WO1997030170A1 - Zusammensetzung für die transfektion höherer eukaryotischer zellen - Google Patents

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WO1997030170A1
WO1997030170A1 PCT/EP1997/000649 EP9700649W WO9730170A1 WO 1997030170 A1 WO1997030170 A1 WO 1997030170A1 EP 9700649 W EP9700649 W EP 9700649W WO 9730170 A1 WO9730170 A1 WO 9730170A1
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WO
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egla
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peptide
lipid
transfection
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PCT/EP1997/000649
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Ernst Wagner
Karl Mechtler
Antoine Kichler
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Boehringer Ingelheim International Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids

Definitions

  • composition for transfection of higher eukaryotic cells Composition for transfection of higher eukaryotic cells
  • the invention relates to the transfection of higher eukaryotic cells, in particular mammalian cells.
  • cationic lipids show the best transfection results with a clearly positive excess charge.
  • DOGS dioctadecylamidoglyclyspermin, commercially available under the trade name "Transfectam”
  • Transfectam a three to six-fold excess of positive charges in relation to the DNA than for the
  • Transfection efficiency proven optimal (Barthel, et al., 1993).
  • the positive charges promote the binding of the complex and its absorption into the cells.
  • Transfectam has a buffering effect on the endosomes (the pKa value of the least basic secondary amine of lipospermin, which is decisive for the buffering effect, is approximately 5.4; Behr, 1994) and therefore protects the DNA on the one hand against enzymatic degradation and on the other hand causes it there is an osmotic swelling and subsequent destabilization of the buffered endosomes.
  • a strongly positive charge of the lipid / DNA complexes thus has the disadvantage, inter alia, that the lipid / DNA particles only have a very short half-life when used in vivo.
  • cationic lipids in combination with membrane-active peptides of enveloped viruses, for example for the transfection of cells.
  • influenza viruses using one of the peptides described by Kamata et.al., 1994 or a peptide derived from the glycoprotein of Vesicular Stomatitis Virus in combination with lipofectamine, a 3: 1 mixture of the polycationic lipid 2,3-dioleyloxy-N- [ 2 (spermincarboxamido) ethyl] - N, N-dimethyl-l-propanaminium trifluoroacetate (DOSPA) and DOPE were used and with an optimally determined positive charge excess of approx. 20, the transfection efficiency was improved by up to 12 times.
  • DOSPA N-dimethyl-l-propanaminium trifluoroacetate
  • the object of the present invention was to provide a new gene transfer system based on cationic lipids.
  • compositions for the transfection of higher eukaryotic cells comprising a complex containing a nucleic acid to be expressed in the cell and, in a concentration which is suboptimal for the transfection, one or more cationic lipids and optionally helper lipid (e).
  • the composition is characterized in that it contains one or more membrane-active acid peptides, the The ratio of the total number of positive to the total number of negative charges in the composition is approximately 0 to approximately 3.
  • the ratio of positive to negative charges in the composition is from about 0 to about 2.
  • “Suboptimal concentration” is understood to mean the amount of cationic lipid at which the ratio of the positive charges of the cationic lipid to the negative charges of the nucleic acid is different from the ratio determined as optimal for the respective transfection, so that the ratio with cationic lipid, if appropriate with the addition of helper lipid, the transfection efficiency achieved is lower than at optimal ratios, “optimal” referring to the expression of the nucleic acid achieved as a result of the transfection (or in the case of using inhibiting RNA to the extent of the intended biological action) in the cell .
  • the suboptimal concentration can be higher or lower than the optimal concentration.
  • the suboptimal concentration of cationic lipid, optionally in a mixture with helper lipid preferably corresponds to a concentration at which the transfection efficiency is lower by a factor of at least about 2, preferably by a factor of about 5 to about 2,000, than at the optimal concentration.
  • a reporter gene for example a luciferase gene, is expediently used to determine the transfection efficiency.
  • Membrane-active peptides are defined by their ability to destabilize endosome membranes; they are also referred to as “endosomolytically active peptides", “endosome-breaking peptides” or as “fusogenic” peptides. These peptides have an amphipathic character and can form ⁇ -helices; due to their membrane-active properties, they are suitable for use in gene transfer methods in which the release of the genetic material transported into the cell from the endosomes is a limiting step, e.g. when importing nucleic acid into the cell via receptor-mediated endocytosis.
  • Suitable membrane-active peptides in the context of the present invention are peptides of natural origin or synthetic peptides, e.g. that in WO 93/07283, by Plank et al. 1994, or by Zauner et al. 1995, published peptides.
  • peptides have suitable membrane-active properties and are therefore suitable for use in the context of the present invention can be determined with the aid of assays which simulate the process that takes place in the cell when endosomes are broken open.
  • Suitable assays are the liposome and erythrocyte permeability assay, which have been described, for example, by Plank et al. , 1994.
  • the composition contains a peptide called INF6 with the sequence GLF GAI AGFI ENGW EGMI DGWYG.
  • the composition contains a peptide called INF10 with the sequence GLF ELA EGLA ELGW EGLA EGWYGC.
  • the composition contains a peptide called INF5 with the sequence [GLF EAI EGFI ENGW EGnIDG] 2 K.
  • the composition contains a peptide of the name EGLA-I with the sequence GLFL GLA EGLA EGLA EGLA EGLA EGL EGLA GGSC.
  • the composition contains a peptide called INFA with the sequence GLF EAI EAFI ENAW EAMI DAWYG.
  • Suitable peptides are synthetic peptides of the designation INF8 with the sequence [GLF EAI EGFI ENGF EGMI DGGGJ2 K; the designation INF9 with the sequence GLF ELA EGLA ELGA EGLA EGWYGC; the name EGLA-II with the sequence WEA GLA EGLA EGLA EGLA EGLA EGL EGLA GGSC; the name EGLA-III with the sequence GLF EGA EGLA EGA EGLA EGLA EGWY GAC and the name EGLA-IV with the sequence GLF EGA EGLA EGW EGLA EGLA EGWY GAC.
  • membrane-active peptides suitable in the context of the present invention are those described by Plank et al., 1994, in particular peptides with the names INF4, INF4DI and INF7.
  • the membrane-active peptide is modified with a lipid, for example with dipalmitoylphosphatidylethanolamyl (DPPE); modified and unmodified peptide may also be included in the composition. If a lipid-modified peptide is used, there is no need to add helper lipid.
  • DPPE dipalmitoylphosphatidylethanolamyl
  • the same lipids that are also used as helper lipids can be used as lipids for the modification of the membrane-active peptide;
  • the choice of the lipid as well as the peptide is generally made for practical reasons, especially with regard to the coupling method, due to the presence of reactive groups.
  • the components are coupled using methods known from the literature, e.g. as described by Martin et al. , 1989, or by Remy et al. , 1995.
  • the amount in which the optionally lipid-modified, membrane-active peptide is added to the transfection complex depends on the total positive charge of the lipid / DNA complex and on the total of the negative charges of the peptide and its molecular weight.
  • the relative amount in relation to the cationic lipid (equivalents, given in mole peptide / mole cationic peptide) or the amount of absolute amount used is calculated in detail on the basis of these parameters. (In the case of INF6, for example, 2 charge equivalents of transfectam, corresponding to 6 nmoles, 5 ⁇ g INF6, corresponding to 2 nmoles, were used).
  • a ratio of positive to negative charges of approx. 0 to approx. 3, preferably approx.
  • any mono- or polycationic lipid can be used in the context of the present invention, polycationic lipids being generally preferred.
  • Numerous cationic lipids are known from the prior art which can be used as a constituent of the composition according to the invention. Examples of suitable cationic lipids are, for example, WO 95/02698, WO 91/16024, and the publications by Remy et al. , 1994; Solodin et al. , 1995; Feigner et al. , 1994; Ruysschaert et al., 1994; Weibel et al. , 1995; Le Bole'h et al. , 1995), to the disclosure of which reference is made.
  • cationic lipids are lipopolyamines, e.g. those described in EP-AI 394 111, in particular DOGS (dioctadecylamidoglyclyspermin), which is available under the trade name "Transfectam”.
  • the cationic lipid is contained in the transfection complexes in a suboptimal amount, ie the ratio between the positive charges of the lipid and the negative of the nucleic acid is greater or less than that used for the optimal gene transfer efficiency.
  • helper lipid can improve the effect of cationic lipid at a concentration that would only have suboptimal efficiency without helper lipid, that the transfection achieved corresponds to that at an optimal lipid concentration; the The total concentration of the partners cationic lipid / helper lipid would be optimal in this case, despite the suboptimal concentration of cationic lipid alone.
  • Helper lipids are neutral lipids (natural or synthetic) that are physiologically or zwitterionic or free of charge, e.g. Cholesterol, dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE), oleoylpalmitoylphosphatidylethanolamine (POPE), phosphatidylglycerol, diacylglycerol, etc. Further examples of suitable helper lipids include described in WO 95/18863 and WO 95/02698, the disclosures of which are incorporated by reference.
  • the composition can contain one or more helper lipids.
  • Preferred helper lipids are the lipids DOPE, POPE, DOG (1,2-di-oleoyl-rac-glycerol), MOG (1-mono-oleoyl-rac ⁇ glycerol), EPC (egg phosphatidylcholine), EPE (egg phosphatidylethanolamine).
  • the helper lipids are preferably used in a concentration, based on the cationic lipid, of 0.1 to 10 equivalents (mol / mol).
  • the nucleic acids to be transported into the cell can be DNAs or RNAs, with no restrictions with regard to the nucleotide sequence.
  • DNA is primarily genes that are introduced into the cell, the expression of therapeutically effective gene products that are not or not sufficiently high in the cell be expressed to achieve.
  • Inhibitory nucleic acids for example antisense RNA molecules or ribozymes or the DNA molecules coding therefor, are also suitable for therapeutic purposes. Examples of nucleic acids which can be used in the context of the present invention are given, for example, in WO 93/07283 and in WO 95/18863.
  • the invention relates to a method for transfecting higher eukaryotic cells, which is characterized in that the cells are brought into contact with the composition according to the invention.
  • the method can be used in in vitro, ex vivo or in vivo transfections, preferably for the transfection of mammalian cells.
  • the method is mainly used on cell cultures (adherent or in suspension).
  • Applications ex vivo are gene therapy applications in which cells are removed from the organism to be treated and transfected ex corpore with a therapeutically active nucleic acid molecule, in order to subsequently be returned to the organism, where the gene product is expressed and has its therapeutic effect.
  • An example of an ex vivo application is the production of tumor vaccines from autologous cells that are transfected with a cytokine gene.
  • the composition according to the invention is administered to the organism in the form of a pharmaceutical preparation which is also the subject of the present invention, preferably intravenously or, in the treatment of tumor diseases, intratumorally.
  • a pharmaceutical preparation which is also the subject of the present invention
  • pharmaceutically acceptable additives and inert carriers for example saline or phosphate-buffered saline or any carrier in which the compositions have suitable solubility properties can be added to the composition according to the invention.
