wahrscheinlich in der Lage, aus zwei Peptidsequenzen zusammengesetzte Signale zu erkennen (Boulikas 1993).
Von Sebastyen et al. (1998) wurden viele hundert NLS-Peptide von SV40 kovalent an DNA- Moleküle gekoppelt, und zwar verteilt über den gesamten DNA-Strang. Die DNA kann aufgrund ihrer massiven Modifizierung nicht mehr transkribiert werden und wird, wie auch in der Veröffentlichung diskutiert, offensichtlich erst dann in den Kern transportiert, wenn so viele NLS-Peptide gebunden sind, daß aus sterischen Gründen nicht mehr alle durch die Interaktion mit den negativen Ladungen der DNA maskiert werden.
Gopal (US Patent 5670347) beschreibt ein Peptid, das aus einer DNA-bindenden basischen Region, einer flexiblen „hinge" Region und einem NLS besteht. Da auch hier die DNA-Bindung über positive Ladungen der Aminosäuren erreicht wird, bildet das Reagenz mit der DNA Komplexe, die gleichzeitig dem Transport durch die Zellmembran dienen sollen. Es ist nicht ersichtlich, warum die NLS-Sequenz nicht an der DNA-Bindung beteiligt sein sollte, so ist wahrscheinlich wieder das eigentliche Signal für die Kerntransporproteine so lange von der DNA maskiert, wie die DNA mit dem Peptid verbunden ist. Außerdem können die entstehenden Komplexe sehr groß werden (Emi et al., 1997, Niidome et al., 1997, Wadhwa et al., 1997, Trubetskoy et al., 1998), was einen Transport durch die Kemporen beeinträchtigen würde (Lanford et al., 1986, Yoneda et al., 1987, 1992). Ein Effekt, der über die bekannte Wirkung von polykationischen Peptiden als Transfektionsreagenz, das den Durchtritt der DNA durch die Zellmembran unterstützt (Sorgi et al., 1997, vergl. Hawley-Nelson et. al., 1997), hinausgeht, ist nicht gezeigt.
Gerhard et al. (DE-OS 195 41 679) schlagen NLS-Polylysinkonjugate für den Gentransfer vor. Auch hierfür gilt, daß die entstehenden Komplexe aus kationischem Polylysin, kationischem NLS und DNA das eigentliche Kerntransportsignal maskieren, solange es mit der DNA verbunden ist.
Szoka (PCT von 1993 Claim 23-27) koppelt NLS-Peptide über ein interkalierendes Agens an DNA. Nach einer Vorinkubation von Vektor und Peptid (im Verhältnis 1 :300) erhöht sich die
Effizienz einer Lipofektion 4-5-fach. Das verwendete SV40-Peptid ist aufgrund seiner stark positiven Ladung in der Lage, DNA zu komplexieren. Komplexierung von DNA mit kationischen Peptiden führt zur Erhöhung der Effizienz einer Lipofektion durch Verbesserung der Effizienz des Durchtritts durch die Zellmembran (Sorgi et al., 1997, vergl. Hawley-Nelson et. al., 1997). Ein Keratransport wird dadurch, zumindest wenn große Komplexe entstehen, eher behindert (s.o.). Da die verwendeten NLS-Peptide selbst aufgrund ihrer Ladung an die
DNA binden, wird die Erkennung des Transportsignals für die Kerntransportmaschinerie behindert (s.o.). Die im Beispiel aufgeführte Verwendung von mutagenen Interkalatoren schränkt die Anwendbarkeit ein. Szoka schlägt weitere Moleküle für die Transfektion vor, die DNA ebenfalls nicht-kovalent und unspezifisch binden, aber nicht verhindern können, daß das
NLS-Peptid wie zuvor selbst an die DNA bindet und diese komplexiert. Auf das Problem einer direkten Bindung des NLS-Peptides an die DNA wird nicht eingegangen.
Hawley-Nelson et al. (US Patent 5736392) beschreiben ein vergleichbares System. Ein NLS- Peptid wird entweder direkt oder nach kovalenter Kopplung an ein DNA-bindendes Molekül mit Vektor-DNA gemischt. Die entstehenden Komplexe werden anschließend für Lipofektion (oder andere Transfektionen) eingesetzt. In diesem System erhöht die Zugabe eines polykationischen Peptids ohne NLS die Transfektionseffizienz sogar stärker als die Zugabe eines kationischen NLS. Die Kopplung von Spermidin an das NLS-Peptid bewirkt keine weitere Erhöhung der Transfektioneffizienz. Also ist auch hier der Verstärkungseffekt allein durch die Komplexierung der DNA über kationische Peptide zu erklären. Da das Vorhandensein von NLS die Transfektionseffizienz nicht weiter erhöht, ist davon auszugehen, daß auch hier die Erkennungssequenz für die Kerntransportmaschinerie maskiert ist.
Die Firma TIB Molbiol (Broschüre 1998) beschreibt den Transport von PNA-Oligonukleotiden mit einem C-terminalen NLS-(Nuclear Localization Signal)-Peptid, um die Genexpression ausgewählter Gene spezifisch zu unterdrücken. Das NLS dient hier dem Transport der PNA- Oligonukleotide in den Kern, damit sie dort mit der Zielsequenz hybridisieren können.
