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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer
transformierten Zelle, die durch dieses Verfahren erhältliche,
transformierte Zelle, die Verwendung eines Komplexes eines Übergangsmetalls
bei der Transformation von Zellen, einen Kit zur Transformation
von Zellen, die Verwendung dieses Kits, eine therapeutische Zusammensetzung
sowie die Verwendung eines Komplexes zur Herstellung einer therapeutischen
Zusammensetzung.
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Der
Begriff „Transformation", wie er hierin verwendet wird,
beschreibt ganz allgemein den Vorgang des Einführens von
Nukleinsäuren, insbesondere von Desoxyribonukleinsäure
(DNA), in beliebige, eukaryontische oder prokaryontische Zellen.
Er umfasst insbesondere auch den Sonderfall der Transfektion, bei
der Fremd-DNA in eine Zellkulturzelle eingeführt wird.
Der Begriff „Transformation" umfasst insbesondere sowohl
das nur zeitweilige Einbringen einer DNA, beispielsweise eines Gens,
in die Zelle (transiente Transformation) als auch den dauerhaften
Einbau der DNA in das Genom der Zelle (stabile Transformation).
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Aus
dem Stand der Technik sind zahlreiche unterschiedliche Methoden
bekannt, um Fremd-Nukleinsäuren, insbesondere Fremd-DNA
in eine Zelle einzubringen. Zur Transfektion in vivo werden insbesondere
der Virus-vermittelte Gentransfer unter Verwendung von Adenoviren
oder Retroviren, die in der Lage sind, nichtvirale DNA in mitotisch
aktive Zellen zu transfizieren, und die Transfektion mittels kationischer
Liposomen, die mit dem negativ geladenen Phosphat-Rückgrat
der DNA interagieren, eingesetzt.
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Zur
Transfektion in vitro eignet sich insbesondere physikalische in
vitro-Transfektionsverfahren, wie etwa die Mikroinjektion, bei der
die DNA mit einer Injektionsapperatur direkt in den Zellkern bzw. in
die Zelle injiziert wird, die Elektroporation, bei der die Zellmembran
durch Elektroschocks für DNA permeabel gemacht wird, sowie
das sogenannte "Particle Gun"-Verfahren, bei dem die Fremd-DNA mit
Hilfe von winzigen Metallkügelchen, auf denen die DNA fixiert
wurde, in die Zelle geschossen wird. Neben diesen physikalischen
Verfahren, die in der Regel sehr aufwendig sind, eignen sich zur
Transfektion von Zellen in vitro auch chemische Verfahren, wie etwa
die sogenannte Calcium-Phosphat-Präzipitation, bei der sich
in einem Gemisch aus Calciumchlorid und Natriumphosphat die zu übertragende
DNA an das ausfallendes Calciumphosphat bindet. Die ausgefallenen Kristalle
werden der Zellkultur zugegeben und von den Zellen durch Endocytose
aufgenommen. Weiterhin können auch liposomale oder nicht-liposomale
Lipide zur in vitro-Transfektion von Zellen eingesetzt werden. Ein
Beispiel für ein als Transfektionsreagenz eingesetztes,
nicht-liposomales Lipid ist beispielsweise das kommerziell erhältliche
Produkt Effectene® (QIAGEN, Hilden,
Deutschland) dar.
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Werden
chemische Transfektionsreagenzien wie beispielsweise nicht-liposomale
Lipide zur Transformation von Zellen eingesetzt, wie etwa in der
WO-A-97/30024 beschrieben,
so ist es häufig erforderlich, die Nukleinsäure,
welche in die Zellen eingeschleust werden soll, zunächst
mit sogenannten Enhancern vorzuinkubieren, um eine optimale Transfektionseffizienz
sicherzustellen. Bei diesen Enhancern handelt es sich häufig
um kationische Peptide oder Proteine, wie etwa Protaminsulfat. Der
Nachteil dieser Enhancer besteht zum einen darin, dass sie häufig
aus biologischem Material isoliert und daher vergleichsweise teuer
sind und zudem auch kühl gelagert werden müssen.
Zum anderen ist es bei diesen herkömmlichen Enhancern erforderlich,
dass die Nukleinsäure zunächst mit diesen Enhancern
vorinkubiert werden muss, bevor sie mit dem Transfektionsreagenz
und den Zellen inkubiert wird. Das Verfahren ist daher vergleichsweise
aufwendig.
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Der
vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem
Stand der Technik ergebenden Nachteile bei der Transformation von
Zellen, insbesondere bei der in vitro-Transformation, zu überwinden.
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Ferner
lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
zur Herstellung einer transformierten Zelle anzugeben, wobei das
Verfahren durch eine hohe Transformationseffizienz gekennzeichnet
ist. Zudem sollte das Verfahren mit möglichst wenigen Verfahrensschritten
und mit möglichst kostengünstigen und leicht handhabbaren
Reagenzien durchführbar sein.