  • inert carriers for example saline or phosphate-buffered saline or any carrier in which the compositions have suitable solubility properties
  • composition of the present invention can be modified to be used for applications with anionic molecules other than nucleic acid, e.g. to deliver anionic proteins to higher eukaryotic cells.
  • the order of performance of the peptides was INF6>INF10> EGLA-I ⁇ INF5>INFA> Melittin.
  • the results obtained for the peptides examined with Transfectam differ from the results obtained when the peptides were used in the transfection system based on the receptor-mediated endocytosis as a component of transfection complexes containing transferrin-polylysine: INF5 was the best peptide in this system and about 50 times more effective than INF6, while in combination with Transfectam it is 10 times less effective than INF6.
  • the peptide INF5 has a membrane-breaking effect only at an acidic pH, while INF6 is membrane-active even at a neutral pH.
  • the activity of the peptide at neutral pH was accompanied by toxic side effects which were not observed when the peptide was used in the lipid system.
  • the artificial peptide EGLA-I and INF10 were found to be more suitable as an addition to lipid / DNA complexes than complexes containing polylysine.
  • transfection complexes containing cationic lipid and membrane-active peptide can be prepared by various methods.
  • the compositions were prepared by three different methods, the methods differing in the order of addition or combination of the complex components and in terms of the time of dilution.
  • the DNA was added after the peptide was combined with transfectam; in the second variant, transfectam was first complexed with DNA and then the peptide was added.
  • the peptide was added after dilution of the transfectam / DNA complex. It was examined whether the type of production of the transfection complexes has an influence on the extent of the increase in the transfection efficiency. It was shown that the production method affects the different peptides differently: For INF6, the three production methods proved to be equivalent. With INF5, the transfection complexes produced by the second and third methods gave better results, while with INF10 the first and third variants were superior to the second.
  • the combination of the mutant influenza peptides, which have an overall negative charge, with cationic lipids changes the state of charge of the transfection particles, with some of these peptide-containing complexes being close to electroneutrality because the mutant influenza apeptides have an overall negative charge, (see insert of Fig. 1).
  • membrane-active peptide did not increase the optimally effective complexes containing the helper lipid, whereas when using transfectam in excess (6 charge equivalents), i.e. when using a suboptimal amount, a significant increase in gene expression compared to that with optimal ones Amounts of transfectam alone were obtained.
  • the membrane-active peptide was also found to reduce the sensitivity of the transfection complexes to serum, which is important with regard to use in vivo.
  • Fig. 1 Transfection efficiency of Transfectam / DNA / INF6 complexes
  • Fig. 2 Effect of serum on transfection efficiency
  • Fig. 3 A: flow cytometric analysis
  • B gene expression
  • Fig. 4 Effect of various membrane-active peptides on the transfection efficiency
  • Fig. 7 Influence of bafilomycin AI on the transfection efficiency
  • Fig. 8 Influence of helper lipids on transfection efficiency
  • pCMV-Luc which carries the luciferase gene under the control of the CMV promoter / enhancer, was described under the name pCMVL in WO 93/07283.
  • the lipopolyamine DOGS (dioctadecylamidoglyclyspermin) with the trade name "Transfectam” was obtained from Promega, the helper lipids DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), MOG (1-mono-oleoyl-rac-glycerol), DOG (1.2 -di-0leoyl-rac-glycerol), EPE (egg phosphatidylethanolamine), EPC (egg phosphatidylcholine), as well as chloroquine, bafilomycin A ⁇ and melittin (from bee venom) were obtained from Sigma.
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • MOG 1-mono-oleoyl-rac-glycerol
  • DOG 1.2 -di-0leoyl-rac-glycerol
  • EPE egg
  • the INF5 and INF6 peptides were synthesized as described by Plank, et al. , 1994.
  • the INFA, INF10 and EGLA-I peptides were generated using the Fmoc strategy (N- (9-fluorenyl) methoxycarbonyl) with HBTU activation [0- (IH-benzotriazol-l-yl) -N, N, N ', N '- tetramethyluronium hexafluorophosphate], (Fastmoc TM - 0.25 mmol scale) on an Applied Biosystems peptide synthesizer model 433 A (Foster City, California) with feedback monitoring. Three deprotection steps were carried out per cycle.
  • the next step was to double-couple the next amino acid and block the terminal NH2 groups (using acetic anhydride).
  • the following amino acid protecting groups were used: (Trt) Asn, (Trt) Cys, (t-Bu) Cys, (t-Bu) Asp, (t-Bu) Glu, (Boc) Lys.
  • a mixture of 70% NMP / 30% DMF was used as solvent.
  • HMP resin Tetagel R PHB, 0.22 mmol / g, Rapp polymers
  • the peptides INF10 and INFA were synthesized on a Cys (Trt) - preloaded aminomethylated polystyrene resin with a p-carboxytrityl chloride linker (0.52 mmol / g; PepChem, Tübingen, Germany) using DMF as solvent.
  • the INF7dimer peptide (a dimer of the INF7 peptide described by Plank et al., 1994) was synthesized using the Fmoc strategy on an Applied Biosystems peptide synthesizer model 431. A resin preloaded with cysteine was used (Tentagel S PHB-Cys). The medium-sized Lys DiFmoc was coupled as the first amino acid. Thereafter, double couplings were carried out up to Ile-18. Single couplings were performed from Met-17 to Ile-10; with Phe-9 a single coupling, then additional coupling with 1% Triton in the coupling approach. From Gly-8, simple pairings were carried out.
  • Deprotection of the peptides and cleavage from the resin were carried out using a mixture of phenol, ethanedithiol, thioanisole, water and trifluoroacetic acid (0.75: 0.25: 0.5: 0.5: 10).
  • the crude peptides were precipitated by dropwise addition to ether and centrifuged.
  • the peptides thus obtained were washed three times with ether and then dried under a stream of argon, followed by high vacuum.
  • the crude peptides were dissolved in 1 M TEAB, pH 9 and 1% ⁇ -mercaptoethanol.
  • the purity of the peptides was determined by means of analytical reverse phase HPLC using a C-18 column (Vydac 218ATP54, 2.1 mm x 25 cm, 5 ⁇ m).
  • a binary solvent system (solvent A: aqueous 0.1% trifluoroacetic acid; solvent B: acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid) was used at a gradient of 0-100% in 45 minutes at a flow rate of 1 ml / min.
  • the EGLA-I peptide was subjected to gel filtration (Sephadex G10, 20 mM TEAA, pH 7.3). The purified peptide fraction was freeze-dried in a Speedvac (Savant). The analytical reverse phase chromatography showed a purity of approx. 95%.
  • the solutions of the raw peptides INF10 and INFA were fractionated by gel filtration on Sephadex G10 (10 mm x 300 mm column) in 20 mM TEAA, pH 7.3. The peptides were lyophilized; analytical reverse phase chromatography showed a purity of approx. 98 and 95%, respectively.
  • the peptide INF7dimer was purified over Sephadex G 10 (buffer HBS; column 10mm x 300mm). Ion exchange chromatography was then carried out (column: (10 mm ⁇ 100 mm); material: Toso Haas Super Q 650 S; flow rate: 0.5 ml / min; eluent: A: 20 mM Hepes 7.3, B: 3 M NaCl / 20 mM Hepes 7.3; Gradient: 0 - 40 min 0% B, 40 - 140 min 100% B, ie 1% / min). The peptide eluted at 70-80 min. The peptide purified via ion exchanger was again cleaned on a Sephadex G 10 column (10mm x 300mm) (buffer HBS / 50% glycerin).
  • the identity of the peptides was determined as described by Plank, et al. , 1994. The peptides were frozen in liquid nitrogen.
  • the liposome leakage assay was performed as described by Plank, et al. , 1994.
  • the media, fetal calf serum (FCS) and horse serum were purchased from Gibco-BRL.
  • the culture media were supplemented with 2 mM L-glutamine and antibiotics.
  • Primary human melanoma cells of the designation H225, mouse embryo liver cells of the cell line TIB-73 (ATCC BNL CL.2), human lung carcinoma cells of the cell line A549 (ATCC CCL 185) and cells of the mouse melanoma cell line Cloudman S91, clone were used as cells M3 (ATCC No. CCL 53.1) used.
  • the H225 cells were in RPMI 1640/10% FCS / 1 mM sodium pyruvate, the A549 cells in DMEM / 10% FCS, the BNL CL.2 cells in high-glucose DMEM / 10% FCS and the M3 cells in Ham's F10 medium / 15% horse serum / 5% FCS grown.
  • the complexes were prepared as described by Barthel, et al. , 1993, where 3 ⁇ g of plasmid DNA and the amount of transfectam used in each case were dissolved in 75 ⁇ l of 150 mM NaCl. After 10 to 20 minutes, the two solutions were combined. After a further 10 min the mixture was diluted to a total volume of 2 ml with serum-free medium.
  • charge equivalent indicates the amount of cationic lipid used for transfection; 1 charge equivalent corresponds to the amount required to neutralize all negative charges of the phosphate groups of the plasmid. 3 ⁇ g of DNA correspond to 9 nmoles of negative charges; when calculating the charge ratio, it was taken into account that 1 mole of transfectam has 3 moles of positive charges which originate from the three ammonium groups protonated at physiological pH. Starting from the molecular weight of approx. 1250, this means that when using 3 ⁇ g DNA for a double positive charge excess (2 charge equivalents
  • the peptides were contained in an amount of 0.5 or 1 mg / ml solution in HBS (HEPES-buffered saline) 150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.3) to the
  • helper lipids DOPE, DOG, EPC, EPE or MOG or cholesterol were diluted in ethanol containing a trace of dichloromethane.
  • Transfectam / helper lipid / DNA complexes were formed by mixing the respective amounts of transfectam / helper lipid (the amount of helper lipid used, based on transfectam, is given as a molar ratio) before dilution with the DNA solution.
  • the cells were harvested and taken up in 150-200 ⁇ l 250 mM Tris pH 7.3, 0.5% Triton X-100. The cellulose was then transferred to 1.5 ml Eppendorf tubes and centrifuged at 14,000 g for 5 min in order to close the cell debris pelletize.
  • the determination of the luciferase activity was carried out as described in WO 93/7283, the luciferase light units being determined from an aliquot of the supernatant (20 ⁇ l) with 10 seconds integration after injection of freshly prepared luciferin solution.
  • the luciferase background (150-250 light units) was subtracted from each value; the transfection efficiency was expressed as total light units, which represent the mean of duplicate determinations.
  • the Bradford assay Bio-Rad was used for quantitative determination of the protein content.
  • the plasmid DNA was incubated with the intercalating fluorescent dye YOYO-1 (described by Rye, et al., 1992; Hirons, et al., 1994, available from Molecular Probes; approx. 1 dye molecule per 300 bp).
  • the complexes were then prepared as described above.
  • the complexes were placed on 300,000 H225 cells per well of a 6 well plate, then incubated for 4 hours either at 4 ° C (cell surface association) or at 37 ° C (cell surface association and uptake into the cells).