Die bisher bekannten Agenzien zum Transport von DNA in den Zellkern haben den Nachteil, daß die Effizienz sehr gering ist. Diese niedrige Effizienz reicht aber nicht aus, um teilungsinaktive Zellen transfizierbar zu machen.
Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Kemtransportagenz bereitzustellen, daß einen effizienten Transport von DNA in den Kern ermöglicht, so daß auch ruhende oder sehr schwach teilungsaktive Zellen in einem sinnvollen Maße transfizierbar sind.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Kemtransportagenz bestehend aus zwei Modulen A und B, wobei Modul A spezifisch an DNA bindet und nicht durch unspezifische Bindung zur Bildung von Komplexen mit mehr als einem DNA-Molekül führt und Modul B ein Kernlokalisationssignal oder ein Nicht-NLS-Signal enthält, das nicht unspezifisch an DNA bindet. Ein bevorzugtes erfindungsgemäße Kemtransportagenz umfaßt ein Modul A, daß sequenzspezifisch an die DNA bindet und/oder spezifisch an DNA-Enden bindet. Besonders bevorzugt ist ein Kemtransportagenz bei dem das Modul A ein synthetisches Peptid, ein Protein oder eine PNA (peptide nucleic acid) ist.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kemtransportagenz enthält Modul B ein erweitertes Kernlokalisationssignal, das aufgrund seiner Ladungen keine Komplexe mit DNA bildet. Bevorzugt ist ein Kemtransportagenz bei dem Modul B ein erweitertes Kernlokalisationssignal enthält, das eine annähernd neutrale Summenladung aufweist. Besonders bevorzugt ist ein Kemtransportagenz bei dem Modul B ein erweitertes Kernlokalisationssignal enthält, das ein Kernlokalsationssignal und flankierende negativ geladene Aminosäuren umfaßt. Eine NLS-Sequenz muß nicht identisch mit einer natürlich vorkommenden NLS-Sequenz sein, sie kann auch eine auf theoretischen Überlegungen basierende Aminosäureabfolge sein, solange sie als NLS funktioniert. Modul B kann weiter Peptidsequenzen oder nicht Peptidkomponenten enthalten, die nicht direkt zum Kernlokalisationssignal oder erweiterten Kernlokalisationssignal zu zählen sind. Vorzugsweise eine Komponente, die den Abstand zwischen Kernlokalisationssignal und Modul A erhöht.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Gentransfersystem umfassend ein erfindungsgemäßes Kemtransportagenz und ein kationisches Lipid, Peptid, Polyamin oder kationisches Polymer.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Transport von DNA in den Kern eukaryontischer Zellen, vorzugsweise primäre Zellen, wobei die Zellen mit der zu transportierenden DNA und dem erfindungsgemäßen Kemtransportagenz nach dem Stand der Technik entsprechenden Methoden transfiziert werden.
Eine zusätzliche Ausführungsform betrifft die Verwendung von des erfindungsgemäßen Kemtransportagenz in der Gentherapie, insbesondere zur Behandlung von Krebs, Virusinfektionen, Erkrankungen des Nervensystems, Transplantatabstoßung sowie monogenen oder polygenen Erbkrankheiten.
Der Ausdmck "unspezifische Bindung des Ke lokalisationssignals an DNA", wie er im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird, meint eine Bindung, die zur Folge hat, daß das Kernlokalisationssignal nicht mehr vollständig von der Kerntransportmaschinerie erkennbar ist.
Der Ausdmck "spezifische Bindung des Moduls A an DNA", wie er im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird, meint einerseits eine sequenzspezifische Bindung, bei der die Abfolge der DNA Nukleotide für die Bindung ausschlaggebend ist, andererseits eine kovalente Bindung an DNA, die durch DNA Einzel- oder Doppelstrangenden vermittelt wird.
Der Ausdmck "erweitertes Kernlokalisationssignal", wie er im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird, meint daß ein Kernlokalisationssignal zusätzliche, flankierende Aminosäuren aufweist. Bevorzugt ist ein erweitertes Kernlokalisationssignal, das 2-40, vorzugsweise 4-20, zusätzliche, flankierende Aminosäuren aufweist.
Der Ausdmck "erweitertes Kernlokalisationssignal, das aufgrund seiner Ladungen keine Komplexe mit DNA bildet", wie er im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird, meint, daß Modul B ein Kernlokalisationssignal enthält, dessen Ladung so verteilt ist, daß es nicht unspezifisch mit DNA interagiert und daher für die Kerntransportmaschinerie vollständig zugänglich bleibt.
Der Ausdmck "annähernd neutrale Summenladung", wie er im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet wird, meint, daß der erweiterte Teil des Kemlokalisationssignals negativ geladene Aminosäuren aufweist, um die positive Ladung des eigentlichen Kemlokalisationssignals auszugleichen, so daß nicht mehr als drei positive Ladungen im Überschuß im gesamten Bereich des erweiterten Kemlokalisationssignals vorkommen.
