KR100807060B1

KR100807060B1 - 신규한 양이온성 지질, 그의 제조 방법 및 그를 포함하는전달체

Info

Publication number: KR100807060B1
Application number: KR1020070086524A
Authority: KR
Inventors: 오유경; 서민성; 신혜정; 심가용
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2007-08-28
Filing date: 2007-08-28
Publication date: 2008-02-25
Also published as: CN101842347B; WO2009028824A2; JP2010537972A; EP2197834A2; EP2197834A4; WO2009028824A3; US20120021044A1; JP5464556B2; CN101842347A

Abstract

본 발명은 신규한 양이온성 지질, 그의 제조 방법 및 그를 포함하는 핵산 전달체를 제공한다. 본 발명의 양이온성 지질은 핵산 또는 음이온성 생리활성 단백질 전달체의 제조를 위해 사용된다. 본 발명의 양이온성 지질은 제조 및 정제 공정이 간편하여 대량 생산시의 경제성이 높다. 또한, 본 발명의 양이온성 지질을 포함하는 핵산 또는 단백질 전달체는 세포 내로 전달하고자 하는 데옥시리보핵산, 리보핵산, 작은 간섭 리보핵산, 안티센스 올리고핵산, 핵산 앱타머(aptamer) 등의 핵산 의약이나 생리활성을 보유한 음이온성 단백질을 세포 내로 수송하는 효율을 현저히 증강시킬 뿐만 아니라, 세포 독성을 감소시켜 핵산 또는 단백질 소재 의약의 치료 효능을 증강시키는 용도로 유용하게 사용된다.

양이온성 지질, 핵산 전달체, 단백질 전달체, 리포좀, 미셀, 에멀젼

Description

신규한 양이온성 지질, 그의 제조 방법 및 그를 포함하는 전달체{A novel cationic lipid, a preparation method of the same and a delivery system comprising the same}

본 발명은 신규한 양이온성 지질, 그의 제조 방법 및 그를 포함하는 전달체에 관한 것이다.

최근, 플라스미드 데옥시리보핵산 (plasmid DNA), 작은 간섭 이중나선 리보핵산(siRNA), 마이크로 리보핵산(micro RNA), 안티센스 올리고 핵산(antisense oligonucleotide) 등 각종 핵산 물질의 의약적 용도가 규명됨에 따라서 이들 핵산 물질들을 세포 내로 효율적으로 전달하는 핵산 전달 물질의 중요성도 증대되고 있다.

세포 내로 핵산 물질을 전달하기 위한 핵산 전달체는 크게 바이러스성 벡터와 비바이러스성 벡터로 구분할 수 있다.

비바이러스성 벡터로서는 리포좀, 양이온성 고분자를 비롯하여, 미셀, 에멀젼, 나노입자 등의 다양한 제형이 사용될 수 있다. 이들 제형에서 양이온성 지질은 음하전의 핵산 물질과 정전기적으로 결합하는 힘을 제공하므로 핵산 전달체 설계의 핵심 물질이다. 양이온성 지질은 음이온성 핵산 물질과 안정한 이온결합에 의한 복합체 입자를 형성하며, 이렇게 형성된 복합체는 세포막 융합이나 세포내 식작용 (endocytosis)에 의하여 세포 내로 수송되게 된다.

종래에 개발된 양이온성 지질들은 중성의 지방산 사슬에 1차 아민 (primary amine), 2차 아민(secondary amine), 3차 아민(tertiary amine), 또는 4급 암모늄염(quarternary ammonium salt) 등의 아민 보유 화합물을 결합시켜 양이온성을 부여하는 방법을 사용하였다.

초기 단계의 핵산 전달용 양이온성 지질로서는 1987년 Felgner 박사 연구진이 합성한 양이온성 4급 아미노 지질인 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리에틸암모늄 클로라이드 (N-[1-(2,3-dioleyloxy) propyl]-N,N,N-triethylammonium chloride; DOTMA)가 있다. DOTMA는 세포막 융합 활성을 가진 것으로 알려진 디올레오일 포스파티딜 에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine; DOPE)과 양이온성 리포좀을 형성하여 유전자 전달에 이용되고 있다. DOTMA의 소수성기는 이중결합을 갖는 탄소수 18개의 지방족 화합물 그룹 (aliphatic group)이며, 스페이서 아암(spacer arm)과 에테르 결합(ether linker bond)을 통하여 화학적으로 연결된 소수성기의 반대쪽에 4차 암모늄염이 결합되어 있다. DOTMA의 경우 유전자 전달효율은 비교적 높지만 세포 독성을 지니고 있으며, 여러 공정의 합성과정을 거쳐야 한다는 단점을 가지고 있다.