  • the cells were then washed twice with cold PBS and harvested with 1 mM EDTA in PBS and analyzed on a FACScan device (Becton Dickinson).
  • Transfection efficiency of Transf ec camo / DNA / INF6 complexes Complexes of 1, 1.5, 2 or 4 charge equivalents of transfectam per 3 ⁇ g pCMV-Luc in combination with increasing amounts of the membrane-active, acidic peptide INF6 derived from the influenza virus were prepared and mixed with RPMI 1640 culture medium. The complexes obtained were applied to H225 cells (75,000 cells per well of a 24-well plate). After 4 h, the transfection medium was replaced by fresh RPMI medium containing 10% FCS. The result of the experiments is shown in FIG. 1 (dotted line with rhombuses: 1 equivalent (eq.) Transfectam / x ⁇ g INF6; full line with circular.
  • FIG. 1 shows the transfection efficiency of the transfectam / DNA / INF6 complexes, plotted against the theoretical charge ratio of the complexes. Assuming that almost all of the peptide binds to the transfecting particles, a high Luciferase expression achieved with electroneutral (or almost neutral) lipid vectors.
  • Transfections of H225 cells were carried out using the amounts of transfectam (in charge equivalents) shown in FIG. 2 and the peptide INF6. The transfections were carried out on the one hand without serum (empty bars), on the other hand in the presence of 10% (dotted bars). 20% (gray bars) FCS not heat-inactivated (Fig. 2). The peptide-containing complexes were found to be less sensitive to serum.
  • Transfection complexes were measured (the cells were incubated at 4 ° C. or at 37 ° C., washed twice with PBS after 4 h, mixed with fresh medium containing 10% FCS and incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 for 20 h).
  • the presence of peptide (1.5 ⁇ g / well; in this experiment a single determination was carried out) caused a 15-fold increase in expression when the mixture was prepared at 4 ° C. and a 100-fold increase in the mixture at 37 ° C.
  • Fig. 3B Empty bars: gene expression after incubation at 4 ° C; filled bars: gene expression after incubation at 37 ° C).
  • transfeetarn / DNA complexes were prepared from 2 charge equivalents of transfectam per 3 ⁇ g DNA.
  • the complexes contained the peptides indicated in FIG. 4 in the amounts indicated in each case.
  • the peptides INF6, INFA and melittin which have good hemolytic activity without a pronounced specificity for low pH values, showed different behavior: INFA and INF6 increased the transfection efficiency of 2 charge equivalents of transfectam by 10 and 200 times, respectively Melittin only slightly increased luciferase expression.
  • melittin was highly toxic at 5 ⁇ g / double determination.
  • influenza apeptide mutants INF5 and INF10 which had been shown in the liposome permeability test to release calcein efficiently at pH 5.0 (Plank, et al., 1994) gave better results than INFA, but were less effective than INF6.
  • a peptide called EGLA-I which was not derived from the HA2 sequence of the influenza virus, was tested, in which one of the alanine residues in the GALA repeat (Parente, et al., 1988) was replaced by a glycine residue. This peptide gave results as good as INF5.
  • transfectam was used with a charge excess of 4 charge equivalents, although there are not the highest values on all cells tested.
  • Increase rates of the transfection efficiency were found for all cell lines if the transfection complexes contained a membrane-active peptic.
  • helper lipids shown in FIG. 8 were used in a molar ratio of 2 charge equivalents of transfectam to 1 to 3 equivalents of helper lipid.
  • DOPE DOPE
  • EPE or DOG this resulted in a gene expression that was 10 to 20 times higher (see also FIG. 3B).
  • MOG increased expression approximately 4-fold, while EPC and cholesterol were unable to increase transfection efficiency on H225 cells.
  • up to 7-fold increase could be achieved if 1 mol /% DOG was added to the transfectam / DOPE formulation; this is presumably due to the ability of DOG to induce fusion, among other things (Siegel, et al., 1989).
  • the peptide with the designation INF7dimer (see table), a dimer of that described by Plank, et al. , 1994 described peptide INF7, was attached to the lipid derivative DPPE-
  • Transfectam were diluted in 75 ⁇ l 0.15 M NaCl, mixed intensively, whereupon the amounts of DPPE-INF7dimer indicated in FIG. 10 (the values given in the figure are mol%, based on the total amount of transfectam) were added. The mixture was then mixed well, after 10 min 3 ⁇ g DNA in 75 ⁇ l NaCl were added, mixed again and after a further 10 min filled with medium to a total transfection volume of 2 ml. 1 ml per well of the transfection composition obtained was applied to the cells. The results shown in Fig. 10 show that the highest increase was obtained at a content of 7.5 mol% DPPE-INF7dimer.

Abstract

Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen. Ein Komplex aus einer in der Zelle zu exprimierenden Nukleinsäure und einem kationischen Lipid, das in einer für die Transfektion suboptimalen Konzentration vorliegt, enthält ein oder mehrere membranaktive saure Peptide, sowie gegebenenfalls Helferlipid(e). Das Verhältnis der Gesamtzahl der positiven zur Gesamtzahl der negativen Ladungen in der Zusammensetzung beträgt ca. 0 bis ca. 3.

Description

Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen
Die Erfindung bezieht sich auf die Transfektion von höheren eukaryotischen Zellen, insbesondere von Säugetierzellen.
Bedarf an einem effizienten System für das Einführen von Nukleinsäure in lebende Zellen besteht vor allem im Rahmen der Gentherapie. Dabei werden Gene in Zellen eingeschleust, um in vivo die Synthese therapeutisch wirksamer Genprodukte zu erzielen.
Die bisher am weitesten fortgeschrittenen und verbreiteten Technologien für die Anwendung von Nukleinsäuren im Rahmen der Gentherapie benutzten Systeme für den Transfer von Genen in die Zelle funktionieren auf der Grundlage von Viren, insbesondere Retroviren und Adenoviren (Miller, 1992; Mulligan, 1993; Berkner; 1988) , und kationischen Lipiden (Behr, 1994) . Alternative Strategien für den Gentransfer beruhen auf Mechanismen, deren sich die Zelle für den Transport von Makromolekülen bedient. Ein Beispiel dafür ist der Import von Genen in die Zelle über den Weg der Rezeptor-vermittelten Endozytose (z.B. Wu und Wu, 1987, Wagner et al. , 1990, EP-AI 0388 758) .
Von den im letzten Jahrzehnt entwickelten synthetischen Gentransfervehikeln haben sich mono- und polykationische amphipathische Lipide, die DNA komplexieren und kondensieren können, als besonders vielversprechend erwiesen (Behr, et al . , 1989; Feigner, et al., 1987 und 1994; Leventis, et al . , 1990; Gao, et al., 1991; Rose, et al. , 1991; Hawley-Nelson, et al.,1993; Weibel, et al . , 1995; Solodin, et al . , 1995) . Bestrebungen zur Steigerung der Leistungsfähigkeit von Gentransfermethoden auf der Grundlage von kationischen Lipiden konzentrierten sich bisher auf die direkte Modifikation des kationischen Lipids, z.B. durch Acylgruppen, Spacer-Arme oder hydrophile Abschnitte (Remy, et al. , 1994; Feigner, et al. , 1994). Trotz verbesserter Ergebnisse aufgrund solcher Maßnahmen ist noch immer vieles über den Eintrittsmechanismus von Lipid/DNA-Partikeln in die Zelle unklar. Aufgrund jüngerer Veröffentlichungen (Zabner, et al. , 1995) dürfte der Haupttransportweg dieser Partikel über die Endozytose verlaufen.
Kationische Lipide zeigen in vi tro die besten Transfektionsergebnisse bei deutlichem positivem Ladungsüberschuß. So hat sich z.B. für das Lipospermin DOGS (Dioctadecylamidoglyclyspermin, kommerziell erhältlich unter dem Handelsnamen "Transfectam") ein drei- bis sechsfacher Überschuß an positiven Ladungen im Verhältnis zur DNA als für die
Transfektionseffizienz optimal erwiesen (Barthel, et al. , 1993) . Die positiven Ladungen fördern die Bindung des Komplexes und deren Aufnahme in die Zellen. Zusätzlich hat Transfectam eine Pufferwirkung auf die Endosomen (der pKa-Wert des am wenigsten basischen sekundären Amins von Lipospermin, das für die Pufferwirkung maßgeblich ist, beträgt ca. 5.4; Behr, 1994) und schützt daher einerseits die DNA vor enzymatischem Abbau, andererseits verursacht es ein osmotisches Anschwellen und eine anschließende Destabilisierung der gepufferten Endosomen. Eine stark positive Ladung der Lipid/DNA-Komplexe hat somit bei der Anwendung in vivo u.a. den Nachteil, daß die Lipid/DNA-Partikel nur eine sehr kurze Halbwertszeit haben. Um die Effizienz der Lipopolyamine DOGS und DPPES (Palmitoylphosphatidylethanolamin) bei geringem positivem Ladungsüberschuß (Verhältnis positive:negative Ladungen ≤. 2, vorzugsweise 0.5 bis 1.5) zu verbessern, wurde der Zusatz von Adjuvantien vorgeschlagen, die mit dem Lipopolyamin/Nukleinsäure- Komplex assoziieren können, z.B. der Zusatz sog. "Helferlipide" .
Von Kamata, et al. , 1994, wurde die Effizienz des Gentransfers, der mit Lipofectin, einem 1:1 Gemisch aus dem monokationischen Lipid DOTMA (N-[l- (2,3-Dioleyl- oxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid) und dem Helferlipid DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin) , bei einem positiven Ladungsüberschuß von 1.25 erzielt wurde, mittels Peptiden um das 3 bis Sfache erhöht.
Ähnlich wurde in der WO 95/02698 vorgeschlagen, für die Transfektion von Zellen kationische Lipide in Kombination mit membranaktiven Peptiden von Viren mit Hülle, u.a. von Influenzaviren, einzusetzen, wobei eines der von Kamata et.al., 1994 beschriebenen Peptide oder ein vom Glycoprotein von Vesicular Stomatitis Virus abgeleitetes Peptid in Kombination mit Lipofectamin, einem 3:1 Gemisch des polykationischen Lipids 2,3-Dioleyloxy-N-[2 (spermincarboxamido)ethyl]- N,N-dimethyl-l-propanaminiumtrifluoracetat (DOSPA) und DOPE verwendet und bei einem als optimal ermittelten positiven Ladungsüberschluß von ca. 20 eine Verbesserung der Transfektionseffizienz um das bis zu 12fache erzielt wurde.
Andererseits brachten kationische Lipide, die mit viralen Peptiden konjugiert wurden, um ihnen die fusogenen oder karyophilen Eigenschaften von Viren zu verleihen, enttäuschende Ergebnisse bei optimaler Lipidkonzentration (Remy et al . , 1995) .
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein neues Gentransfersystem auf der Grundlage kationischer Lipide bereitzustellen.