Das erfindungsgemäße Kemtransportagenz hat den Vorteil, das es nicht zu einer Komplexierung der DNA führt. Ein weiterer Vorteil ist, daß das Kernlokalisationssignal frei zugänglich für die Kerntransportmaschinerie bleibt. Die Vermeidung von großen, den Kerntransport behindernden DNA-Komplexen und das Freibleiben der Kernlokalisationssignale für die Kerntransportmaschinerie bei Verwendung der erfindungsgemäßen Kerntransportagenzien führen zu einem deutlich effizienteren Transport der DNA in den Kern.
Erfindungsgemäß führen weder der DNA-bindende Anteil (Modul A) noch das Kernlokalisationssignal (Modul B) zur Bildung großer DNA-Komplexe.
Modul A
Modul A bindet spezifisch an DNA und führt nicht zur Bildung von Komplexen mit mehr als einem DNA-Molekül. Modul A bindet entweder sequenzspezifisch (d. h. nicht unspezifisch allein aufgrund positiver Ladungen), oder kovalent an DNA-Enden. Modul A kann ein Peptid unterschiedlicher Länge oder ein Protein sein oder eine PNA-Sequenz (Nielson et al., 1991) oder eine andere Substanz, die sequenzspezifisch an Nukleinsäuren bindet. Modul A kann weiterhin ein rekombinantes Protein sein, das sequenzspezifisch an DNA bindet, wie z. B. der lac-Repressor oder eine hochaffine Mutante davon (Kolkhof, 1992, Fieck et al., 1992) oder eine retrovirale Integrase, die sequenzspezifisch an DNA-Enden (mit einer LTR core-Sequenz) bindet (Ellison und Brown, 1994).
Eine kovalente Bindung an ein Strangende kann biologisch, z.B. durch die Topoisomerase I des Poxyvirus, vermittelt werden, wenn das Strangende einer linearen DNA eine Sequenz trägt, die als „Suizid-Substrat" zwar einen Topoisomeraseschnitt aber keine Religation ermöglicht (Shuman, 1994).
Modul B
Modul B ist ein Kernlokalisationssignal oder ein Nicht-NLS-Signal, das nicht unspezifisch an DNA bindet.
Der Begriff Nicht-NLS-Signale bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung Signale, die keine Kernlokalisationssignale sind, die aber im Rahmen von Transfektion, Gentherapie oder DNA- Vakzinierung dem Transport der DNA in die Zelle oder dem Transport von DNA innerhalb der Zelle dienen.
Zu den Nicht-NLS-Signalen zählen unter anderem: Liganden für zelluläre Oberflächenstmkturen, die DNA- Aufnahme, z.B. die Rezeptor- vermittelte, vermitteln können; Peptide, die Membranen destabilisieren, z.B. zur Förderung des frühzeitigen Austritts der DNA aus den Endosomen; Signale, die in der Zelle die Bindung an Transportstrukturen vermitteln, um einen intrazellulären Transport zum Kern zu begünstigen.
Das Kernlokalisationssignal ist vorzugsweise ein erweitertes Kernlokalisationssignal (wie vorstehend definiert), das aufgrund seiner Ladungen oder räumlichen Ausrichtung im Bezug zum DNA bindenden Modul A keine Komplexe mit DNA bildet.
Das Kernlokalisationssignal kann synthetisch hergestellt werden, oder als Teil eines Proteins vorliegen. Bei einem Kernlokalisationssignal, wie es im erfindungsgemäßen Kemtransportagenz eingesetzt wird, werden solche Signalsequenzen - mit und ohne flankierende Regionen - verwendet, die nicht so über ihre positiven Ladungen an die DNA binden, daß diese Ladungen, die einen essentiellen Teil der meisten Kerntransportsignale ausmachen, als Signal für die Kerntransportmaschinerie maskiert sind.
Modul B kann, neben dem Kernlokalisationssignal, oder Nicht-NLS-Signal, Peptidsequenzen oder nicht-Peptidkomponenten enthalten, die nicht dem Kernlokalisationssignal oder dem erweiterten Kernlokalisationssignal zuzurechnen sind. Sie dienen vorzugsweise der besseren sterischen Ausrichtung des Kemlokalisationssignals, insbesondere der Erhöhung des Abstandes zur DNA.
Gut geeignet sind erweiterte Sequenzen klassischer NLS, wenn die Summenladung des Peptids durch flankierende negativ geladene Aminosäuren annähernd ausgeglichen werden kann. Diese Aminosäuren können im Protein an diesen Positionen natürlicherweise vorkommen oder aufgrund struktureller Überlegungen dort eingeführt worden sein. In der Nachbarschaft vieler NLS „core" Sequenzen liegen im ursprünglichen Kontext negative Aminosäuren (Xiao et al., 1997). Für ein NLS aus SV40, das das am besten untersuchte ist, konnte gezeigt werden, daß diese flankierenden Sequenzen die Effizienz des Kerntransportes deutlich erhöhen (Rihs und Peters, 1989, Rihs et al., 1991, Chen et al., 1991, Jans et al., 1991, Xiao et al., 1997). Ein großes Protein (IgM) wurde nur nach chemischer Kopplung des um benachbarte Sequenzen erweiterten SV40-NLS in den Kern transportiert, nicht aber nach Kopplung des SV40 „core" NLS-Peptides (Yoneda et al., 1992).
