JP5653348B2 - ポリアミドアミンデンドロンを含む遺伝子導入剤組成物 - Google Patents
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Description
項1.下記式DL−G1〜DL−G4のいずれかで表される化合物を含む遺伝子導入剤組成物であって
DL−G1:R1R2NX(XH2)2
DL−G2:R1R2NX(X(XH2)2)2
DL−G3:R1R2NX(X(X(XH2)2)2)2
DL−G4:R1R2NX(X(X(X(XH2)2)2)2)2
(Xは、−CH2CH2CONHCH2CH2N−を示す。)、
上記式中R1が不飽和長鎖脂肪族基であり、かつR2が不飽和長鎖脂肪族基又は飽和長鎖脂肪族基であることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。
項2.長鎖脂肪族基が炭素数10〜22の脂肪族基である、項1に記載の組成物。
項3.不飽和長鎖脂肪族基がヘキサデセニル基、オクタデセニル基、オクタデカジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサペンタエニル基、又はドコサヘキサエニル基である、項1に記載の組成物。
項4.さらにリン脂質を含む項1〜3のいずれかに記載の組成物。
項5.リン脂質がDOPEである項4に記載の組成物。
項6.項1〜5のいずれかに記載の組成物を遺伝子とともにイン・ビトロまたはイン・ビボ(ただし、ヒトを除く)で細胞に適用することを特徴とする遺伝子の細胞への導入方法。
項7.項1〜5のいずれか1項に記載の組成物を含有する遺伝子導入用キット。
DL−G1:R1R2NX(XH2)2
DL−G2:R1R2NX(X(XH2)2)2
DL−G3:R1R2NX(X(X(XH2)2)2)2
DL−G4:R1R2NX(X(X(X(XH2)2)2)2)2
(Xは、−CH2CH2CONHCH2CH2N−を示す。)、
上記式中R1が不飽和長鎖脂肪族基であり、かつR2が不飽和長鎖脂肪族基又は飽和長鎖脂肪族基であることを特徴とする遺伝子導入剤組成物である。
Xは、−CH2CH2CONHCH2CH2N−を表し、その末端のNは、通常2個の水素原子を有するが、1個の水素原子がロイシン、バリン、イソロイシン、ノルロイシン、フェニルアラニン、チロシンなどの疎水性アミノ酸で置換されていてもよい。
R1は不飽和長鎖脂肪族基である。
本発明のポリアミドアミンデンドロンは、例えば以下のようにして製造することができる。
本発明の好ましいポリアミドアミンデンドロンを以下に示す。
本発明の遺伝子導入剤組成物は、ポリアミドアミンデンドロンの他に、リン脂質を好適に含むことができる。このようなリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスマロゲンおよびホスファチジン酸等を挙げることができ、これらは1種または2種以上を組み合わせて用いることができる。このうち、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファリジルコリンをそれぞれ単独で、または組み合わせて用いるのが好ましい。これらのリン脂質の脂肪酸残基は、特に限定されるべきものではないが、炭素数12から18の飽和または不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、具体的には、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、オレオイル基、リノレイル基等を挙げることができ、DOPE(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)が特に好ましい。
1.ポリアミドアミンデンドロンの合成
(1)オレイルオレオイルアミド(Oleyloleoylamide)の合成
Oleoylchloride 7.78ml(20.0×10-3mol)をジクロロメタン100mlに溶解して、十分にN2ガス置換した。反応容器を氷水浴で冷やし、撹拌しながら、これにジクロロメタン50ml にOleylamine 9.40ml(20.0×10-3mol)、トリエチルアミン3.3ml(0.024mol)を溶解したものを滴下ロートを用いてゆっくりと滴下した。その後、室温で70時間、N2ガス注入下で攪拌した。反応終了後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した。得られた粗生成物をオープンカラムクロマトグラフィーにより分離精製した(展開溶媒:クロロホルム/酢酸エチル=2/1、充填材:シリカゲル)。得られた粗結晶を、エタノールを用いて-20℃で再結晶した。白色の固体として得られた生成物を、常温で減圧乾燥した。
Oleyloleoylamide(化4)2.84g(5.33×10-3mol)をテトラヒドロフラン(THF) 80mlに溶解した。これを、THF 80mlにリチウムアルミニウムヒドリド(LAH) 1.40g(37.0×10-3mol)を少しずつ加え作成した懸濁液に滴下ロートを用いてゆっくりと滴下した。その後、50℃で8日間攪拌した。反応終了後、吸引濾過して濾別したLAHを、THFで1回、クロロホルムで2回、エタノールで1回洗浄した。再びLAHを濾別し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去した。その後、飽和食塩水で3回洗浄後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。得られた粗生成物をオープンカラムクロマトグラフィーにより分離精製した(展開溶媒:クロロホルム/酢酸エチル=2/1→クロロホルム/メタノール=9/1、充填材:シリカゲル)。黄色の油状物質として得られた生成物を、常温で減圧乾燥した。常温で減圧乾燥した。