Bei der Lösung der gestellten Aufgabe wurde zunächst die Frage gestellt, ob es die an die Endozytose anschließenden Schritte sind, wie der Transport von DNA aus dem Endosom ins Zytoplasma und weiter in den Kern, die den Engpaß für einen erfolgreichen Gentransfer mit kationischen Lipiden darstellen.
Es wurde festgestellt, daß der Zusatz von membranaktiven Influenzapeptiden nur eine geringfügige Verstärkung der Genexpression (1.5 bis 5fach) mit Transfectam bewirkt, wenn dieses bei optimalen Konzentrationen, also bei hohem positivem Ladungsüberschuß, eingesetzt wird. Dies läßt darauf schließen, daß in diesem Zusammenhang der Engpaß für den Gentransfer nicht die Freisetzung aus den endozytotischen Vesikeln sein dürfte, was auch im Einklang mit den von Kamata, et al., 1994, erhaltenen Ergebnissen steht (vgl . oben) .
Die gestellte Aufgabe wurde erfindungsgemäß durch eine Zusammensetzung für die Transfektion von höheren eukaryotischen Zellen gelöst, wobei die Zusammensetzung einen Komplex, enthaltend eine in der Zelle zu exprimierende Nukleinsäure sowie, in einer für die Transfektion suboptimalen Konzentration, ein oder mehrere kationische Lipide, sowie gegebenenfalls Helferlipid(e) , enthält. Die Zusammensetzung ist dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oder mehrere membranaktive saure Peptide enthält, wobei das Verhältnis der Gesamtzahl von positiven zur Gesamtzahl von negativen Ladungen in der Zusammensetzung ca. 0 bis ca. 3 beträgt.
Vorzugsweise beträgt das Verhältnis der positiven zu den negativen Ladungen in der Zusammensetzung ca. 0 bis ca. 2.
Unter "suboptimaler Konzentration" wird die Menge an kationischem Lipid verstanden, bei der das Verhältnis der positiven Ladungen des kationischen Lipids zu den negativen Ladungen der Nukleinsäure verschieden ist von dem für die jeweilige Transfektion als optimal ermittelten Verhältnis, so daß die mit kationischem Lipid, gegebenenfalls unter Zusatz von Helferlipid, erzielte Transfektionseffizienz geringer iεt als bei optimalen Verhältnissen, wobei sich "optimal" auf die infolge der Transfektion erzielte Expression der Nukleinsäure (bzw. im Fall der Verwendung von inhibierender RNA auf das Ausmaß der beabsichtigten biologischen Wirkung) in der Zelle bezieht. Die suboptimale Konzentration kann höher oder geringer sein als die optimale Konzentration.
Die suboptimale Konzentration von kationischem Lipid, gegebenfalls in Mischung mit Helferlipid, entspricht bevorzugt einer Konzentration, bei der die Transfektionseffizienz um einen Faktor von mindestens ca. 2, vorzugweise um einen Faktor ca. 5 bis ca. 2.000, geringer ist als bei optimaler Konzentration.
Die für die jeweilige Transfektion optimale Konzentration an kationischem Lipid bzw. die subobtimale Konzentration, bei der Transfektionseffizienz höchstens den halben Wert erreicht wie bei optimaler Konzentration, ist zelltypabhängig,* sie kann im einzelnen durch Titration ermittelt werden, indem das kaionische Lipid, das gegebenenfalls in Mischung mit Helferlipid vorliegt, in steigenden (oder auch fallenden) Konzentrationen eingesetzt wird; zweckmäßig wird zur Bestimmung der Transfektionseffizienz ein Reportergen, z.B. ein Luciferasegen, verwendet.
Membranaktive Peptide sind durch ihre Fähigkeit definiert, Endosomenmembranen zu destabilisieren; sie werden auch als "endosomolytisch wirksame Peptide", "Endosomen aufbrechende Peptide" oder als "fusogene" Peptide bezeichnet. Diese Peptide haben amphipathisehen Charakter und können α-Helices ausbilden; sie sind aufgrund ihrer membranaktiven Eigenschaften für den Einsatz bei Gentransfermethoden geeignet, bei denen die Freisetzung des in die Zelle transportierten genetischen Materials aus den Endosomen einen limitierenden Schritt darstellt, z.B. beim Import von Nukleinsäure in die Zelle über Rezeptor-vermittelte Endozytose.
Als membranaktive Peptide im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind Peptide natürlichen Ursprungs oder synthetische Peptide, z.B. die in der WO 93/07283, von Plank et al . 1994, oder von Zauner et al . 1995, verδfffentlichten Peptide.
Ob Peptide geeignete membranaktive Eigenschaften aufweisen und somit für die Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Betracht kommen, kann mit Hilfe von Assays bestimmt werden, die den Vorgang simulieren, der in der Zelle beim Aufbrechen von Endosomen abläuft . Geeignete Assays sind der Liposomen- und der Erythrozyten-Durchlässigkeits-Assay, die z.B. von Plank et al. , 1994, beschrieben wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Zusamensetzung ein Peptid der Bezeichnung INF6 mit der Sequenz GLF GAI AGFI ENGW EGMI DGWYG.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die Zusamensetzung ein Peptid der Bezeichnung INF10 mit der Sequenz GLF ELA EGLA ELGW EGLA EGWYGC.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die Zusammensetzung ein Peptid der Bezeichnung INF5 mit der Sequenz [GLF EAI EGFI ENGW EGnIDG]2 K.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die Zusammensetzung ein Peptid der Bezeichnung EGLA-I mit der Sequenz GLFL GLA EGLA EGLA EGLA EGLA EGL EGLA GGSC.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die Zusammensetzung ein Peptid der Bezeichnung INFA mit der Sequenz GLF EAI EAFI ENAW EAMI DAWYG.
Weitere geeignete Peptide sind synthetische Peptide der Bezeichnung INF8 mit der Sequenz [GLF EAI EGFI ENGF EGMI DGGGJ2 K; der Bezeichnung INF9 mit der Sequenz GLF ELA EGLA ELGA EGLA EGWYGC; der Bezeichnung EGLA-II mit der Sequenz WEA GLA EGLA EGLA EGLA EGLA EGL EGLA GGSC; der Bezeichnung EGLA-III mit der Sequenz GLF EGA EGLA EGA EGLA EGLA EGWY GAC und der Bezeichnung EGLA-IV mit der Sequenz GLF EGA EGLA EGW EGLA EGLA EGWY GAC.
Weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete synthetische membranaktive Peptide sind die von Plank et al., 1994, beschriebenen, insbesondere Peptide der Bezeichnung INF4, INF4DI und INF7. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das membranaktive Peptid mit einem Lipid modifiziert, z.B. mit Dipalmitoylphosphatidylethanolamyl (DPPE) ; es können auch modifiziertes und nicht-modifiziertes Peptid in der Zusammensetzung enthalten sein. Bei Verwendung eines lipidmodifizierten Peptids kann auf den Zusatz von Helferlipid verzichtet werden.
Als Lipide für die Modifikation des membranaktiven Peptids können grundsätzlich dieselben Lipide verwendet werden, die auch als Helferlipide zum Einsatz kommen; die Auswahl des Lipids wie auch des Peptids erfolgt im allgemeinen, aus praktischen Gründen, vor allem im Hinblick auf die Koppelungmethode, aufgrund des Vorhandenseins von reaktiven Gruppen. Die Koppelung der Komponenten erfolgt nach literaturbekannten Methoden, z.B. wie von Martin et al . , 1989, oder von Remy et al . , 1995, beschrieben.
Die Menge, in der das, gegebenfalls lipidmodifizierte, membranaktive Peptid dem Transfektionskomplex zugesetzt wird, ist abhängig von der positiven Gesamtladung des Lipid/DNA-Komplexes sowie von der Summe der negativen Ladungen des Peptids und dessen Molekulargewicht . Die relative Menge im Verhältnis zum kationischen Lipid (Äquivalente, angegeben in Mol Peptid/Mol kationisches Peptid) bzw. die Menge an verwendeter absoluter Menge, wird im einzelnen augrund dieser Parameter berechnet. (Im Fall von INF6 wurden z.B. für 2 Ladungsäquivalente Transfectam, entsprechend 6 nMol, 5 μg INF6, entsprechend 2 nMol, eingesetzt) . Im Hinblick auf ein Verhältnis von positiven zu negativen Ladungen von ca. 0 bis ca. 3, vorzugsweise ca. 0 bis ca. 2, kann die Peptidmenge zunächst in Vorversuchen, gegebenenfalls im Vergleich mit anderen Peptiden, variiert und auf diese Weise die optimal wirksame Menge ermittelt werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann grundsätzlich jedes mono- oder polykationische Lipid verwendet werden, wobei polykationische Lipide im allgemeinen bevorzugt werden. Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche kationische Lipide bekannt, die als Bestandteil der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verwendet werden können. Beispiele für geeignete kationische Lipide sind z.B. der WO 95/02698, der WO 91/16024, sowie den Veröffentlichungen von Remy et al . , 1994; Solodin et al . , 1995; Feigner et al . , 1994; Ruysschaert et al., 1994; Weibel et al . , 1995; Le Bole'h et al . , 1995) , auf deren Offenbarung Bezug genommen wird, zu entnehmen.
Besonders bevorzugte kationische Lipide sind Lipopolyamine, z.B. die in der EP-AI 394 111 beschriebenen, insbesondere DOGS (Dioctadecylamidoglyclyspermin) , das unter dem Handelsnamen "Transfectam" erhältlich ist.
Das kationische Lipid, gegebenenfalls in Mischung mit Helferlipid, ist, wie oben angegeben, in den Transfektionskomplexen in suboptimaler Menge enthalten, d.h. das Verhältnis zwischen den positiven Ladungen des Lipids und den negativen der Nukleinsäure ist größer oder kleiner als das für die optimale Gentransfereffizienz eingesetzte, wobei für die Definition der suboptimalen Menge an kationischem Lipid im Falle der Gegenwart von Helferlipid dessen Wirkung auf die Transfektionseffizienz mitberücksichtigt wird: Es kann z.B. ein Helferlipid die Wirkung von kationischem Lipid bei einer Konzentration, die ohne Helferlipid nur eine suboptimale Effizienz hätte, so verbessern, daß die erzielte Transfektion derjenigen bei optimaler Lipidkonzentration entspricht; die Gesamtkonzentration der Partner kationisches Lipid/Helferlipid wäre somit in diesem Fall, trotz suboptimaler Konzentration von kationischem Lipid allein, insgesamt optimal.
Bei "Helferlipiden" handelt es sich um neutrale Lipide (natürlichen Ursprungs oder synthetisch) , die unter physiologischen Bedingungen zwitterionisch oder frei von Ladungen sind, z.B. Cholesterin, Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE) , Oleoyl- palmitoylphosphatidylethanolamin (POPE) , Phosphatidylglycerin, Diacylglycerin, etc. Weitere Beispiele für geeignete Helferlipide sind u.a. in der WO 95/18863 und in der WO 95/02698 beschrieben, auf deren Offenbarungen Bezug genommen wird.
Erfindungsgemäß kann die Zusammensetzung ein oder mehrere Helferlipide enthalten.