Ist das NLS Teil eines sequenzspezifisch an die DNA bindenden Proteins, ist die Gefahr einer Maskierung dieser Sequenz(en) durch die DNA relativ gering. Auch hier können aber wegen der höheren Effizienz verlängerte NLS-Sequenzen verwendet werden.
Auch sogenannte Nicht-klassische-NLS, wie z.B. ein NLS aus dem Influenza Vi s "nucleoprotein" (Wang et al., 1997, Neumann et al., 1997), die keinen großen Überschuß an positiven Ladungen besitzen oder nicht über den klassischen Transportweg in den Kern gelangen, können Verwendung finden.
Eine (nicht vollständige) Übersicht über NLS, wie sie hier gemeint sind, gibt T. Boulikas (1993, 1996, 1997). Schließlich können auch solche Kerntransportsignale Verwendung finden, die Komponenten der Kerntransportmaschinerie selbst entnommen sind, so z.B. die Importin ß bindende Domäne (IBB) von Importin α. Das NLS bindende Protein Importin α ist über diese Domäne mit der restlichen Kerntransportmaschinerie verbunden (Görlich et al., 1996, Weiss et al., 1996)
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Nicht-NLS-Signal über PNA (als Modul A) an vorhandene Vektorsequenzen gebunden. Die Bindung zwischen PNA und Vektor ist sequenzspezifisch. Dies ermöglicht, solche Nicht-NLS-Signale an fast alle gängigen Expressionsvektoren zu koppeln, ohne daß diese verändert werden müssen.
Zur sequenzspezifischen Bindung von PNA an die DNA werden ausschließlich solche DNA- Sequenzen des Vektors benutzt, deren Maskierung durch PNA dem späteren Verwendungszweck der DNA nicht wesentlich schadet. Bei Expressionsvektoren werden vor allem Sequenzen im Plasmidrückgrat verwendet, besonders solche, die in den meisten gängigen Expressionsvektoren vorkommen (z.B. Promotor des Ampicillin-Resistenzgens), aber auch eine Bindung im nicht-kodierenden Strang im Expressionsbereich ist möglich. Ein Vorteil der sequenzspezifischen Bindung ist, daß eine einfache und schnelle Bindung von PNA-Peptid- Hybrid an die DNA stattfindet. In Beispiel 2 ist z.B. eine einfache und schnelle Bindungsreaktion (5 min., 65°C) von PNA-Peptid-Hybriden an doppelsträngige DNA gezeigt. Zwischen PNA-Anteil und dem eigentlichen Signal kann ein Spacer liegen. Der Spacer kann dazu dienen, den Abstand von Signal zur DNA zu erhöhen, z.B. um sterische Behinderungen zu verringern. Der Spacer kann auch dazu dienen, eine Sollbruchstelle einzuführen, um z.B. im endosomalen Milieu die Abtrennung eines Liganden zu erlauben, über den die DNA an einen endozytierten Zeiloberflächenrezeptor gebunden ist.
Die vorliegende Erfindung macht erstmals ruhende und schwach teilungsaktive Zellen zu einem Prozentsatz transfizierbar, der eine nachfolgende Analyse ermöglicht. Die meisten frisch aus dem Körper eines Tieres oder eines Menschen isolierten Zellen (primäre Zellen) teilen sich nicht oder so selten, daß DNA, die erfolgreich durch die Zellmembran transportiert worden ist, inaktiviert wird, bevor sie in den Kern gelangen und exprimiert werden kann. Das führte bisher dazu, daß diese primären Zellen untransfizierbar waren, es sei denn, sie wurden in Kultur künstlich zur Teilung stimuliert. Dies hat allerdings immer zur Folge, daß sie sich vom ursprünglichen Zustand entfernen. Eine Technik zur Transfektion primärer Zellen ermöglicht die Analyse von genetischem Material unter den ursprünglichen Bedingungen einer Körperzelle, was für die Erforschung der Wirkungsweise von Genen und für die Erforschung von Prozessen innerhalb einer Körperzelle von großer Bedeutung ist.
Die erfindungsgemäße Lehre, die primäre Zellen transfizierbar macht, stellt außerdem einen essentiellen Schritt zu einem komplett künstlichen Gentransfersystem für die Gentherapie dar. Ein solches Gentransfersystem muß drei funktionale Komponenten besitzen: eine Komponente für den Durchtritt der DNA durch die Zellmembran, wofür sich kationische Lipide und andere kationische Polymere als relativ gut geeignet erwiesen haben, eine weitere für den Transfer der DNA in den Kern der (meist teilungsinaktiven) Zielzellen und eine dritte, die für die Integration der DNA ins Genom sorgt. Erfindungsgemäß wird erstmals hier ein effizientes Agenz beschrieben, das als zweite Komponente dienen kann. Ein komplett künstliches Gentransfervehikel, das in der Gentherapie eingesetzt werden kann, wird aller Erwartung nach leichter und billiger herzustellen und leichter zu handhaben sein als die momentan angewendeten viralen Systeme und ist nicht mit den immanenten Risiken dieser Systeme behaftet. Gentherapeutische Ansätze sind z.B. für die Behandlung von Krebs, AIDS und diversen Erbkrankheiten vorgeschlagen worden und werden eine sehr große Rolle in der Medizin spielen.