DOTMA의 높은 독성을 해결하고 세포 내 핵산 전달 효율을 보다 높이기 위해 DOTMA의 다른 형태의 유도체인 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium bromide; DM RIE), N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸 설페이트(N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N- trimethylammonium methyl sulfate; DOTAP), 2,3-디올레일옥시-N-[2-(스퍼마인카복시아미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판 암모늄 트리플루오로아세테이트 (2,3-dioleyloxy-N-[2-(sperminecarboxyamide) ethyl]-N,N-dimethyl-1-propane ammonium trifluoroacetate; DOSPA) 등이 개발되었다.

또한, 콜레스테롤(cholesterol) 유도체인 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)carbamoyl]cholesterol; DC-Chol), 디메틸-디옥타데실 암모늄 브로마이드(dimethyl-dioctadecyl ammonium bromide; DDAB), N-(α-트리메틸암모니오아세틸)-디도데실-D-글루타메이트 클로라이드(N-(α-trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate chloride; TMAC), 디옥타데실 아미도글리실 스퍼민(dioctadecylamidoglycylspermine; DOGS) 등이 합성되어 데옥시리보핵산 등의 핵산 물질 전달을 목적으로 이용되고 있다.

이들 양이온성 지질들은 4차 아민, 3차 아민, 또는 하이드록시 에틸화 4차 아민 등이 지질의 헤드 부분에 연결되어 한 개의 양전하를 제공하는 종류 (DC-Chol, DDAB, TMAC 등)와 스퍼민(spermine) 등의 다중 아민(polyamine) 물질이 연결되어 여러 개의 양전하를 제공하는 종류 (DOGS) 로 구분될 수도 있다.

핵산 전달에 사용되는 양이온성 지질의 또 다른 예는 4급 암모늄염(quarternary ammonium salt)인 계면 활성제(detergent)이다. 이들은 단일사슬, 예를 들어, 세트리 메틸 암모늄 브로마이드(cetrimethylammonium bromide) 또는 이중사슬, 예를 들어, 디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드(dimethyldioctadecyl ammonium bromide) 등의 계면 활성제이고, 모두 동물세포에 핵산 전달이 가능하다. 이들 4급 암모늄염 양이온성 지질의 경우 양친매성(amphiphile)에 속하는 아민기(amine group)는 4차이고, 스페이서 아암(spacer arm)이나 연결 결합(linker bond) 없이 지질의 단일사슬이 1차 아민기에 붙어있다. 그러나 이들 양친매성 계면활성제를 이용한 제형들 또한 일반적으로 세포 독성이 심각한 문제점을 가지고 있다. 또 다른 양친매성 물질들로는 DOTMA와 구조가 유사한 1,2-디올레오일-3-(4'-트리메틸암모니오)부타노일-글리세롤(1,2-dioleoyl-3-(4'-trimethylammonio) butanoyl-sn-glycerol), 콜레스테릴(4'-트리메틸암모니오)부타노에이트 (cholesteryl (4'-trimethylammonino)butanoate), 1,2-디올레오일-3-숙시닐-글리세롤 콜린 에스테르(1,2-dioleoyl-3-succinyl-sn-glycerol choline ester) 등이 있는데, 이들 양친매성 물질들은 세포내 핵산 전달효율(delivery efficiency)이 일반적으로 낮다.

비바이러스성 벡터 중 양이온성 지질은 렌티바이러스나 아데노 바이러스 등의 바이러스성 핵산 수송체에 비하여 제조방법이 간편하고, 바이러스 캡시드 단백질에 의한 반복투여시의 면역부작용이 적고, 바이러스 자체가 소유하는 유전자에 의한 체내 안전성 문제가 제기되지 않으며, 제조 비용 또는 제조 공정에 있어서도 산업적으로 유리한 장점이 있다. 그러나, 종래에 개시된 여러 핵산 전달용 양이온성 지질들은 합성 방법, 세포 독성 및 세포내 핵산 전달 효율 면에서 아직 보완되 어야 할 점이 많다. 그러므로 합성 공정이 짧고, 세포 독성이 작으면서도 세포 내로 효율적으로 핵산 물질들을 전달하는 기술의 개발이 요구된다.

