DE69828045T2

DE69828045T2 - Verbindungen, ihre herstellung und ihre verwendung für den transfer von nucleinsäuren in zellen

Info

Publication number: DE69828045T2
Application number: DE69828045T
Authority: DE
Inventors: Gerardo Byk; Catherine Dubertret; Daniel Scherman
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1997-05-28
Filing date: 1998-05-25
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2018-05-26
Also published as: BR9809506A; EP0984925B1; NO995808D0; WO1998054130A1; FR2763943A1; CA2290664A1; ZA984440B; PL336983A1; DE69828045D1; EP0984925A1; CA2290664C; JP4467084B2; JP2002502388A; CN1257480A; US6300321B1; ATE284383T1; NO314497B1; CN1131208C; KR20010013029A; AU8022198A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Verbindungen zum Transfer von Nukleinsäuren in die Zellen. Diese neuen Verbindungen sind besonders mit der Familie der Lipopolyamine verwandt und enthalten Amidinfunktionen. Diese Verbindungen sind zum Transfer von interessierenden Nukleinsäuren in verschiedene Zelltypen, sowohl in vitro als auch in vivo oder ex vivo verwendbar.
Mit der Entwicklung der Biotechnologie ist die Möglichkeit, Nukleinsäuren wirksam in Zellen zu transferieren, eine Notwendigkeit geworden. Es kann sich um den Transfer von Nukleinsäuren in vitro in Zellen handeln, z. B. zur Produktion von rekombinanten Proteinen oder im Labor zur Untersuchung der Regulation der Expression von Genen, der Genklonierung oder jeder anderen Manipulation, die DNA impliziert. Es kann sich auch um den Transfer von Nukleinsäuren in vivo in Zellen handeln, z. B. zur Erzeugung von transgenen Tieren, zur Herstellung von Vakzinen, für Markierungsuntersuchungen und auch für therapeutische Ansätze. Es kann sich außerdem um den Transfer von Nukleinsäuren ex vivo in Zellen handeln, und zwar in Verfahren der Knochenmarkstransplantation oder der Immuntherapie oder anderen Methoden, die den Transfer von Genen in Zellen, die einem Organismus mit der Absicht der letztlichen Wiederverabreichung entnommen worden waren, implizieren.
Es wurden verschiedene synthetische Vektoren entwickelt, um den Transfer der Nukleinsäuren in die Zellen zu verbessern. Unter diesen Vektoren besitzen die kationischen Lipide interessante Eigenschaften. Diese Vektoren werden von einem polaren, kationischen Teil, der mit den Nukleinsäuren wechselwirkt, und einem lipidischen, hydrophoben Teil, der die zelluläre Penetration begünstigt, gebildet. Besondere Beispiele für kationische Lipide sind insbesondere die monokationischen Lipide (DOTMA: Lipofectin^®), bestimmte kationische Detergentien (DDAB), die Lipopolyamine und insbesondere Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS) oder 5-Carboxyspermylamid von Palmitoylphosphatidylethanolamin (DPPES), dessen Herstellung z. B. in der Patentanmeldung EP 394 111 beschrieben ist. Eine andere Familie der Lipopolyamine wird durch die Verbindungen repräsentiert, die in der Patentanmeldung WO 97/18185 beschrieben werden, welche hier durch Referenz aufgenommen wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Typ an Mitteln zum Transfer von Nukleinsäuren, die besonders interessante Eigenschaften besitzen. Genauer ausgedrückt, die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind kationische Lipide, die eine ursprüngliche kationische Region tragen, die den Molekülen verbesserte Eigenschaften verleiht. Dieser kationische Teil wird genauer durch ein besonderes Polyamin dargestellt, das eine oder mehrere Amindinfunktionen trägt.
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft genauer Verbindungen in der Form D, L oder DL sowie ihre Salze, der allgemeinen Formel (I):
in der:

– R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -(CH₂)q-NRR' darstellen, mit
• q, das eine ganze Zahl von 1 bis einschließlich 6 darstellt, wobei die Werte von q unabhängig voneinander innerhalb der verschiedenen Gruppen R₁, R₂ und R₃ sind, und
• R und R' unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel (II):
darstellen, worin r eine ganze Zahl darstellt, die von 0 bis einschließlich 6 variieren kann, und die Gruppen R₅ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder einen Kohlenwasserstoffrest darstellen, mit der Maßgabe, daß mindestens eine der Gruppe R₁, R₂ und R₃ mindestens eine Gruppe der Formel (II) umfaßt,
– m und n unabhängig voneinander eine ganze Zahl darstellen, die von 1 bis einschließlich 6 variieren kann, wobei in dem Fall, wo n höher als 1 ist, m unterschiedliche Werte annehmen kann und R3 die verschiedenen bei der allgemeinen Formel (I) angegebenen Bedeutungen besitzt,
– p eine ganze Zahl darstellt, die von 1 bis einschließlich 6 variieren kann und
– R₄ eine Gruppe der allgemeinen Formel (III):
darstellt, in der
• R₇ und R₈ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine lipophile Gruppe darstellen, wobei mindestens eine der Gruppen R₇ und R₈ von Wasserstoff verschieden ist,
• t eine ganze Zahl ist, ausgewählt von 0 bis einschließlich 10, wobei, wenn t eine ganz Zahl höher 1 darstellt, R₆, X, Y und s innerhalb der verschiedenen Struktureinheiten [X-(CHR₆)_s-Y] verschiedene Bedeutungen besitzen können,
• X ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder eine Gruppe Amino oder Alkylamino darstellt, wobei der Substituenten Alkyl linear oder verzweigt ist und 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthält,
• Y eine Gruppe Carbonyl oder eine Gruppe Methylen darstellt,
• R₆ ein Wasserstoffatom oder eine Seitenkette einer natürlichen Aminosäure, gegebenenfalls substituiert, darstellt und
• s eine ganze Zahl darstellt, die von 1 bis einschließlich 10 variiert, wobei, wenn s gleich 1 ist, R₆ eine Seitenkette einer natürlichen Aminosäure, gegebenenfalls substituiert, darstellt, und wenn s höher als 1 ist, R₆ ein Wasserstoffatom darstellt.