Die erfindungsgemäß beschriebenen Kerntransportagenzien erhöhen die Effizienz der Transfektion in solche Kulturzellen, die bisher schon transfizierbar waren, indem nun auch diejenigen Zellen DNA in den Kern aufnehmen können, die sich im Zeitfenster zwischen Durchtritt der DNA durch die Zellmembran und Analyse nicht teilen. Das ist deshalb von Bedeutung, weil auch bei vielen etablierten Zellinien eine Erhöhung der Transfektionseffizienz die Analyse erleichtem und durch den geringeren Bedarf an Zellmaterial die Kosten senken würde. Natürlich gilt dies auch für alle Zwischenstufen zwischen primären Zellen und etablierten Zellinien.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind nicht als beschränkend aufzufassen. Beispiel 1: PNA-Peptid-Hvbride
Es wurden NLS-PNA-Kerntransportreagenzien verwendet. Es wurden solche PNA-Sequenzen eingesetzt, die in der Lage sind, in den DNA-Doppelstrang einzuwandern (Nielson et al., 1991, Nielson, US-Patent 5,539,082).
Im Plasmidrückgrat fast aller Expressionsvektoren finden sich im Ampicillinresistenzgen und im Replikationsursprung zwei gut geeignete Sequenzen für eine solche hochaffine PNA-Bindung.
Die verwendeten Peptide enthalten als Peptidbestandteile: entweder 1) "SV21": NH2-GKPTADDQHSTPPKKKRKVED-COOH (Peptid 1; SEQ ID NO:l), oder
2) "SV27" NH2-GKPSSDDEATADSQHSTPPKKKRKVED-COOH (Peptid 2; SEQ ID NO:2).
Jeweils am N-Terminus beider Peptide befindet sich die folgende PNA-Sequenz: Entweder
A) "ori": NH2-CCTTTCTCCCTTC-Peptid (SEQ ID NO:3) oder
B) "ssp" : NH2-CTCTTCCTTTTTC-Peptid (SEQ ID NO:4) oder
C) die Peptid/PNA-Mischsequenz NH2-CCTTT-GGGGGGG -TTTCC-Peptid (SEQ ID NO: 5), für die es ca. 30 Bindungsstellen in einem durchschnittlichen Expressionsvektor (5 kb) gibt (G = die Aminosäure Glycin).
5 μg in Wasser gelöster Vektor-DNA wurden in 10 μl 25 μM NLS-PNA für 10 min bei 60°C inkubiert. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit RPMI auf ein Volumen von 250 μl aufgefüllt. 5xl06 Chinese hamster ovary (CHO)-Zellen wurden bei 60 bis 80% Konfluenz mit 5 mM EDTA abgelöst, in 15 ml PBS gewaschen (10 min bei 50xg abzentrifügiert). Das Pellet wurde in 250 μl RPMI aufgenommen und mit der vorinkubierten DNA gemischt, in eine Elektroporationsküvette (0,4 cm Spaltbreite) überführt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Elektroporation (210 V, 975 μF, BioRad Genepulser) wurde die Küvette weitere 10 min bei 37 °C inkubiert, bevor die Zellen in vorgewärmtem Medium ausplattiert wurden. Um eindeutig zu zeigen, daß solche Zellen transfiziert wurden, die sich vom Beginn des Experiments bis zur Analyse nicht geteilt hatten, wurden die Zellen mit pMACS4.1 (einem Expressionsvektor für humanes CD4) mit der beschriebenen Methode transfiziert und die Zellteilung wurde folgendermaßen gemessen. Durch Inkubation in 1 μM Carboxyfluorescein- Diacetat-Succinimidester (CFDA, SE) (Molecular Probes, Eugene, USA) wurden die Zellen vor der Transfektion grün-fluoreszent markiert. Durch Teilung halbiert sich die Helligkeit der Zellen. Mit dem Durchfluß-Zytometer (FACSCalibur) wurde dann auf Einzelzell-Niveau bestimmt, daß Zellen, die sich nicht geteilt haben (volle grüne Fluoreszenz) das transfizierte Gen ausprägen (dunkelrote Fluoreszenz nach Färbung mit Cy5-gekoppeltem anti -CD4 Antikörper).
