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Diese
Erfindung betrifft neu identifizierte oberflächenaktive Verbindungen auf
Spermin:Peptid-Basis, die
Verwendung derartiger Verbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Die Erfindung betrifft auch die Anwendungen oberflächenaktiver
Verbindungen auf Spermin:Peptid-Basis.
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Oberflächenaktive
Mittel sind Stoffe, welche die Oberflächeneigenschaften einer Flüssigkeit
merklich beeinflussen, sogar bei geringen Konzentrationen. Zum Beispiel
werden oberflächenaktive
Mittel die Oberflächenspannung
signifikant verringern, wenn sie in Wasser oder wässrigen
Lösungen
gelöst
werden, und werden die Grenzflächenspannung
zwischen zwei Flüssigkeiten
oder einer Flüssigkeit
und einem Feststoff verringern. Diese Eigenschaft von oberflächenaktiven
Molekülen
wird in der Industrie, insbesondere in der Reinigungsmittel- und Ölindustrie,
weitgehend ausgenutzt. In den 1970iger Jahren wurde von einer neuen
Klasse von oberflächenaktiven
Molekülen
berichtet, welche durch zwei hydrophobe Ketten mit polaren Köpfen gekennzeichnet
waren, die durch eine hydrophobe Brücke gebunden sind (Deinega,
Y. et al. Kolloidn. Zh. 36, 649, 1974). Diese Moleküle, welche "Gemini" genannt worden sind
(Menger, F. M. und Littau, C. A., J. Am. Chem. Soc. 113, 1451, 1991)
weisen gegenüber
ihren monomeren Äquivalenten
sehr erstrebenswerte Eigenschaften auf. Zum Beispiel sind sie beim
Verringern der Grenzflächenspannung
zwischen Flüssigkeiten
auf Öl- und
Wasserbasis sehr wirksam und weisen eine sehr niedrige kritische
Mizellenkonzentration auf.
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Kationische
oberflächenaktive
Mittel sind unter anderem zur Transfektion von Polynucleotiden in
Zellen in Kultur verwendet worden, und es gibt Beispiele für derartige
Mittel, welche im Handel für
Wissenschaftler erhältlich
sind, die an gentechnologischen Verfahren beteiligt sind (zum Beispiel
das Mittel TfxTM-50 zur Transfektion von
eukaryontischen Zellen, erhältlich
von Promega Corp. WI, USA).
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Die
effiziente Zuführung
von DNA in Zellen in vivo, entweder zur Gentherapie oder zur Antisense-Therapie,
war einige Jahre lang ein Hauptziel. Sehr viel Aufmerksamkeit konzentrierte
sich auf die Verwendung von Viren als Zuführungsvehikel, zum Beispiel
Adenoviren für
Epithelzellen im Respirationstrakt mit dem Ziel einer korrigierenden
Gentherapie für
zystische Fibrose (CF). Jedoch blieb ungeachtet einiger Beweise
für einen
erfolgreichen Gentransfer in CF-Patienten die Adenovirus-Route problematisch
aufgrund von inflammatorischen Nebenwirkungen und begrenzter nicht
dauerhafter Expression des übertragenen
Gens. Es sind verschiedene alternative Verfahren zur in-vivo Gentransfer
untersucht worden, einschließlich
Studien, die kationische oberflächenaktive
Mittel verwendeten. Gao, X. et al. (1995) Gene Ther. 2, 710–722, demonstrierte
die Durchführbarkeit
dieser Herangehensweise mit einem normalen humanen Gen für den CF-Transmembran-Leitfähigkeitsregulator
(CFTR) in das respiratorische Epithel von CF-Mäusen unter Verwendung Amin-tragender
kationischer Lipide. Diese Gruppe unternahm weitere Schritte mit
einem liposomalen CF-Gentherapieversuch, der, wenn auch nur teilweise
erfolgreich, das Potenzial für
diese Herangehensweise an Menschen demonstrierte (Caplen, N. J.
et al., Nature Medicine, 1, 39–46,
1995). Vor kurzem haben andere Gruppen das Potenzial von anderen
kationischen Lipiden zur Genzuführung
untersucht, zum Beispiel Cholesterinderivate (Oudrhiri, N. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 1651–1656,
1997). Diese eingeschränkte
Studie zeigte die Fähigkeit
dieser cholesterinbasierten Verbindungen auf, den Gentransfer in
Epithelzellen sowohl in vitro als auch in vivo zu ermöglichen,
wodurch die Allgemeingültigkeit
dieser Herangehensweise bestätigt
wurde.
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Diese
und andere Studien zeigen, dass es auf diesem neuen Forschungsgebiet
eine anhaltende Notwendigkeit gibt, neue, gering-toxische, oberflächenaktive
Moleküle
zu entwickeln, welche den wirksamen Transfer von Polynucleotiden
in Zellen sowohl in vitro zur Transfektion in zellbasierten experimentellen
Untersuchungen als auch in vivo zur Gentherapie und Antisense-Behandlungen ermöglichen.