Dioleylamine 1.59g(3.07×10-3mol)をアクリル酸メチル28ml(0.31mol)に溶解して、70℃で、N2ガス注入下で攪拌した。TLCより反応があまり進んでいないことを確認したため、反応開始後48時間、136時間でアクリル酸メチルを14mlずつ追加した(合計56ml)。反応終了後(168時間)、ロータリーエバポレーターを用いて未反応のアクリル酸メチルを留去し、得られた粗生成物をオープンカラムクロマトグラフィーにより分離精製した(展開溶媒:クロロホルム/酢酸エチル=2/1、充填材:シリカゲル)。黄色の油状物質として得られた生成物を、常温で減圧乾燥した。
DL−G−0.5−2C18−U21.42g(2.35×10-3mol)をメタノール100mlに加熱溶解した。これをシアン化ナトリウム 25.4mg(0.52×10-3mol)を含む、蒸留精製したエチレンジアミン70ml(1.05mol)にパスツールピペットを用いてゆっくりと滴下した。その後、70℃で7日間、N2ガス注入下で攪拌した。反応終了後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒、未反応のエチレンジアミンを留去し、得られた粗生成物をオープンカラムクロマトグラフィーにより分離精製した(展開溶媒:クロロホルム/メタノール/水=60/35/5、充填材:シリカゲル)。黄色のペースト状物質として得られた生成物を、常温で減圧乾燥した。
DL-G0-2C18 0.45g(0.71×10-3mol)をメタノール45mlに加熱溶解した。これをアクリル酸メチル30ml(0.33mol)にパスツールピペットを用いてゆっくりと滴下した。その後、45℃で48時間、N2ガス注入下で還流した。反応終了後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒、未反応のアクリル酸メチルを留去し、得られた粗生成物をオープンカラムクロマトグラフィーにより分離精製した(展開溶媒:石油エーテル/酢酸エチル=10/3→クロロホルム/メタノール=4/1、充填材:シリカゲル)。黄色の油状物質として得られた生成物を、常温で減圧乾燥した。
DL-G0.5-2C18 0.45g(0.56×10-3mol)をメタノール13mlに加熱溶解した。これをシアン化ナトリウム 12.0mg(0.25×10-3mol)を含む、蒸留精製したエチレンジアミン24ml(0.36mol)にパスツールピペットを用いてゆっくりと滴下した。その後、50℃で45時間、N2ガス注入下で攪拌した。反応終了後、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒、未反応のエチレンジアミンを留去した。黄色の固体として得られた生成物を常温で減圧乾燥した。塩酸によってプロトン化し、蒸留水に溶解させた後、3日間透析することで未反応のエチレンジアミン等を除去し、凍結乾燥して黄色の粉末状固体を得た。
(1)ポリアミドアミンデンドロンとプラスミドDNAとのリポプレックスの調製
実施例1で得たDL−G1−2C18−U2のクロロホルム溶液からロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して、脂質薄膜を形成させた。これにPBSを加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を2分間照射し、脂質分散液を調製した。次に、20mMTris−HClのプラスミドDNA溶液(1μg/50μl)と種々の濃度の脂質分散液(50μl)を加えて混合し、室温で10分間インキュベーションして、リポプレックスを得た。
DL−G1−2C18−U2と種々の量のDOPEからなる混合薄膜に、PBS 0.5mlを加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を2分間照射し、混合脂質分散液を調製した。20mMTris−HClのプラスミドDNA溶液(1μg/50μl)に混合脂質分散液を種々のN/P(DL−G1−2C18−U2の1級アミノ基/DNAのリン酸エステル、モル/モル)比に混合し、室温で10分インキュベーションしてリポプレックスを調製した。
次の通りDL−G1−2C18を合成した。
Dioctadecylamine(2.0g、3.8 mmol)をアクリル酸メチル(35ml、0.39 mol)に溶解(60-70℃に加熱すると溶解)し、窒素雰囲気で還流(80℃)した。18時間後、エバポレーターで未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカ(展開溶媒:石油エーテル/ジエチルエーテル=2/1)により精製した。生成物の収量は2.0gであり、収率は87.9%であった。
DL−G−0.5 (2.0g、3.4 mmol)をメタノール(40ml)に溶解した。(加熱によって溶ける)これをシアン化ナトリウム(33mg、0.67 mmol)を含む蒸留して精製したエチレンジアミン(70ml、1.05mol)に滴下して加え、窒素雰囲気下、50℃で7日間撹拌した。その後、シリカ(展開溶媒:クロロホルム/メタノール/水=60/35/5)により精製した。生成物の収量は1.4gであり、収率は53.2%であった。