Der Ausdruck "Form DL", wie er vorstehend verwendet wurde, bezeichnet ein Gemisch der Formen D und L in jedem Verhältnis und zum Beispiel in gleichen Verhältnismengen.
Im Sinne der Erfindung versteht man unter "Kohlenwasserstoffrest" jeden Alkyl-, Carbamat- oder aliphatischen oder aromatischen acyclischen Rest, gegebenenfalls halogeniert. Unter den aliphatischen Resten kann man insbesondere die gesättigten oder ungesättigten, linearen oder verzweigten, cyclischen oder nicht-cyclischen und gegebenenfalls halogenierten aliphatischen Resten nennen. Es handelt sich besonders bevorzugt um einen aliphatischen Rest, der 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält. Insbesondere handelt es sich um Alkanoyl-, Alkyl- und Alkylcarbamat-Reste, zum Beispiel die Substituenten Formyl, Butyl, tert-Butyl oder tert-Butylcarbamat. Nach einer Variante der Erfindung stellt R₅ tert-Butylcarbamat dar.
Unter den aromatischen Resten kann man insbesondere Benzyl und seine Derivat wie Chlorbenzyl, Benzylcarbamat oder Chlorbenzylcarbamat nennen.
In bevorzugter Weise stellt R₅ tert-Butylcarbamat, Benzylbenzylcarbamat oder Chlorbenzylcarbamat dar.
Nach einer ersten Variante der Erfindung stellt eine der Gruppen R₅ ein Wasserstoffatom dar und stellt die andere einen aliphatischen Rest, der 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält, dar.
Nach einer zweiten Variante der Erfindung stellt eine der Gruppen R₅ ein Wasserstoffatom dar und stellt die andere einen aromatischen Rest, vorzugsweise ausgewählt aus Benzyl und seinen Derivaten, dar.
Nach einer anderen Variante der Erfindung stellen die zwei Gruppen R₅ Wasserstoffatome dar.
Wenn R₁, R₂ und/oder R₃ nicht Wasserstoff darstellen und die allgemeine Formel (II) umfassen, nimmt q vorteilhafterweise den Wert 2 oder 3 an und r stellt 0 dar.
Vorteilhafterweise ist m in der allgemeinen Formel (I) unter 2, 3 und 4 ausgewählt.
Wie vorstehend angegeben wurde, stellt in der Formel (III) wenigstens eine der Gruppen R₇ und R₈ eine lipophile Gruppe dar. Im Sinne der Erfindung versteht man unter "lipophile Gruppe" jede dem Fachmann bekannte Gruppe des lipiden, hydrophoben Typs, die die zelluläre Penetration begünstigt. Es handelt sich insbesondere um eine oder mehrere aliphatische Fettketten, ein Steroid-Derivat, ein natürliches oder synthetisches Lipid, das vorzugsweise fähig ist, lamellare oder hexagonale Phasen zu bilden oder es handelt sich gegebenenfalls um eine Kombination dieser. Es kann sich insbesondere um einen aliphatischen Rest handeln, der 5 bis 22 Kohlenstoffatome enthält, gesättigt oder nicht gesättigt ist, linear oder verzweigt ist, gegebenenfalls halogeniert ist. Es kann sich auch um ein Steroid-Derivat oder eine Gruppe (CH₂)_u-NH-R₉, in der u eine ganze Zahl zwischen 2 und einschließlich 6 ist, und R₉ einen Acylrest darstellt, wie zum Beispiel Cholesterylformiat, Arachidonyl oder Cholsäure, handeln.
Andere Beispiele für Steroid-Derivate sind insbesondere Cholesterin, Cholestanol, 3-α-5-Cyclo-5-α-cholestan-6-β-ol, Cholsäure, Cholesterylformiat, Cholestanylformiat, 3α,5-Cyclo-5α-cholestan-6β-yl-formiat, Cholesterylamin, 6-(1,5-Dimethylhexyl)-3α,5α-dimethylhexadecahydrocyclopenta[a]cyclopropal-[2,3]-cyclopenta-[1,2-f]-naphthalin-10-ylamin oder Cholestanylamin.
Vorzugsweise ist die lipophile Gruppe ein aliphatischer Rest, der 10 bis 22 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 14, 16, 17, 18 oder 19 Kohlenstoffatome, enthält. Man kann insbesondere die lipophilen Gruppen (CH₂)₁₃CH₃, (CH₂)₁₅CH₃, (CH₂)₁₆CH₃, (CH₂)₁₇CH₃, (CH₂)₁₈CH₃ und Oleyl nennen.
In einer besonderen Ausführungsform stellen die zwei Gruppen R₇ und R₈ lipophile Gruppen dar, wie sie oben definiert sind. In einer besonderen Ausführungsform stellt jede der Gruppen R₇ und R₈ eine aliphatische Kette, die zwischen 5 und 22 Kohlenstoffatome und noch bevorzugter zwischen 12 und 22 Kohlenstoffatome enthält, dar.
Nach einer Variante der Erfindung stellt R₆ eine Seitenkette einer natürlichen Aminosäure dar. Insbesondere kann die Seitenkette einer natürlichen Aminosäure Amidiniummotive enthalten, wie zum Beispiel die Seitenkette des Arginins. Diese Seitenkette R₆ kann auch, wie es vorher beschrieben wurde, durch gesättigte oder ungesättigte, lineare, verzweigte oder cyclische Gruppen substituiert sein und zwischen 1 und 24 Kohlenstoffatome enthalten. Mann kann zum Beispiel die Aminosäure-Seitenketten nennen, die substituiert sind durch Cholesteryl-, Arachidonyl- oder Retinoyl-Reste, mono- oder polyaromatische Gruppen wie zum Beispiel Benzyloxycarbonyl-, Benzylester-, Rhodaminyl- oder auch Biotinyl, substituiert oder nicht.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform umfassen die beanspruchten Verbindungen außerdem ein Zielelement, das es ermöglicht, den Transfer der Nukleinsäure, mit der sie verbunden sind, zu orientieren. Dieses Zielement ist vorzugsweise im Bereich der Seitenkette der Aminosäure, die durch den Substituenten R₆ dargestellt wird, in die Verbindung der allgemeinen Formel (I) eingegliedert. Bevorzugter befindet sich das Zielelement kovalent oder nicht-kovalent an die Verbindung gemäß der Erfindung gebunden.
Es kann sich um ein extrazelluläres Zielelement handeln, das es ermöglicht, den Transfer der Nukleinsäure auf bestimmte Zelltypen oder bestimmte gewünschte Gewebe (Tumorzellen, hepatische Zellen, hämatopoetische Zellen, usw.) zu richten. Dabei kann es sich um einen zellulären Rezeptorliganden handeln, der an der Oberfläche des Zielzelltyps vorliegt, zum Beispiel ein Zucker, ein Folat, ein Transferin, ein Insulin, ein Asialo-orosomucoid-Protein oder ein beliebiges bioaktives Molekül, das durch extrazelluläre Rezeptoren erkannt wird. Es kann sich auch um ein intrazelluläres Zielelement handeln, das es ermöglicht, den Transfer der Nukleinsäure auf bestimmte privilegierte Zellkompartimente (Mitochondrien, Zellkern, usw.) zu lenken, zum Beispiel eine Signalsequenz für eine Kernlokalisierung (nls), die eine Akkumulation der transfizierten DNA im Zellkern fördert.
Allgemeiner ausgedrückt, die Zielelemente, die zur Verwendung im Rahmen der Erfindung geeignet sind, umfassen Zucker, Peptide, Oligonukleotide, Steroide oder Lipide. Vorzugsweise handelt es sich um Zucker und/oder Peptide, wie zum Beispiel Antikörper oder Antikörperfragmente, zelluläre Rezeptorliganden oder Fragmente davon, Rezeptoren oder Rezeptorfragmente usw. Es handelt sich insbesondere um Rezeptorliganden der Wachstumsfaktoren, Cytokin-Rezeptoren, Rezeptoren zellulärer Lectine oder Rezeptoren von Adhäsionsproteinen wie zum Beispiel Integrine. Man kann auch den Rezeptor für Transferin, die Lipide HDL und LDL nennen. Das Zielelement kann auch ein Zucker sein, der es ermöglicht, die Lectine zu targetieren, zum Beispiel Asialoglycoprotin-Rezeptoren; oder es kann auch Antikörperfragment Fab sein, das es ermöglicht, den Rezeptor des Fragments Fc der Immunglobuline zu targetieren.
Gleichermaßen ist es möglich, die Verbindung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit einem Markermittel vom Typ Biotin, Rhodamin, Folat, beispielsweise an der Seitenkette der Aminosäure R₆, ins Auge zu fassen. Diese Markermittel kann auch eine lineare oder cyclische Peptid- oder Pseudopeptid-Sequenz sein, die das Erkennungsepitop Arg-Gly-Asp der primären und/oder sekundären Rezeptoren der Adhäsionsproteine vom Typ Integrine trägt.
Eine besondere Familie der Verbindungen gemäß der Erfindung ist die, für die R₁ eine Gruppe der Formel (II) umfaßt und R₂ und R₃ Wasserstoffatome sind.
Eine zweite besondere Familie der Verbindungen gemäß der Erfindung ist die, für die R₁ und R₂ jeweils eine Gruppe der Formel (II) umfassen und R₃ ein Wasserstoffatom ist.
Eine andere besondere Familie der Verbindungen gemäß der Erfindung ist die, für die R₁ und R₃ jeweils eine Gruppe der Formel (II) umfassen, und R₂ ein Wasserstoffatom ist.
Eine andere besondere Familie an Verbindungen gemäß der Erfindung ist die, in der R₁, R₂ und R₃ jeweils eine Gruppe der Formel (II) umfassen.
Die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß der Erfindung können sich in Form von Salzen, vorzugsweise nichttoxischen und pharmazeutisch annehmbaren Salzen, präsentieren. Diese nicht-toxischen Salze umfassen die Salze, die mit Mineralsäuren (Salzsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure) gebildet werden, die, die mit organischen Säuren (Essigsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Fumarsäure, Methansulfonsäure oder Oxalsäure) gebildet werden, oder auch die, die mit mineralischen Basen (Soda, Pottasche, Lithine, Kalk) oder organischen Basen (tertiäre Amine wie Triethylamin, Piperidin, Benzylamin) gebildet werden.
Als typische Beispiele kann man insbesondere die Verbindungen gemäß der Erfindung nennen, die durch die folgenden allgemeinen Unterformeln definiert werden:
worin R₄ und R₅ die vorstehend gegebenen Bedeutungen besitzen.
Als Beispiele für die Mittel zum Transfer von Nukleinsäuren gemäß der Erfindung kann man die Verbindungen der folgenden Formeln nennen:
Verbindung 1
Verbindung 2
Verbindung 3
Verbindung 4
Verbindung 5
Verbindung 6
Die Verbindungen der Erfindung können auf verschiedene Arten hergestellt werden, insbesondere durch Synthese und/oder durch Synthese in fester Phase auf einem polymeren Trägerstoff hergestellt werden. Nach einem ersten Syntheseweg können die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) erhalten werden durch Einwirkung eines Thio- oder Oxo-Derivats von Harnstoff, dessen Amine gegebenenfalls geschützt sind, auf ein Lipopolyamin der Formel (VIII):
worin R₁', R₂', R₃' unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe (CH₂)_q-NR₉R₁₀, worin q zwischen 1 und einschließlich 6 variieren kann, wobei die verschiedenen q unabhängig voneinander sind, darstellen,
R₉ und R₁₀ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel (CH₂)_r-NH₂, worin r unabhängig voneinander zwischen 1 und einschließlich 6 variieren können, darstellen,
und m, n, p und R₄ wie vorstehend definiert sind.
Die Einwirkung des Harnstoff-Derivats erfolgt im allgemeinen in Gegenwart einer Base, in einem zweckdienlichen protischen oder aprotischen Lösungsmittel und bei einer Temperatur zwischen 0°C und 100°C.
Die verwendete Base ist im allgemeinen eine nicht-nukleophile Base wie zum Beispiel tertiäre Amine, Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat. Vorteilhafterweise verwendet man tertiäre Amine, zum Beispiel Triethylamin (TEA) oder N-Ethyldiisopropylamin (DIEA).
Die Reaktion erfolgt vorteilhafterweise in Lösungsmitteln wie Wasser, Alkoholen (Methanol, Ethanol, Isopropanol...), Dimethylformamid, Dichlormethan, Chloroform, Toluol, Tetrachlorkohlenstoff, Benzol, Acetonitril, N-Methylpyrrolidon usw. Die Reaktionstemperatur liegt vorteilhafterweise zwischen 20°C und 60°C und noch bevorzugter zwischen 30°C und 50°C.
Besonders interessante Harnstoff-Derivate sind zum Beispiel O-Methylisoharnstoff (J. Med. Chem. 38(1995) 16, 3053–3061), das Semisulfat von S-Methylisothioharnstoff (Int. J. Pept. Prot. Res., 40(1992), 119–126), Bis-Boc-Thioharnstoff (Tet. Lett. 48(1993), 7677–7680), N,N'-Bis(benzyloxycarbonyl)-Smethylthioharnstoff oder N,N'-Bis(tert-butoxycarbonyl)-Smethylthioharnstoff (Synth. Commun. 26(1996), 2, 407–413).
Die Lipopolyamine der allgemeinen Formel (VIII) werden nach den Verfahren, die in der Patentanmeldung WO 97/18185, die durch Referenz in die vorliegende Beschreibung aufgenommen wird, beschrieben sind, oder durch jedes analoge Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, erhalten.
Gemäß der Erfindung können die Transfermittel der allgemeinen Formel (I) auch durch Peptidkopplung zwischen der Säure der allgemeinen Formel (IX):
und dem Lipidmolekül R₄H erhalten werden, wobei R₁, R₂, R₃, m, n, p und R₄ wie vorstehend definiert sind.
Die Peptidkopplung erfolgt nach klassischen Verfahren (Bodanski M., Principles and Practics of Peptides Synthesis, Hrsg. Springer-Verlag) oder jedes analoge Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist.
Die Reaktion erfolgt insbesondere im allgemeinen in Gegenwart einer nicht-nukleophilen Base in geeigneten aprotischen Lösungsmitteln bei einer Temperatur zwischen 0 und 100°C, wobei der pH zwischen 9 und 11 eingestellt ist.
Als Lösungsmittel können zum Beispiel Chloroform, Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon, Acetonitril, Dichlormethan, Toluol oder Benzol verwendet werden.
Die verwendeten nicht-nukleophilen Basen sind vorzugsweise tertiäre Amine, Calciumcarbonat oder auch Natriumbicarbonat. Nach bevorzugter sind die verwendeten Basen tertiäre Amine, zum Beispiel Triethylamin (TEA) oder N-Ethyldiisopropylamin (DIEA).
Vorteilhafterweise wird die Reaktion bei einer Reaktion zwischen 0°C und 50°C und bevorzugter zwischen 10°C und 30°C durchgeführt.
Das Lipidmolekül der Formel R₄H, für das R₄ wie vorstehend definiert ist, kann durch Peptidkupplung zwischen der handelsüblichen Verbindung der allgemeinen Formel (X):
und dem Amin der Formel NHR₇R₈ erhalten werden, wobei X, Y, s, t, R₆, R₇ und R₇ wie vorstehend definiert sind.
Die Peptidkupplung erfolgt nach klassischen Verfahren (Bodanski M., Principles and Practices of Peptides Synthesis, Hrsg. Springer-Verlag) oder durch jedes analoge Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist.
Die Reaktion wird im allgemeinen in Gegenwart einer nicht-nukleophilen Base in geeigneten aprotischen Lösungsmitteln bei einer Temperatur zwischen 0 und 100°C durchgeführt, wobei der pH zwischen 9 und 11 eingestellt wird, wie es bereits vorstehend beschrieben wurde.
Die Säure der allgemeinen Formel (IX) kann nach einem Festphasen-Syntheseweg in drei Stufen wie folgt erhalten werden:

– ein Polyamin der allgemeinen Formel (XI):
für die R'₁, R'₂, R'₃, m und n wie vorstehend definiert sind, wird aud einen Polymerträger
aufgepfropft, daß eine gepfropfte Verbindung der allgemeinen Formel (XII) erhalten wird:

Die Reaktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 0°C und 100°C in Gegenwart eines geeigneten aprotischen Lösungsmittels, zum Beispiel Chloroform, Dichlormethan, Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon, Acetonitril, Toluol, Benzol usw., durchgeführt. Vorteilhafterweise ist die Reaktionstemperatur die Umgebungstemperatur.
Verschiedene polymere Träger sind zweckdienlich. Vorteilhafterweise wählt man im Handel verfügbare Harze zur Festphasen-Peptidsynthese (Marrifield-Synthese). Man kann insbesondere das O-Chlortritylchlorid-Harz oder das HMP-Harz wählen, die Produkte liefern, welche freie Säurefunktionen tragen, oder man kann ein Harz des Rink-Typs wählen. Die mehrfach aminierten Säuren können direkt an einem vorsynthetisierten Peptid, das an der festen Phase vorsynthetisiert wurde und eine Bromalkyl-Funktion oder eine Säure-w-Aldehyd-Funktion trägt, synthetisiert werden.
Die Alkylierungsmittel, die zum Erhalt des geeigneten Harzes verwendet werden, werden als Funktion des Alkylierungsverfahrens ausgewählt. Für eine klassische Alkylierung wählt man zum Beispiel Bromessigsäure oder w-Halogencarbonsäuren. Für eine reduktive Alkylierung wählt man zum Beispiel eine w-Aldehyd-Carbonsäure, wie zum Beispiel Glyoxalsäure oder Bernsteinsemialdehyd usw. oder eine Ketosäure wie zum Beispiel Acetoessigsäure oder Brenztraubensäure usw.
Die Ausgangspolyamine der allgemeinen Formel (XI) sind im Handel verfügbar, zum Beispiel Spermidin, Spermin, Tris-(2-aminoethyl)amin, Phenylendiamin, Diaminoethan (-Propan, -butan, -pentan, -hexan, usw.); diese können entweder durch klassische Methoden, zum Beispiel durch Cyanoethylierung von Aminen, die im Handel verfügbar sind, zum Beispiel Diaminoethan (-Propan, -butan, -pentan, -hexan usw.), Spermidin, Spermin, um verzweigte Polyamine zu erhalten, synthetisiert werden.
In einer zweiten Stufe läßt man die gepfropfte Verbindung der allgemeinen Formel (XII) mit einem Thio- oder Oxo-Derivat von Harnstoff, dessen Amine gegebenenfalls geschützt sind, reagieren, um eine gepfropfte Polyaminoamidin-Verbindung der allgemeinen Formel (XIII) zu erhalten:
worin R₁, R₂, R₃, m, n und p wie vorstehend definiert sind.
Die Reaktion erfolgt nach Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind (Bergeron, R. J. und McManis, Total synthesis of 15-Deoxyspergualin, J. Org. Chem., 1987, 52, 1700–1703) oder nach analogen Verfahren.
Die Reaktion wird insbesondere bei einer Temperatur zwischen –20°C und 100°C und in Gegenwart eines erotischen oder aprotischen Lösungsmittels durchgeführt.
Man verwendet beispielsweise als Lösungsmittel Wasser, Alkohole (Methanol, Ethanol, Isopropanol, usw.), Dichlormethan, Dichlormethan, Chloroform, aromatische Lösungsmittel (Toluol, Benzol usw.), Tetrachlorkohlenstoff, Acetonitril, N-Methylpyrrolidon, usw.
Äußerst interessante Harnstoff-Derivate sind zum Beispiel O-Methylisoharnstoff (J. Med. Chem. 38(1995) 16, 3053–3061), das Semisulfat von S-Methylisothioharnstoff (Int. J. Pept. Prot. Res. (40(1992), 119–126), Bis-Boc-Thioharnstoff (Tet. Lett. 48(1993), 7677–7680), N,N'-Bis(benzyloxycarbonyl)-S-methylisothioharnstoff oder N,N'-Bis(tert-butoxycarbonyl)-S-methylisothioharnstoff (Synth. Commun. 26(1996), 2 407–413).
Schließlich werden die gepfropften Polyaminoamidine der allgemeinen Formel (XIII) in einer letzten Stufe vom polymeren Träger abgespalten, wodurch die Säure der allgemeinen Formel (IX), wie sie vorstehend definiert ist, erhalten wird. Die Spaltung erfolgt nach klassischen, dem Fachmann bekannten Verfahren. Man arbeitet insbesondere durch Einwirkung einer schwachen Säure, die den Rest des Moleküls nicht abbaut. Bevorzugte schwache Säuren sind zum Beispiel fluorierte Alkohol und insbesondere 1,1,1-Trifluorethan-2-ol.
Für das Polyaminoamidin der allgemeinen Formel (XIII), das Säure-, Amino-, Alkylamino- und/oder Amidin-Funktionen enthält, ist es gegebenenfalls vorteilhaft, diese vor Abspaltung vom polymeren Träger zu schützen. Der Schutz kann durch jede kompatible Gruppe erfolgen, deren Verwendung und Entfernung den Rest des Moleküls nicht verändert. Man arbeitet insbesondere nach Verfahren, die in T. W. GREENE, Protective Groups in Organic Synthesis, A. Wiley-Interscience Publication (1981) oder in McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press (1973) beschrieben sind.
Eine eventuelle Eliminierung der Schutzgruppen wird vor der Peptidkopplung zwischen der Säure der allgemeinen Formel (IX), die nach Abspaltung vom polymeren Träger erhalten wurde, und der Verbindung der Formel R₄H gemäß üblicher Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt.
Beispielsweise können die Schutzgruppen unter den Trimethylsilyl-, Benzydryl-, Tetrahydropyranyl-, Formyl-, Acetyl-, Chloracetyl-, Trichloracetyl-, Trifluoracetyl-, Ethoxycarbonyl-, tert-Butoxycarbonyl-, Trichlorethoxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-, Fluorenyloxycarbonyl-Gruppen usw. ausgewählt sein.
Jedes andere Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, und insbesondere die, die in Bodenski M., Principles and Practices of Peptides Synthesis, Hrsg. Springer-Verlag, beschrieben sind, und zu Mitteln zum Transfer von Nukleinsäuren gemäß der Erfindung führen, fallen ebenfalls unter den Rahmen der Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die ein Mittel, wie es vorstehend definiert ist, und eine Nukleinsäure umfaßt. Vorzugsweise liegen die Verbindung und die Nukleinsäure in solchen Mengen vor, daß das Verhältnis der positiven Ladungen der Verbindung zu den negativen Ladungen der Nukleinsäure zwischen 0,1 und 50 und vorzugsweise zwischen 0,1 und 20 liegt. Dieses Verhältnis kann vom Fachmann in Abhängigkeit von der verwendeten Verbindung, der Nukleinsäure und den angestrebten Verwendungen (insbesondere vom Zelltyp, der zu transfizieren ist) einfach eingestellt werden.
Im Sinne der Erfindung versteht man unter "Nukleinsäure" sowohl eine Desoxyribonukleinsäure als auch eine Ribonukleinsäure. Es kann sich um natürliche oder künstliche Sequenzen und insbesondere um genomische DNA (gDNA), komplementäre DNA (cDNA), Messenger-RNA (mRNA), Transfer-RNA (t-RNA), Ribosomen-RNA (rRNA), Hybridsequenzen oder synthetische oder halbsynthetische Sequenzen, modifizierte oder nicht-modifizierte Oligonukleotide handeln. Diese Nukleinsäuren können humanen, tierischen, pflanzlichen, bakteriellen, viralen Ursprungs usw. sein. Sie können durch jede Technik, die dem Fachmann bekannt ist, und insbesondere durch Durchmusterung von Banken, durch chemische Synthese oder auch durch Mischverfahren, die chemische oder enzymatische Modifikation von Sequenzen einschließen, die durch Durchmusterung von Banken erhalten wurden, erhalten werden. Sie können chemisch modifiziert sein.
Was insbesondere die Desoxyribonukleinsäuren angeht, so können sie selbst einzelsträngig oder doppelsträngig sein sowie kurze Oligonukleotide oder längere Sequenzen sein. Die Nukleinsäuren bestehen vorteilhafterweise aus Plasmiden, Vektoren, Episomen, Expressionskassetten usw. Diese Desoxyribonukleinsäuren können einen funktionellen Replikationsursprung in der Zielzelle oder auch nicht tragen sowie ein oder mehrere Markergene, regulatorische Sequenzen für die Transkription oder Replikation, Gene von therapeutischem Interesse, modifizierte oder nicht-modifizierte Antisense-Sequenzen, Bindungsregionen für andere Zellbestandteile usw. tragen.
Die Nukleinsäure umfaßt vorzugsweise eine Expressionskassette, die aus einem Gen von therapeutischem Interesse oder mehreren Genen von therapeutischem Interesse unter der Kontrolle eines Promotors oder mehrerer Promotoren und einem aktiven Transkriptionsterminator besteht, in den Zielzellen.
Im Sinne der Erfindung versteht man unter einem Gen von therapeutischem Interesse insbesondere jedes Gen, das für Proteinprodukt codiert, welche eine therapeutische Wirkung hat. Das so codierte proteinogene Produkt bzw. Proteinprodukt kann insbesondere ein Protein oder Peptid sein. Das proteinogene Produkt kann exogen homolog oder bezüglich der Zielzelle endogen sein, das heißt ein Produkt sein, das normalerweise in der Zielzelle exprimiert wird, wenn sie keine Pathologie aufweist. In diesem Fall kann die Expression eines Proteins zum Beispiel eine unzureichende Expression in der Zelle oder die Expression eine inaktiven oder schwach aktiven Proteins als Folge einer Modifikation abschwächen oder auch das Protein überexprimieren. Das Gen von therapeutischem Interesse kann auch für eine Mutante eines Zellproteins mit erhöhter Stabilität, modifizierter Aktivität usw. codieren.
Das proteinogene Produkt kann auch für die Zielzelle heterolog sein. In diesem Fall kann ein exprimiertes Protein zum Beispiel eine fehlende Aktivität in der Zelle ergänzen oder beibringen, die dieser erlaubt, gegen eine Pathologie anzukämpfen oder eine Immunantwort zu stimulieren.
Unter den therapeutischen Produkten im Sinne der vorliegenden Erfindung kann man insbesondere die Enzyme, Blutderivate, Hormone, Lymphokine: Interleukine, Interferone, THF usw. (FR 92/03120), Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter oder ihre Vorläufer oder Syntheseenzyme, trophische Faktoren (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/Pleiotrophin usw.), Apolipoproteine (ApoAI, ApoAIV, ApoE usw. FR 93/05125), Dystrophin oder Minidystrophin (FR 91/11947), das Protein CFTR, das mit Mucoviscidose in Verbindung steht, die Suppressorgene von Tumoren (p52, Rb Rap1A, DCC, k-rev, usw. FR 93/04745), die Gene, die für Faktoren codieren, welche bei der Gerinnung involviert sind (Faktoren VII, VIII, IX), Gene, die bei der Reparatur der DNA eingreifen, Suicid-Gene (Thymidinkinase, Cytosindesaminase), Gene für Hämoglobin oder andere Proteintransportmittel, die Enzyme des Metabolismus, Katabolismus usw. nennen.
Die Nukleinsäure von therapeutischem Interesse kann auch ein Gen oder eine Antisense-Sequenz sein, deren Expression in der Zielzelle die Möglichkeit bietet, die Expression der Gene oder die Transkription der zellulären mRNA zu kontrollieren. Solche Sequenzen können zum Beispiel Transkripte in der Zielzelle als RNA sein, welche zu zellulärer mRNA komplementär sind und somit ihre Translation im Protein blockieren; die entsprechende Technik ist in dem Patent EP 140 308 beschrieben. Die therapeutischen Gene umfassen auch Sequenzen, die für Ribozyme codieren, welche fähig sind, selektiv Ziel-RNA zu zerstören ( EP 321 201 ).
Die Nukleinsäure kann auch ein oder mehrere Gene umfassen, die für ein antigenes Peptid codieren, das fähig ist, beim Menschen oder Tier eine Immunantwort hervorzurufen. Bei dieser besonderen Durchführungsform ermöglicht die Erfindung die Verwirklichung von entweder Impfstoffen oder immuntherapeutischen Behandlungen, die beim Menschen oder Tier angewendet werden, und zwar insbesondere gegen Mikroorganismen, Viren oder Krebs. Es kann sich insbesondere um spezifische antigene Peptide des Epstein-Barr-Virus, des HIV-Virus, des Hepatitis B-Virus ( EP 185 573 ), des Virus der Pseudowut, des "Syncitien-bildenden Virus", anderer Viren oder auch um spezifische antigene Tumorpeptide ( EP 259 212 ) handeln.
Vorzugsweise umfaßt die Nukleinsäure auch Sequenzen, die die Expression des Gens von therapeutischem Interesse und/oder des Gens, das für das antigene Peptid codiert, in der Zelle oder dem gewünschten Organ ermöglichen. Es kann sich um Sequenzen handeln, die natürlicherweise für die Expression des betrachteten Gens verantwortlich sind, wenn die Sequenzen in der infizierten Zelle funktionieren können. Es kann sich auch um Sequenzen anderen Ursprungs handeln (die für die Expression anderer Proteine auch synthetischer Proteine verantwortlich sind). Es kann sich insbesondere um Promotorsequenzen von eukaryotischen oder viralen Genen handeln. Es kann sich beispielsweise um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom der Zelle stammen, die man infizieren möchte. Es können insbesondere Promotorsequenzen sein, die aus dem Genom eines Virus stammen. Diesbezüglich können zum Beispiel die Promotoren der Gene E1A, MLP, CMV, RSV usw. genannt werden. Außerdem können diese Expressionssequenzen durch Hinzufügen von Aktivierungssequenzen, Regulierungssequenzen usw. modifiziert werden. Es kann sich auch um einen Promotor handeln, der induzierbar oder unterdrückbar ist.
Im übrigen kann die Nukleinsäure auch insbesondere stromaufwärts zum Gen von therapeutischem Interesse, eine Signalsequenz umfassen, die das synthetisierte therapeutische Produkt in den Sekretionswegen der Zielzelle steuert. Diese Signalsequenz kann die natürliche Signalsequenz des therapeutischen Produkte sein, es kann sich aber auch um jede andere funktionelle Signalsequenz oder um eine künstliche Signalsequenz handeln. Die Nukleinsäure kann auch eine Signalsequenz umfassen, die das synthetisierte therapeutische Produkt zu einem besonderen Zellkompartiment lenkt.
Nach einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch Zusammensetzungen, die eine Nukleinsäure, ein Transfektionsmittel (I), wie es vorstehend definiert wurde, und ein Adjuvans oder mehrere Adjuvanzien, die fähig sind, sich zu einem Komplex aus Transfektionsmittel/Nukleinsäure zu assoziieren und dann die Transfektionskraft zu erhöhen, umfassen. Das Vorliegen dieses Typs an Adjuvanzien bzw. Zusatzstoffen (Lipide, Peptide oder Proteine beispielsweise) kann es ermöglichen, daß die Transfektionskraft der Verbindungen erhöht wird.
Diesbezüglich können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen als Zusatzstoff bzw. Adjuvans ein neutrales Lipid oder mehrere neutrale Lipide umfassen. Diese Zusammensetzungen sind besonders vorteilhaft, wenn das Verhältnis des Ladung R der Nukleolipidkomplexe schwach ist. Die Anmelderin hat in der Tat gezeigt, daß der Zusatz eines neutralen Lipids eine Verbesserung der Bildung von Nukleolipidpartikel möglich macht und die Penetration des Partikels in die Zelle unter Destabilisierung seiner Membran begünstigt.
Nach bevorzugter sind die neutralen Lipide, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, Lipide mit zwei Fettketten. In besonders vorteilhafter Weise verwendet man natürliche oder synthetische, zwitterionische oder unter physiologischen Bedingungen von ionischer Ladung freie Lipide. Sie können insbesondere unter Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE), Oleylpalmitoylphosphatidylethanolamin (POPE), den Distearoyl-, -palmitoyl-, -myristoylphosphatidylethanolaminen sowie ihren 1- bis 3-mal N-methylierten Derivaten, den Phosphatidylglycerinen, den Diacylglycerinen, den Glycosyldiacylglycerinen, den Cerebrosiden (wie insbesondere den Galactocerebrosiden), den Sphingolipiden (wie insbesondere den Sphingomyelinen) oder auch den Asialogangliosiden (wie insbesondere AsialoGMl und GM2) ausgewählt werden.
Diese verschiedene Lipide können zum Beispiel durch Synthese oder durch Extraktion ausgehend von Organen (zum Beispiel Gehirn) oder Eiern durch klassische Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, erhalten werden. Die Extraktion der natürlichen Lipide kann zum Beispiel mittels organischer Lösungsmittel durchgeführt werden (siehe auch Lehninger, Biochemistry).
In jüngerer Zeit hat die Anmelderin gezeigt, daß es auch besonders vorteilhaft ist, als Adjuvans eine Verbindung zu verwenden, die direkt oder nicht direkt auf dem Niveau der Kondensation der Nukleinsäure eingreift (WO 96/25508). Das Vorliegen einer solchen Verbindung in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung erlaubt es, die Menge der transfizierenden Verbindung zu verringern, und zwar mit vorteilhaften Folgen, die sich auf toxikologischer Ebene abspielen, ohne daß Nachteile bezüglich der Transfektionsaktivität bestehen. Unter Zusammensetzung, die auf dem Niveau der Kondensation der Nukleinsäure eingreift, versteht man per Definition eine Verbindung, die die Nukleinsäure direkt oder nicht verdichtet. Genauer ausgedrückt, diese Verbindung kann direkt auf der Ebene der zu transfizierenden Nukleinsäure wirken oder auf dem Niveau einer verwandten Verbindung, die direkt bei der Kondensation dieser Nukleinsäure beteiligt ist, eingreifen. Vorzugsweise wirkt sie direkt auf der Ebene der Nukleinsäure. Beispielsweise kann das Vorkompaktierungsmittel jedes Polykation sein und zum Beispiel Polylysin sein. Nach einer bevorzugten Durchführungsform ist dieses Mittel, das im Bereich bzw. auf dem Niveau der Kondensation der Nukleinsäuren eingreift, ganz oder teilweise von einem Protamin, einem Histon oder Nukleoin und/oder einem ihrer Derivate abgeleitet. Ein derartiges Mittel kann auch ganz oder teilweise auf peptidischen Struktureinheiten (KTPKKAKKP) und/oder (ATPAKKAA) bestehen, wobei die Anzahl der Struktureinheiten zwischen 2 und 10 variieren kann. In der Struktur der erfindungsgemäßen Verbindung können diese Struktureinheiten sich in kontinuierlicher Weise oder auch in nicht-kontinuierlicher Weise wiederholen. So können durch Linker biochemischer Natur, zum Beispiel durch eine Aminosäure oder mehrere Aminosäuren, oder durch ihre chemische Natur getrennt sein.
Vorzugsweise umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung 0,01 bis 20 Äquivalente Adjuvans bzw. Hilfsstoff pro 1 Äquivalent Nukleinsäuren, ausgedrückt als mol/mol, und bevorzugter 0,5 bis 5.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen außerdem ein Zielelement, das eine Orientierung des Transfers der Nukleinsäure ermöglicht. Dieses Zielelement kann ein extrazelluläres Zielelement sein, das es ermöglicht, daß der Transfer der DNA gegen bestimmte Zelltypen oder bestimmte gewünschte Gewebe (Tumorzellen, hepatische Zellen, hämatopoetische Zellen...) gerichtet wird. Es kann sich um ein intrazelluläres Zielelement handeln, das es ermöglicht, den Transfer der Nukleinsäure auf bestimmte privilegierte Zellkompartimente (Mitochondrien, Kern, usw.) zu richten. Das Zielelement kann an ein Mittel zum Transfer von Nukleinsäuren gemäß der Erfindung oder auch an eine Nukleinsäure, wie es vorstehend beschrieben wurde, gebunden sein.
Unter den im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren Zielelemente kann man die Zucker, die Peptide, die Proteine, die Oligonukleotide, die Lipide, die Neuromediatoren, Hormone, Vitamine und deren Derivate nennen. Vorzugsweise handelt es sich um Zucker, Peptide oder Proteine wie zum Beispiel Antikörper oder Antikörperfragmente, zelluläre Rezeptorliganden oder Fragmente davon, Rezeptoren oder Rezeptorfragmente usw. Es handelt sich insbesondere um Rezeptorliganden von Wachstumsfaktoren, um Liganden der Rezeptoren von Cytokinen, der Rezeptoren von Zellectinen oder der Liganden mit RGD-Sequenz mit Affinität für die Rezeptoren der Adhäsionsproteine wie Integrine. Man kann auch die Rezeptoren des Transferins, von HDL und LDL oder den Trasporteur des Folats nennen. Das Zielelement kann auch Zucker sein, der das Targetin der Lectine wie zum Beispiel der Rezeptoren für Asialoglycoproteine oder Sialyde wie zum Beispiel das Sialyd Lewis X oder auch ein Antikörperfragment Fab oder eine einfache Antikörperkette (ScFv) ermöglicht.
Die Assoziierung der Zielelemente an Nukleotidkomplexe kann durch jede dem Fachmann bekannte Technik durchgeführt werden, beispielsweise durch Kopplung an einen hydrophoben Teil oder an einen Teil, der mit der Nukleinsäure des Transfermittels gemäß der Erfindung wechselwirkt, oder auch an eine Gruppierung, die mit dem Transfermittel gemäß der vorliegenden Erfindung oder mit der Nukleinsäure wechselwirkt. Die fraglichen Wechselwirkungen können nach einer bevorzugten Ausführungsform ionischer oder kovalenter Natur sein.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der Verbindungen, wie sie vorstehend definiert wurden, für den Transfer von Nukleinsäuren (und allgemeiner von Polyanionen) in die Zellen.
Für in vivo-Verwendungen, zum Beispiel zur Untersuchung der Genregulation, zur Schaffung von Tierpathologiemodellen oder als Therapie können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen im Hinblick auf Verabreichungen auf topischem, kutanem, oralem, rektalem, vaginalem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraokulärem, transdermalem, intratrachealem, intraperitonealem Weg usw. formuliert werden. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten vorzugsweise einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff für eine injizierbare Formulierung, insbesondere für eine direkte Injektion auf der Ebene des gewünschten Organs oder für eine Verabreichung auf topischem Weg (auf die Haut und/oder Schleimhaut). Es kann sich insbesondere um sterile, isotonische Lösungen oder um trockene, insbesondere lyophilisierte Zusammensetzungen handeln, die gegebenenfalls durch Zusatz von sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum die Bildung von injizierbaren Lösungen erlauben. Die Nukleinsäuredosen, die zur Injektion verwendet werden, sowie die Anzahl der Verabreichungen können in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern und insbesondere als Funktion des verwendeten Verabreichungsmodus, der betreffenden Pathologie, dem zu exprimierenden Gen oder auch der gewünschten Dauer der Behandlung angepaßt werden. Was insbesondere den Verabreichungsmodus angeht, so kann es sich um eine direkte Injektion in die Gewebe, zum Beispiel im Bereich der Tumoren oder die Blutkreislaufwege oder um eine Behandlung von Zellen in Kultur, gefolgt von ihrer Reimplantation in vivo durch Injektion oder Transplantation handeln. Die betreffenden Gewebe oder Zirkulationswege sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum Beispiel die Muskeln, die Haut, das Gehirn, die Lungen, die Leber, die Milz, das Knochenmark, die Thymusdrüse, das Herz, die Lymphe, das Blut, die Knochen, die Knorpel, die Bauchspeicheldrüse, die Nieren, die Harnblase, der Magen, der Darm, die Hoden, die Eierstöcke, das Rektum, das Nervensystem, die Augen, die Drüsen, die Bindegewebe usw.
Die Erfindung betrifft außerdem eine Methode zum Transfer von Nukleinsäuren in Zellen, die die folgenden Stufen umfaßt:

(1) das Inkontaktbringen der Nukleinsäure mit einem Transfermittel, wie es vorstehend definiert wurde, um einen Komplex zu bilden und
(2) das Inkontaktbringen der Zellen mit den in (1) gebildeten Komplex.

Das Inkontaktbringen der Zellen mit dem Komplex kann durch Inkubation der Zellen mit dem Komplex (für in vitro- oder ex vivo-Verwendungen) oder durch Injektion des Komplexes in einen Organismus (für in vivo-Verwendungen) erfolgen. Die Inkubation erfolgt vorzugsweise in Gegenwart von zum Beispiel 0,01 bis 1000 μg Nukleinsäure pro 10⁶ Zellen. Für eine in vivo-Verabreichung können zum Beispiel Dosen an Nukleinsäure zwischen 0,01 und 10 mg verwendet werden.
Wenn die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen außerdem einen Zusatzstoff oder mehrere Zusatzstoffe und/oder ein Ziel-Element, wie sie vorstehend definiert sind, enthalten, so werden der Zusatzstoff bzw. das Adjuvans oder die Zusatzstoffe und/oder das Zielelement zuvor mit dem Transfermittel gemäß der Erfindung oder der Nukleinsäure vermischt.
Somit liefert die vorliegende Erfindung ein besonders vorteilhaftes Verfahren bzw. eine besonders vorteilhafte Methode für den Transfer von Nukleinsäure, insbesondere für die Behandlung von Krankheiten, das/die die in vitro-, in vivo- oder ex vivo-Verabreichung einer Nukleinsäure, die geeignet ist, die Krankheit zu korrigieren, in Kombination mit einem Transfermittel der allgemeinen Formel (I) unter den vorstehend definierten Bedingungen umfaßt. Dieses Verfahren ist insbesondere auf Krankheiten anwendbar, die aus einem Mangel an einem proteinogenen oder nukleinogenen Position resultieren, wobei die verabreichte Nukleinsäure für das proteinogene Produkt codiert oder in ein Nukleinsäureprodukt transkribiert wird oder auch das Nukleinsäureprodukt bildet.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf jede Verwendung eines Transfermittels der allgemeinen Formel (I) gemäß der Erfindung für die in vivo-, ex vivo- oder in vitro-Transfektion von Zellen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind insbesondere für den Transfer von Nukleinsäuren in primäre Zellen oder in entwickelte Zellinien verwendbar. Es handelt sich dabei um Fibroblastenzellen, Muskelzellen, Nervenzellen (Neuronen, Astrozyten, Gliazellen), Leberzellen, Zellen der hämatopoetischen Linie (Lymphozyten, CD34, Dendriten usw.), Epithelzellen usw. in differenzierter oder pluripotenter (Vorläufer-) Form.
Neben den voranstehenden Anordnung umfaßt die Erfindung auch andere Merkmale und Vorzüge, die aus den folgenden Beispielen und Figuren klar werden, wobei diese als für die Erfindung erläuternd und nicht beschränkend anzusehen sind.
Figuren
1/15: Syntheseschema der Verbindung 1 gemäß der Erfindung.
2/15: Messung der in vitro-Transfektionswirksamkeit der Verbindung 1 gemäß der Erfindung in den Zellen NIH3T3, HepT2 und HeLa in Abwesenheit von Serumproteinen und im Vergleich mit ihrem aminierten Homologen (RPR120535).
Unter "aminiertes Homologes" versteht man das kationische Lipid, das mit Ausnahme der Amidin- und/oder Guanidin-Funktion, die durch Aminofunktionen ersetzt sind, identisch ist. Die Messungen wurden bei verschiedenen Ladungsverhältnissen durchgeführt, die als Abszisse aufgetragen sind. Die Expression der Luziferase ist auf der Ordinate aufgetragen und ist als RLE (relative Lichteinheit) pro Vertiefung ausgedrückt.
3/15: Messung der in vitro-Transfektionswirksamkeit der Verbindung 1 gemäß der Erfindung in den Zellen NIH3T3, HepG2 und HeLa in Abwesenheit (weiße Balken) und insbesondere Gegenwart (schwarze Balken) von Serumproteinen und im Vergleich zu ihren aminierten Homologen (RPR120535).
Die Messungen wurden bei verschiedenen Ladungsverhältnissen, die auf der Abszisse aufgetragen sind, durchgeführt. Die Expression der Luciferase ist auf der Ordinate aufgetragen und ist als RLE (relative Lichteinheit) pro Vertiefung ausgedrückt.
4/15: Messung der in vitro-Transfektionswirksamkeit der Verbindung 2 gemäß der Erfindung in HeLa-Zellen in Abwesenheit von Serumproteinen. Die Messungen wurden für die Verbindung 2 in micellarer Form in Verbindung mit einem neutralen Co-Lipid (DOPE und Cholesterin) durchgeführt.
Die X-Achse stellt das Ladungsverhältnis des Komplexes, der zwischen dem kationischen Lipid und DNA gebildet wird, dar. Die Ordinate stellt die Expression der Luciferase, ausgedrückt in pg/Vertiefung, die jeweils 100 000 Zellen enthalten, dar.
5/15: Messung der in vitro-Transfektionswirksamkeit der Verbindung 3 gemäß der Erfindung in HeLa-Zellen in Abwesenheit von Serumproteinen. Die Messungen wurden für die Verbindung 3 in micellarer Form und in Verbindung mit einem neutralen Co-Lipid (DOPE und Cholesterin) durchgeführt.
Die Abszisse stellt das Ladungsverhältnis des Komplexes, der zwischen dem kationischen Lipid und der DNA gebildet wird, dar. Die Ordinate stellt die Expression der Luziferase, ausgedrückt in pg/Vertiefung, wobei jede 100 000 Zellen enthält, dar.
6/15: Messung der in vitro-Transfektionswirksamkeit der Verbindung 5 gemäß der Erfindung in HeLa-Zellen in Abwesenheit von Serumproteinen. Die Messungen wurden für die Verbindung 5 in micellarer Form und in Verbindung einem neutralen Co-Lipid (DOPE und Cholesterin) durchgeführt.
Die Abszisse stellt das Ladungsverhältnis des Komplexes, der zwischen dem kationischen Lipid und der DNA gebildet wird, dar. Die Ordinate stellt die Expression der Luciferase, ausgedrückt in pg/Vertiefung, von denen jede 100 000 Zellen enthält, dar.
7/15: Messung der in vitro-Transfektionswirksamkeit der Verbindung 6 gemäß der Erfindung in HeLa-Zellen in Abwesenheit von Serumproteinen. Die Messungen wurden für die Verbindung 6 in micellarer Form und in Verbindung mit einem neutralen Co-Lipid (DOPE und Cholesterin) durchgeführt.
Die Abszisse stellt das Ladungsverhältnis des Komplexes dar, der zwischen dem kationischen Lipid und der DNA gebildet wird. Die Ordinate stellt die Expression der Luciferase, ausgedrückt in pg/Vertiefung von denen jede 100 000 Zellen enthält, dar.
8/15: Tabellen, die die physikochemische Phase (Phase A, B oder C) angeben, in der sich die Nukleolipidkomplexe, die mit der Verbindung 2, vergleichsweise mit ihrem aminierten Analogon, gebildet wurden, als Funktion des Ladungsverhältnisses befinden.
Die Bestimmung der Phasen wurde für die Verbindung 2 und für ihr aminiertes Homologes in micellarer Form und in Verbindung mit einem neutralen Co-Lipid (DOPE und Cholesterin) durchgeführt.
Beim Vergleich der zwei Tabelle beobachtet man eine Verschiebung der instabilen Phase B zu tieferen Ladungsverhältnissen im Fall der Verbindung 2.
9/15: Tabellen, die die physikochemische Phase (Phase A, B oder C) angeben, in der sich die Nukleolipidkomplexe, die sich mit der Verbindung 3 vergleichsweise mit ihrem aminierten Analogon, bilden, als Funktion des Ladungsverhältnisses befinden.
Die Bestimmung der Phasen wurde für die Verbindung 3 und für ihre aminiertes Homologes in micellarer Form und in Verbindung mit einem neutralen Colipid (DOPE und Cholesterin) durchgeführt.
Beim Vergleich der zwei Tabellen beobachtet man eine Verschiebung der instabilen Phase B gegen tiefere Ladungsverhältnisse im Fall der Verbindung 3.
10/15: die Tabellen zeigen die physikalisch chemische Phase (Phase A, B oder C) an, in der sich die Nukleolipidkomplexe, die sich mit der Verbindung 5, vergleichsweise mit ihrem aminierten Analogon bilden, als Funktion des Ladungsverhältnisses befinden.
Die Bestimmung der Phasen wurde für die Verbindung 5 und für ihr aminiertes Homologes in micellarer Form und in Verbindung mit einem neutralen Co-Lipid (DOPE und Cholesterin) durchgeführt.
Beim Vergleich der zwei Tabellen beobachtet man im Fall der Verbindung 5 eine Verschiebung der instabilen Phase B gegen tiefere Ladungsverhältnisse.
11/15: Tabellen, die die physikochemische Phase (Phase A, B oder C) anzeigen, in der sich die Nukleolipidkomplexe, die mit der Verbindung 6, vergleichsweise mit ihrem aminierten Analogon, gebildet haben, als Funktion des Ladungsverhältnisses befinden.
Die Bestimmung der Phasen wurde für die Verbindung 6 und für ihr aminiertes Homologes in micellarer Form und in Verbindung mit einem neutralen Co-Lipid (DOPE und Cholesterin) durchgeführt.
Beim Vergleich der zwei Tabellen beobachtet man im Fall der Verbindung 6 eine Verschiebung der instabilen Phase B gegen tiefere Ladungsverhältnisse.
12/15: Die Tabelle stellt die Fluoreszenzreduktion nach Zusatz von Ethidiumbromid für die Verbindungen 2, 3, 5 und 6 in Form von Micellen dar. Der Ersatz des Ethidiumbromids der DNA durch das Lipid ist ein Hinweis für die Bindung an DNA. Die Fluoreszenz, die für die DNA allein erhalten wird, wird als 100% definiert.
13/15: Die Tabelle stellt die Fluoreszenzverringerung nach Zusatz von Ethidiumbromid für die Verbindungen 2, 3, 5 und 6 in Gegenwart von Cholesterin dar. Der Ersatz des Ethidiumbromids der DNA durch das Lipid ist ein Hinweis für die Bindung an die DNA. Die Fluoreszenz, die für die DNA allein erhalten wird, wird als 100% definiert.
14/15: Die Tabelle stellt die Verringerung der Fluoreszenz nach Zusatz von Ethidiumbromid für die Verbindungen 2, 3, 5 und 6 in Gegenwart von DOPE dar. Der Ersatz des Ethidiumbromids der DNA durch das Lipid ist ein Hinweis für die Bindung an DNA. Die Fluoreszenz, die für die DNA allein erhalten wird, ist als 100% definiert.
15/15: Darstellung des Plasmids pXL3031.
Abkürzungen und Symbole:

AcOEt: Ethylacetat
BOC: tert-Butoxycarbonyl
BOP: Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat
DCC; Dicyclohexylcarbodiimid
DCU: Dicyclohexylharnstoff
DIEA: N-Ethyldiisopropylamin
DMAP: 4-Dimethylaminopyridin
DMF: Dimethylformamid
DMSO: Dimethylsulfoxid
DODA: Dioctadecylamin
EP: Petrolether
EtOH: Ethanol
NEt₃: Triethylamin
Rf: Rf-Wert
TEA: Triethylamin
TFA: Trifluoressigsäure
THF: Tetrahydrofuran
TMS: Tetramethylsilan
UV: Ultraviolettstrahlung
SPPS: Peptidsynthese in fester Phase (Festphasenpeptidsynthese)
CLHP: Hochdruckflüssigkeitschromatographie
Z: Benzyloxycarbonyl
ClZ: p-Chlorbenzyloxycarbonyl

Materialien und Verfahren für die chemischen Synthesen
a) Verbindungen

– Die Ausgangspolyamine sind im Handel verfügbar, zum Beispiel Spermidin, Spermin, Tris(2-aminoethyl)amin, Phenylendiamin, Diaminoethan (-propan, -butan, -pentan, -hexan usw...), oder können durch klassische Verfahren synthetisiert werden, zum Beispiel durch Cyanoethylierung von im Handel verfügbaren Aminen wie zum Beispiel Diaminoethan (-propan, -butan, -pentan, -hexan usw.)-amin, Spermidin, Spermin, um verzweigte Polyamine zu erhalten;
– Die verwendeten Polymere sind Harze, die im Handel für die Peptidsynthese in fester Phase (Merrifield-Synthese) verfügbar sind, insbesondere das Harz von O-Chlortritylchlorid, das HMP-Harz, die Produkte liefern, welche freie Säurefunktionen tragen, oder auch ein Harz vom Rink-Typ. Die polyaminierten Säuren können direkt an einem an der festen Phase vorsynthetisierten Peptid synthetisiert werden und tragen eine Bromalkylfunktion oder einen Säure-w-aldehyd.
– Dioctadecylamin, Triethylamintrifluoressigsäure, BOP, DMAP, Benzylchlorformiat sind handelsübliche Produkte. Die Lösungen von NaCl und NaHCO₃ sind gesättigt; die Lösung von KHSO₄ ist 0,5 M.

b) Physikalische Messungen
Die Protonen-NMR-Spektren wurden auf den Spektrometern Bruker 400 und 600 MHz aufgenommen.
Die Massenspektren (MS) wurden an einem API-MS/III aufgenommen.
c) Techniken der Reinigung und der Analyse
a) Bedingungen für die Chromatographie in direkter Phase

– Die Dünnschichtchromatographie-Analysen (DSC) wurden mit Silicagel-Platten von Merck mit einer Dicke von 0,2 mm durchgeführt. Sie wurden im UV (254 nm) mit Ninhydrin durch Bedampfen (leichtes Besprühen) mit einer ethanolischen Ninhydrinlösung (40 mg/100 ml EtOH) entwickelt, um die Amine oder die Amide unter Erwärmen auf 150°C zu zeigen, mit Flurescamin unter Bedampfen mit einer Lösung (40 mg/100 ml Aceton) um die primären Amine zu zeigen, oder mit Iod, indem die Platte mit Iodpulver bedeckt wurde.
– Säulenchromatographie in direkter Phase wurden an der Merck 60-Silicagel mit einer Granulometrie von 0,063–0,200 mm durchgeführt.

b) Analytische Chromatographietechniken
HPLC-Analysen (Hodruckflüssigkeitschromatographie) wurden an einem Merck-Hitachi-Gerät durchgeführt, das mit einem Computer D 2500 HITACHI, einem Autosampler AS-2000A, einer intelligenten Pumpe L-6200A und einem UV-sichtbare Licht-Detektor L-4000 mit einer regelbaren Wellenlänge, die auf 220 nm eingestellt war, für analytische Trennungen ausgerüstet war, durchgeführt. Die Säulen für die analytischen Trennungen sind die Säulen BU-300 Aquapore Butyl 7 m, 300 A 300 × 4,65 mm von Perkin-Elmer. Die mobilen Phasen sind entmineralisiertes Wasser, das 0,1% TFA enthält, und Acetonitril, das 0,1% TFA enthält. Die Injektion einer Lösung mit etwa 1 mg/ml in eine 100 μl-Schleife ist 20 μl. Der Durchfluß für die Analysen ist auf 1 ml/min reguliert. Trennbedingungen

Lösungsmittel A Lösungsmittel B

Entmineralisiertes Wasser 2500 ml Acetonitril zur HPLC 2500 ml

Trifluoressigsäure 2 ml Trifluoressigsäure 2,5 ml
Gradient
c) Techniken der präparativen Chromatographie
Die Apparatur ist eine Kombination für die Flüssigphasenchromatographie mit Gradient, die eine UV-Detektion ermöglicht. Diese präparative Kette besteht aus folgenden Elementen:
Pumpe A: GILSON, Modell 305, ausgestattet mit einem 50 SC-Kopf.
Pumpe B: GILSON, Modell 303, ausgestattet mit einem 50 SC-Kopf.
Injektionsschleife: GILSON, Modell 303, ausgestattet mit einem 25 SC-Kopf.
Druckmodul: GILSON, Modell 806.
Mischer: GILSON, Modell 811 C, ausgestattet mit einem 23 ml-Kopf.
UV-Detektor: GILSON, Modell 119, ausgestattet mit einer präparativen Zelle.
Fraktionssammler: GILSTON, Modell 202, ausgestattet mit Träger Nr. 21.
Computer: SHIMADZU, Modell C-R6A.
Säule: Säule C4 (10 mm) aus nicht-rostendem Stahl mit einer Länge von 25 cm und einem Durchmesser von 2,2 cm, im Handel vertrieben von VYDAC, Modell 215 TP 1022.
Die zu reinigende Produktlösung wird durch die Injektionspumpe mit einem Durchfluß von 15 ml/min auf die Säule aufgebracht und das Eluat wird in 30 s durch Fraktionierung in einem Röhrchen gesammelt. Der Detektor ist auf Wellenlängen von 220 nm und 235 nm eingestellt.
Die mobilen Phasen werden wie folgt definiert:

Lösungsmittel A Lösungsmittel B

Entmineralisiertes Wasser 2500 ml Acetonitril zur HPLC 2500 ml

Trifluoressigsäure 2 ml Trifluoressigsäure 2,5 ml
Gradient
d) Technik der Festphasen-Peptidsynthese (synthese peptidique en phase solide = SPPS)
Die Festphasensynthese wird in einem manuellen Synthesereaktor für die handwerkliche Herstellung von Peptiden (SPPS) durchgeführt und der Rührer ist ein Flask Shaker, Modell A5-6021. Auf die Entwicklung der Kopplung der Polyamine an die feste Phase sowie die Entwicklung des Schutzes der Polyamine in der SPPS folgt der Kaiser-Test [Kaiser, E., Colescolt, D. L., Bossinger, C. D. und Cook, P. I., Anal. Biochem. 34(2), 595 (1970)]. Das in den Beispielen für die SPPS verwendete Harz ist das "Chlortritylchlorid-Harz" von NOVABIOCHEM.
Beispiele
Beispiel 1: Synthese der Verbindung 1 (N-Dioctadecylcarbamoylmethyl-2-{3-[4-(3-guanidino-propylamino)butylamino]-propylamino}-acetamid) ausgehend von der Verbindung RPR 120535, (deren Herstellung ist in der Patentanmeldung WO 97/18185 beschrieben, die hier durch Referenz aufgenommen wird).
Die Synthesestufe ist in Figur 1/15 der Figuren dargestellt.
0,784 mmol RPR 120535 werden in 25 ml Methanol in einem Kolben, der mit einem Stabmagnet ausgestattet ist, gelöst. Zu dieser Lösung gibt man 10,21 mol Triethylamin TEA. Dann gießt man langsam (5 Minuten) 1,173 mmol einer Lösung von O-Methylisoharnstoff/Schwefelsäure, H₂SO₄, in 9 ml Wasser auf das Gemisch. Am Ende des Zugießens tritt eine Trübung auf. Das Gemisch wird für 16 Stunden bei 40°C gehalten, dann wird die Lösung zur Trockene eingeengt. Das erhaltene Produkt wird dann durch präparative HPLC gereinigt. Die interessanten Fraktionen werden wiedervereinigt und lyophilisiert. Man erhält 0,157 mmol der Verbindung 1 als Salz in einer Ausbeute von 20,1%.
Analytische HPLC: Rt = 14,94 min.
¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, (CD3)₂SO-d6, δ in ppm): 0,86 (t, J = 7 Hz, 6H: CH₃ der Fettketten); 1,24 (mt, 60H: (CH₃)₁₅ mitten in den Fettketten); 1,43 und 1,53 (2 m, jeweils 2H: 1 CH₂ jeder Fettkette); 1,63 (m, 4H: (CH₂)₂ im Butyl); 1,81 und 1,96 (2m, je 2H:CH₂, Mitte der Propylene); 2,85 bis 3,10 und 3,22 (2m, insgesamt 16H: NCH₂ des Butyls - NCH₂ der Propyle und NCH₂ der Fettketten); 3,81 (s groß, 2H: NCH₂CON); 4,03 (d, J?4,5 Hz, 2H: CONCH₂CON des Glycyls); 7,32–7,97–8,62–8,75 und 9,02 (m-t-t-m und m: H entsprechend austauschbaren Protonen).
MH⁺ = 863.
Beispiel 2: Synthese der Verbindung 2 (2-[{2-[Bis-(2-guanidino-ethyl)-amino]-ethylamino}-N,N-dioctadecyl-acetamid) ausgehend von Verbindung RPR 120527 (deren Herstellung in der Patentanmeldung WO 97/18185 beschrieben ist, welche hier durch Referenz aufgenommen gilt).
48 μmol RPR 120527 werden in 10 ml Methanol gelöst, dann werden 85 μl DIEA (10 Äquivalente) und 32 mg 1,3-Bis-(tertbutoxycarbonyl)-2-methyl-2-thiopseudoharnstoff (2,3 Äquivalente) zugegeben. Die Reaktion wird durch HPLC verfolgt. Nach 24 Stunden wird das Lösungsmittel abgedampft und man fügt zu dem erhaltenen Rückstand 20 ml einer Lösung von TFA/Dichlormethan, 1 : 1, als Volumen zu. Nach Einengung im Vakuum reinigt man den Rückstand durch präparative HPLC. Die interessanten Fraktionen werden vermischt, in flüssigem Stickstoff gefroren, dann lyophilisiert.
Auf diese Weise erhält man 0,035 mmol Verbindung 2, oder eine Ausbeute von 73%.
Analytische HPLC: Rt = 16,20 min.
¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, (CD₃)₂SO-d6, δ in ppm): 0,9 (m: 6H: CH₃); 1,2 (m: 60H: CH₂); 1,6 (m: 4H: CH₂CH₂N); 2,7–2,9 (m: 6H: CH₂N(CH₂)₂); 3,0 (m: 2H: CH₂CH₂N(CH₂)₂); 3,2 (m: 8H: CH₂N), 3,8 (m: 4H: CH₂NCOCH₂N).
MH⁺ = 793
Beispiel 3: Synthese der Verbindung 3 (N- Ditetradecylcarbamoylmethyl-2-{3-[4-(3-guanidinopropylamino)-butylamino]-propylamino]-acetamid) ausgehend von der Verbindung RPR 122766 (deren Herstellung in der Patentanmeldung WO 97/18185 beschrieben ist, welche hier durch Referenz aufgenommen wird).
0,784 mmol PRPR 122766 werden in 25 ml Methanol in einem Kolben, der mit einem Stabmagnet ausgestattet ist, gelöst. Diese Lösung versetzt man mit 10,21 mmol Triethylamin TEA. Dann gießt man langsam (5 Minuten) 1,173 mmol einer Lösung von O-Methylisoharnstoff/Schwefelsäure, H₂SO₄ in 9 ml Wasser auf das Gemisch. Nach dem Zugießen tritt eine Trübung auf. Das Gemisch wird für 16 Stunden bei 40°C gehalten, dann wird die Lösung zur Trockene eingeengt. Das erhaltene Produkt wird dann durch präparative HPLC gereinigt. Die interessanten Fraktionen werden neu kombiniert und lyophilisiert. So erhält man 0,2289 mmol Verbindung 3 oder eine Ausbeute von 29%.
Analytische HPLC: Rt = 9,8 min.
¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, (CD₃)₂SO-d6, δ in ppm): 0,87 (t, J = 7 Hz, 6H: CH₃ der Fettketten); 1,15–1,40 (m, 44H: (CH₂)₁₁ Mitte der Fettketten); 1,46 und 1,55 (2 m, jeweils 2H: 1 CH₂ jeder Fettkette); 1,63 (m, 4H: die 2 CH₂ in der Mitte des Butyl); 1,81 und 1,95 (2m, je 2H: CH₂ in der Mitte der Propyle); 2,85 bis 3,10 (m, 10H: die 2 NCH₂ des Butyl – die 2 NCH₂ eines der 2 Propyle und eines der 2 NCH₂ des anderen Propyls); 3,15 bis 3,25 (mn, 6H: das andere NCH₃ des anderen Propyl und NCH₂ der Fettketten); 3,82 (m, 2H: NCH₂CON); 4,04 (d, J = 5 Hz, 2H: CONCH₂CON des Glycyls); 7,00 bis 7,6–8,60 bis 8,75 und 9,00 (ausgedehntes m und 2 m, 3H–5H und 2H: NH₃ ⁺CF₃COO^– – NH₂ ⁺CF₃COO und =NH); 7,78 (großes t, J = 5,5 Hz, 1H: N=CNH); 8,65 (m: 1H entsprechend CONH).
MH⁺ = 751.
Beispiel 4: Synthese der Verbindung 4 (2-{2-[Bis-(2-guanidino-ethyl)-amino]-ethylamino}-N-ditetradecylcarbamoylmethyl-acetamid)
Stufe A: Ein 10-fach molarer Überschuß an Tris(aminoethyl)amin wird in 50 ml Dichlormethan gelöst und die Lösung wird in den Reaktor eingeführt, der ein Bromacetyl(chlor)trityl-Harz (vorher erhalten durch Reaktion der Bromessigsäure mit Chlortritylharz) enthält. Der Reaktor wird 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur bewegt, das Lösungsmittel wird filtriert und der Rückstand wird 10-mal mit 50 ml Dichlormethan und Isopropanol gewaschen. Der Test ist Kaiser-positiv.
Stufe B: Die erhaltenen Harze werden mit einem Überschuß an 10 Äquivalenten 1,3-Bis-(tert-butoxycarbonyl)-2-methyl-ethiopseudoharnstoff, gelöst in Dichlormethan, unter Rühren während 24 Stunden in Kontakt gebracht, das Lösungsmittel wird filtriert und das Harz wird 10-mal mit 50 ml Dichlormethan und Isopropanol gewaschen. Der Kaiser-Test in der Kälte über 3 Minuten ist negativ.
Stufe C: 50 mmol DIEA werden in 50 ml Dichlormethan gelöst und das Gemisch wird in den Reaktor eingeführt, der das in Stufe B erhaltene Produkt enthält. Dann gießt man 40 mmol Di-tert-butyldicarbonat zu. Der Reaktor wird während einer Nacht bewegt. Am nächsten Morgen ist der Kaiser-Test negativ. Das Lösungsmittel wird filtriert und das Harz wird alternativ 10-mal mit 50 ml Dichlormethan und Isopropanol, 2-mal mit 50 ml Methanol und 2-mal mit 50 ml Ether gewaschen. Danach wird das Harz unter Stickstoffstrom getrocknet. Der Kaiser-Test ist immer negativ.
Stufe D: Die in Stufe C erhaltenen Harze werden in einen 250 ml-Kolben, der mit einem Stabmagnet ausgestattet ist, eingeführt. Dann fügt man eine Lösung zu, die aus 50 ml Dichlormethan und 25 ml 1,1,1-Trifluorethan-2-ol besteht, hinzu und das Gemisch wird 2 Stunden gerührt. Die Lösung wird filtriert und das Harz wird zweimal mit 10 ml Dichlormethan gewaschen. Die so erhaltenen organischen Phasen werden gesammelt und im Vakuum eingeengt. Die Produkte werden an Silicagel gereinigt (Elutionsmittel: Chloroform/Methanol 8 : 2 als Volumen). Die interessanten Fraktionen werden kombiniert, dann im Vakuum eingedampft, wobei 168 mg des Produktes der folgenden Struktur erhalten werden:
Die Ausbeute ist 20%.
DSC: Rf = 0,9.
MH⁺ = 789.
Stufe E: 9 mmol Boc-Glycinyl-di-tetradecylamid werden in einen Kolben, der mit einem Stabmagnet ausgestattet ist, eingeführt. Es werden 30 ml Trifluoressigsäure mit 4°C zugefügt. Die Lösung wird eine Stunde lang gerührt und die TFA wird im Vakuum verdampft. Das erhaltene Produkt wird durch Zusatz von 70 ml DMF erneut gelöst, dann gibt 30 mmol TEA und 9 mmol der vorstehend erhaltenen Säure zu. Der pH wird auf 10 eingestellt und es werden 33 mmol BOP zugesetzt. Die Lösung wird 2 Stunden gerührt und durch DSC verfolgt. Wenn die Kupplung erreicht ist, werden 700 ml einer Kaliumsulfat-Lösung zugesetzt und das Produkt wird 3-mal mit 100 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird dreimal mit 50 ml Kaliumsulfat, 3 × 50 ml Natriumcarbonat und 3-mal 50 ml Natriumchlorid gewaschen. Dann wird sie auf Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum eingeengt. Das erhaltene Produkt wird durch NMR, DSC und MS analysiert und mit 50 ml TFA, die dem erhaltenen Produkt ohne vorherige Reinigung zugesetzt werden, entschützt. Die Lösung wird dann für 1 1/2 Stunden gerührt. Schließlich wird die TFA verdampft und die Endprodukte werden durch sempräparative HPLC gereinigt.
Man erhält schließlich 8,1 mmol Verbindung 4, oder eine Ausbeute von 90% für diese letzte Stufe.
Analytische HPLC: Rt = 11,4 min
¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, (CD₃)₂SO-d6, δ in ppm): 0,89 (t, J = 7 Hz, 6H; CH₃ der Fettkern); 1,15 bis 1,35 (m, 44H: (CH₂)₁₁ in der Mitte der Fettketten); 1,45 und 1,54 (m, je 2H: 1c2 jeder Fettkette); 2,65–2,78–3,06 und 3,23 (jeweils t, J = 6,5 Hz - t groß, J = 6,5 Hz - m und m jeweils 4H–2H–2H und 8H: NCH₂CH₂N - die 2 NCH₂CH₂NC=N und die NCH₂ der Fettketten); 3,83 (s groß, 2H: NCH₂CON); 4,04 (d, J = 5 Hz, 2H: CONCG₂CON des Glycidyl); 7,34 (ausgedehntes m, =NH und NH₂); 7,61 (t, J = 5,5 Hz, 2H: NH); 8,65 (t, J = 5 Hz, 1H: NH); 8,75 (m: NH).
MH⁺ = 737.
Das in Stufe E verwendete Glycinyl-di-tetradecylamid wurde vorher in folgender Weise erhalten:
10 mmol Glycin, das durch Boc-Substituenten geschützt war, und 10 mmol Ditetradecylamin werden in einen 250 ml-Kolben eingeführt. Man gibt 100 ml Chloroform zu und das Gemisch wird bis zur vollständigen Auflösung gerührt. Dann fügt man 30 mmol TEA und 33 mmol BOP hinzu. Der pH wird durch Triethylamin bei 10 gehalten. Die Reaktion wird während 2 Stunden gerührt. Wenn die Reaktion, die durch DSC verfolgt wird, vollständig ist, wird Chloroform verdampft. Man erhält einen Feststoff, der erneut in 300 ml Ethylacetat gelöst wird, die organische Phase wird dann 4-mal mit 100 ml Kaliumsulfat, 4-mal mit 100 ml Natriumcarbonat und 4-mal mit 100 ml Natriumchlorid gewaschen. Dann wird die organische Phase auf Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingedampft. Das erhaltene Produkt wird durch DSC, NMR und MS analysiert und ohne weitere Reinigungen verwendet.
Beispiel 5: Synthese der Verbindung 5 (N-Ditetradecylcarbamoylmethyl-2-((3-guanidino-propyl}-[4-(3-guanidino-propylamino)-butyl]-amino}acetamid)
Man arbeitet wie vorstehend für Verbindung 4 beschrieben, allerdings ausgehend von Spermin als Ausgangspolyamin, wodurch die Säure mit der folgenden Struktur erhalten wird:
Nachdem sie vom Harz abgespalten wurde, wird der Rest an Silicagel gereinigt (Elutionsmittel: Chloroform/Methanol 8 : 2 als Volumen). Die interessanten Fraktionen werden gemischt, dann unter Vakuum eingedampft, wodurch 0,69 mmol des genannten Moleküls erhalten werden; Ausbeute 50%.
DSC: RF = 0,5,
MH⁺ = 845.
Die Verbindung 5 wird durch Kopplung der vorstehend synthetisierten Säure und des Glycinyl-ditetradecylamids nach demselben Verfahren, wie es in Beispiel 4 beschrieben wurde, erhalten. Das Glycinyl-ditetradecylamid wird in der gleichen Weise wie vorher erhalten.
Auf diese Weise erhält man 0,65 mmol Verbindung 5 mit einer Ausbeute von 94% für diese Stufe.
Analytische HPLC: Rt = 10,1 min.
¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, (CD₃)₂SO-d6 bei einer Temperatur von 393 K, δ in ppm): 0,92 (t, J = 7 Hz, 6H: CH₃ der Fettketten); 1,25–1,45 (m, 44H: (CH₂)₁₁ in der Mitte der Fettketten); 1,57 (m, 4H: die 2 CH₂ in der Mitte des Butyl); 1,57 und 1,67 (m, je 2H: 1 CH₂ jeder Fettkette); 1,74 und 1,91 (2m, je 2H: CH₂ in der Mitte der Propyle); 2,62–2,85–3,20–3,35 (3m, insgesamt 16H: die NCH₂ - die CH₂NC=N und die NCH₂ der Fettketten); 3,17 (s, 2H: NCH₂CON); 4,02 (d, J = 5 Hz, 2H: CONCH₂CON des Glycyls); 6,89–7,30 bis 7,55 und 7,65 (jeweils m-m, ausgedehnt, und m: die austauschbaren H).
MH⁺ = 845.
Beispiel 6: Synthese der Verbindung 6 (2-{3-[(4-[Bis-(3-guanidino-propyl)-amino]-butyl}-(3-guanidino-propyl)-amino]propylamino}-N-ditetradecylcarbamoylmethylacetamid)
Man arbeitet in der gleichen Weise wie vorstehend für die Verbindungen 4 und 5, allerdings ausgehend von N,N-N',N'(Tetraminopropyl)butylendiamin als Ausgangspolyamin, um die Säure der folgenden Struktur zu erhalten:
Nach Abspaltung vom Harz wird der erhaltene Rest an Silicagel gereinigt (Elutionsmittel: Chloroform/Methanol 8 : 2, als Volumen). Die interessanten Fraktionen werden gemischt, danach im Vakuum eingedampft, wodurch 0,099 mmol Produkt in einer Ausbeute von 20% erhalten werden.
DSC: Rf = 0,3.
MH⁺ = 1201.
Die Verbindung 6 wird durch Kopplung der vorher synthetisierten Säure und des Glycinyl-ditetradecylamids nach dem Verfahren, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist, erhalten. Das Glyciny-ditetradecylamid wird auch in der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben erhalten.
Auf diese Weis erhält man 0,09 mmol Verbindung 6 in einer Ausbeute von 90% für diese Stufe.
Analytische HPLC: Rt = 11,2 min.
¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, (CD₃)₂SO-d6 mit Zusatz von einigen Tropfen CD₃COOD-d4, δ in ppm): 0,87 (t, J = 7 Hz, 6H: CH₃ der Fettketten); 1,20–1,40 (m, 44H: (CH₂)₁₁ in der Mitte der Fettketten); 1,45 und 1,54 (2m, je 2H: 1 CH₂ jeder Fettkette); 1,67 (m, 4H: CH₂ in der Mitte des Butyl); 1,80 bis 2,1 (m, 8H: CH₂ in der Mitte der Propyle); 2,95–3,30 (m, 20H: die NCH₂ der Propyle und die NCH₂ des Butyls); 3,15 bis 3,30 (m, 4H: die NCH₂ der Fettketten); 3,84 (d, 2H: NCH₂CON); 4,05 (s, 2H: CONCH₂CON des Glycyls).
MH⁺ = 949.
Beispiel 7: Verwendung der Verbindung 1 für die in vitro-Transfektion von genetischem Material
Verwendetes genetisches Material
Die verwendet Nukleinsäure ist das Plasmid pXL2774 (WO 97/10343), das das Gen, welches für die Luciferase codiert unter der Kontrolle des Promotors des humanen Cytomegalovirus (CMV) trägt.
Die Nukleinsäurelösungen sind auf 20 μg/ml in physiologischem Serum verdünnt (Natriumchlorid NaCl 0,15 M).
Transfektionslösungen (Präparat aus dem Stegreif) Die in der Erfindung beschriebenen Produkte werden in einer Konzentration, die von 60 bis 240 μM variiert, in Wasser gelöst und mit der DNA-Lösung Volumen zu Volumen vermischt. Die Endsalzkonzentration ist 75 mM.
Transfektion
Die Zellen werden unter geeigneten Bedingungen auf Mikroplatten mit 24 Vertiefungen (2 cm²/Vertiefung) kultiviert und transfiziert, wenn sie in der exponentiellen Wachstumsphase mit einer Konfluenz von 50–70% sind.
Die Zellen werden zweimal mit 500 μl Medium, das an Serumproteinen verarmt ist, gewaschen und in einem Medium ohne Serum erneut wachsen gelassen [Transfektion in Abwesenheit von Serum] oder auch in vollständigem Medium wachsen gelassen [Transfektion in Gegenwart von Serum]. 50 μl des Transfektionsgemisches [oder 0,5 μg DNA/Vertiefung] werden den Zellen zugesetzt [3 Vertiefungen/Konditionsvektor-DNA]. Wenn die Zellen in Abwesenheit von Serum transfiziert werden, wird das Wachstumsmedium 2 Stunden nach Transfektion mit der geeigneten Menge an Serum ergänzt.
Die Transfektionswirksamkeit wird 48 Stunden nach der Transfektion durch Messung der Expression der Luciferase nach den Empfehlungen, die für die Verwendung des Promega-Kits [Luciferase Assay System] gegeben wurden, beurteilt. Die Toxizität der Transfektionsgemische wird durch Messung der Proteinkonzentrationen in den Zelllysaten bestimmt.
Resultate
Die Verbindung 1 zum Vergleich mit dem kationischen Lipid RPR 120535 (TFA-Salz) [beschrieben in der Patentanmeldung WO 97/18185, die hier durch Referenz aufgenommen wird] als DNA-Vektor verwendet, um drei verschiedene Zellinien zu transfizieren: die Zellen NIH3T3, die Zellen HepG2 und die Zelle HeLa. Für diese drei Zelltypen haben wir keinen Beweis für eine signifikante Toxizität der Verbindung 1, deren Herstellung in Beispiel 1 beschrieben ist, gefunden. Die Transfektionswirksamkeit der Verbindung 1 und des kationischen Vergleichslipids in drei Zelltypen ist in 2/15 für die Verhältnisse nmol Verbindung/μg DNA zwischen 3 und 12 dargestellt.
Aus 2/15 kann man ableiten, daß die maximale Transfektionswirksamkeit für ein Verhältnis von 6 nomol kationisches Lipid/μg DNA für die Zellen NIH3T3 und für ein Verhältnis von 9 nmol kationisches Lipid/μg DNA für die HeLa- oder HepG2-Zellen erhalten wird. Für eine Transfektion in Abwesenheit von Serum sind die in den HeLa- oder HepG2-Zellen erhaltenen Expressionsniveaus für die Verbindung 1 gegenüber dem getesteten Vergleichsprodukt 2- bis 4-mal höher.
Die 3/15 stellt die Transfektionswirksamkeit der Komplexe Verbindung 1/DNA im Vergleich zum kationischen Referenzlipid wie vorstehend (RPR120535) komplexiert mit der DNA, dar. Die weißen Balken stellen die Transfektionswirksamkeit der Nukleolipidkomplexe in Abwesenheit von Serum während 2 Stunden dar. Die schwarzen Balken stellen die Transfektionswirksamkeit der Nukleolipidkomplexe in Gegenwart von Serum dar.
Mit 3/15 kann man einen der besonderen Vorteile der erfindungsgemäßen Mittel zum Transfer beweisen. Tatsächlich beobachtet man, daß die Transfektionsniveaus mit oder ohne Serumproteine im Fall der erfindungsgemäßen Verbindung 1 dieselben sind, während im Fall des kationischen Vergleichslipids eine starke Inhibierung durch das Vorliegen von Serumproteinen beobachtet. Dies stellt eine Eigenschaft dar, die für die in vivo-Transfektionen besonders interessant ist.
Beispiel 8: Verwendung der Verbindungen 2, 3, 5 und 6 für die in vitro-Transfektion von genetischem Material
Verwendetes genetisches Material
Die verwendete Nukleinsäure ist das Plasmid pXL3031, das das Gen, welches für die Luciferase codiert, unter der Kontrolle des Promotors des humanen Cytomegalovirus (CMV) umfaßt. Dieses Plasmid pXL3031 ist in 15/15 dargestellt. Es wurde nach Standardprotokollen, die dem Fachmann bekannt sind und insbesondere nach Maniatis T., Fritsch E. F. und Sambrook J., Methods in Molecular Biology: a Laboratory Manual, 1982, S. 83–94, Cold Spring Harbor Lab., NY isoliert.
Genauer ausgedrückt, die verwendeten Verfahren sind das Verfahren der alkalischen Lyse und der Reinigung mit Cäsiumchlorid-Gradient.
Transfektion
Die Zellen werden unter geeigneten Bedingungen auf Mikroplatten mit 24 Vertiefungen kultiviert. Nach einem Wachstum während einer Nacht enthält jede Vertiefung etwa 100 000 Zellen.
In jeder Vertiefung führt man ein Transfektionsgemisch ein, das 1 μg DNA in 0,5 ml DMEM in Abwesenheit von Serum enthält. 5 Stunden nach der Transfektion wird das Wachstumsmedium durch die geeignete Serummenge (DMEM und fötales Kälberserum, 10%) ergänzt. Die Zelllysate werden 24 Stunden nach der Transfektion wiedergewonnen und die Wirksamkeit der Transfektion wird durch Messen der Expression der Luciferase nach den Empfehlungen, die für die Verwendung des Promega-Kits (Luciferase-Detektionskit) gegeben wurden, beurteilt.
Resultate
Die Transfektionsniveaus sind in den Figuren 4/15, 5/15, 6/15 und 7/15 dargestellt.
Die Transfektionswirksamkeit wurde jedes Mal für das Lipid in Form von Micellen und im Gemisch mit einem Co-Lipid (DOPE oder auch Cholesterin) gemessen. Aus diesen Tabellen kann man entnehmen, daß die Transfektionsniveaus selbst bei sehr niedrigen Ladungsverhältnissen stark erhöht sind, und zwar mit den günstigen Folgen, die für die Toxizität daraus resultieren. Dies bildet einen der Vorteile der erfindungsgemäßen Verbindungen. In der Tat ist es mit kationischen Lipiden, die keine Aminidinfunktion(en) enthalten, oft notwendig, sehr erhöhte Ladungsverhältnisse anzuordnen, um derartige Transfektionsniveaus zu erhalten, die im allgemeinen eine verstärkte Toxizität mit sich ziehen.
Beispiel 9: Untersuchung der Affinität der Verbindungen 2, 3, 5 und 6 für die DNA
Die verwendete Nukleinsäure ist das Plasmid pXL3031, wie es im vorstehenden Beispiel beschrieben wurde.
Die Komplexe werden in Konzentrationen von 0,25 mg DNA/ml mit einer geeigneten Menge an Lipid, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, mit dem gewünschten Ladungsverhältnis hergestellt. Der Komplex wird in einem Medium hergestellt, das 5% Glucose und eine 20 mM Natriumchlorid-Lösung enthält. 50 μl Nukleolipid-Komplex werden dann 20-fach in 950 μl Lösung, die 5% Glucose und eine 20 mM Natriumchlorid-Lösung enthält, verdünnt.
Die Größe der Komplexe wird dann bestimmt, indem der hydrodynamische Durchmesser durch dynamische Diffusion des Lichtes mit Hilfe eines Coulter N4+-Geräts gemessen wird.
Für alle Verbindungen wurden 3 verschiedene physikochemische Phasen entsprechend dem Ladungsverhältnis bewiesen:

– Die Phase A, für die die DNA durch das kationische Lipid nicht gesättigt ist, das heißt es bleibt noch nackte DNA in dem Gemisch, was bedeutet, daß die DNA durch das Lipid nicht vollständig geschützt ist und somit einem Abbau durch die Enzyme unterliegen kann. Die gebildeten Komplexe sind insgesamt negativ geladen, was den Durchgang durch Zellmembranen schwierig macht. Es ist somit vorteilhaft, zur Transfektion der DNA sie nicht in dieser Zone zu plazieren.
– Die Phase B, für die die DNA vollständig mit dem kationischen Lipid gesättigt ist; die Komplexe sind insgesamt neutral oder leicht positiv. Die ionischen Abstoßungen sind maximal, wodurch diese Phase instabil ist. Es kann ein Phänomen der "Vernetzung" bei der Präzipitation der Komplexe entstehen. Die Komplexe können in diesem Fall nicht zur Injektion verwendet werden.
– Die Phase C, für die die DNA mit dem Lipid übergesättigt ist und die Komplexe demnach insgesamt positiv sind. Die DNA ist somit vom Lipid vollständig geschützt und ihre Passage durch die Zellmembran (insgesamt negativ) ist erleichtert. Die Komplex der Phase C sind demnach für eine Verwendung für den Nukleinsäuretransfer in die Zellen besonders angepaßt.