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Einen
Beitrag zur Lösung der vorstehend genannten Aufgaben leistet
ein Verfahren zur Herstellung einer transformierten Zelle, umfassend
die Verfahrensschritte:
- i) Bereitstellen einer
Nukleinsäure,
- ii) Inkubation der Nukleinsäure mit einem Komplex KI eines Übergangsmetalls und einem
von diesem Komplex KI verschiedenen Transformationsreagenz
unter Erhalt eines Komplexes KII aus Nukleinsäure,
Transformationsreagenz und Komplex KI des Übergangsmetalls,
sowie
- iii) In Kontakt bringen des Komplexes KII aus
Nukleinsäure, Transformationsreagenz und Komplex KI des Übergangsmetalls mit einer
Zelle, wobei das in Kontakt bringen vorzugsweise in vitro erfolgt.
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Überraschend
wurde festgestellt, dass bei der Verwendung von Komplexen eines Übergangsmetalls
als Enhancer bei der Transformation von Zellen auf eine Vorinkubation
der Nukleinsäure mit dem Enhancer, wie sie bei den aus
dem Stand der Technik bekannten Enhancer erforderlich ist, ohne
Einbuße bei der Transformationseffizienz verzichtet werden kann.
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Die
im Verfahrensschritt i) bereitgestellte Nukleinsäure, für
die synonym auch der Begriff Polynukleotid verwendet werden kann,
kann eine Ribonukleinsäure (RNA), Deoxyribonukleinsäure
(DNA), oder auch gemischte Form sein. Im allgemeinen Fall kann es
sich um jeden Typ von Polynukleotid handeln, der ein N-Glykosid
oder C-Glykosid einer Purin- oder Pyrimidinbase oder einer modifizierten
Purin- oder Pyrimidinbase darstellt, also auch solche Basen enthalten
kann, die in der Natur nicht vorkommen. Außer der Base
selbst kann auch der Zuckerrest modifiziert sein. Eingeschlossen
sind Nukleinsäuren mit modifizierter Verknüpfung
der Untereinheiten, etwa Phosphorothioat- oder amidat-Verknüpfungen.
Die Nukleinsäure kann einzel-, doppel- oder mehrsträngig,
linear oder zirkulär sein. Sie kann einem in einer Zelle vorkommenden
Molekül entsprechen, wie etwa genomische DNA oder Boten-RNA
(mRNA), oder in vitro erzeugt werden wie Komplementär-DNA
(cDNA), Gegenstrang-RNA (aRNA), oder synthetische Nukleinsäuren.
Die Nukleinsäure kann aus wenigen Untereinheiten, mindestens
zwei Untereinheiten, bevorzugt acht oder mehr Untereinheiten bestehen,
wie etwa Oligonukleotide, mehreren hundert Untereinheiten bis hin
zu mehreren tausend Untereinheiten, wie etwa bestimmte Expressionsvektoren.
Bevorzugt enthält die Nukleinsäure die kodierende
Information für ein Polypeptid in funktionellem Zusammenhang mit
regulatorischen Sequenzen, die die Expression des Polypeptids in
der Zelle erlauben, in die die Nukleinsäure eingebracht
wird. So ist die Nukleinsäure in einer bevorzugten Ausführungsform
ein Expressionsvektor. In einer anderen Ausführungsform
ist sie eine pDNA (Plasmid-DNA), eine siRNA, eine siRNA- Duplex oder
eine siRNA-hetero-Duplex, wobei unter dem Begriff „siRNA"
Ribonukleinsäuren mit einer Länge von etwa 22
Nukleotiden verstanden werden, die durch Spaltung einer doppelsträngigen
RNA (dsRNA) durch das Enzym „Dicer" entstehen und in den
Enzymkomplex „RISC" (RNA-induced silencing complex) eingebaut
werden. Die Bereitstellung der Nukleinsäure umfasst gegebenenfalls
die Isolierung der DNA aus einer Zelle oder einem Gewebe durch dem
Fachmann bekannte Isolierungsverfahren, die Amplifizierung der Nukleinsäure
durch dem Fachmann bekannte Amplifizierungsverfahren oder aber gegebenenfalls
die synthetische Herstellung von Nukleinsäurefragmenten
durch dem Fachmann bekannt Syntheseverfahren.
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Im
Verfahrensschritt ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die im Verfahrensschritt i) bereitgestellte Nukleinsäure
mit einem Komplex KI eines Übergangsmetalls
und einem von diesem Komplex KI verschiedenen
Transformationsreagenz inkubiert, wobei ein Komplex KII aus
der Nukleinsäure, dem Transformationsreagenz und dem Komplex
KI des Übergangsmetalls erhalten
wird.