핵산 물질 외에 생리활성 단백질의 경우에도 생체 내 짧은 반감기로 인하여 약물동력학적인 체류시간이 낮고, 빈번한 반복 투여가 요구되는 것이 문제점으로 지적되고 있다. 생리활성 단백질의 경우 폴리에틸렌 글리콜과 같은 고분자 물질과의 화학적인 접합으로서 생체 내 체류시간을 증강시키는 기술들이 사용되고 있다. 그러나, 이러한 화학적인 접합의 경우 단백질의 생리활성 부위가 화학적 수식에 의해 변형되어 단백질 본연의 생리활성이 감소되는 경우가 많다. 따라서 생리 활성 단백질에 화학적인 변형을 주지 않으면서도 생체 내에서 단백질이 분해 효소에 의해 신속히 분해되는 것을 막을 수 있는 전달체의 개발이 필요하다. 특히 음이온성 생리활성 단백질인 헤파린 등의 경우, 양이온성 전달체와 정전기적 복합체를 형성할 경우 화학적인 구조 변형이 없이도 생체 내 약물동력학적인 특징을 변화시킬 수 있다.

이에 본 발명자들은 이제까지의 일반적인 양이온성 지질의 합성 방법과는 달리 아민구조를 가지는 지방산 유도체에 음이온성 아미노산을 결합시켜 양이온성을 부여하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규한 양이온성 지질, 그의 제조 방법 및 그를 포함하는 전달체를 제공하는 것이다. 본 발명의 양이온성 지질은 다양한 형태의 핵산 전 달체 또는 생리활성을 보유한 음이온성 단백질의 전달체로 제제화되어 세포 내로 목적하는 물질의 전달을 증강시키는데 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 일반식 (I)의 양이온성 지질을 제공한다:

(I)

상기 식에서,

n은 1 또는 2이고,

R₁과 R₂는 각각 탄소수 12 내지 20개의 포화 또는 불포화 탄화수소이다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 R₁과 R₂는 각각 탄소수 16개의 포화 또는 불포화 탄화수소일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 R₁과 R₂는 각각 탄소수 18개의 포화 또는 불포화 탄화수소일 수 있다.

상기 일반식 (I)으로 표시되는 본 발명의 양이온성 지질은 음전하를 띠는 아미노산 그룹과 소수성인 C₁₂∼C₂₀의 포화 또는 불포화 지방산 아민 유도체가 결합되어 이루어진다.

본 발명의 양이온성 지질은 친수성인 아미노산 그룹과 소수성인 지방산 부위 로 구성된 양친매성 화합물로서 아미노산의 카르복시기(-COOH) 그룹과 지방산 유도체의 아민그룹(-NH₂)간의 아미드(amide) 결합으로 이루어진다.

따라서 본 발명은 또한 음이온성 아미노산의 카르복실 그룹(-COOH)을 지방산 아민 유도체의 아민 그룹(-NH₂)에 아마이드 결합(amide bond)으로 연결시켜 상기 화학식 (I)의 양이온성 지질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 양이온성 지질을 구성하는 지방산 아민 유도체는 탄소수 12 내지 20개의 포화 또는 불포화 지방산이면 어떠한 것이든 가능하다. 상기 지방산 아민 유도체는 예를 들어, 올레일아민(oleylamine), 미리스틸아민(myristylamine), 팔미틸아민(palmitylamine), 스테아릴아민(stearylamine), 라우릴아민(laurylamine), 리놀레일아민(linoleylamine), 아라키딜아민(arachidylamine) 등을 포함한다.

본 발명의 양이온성 지질을 구성하는 아미노산 그룹으로는 음하전을 가지는 아미노산 중 탄소수 10개 이하의 어떤 아미노산도 가능하나, 글루탐산(Glutamic acid, E) 또는 아스파트르산(Aspartic acid, D)을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 일반식 (I)에서, n=1인 경우는 아민 구조를 가지는 지방산 유도체를 아스파르트산과 결합시켜 양이온성 지질을 합성한 경우이고, n=2인 경우는 아민 구조를 가지는 지방산 유도체를 글루탐산과 결합시켜 양이온성 지질을 합성한 경우이다.