DL−G−0(1.2g、1.9 mmol)をメタノール(20ml)に溶解した。これをアクリル酸メチル(34ml、0.38 mol)に滴下して加え、窒素雰囲気下、35℃で50時間撹拌した。その後、シリカ(展開溶媒:石油エーテル/ジエチルエーテル=2/1、のちクロロホルム/メタノール=9/1)により精製した。生成物の収量は1.5gであり、収率は97.7%であった。
DL−G−0.5(1.5g、1.8 mmol)をメタノール(50ml)に溶解した。これをシアン化ナトリウム(18mg、0.37 mmol)を含む蒸留して精製したエチレンジアミン(65ml、0.92mol)に滴下して加え、窒素雰囲気下、45℃で60時間撹拌した。その後、LH-20(溶離液:クロロホルム)により精製した。生成物の収量は1.5gであり、収率は94.3%であった。
1.方法
(1)遺伝子導入
ヒト子宮頸がん由来HeLa細胞を24穴ディッシュ1穴当たり5.0×104個になるように撒き、10%FBS含有DMEMメディウム0.5ml中、37℃で一晩培養した。その後、0.36mM CaCl2と0.42mM MgCl2を含むPBS(PBS(+))で2回洗浄した後、10%FBS含有DMEMメディウム0.5mlを加え、1穴当たり1マイクログラムのプラスミドDNAを含むリポプレックス(100マイクロリットル)を細胞に加え、37℃で4時間インキュベーションした。その後PBS(+)で3回洗浄して、細胞に取り込まれていないリポプレックスを除去し、10%FBS含有DMEMメディウム1mlを加え37℃で40時間培養した。
リポプレックスと処理し、40時間培養した後、PBS(+)で2回洗浄し、さらにPBS(−)で1回洗浄した後、1穴当たり50μlの細胞溶解剤を加えて細胞を溶かし、12000rpmで2分間遠心分離し、その上澄みを回収した。得られた細胞溶解液のルシフェラーゼ活性及びタンパク量を、シフェラーゼアッセイおよびCoomassie(Bradford)Protein Assay Kit(PIERCE) により行った。なお、ルシフェラーゼアッセイは、トリシン(358 mg)、および(MgCO3)4Mg(OH)2・5H2O(69.3 mg)を蒸留水に溶かし、さらにMgSO4(32.1 mg)、EDTA(3.7 mg)、DTT(513.6 mg)、CoA(20.7 mg)、ATP(29.2mg)、NaCl(800 mg)、KCl(20mg)、Na2HPO4(60 mg)、KH2PO4(19 mg)を加え溶解させた後、全量を99 mlにし、この溶液(9.9 ml)に、47 mM ルシフェリン(0.1 ml)を加えてたものを発光基質液として用い、この発光基質溶液(20 μl)を、ルシフェリン(13.5 μg)を含んだ発光基質液(95 μl)、及び5 mg / ml アルブミン溶液(5 ml)と混合し、ルミノメーターLumat LB9507(ベルトールドジャパン)を使って20秒間の発光量を測定することにより行った。
図7及び8に示されるように、本発明の遺伝子導入剤(G1−U2)は、ポリアミドアミンデンドロンのR1及びR2がいずれも飽和アルキル基である遺伝子導入剤(G1)に比べて2倍を上回る非常に高い遺伝子導入効率を発現することが明らかになった。これは予想を遙かに超える遺伝子導入効率であった。
実施例1で得た、R1及びR2のいずれもが不飽和アルキル基であるDL−G1−2C18−U2(DL−U2)と、R1及びR2のいずれもが飽和アルキル基であるDL−G1−2C18(DL−G1)との比較を次の通り行った。
(1)リポプレックスの調製
緑色蛍光タンパク質を発現するプラスミドDNAであるpEGFP-C1を用いて、以下の手順でリポプレックスを作製した。
ポリアミドアミンデンドロン(DL-G1、DL-G1-U2)のクロロホルム溶液(1mg/ml)からロータリーエバポレータを用いて溶媒を除去して脂質薄膜111.5μgを形成させた。この薄膜を2時間真空乾燥させた後、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)500μlを加えた。さらにバス型超音波照射装置を用いて超音波を2分間照射し、脂質分散液160μlを得た。それぞれの脂質分散液に、プラスミドDNAを20 mM Tris-HCl緩衝液に溶解させた溶液(20μg/ml、160μl)を様々なN/P比となるように加えて混合し、室温で30分インキュベートすることによりリポプレックスを得た。
前日
COS7細胞を24ウェルプレートに播種した。
(COS7細胞:2.0×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
当日
(i) 20mM Tris-HCl(pH7.4)バッファーに、2.0μg のプラスミドDNA(pCAG-GFP) を添加し、2.0μg/100μl となるように調製した。
(ii) (i)で調製した100μl のプラスミドDNA 溶液に、50μl のDL-G1, DL-U2リポソーム溶液(N/P比=4)を加え、ボルテックスでよく混合し、室温で30 分間インキュベートした。
(iii) さらに50μl のOpti-MEM(登録商標) I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(iv) 1 ウェルあたり20、50、又は100 μl のDL- プラスミドDNA 複合体溶液を加え、均一になるようプレートを揺らして混合した。
(v) 37℃、5%CO2 下、細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