Bevorzugt als Helferlipide sind die Lipide DOPE, POPE, DOG (1.2-di-Oleoyl-rac-glycerin) , MOG (1-Mono-oleoyl- rac~glycerin) , EPC (Eiphosphatidylcholin) , EPE (Eiphosphatidylethanolamin) .
Vorzugsweise werden die Helferlipide in einer Konzentration, bezogen auf das kationische Lipid, von 0.1 bis 10 Äquivalenten (Mol/Mol) eingesetzt.
Bei den in die Zelle zu transportierenden Nukleinsäuren kann es sich um DNAs oder RNAs handeln, wobei hinsichtlich der Nukleotidsequenz keine Beschränkungen bestehen. Bei der DNA handelt es sich für gentherapeutische Anwendungen vor allem um Gene, die in die Zelle eingeschleust werden, um die Expression therapeutisch wirksamer Genprodukte, die in der Zelle nicht oder nicht in genügend hoher Konzentration exprimiert werden, zu erzielen. Für therapeutische Zwecke kommen auch inhibierend wirkende Nukleinsäuren, z.B. Antisense-RNA-Moleküle oder Ribozyme bzw. die dafür kodierenden DNA-Moleküle, in Betracht. Beispiele für Nukleinsäuren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Anwendung kommen können, sind z.B. in der WO 93/07283 und in der WO 95/18863 angeführt.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Transfektion von höheren eukaryotischen Zellen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Zellen mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in Berührung bringt.
Das Verfahren kann bei in vi tro, ex vivo oder in vivo Transfektionen zur Anwendung kommen, bevorzugt für die Transfektion von Säugetierzellen. In vi tro wird das Verfahren vor allem auf Zellkulturen (adhärent oder in Suspension) angewendet. Anwendungen ex vivo sind gentherapeutische Anwendungen, bei denen dem zu behandelnden Organismus Zellen entnommen und ex corpore mit einem therapeutisch wirksamen Nukleinsäuremolekül, transfiziert werden, um anschließend wieder in den Organismus rückgeführt zu werden, wo das Genprodukt exprimiert wird und seine therapeutische Wirkung entfaltet. Ein Beispiel für eine ex vivo Anwendung ist die Herstellung von Tumorvakzinen aus autologen Zellen, die mit einem Zytokin-Gen transfiziert sind.
Für Anwendungen in vivo wird dem Organismus die erfindungsgemäße Zusammensetzung in Form einer pharmazeutischen Zubereitung, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, verabreicht, vorzugsweise intravenös oder, bei der Behandlung von Tumorerkrankungen, intratumoral. Für die pharmazeutische Zubereitung können der erfindungsgemäßen Zusammensetzung pharmazeutisch annehmbare Zusatzstoffe sowie inerte Träger, z.B. Kochsalzlösung oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder jeder Träger, in dem die Zusammensetzungen geeignete Löslichkeitseigenschaften haben, beigegeben werden. Bezüglich der Formulierung pharmazeutischer Zubereitungen wird auf Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980, Bezug genommen.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann abgewandelt werden, um für Anwendungen mit anderen anionischen Molekülen als Nukleinsäure eingesetzt zu werden, z.B. um anionische Proteine in höhere eukaryotische Zellen zu befördern.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschend festgestellt, daß die Transfektionseffizienz des kationischen Lipids Transfectam (Behr, et al. , 1989), wenn es bei geringem positivem Ladungsüberschuß (1.5 und 2 Ladungsäquivalente) , d.h. bei suboptimaler Konzentration, eingesetzt wird, mittels membranaktiven sauren Peptiden signifikant verstärkt werden kann.
Die Verstärkung war im Falle des Peptids INF6 (2 μg/1.5 Ladungsäquivalente Transfectam) bis zu l.OOOfach, was an das Niveau der mit optimalen Mengen Transfectam (hoher positiver Ladungsüberschuß) erzielten Genexpression heranreicht. Die Verstärkung der Genexpression mit membranaktiven Peptiden wurde bei mehreren Zelltypen beobachtet. Unter den getesteten membranaktiven Peptiden brachten nur die sauren gute Ergebnisse in Kombination mit Transfectam. Dieser Befund ist in Übereinstimmung mit der Hypothese, daß die Peptide für eine verbesserte Freisetzung der DNA aus den Endosomen in denselben endozytotischen Vesikeln lokalisiert sein müssen wie die Lipid/DNA-Komplexe, was dann gewährleistet ist, wenn die Peptide ionisch an die Transfektionspartikel gebunden sind. Beim Einsatz von 2 Ladungsäquivalenten Transfectam war die Reihenfolge der Leistungfähigkeit der Peptide INF6>INF10> EGLA-I^INF5>INFA>Melittin. Diese für die untersuchten Peptide mit Transfectam erhaltenen Ergebnisse weichen von Befunden ab, die erhalten wurden, wenn die Peptide im Transfektionssystem auf der Grundlage der rezeptorvermittelten Endozytose als Bestandteil von Transfektionskomplexen, enthaltend Transferrin- Polylysin, eingesetzt wurden: in diesem System war INF5 das beste Peptid und ca. 50fach wirksamer als INF6, während es in Kombination mit Transfectam 10 mal weniger wirksam ist als INF6. Das Peptid INF5 hat eine membranaufbrechende Wirkung nur bei saurem pH-Wert, während INF6 auch bei neutralem pH-Wert membranaktiv ist. Im lipidfreien Gentransfersystem auf der Grundlage von Polylysin-konjugierten zellulären Liganden war die Aktivität des Peptids bei neutralem pH-Wert von toxischen Nebeneffekten begleitet, die nicht beobachtet wurden, wenn das Peptid im Lipid-System eingesetzt wurden. Das künstliche Peptid EGLA-I sowie INF10 zeigten sich als Zusatz zu Lipid/DNA-Komplexen geeigneter als in Polylysin enthaltenden Komplexen.
Es wurde ferner festgestellt, daß die Wirkung der getesteten Peptide auf die Transfektionseffizienz von kationischen Lipiden bei suboptimalem Ladungsverhältnis in derselben Größenordnung lag wie die Wirkung von Helferlipiden (Remy, et al . , 1995; Zhou, et al . , 1994; Feigner, et al., 1994; Leventis, et al . , 1990) .
Die Transfektionskomplexe, enthaltend kationisches Lipid und membranaktives Peptid, können nach verschiedenen Methoden hergestellt werden. In den 30170 PCI7EP97/00649
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Versuchen der vorliegenden Erfindung wurden die Zusammensetzungen nach drei verschiedenen Methoden hergestellt, wobei sich die Methoden in der Reihenfolge der Zugabe bzw. Vereinigung der Komplexkomponenten sowie hinsichtlich des Zeitpunktes der Verdünnung unterschieden. Bei der ersten Variante wurde die DNA nach der Vereinigung von Peptid mit Transfectam zugegeben; in der zweiten Variante wurde zuerst Transfectam mit DNA komplexiert und anschließend das Peptid zugegeben. Bei der dritten Variante wurde das Peptid nach Verdünnung des Transfectam/DNA-Komplexes zugegeben. Es wurde untersucht, ob die Art der Herstellung der Transfektiσnskomplexe einen Einfluß auf das Ausmaß der Steigerung der Transfektionseffizienz hat. Dabei zeigte sich, daß sich die Herstellungsmethode auf die verschiedenen Peptide unterschiedlich auswirkt: Für INF6 erwiesen sich die drei Herstellungsmethoden als gleichwertig. Bei INF5 brachten die nach der zweiten und dritten Methode hergestellten Transfektionskomplexe bessere Ergebnisse, während bei INF10 die erste und dritte Variante der zweiten überlegen waren.
Unabhängig von der Herstellungsmethode verändert die Vereinigung der mutanten Influenzapeptide, die insgesamt eine negative Ladung aufweisen, mit kationischen Lipiden den Ladungszustand der Transfektionspartikel, wobei einige dieser peptidhaltigen Komplexe nahe der Elektroneutralität sind, weil die mutanten Influenzapeptide insgesamt eine negative Ladung aufweisen, (s. Insert von Fig. 1).
In den Versuchen der vorliegenden Erfindung wurden ferner hochwirksame DNA-Komplexe, die bei niedriger Ladung (2 Ladungsäquivalente Transfectam) das Helferlipid DOPE enthielten (Remy, et al. , 1995), mit den ein membranaktives Peptid enthaltenden Komplexen der vorliegenden Erfindung hinsichtlich ihrer Transfektionseffizienz verglichen. Nachdem die Verstärkung durch DOPE auf dessen fusogene Aktivität zurückgeführt worden war (Allen, et al. , 1990; Litzinger und Huang, 1992) , lassen die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltenen FACS-Daten (Fig. 3) auf einen weiteren wichtigen Effekt des Helferlipids schließen: die Zellassoziierung der Transfektionskomplexe ist wesentlich stärker ausgeprägt, wenn zu 2 Ladungsäquivalenten Transfectam 1.5 Äquivalente DOPE beigegeben werden, als wenn das Lipospermin allein verwendet wird. Es zeigte sich, daß das membranaktive Peptid keine Steigerung der optimal wirksamen, das Helferlipid enthaltenden Komplexe herbeiführte, während bei Verwendung von Transfectam im Überschuß (6 Ladungsäquivalente) , also bei Einsatz einer suboptimalen Menge, eine signifikante Steigerung der Genexpression im Vergleich zu den mit optimalen Mengen von Transfectam allein erzielten Werten erhalten wurde.
Außerdem wurde festgestellt, daß das membranaktive Peptid die Empfindlichkeit der Transfektionskomplexe gegenüber Serum verringert, was im Hinblick auf die Anwendung in vivo von Bedeutung ist.
Figurenübersicht
Fig. l: Transfektionseffizienz von Transfectam/DNA/INF6- Komplexen
Fig. 2: Wirkung von Serum auf die Transfektionseffizienz Fig. 3: A: Durchflußzytometrieanalyse B: Genexpression
Fig. 4: Wirkung verschiedener membranaktiver Peptide auf die Transfektionseffizienz
Fig. 5: Einfluß der Herstellungmethode von membranaktives Peptid enthaltenden Transfektionskomplexen auf die Transfektionseffizienz
Fig. 6: Effizienz von membranaktives Peptid enthaltenden Komplexen bei Transfektion verschiedener Zellinien
Fig. 7: Einfluß von Bafilomycin AI auf die Transfektionseffizienz
Fig. 8: Einfluß von Helferlipiden auf die Transfektionseffizienz
Fig. 9: Einfluß der Kombination von Transfectam,
Helferlipid und membranaktivem Peptid auf die Transfektionseffizienz
Fig. 10: Wirkung eines lipidmodifizierten membranaktiven Peptids auf die Transfektionseffizienz
In den folgenden Beispielen wurden, wenn nicht anders angegeben, die folgenden Materialien und Methoden verwendet: a) Reportergenplasmid pCMV-Luc
Die Konstruktion des Plasmids pCMV-Luc, das das Luciferasegen unter der Kontrolle des CMV- Promotor/Enhancers trägt, wurde unter der Bezeichnung pCMVL in der WO 93/07283 beschrieben.
b) Diverse Reagentien
Das Lipopolyamin DOGS (Dioctadecylamidoglyclyspermin) mit dem Handelsnamen "Transfectam" wurde von Promega bezogen, die Helferlipide DOPE (1.2-Dioleoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamin) , MOG (1-Mono-oleoyl-rac-glycerin) , DOG (1.2-di-0leoyl-rac-glycerin) , EPE (Eiphosphatidylethanolamin) , EPC (Eiphosphatidylcholin) , sowie Chloroquin, Bafilomycin A^ und Melittin (aus Bienengift) wurden von Sigma bezogen.
c) Peptidsynthese
Die Bezeichnung der Peptide, ihre Herkunft sowie Sequenzen sind in der Tabelle angegeben.