본 발명의 양이온성 지질은 생체 단백질의 구성성분인 아미노산을 사용하여 간단한 공정으로 높은 수율의 합성이 가능하다. 본 발명의 양이온성 지질의 경우, 정상적인 생체내 환경의 중성영역 pH에서 글루탐산과 아스파트르산의 아민기가 양하전의 형태로 존재하게 되므로 상기 일반식 (I)의 양이온성 지질은 전체적으로 세포 내에서 양전하의 하전상태를 보유하게 된다. 상기 양이온성 지질의 양이온 하전은 중성영역 pH에서 음전하를 띠고 있는 각종 핵산 물질과 복합체를 형성하는 것을 가능하게 하고 또한 생체 내에서 상대적으로 음전하를 보유하고 있는 표적 세포막과의 접촉을 증가시키는데 도움을 준다. 따라서 본 발명의 양이온성 지질은 핵산 전달 용도의 리포좀, 미셀, 에멀젼 등 다양한 형태의 핵산 전달체 제형(delivery formulation)들을 제조하기 위해 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 또한 상기 화학식 (I)의 양이온성 지질을 포함하는 핵산 전달체(nucleic acid delivery system)을 제공한다. 본 발명에 있어서, 핵산 전달체는, 음전하를 띤 핵산 서열과의 상호작용에 의해 통상적으로 핵산과 결합하여 세포 내로 유입될 수 있는 복합체를 형성할 수 있는 핵산 운반 매개체를 말한다.

본 발명에 있어서, 핵산은 리보핵산(RNA), 작은 간섭 리보핵산(small interfering RNA), 안티센스 올리고핵산(antisense oligonucleotide), 데옥시리보 핵산(DNA), 앱타머(aptamer) 등을 포함한다.

본 발명의 구체예에서, 본 발명의 양이온성 지질을 포함하는 핵산 전달체는 리보핵산(RNA), 작은 간섭 리보핵산(small interfering RNA), 안티센스 올리고핵산(antisense oligonucleotide), 데옥시리보 핵산(DNA), 앱타머(aptamer) 등을 포함하는 핵산의 세포 내 운반을 매개한다.

본 발명의 핵산 전달체는 리포좀, 미셀, 에멀젼 및 나노입자로 구성되는 군 으로부터 선택되는 제형으로 이루어질 수 있다.

또한 상기 핵산 전달체는 본 발명의 양이온성 지질 성분 외에도 갈락토오스 지질 유도체, 만노오스 지질 유도체, 엽산 지질 유도체, 폴리틸렌 글리콜 지질 유도체, 바이오틴 지질 유도체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 핵산 전달체는 상기 양이온성 지질 및 세포 융합성 인지질을 함유하는 리포좀 제형으로 이루어진 것일 수 있다. 상기 세포 융합성 인지질은 예를 들어 디올레오일 포스파티딜에탄올 아민(dioleoylphosphatidylethanolamine; DOPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 등을 포함한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 핵산 전달체는 상기 양이온성 지질 및 계면활성제를 함유하는 미셀 제형으로 이루어진 것일 수 있다. 상기 계면활성제는 예를 들어 트윈 20 (Tween 20), 폴리에틸렌 글리콜 모노올레일 에테르(polyethylene glycol monooleyl ether), 에틸렌글리콜 모노도데실 에테르 (ethylene glycol monododecyl ether), 디에틸렌글리콜 모노헥실 에테르 (diethylene glycol monohexyl ether), 트리메틸헥사데실 암모늄 클로라이드 (trimethylhexadecyl ammonium chloride), 도데실트리메틸 암모늄 클로라이드 (dodecyltrimethyl ammonium bromide), 사이클로헥실 베타 말토사이드 (cyclohexylmethyl β-D-maltoside), 펜타에리스리틸 팔미테이트 (pentaerythrityl palmitate), 라우릴에메틸아민옥사이드 (lauryldimethylamine-oxide), 또는 라우로살코신 소듐염(N- lauroylsarcosine sodium salt) 등을 포함한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 핵산 전달체는 상기 양이온성 지질 및 계면활성제를 함유하는 에멀젼 제형으로 이루어진 것일 수 있다. 에멀젼 제형에서 사용할 수 있는 계면활성제는 양이온성(cationic), 양쪽성 (zwitterionic), 비이온성(nonionic) 등으로 분류된다. 양이온성 계면활성제로는 예를 들어 세틸 브롬화 트리메틸암모늄염(cetyl trimethylammonium bromide), 헥사데실 브롬화 암모늄염(hexadecyl trimethyl ammonium bromide) 등을 사용할 수 있으며, 양쪽성 계면활성제로는 예를 들어 도데실 베타인(dodecyl betaine), 도데실 디메틸아민 산화물(dodecyl dimethylamine oxide), 디메틸팔미토일암모니오프로판 설포네이트(3-(N,N-dimethylpalmitylammonio)propane sulfonate) 등을 사용할 수 있으며, 비이온성 계면활성제로는 예를 들어 트윈-20 (Tween 20), 트윈-80(Tween 80), 트리톤 X-100 (Triton-X-100), 폴리에틸렌 글리콜 모노올레일 에테르(polyethylene glycol monooleyl ether), 트리에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 (triethylene glycol monododecyl ether), 옥틸 글루코사이드(octyl glucoside), 노나노일메틸글루카민 (N-nonanoyl-N-methylglucamine) 등을 사용할 수 있다.