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Bei
dem Komplex KI eines Übergangsmetalls kann
es sich grundsätzlich um einen quadratischen, tetraedrischen
oder oktaedrischen Komplex handeln, wobei oktaedrische Komplexe
besonders bevorzugt sind.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens handelt es sich bei dem Komplex KI eines Übergangsmetalls
um einen Komplex ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
KobatIII-Komplexen, KobaltII-Komplexen,
ManganII-Komplexen, ManganIII-Komplexen,
ManganIV-Komplexen, KupferII-Komplexen,
NickelII-Komplexen, ChromIII-Komplexen,
EisenII-Komplexen, EisenIII-Komplexen,
RhodiumIII-Komplexen, RhodiumII-Komplexen,
IridiumIII-Komplexen, ZinkII-Komplexen,
TitanIV-Komplexen, PalladiumII- Komplexen
und PlatinII-Komplexen, wobei KobaltII-Komplexe, KobaltIII-Komplexe,
RhutheniumII-Komplexe, RutheniumIII-Komplexe, EisenII-Komplexe,
EisenIII-Komplexe und NickelII-Komplexe
besonders bevorzugt, KobaltII-Komplexe und
KobaltIII-Komplexe darüber hinaus bevorzugt
und KobaltIII-Komplexe am meisten bevorzugt
sind.
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Weiterhin
ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass der Komplex
KI eines Übergangsmetalls ein oktaedrischer
Komplex ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus den Komplexen [M(a)6]X, [M(c)3]X, [M(c)2(a)2]X oder
[M(c)(a)4]X, wobei
M
ein Übergangsmetall-Kation,
a ein H2O-Molekül,
ein NH3-Molekül, ein CO-Molekül, ein
Pyridin-Molekül, ein NO-Kation, ein Chlorid-Anion, ein
Bromid-Anion, ein Iodid-Anion, ein Nitrit-Anion, gebunden über
das Stickstoffatom (Nitro-Ligand) oder das Sauerstoffatom (Nitrito-Ligand),
ein Hydroxid-Anion, Cyanid-Anion, ein NCS-Anion, gebunden über
das Stickstoffatom (Isothiocyanat) oder über das Schwefelatom
(Thiocyanat), ein Sulfid-Anion, ein Thiosulfat-Anion oder ein Sulfat-Anion,
wobei, wenn mehr als ein a-Ligand in einem Komplex vorliegt, die jeweiligen
a-Liganden gleich oder verschieden sein können,
c
ein zweizähniger Ligand, vorzugsweise ein Carbonat-Anion,
ein Nitrat-Anion, ein Acetylacetonat-Anion, ein 1,2-Diaminoethan-Molekül,
ein Bipyridin-Molekül oder ein Phenanthrolin-Molekül,
und
x gleich der Ladung des Komplexes KI ist,
wobei der Betrag von x gleich m–n ist, wobei n die Summe
der negativen Ladungen aller Liganden im oktaedrischen Komplex und
m die Ladung des Übergangsmetall-Kations M ist, wobei es
erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist, dass
x einen Wert von mindestens +1, besonders bevorzugt mindestens +2
und am meisten bevorzugt einen Wert von +3 aufweist, die Komplexe
KI somit vorzugsweise eine positive Ladung
aufweisen.
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Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens handelt es sich bei dem Komplex KI eines Übergangsmetalls
um einen oktaedrischen KobaltIII-Komplex,
wobei es darüber hinaus bevorzugt ist, dass dieser KobaltIII-Komplex mindestens ein Ammoniak-Molekül,
darüber hinaus bevorzugt mindestens zwei Ammoniak-Moleküle,
darüber hinaus noch mehr bevorzugt mindestens drei Ammoniak-Moleküle, noch
mehr bevorzugt mindestens vier Ammoniak-Moleküle und am
meisten bevorzugt mindestens fünf Ammoniak-Moleküle
als Liganden umfasst.
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Als
erfindungsgemäß besonders bevorzugte KobaltIII-Komplexe kommen insbesondere folgende Komplexe
- a) [CoIII(NH3)5H2O]3+,
- b) [COIII(NH3)4(H2O)2]3+,
- c) [CoIII(NH3)3(H2O)3]3+,
- d) [CoIII(NH3)6]3+,
- e) [CoIII(NH3)2(H2O)4]3+,
- f) [CoIII(NH3)1(H2O)5]3+,
- g) [CoIII(NH3)5Cl]2+,
- h) [CoIII(NH3)4Cl2]+,
- i) [CoIII(NH3)3Cl3],
- j) [CoIII(NH3)2Cl4]–,
- k) [CoIII(NH3)1Cl5]2–,
- l) [CoIII(NH3)4Cl(H2O)]2+,
- m) [CoIII(NH3)5NO2]2+,
- n) [CoIII(NH3)4(NO2)2]+,
- o) [CoIII(NH3)3(NO2)3],
- p) [CoIII(NH3)2(NO2)4]–,
- q) [CoIII(NH3)1(NO2)5]2– und
- r) [CoIII(NH3)5(SO4)]+
in
Betracht, wobei unter diesen Komplexen KI diejenigen
mit einer positiven Gesamtladung (= Komplexe a), b). c), d), e),
f), g), h), l), n) und r)) besonders bevorzugt und der [Co(NH3)6]3+-Komplex
am meisten bevorzugt ist.