Durch vorliegende Erfindung wird angestrebt, die von den bestehenden
Verbindungen gezeigten Schwierigkeiten zu überwinden.
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Die
Erfindung betrifft eine oberflächenaktive
Verbindung auf Spermin:Peptid-Basis mit einem Spermingrundgerüst und mit
der allgemeinen Struktur der Formel (I):
wobei R
1 und
R
3 Wasserstoff sind und R
2 und
R
4, welche gleich oder voneinander verschieden
sein können, Peptidreste
sind, welche aus einer oder mehreren Aminosäuren gebildet werden, die in
einer linearen oder verzweigten Weise durch Amid-(CONH)-Bindungen
aneinander gebunden sind, und die ferner an das Spermingrundgerüst durch
Amidbindungen gebunden sind, mit der allgemeinen Formel (II):
wobei
p1 0 bis 5 ist und p2 1 bis 5 ist, bevorzugt 1; und die Werte für p3 und
p4, welche gleich oder voneinander verschieden sein können, 0
bis 5 betragen, bevorzugt 0;
A1, A3 und A4, welche gleich oder
voneinander verschieden sein können,
Aminosäuren
sind, welche aus Serin, Lysin, Ornithin, Threonin, Histidin, Cystein,
Arginin und Tyrosin ausgewählt
sind; und
A2 eine Aminosäure
ist, welche aus Lysin, Ornithin und Histidin ausgewählt ist;
und
R
5 und R
6 gesättigte oder
ungesättigte
Kohlenwasserstoffreste sind, welche bis zu 24 Kohlenstoffatome aufweisen
und an das Spermingrundgerüst
durch eine Amid- oder Amin-(NCH
2)-Bindung gebunden sind;
oder
wenn
R
1 und R
3 Wasserstoff
sind, R
2 und R
4,
welche gleich oder voneinander verschieden sein können, gesättigte oder
ungesättigte
Kohlenwasserstoffreste sind, welche bis zu 24 Kohlenstoffatome aufweisen
und an das Spermingrundgerüst
durch Amid- oder Aminbindungen gebunden sind, und R
5 und
R
6, welche gleich oder voneinander verschieden
sein können,
Peptidreste der Formel (II) sind, welche an das Spermingrundgerüst durch Amidbindungen
gebunden sind,
oder
ein Salz, vorzugsweise ein pharmazeutisch
verträgliches
Salz, davon.
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Wenn
hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Kohlenwasserstoff" auf einen Rest mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen,
der geradkettig oder verzweigt sein kann und einen gesättigten
carbocylischen Ring mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen einschließen kann
und der Ungesättigtheit
(Doppel- und/oder Dreifach-Kohlenstoff-Kohlenstoffbindungen) enthalten
kann.
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Die
Amidbindungen zwischen den Aminosäuren A1, A2 und A3 im Peptidrest
der Formel (II) sind Standardpeptidbindungen (α-Bindungen), außer wenn
die Aminosäure
ein Diamin ist, zum Beispiel Lysin oder Ornithin, wo die Bindung
einen der beiden Aminreste umfassen kann. Zum Beispiel kann, wo
A1 Lysin ist, die Bindung an die Aminosäure A2 eine Standard-Alpha-Amidbindung sein
oder eine Epsilon-(ε)-Amidbindung, welche
das Amin der Lysinseitenkette umfasst. Ähnlich kann, wo A1 Ornithin
ist, die Amidbindung, welche A1 an A2 bindet, eine Alphabindung
oder eine Delta-(δ)-Bindung
sein, die unter Verwendung des Amins an der Seitenkette des Ornithinaminosäurerests
erzeugt wird.
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Bevorzugt
ist die Verbindung symmetrisch, das heißt, R1 und
R3 sind gleich, R2 und
R4 sind gleich und R5 und
R6 sind gleich. Erfindungsgemäße symmetrische
oberflächenaktive
Verbindungen auf Spermin:Peptid-Basis sind "Gemini"-oberflächenaktive-Mittel.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist A1 im Rest der Formel (II) Serin oder Threonin, bevorzugt Serin.
Bevorzugt sind A3 und A4 im Rest der Formel (II) Lysin, Ornithin,
Histidin oder Arginin.
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In
einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform
ist der Kohlenwasserstoffrest ausgewählt aus:
-(CH2)11CH3
-(CH2)13CH3
-(CH2)15CH3
-(CH2)17CH3
-(CH2)19CH3
-(CH2)23CH3
-(CH2)8CH=CH(CH2)5CH3
-(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3
-(CH2)8CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3
-(CH2)8(CH=CHCH2)3CH3
-(CH2)4CH=CH(CH2CH=CH)3(CH2)4CH3
-(CH2)8CH=CH(CH2)5CH3 trans
-(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3 trans
-(CH2)9CHCH3(CH2)7CH3.