Beispiel 2: Schnelle Bindung von PNA-NLS an vorhandene Vektorsequenzen
Es wurden PNA-Peptid-Hybride an doppelsträngige DNA gebunden. Eine vorhandene Vektorsequenzen kann innerhalb von 5 min fast quantitativ (>90%) über PNA mit einem NLS-Peptid markiert werden. Für eine Bindung hitzelabiler Komponenenten über PNA reicht eine einstündige Inkubation bei 37°C aus, um den größten Teil der DNA zu markieren (Tabelle 1). 100 ng eines Expressionsvektors wurden in TE (pH 7,8) mit 25 μM verschiedener PNA-Peptide-Hybride bei 65°C oder 37°C für fünf Minuten bis drei Stunden inkubiert. Die verwendete PNA-Sequenz NH2-CTCTTCCTTTTTC-COOH (SEQ ID NO:6) bindet im Promoterbereich des Ampicillinresistenzgens. Am C-Terminus befindet sich ein Peptid von 21 Aminosäuren (Peptid 1) oder 27 Aminosäuren (Peptid 2) Länge oder ein Spacer aus 10 AEEA-Einheiten (Fmoc-AEEA-OH Spacer, PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, USA) gefolgt von 27 Aminosäuren (Peptid 3). Die Bindungsansätze wurden danach mit der Restriktionsendonuklease Earl umgesetzt. Die gespaltene DNA wurde mit YOYO (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA) gefärbt, auf einem Agarosegel aufgetrennt und mit einem Fluoreszenz-Lesegerät (Image Plate Reader FLA 2000, Auswertungssoftware L-Process, Version 1.6, Fuji Photo Film Co., Ltd., Tokio) quantifiziert. An der PNA-Bindungsstelle wird die Spaltung der DNA durch die Restriktionsendonuklease verhindert, andere Earl- Schnittstellen dienen der internen Kontrolle der Reaktion.
Tab.l Anteil peptidmarkierter DNA in Prozent der eingesetzten DNA
Die Bindereaktion der PNA an die DNA ist einfach, robust und schnell. Die Bindung ist praktisch irreversibel und damit geeignet für zelluläre Transportvorgänge. Peptide und PNA sind billiger herzustellen und länger und einfacher zu lagern als Proteine.
Beispiel 3: Transfektion mit PNA-NLS
Bei teilungsaktiven Zellinien führt aktiver Kerntransport transfizierter DNA dazu, daß diese früher exprimiert werden kann als DNA, die nicht transportiert wird. Unter der Voraussetzung, daß transfizierte DNA im Zytoplasma lange genug überdauert, sollten sich in stark teilungsaktiven Zellen die Expressionsraten transfizierter DNA mit und ohne Kemtransportreagenz allmählich aneinander annähern. Dies ist darin begründet, daß im Zytoplasma vorhandene tranfizierte DNA während der Zellteilung in den Kern gelangen kann. Mit Aphidicolin läßt sich die Teilungsaktivität und damit auch die Transfizierbarkeit stark reduzieren, aktiver Kerntransport hebt diesen Effekt der reduzierten Transfektionseffizienz wieder auf.
Für die Elektroporation wurden 5 μg in Wasser gelöster linearisierte Vektor-DNA in 10 μl mit und ohne 25 μM PNA-NLS (Peptid 3: NH2-(AEEA)10-
GKPSSDDEATADSQHSTPPKKKRKVED-COOH.) für 10 min bei 65°C inkubiert. Dann wurde weiter verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben. Für die Lipofektion wurden 3 μg in Wasser gelöster Vektor-DNA in 10 μl mit und ohne 25 μM PNA-NLS (Peptid 3) für 10 min bei 65°C inkubiert. Die Transfektion mit Lipofectamine (Life Technologies GmbH, Karlsruhe) erfolgte danach entsprechend den Herstellerangaben.
Um die Teilung von CHO Zellen wesentlich zu inhibieren, wurden sie für 24 Stunden ohne Serum und dann für weitere 12 Stunden mit Serum und 20 μg/ml Aphidicolin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen) inkubiert. Alle nachfolgenden Schritte der Lipofektion wurden in Gegenwart von 20 μg/ml Aphidicolin durchgeführt. Die Ergebnisse der Transfektion sind in Figur 1 dargestellt.
Zwei elektrisch neutrale NLS, die an eine in den meisten Expressionsvektoren vorhandene Sequenz gebunden sind, sind in der Lage, den Prozentsatz transfizierter Zellen früh nach einer Transfektion zu verdoppeln, obwohl sich erst wenige Zellen geteilt haben. Die Verringerung der Transfektionseffizienz durch eine Reduktion der Zellteilung mit Aphidicolin läßt sich auf diese Weise wieder aufheben.
Beispiel 4: Sequenzspezifisch bindendes NLS-Fusionsprotein
Als sequenzspezifisch DNA-bindendes Protein wurde eine hochaffin bindende Mutante des lac- Repressors aus E. coli eingesetzt. Diese Mutante hat eine Bindungskonstante von 10"15 M für die lac-Operatorsequenz (Kolkhof, 1992). Die hohe Affinität wird durch einen Aminosäureaustausch Serin 61 zu Leucin erreicht.