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Die
Herstellung der Komplexe K
I eines Übergangsmetalls
erfolgt durch die dem Fachmann bekannten Herstellungsverfahren.
Besonders bevorzugt erfolgt die Herstellung der Komplexe K
I in wässriger Lösung,
in dem die geeigneten Übergangsmetall-Kationen in Form
eines wasserlöslichen Salzes, besonders bevorzugt in Form
eines Sulfates, Chlorides, Bromides, Iodides, Acetates, am meisten
bevorzugt jedoch in Form eines Chlorides gelöst und zu dieser
wässrigen Lösung des Übergangsmetall-Kations
der entsprechende Ligand bzw. die entsprechenden Liganden zugesetzt
werden. Genaue Vorschriften zur Herstellung von Übergangsmetallkomplexen können
unter anderem
J. C. Blair, „The Chemistry of Coordination
Compounds", Reinhold, New York (1956),
J. Lewis
und R. G. Wilkins (Hrsg.), „Modern Coordination Chemistry",
Wiley, New York (1960),
D. P. Graddon, „An
introduction to Coordination Chemistry", Pergamon Press, London
(1968),
F. Basolo und R. C. Johnson, "Coordination
Chemistry, the Study of Metal Complexes", Benjamin, New York (1965–1970) sowie
M-Becke-Goehring
und H. Hoffmann, "Komplexchemie", Springer, Berlin (1970) entnommen
werden.
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Wenn
der Komplex KI des Übergangsmetalls im
Verfahrensschritt ii) mit der Nukleinsäure in Kontakt gebracht
wird, ist es weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt,
dass die Nukleinsäure und der Komplex KI in
einem Gewichtsverhältnis Nukleinsäure:Komplex von
1:10.000 bis 1:1 besonders bevorzugt von 1:1.000 bis 1:10 und am
meisten bevorzugt von 1:100 bis 1:50 eingesetzt werden, wobei der
Fachmann in Abhängigkeit von der Art der Nukleinsäure und
des Komplexes KI das optimale Gewichtsverhältnis
zwischen der Nukleinsäure und dem Komplex durch einfache
Routineversuche bestimmen kann.
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Bei
dem im Verfahrensschritt ii) eingesetzten Transformationsreagenz
kann es sich um eine beliebige, dem Fachmann als Transformationsreagenz bzw.
Transfektionsreagenz bekannte Substanz handeln, insbesondere um
ein liposomales oder ein nicht-liposomales Lipid, um ein Polymer,
wie etwa ein Polyethylenimin, ein Poly-L-Lysin, ein Poly-L-Arginin, ein
Polyamid, ein Polyallylamin, ein kationisches Methacrylat, Chitosan,
um ein Poly(D,L-Lactid-co-Glycolid) (PLGA), um ein dendritisches
kationisches Polymer, wie etwa ein Polyamidoamin (PAMAM) oder um
eine Mischung aus mindestens zwei dieser Substanzen. Gemäß einer
besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens handelt es sich bei dem Transformationsreagenz um eine
Verbindung beinhaltend ein Lipid, wobei das Transformationsreagenz
frei von Liposomen ist. Unter Liposomen werden vorzugsweise kugelartige
Anordnungen von Lipiden in wässrigen Lösungen
mit "Bilayer-Struktur" verstanden, welche typischerweise in drei
Klassifikationen eingeteilt werden (siehe
N. Y. Academy
Sciences Meeting: "Liposomes and their use in Biology and Medicine"
von Dezember 1977): Multilamellare Vesikel (MLV, bis zu
10 000 nm), kleine unilamellare Vesikel (SUV, 20–50 nm)
und große unilamellare Vesikel (LUV, 600–30.000
nm). In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das
Transformationsreagenz mindestens ein kationisches, nicht-liposomales
Lipid umfasst. Erfindungsgemäß geeignete, kationische,
nicht-liposomale Peptide sind beispielsweise Lipopolyamine, wobei
die Polyamine linear oder verzweigt aufgebaut und Ethylen-, Propylen-
oder Butylengruppen zwischen den Aminofunktionen enthalten können.
Die Polyamine sind auf unterschiedlichste Weise mit einem lipophilen
Rest verbunden. Solche Lipopolyamine sind unter anderem von Behr,
J. P. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6982–6986;
1989;
EP-A-0 394 111 )
beschrieben worden.
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Gemäß einer
anderen besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens handelt es sich bei dem Transformationsreagenz um eine
Verbindung beinhaltend ein Lipid, wobei das Transformationsreagenz
Liposomen beinhaltet.