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können aus leicht erhältlichen
Ausgangsmaterialien unter Verwendung der dem Fachmann bekannten
synthetischen Peptidchemie hergestellt werden. Das in den 1a und 1b gezeigte
Schema zeigt ein allgemeines Verfahren zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen,
wobei die Kohlenwasserstoffreste an die Spermineinheit durch Aminbindungen
gebunden sind, und das in den 2a und 2b gezeigte
Schema zeigt ein allgemeines Verfahren zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen,
wobei die Carbonylreste an die Spermineinheit über Amidbindungen gebunden sind.
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Die
in den 1 und 2 gezeigten
Verfahren dienen der Synthese von symmetrischen, das heißt "Gemini"-oberflächenaktiven-Mitteln
auf Spermin:Peptid-Basis. Die erfindungsgemäßen nicht symmetrischen oberflächenaktiven
Mittel auf Spermin:Peptid-Basis können durch Einführen von
Asymmetrie hergestellt werden, zum Beispiel an den primären Aminen
des Spermins unter Verwendung von unterschiedlichen Schutzgruppen.
Geeignete Stickstoffschutzgruppen sind auf dem Fachgebiet bekannt
und in zum Beispiel "Protective Groups
in Organic Chemistry" (T.
W. Greene, Wiley-Interscience, New York, 2. Auflage, 1991) beschrieben.
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Eine
andere Ausführungsform
der Erfindung betrifft Verfahren zur Verwendung der oberflächenaktiven Verbindungen
auf Spermin:Peptid-Basis. Derartige Verwendungen schließen das
Erleichtern des Transfers von DNA- oder RNA-Polynucleotiden oder
von Analoga davon in eukaryontische oder prokaryontische Zellen in
vitro ein. Diese Verwendungen schließen das Erleichtern der Transfektion
von Polynucleotiden ein, um eine Antisense-Knock-out-Wirkung zu
erzielen.
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Andere
Anwendungen schließen
die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen
ein, um die Transfektion von Polynucleotiden in Zellen in Kultur
zu erleichtern, wenn ein derartiger Transfer, zum Beispiel unter
anderem in Genexpressionsstudien und in Antisense-Kontrollexperimenten
erforderlich ist. Die Polynucleotide können mit den Verbindungen gemischt,
zu den Zellen gegeben und inkubiert werden, um die Polynucleotidaufnahme
zu ermöglichen.
Nach weiterer Inkubation können
die Zellen auf phänotypische
Merkmale die durch die transfizierte DNA hervorgebracht werden,
untersucht werden, oder die Spiegel der mRNA, die von der DNA exprimiert
wird, können
durch Northern Blotting oder unter Verwendung von PCR-basierten Quantifizierungsverfahren,
zum Beispiel dem Taqman®-Verfahren (Perkin Elmer, Connecticut,
USA), bestimmt werden. Die Verbindungen der Erfindung bieten eine
signifikante Verbesserung, typischerweise zwischen 3- und 6-fach,
in der Wirksamkeit der zellulären
Aufnahme von DNA in Zellen in Kultur, verglichen mit Verbindungen
nach bisherigem Stand der Technik. Im Transfektionsprotokoll kann
die Gemini-Verbindung
in Kombination mit einer oder mehreren Zusätzen verwendet werden, um die
Wirksamkeit der Transfektion zu steigern. Derartige Zusätze können zum
Beispiel ausgewählt
werden aus:
- (i) einem neutralen Träger, zum
Beispiel Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE) (Farhood, H., et
al. (1985) Biochim. Biophys. Acta 1235, 289);
- (ii) einem Komplexbildner, zum Beispiel das im Handel erhältliche
PLUS-Reagens (Life Technologies Inc. Maryland, USA) oder Peptide,
wie Polylysin- oder Polyornithinpeptide, welche primär, aber
nicht ausschließlich
basische Aminosäuren
wie Lysin, Ornithin und/oder Arginin umfassen. Die vorstehende Liste soll
nicht erschöpfend
sein und andere Zusätze,
welche die Wirksamkeit der Transfektion steigern, sollen unter den
Umfang der Erfindung fallen.
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Noch
eine andere Ausführungsform
der Erfindung betrifft die Verfahren, um die Zuführung der Nicht-Nucleotid-basierten
Arzneistoff-Verbindungen in Zellen in vitro unter Verwendung der
erfindungsgemäßen Verbindungen
zu bewirken.
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Die
folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um das Verständnis bestimmter,
hierin häufig
verwendeter Begriffe zu erleichtern.
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"Aminosäure" bezieht sich auf
dipolare Ionen (Zwitterionen) von der Form +H3NCH(R)CO2 –.
Sie werden anhand der Natur des Restes R unterschieden, und wenn
R sich von Wasserstoff unterscheidet, können sie auch asymmetrisch
sein, wobei sie D- und L-Familien bilden. Aminosäuren können natürliche oder nicht natürliche Aminosäuren sein.