Die Tabellen geben die Phase an, in der die Komplexe sich als Funktion des Ladungsverhältnisses befinden, was in den Figur 8/15, 9/15, 10/15 und 11/15 dargestellt ist.
Die Tabellen der Figuren 8/15, 9/15, 10/15 und 11/15 vergleichen die Phasen in Funktion der Ladungsverhältnisse zwischen den erfindungsgemäßen Verbindungen und ihren aminierten Analoga, das heißt die kationischen Lipide, deren Amidinfunktion oder Guanidinfunktion durch eine Aminofunktion ersetzt ist. Man stellt fest, daß die Phase B in Richtung der viel schwächeren Ladungsverhältnisse verschoben ist. Somit trägt die Tatsache, Amidinfunktionen in den kationischen Kopf einzuarbeiten, zu Erhöhung der Affinität der Verbindungen für die DNA bei. Dies bildet eine wichtige Eigenschaft der erfindungsgemäßen Verbindungen, denn die Komplexe, die sie mit der DNA bilden, können in der Phase C verwendet werden, ohne daß sie in zu stark erhöhte Ladungsverhältnisse fallen; die günstigen Effekte führen zu der Toxizität.
Die Affinität der erfindungsgemäßen Verbindungen für die DNA wurde auch mit Hilfe der Messung der Verringerung der Fluoreszenz nach Zusatz von Ethidiumbromid beurteilt. In der Tat ist der Ersatz des Ethidiumbromids der DNA durch das Lipid ein Hinweis für eine Bindung an die DNA.
So fügt man zu hergestellten Komplexen 4 μl einer Ethidiumbromid-Lösung, 1 mg/ml, mißt die Fluoreszenz bei der Anregungswellenlänge von 260 nm und bei der Emissionswellenlänge von 590 nm. Die erhaltene Fluoreszenz für die DNA allein wird als 100% definiert.
Die Resultate sind in den Tabelle der 12/15, 13/15 und 14/15 angegeben. Diese Resultate zeige, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen eine sehr gute Affinität für die DNA aufweisen, was eine besonders interessante Eigenschaft der erfindungsgemäßen Verbindungen ausmacht.

Claims

Lipopolyamine in der Form D, L oder DL sowie ihre Salze, der allgemeinen Formel (I)
in der R₁, R₂ und R₃, unabhängig voneinander, ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -(CH₂)_q-NRR' darstellen, mit • q, das eine ganze Zahl von 1 bis einschließlich 6 darstellt, wobei die Werte von q unabhängig voneinander innerhalb der verschiedenen Gruppen von R₁, R₂ und R₃ sind, und • R und R', unabhängig voneinander, ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel (II)
worin r eine ganze Zahl darstellt, die von 0 bis einschließlich 6 variieren kann, und die Gruppen R₅, unabhängig voneinander, ein Wasserstoffatom oder einen Substituenten Alkyl, Carbamat oder Acyl, aliphatisch oder aromatisch, gegebenenfalls halogeniert, darstellen, mit der Maßgabe, daß mindestens eine der Gruppen R₁, R₂ und R₃ mindestens eine Gruppe der Formel (II) umfaßt, – m und n, unabhängig voneinander, eine ganze Zahl darstellen, die von 1 bis einschließlich 6 variieren kann, wobei in dem Fall, wo n höher als 1 ist, m unterschiedliche Werte annehmen kann und darstellen R₃ die verschiedenen bei der allgemeinen Formel (I) angegebenen Bedeutungen besitzt, – p eine ganze Zahl darstellt, die von 1 bis einschließlich 6 variieren kann, und – R₄ eine Gruppe der allgemeinen Formel (III)
darstellt, in der • R₇ und R₈, unabhängig voneinander, ein Wasserstoffatom oder einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Rest mit 5 bis 22 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls halogeniert, oder ein Steroid-Derivat oder eine Gruppe (CH₂)_u-NH-R₉ darstellen, worin u eine ganze Zahl zwischen 2 und einschließlich 6 darstellt und R₉ ein Rest Acyl ist, wobei mindestens eine der Gruppen R₇ und R₈ von Wasserstoff verschieden ist, • t eine ganze Zahl ist, ausgewählt von 0 bis einschließlich 10, wobei, wenn t eine ganze Zahl höher als 1 darstellt, R₆, X, Y und s innerhalb der verschiedenen Struktureinheiten [X-(CHR₆)_s-Yl verschiedene Bedeutungen besitzen können, • X ein Atom von Sauerstoff oder Schwefel oder eine Gruppe Amino oder Alkylamino darstellt, worin der Substituent Alkyl linear oder verzweigt ist und 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthält, • Y eine Gruppe Carbonyl oder eine Gruppe Methylen darstellt, • R₆ eine Wasserstoffatom oder eine Seitenkette einer natürlichen Aminosäure ist, gegebenenfalls substituiert, und • s eine ganze Zahl darstellt, die von 1 bis einschließlich 10 variieren kann, wobei, wenn s gleich 1 ist, R₆ eine Seitenkette einer natürlichen Aminosäure darstellt, gegebenenfalls substituiert, und wenn s höher als 1 ist, R₆ ein Wasserstoffatom darstellt.
Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Formel (II) eine der Gruppen R₅ ein Wasserstoffatom ist und die andere einen aliphatischen Rest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder einen aromatischen Rest darstellt.
Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Formel (II) eine der Gruppen R₅ ein Wasserstoffatom ist und die andere Benzyl oder eines seiner Derivate darstellt.
Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Formel (II) beide Gruppen R₅ Wasserstoffatome darstellen.
Verbindungen nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Fall, wo R₁, R₂ und/oder R₃ von Wasserstoff verschieden sind und die Formel (II) umfassen, q den Wert 2 oder 3 annimmt und r 0 ist.
Verbindungen nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) m unter 2, 3 und 4 ausgewählt wird.
Verbindungen nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Gruppen R₇ und R₈ durch ein Steroid-Derivat dargestellt wird, ausgewählt unter Cholesterin, Cholestanol, 3α-5-Cyclo-5α-cholestan-6β-ol, Cholsäure, Cholesteryl-formiat, Cholestanyl-formiat, 3α-5-Cyclo-5α-cholestan-6ββ-yl-formiat, Cholesterylamin, 6-(1,5-Dimethylhexyl)-3a,5adimethylhexadecahydrocyclo-penta[a]-cyclopropa[2,3]-cyclopenta[1,2-f]-naphthalin-l0-ylamin oder Cholestanyl-amin.
Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Gruppen R⁷ und R₈ durch eine Gruppe (CH₂)_u-NH-R₉ dargestellt wird, in der u eine ganze Zahl zwischen 2 und einschließlich 6 ist und R₉ einen Rest Acyl darstellt.
Verbindungen nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe R₉ Cholesteryl-formiat, Arachidonyl oder Cholsäure ist.
Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Gruppen R₇ und R₈ unabhängig voneinander einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Rest mit 5 bis 22 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls halogeniert, oder ein Steroid-Derivat oder eine Gruppe (CH₂)_u-NH-R₉ darstellen, worin u eine ganze Zahl zwischen 2 und einschließlich 6 darstellt und R₉ ein Rest Acyl ist.
Verbindungen nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Gruppen R₇ und R₈ eine aliphatische Kette mit 5 bis 22 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise zwischen 12 und 22 Kohlenstoffatomen darstellen.
Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ eine Gruppe der Formel (II) umfaßt und R₂ und R₃ Wasserstoffatome sind.
Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R₂ jeweils eine Gruppe der Formel (II) umfassen und R₃ ein Wasserstoffatom ist.
Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R₃ jeweils eine Gruppe der Formel (II) umfassen und R₂ ein Wasserstoffatom ist.
Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R₁, R₂ und R₃ jeweils eine Gruppe der Formel (II) umfassen.
Verbindungen nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem extra- oder intrazellularen Ziel-Element assoziiert sind.
Verbindungen nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Ziel-Element im Bereich der Seitenkette der Aminosäure R₆ eingliedern.
Verbindungen nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Marker-Mittel vom Typ Biotin, Rhodamin, Folat oder eine lineare oder cyclische, peptidische oder pseudopeptidische Sequenz eingliedern, die das Epitop Arg-Gly-Asp im Bereich der Seitenkette der Aminosäure R₆ umfaßt.
Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie unter den Verbindungen der folgenden Formeln ausgewählt werden, in denen R₄ und R₅ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen:
Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgewählt werden unter
Verbindung 1
Verbindung 2
Verbindung 3
Verbindung 4
Verbindung 5
Verbindung 6
Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche und eine Nucleinsäure.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem einen oder mehrere Zusatzstoffe umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatzstoff aus einem oder mehreren neutralen Lipiden besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 22 und 23, dadurch gekennzeichnet, daß die neutralen Lipide Lipide mit zwei Fettketten sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die neutralen Lipide natürliche oder synthetische, zwitterionische oder unter physiologischen Bedingungen von ionischer Ladung freie Lipide sind, beispielsweise ausgewählt unter Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE), Oleylpalmitoylphosphatidylethanolamin (POPE), den Di-Stearoyl-, Palmitoyl-, Mirystoylphosphatidylethanolaminen sowie ihren ein- bis dreimal N-methylierten Derivaten, den Phosphatidylglycerinen, den Diacylglycerinen, den Glycosyldiacylglycerinen, den Cerebrosiden (wie insbesondere den Galactocerebrosiden), den Sphingolipiden (wie insbesondere den Sphingomyelinen) oder auch den Asialogangliosiden (wie insbesondere den asialoGMl und GM2).
Zusammensetzung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatzstoff eine Verbindung ist, die im Bereich der Kondensation der Nucleinsäure eingreift oder nicht direkt eingreift.
Zusammensetzung nach Anspruch 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß sich der genannte Zusatzstoff ganz oder teilweise von einem Protamin, einem Histon oder einem Nucleolin und/oder einem seiner Derivate ableitet, oder auch ganz oder teilweise aus peptidischen Struktureinheiten (KTPKKAKKP) und/oder (ATPAKKAA) besteht, wobei die Anzahl der Struktureinheiten zwischen 2 und 10 variieren und sich in kontinuierlicher Weise oder auch nicht wiederholen kann.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem ein Ziel-Element umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 21 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff für eine injizierbare Formulierung umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 21 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff für eine Anwendung auf der Haut und/oder den Schleimhäuten umfaßt.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 20 für den Transfer von Nucleinsäuren in die Zellen.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)
in der R₁, R₂ und R₃, unabhängig voneinander, ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -(CH₂)_q-NRR' darstellen, mit • q, das eine ganze Zahl von 1 bis einschließlich 6 darstellt, wobei die Werte von q unabhängig voneinander innerhalb der verschiedenen Gruppen R₁, R₂ und R₃ sind, und • R und R', unabhängig voneinander, ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel (II)
darstellen, worin r eine ganze Zahl darstellt, die von 0 bis einschließlich 6 variieren kann, und die Gruppen R₅, unabhängig voneinander, ein Wasserstoffatom oder einen Substituenten Alkyl, Carbamat oder Acyl, aliphatisch oder aromatisch, gegebenenfalls halogeniert, darstellen, mit der Maßgabe, daß mindestens eine der Gruppen R₁, R₂ und R₃ mindestens eine Gruppe der Formel (II) umfaßt, – m und n, unabhängig voneinander, eine ganze Zahl darstellen, die von 1 bis einschließlich 6 variieren kann, wobei in dem Fall, wo n höher als 1 ist, m unterschiedliche Werte annehmen kann und R₃ die verschiedenen, bei der allgemeinen Formel (I) angegebenen Bedeutungen besitzt, – p eine ganze Zahl darstellt, die von 1 bis einschließlich 6 variieren kann, und – R₄ eine Gruppe der allgemeinen Formel (III)
darstellt, in der • R₇ und R₈, unabhängig voneinander, ein Wasserstoffatom oder einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Rest mit 5 bis 22 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls halogeniert, oder ein Steroid-Derivat oder eine Gruppe (CH₂)_u-NH-R₉ darstellen, worin u eine ganze Zahl zwischen 2 und einschließlich 6 darstellt und R₉ ein Rest Acyl ist, wobei mindestens eine der Gruppen R₇ und R₈ von Wasserstoff verschieden ist, • t eine ganze Zahl ist, ausgewählt von 0 bis einschließlich 10, wobei, wenn t eine ganze Zahl höher als 1 darstellt, R₆, X, Y und s innerhalb der verschiedenen Struktureinheiten [X-(CHR₆)_s-Y] verschiedene Bedeutungen besitzen können, • X ein Atom von Sauerstoff oder Schwefel oder eine Gruppe Amino oder Alkylamino darstellt, worin der Substituent Alkyl linear oder verzweigt ist und 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthält, • Y eine Gruppe Carbonyl oder eine Gruppe Methylen darstellt, • R₆ eine Wasserstoffatom oder eine Seitenkette einer natürlichen Aminosäure ist, gegebenenfalls substituiert, und • s eine ganze Zahl darstellt, die von 1 bis einschließlich 10 variieren kann, wobei, wenn s gleich 1 ist, R₆ eine Seitenkette einer natürlichen Aminosäure darstellt, gegebenenfalls substitu iert, und wenn s höher als 1 ist, R₆ ein Wasserstoffatom darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Amidingruppe durch Einwirkung eines Thio- oder Oxo-Derivates von Harnstoff auf ein Lipopolyamin bildet oder daß man ein Polyaminoamidin auf ein Lipid durch peptidische Kopplung pfropft.
Methode zum Transfer von Nucleinsäuren in Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgenden Stufen umfaßt: (1) das In-Kontakt-Bringen der Nucleinsäure mit einer Verbindung wie in den Ansprüchen 1 bis 20 definiert und gegebenenfalls mit einem oder mehreren Zusatzstoff en) und/oder Ziel-Element(en), um einen Komplex zu bilden, und (2) das In-Kontakt-Bringen der Zellen mit dem in (1) gebildeten Komplex.