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Erfindungsgemäß geeignete
Transformationsreagenzien sind insbesondere die kommerziell erhältlichen
Produkte jetPEI®, Ligand-konjugiertes jetPEI®, sogenanntes „Tagged"
jetPEI® sowie DuoFect®,
welche von der Firma Midwest Scientific, St. Louis, USA, erhältlich
sind, das Produkt „FuGENE® 6"
der Firma Roche Applied Science, Indianapolis, USA, das Produkt
Effectene® der Firma QIAGEN, Hilden,
Deutschland, die Produkte Lipofectamine® oder Lipofectamine® 2000 der Firma Invitrogen Life
Technologies, Karlsruhe, sowie das Produkt transPEI® der Firma
EUROGENTEC s. a, Seraing, Belgien.
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Weiterhin
ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Nukleinsäure
und das Transformationsreagenz im Verfahrensschritt ii) in einem
Gewichtsverhältnis Nukleinsäure:Transformationsreagenz
von 1:1.000 bis 10:1, besonders bevorzugt von 1:100 bis 1:1 und
am meisten bevorzugt von 1:20 bis 1:5 in Kontakt gebracht werden,
wobei auch hier der Fachmann in Abhängigkeit von der Art
der Nukleinsäure und des Transformationsreagenzes das optimale
Gewichtsverhältnis dieser beiden Komponenten durch einfache
Routineversuche bestimmen kann.
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Die
Inkubation der Nukleinsäure mit dem Komplex KI eines Übergangsmetalls
und dem Transformationsreagenz erfolgt vorzugsweise für
etwa 0 bis 120 Minuten, besonders bevorzugt 0 bis 20 Minuten und
darüber hinaus bevorzugt 0 bis 2 Minuten, wobei eine Inkubation
für mindestens 30 Sekunden, mindestens zwei Minuten und
am meisten bevorzugt für mindestens 5 Minuten vorteilhaft
sein kann. Weiterhin ist es bevorzugt, dass die Inkubation bei einer Temperatur
in einem Bereich von 4 bis 40°C, besonders bevorzugt in
einem Bereich von 10 bis 37°C und am meisten bevorzugt
in einem Bereich von 15 bis 25°C erfolgt.
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Die
Reihenfolge, in der die einzelnen Komponenten beim Inkubationsschritt
ii) miteinander in Kontakt gebracht werden können, ist
beliebig. So kann beispielsweise zunächst die Nukleinsäure
in einer geeigneten wässrigen Pufferlösung, beispielsweise
einer physiologischen Kochsalzlösung oder einem Nährmedium,
besonders bevorzugt mit einem pH-Wert in einem Bereich von 6,5 bis
8,5, am meisten bevorzugt 7 bis 8, vorgelegt werden, wobei die Konzentration
an Nukleinsäure (auch während des Inkubationsschrittes)
vorzugsweise in einem Bereich von 0,01 bis 1.000 μg/ml,
besonders bevorzugt in einem Bereich von 0,2 bis 100 μg/ml
und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 1 bis 10 μg/ml
liegen sollte.
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Anschließend
wird zu dieser DNA-Lösung das Transformationsreagenz und
der Komplex zugegeben, wobei die Konzentration des Komplexes KI während des Bildung des Komplexes
KII vorzugsweise in einem Bereich von 1 μMol/l
bis 100 mMol/l, besonders bevorzugt in einem Bereich von 10 μMol/l
bis 10 mMol/l und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 50 μMol/l
bis 1 mMol/l liegen sollte. Die Konzentration an Transformationsreagenz,
insbesondere die Menge an kationischem, nicht-liposomalem Lipid
sollte während der Bildung des Komplexes KII vorzugsweise
in einem Bereich von 0,2 bis 2.000 μg/ml, besonders bevorzugt
in einem Bereich von 2 bis 200 μg/ml und am meisten bevorzugt
in einem Bereich von 10 bis 40 μg/ml liegen.
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Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird die Nukleinsäure vor dem in Kontakt bringen
mit dem Transformationsreagenz im Verfahrensschritt ii) nicht mit
dem Komplex KI eines Übergangsmetalls aktiviert,
wobei unter „Aktivierung" vorzugsweise eine Inkubation
der Nukleinsäure mit dem Komplex KI (in Abwesenheit
des Transformationsreagenzes) für mindestens fünf
Minuten, vorzugsweise für mindestens zwei Minuten und am
meisten bevorzugt für mindestens eine Minute bei einer
Temperatur in einem Bereich von 4 bis 40°C, besonders bevorzugt
in einem Bereich von 10 bis 37°C und am meisten bevorzugt
bei 15 bis 25°C, beispielsweise bei Raumtemperatur, verstanden
wird. Es ist demnach bei dieser besonderen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt, dass,
wenn Nukleinsäure und Komplex KI zunächst
miteinander inkubiert werden und erst dann das Transformationsreagenz
zugesetzt wird, diese Vorinkubation aus Komplex KI und Nukleinsäure
für nicht mehr als 5 Minuten, besonders bevorzugt für
nicht mehr als 2 Minuten und am meisten bevorzugt für nicht
mehr als eine Minute durchgeführt wird.