Die Peptide der Bezeichnung INF5 und INF6 wurden synthetisiert, wie von Plank, et al . , 1994, beschrieben.
Die Peptide INFA, INF10 und EGLA-I wurden unter Verwendung der Fmoc-Strategie (N-(9- Fluorenyl)methoxycarbonyl) mit HBTU-Aktivierung [0- (IH-Benzotriazol-l-yl) -N,N,N' ,N' - tetramethyluroniumhexafluorophosphat], (Fastmoc™ - 0.25 mmol Maßstab) auf einem Applied Biosystems Peptidsynthesizer Modell 433 A (Foster City, Kalifornien) mit Feedback-Monitoring synthetisiert. Pro Zyklus wurden drei Entschützungsschritte ("Deprotection") durchgeführt. Wenn das Feedback- Monitoring ergab, daß die Fmoc-Entschützung nicht quantitativ war, wurde im folgenden Schritt eine Doppelkoppelung der nächsten Aminosäure und Blockierung der endständigen NH2-Gruppen (mittels Essigsäureanhydrid) vorgenommen. Es wurden die folgenden Aminosäureschutzgruppen verwendet: (Trt)Asn, (Trt)Cys, (t-Bu)Cys, (t-Bu)Asp, (t-Bu)Glu, (Boc)Lys. Als Lösungsmittel wurde eine Mischung von 70 % NMP/30 % DMF verwendet.
Für EGLA-I wurde ein HMP-Harz (Tentagel R PHB, 0.22 mmol/g, Rapp Polymere) verwendet. Die Peptide wurden bis zum Rest Gly-30 gemeinsam synthetisiert, dann wurde die halbe Harzmenge für die Synthese von EGLA-I verwendet.
Die Peptide INF10 und INFA wurden auf einem Cys(Trt)- vorbeladenen aminomethylierten Polystyrolharz mit einem p-Carboxytritylchlorid-Linker (0.52 mmol/g; PepChem, Tübingen, Deutschland) unter Verwendung von DMF als Lösungsmittel synthetisiert.
Das Peptid der Bezeichnung INF7dimer (ein Dimeres des von Plank et al . , 1994, beschriebenen Peptids INF7) wurde unter Verwendung der Fmoc-Strategie auf einem Applied Biosystems Peptidsynthesizer Modell 431 synthetisiert. Es wurde ein mit Cystein vorbeladenes Harz verwendet (Tentagel S PHB-Cys) . Als erste Aminosäure wurde das mittelständige Lys DiFmoc- gekoppelt . Danach wurden bis Ile-18 Doppelkoppelungen durchgeführt. Von Met-17 bis Ile-10 wurden Einfachkoppelungen durchgeführt; bei Phe-9 eine Einfachkoppelung, dann zusätzliche Koppelung mit 1% Triton im Kopplungsansatz. Ab Gly-8 wurden einfache Koppelungen durchgeführt.
Die Entschützung der Peptide und die Abspaltung vom Harz wurden mit einer Mischung von Phenol, Ethandithiol, Thioanisol, Wasser und Trifluoressigsäure (0.75:0.25:0.5:0.5:10) durchgeführt. Die Rohpeptide wurden durch tropfenweise Zugabe zu Ether ausgefällt und zentrifugiert . Die so gewonnenen Peptide wurden dreimal mit Ether gewaschen und anschließend unter einem Argonstrom, gefolgt von Hochvakuum, getrocknet. Die Rohpeptide wurden in 1 M TEAB, pH 9 und 1 % ß-Mercaptoethanol gelöst.
Die Reinheit der Peptide wurde mittels analytischer Umkehrphasen-HPLC unter Einsatz einer C-18 Säule (Vydac 218ATP54, 2.1 mm x 25 cm, 5 μm) bestimmt. Dabei wurde ein binäres Lösungsmittelsystem (Lösungsmittel A: wässerige 0.1 % Trifluoressigsäure; Lösungsmittel B: Acetonitril, enthaltend 0.1 % Trifluoressigsäure) bei einem Gradienten von 0 - 100 % in 45 Minuten bei einer Flußrate von 1 ml/min verwendet . Eine analytische Ionenaustauschchromatographie (SuperQ-Toyopearl 650, TosoHaas, 5 mm x 50 mm Säule) wurde unter Verwendung eines Salzgradienten (20 mM HEPES, pH 7.3, 0 - 1.5 M NaCl in 60 min, Flußrate 0.5 ml/min) durchgeführt.
Das Peptid EGLA-I wurde einer Gelfiltration (Sephadex G10, 20 mM TEAA, pH 7.3) unterworfen. Die gereinigte Peptidfraktion wurde in einem Speedvac (Savant) gefriergetrocknet. Die analytische Umkehrphasen-Chromatographie zeigte eine Reinheit von ca. 95 %. Die Lösungen der Rohpeptide INF10 und INFA wurden mittels Gelfiltration auf Sephadex G10 (10 mm x 300 mm Säule) in 20 mM TEAA, pH 7.3 fraktioniert. Die Peptide wurden lyophilisiert; die analytische Umkehrphasen- Chromatographie ergab eine Reinheit von ca. 98 bzw. 95 %.
Das Peptid INF7dimer wurde über Sephadex G 10 gereinigt (Puffer HBS; Säule 10mm x 300mm) . Dann wurde eine Ionenaustauschchromatographie durchgeführt (Säule: (10mm x 100mm); Material: Toso Haas Super Q 650 S; Durchflußrate: 0.5 ml/min; Eluens: A: 20 mM Hepes 7.3, B: 3 M NaCl/20 mM Hepes 7.3; Gradient: 0 - 40 min 0% B, 40 - 140 min 100% B, d.h. 1%/min) . Das Peptid eluierte bei 70 - 80 min. Das über Ionenaustauscher gereinigte Peptid wurde nochmals über eine Sephadex G 10 Säule (10mm x 300mm) gereinigt (Puffer HBS/50% Glycerin) .
Die Identität der Peptide wurde bestimmt, wie von Plank, et al. , 1994, beschrieben. Die Peptide wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Der Liposomendurchlässigkeits-Assay ("Liposomen Leakage Assay") wurde durchgeführt, wie von Plank, et al . , 1994, beschrieben.
d) Zellkultur und Medien
Die Medien sowie fötales Kälberserum (FCS) und Pferdeserum wurden von Gibco-BRL bezogen. Die Kulturmedien wurden mit 2 mM L-Glutamin und Antibiotika ergänzt. Als Zellen wurden primäre humane Melanomzellen der Bezeichnung H225, Mausembryo-Leberzellen der Zellinie TIB-73 (ATCC BNL CL.2) , humane Lungenkarzinomzellen der Zellinie A549 (ATCC CCL 185) und Zellen der Maus-Melanomzellinie Cloudman S91, Klon M3 (ATCC No. CCL 53.1) verwendet. Die H225-Zellen wurden in RPMI 1640/10 % FCS/l mM Natriumpyruvat, die A549-Zellen in DMEM/10 % FCS, die BNL CL.2-Zellen in Hochglukose-DMEM/10 % FCS und die M3-Zellen in Ham's F10-Medium/15 % Pferdeserum/5 % FCS gezüchtet.
e) Transfektion der Zellen
i) Herstellung von kationischen Lipid/DNA-Komplexen
Die Komplexe wurden hergestellt, wie von Barthel, et al . , 1993, beschrieben, wobei 3 μg Plasmid-DNA und die jeweils eingesetzte Menge von Transfectam in je 75 μl 150 mM NaCl gelöst wurden. Nach 10 bis 20 min wurden die beiden Lösungen vereinigt. Nach weiteren 10 min wurde die Mischung mit serumfreiem Medium auf ein Gesamtvolumen von 2 ml verdünnt .
Der Ausdruck "Ladungsäquivalent" gibt die Menge an kationischem Lipid an, die für eine Transfektion verwendet wurde; 1 Ladungsäquivalent entspricht der Menge, die erforderlich ist, um alle negativen Ladungen der Phosphatgruppen des Plasmids zu neutralisieren. 3 μg DNA entsprechen 9 nMol negativer Ladungen; bei der Berechnung des Ladungsverhältnisses wurde berücksichtigt, daß 1 Mol Transfectam 3 Mol positive Ladungen aufweist, die von den drei bei physiologischem pH-Wert protonierten Ammoniumgruppen stammen. Ausgehend vom Molgewicht ca. 1250 bedeutet das, daß man bei Verwendung von 3 μg DNA für einen zweifachen positiven Ladungsüberschuß (2 Ladungsäquivalente
Transfectam/3 μg DNA) 3 μl einer 2mM Transfectamlösung, enthaltend 6nmol (=7.58 μg) Transfectam benötigt.
Die Peptide wurden in einer Menge von 0.5 oder 1 mg/ml Lösung in HBS (HEPES-gepufferte Salzlösung, enthaltend 150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.3) zu den
Transfectam/DNA-Komplexen gegeben. Nach einer 10 bis
20 minütigen Reifungszeit wurde das
Transfektionsvolumen mit Kulturmedium auf 2 ml gebracht, von der erhaltenen Transfektionsmischung wurde 1 ml auf die Zellen pipettiert.
Die Helferlipide DOPE, DOG, EPC, EPE bzw. MOG oder Cholesterin wurden in Ethanol, enthaltend eine Spur Dichlormethan, verdünnt. Die
Transfectam/Helferlipid/DNA-Komplexe wurden gebildet, indem die jeweiligen Mengen an Transfectam/Helferlipid (die Menge an verwendetem Helferlipid, bezogen auf Transfectam, wird als Molverhältnis angegeben) vor der Verdünnung mit der DNA-Lösung gemischt wurden.
ii) Transfektion und Luciferase-Bestimmung
50.000 bis 75.000 Zellen pro Vertiefung einer 24 Well- Platte wurden einen Tag vor der Transfektion ausplattiert, wobei bei allen Versuchen das Transfektionsvolumen 1 ml betrug. Die Transfektion wurde mit 1 ml des in i) hergestellten Komplexes durchgeführt. Nach 3 bis 4 h wurde das Transfektionsmedium durch frisches Medium, enhaltend 10 % FCS, ersetzt. Jedes Experiment wurde, sofern nicht anders angegeben, mindestens zweifach durchgeführt, wobei sich die in den Abbildungen angegebenen Peptidmengen in diesen Fällen auf die insgesamt für die Doppelbestimmung eingesetzte Menge beziehen.