(vi) 48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてGFP発現細胞を観察した(100倍観察)。
前日
COS7細胞を24ウェルプレートに播種した。
(COS7細胞:2.0×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
当日
(i) 20mM Tris-HCl(pH7.4)バッファーを、3本のチューブにそれぞれ363μl(NP比=2 用)、288μl(NP比=4 用)、又は138μl(NP比=8 用)分注した。
(ii) 6.0μg のプラスミドDNA(pEGFP-luc+) を(i)で用意した3本のチューブにそれぞれ12μl(6.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) DL-G1, DL-U2リポソーム溶液を(ii)で調整した3本のチューブにそれぞれ75μl(N/P比=2)、150μl(N/P比=4)、又は300μl(N/P比=8)添加した。
(iv) さらに150μl のOpti-MEM(登録商標) I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置。
(v) 1 ウェルあたり20, 50, 100 μl のDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々3ウェルに加え、混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下で細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
(vii) 24時間後、luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
結果を図9(GFP発現)及び10(ルシフェラーゼ活性測定)に示す。
実施例1で得た、DL−U2とDL−G1との比較を次の通り行った。
リポプレックスの調製は実施例3と同様に行った。
(1)GFPの発現
前日
NHDF-ad細胞を24ウェルプレートに播種した。
(NHDF-ad細胞:2.5×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
当日
(i) 20mM Tris-HCl(pH7.4)バッファーを、2本のチューブにそれぞれ56.3μl(NP比=3 用),37.5μl(NP比=6 用), 138μl(NP比=8 用) 分注した。
(ii) 1.0μg のプラスミドDNA(pCAG-GFP) を(i)で用意した2本のチューブにそれぞれ2μl(1.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) 調製したプラスミドDNA 溶液に、18.7μl のDL-G1(N/P比=3), 37.5μlのDL-U2リポソーム溶液(N/P比=6)をそれぞれ加え、ボルテックスでよく混合し、室温で30 分間インキュベートした。
(iv) さらに25μl のOpti-MEM(登録商標) I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) 1 ウェルあたり50μl のDL- プラスミドDNA 複合体溶液を加え、均一になるようプレートを揺らして混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下、細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
(vii) 48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてGFP発現細胞を観察した(100倍観察)。
前日
NHDF-ad細胞を24ウェルプレートに播種した。
(NHDF-ad細胞:2.5×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
当日
(i) 20mM Tris-HCl(pH7.4)バッファーを、3本のチューブにそれぞれ363μl(NP比=2 用),288μl(NP比=4 用), 138μl(NP比=8 用) 分注した。
(ii) 6.0μg のプラスミドDNA(pEGFP-luc+) を(i)で用意した3本のチューブにそれぞれ12μl(6.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) DL-G1, DL-U2リポソーム溶液を(ii)で調整した3本のチューブにそれぞれ75μl(N/P比=2), 150μl(N/P比=4), 300μl(N/P比=8)添加した。
(iv) さらに150μl のOpti-MEM(登録商標) I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) 1 ウェルあたり20, 50, 100 μl のDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々3ウェルに加え、混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下で細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
(vii) 48時間後、luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