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Nach
der Inkubation der Nukleinsäure mit dem Transformationsreagenz
und dem Komplex KI des Übergangsmetalls
wird der so erhaltene Komplex KII aus der
Nukleinsäure, dem Transformationsreagenz und dem Komplex
KI eines Übergangsmetalls im Verfahrensschritt
iii) mit einer Zelle in Kontakt gebracht, wobei dieses in Kontakt
bringen sowohl in vivo als auch in vitro erfolgen kann, die in vitro-Transformation
jedoch am meisten bevorzugt ist.
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Bei
den im Verfahrensschritt iii) eingesetzten Zellen kann es sich grundsätzlich
um pflanzliche Zellen, tierische Zellen oder um Mikroorganismen
wie Bakterien, Hefen oder Pilze handeln, wobei eukaryontische Zellen,
insbesondere menschliche Zellen, am meisten bevorzugt sind. Dabei
können die Zellen in einen Gewebeverbund eingebettet sein,
beispielsweise in einem Gewebefragment oder einem Gewebeschnitt,
sie können jedoch auch in Form einer in vitro-Zellkultur,
insbesondere in Form eines adhärenten Zellrasens (adhärente
Zellen) oder in Form einer Zellsuspension (Suspensionszellen), vorliegen.
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Bei
der in vitro-Transformation können Zellen oder Gewebe mit
dem Komplex KII aus der Nukleinsäure,
dem Transformationsreagenz und dem Komplex KI eines Übergangsmetalls
in einem geeigneten Milieu inkubiert werden. Sollen Kulturzellen
transformiert werden, kann der Komplex KII bzw.
eine sterile wässrige Pufferlösung beinhaltend
diesen Komplex KII zum Kulturmedium gegeben
werden. Geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren
sowohl für Zellen, die in Zellkultur in Suspension wachsen
(Suspensionszellen) als auch für Zellen, die an Substratoberflächen
adhärent wachsen (adhärente Zellen). Weiterhin
ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass bei der
in vitro-Transformation der Komplex KII mit
der Zelle für mindestens 5 Minuten, vorzugsweise für
mindestens 15 Minuten und darüber hinaus bevorzugt für
mindestens 30 Minuten bei einer Temperatur in einem Bereich von
4 bis 37°C, besonders bevorzugt bei 37°C zum Zwecke
der Transformation inkubiert wird.
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Zur
Transformation in vivo kann der Komplex KII bzw.
die sterile wässrige Lösung beinhaltend diesen
Komplex KII in einen tierischen oder pflanzlichen Organismus
einschließlich des Menschen appliziert werden. Die Applikation
kann dabei systemisch oder topisch erfolgen, bei tierischen Organismen
insbesondere parenteral, z. B. durch intravenöse, intraperitoneale,
intramuskuläre, intra- oder subkutane Injektion, intravenöse
Infusion, pulmonare, buccale, nasale, dermale oder transdermale
Applikation. Auch andere Applikationswege, z. B. orale/enterale
Applikation sind unter geeigneten Bedingungen und mit entsprechenden Formulierungen
möglich. Der Komplex KII bzw. die
sterile wässrige Lösung beinhaltend den Komplex
KII kann auch lokal direkt in ein Zielgewebe,
etwa ein Organ oder einen Tumor, appliziert werden. Zur Applikation
in vivo sollte der Komplex KII in pharmazeutisch
verträglicher Form vorliegen. Er kann dafür mit
einem pharmazeutisch akzeptablen Träger kombiniert werden.
Die Formulierung richtet sich dabei nach dem Applikationsmodus.
Zur Injektion oder Infusion kann der Komplex KII beispielsweise in
isotonischer Kochsalzlösung oder in einem isotonischen
Puffer wie PBS oder Ringers Lösung vorliegen, zur pulmonaren
Verabreichung zum Beispiel in Form eines pharmazeutisch verträglichen
Aerosols. Auch feste Formulierungen können je nach Verwendungszweck
gewählt werden, beispielsweise gefriergetrocknete Präparate,
die vor Verabreichung mit Wasser rekonstituiert werden können.
Dem Fachmann sind geeignete pharmazeutische Träger und Formulierungen
bekannt, zum Beispiel aus Gennaro (Hrsg.), Remington: The
Science and Practice of Pharmacy, 19. Ausgabe, 1995, Mack Publishing
Co., Easton, PA, USA. Auf diese Weise kann die Nukleinsäure
als Arzneimittel in der Gentherapie eingesetzt werden.
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Die
Dosierung wählt der Fachmann in Abhängigkeit von
der Art der Erkrankung, dem Zustand des Patienten, dem therapeutischen
Ansatz sowie weiteren Faktoren. Im Allgemeinen wird bei humaner Anwendung
die Menge des verabreichten Komplexes KII im
Bereich von 0.1 μg/kg bis 100 μg/kg Körpergewicht
liegen, vorzugsweise 2.5 μg/kg bis 10 μg/kg Körpergewicht.
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Einen
Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet
weiterhin eine transformierte Zelle, welche durch das – vorstehende
beschriebene Verfahren erhältlich ist.