Es gibt 20 natürlich
vorkommende Aminosäuren,
wobei der R-Rest zum Beispiel nicht polar (z. B. Alanin, Leucin,
Phenylalanin) oder polar (z. B. Glutamsäure, Histidin, Arginin und
Lysin) sein kann. In Fall der nicht natürlichen Aminosäuren kann
R jeder andere Rest sein, der in Aminosäuren in der Natur nicht vorkommt.
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"Polynucleotid" bezieht sich im
Allgemeinen auf jedes Polyribonucleotid oder Polydesoxyribonucleotid, welches
unmodifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sein
kann. "Polynucleotide" schließen einzel-
oder doppelsträngige
DNA, DNA, welche ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen
ist, einzel- und doppelsträngige
RNA und RNA, welche ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen ist,
Hybridmoleküle
umfassend DNA und RNA, welche einzelsträngig oder typischer doppelsträngig oder
ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen sein kann,
ein. Zudem bezieht sich "Polynucleotid" auf dreifachsträngige Regionen
umfassend RNA oder DNA oder sowohl RNA als auch DNA. Der Begriff
Polynucleotid schließt
auch DNAs oder RNAs ein, welche eine oder mehrere modifizierte Basen
und DNAs oder RNAs mit Gerüsten
enthalten, die wegen der Stabilität oder aus anderen Gründen modifiziert
wurden. "Modifizierte" Basen schließen zum
Beispiel tritylierte Basen und unübliche Basen wie Inosin ein.
Eine Vielzahl von Modifikationen ist an DNA und RNA vorgenommen
worden; deshalb umfasst "Polynucleotid" chemisch, enzymatisch oder
metabolisch modifizierte Formen von Polynucleotiden, wie sie typischerweise
in der Natur gefunden werden, ebenso wie die chemischen Formen von
DNA und RNA, die für
Viren und Zellen charakteristisch sind. "Polynucleotid" umfasst auch relativ kurze Polynucleotide,
die häufig
als Oligonucleotide bezeichnet werden.
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"Transfektion" bezieht sich auf
die Einführung
von Polynucleotiden in Zellen in Kultur unter Verwendung von Methoden,
welche die Modifikation der Zellmembran entweder durch chemische
oder physikalische Mittel umfassen. Derartige Methoden sind zum
Beispiel in Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL,
2. Auflage, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N. Y. (1989) beschrieben. Die Polynucleotide können linear oder zirkulär, einzelsträngig oder
doppelsträngig
sein und können Elemente
einschließen,
welche die Replikation des Polynucleotids oder die Expression von
homologen oder heterologen Genen steuern, welche einen Teil des
Polynucleotids umfassen.
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Die
Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele beschrieben werden.
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BEISPIELE Beispiel
1 – Synthese
von GSC1 Schritt
1:
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Eine
Lösung
aus N-Carbethoxyphthalimid (4 mmol, 439 mg) in Chloroform (5 ml)
wurde in einer Portion bei Raumtemperatur zu einer gerührten Lösung aus
Spermin (2 mmol, 406,7 mg) in Chloroform (5 ml) zugegeben. Das Gemisch
wurde für
1 Stunde gerührt
und das Lösungsmittel
wurde entfernt, das rohe Material wurde unter starkem Vakuum getrocknet,
um die Titelverbindung ohne weitere Reinigung zu erhalten (Sosnovsky,
G. (1986) Zeitschrift für
Naturforschung 41b: 122–129).
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Das
geschützte
Spermin 350 mg, (0,76 mmol) wurde in 10 ml trockenem THF gelöst, das
Lauroylchlorid 3 eq (2,28 mmol) und 2 ml trockenes Pyridin wurden
zugegeben. Nach dem Erhitzen unter Rückfluss für 30 min wurde das Gemisch
bei Raumtemperatur über
Nacht gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde entfernt und das rohe Material wurde in AcOEt (25 ml) gelöst und mit
gesättigtem
Bicarbonat (2 × 20
ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und eingedampft. Das so erhaltene Öl wurde auf Kieselgel mit AcOEt/Hexan
(1 : 1 bis 4 : 1), Rf = 0,20 (AcOEt/Hexan 1 : 1) chromatographiert,
um 490 mg (84%) Bis-dodecyl als Öl
zu ergeben, welches als weißer,
halbfester Kristall kristallisierte. 1H-NMR
(CDCl3): 7,9–7,6 m (8H, (-C6H4-)2); 3,7–3,6 m (4H);
3,4–3,2
m (8H); 2,3–2,1
m (4H); 2,0–1,8
m (4H); 1,6–1,4
m (8H); 1,3–1,1
m (32H); 0,9–0,8
m (6H). 13C-NMR (CDCl3):
173,1, 173,0, 172,9, 172,8, 168,3, 168,2, 134,2, 134,1, 133,9, 133,8,
132,2, 132,1, 132,0, 131,9, 123,4, 123,2, 47,6, 45,7, 45,5, 45,4,
43,5, 43,4, 35,9, 33,9, 33,2, 33,1, 30,9, 29,6, 29,5, 29,4, 29,3,
29,1, 28,3, 28,2, 27,1, 26,7, 26,4, 25,5, 25,4, 25,2, 25,1, 24,9,
22,7, 14,1.