結果を図11(GFP発現)及び12(ルシフェラーゼ活性測定)に示す。
実施例1で得たDL−U2と市販の遺伝子導入剤との比較を次の通り行った。
リポプレックスの調製は実施例3と同様に行った。
(1)GFPの発現
前日
COS7細胞、HeLa-S3を24ウェルプレートに播種した。
(COS7細胞:2.0×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
(HeLa-S3細胞:3× 104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
当日
K562細胞を24ウェルプレートに播種した。
(1× 105 cell / ウェル・RPMI1640+10%FBS(Pe/St) 500μl)
(i) 20mM Tris-HCl(pH7.4)バッファーを、3本のチューブにそれぞれ35..5μl(NP比=6 用)×2本, 23μl(NP比=8 用) 分注した。
(ii) 1.0μg のプラスミドDNA(pCAG-GFP) を(i)で用意した3本のチューブにそれぞれ2μl(1.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) DL-U2リポソーム溶液を(ii)で調整した3本のチューブにそれぞれ37.5μl(N/P比=6)×2本, 50μl(N/P比=8)添加した。
(iv) さらに25μl のOpti-MEM(登録商標) I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) COS7細胞に、100μlのDL- プラスミドDNA 複合体溶液(N/P比=6)を加え、混合した。
HeL-S3細胞に、100μlのDL- プラスミドDNA 複合体溶液(N/P比=6)を加え、混合した。
K562細胞に、50μlのDL- プラスミドDNA 複合体溶液(N/P比=8)を加え、混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下で細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した (K562細胞は培地交換しなかった)。
(vii) 48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてGFP発現細胞を観察した。
・Lipofectamine LTX : プロトコールに従い遺伝子導入し、48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてGFP発現細胞を観察した。
DNA量 COS7 :1.0μg, HeLa-S3 :1.0μg, K562 :0.5μg
・FuGENE HD : プロトコールに従い遺伝子導入し、48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてGFP発現細胞を観察した。
DNA量 COS7 :1.0μg, HeLa-S3 :1.0μg, K562 :0.5μg
前日
COS7細胞、HeLa-S3を24ウェルプレートに播種した。
(COS7細胞:2.0×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
(HeLa-S3細胞:3× 104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
当日
K562細胞を24ウェルプレートに播種した。
(1× 105 cell / ウェル・RPMI1640+10%FBS(Pe/St) 500μl)
(i) 20mM Tris-HCl(pH7.4)バッファーを、3本のチューブにそれぞれ144μl(NP比=4 用) 分注した。
(ii) 3.0μg のプラスミドDNA(pEGFP-luc+) を(i)で用意した3本のチューブにそれぞれ6μl(3.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) DL-U2リポソーム溶液を(ii)で調整した3本のチューブにそれぞれ75μl(N/P比=4)×3本 添加した。
(iv) さらに75μl のOpti-MEM(登録商標) I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) COS7細胞に、50μlのDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々3ウェルに加え、混合した。
HeL-S3細胞に、50μlのDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々3ウェルに加え、混合した。
K562細胞に、100μlのDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々3ウェルに加え、混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下で細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した(K562細胞は培地交換しなかった)。
(vii) 48時間後、luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した(LTXの活性を1とした相対値をグラフ化した)。