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Weiterhin
leistet auch die Verwendung eines Komplexes KI eines Übergangsmetalls,
vorzugsweise eines Komplexes KI eines Übergangsmetalls, wie er
im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
eingangs beschrieben worden ist, bei der Transformation einer Zelle,
insbesondere als sogenannten „Enhancer" bei der Transformation
einer Zelle, einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben.
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Einen
Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet
darüber hinaus ein Kit (zur Transformation von Zellen),
umfassend
- (β1) einen Komplex KI eines Übergangsmetalls, vorzugsweise
eines Komplexes KI, wie er im Zusammenhang
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eingangs beschrieben
worden ist,
- (β2) ein von dem Komplex KI eines Übergangsmetalls
(β1) verschiedenes Transformationsreagenz, sowie
- (β3) gegebenenfalls weitere Kit-Komponenten, wie etwa
Puffer oder Reagenzien zur Kontrolle der Transformationseffizienz.
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Der
Komplex KI eines Übergangsmetalls
(β1) kann dabei in reiner Form im erfindungsgemäßen
Kit vorliegen, beispielsweise in Form eines vorzugsweise sterilen
Salzes, oder aber in gelöster Form, beispielsweise in Form
einer gepufferten, vorzugsweise sterilen Lösung, wobei
der Einsatz der Komplexes KI in Form einer
Lösung besonders bevorzugt ist. In diesem Zusammenhang
am meisten bevorzugt ist eine sterile wässrige Lösung
von HexaaminkobaltIII-Chlorid ([Co(NH3)6]Cl3).
Die Konzentration des Komplexes KI in der
wässrigen Lösung liegt dabei vorzugsweise in einem
Bereich von 0,1 bis 10.000 mM/l, besonders bevorzugt von 1 bis 1.000
mM/l und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 10 bis 100 mM/l.
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Bei
dem von dem Komplex KI eines Übergangsmetalls
(β1) verschiedenen Transformationsreagenz (β2)
kann es sich um jede dem Fachmann als Transformationsreagenz bzw.
als Transfektionsreagenz bekannte Substanz handeln, vorzugsweise
jedoch um eines derjenigen Transformationsreagenzien, die bereits
eingangs im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren genannt worden ist, wobei auch die Transformationsreagenzien
vorzugsweise in Form einer vorzugsweise sterilen wässrigen Pufferlösung
in dem erfindungsgemäßen Kit vorliegen können.
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Bei
dem gegebenenfalls vorliegenden Puffer (β3) kann es sich
ebenfalls um einen beliebigen, dem Fachmann bei der Transformation
einer Zelle gegebenenfalls geeignet erscheinenden Puffer handeln, wobei
als Puffer (β3) insbesondere eine physiologische Kochsalzlösung,
PBS (Phosphate Buffered Saline) oder eine Nährlösung,
wie etwa MEM oder DMEM, besonders bevorzugt ist.
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Einen
Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet
weiterhin die Verwendung des vorstehend beschriebenen Kits in einem
Verfahren zur Transformation einer Zelle, insbesondere jedoch in
dem erfindungsgemäßen Verfahren.
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Einen
Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet
auch eine therapeutische Zusammensetzung, beinhaltend einen Komplex
KII umfassend eine Nukleinsäure,
ein Transformationsreagenz sowie einen Komplex KI eines Übergangsmetalls
KI, wobei es sich bei diesem Komplex KII vorzugsweise um den im Verfahrensschritt
ii) erhältlichen Komplex KII handelt.
Neben diesem Komplex KII kann die therapeutische
Zusammensetzung insbesondere auch einen pharmazeutisch akzeptablen Träger,
wie etwa eine physiologische Kochsalzlösung, beinhalten.
Ebenso leistet auch die Verwendung dieses Komplexes KII zur
Herstellung einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung einen Beitrag
zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben Einen Beitrag
zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet schließlich
auch ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit mittels Gentherapie, umfassend
die Verfahrensschritte:
- I) Entnahme einer Körperzelle
aus einem Lebewesen,
- II) Transformation der entnommenen Körperzelle durch
das erfindungsgemäße Verfahren, sowie
- III) Zurückführung der transformierten Körperzelle in
das Lebewesen.
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Als
Zellen, die für eine solche Gentherapie in Betracht kommen,
können insbesondere alle Zellen eingesetzt werden, die
widerstandsfähig genug sind, um die Entnahme, die Transformation
sowie die Wiedereinpflanzung aus dem bzw. in den Organismus zu überstehen.
Auch sollten die Zellen möglichst langlebig sein, damit
der Organismus ausreichend von den vorteilhaften Eigenschaften der
transformierten Zelle, beispielsweise von einem durch die transformierte Zelle
sezernierten Protein, profitieren kann. Besonders vorteilhaft als
Zellen sind insbesondere Hautzellen wie Fibroblasten, Leberzellen,
T-Zellen wie T-Lymphocyten, oder Knochenmarkszellen.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun anhand nicht limitierender Beispiele
und Figuren näher erläutert.