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Das
Bis-phthalimid (400 mg, 0,48 mmol) wurde in 20 ml MeOH gelöst, Hydrazinmonohydrat
0,4 ml wurde zugegeben und das Gemisch wurde für 6 h unter Rückfluss
erhitzt. Das Lösungsmittel
wurde entfernt und das rohe Material wurde in MeOH (20 ml) wieder
gelöst,
und 2 ml konzentrierte HCl wurde zugegeben. Das Gemisch wurde für 30 min
unter Rückfluss
erhitzt und das Lösungsmittel
wurde entfernt. Der Rückstand wurde
in wässrigem
NaOH 10% gelöst,
das Präzipitat
wurde filtriert und mit 3 Mengen kaltem Wasser gewaschen. Der Rückstand
wurde getrocknet, um 112 mg (41%) weißes Pulver zu ergeben. 1H-NMR (MeOH): 3,21 t (3J
= 6,8 Hz, 4H); 2,6–2,5
m (8H); 2,76 t (3J = 7,5 Hz, 4H); 1,7–1,5 m (12H);
1,4–1,2
m (32H); 0,89 t, (3J = 6,9 Hz, 6H (-CH3)2).
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Das
Diamin 100 mg (0,176 mmol), HOBt 2 eq (0,353 mmol, 54 mg), BOC2Lys 2,4 eq (0,423 mmol, 135 mg) und DIPEA
2 eq (0,353 mmol, 62 ml) wurden in CH2Cl2 (20 ml) gelöst. Das Gemisch wurde bei –10°C gekühlt und
DCC 2,4 eq (0,423 mmol, 87 mg) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde
bei –10°C gerührt und
man ließ es
sehr langsam Raumtemperatur erreichen und es wurde über Nacht
beiseite gestellt. Die DCU wurde durch Filtration entfernt und das
Lösungsmittel
wurde verdampft. Das rohe Material wurde wieder in AcOEt (30 ml)
gelöst,
nacheinander mit 4% NaHCO3 (2 × 15 ml),
4% Citronensäure
(2 × 15
ml), Wasser (20 ml) und schließlich
Salzlösung
(20 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand
wurde auf Kieselgel chromatographiert und mit Hexan/AcOEt 1/1 (Rf
= 0,01) bis AcOEt/MeOH 9/1 (Rf = 0,6) eluiert, um 152 mg (71%) als Öl zu ergeben. 1H-NMR (CDCl3): 7,05
breites Singulett (1H); 6,69 breites Singulett (1H); 5,6–4,7 m (6H);
4,9–4,1
m (4H); 3,7–3,0
m (16H); 2,2–2,0
m (6H); 2,0–1,0
m (88H); 0,88 t (3J = 6,8 Hz, 6H (-CH3)2).
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Das
tetrageschützte
Gemini 150 mg (0,12 mmol) wurde in CH2Cl2/TFA 1/1 (25 ml) gelöst und bei Raumtemperatur für 0,5 h
gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde entfernt, um die entschützten
Verbindungen als ein TFA-Salz zu ergeben, das auf anionischem Dowex
1X8 ausgetauscht wurde, um das Tetrahydrochloridsalz als ein klebriges Öl zu ergeben.
Die Verbindung wurde in kleinen Mengen MeOH wieder gelöst und mit
Ether präzipitiert,
das Lösungsmittel
wurde durch Dekantieren entfernt, dies wurde dreimal wiederholt,
um GSC1 zu ergeben. 1H-NMR (MeOH): 3,8–3,1 m (8H);
3,0–2,8
m (4H); 2,2–2,1
m (4H); 2,0–1,4
m (26H); 1,4–1,2
m (36H); 0,90 t (3J = 6,8 Hz, 6H (-CH3)2). M/z (H+): 823,75; (2H+):
412,38.
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Beispiel
2 – Synthese
von GSC4 Schritt
1:
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Das
Diamin 150 mg (0,265 mmol) wurde in 5% wässrigem Acetonitril (10 ml)
gelöst
und Triethylamin 2,2 eq (0,6 mmol, 80 μl) wurde zugegeben. Das Nα,Nε-Bis-ter-butylcarbamat-L-lysin-L-serin-O-succinimidat (durch
die übliche
Peptidsynthese aufgebaut) 2 eq (0,528 mmol, 280 mg) in Acetonitril
(8 ml) wurde langsam zugegeben. Das Gemisch wurde 48 h bei Raumtemperatur
gerührt
und das Lösungsmittel
wurde entfernt. Das rohe Material wurde wieder in AcOEt (30 ml)
gelöst
und nacheinander mit Wasser (2 × 20
ml), 3% HCl (2 × 20 ml),
Wasser (20 ml) und schließlich
Salzlösung
(20 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft, um 252 mg (68%)
zu ergeben. 1H-NMR (CDCl3):
4,9–4,1
m (4H); 3,6–3,0
m (20H); 2,2–2,0
m (8H); 2,0–1,0
m (80H); 0,88 t (3J = 6,8 Hz, 6H (-CH3)2).