・Lipofectamine LTX : プロトコールに従い3ウェルに遺伝子導入し、48時間後、luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
DNA量 COS7 :0.2μg, HeLa-S3 :0.2μg, K562 :1.0μg
・FuGENE HD : プロトコールに従い3ウェルに遺伝子導入し、48時間後、luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
DNA量 COS7 :0.5μg, HeLa-S3 :0.5μg, K562 :1.0μg
結果を図13(GFP発現)、14(ルシフェラーゼ活性測定)、及び15(毒性評価)に示す。
現在よく使用されている市販の遺伝子導入剤であるリポフェクタミンLTX、及びFuGENE HDと本発明のポリアミドアミンデンドロンとの間で遺伝子導入活性の比較を行ったところ、接着性細胞(COS-7及びHeLa-S3)、並びに浮遊性細胞(K562)のいずれに対しても、本発明のポリアミドアミンデンドロンはより優れた遺伝子導入活性を示し、かつより細胞毒性が低かった。
実施例1で得たDL−U2と市販の遺伝子導入剤との比較を次の通り行った。
リポプレックスの調製は実施例3と同様に行った。
(1)GFPの発現
前日
NHDF-ad細胞を24ウェルプレートに播種した。
(NHDF-ad細胞:2.5×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
当日
(i) 20mM Tris-HCl(pH7.4)バッファーを、2本のチューブにそれぞれ56.3μl(NP比=3 用),37.5μl(NP比=6 用), 138μl(NP比=8 用) 分注した。
(ii) 1.0μg のプラスミドDNA(pCAG-GFP) を(i)で用意した2本のチューブにそれぞれ2μl(1.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) 調製したプラスミドDNA 溶液に、18.7μl のDL-G1(N/P比=3), 37.5μlのDL-U2リポソーム溶液(N/P比=6)をそれぞれ加え、ボルテックスでよく混合し、室温で30 分間インキュベートした。
(iv) さらに25μl のOpti-MEM(R) I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) 1 ウェルあたり50μl のDL- プラスミドDNA 複合体溶液を加え、均一になるようプレートを揺らして混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下、細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
(vii) 48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてGFP発現細胞を観察した(100倍観察)。
・Lipofectamine LTX : プロトコールに従い遺伝子導入し、48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてGFP発現細胞を観察した。
(100倍観察)
DNA量 0.2μg
・FuGENE HD : プロトコールに従い遺伝子導入し、48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてGFP発現細胞を観察した。
(100倍観察)
DNA量 0.2μg
・FuGENE6 : プロトコールに従い遺伝子導入し、48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてGFP発現細胞を観察した。
(100倍観察)
DNA量 1.0μg
前日
NHDF-ad細胞を24ウェルプレートに播種した。
(NHDF-ad細胞:2.5×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
当日
(i) 20mM Tris-HCl(pH7.4)バッファーを、2本のチューブにそれぞれ162.75μl(DL-G1用),106.5μl(DL-U2用) 分注した。
(ii) 3.0μg のプラスミドDNA(pEGFP-luc+) を(i)で用意した3本のチューブにそれぞれ6μl(3.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) 調製したプラスミドDNA 溶液に112.5μlのDL-U2リポソーム溶液(N/P比=6)を加え、ボルテックスでよく混合し、室温で30 分間インキュベートした。
(iv) さらに75μl のOpti-MEM(R) I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) 1 ウェルあたり20, 50μl のDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々3ウェルに加え、混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下で細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
(vii) 48時間後、luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
・Lipofectamine LTX : プロトコールに従い遺伝子導入し、luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