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Es
zeigt die 1 (1) die Ergebnisse der
Transfektion von HeLa S3-Zellen mit dem Plasmid pCMV-beta mit und
ohne erfindungsgemäßen Enhancer.
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BEISPIELE
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Kultivierung der Zellen
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Die
humane Zellinie HeLa S3 (adhärent) wurde in einer Dichte
von 2 × 104 Zellen/Well in je 100 μl
DMEM-Medium ausplattiert. 24 Stunden nach Aussaat der Zellen wurde
die Transfektion durchgeführt.
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Transfektion der Zellen
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Zur
Transfektion wurden das Plasmid pCMV-beta (Clontech Laboratories,
Inc., Mountain View, CA, USA; ein Expressionsplasmid für β-Galaktosidase)
eingesetzt. Bei der Transfektion wurde im Wesentlichen das Protokoll
des Effectene®-Transfektionsreagenzes
(s. a. Effectene ® Transfection Reagent Handbook/Stand
May 2002/der QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) für
adhärente Zellen befolgt, wobei als Vergleichsbeispiele:
- A) die Transfektion mit dem Effectene®-Transfektionsreagenz (EFF) und
dem Effectene®-Enhancer gemäß dem
Effectene®-Protokoll für
die Transfektion adhärenter Zellen (Standard),
- B) die Transfektion mit dem Effectene®-Transfektionsreagenz
und dem Effectene®-Enhancer, jedoch
ohne Vorinkubation des Plasmids mit dem Enhancer und
- C) die Transfektion mit dem Effectene®-Transfektionsreagenz,
jedoch ohne den Effectene®-Enhancer
dienten.
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Als
erfindungsgemäße Beispiele diente die Transfektion
der Zellen mit dem Effectene®-Transfektionsreagenz
(EFF) gemäß dem Effectene®-Protokoll für
die Transfektion adhärenter Zellen, wobei jedoch nicht
der Effectene®-Enhancer, sondern
HexaaminkobaldIII-Chlorid in verschiedenen
Konzentrationen (Beispiel D mit 100 μM, Beispiel E mit
1 mM und Beispiel F mit 10 mM, bezogen auf die Konzentration bei der
Bildung des Komplexes aus Plasmid-DNA und Transfektionsreagenz)
eingesetzt wurde.
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Etwa
48 Stunden nach Zugabe der mit dem Effectene®-Transfektionsreagenz
und dem Enhacer behandelten DNA wurden die Zellen mittels eines
Lysepuffers (5 mM MgCl2, 1% NP-40, 100 mM
NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 7,4) lysiert. Die Transfektionseffizienz
wurde mittels eines β-Galaktosidase-Assays mit ONPG (2-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid,
Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) als Substrat bestimmt. Die Ergebnisse
sind in der 1 dargestellt.
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Aus
der 1 ist ersichtlich, dass mit 10 mM HexaaminkobaltIII-Chlorid als Enhancer (Beispiel F) eine
vergleichbar hohe Transfektionseffizienz erreicht wird wie mit der
Effectene®-Standard-Transfektion
(Vergleichbeispiel A). Eine Kontrollinfektion ohne Kobalt-Komplex
und ohne Peptid-Enhancer (Effectene®-Enhancer) – wie
im Vergleichsbeispiel C gezeigt – erlaubte nur eine sehr
niedrige Transfektionseffizienz. Desgleichen erlaubt die Transfektion
mit dem Effectene®-Transfektionsreagenz
und dem Peptid-Enhancer, aber ohne Vorinkubation von Plasmid-DNA
und Enhancer, nur eine sehr geringe Transfektionseffizienz (Vergleichsbeispiel
B). Die Vorinkubation der DNA mit dem Peptid-Enhancer ist somit unerlässlich,
während eine solche Vorinkubation bei Verwendung des Kobalt-Komplexes
entfallen kann.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - WO 97/30024
A [0005]
- - EP 0394111 A [0019]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - J. C. Blair, „The
Chemistry of Coordination Compounds", Reinhold, New York (1956) [0017]
- - J. Lewis und R. G. Wilkins (Hrsg.), „Modern Coordination
Chemistry", Wiley, New York (1960) [0017]
- - D. P. Graddon, „An introduction to Coordination Chemistry",
Pergamon Press, London (1968) [0017]
- - F. Basolo und R. C. Johnson, "Coordination Chemistry, the
Study of Metal Complexes", Benjamin, New York (1965–1970) [0017]
- - M-Becke-Goehring und H. Hoffmann, "Komplexchemie", Springer,
Berlin (1970) [0017]
- - N. Y. Academy Sciences Meeting: "Liposomes and their use in
Biology and Medicine" von Dezember 1977 [0019]
- - Gennaro (Hrsg.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy,
19. Ausgabe, 1995, Mack Publishing Co., Easton, PA, USA [0030]
- - Effectene ® Transfection Reagent Handbook/Stand May
2002/der QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland [0044]