24 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und in 150 - 200 μl 250 mM Tris pH 7.3, 0.5 % Triton X-100 aufgenommen. Das Zellyεat wurde dann in 1.5 ml Eppendorfröhrchen überführt und 5 min bei 14.000 g zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Die Bestimmung der Luciferaseaktivität wurde durchgeführt, wie in der WO 93/7283 beschrieben, wobei die Luciferase-Lichteinheiten von einem Aliquot des Überstandes (20 μl) mit 10 see Integration nach Injektion von frisch zubereiteter Luciferinlösung bestimmt wurde. Der Luciferasehintergrund (150 - 250 Lichteinheiten) wurde von jedem Wert abgezogen; die Transfektionseffizienz wurde ausgedrückt als Gesamtlichteinheiten, welche den Mittelwert von Doppelbestimmungen darstellen. Zur quantitativen Bestimmung des Proteingehalts wurde der Bradford-Assay (Bio-Rad) verwendet.
f) Durchflußzytometrie
Für die Durchflußzytometrie wurde die Plasmid-DNA mit dem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff YOYO-1, (beschrieben von Rye, et al . , 1992; Hirons, et al . , 1994, erhältlich von Molecular Probes; ca. 1 Farbstoffmolekül pro 300 bp) inkubiert, danach wurden, wie oben beschrieben, die Komplexe hergestellt. Die Komplexe wurden auf 300.000 H225-Zellen pro Vertiefung einer 6 Well-Platte gegeben, dann wurde 4 h lang entweder bei 4°C (Zeiloberflächenassoziation) oder bei 37°C (Zelloberflächenassoziation und Aufnahme in die Zellen) inkubiert. Danach wurden die Zellen zweimal mit kaltem PBS gewaschen und mit 1 mM EDTA in PBS geerntet und auf einem FACScan-Gerät (Becton Dickinson) analysiert .
Beispiel 1
Transfektionseffizienz von Transf ec tarn/DNA/ INF6 - Komplexen Es wurden Komplexe von 1, 1.5, 2 oder 4 Ladungsäquivalenten Transfectam pro 3 μg pCMV-Luc in Kombination mit steigenden Mengen des membranaktiven, sauren, vom Influenzavirus stammenden Peptid INF6 hergestellt und mit RPMI 1640 Kulturmedium gemischt. Die erhaltenen Komplexe wurden auf H225-Zellen (75.000 Zellen pro Vertiefung einer 24 Well-Platte) aufgebracht. Nach 4 h wurde das Transfektionsmedium durch frisches RPMI-Medium, enthaltend 10% FCS ersetzt. Das Ergebnis der Versuche ist in Fig. 1 dargestellt (gepunktete Linie mit Rhomben: 1 Äquivalent (eq.) Transfectam /x μg INF6; volle Linie mit Kreisen-. Transfectam 1.5 eq./x μg INF6; strichlierte Linie mit Quadraten: Transfectam 2 eq./x μg INF6; volle Linie mit Dreiecken: Transfectam 4 eq./x μg INF6) . Es zeigte sich, daß bei Verwendung von 2 bzw. 1.5 Ladungsäquivalenten Lipid eine 100 bis l.OOOfache Steigerung der Transfektionseffizienz, gemessen als Luciferaseaktivität, erzielt wurde. Beim Einsatz von bereits optimalen Bedingungen (4 Ladungsäquivalente kationisches Lipid) wurde nur eine geringe Steigerung (ca. 1.5 bis 5fach) erhalten. Da das Peptid INF6 bei pH 7 vier negative Ladungen hat, kann es über elektrostatische Wechselwirkungen mit den kationischen Lipid/DNA-Partikeln assoziieren. Bei Verwendung von neutralen Partikeln (1 Ladungsäquivalent) wurde keine Verstärkung beobachtet, vermutlich weil an diese Komplexe nur wenige Peptide binden können. Es könnten sogar Wechselwirkungen mit der Zellmembran vermindert werden, weil positive Restladungen durch die Assoziation mit dem Peptid maskiert werden. Das Insert von Fig. 1 zeigt die Transfektionseffizienz der Transfectam/DNA/INF6-Komplexe, aufgetragen gegen das theoretische Ladungsverhältnis der Komplexe. Unter der Annahme, daß beinahe das gesamte Peptid an die transfizierenden Partikel bindet, wird eine hohe Luciferaseexpression mit elektroneutralen (oder nahezu neutralen) Lipid-Vektoren erzielt.
Beispiel 2
Wirkung von Serum auf die Transfektionseffizienz
Es wurden Transfektionen von H225-Zellen vorgenommen, wobei die in Fig. 2 angegebenen Mengen Transfectam (in Ladungsäquivalenten) und das Peptid INF6 verwendet wurden. Die Transfektionen wurden einerseits ohne Serum (leere Balken) , andererseits in Gegenwart von 10% (gepunktete Balken) bwz. 20% (graue Balken) nicht hitzeinaktiviertem FCS vorgenommen (Fig. 2) . Es zeigte sich, daß die Peptid enthaltenden Komplexe eine geringere Empfindlichkeit gegenüber Serum aufwiesen.
Beispiel 3
Assoziation von Transfectam/DNA-Komplexen und Expressionsrate
a) Durchflußzytometrie-Analyse von Transfektionskomplexen
Die Analyse wurde mit H225-Zellen durchgeführt, wie im Methodenteil beschrieben. Wie in Fig. 3A dargestellt, ändert sich die Assoziierung der Transfectam/DNA- Komplexe mit der Zelloberfläche entscheidend mit dem Ladungsverhältnis: mit 2 Ladungsäquivalenten wurde eine heterogene Zellpopulation gefunden, während bei 4 Ladungsäquivalenten eine klassische Gauß-Kurve gefunden wurde. Der Zusatz von membranaktiven Peptiden zu 2 (oder 4) Ladungsäquivalenten Transfectam brachte keine wesentliche Änderung des Kurvenprofils sowohl bei 4°C als auch bei 37°C.
b) Genexpression
Es wurde, parallel zu den in a) durchgeführten Tests, die Genexpression von 300.000 Zellen nach Inkubation bei 4°C und 37°C mit verschiedenen
Transfektionskomplexen gemessen (die Zellen wurden bei 4°C oder bei 37°C inkubiert, nach 4 h zweimal mit PBS gewaschen, mit frischem Medium, enthaltend 10% FCS versetzt und 20 h lang bei 37°C und 5%Cθ2 inkubiert) . Die Gegenwart von Peptid (1.5 μg/Well; bei diesem Experiment wurde eine Einfachbestimmung vorgenommen) bewirkte beim Ansatz bei 4°C eine 15fache und beim Ansatz bei 37°C eine lOOfache Verstärkung der Expression. (Fig. 3B. Leere Balken: Genexpression nach Inkubation bei 4°C; gefüllte Balken: Genexpression nach Inkubation bei 37°C) .
Beispiel 4
Wirkung verschiedener Peptide
Wie im Methodenteil beschrieben, wurden Transfeetarn/DNA-Komplexe aus 2 Ladungsäquivalenten Transfectam pro 3 μg DNA hergestellt. Für einige Experimente enthielten die Komplexe die in Fig. 4 angegebenen Peptide in den jeweils angegebenen Mengen. Die Peptide INF6, INFA und Melittin, die eine gute hämolytische Aktivität besitzen, ohne eine ausgeprägte Spezifität für niedrige pH-Werte zu haben, zeigten ein unterschiedliches Verhalten: INFA und INF6 verstärkten die Transfektionseffizienz von 2 Ladungsäquivalenten Transfectam um das 10 bzw. 200fache, während Melittin die Luciferaseexpression nur geringfügig verstärkte. Darüberhinaus war Melittin bei einer Menge von 5 μg/Doppelbestimmung hochtoxisch. Die Influenzapeptid- Mutanten INF5 und INF10, von denen sich im Liposomendurchlässigkeitstest gezeigt hatte, daß sie bei pH 5.0 Calcein effizient freisetzen, (Plank, et al . , 1994) brachten bessere Ergebnisse als INFA, waren aber weniger wirksam als INF6. Außerdem wurde ein nicht von der HA2-Sequenz des Influenzavirus abgeleitetes Peptid der Bezeichnung EGLA-I getestet, in dem einer der Alaninreste im GALA-Repeat (Parente, et al . , 1988) durch einen Glycinrest ersetzt wurde. Dieses Peptid gab ebensogute Ergebnisse wie INF5.
Beispiel 5
Einfluß der Herstellungsmethode von
Transfectam/DNA/Peptid-Komplexen auf die Effizienz der Transfektion von H225-Zellen
Es wurden Komplexe auf drei verschiedene Arten hergestellt (Fig. 5) : a) Vereinigung von Peptid und Lipid vor der Komplexierung mit DNA (gepunktete Balken) b) Zugabe des Peptids nach Bildung des Transfectam/DNA- Komplexes vor Verdünnung mit Medium (150 μl Volumen; graue Balken) c) Zugabe des Peptids nach Verdünnung der Komplexe mit dem Kulturmedium (2 ml Volumen; schwarze Balken)
Wie die in Fig. 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, hängt der Einfluß der Herstellungsmethode auf die Genexpressionsrate von der Peptidsequenz ab. Die Vereinigung des Peptids mit Transfectam vor der Komplexierung mit dem Plasmid ergab ein konträres 30170 PCΪ7EP97/00649
28
Verhalten der Peptide: während die Genexpressionsrate bei INF6 unverändert blieb, war bei INF10 die Leistungsfähigkeit der so hergestellten Komplexe fünfmal besser als bei nach der Standardmethode (s. Methodenteil) erhaltenen Komplexe. Im Gegensatz dazu bewirkte diese Methode der Komplexherstellung bei INF5 eine starke Verringerung der Genexpression.
Beispiel 6
Wirkung der Peptide auf die Transfektionseffizienz verschiedener Zellinien
Daß die Wirkung der Peptide auf den Gentransfer mittels Lipiden nicht auf bestimmte Zelltypen beschränkt ist, sondern ein allgemeines Phänomen, zeigte sich in Versuchen mit Zellen verschiedener Zellinien, die in Fig. 6 dargestellt sind (H225-Zellen: leere Balken; BNL CL.2-Zellen: gepunktete Balken; A549-Zellen: hellgraue Balken; M3-Zellen: dunkelgraue Balken) . Dazu wurden Komplexe aus Transfectam, pCMV-Luc 5 μg INF6 hergestellt und die Effizienz der Komplexe auf den Zellen getestet. (Als Vergleichswert wurde Transfectam bei einem Ladungsüberschuß von 4 Ladungsäquivalenten verwendet, obwohl es nicht auf allen getesteten Zellen die höchsten Werte gibt.) Es wurden bei allen Zellinien Steigerungsraten der Transfektionseffizienz festgestellt , wenn die Transfektionskomplexe ein membranaktives Peptic enthielten.