DNA量 0.2μg, 0.5μg
・FuGENE HD : プロトコールに従い遺伝子導入し、 luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
DNA量 0.2μg, 0.5μg
・FuGENE6 : プロトコールに従い遺伝子導入し、 luciferase assay system(Promega, E1501 )のプロトコールに従い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
DNA量 0.2μg, 0.5μg
前日
NHDF-ad細胞を96ウェルプレートに播種した。
(NHDF-ad細胞:3.5×103 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 70μl)
当日
(i) 20mM Tris-HCl(pH7.4)バッファーを、2本のチューブにそれぞれ54.25μl(DL-G1用),35.5μl(DL-U2用) 分注した。
(ii) 1.0μg のプラスミドDNA(pEGFP-luc+) を(i)で用意した2本のチューブにそれぞれ2μl(1.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) 調製したプラスミドDNA 溶液に37.5μlのDL-U2リポソーム溶液(N/P比=6)を加え、ボルテックスでよく混合し、室温で30 分間インキュベートした。
(iv) さらに25μl のOpti-MEM(R) I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) 1 ウェルあたり2.8, 7.0μl のDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々3ウェルに加え、混合した(添加量は、ルシフェラーゼ活性測定の添加量のスケールの1/7)。
(vi) 37℃、5%CO2 下で細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
(vii) 48時間後、WST-8キット(キシダ化学)のプロトコールに従い、毒性評価を行った (未添加のウェルを100%とした) 。
・Lipofectamine LTX : プロトコールに従い遺伝子導入し、 WST-8キット(キシダ化学)のプロトコールに従い、毒性評価を行った (未添加のウェルを100%とした)。
・FuGENE HD : プロトコールに従い遺伝子導入し、 WST-8キット(キシダ化学)のプロトコールに従い、毒性評価を行った (未添加のウェルを100%とした)。
・FuGENE6 : プロトコールに従い遺伝子導入し、 WST-8キット(キシダ化学)のプロトコールに従い、毒性評価を行った (未添加のウェルを100%とした)。
結果を図16(GFP発現)、17(ルシフェラーゼ活性測定)、及び18(毒性評価)に示す。
成人ヒト由来正常上皮細胞に対しては、市販導入剤を用いてもGFP遺伝子をほとんど導入できなかったのに対して、本発明のポリアミドアミンデンドロンを用いると顕著に高い頻度で導入できることがわかった。
実施例1で得た、DL−U2と市販の遺伝子導入剤との比較を次の通り行った。
リポプレックスの調製は実施例3と同様に行った。
(1)GFPの発現
前日
NHDF-ad細胞を24ウェルプレートに播種した。
(NHDF-ad細胞:2×104 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 500μl)
一日目
(i) 20mM Tris-HCl(pH7.4)バッファーをチューブに71μl(NP比=6 用)分注した。
(ii) 2.0μg のプラスミドDNA(pCAG-GFP) を(i)で用意した2本のチューブにそれぞれ4μl(2.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) 調製したプラスミドDNA 溶液に、75μlのDL-U2リポソーム溶液(N/P比=6)を加え、ボルテックスでよく混合し、室温で30 分間インキュベートした。
(iv) さらに50μl のOpti-MEM(R) I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) 1 ウェルあたり100μlのDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々1ウェルに加え、均一になるようプレートを揺らして混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下、細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
1dayに遺伝子導入操作を行った細胞について、3day, ,5dayも同様の遺伝子導入を行った。
7day 蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてGFP発現細胞を観察した(40倍観察)。
・Lipofectamine LTX : 1day, 3day, 5dayに、同一細胞についてプロトコールに従い遺伝子導入し、7dayに蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてGFP発現細胞を観察した。
(100倍観察)
DNA量 1.0μg