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Das
tetrageschützte
Gemini 248 mg (0,177 mmol) wurde in THF/konz. HCl 1/1 (25 ml) gelöst und bei Raumtemperatur
für 1 h
gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde entfernt, um die entschützten
Verbindungen als ein klebriges, dunkles Öl zu ergeben, das in einer
kleinen Menge von MeOH wieder gelöst und mit Ether präzipitiert
wurde, das Lösungsmittel
wurde durch Dekantieren entfernt, dies wurde mehrere Male wiederholt,
um 120 mg (60%) GSC4 als pinkfarbenes Pulver zu ergeben. 1H-NMR (MeOH): 4,0–3,9 m (2H); 3,5–3,2 m;
3,1–2,9
m (4H); 2,5–2,3
m (4H); 2,3–2,1
m (1H); 2,0–1,5
m (20H); 1,4–1,2
m (32H); 0,90 t (3J = 6,8 Hz, 6H (-CH3)2).
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Beispiel
3 – Synthese
von GSC40 Schritt
1:
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Das
Diamin 120 mg (0,212 mmol), HOBt 2,5 eq (0,53 mmol, 72 mg), (BOC2Lys)Lys 2,5 eq (0,53 mmol, 426 mg) und DIPEA
2,5 eq (0,53 mmol, 92 μl)
wurden in CH2Cl2/THF
1/1 (20 ml) gelöst.
Das Gemisch wurde bei –10°C gekühlt und
DCC 2,4 eq (0,508 mmol, 105 mg) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde
bei –10°C gerührt und
man ließ es
sehr langsam Raumtemperatur erreichen und stellte es über Nacht
beiseite. Die DCU wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel
wurde verdampft. Das rohe Produkt wurde in EtOAc (30 ml) wieder
gelöst,
nacheinander mit 4% NaHCO3 (2 × 15 ml),
4% Citronensäure
(2 × 15
ml), Wasser (20 ml) und schließlich
Salzlösung
(20 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet
und bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde auf Kieselgel
chromatographiert und mit Hexan/EtOAc 1/1 (Rf = 0,01) bis EtOAc/MeOH
9/1 (Rf = 0,55) eluiert, um 210 mg (46%) als Öl zu ergeben. 1H-NMR
(CDCl3): 4,9–4,6 m (2H); 4,1–3,9 m (4H);
3,5–2,9
m (16H); 2,3–2,1
m (2H), 1,9–1,0
m (164H); 0,88 t (3J = 6,8 Hz, 6H (-CH3)2).
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Das
oktageschützte
Gemini 200 mg (0,094 mmol) wurde in THF/konz. HCl 1/1 (20 ml) gelöst und bei Raumtemperatur
für 1 h
gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde entfernt, um die entschützten
Verbindungen als ein gelbes Öl
zu ergeben, welches in einer kleinen Menge MeOH wieder gelöst und mit
Ether präzipitiert
wurde, das Lösungsmittel
wurde durch Dekantieren entfernt, dies wurde mehrere Male wiederholt,
um 130 mg (85%) GSC40 als gelbes Pulver zu ergeben.
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Beispiel
4 – Synthese
von GSC41 Schritt
1:
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Das
Diamin 200 mg (0,35 mmol) wurde in 5% wässrigem Acetonitril (20 ml)
gelöst
und Triethylamin 2 eq (0,7 mmol, 0,1 ml) wurde zugegeben. Das Bis-(Nα,Nε-bis-ter-butylcarbamat-L-lysin)-L-lysin-L-serin-O-succinimidat
2 eq (0,71 mmol, 700 mg) in Acetonitril (10 ml) wurde langsam zugegeben.
Das Gemisch wurde 48 h bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel
wurde entfernt. Das rohe Produkt wurde in AcOEt (30 ml) wieder gelöst, nacheinander
mit Wasser (2 × 20
ml), 3% HCl (2 × 20
ml), Wasser (20 ml) und schließlich Salzlösung (20
ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft, um 509 mg (63%)
zu ergeben. 1H-NMR (CDCl3):
4,9–4,6
m; 4,1–3,9
m (4H); 3,6–2,9
m (22H); 2,3–2,1
m (4H); 2,0–1,0
m; 0,88 t (3J = 6,8 Hz, 6H (-CH3)2).