Die hier verwendeten Kerntransportproteine weisen eine Deletion der letzten dreißig C- terminalen Aminosären (Position 331 - 360) und einen Austausch des Leucin in Position 330 zu einem Serin auf. Diese mutierten Proteine bilden Homodimere anstelle von Homotetrameren und haben dadurch nur eine DNA-Bindungsstelle anstelle von zweien. Aber auch Tetramere können für ein erfindungsgemäßes Kemtransportagenz eingesetzt werden. Die Dimer- Varianten wurden am N-Terminus um jeweils ein NLS verlängert:
"NID" NLS 1 : MPKKKRKV-MKP VTLYDVA
"N2D" NLS2: MEEDTPPKKKRKVEDL-KPVTLYDVA
(Die NLS-Sequenzen sind hier durch Fettdruck hervorgehoben und entsprechen SEQ ID NO: 8 bzw. SEQ ID NO:9. Die Sequenzen MKPVTLYDVA ... und KPVTLYDVA ... bezeichnen den vorstehend beschriebenen lac-Repressor aus E.coli.) NLS1 entspricht dem NLS des großen T-Antigens des SV40 Vims. NLS2 ist ein der Summenladung nach neutrales Hybrid aus dem SV40-NLS und der N-terminal flankierenden Region des NLS des Polyoma- Virus VP2-Proteins.
Lac-Operatorsequenzen kommen in einer Reihe von Expressionsvektoren vor und lassen leicht als Überhang eines PCR-Primers mit jeder beliebigen Sequenz verknüpfen.
Beispiel 5: DNA-Bindung von lac-Repressor Mutanten mit NLS
Für Bindungsstudien wurden folgende lac-Operator-Sequenzen verwendet: der natürlich vorkommende Operator: AATTGTGAGC GGATAACAATT und eine perfekt palindromische Operator- Seqeuenz: AATTGTGAGC GCTCACAATT. Es wurden 0,7 ng eines radioaktiv markierten DNA-Fragments von lkb Länge durch Restriktionsverdau in Fragmente der Länge von 914 und 86 bp zerlegt und mit lac-Represor NLS-1-Dimer bzw. NLS-2-Dimer für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Fragmente wurden danach auf einem Polyacrylamidgel aufgetrennt (Figur 2). Durch spezifische Bindung wird das 86 bp Fragment, das einen lac-Operator enthält, retardiert. Unspezifische Bindung führt zur Retardierung des 914 bp-Fragmentes, ohne lac-Operator. Bei kompletter spezifischer Bindung ist so gut wie keine unspezifische Bindung feststellbar.
In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, daß die Bindung stattfindet und stabil ist unter sehr unterschiedlichen Bedingungen, wie z.B. im Zellkulturmedium RPMI, in 150 mM Kochsalz oder einem Puffer aus 10 mM Tris/HCl (pH 7,2), 10 mM Kaliumchlorid und 3 mM Magnesiumacetat, mit beiden getesteten Operatorsequenzen.
Beispiel 6: Kerntransport von DNA durch lac-Repressor-NLS
Ca. 8 μg (100 pmol) lac-Repressor-NLS-Mutanten wurden mit 2 μg (100 pmol) einer doppelsträngigen DNA von 30 bp Länge, die an beiden Enden mit dem fluoreszenten Molekül Cy5 markiert war, in 300 μl 10 mM Tris/Cl (pH 7,2)), 10 mM KC1, 3 mM Mg-Acetat und 50 μg/ml BSA für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Überschüssige, nicht gebundene DNA wurde durch eine Zentrifugation durch einen Microcon-Filter (Amicon) abgetrennt und die Probe wurde danach in Zeilinjektionspuffer umgepuffert (76 mM K2HPO4, 17 mM KH2PO , 14 mM NaH2PO4 (pH 7,2).
In jeweils 50 NIH3T3-Zellen wurde ein Gemisch aus DNA, gebunden an lac-Repressor- Mutanten, und Fluorescein-markiertem BSA (BSA-FITC) ins Zytoplasma mikroinjiziert (Eppendorf Transjektor 5246 mit Femtotips, 0,5 μm Durchmesser, Injektionsdruck 55 hPa, Injektionszeit 0,5 sec). 10 bis 15 min nach der Injektion erfolgte eine fluoreszenzmikroskopische Auswertung (siehe Figur 3). Bei erfolgreicher Zytoplasmainjektion befindet sich (BSA-FITC) ausschließlich im Zytoplasma (la, 2a, 3a). Bei Bindung an lac- Repressor-NLS-Mutanten ist in praktisch allen auswertbaren Zellen die DNA nach weniger als 15 min (NLSl-Dimer, 2b) bzw. weniger als 10 min (NLS2-Dimer, 3b) in den Kern transportiert worden und annähernd quantitativ aus dem Zytoplasma verschwunden. Kontrollexperimente zeigen, daß markierte DNA alleine im Zytoplasma bleibt (lb).