Beispiel 7
Untersuchung des Einflusses von Bafilomycin A auf die Transfektionseffizienz von Transfectam/DNA-Komplexen Die Gegenwart des spezifischen Inhibitors der Vakuolen- Protonenpumpe Bafilomycin A^ (Bowman, et al . , 1988; Yoshimori, et al . , 1991) in einer Konzentration von 200 nM bei der Transfektion von H225-Zellen (es wurden 2 Ladungsäquivalente Transfectam bzw.
2 Ladungsäquivalente Transfectam plus INF10 bzw. INF6 eingesetzt; nach 4 h Inkubation wurde das Medium durch frisches mit einem Gehalt von 10 % FCS ersetzt) verminderte die Genexpression um einen Faktor 7, 5 bzw. 1.5 (Fig. 7. Leere Balken: ohne Zusatz von Bafilomycin AI. Gepunktete Balken: In Gegenwart von 200 nM Bafilomycin AI) . Beim Einsatz von 4 Ladungsäquivalenten Transfectam konnte Bafilomycin keine Verringerung des Gentransfers bewirken.
Beispiel 8
Untersuchung des Einflusses von Helferlipiden auf die Effizienz von Transfectam/DNA-Komplexen
a) Verstärkung der Wirkung von Transfectam durch Helferlipide
Es wurden die in Fig. 8 angegebenen Helferlipide in einem molaren Verhältnis von 2 Ladungsäquivalenten Transfectam zu 1 bis 3 Äquivalenten Helferlipid eingesetzt. Dies ergab für DOPE, EPE oder DOG eine 10 bis 20fach höhere Genexpression (s. auch Fig. 3B) . MOG verstärkte die Expression um das ca. 4fache, während EPC und Cholesterin die Transfektionseffizienz auf H225-Zellen nicht verstärken konnte. Eine weitere, bis zu 7fache Verstärkung konnte erzielt werden, wenn der Transfectam/DOPE-Formulierung 1 mol/% DOG beigemischt wurde; dies ist vermutlich auf die Fähigkeit von DOG zurückzuführen, u.a. eine Fusion zu induzieren (Siegel, et al. , 1989) .
Mit Transfektionskomplexen, enthaltend das Helferlipid DOPE (1.5 Mol pro 2 Mol Transfectam; das sind 9 nMol DOPE, entsprechend 6.7 μg) , wurde, wie in Beispiel 3 a) beschrieben, eine Durchflußzytometrie durchgeführt. Es ergab sich eine deutliche Veränderung des FACScan- Profils (Fig. 3A) : die Zellpopulation ist homogener und die Zellassoziierung (sowie auch die Aufnahme in die Zellen bei 37°C, nicht in der Figur dargestellt) ist stärker als ohne Helferlipid. Wenn die Luciferaseaktivität aus einem bei 4°C durchgeführten Experiment, bei dem 2 Ladungsäquivalente Transfectam und 1.5 Äquivalente DOPE, 24 h später gemessen wurde, zeigte sich, daß die DOPE enthaltenden Komplexe 8 bzw. 280 mal besser waren, als 4 bzw. 2 Ladungsäquivalente des kationischen Lipids allein (Fig. 3B) . Wenn der Versuch bei 37°C durchgeführt wurde, waren die Unterschiede in der Luciferaseexpression 2 bzw. 640fach.
b) Verstärkung der Wirkung von Transfectam durch Helferlipide und membranaktive Peptide
Nach Herstellung von Transfectam/DNA/DOPE-Komplexen wurden steigende Mengen INF10 beigegeben. Nach einer Reifungszeit von 10 - 20 min wurde serumfreies Kulturmedium auf ein Gesamtvolumen von 2 ml beigegeben; 1 ml der Transfektionsmischung wurde auf jede Vertiefung der Doppelbestimmung aufgebracht. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 9 dargestellt (leere Balken:Transfectam, gepunkteter Balken: Transfectam 6 eq.Transfectam/DOPE 0.36 eq. , gefüllte
Balken: Transfectam 6 eq.Transfectam/DOPE
0.36 eq./x μg INF10) . Die Gegenwart von membranaktivem
Peptid ergab bei Komplexen mit hoher Effizienz
(Transfectam 2 eq./INFlO 3 μg, 5 μg oder
7,5 μg/1.5 eq. DOPE) keine weitere Steigerung (nicht in
Fig. 9 gezeigt) . Wenn jedoch das Peptid zusammen mit einem Überschuß von Transfectam (6 Ladungsäquivalente) verwendet wurde, konnte gegenüber den mit optimalen
Mengen Transfectam/DOPE erhaltenen Werten eine signifikante Steigerung der Genexpression erhalten werden; die Werte mit
6 eq.Transfectam/0.36 eq. DOPE/10 μg INF10 waren 6x besser als die mit
2 eq.Transfectam/1.5 eq. DOPE/7.5 μg INF10.
Beispiel 9
Wirkung eines lipidmodifizierten membranaktiven Peptids auf die Transfektionseffizienz
a) Herstellung von modifiziertem Peptid (DPPE-INF7dimer)
Das Peptid der Bezeichung INF7dimer (vgl. Tabelle) , ein Dimeres des von Plank, et al . , 1994 beschriebenen Peptids INF7, wurde an das Lipidderivat DPPE-
(Dipalmitoylphosphatidylethanolamyl)Bromacetamid
(Hexadecansäure-3- ( (2- (2- (2- (2- (2- (2- Bromacethylamino) ethoxy)ethoxy) ethoxy) - acetylamino)ethoxy)hydroxyphosphoryloxy) -2- hexadecanoyloxypropylester) gekoppelt, indem 0.95 Äquivalente Peptid (80 nmol; ca. 450 μg) zu dem in 1.3ml Diethanolaminpuffer (pH 9.5/Ethanol; 9/1; v/v) verdünnten Lipid zugegeben wurden. Nach 3 h bei Raumtemperatur wurde ein Ellman-Test zur quantitativen Bestimmung der Thiolreste durchgeführt. Anschließend wurde zwecks Zerstörung der restlichen Bromacetamidgruppe ß-Mercaptoethanol zugegeben. Das erhaltene lipidmodifizierte Peptid wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
b) Transfektion von BNL CL.2-Zellen
1.5 eq. Transfectam wurden in 75 μl 0.15 M NaCl verdünnt, intensiv gemischt, worauf die in Fig. 10 angegebenen Mengen an DPPE-INF7dimer (die in der Fig. angegebenen Werte sind Mol%, bezogen auf die Gesamtmenge an Transfectam) zugegeben wurden. Anschließend wurde gut gemischt, nach 10 min wurden 3 μg DNA in 75 μl NaCl beigegeben, abermals gemischt und nach weiteren 10 min mit Medium auf ein Gesamttransfektionsvolumen von 2 ml aufgefüllt. Von der erhaltenen Transfektionszusammensetzung wurden 1 ml pro Well auf die Zellen aufgegeben. Die in Fig. 10 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die höchste Steigerung bei einem Gehalt von 7.5 Mol% DPPE-INF7dimer erhalten wurde.
Tabelle
Sequenzen und Ursprung der membranaktiven Peptide
Figure imgf000035_0001
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Claims

Patentansprüche
1. Zusammensetzung für die Transfektion von höheren eukaryotischen Zellen, wobei die Zusammensetzung einen Komplex, enthaltend eine in der Zelle zu exprimierende Nukleinsäure sowie, in einer für die Transfektion suboptimalen Konzentration, ein oder mehrere kationische Lipide, sowie gegebenenfalls Helferlipid(e) enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung ein oder mehrere membranaktive saure Peptide enthält, wobei das Verhältnis der Gesamtzahl der positiven zur Gesamtzahl der negativen Ladungen in der Zusammensetzung ca. 0 bis ca. 3 beträgt.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis der positiven zu den negativen Ladungen der Zusammensetzung ca. 0 bis ca. 2 beträgt.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die suboptimale Konzentration von kationischem Lipid, gegebenfalls in Mischung mit Helferlipid, einer Konzentration entspricht, bei der die Transfektionseffizienz um einen Faktor von mindestens ca. 2 geringer ist als bei optimaler Konzentration.
4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid der Bezeichnung INF6 mit der Sequenz GLF GAI AGFI ENGW EGMI DGWYG enthält.
5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid der Bezeichnung INF10 mit der Sequenz GLF ELA EGLA ELGW EGLA EGWYGC enthält.
6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid der Bezeichnung INF5 mit der Sequenz [GLF EAI EGFI ENGW EGnIDG]2 K enthält.
7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie Peptid der Bezeichnung EGLA-I mit der Sequenz GLFL GLA EGLA EGLA EGLA EGLA EGL EGLA GGSC enthält.
8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid der Bezeichnung INFA mit der Sequenz GLF EAI EAFI ENAW EAMI DAWYG enthält.
9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid der Bezeichnung INF8 mit der Sequenz [GLF EAI EGFI ENGF EGMI DGGG]2 K enthält.
10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid der Beze: nung INF9 mit der Sequenz GLF ELA EGLA ELGA EGLA JWYGC etnhält.
11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid der Bezeichnung EGLA-II mit der Sequenz WEA GLA EGLA EGLA EGLA EGLA EGL EGLA GGSC enthält.
12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid der Bezeichnung EGLA-III mit der Sequenz GLF EGA EGLA EGA EGLA EGLA EGWY GAC enthält.
13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid der Bezeichnung EGLA-IV mit der Sequenz GLF EGA EGLA EGW EGLA EGLA EGWY GAC enthält.
14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Peptid der Bezeichnung INF7dimer mit der Sequenz [GLF EAI EGFI ENGW EGMI DGWYG]2 KC enthält.
15. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das membranaktive Peptid mit einem Lipid modifiziert ist .
16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid mit Dipalmitoylphosphatidylethanolamyl (DPPE) modifiziert ist.
17. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das kationische Lipid ein Lipopolyamin ist.
18. Zusammensetzung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Lipopolyamin Dioctadecylamidoglyclyspermin (DOGS) ist.
19. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oder mehrere Helferlipide, ausgewählt aus der Gruppe Phosphatidylethanolamine,
Phosphatidylglycerine und Diacylglycerine, enthält.
20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Helferlipid Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE) enthält.
21. Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Helferlipid Oleoyl- palmitoylphosphatidylethanolamin (POPE) enthält
22. Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Helferlipid 1-Mono- oleoyl-rac-glycerin (MOG) enthält
23. Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Helferlipid 1.2-di- Oleoyl-rac-glycerin (DOG) enthält.
24. Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Helferlipid Eiphosphatidylcholin (EPC) enthält.
25. Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Helferlipid Eiphosphatidylethanolamin (EPE) enthält.
26. Zusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Helferlipid Cholesterin enthält.
27. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend als wirksame Komponente eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 25.
28. Verfahren zur Transfektion höherer eukaryotischer Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 26 in Berührung bringt.
29. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 28 auf Säugetierzellen in vi tro oder ex vivo .
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