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Das
tetrageschützte
Gemini 499 mg (0,216 mmol) wurde in THF/konz. HCl 1/1 (30 ml) gelöst und bei Raumtemperatur
für 1 h
gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde entfernt, um die entschützten
Verbindungen als ein klebriges, braunes Öl zu ergeben, welches in einer
kleinen Menge MeOH wieder gelöst
und mit Ether präzipitiert
wurde. Das Lösungsmittel
wurde durch Dekantieren entfernt, dies wurde mehrere Male wiederholt,
um 350 mg (90%) GSC41 als braunes Pulver zu ergeben.
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Beispiel
5 – Synthese
von GSC42 Schritt
1:
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Das
Diamin 200 mg (0,35 mmol) wurde in 5% wässrigem Acetonitril (20 ml)
gelöst
und Triethylamin 2 eq (0,7 mmol, 0,1 ml) wurde zugegeben. Das Bis-(Nα,Nε-bis-ter-butylcarbamat-L-lysin)-L-lysin-L-serin-O-succinimidat
2 eq (0,71 mmol, 700 mg) in Acetonitril (10 ml) wurde langsam zugegeben.
Das Gemisch wurde für 48
h bei Raumtemperatur gerührt
und das Lösungsmittel
wurde entfernt. Das rohe Produkt wurde in AcOEt (30 ml) wieder gelöst, nacheinander
mit Wasser (2 × 20
ml), 3% HCl (2 × 20
ml), Wasser (20 ml) und schließlich Salzlösung (20
ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft, um 522 mg (70%)
zu ergeben. 1H-NMR (CDCl3):
6,7–6,6
m (2H); 5,5–5,3
m (2H); 4,9–4,6
m (4H); 4,5–4,3
m (4H); 4,1–3,9
m (4H); 3,5–2,9
m (20H); 2,3–2,1
m (4H); 1,9–1,0
m; 0,88 t (3J = 6,8 Hz, 6H (-CH3)2).
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Das
tetrageschützte
Gemini 517 mg (0,242 mmol) wurde in THF/konz. HCl 1/1 (30 ml) gelöst und bei Raumtemperatur
für 1 h
gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde entfernt, um die entschützten
Verbindungen als klebriges dunkles Öl zu ergeben, welches in einer
kleinen Menge von MeOH wieder gelöst und mit Ether präzipitiert
wurde, das Lösungsmittel
wurde durch Dekantieren entfernt, dies wurde mehrere Male wiederholt,
um 346 mg (88%) GSC42 als braunes Pulver zu ergeben.
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Beispiel
6 – Synthese
von GSC2 Schritt
1:
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Das
geschützte
Spermin 1,23 g (2,65 mmol) wurde in 1,2-Dichlorethan (25 ml) gelöst und Dodecylaldehyd
2,5 eq. (6,6 mmol, 1,5 ml) wurde zugegeben. Nach 10 min wurde Natriumcyanoborhydrid
6 eq. (15,9 mmol, 1 g) zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht
gerührt.
Dann wurde wieder Natriumcyanoborhydrid 4,5 eq (750 mg) zugegeben
und das Gemisch wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Diese Lösung
wurde zwischen Dichlormethan (150 ml) und Wasser (150 ml) verteilt
und der pH-Wert wurde auf 9 eingestellt. Die so erhaltene Emulsion
wurde für
12 h in einem Trenntrichter belassen. Dann wurde die organische
Phase über
Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das rohe Produkt wurde auf
Kieselgel chromatographiert, mit EtOAc/Hexan 1/4 bis 1/2 (Rf: 0,3),
das 0,1% NEt3 enthielt, eluiert, um 540
mg einer halbfesten gelben Verbindung (26%) zu ergeben.
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Das
geschützte
Spermin 200 mg (0,25 mmol) wurde in Methanol (10 ml) gelöst und Hydrazinmonohydrat
10 eq (2,5 mmol, 0,13 ml) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde unter
Rückfluss
für 8 h
erhitzt und das Lösungsmittel
wurde entfernt. Das rohe Produkt wurde in 10 ml Methanol wieder
gelöst
und konz. HCl (2 ml) wurde zugegeben, das Gemisch wurde für 30 min
unter Rückfluss
erhitzt, auf Eis gekühlt
und filtriert. Das Lösungsmittel
wurde entfernt und das rohe Produkt wurde in Dichlormethan (30 ml)
wieder gelöst,
30 min bei Raumtemperatur gerührt
und das Präzipitat
wurde durch Filtration entfernt. Die Lösung wurde eingedampft und
unter vermindertem Druck getrocknet, um 150 mg GSC2 als eine gelbe
halbfeste Verbindung (88%) zu ergeben.
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Beispiel
7 – Synthese
von GSC12 Schritt
1:
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Das
Diamin 143 mg (0,265 mmol) wurde in 5% wässrig. THF (10 ml) gelöst und NEt3 0,6 mmol (80 ml), aktiviertes Peptid 2
eq. (0,528 mmol, 282 mg) in THF (5 ml) wurden zugegeben. Das Gemisch
wurde über Nacht
gerührt
und eingeengt. Dann wurde das rohe Produkt in EtOAc (60 ml) gelöst und nacheinander
mit Wasser (2 × 20
ml), 3% HCl (2 × 20
ml), Wasser (20 ml), Salzlösung
(20 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet
und das Lösungsmittel
wurde verdampft, um 210 mg einer klebrigen weißen Verbindung (58%) zu erhalten.