Beispiel 7: Transfektion mit lac-Repressor-NLS
Je 1 μg einer linearen DNA von 1,1 kb Länge, die eine vollständige Expressionskassette und hinter der Polyadenylierungssequenz eine perfekt palindromische lac-Operator Seqeuenz enthält, wurde in 50 μl isotonischen 0,5 x RPMI (für Lipofektion) oder 150 mM NaCl (für Transfektion mit Polyethylenimin) für 30 min bei Raumtemperatur mit verschiedenen Konzentrationen an lac-Repressor-Protein inkubiert, und zwar mit mit ca. 2,5 μg, 0,3 μg und 0,15 μg Dimer bzw. 5 μg, 0,6 μg und 0,3 μg Tetramer. Die Proben wurden danach entsprechend den Herstellerangaben mit Lipofectamine (Life Technologies) oder Polyethylenimin (PEI; ExGen 500, Fermentas) komplexiert und auf konfluente NIH3T3 -Zellen gegeben. Die Ergebnisse sind in Figur 4 dargestellt.
Lac-Repressor-NLS kann die Transfektionseffizienz 4 h nach der Transfektion um einen Faktor von 3-4 erhöhen. Im hier aufgeführten Beispiel wurden adhärente NIH3T3 vor der Transfektion bis zur Konfluenz kultiviert, was zu einer weitgehenden Teilungsinhibition führt. 4 h nach der Transfektion haben sich erst sehr wenige Zellen geteilt. Der Zeitraum, in dem die ohnehin schon geringe Teilungsaktivität in diesem Beispiel relevant für die Transfektion ist, wird dadurch noch verkürzt, daß die transfizierte, endozytotisch aufgenommene DNA zunächst die Endosomen und dann dem Komplex mit dem kationischen Transfektionsreagenz verlassen muß, bevor sie in den Kern transportiert und exprimiert werden kann. Lipofectamine-DNA Komplexe überdauern wahrscheinlich deutlich länger als Komplexe mit Polyethylenimmin, was dazu führt, daß der Effekt von lac-Repressor-NLS mit Lipofectamine weniger deutlich ausfällt. Wenn sich die meisten Zellen nach 24 h einmal geteilt haben, nähern sich die Expressionsraten transfizierter DNA mit und ohne Kemtransportreagenz allmählich aneinander an.
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Claims

Patentansprüche
1. Kemtransportagenz bestehend aus zwei Modulen A und B, dadurch gekennzeichnet, daß Modul A spezifisch an DNA bindet und nicht zur Bildung von Komplexen mit mehr als einem DNA-Molekül führt und
Modul B ein Kernlokalisationssignal enthält, das keine unspezifische Bindung des Kerntransportagenzes an die DNA vermittelt.
2. Kemtransportagenz gemäß Anspmch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Modul A sequenzspezifisch an die DNA bindet.
3. Kemtransportagenz gemäß Anspmch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Modul A spezifisch an DNA-Enden bindet.
4. Kemtransportagenz gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß Modul A ein Peptid, ein Protein oder eine PNA (peptide nucleic acid) ist.
5. Kemtransportagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Modul B ein erweitertes Kernlokalisationssignal enthält, das aufgmnd seiner Ladungen keine Komplexe mit DNA bildet.
6. Kemtransportagenz gemäß Anspmch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Modul B ein erweitertes Kernlokalisationssignal enthält, das eine annähernd neutrale Summenladung aufweist.
7. Kemtransportagenz gemäß Anspmch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Modul B ein erweitertes Kernlokalisationssignal enthält, das ein Kernlokalsationssignal und flankierende negativ geladene Aminosäuren umfaßt.
8. Kemtransportagenz gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß Modul B zusätzlich zum Kernlokalisationssignal oder erweiterten Kernlokalisationssignal weitere Peptidsequenzen oder nicht-Peptidkomponenten enthält, die nicht dem Kernlokalisationssignal zuzuordnen sind.
9. Kemtransportagenz gemäß Anspmch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Modul A eine PNA ist und Modul B, anstelle oder neben einem NLS-Signal, ein Nicht-NLS-Signal enthält.
10. Kemtransportagenz gemäß Anspmch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Modul A ein sequenzspezifisch DNA-bindendes Protein ist und Modul B, anstelle oder neben einem NLS-Signal, ein Nicht-NLS-Signal enthält.
11. Kemtransportagenz gemäß Anspmch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Nicht-NLS- Signal ausgewählt ist aus der Gmppe bestehend aus
Liganden für zelluläre Oberflächenstmkturen, die DNA- Aufnahme vermitteln können,
Peptide, die Membranen destabilisieren und Signale, die in der Zelle die Bindung an Transportstrukturen vermitteln, sowie Signale, die eine Retention im Kern bewirken.
12. Gentransfersystem umfassend ein Kemtransportagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und ein kationisches Lipid, Peptid, Polyamin oder kationisches Polymer.
13. Verfahren zum Transport von DNA in den Kern eukaryontischer Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit der zu transportierenden DNA und dem Kemtransportagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 transfiziert werden.
14. Verfahren gemäß Anspmch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryontischen Zellen, primäre Zellen sind.
15. Arzneimittel, enthaltend ein Kemtransportagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.
16. Verwendung des Kemtransportagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 in der Gentherapie.
7. Verwendung des Kemtransportagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 in der Gentherapie zur Behandlung von Krebs, Vimsinfektionen, Erkrankungen des Nervensystems; Transplantatabstoßung sowie monogen oder polygen vemrsachter Erbkrankheiten.
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