・FuGENE HD : 1day, 3day, 5dayに、同一細胞についてプロトコールに従い遺伝子導入し、7dayに蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてGFP発現細胞を観察した。
(100倍観察)
DNA量 1.0μg
・FuGENE6 : 1day, 3day, 5dayに、同一細胞についてプロトコールに従い遺伝子導入し、7dayに蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてGFP発現細胞を観察した。
(100倍観察)
DNA量 1.0μg
前日
NHDF-ad細胞を96ウェルプレートに播種した。
(NHDF-ad細胞: 3.5×103 cell / ウェル・DMEM+10%FBS(Pe/St) 70μl)
一日目
(i) 20mM Tris-HCl(pH7.4)バッファーをチューブに35.5μl(NP比=6 用)分注した。
(ii) 1.0μg のプラスミドDNA(pCAG-GFP) を(i)で用意した2本のチューブにそれぞれ2μl(1.0μg)添加し、攪拌した。
(iii) 調製したプラスミドDNA 溶液に、37.5μlのDL-U2リポソーム溶液(N/P比=6)を加え、ボルテックスでよく混合し、室温で30 分間インキュベートした。
(iv) さらに25μl のOpti-MEM(R) I Reduced-Serum Mediumを添加し、よく混合し、室温で5 分間静置した。
(v) 添加量は、ルシフェラーゼ活性測定の添加量のスケールの1/7。
1 ウェルあたり7μl , 14μlのDL- プラスミドDNA 複合体溶液を各々3ウェルに加え、均一になるようプレートを揺らして混合した。
(vi) 37℃、5%CO2 下、細胞を4 時間インキュベートし、新しい増殖培地に交換した。
1dayに遺伝子導入操作を行った細胞について、3day、及び5dayも同様の遺伝子導入を行った。
7day WST-8キット(キシダ化学)のプロトコールに従い、毒性評価を行った。
(未添加 のウェルを100%とした)
・Lipofectamine LTX : 1day, 3day, 5dayに、同一細胞についてプロトコールに従い遺伝子導入し、7dayにWST-8キット(キシダ化学)のプロトコールに従い、毒性評価を行った (未添加のウェルを100%とした) 。
添加量は、ルシフェラーゼ活性測定の添加量のスケールの1/7。
・FuGENE HD : 1day, 3day, 5dayに、同一細胞についてプロトコールに従い遺伝子導入し、7dayにWST-8キット(キシダ化学)のプロトコールに従い、毒性評価を行った (未添加のウェルを100%とした) 。
添加量は、ルシフェラーゼ活性測定の添加量のスケールの1/7。
・FuGENE6 : 1day, 3day, 5dayに、同一細胞についてプロトコールに従い遺伝子導入し、7dayにWST-8キット(キシダ化学)のプロトコールに従い、毒性評価を行った (未添加のウェルを100%とした) 。
添加量は、ルシフェラーゼ活性測定の添加量のスケールの1/7。
結果を図19(GFP発現)、及び20(毒性評価)に示す。それぞれ最初のトランスフェクションから7日経過時のデータを示している。
iPS細胞を作製するには、複数回遺伝子導入する必要がある。その状況を想定して、成人ヒト正常上皮細胞への遺伝子導入を複数回行った際における効果について、本発明のポリアミドアミンデンドロンと市販ベクターとの比較を行った。FuGENE 6は、遺伝子導入活性を示さなかった。本発明のポリアミドアミンデンドロンは最も高効率に遺伝子発現させることができるだけでなく、最も低毒性であった。したがって、iPS細胞の作製のために利用できる遺伝子導入剤という面においても、本発明のポリアミドアミンデンドロンは特に優れていることがわかった。
実施例1で得た、DL−U2を用いて、各種細胞株に対するトランスフェクションを次の通り行った。
トランスフェクションの条件は表1に示す通りとした。添加4時間後、培地交換した(Jurkat,K562は培地交換していない)。48時間後、蛍光顕微鏡(OLYMPUS, CKX41)にてGFP発現細胞を観察した。なお、ここに記載されていない実験条件は、他の実施例におけるものに準じたものとした。
結果を図21に示す。
Claims (5)
- 下記式DL−G1〜DL−G4のいずれかで表される化合物を含む遺伝子導入剤組成物であって
DL−G1:R1R2NX(XH2)2
DL−G2:R1R2NX(X(XH2)2)2
DL−G3:R1R2NX(X(X(XH2)2)2)2
DL−G4:R1R2NX(X(X(X(XH2)2)2)2)2
(Xは、−CH2CH2CONHCH2CH2N−を示す。)、
上記式中R1が炭素数10〜22の不飽和長鎖脂肪族基であり、かつR2が炭素数10〜22の不飽和長鎖脂肪族基又は炭素数10〜22の飽和長鎖脂肪族基であることを特徴とする遺伝子導入剤組成物。 - さらにリン脂質を含む請求項1に記載の組成物。
- リン脂質がDOPEである請求項2に記載の組成物。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の組成物を遺伝子とともにイン・ビトロまたはイン・ビボ(ただし、ヒトを除く)で細胞に適用することを特徴とする遺伝子の細胞への導入方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物を含有する遺伝子導入用キット。
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