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Tetra-Boc
200 mg (0,146 mmol) wurde in THF/konz. HCl 1/1 (20 ml) gelöst und bei
Raumtemperatur für
1 h gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde entfernt und das rohe Produkt wurde in einer kleinen Menge
MeOH wieder gelöst
und mit Ether präzipitiert,
auf –20°C gekühlt, das
Lösungsmittel
wurde durch Dekantieren entfernt, dies wurde mehrere Male wiederholt,
um 150 mg (87%) GSC12 als ein gelbes Pulver zu ergeben.
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Beispiel 8. Transfektion
von rekombinantem, Luciferase exprimierendem Plasmid in Zellen unter
Verwendung von oberflächenaktiven
Verbindungen auf Spermin:Peptid-Basis
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Die
Transfektionsstudien wurden unter Verwendung der adhärenten Zelllinie
CHO-K1 (Puck et al., 1958) durchgeführt. Das vollständige Medium
bestand aus MEM Alphamedium ergänzt
mit 10% Vol./Vol. fötalem
Rinderserum und 1 × L-Glutamin.
Alle Medien und Zusätze
wurden von Life Technologies erhalten.
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Es
wurden stabil transfizierte Zelllinien, welche β-Galactosidase exprimieren,
durch Co-transfektion des
Plasmid pSV-β-Galactosidase-Kontrollvektors
(Promega) mit dem Plasmid Selecta Vecta-Neo (R & D Systems) in einem 10 : 1 Verhältnis erzeugt.
Nach der G418- (Life Technologies) Selektion (0,8 mg ml–1)
wurden die Kandidaten-Zelllinien auf β-Galactosidaseaktivität getestet
(β-Gal Reportergentest,
chemilumineszierend; Roche Diagnostics).
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In vitro Gentransfektion
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Die
Zellen wurden in MTP-Platten mit 96 Vertiefungen (Beckton Dickinson)
16–18
Stunden vor der Transfektion in einer ungefähren Dichte von 1 × 104 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Zur Transfektion
wurden 64 ng Luciferase-Reportergenplasmid, pGL3-Kontrollvektor
(Promega), pro Vertiefung mit verschiedenen Konzentrationen der
oberflächenaktiven
Verbindungen auf Spermin:Peptid-Basis und Komplexbildnern inkubiert. Nach
30 Minuten Inkubation bei RT wurde OPTI-MEM®-Medium
(Life Technologies) zu dem Transfektionsgemisch zugegeben und die
Lösung
wurde auf die Zellen (finales Volumen pro Vertiefung: 100 μl) gegeben.
Nach einer 3-stündigen
Inkubation oder einer Inkubation über Nacht bei 37°C wurde die
Transfektionslösung
mit vollständigem
Medium ersetzt und die Zellen wurden weiter bei 37°C inkubiert.
Es wurden annähernd
48 Stunden nach der Transfektion Reportergentests gemäß den Anleitungen
des Herstellers (Roche Diagnostics) durchgeführt. Die Lumineszenz wurde
in einem Packard TopCount NXT Mikroplatten Szintillations- und Lumineszenz-Zähler gemessen.
Zum Zweck der Normalisierung wurde die β-Galactosidaseaktivität (β-Gal Reportergentest,
chemilumineszierend; Roche Diagnostics) gemessen und die Luciferaseaktivität wurde
pro β-Galactosidaseaktivität berechnet.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1a und 1b.
Das allgemeine Syntheseschema der oberflächenaktiven Verbindungen auf
Spermin:Peptid-Basis, wobei die Carbonylgruppen (in diesem Fall
Dodecanoyl) mit der Spermineinheit durch Amidbindungen verbunden
sind. Die finale Verbindung in 1a ist
die erste Verbindung in 1b.
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2a und 2b.
Das allgemeine Syntheseschema der oberflächenaktiven Verbindungen auf
Spermin:Peptid-Basis, wobei die Carbonylgruppen (in diesem Fall
Dodecanoyl) mit der Spermineinheit durch Aminbindungen verbunden
sind. Die finale Verbindung in 2a ist
die erste Verbindung in 2b.
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3.
Transfektion von CHO-K1-Zellen (stabil mit beta-Galactosidase transfiziert)
mit den Gemini-oberflächenaktiven-Mitteln
auf Spermin:Peptid-Basis GS-C-1, GS-C-2, GS-C-3, GS-C-4 und GS-C-12.
Die Balken repräsentieren
die mittleren cps (Zählungen
pro Sekunde) von 8 Experimenten ± Standardabweichung des Mittels.