양이온성 리포좀, 미셀, 에멀젼 등의 제형으로 이루어진 본 발명의 핵산 전달체는 동물 세포 내에 목적하는 핵산의 수송 효율을 현저히 증강시킬 수 있으며 세포에 대한 독성도 감소시킨다.

본 발명의 양이온성 지질을 함유한 핵산 전달체는 전달하고자 하는 핵산의 사용 목적에 따라 어떤 동물 세포로도 핵산 전달이 가능하다. 하기 실시예에서는 상기 핵산 전달체의 종양세포(사람의 자궁경부암 상피 세포인 SiHa 세포주, 폐암 세포인 A549 세포주, 질 점막 케라틴 세포주인 VK2 세포주, 쥐의 간암 세포주인 Hepa1-6)로의 핵산 전달 효율을 평가한다.

형광 표식이 붙어있는 Block IT (Invitrogen, USA) 이중 나선 리보핵산을 사용하여 양이온성 지질을 함유하는 다양한 제형과 복합체를 형성시켜 세포 내에 전달하고 이를 형광 현미경으로 관찰하면 상기 양이온성 지질의 세포 내로 전달되는 핵산 수송 능력을 구체적으로 측정할 수 있다. 또한 본 발명의 핵산 전달체의 세포 독성은 tetrazolium 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide을 이용한 발색 방법(MTT)을 사용하여 평가할 수 있다.

본 발명에서 기술된 양이온성 지질을 포함하는 리포좀, 미셀, 에멀젼 등의 핵산 전달체는 다양한 세포들에서 핵산 전달 효율을 증강시킬 목적으로 기존에 사용되어 왔던 양이온성 지질인 DC-Chol을 함유한 양이온성 인지질 리포좀 보다 세포내 수송도를 증가시킬 뿐만 아니라 세포 독성도 현저하게 감소시키는 바, 데옥시리보핵산, 리보핵산, 작은 간섭 리보핵산, 안티센스 올리고핵산, 핵산 앱타머 (aptamer) 등의 핵산 의약을 이용한 치료요법 등에 효과적으로 사용 가능하다.

또한 본 발명은 상기 핵산 전달체와 핵산의 복합체를 제공한다. 리포좀, 미셀, 에멀젼, 나노입자 등의 제형을 갖는 본 발명의 핵산 전달체는 양이온성 지질로 인해 양하전을 띠게 되므로, 핵산 전달체의 양하전과 핵산의 음이온성 하전에 의해 단순한 혼합(mix)에 의해 정전기 결합을 통해 핵산 전달체와 핵산 간의 복합체를 형성할 수 있다.

상기 핵산 전달체와 핵산의 복합체는 종양, 관절염, 심혈관계, 내분비계 질환 등을 포함하는 병인성 단백질의 과다발현으로 야기되는 각종 질환들의 치료를 위해 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 핵산 전달체는 핵산 전달 효율이 우수할 뿐만 아니라 세포 독성이 낮으므로 병인성 단백질의 세포내 과다 발현을 억제하여 우수한 질환 치료 효과를 거둘 수 있다.

따라서 본 발명은 또한 상기 핵산 전달체와 핵산의 복합체를 유효성분으로 포함하는 핵산 의약 치료제, 핵산 의약 치료제의 제조를 위한 상기 핵산 전달체와 핵산의 복합체의 용도 및 치료상 유효량의 상기 핵산 전달체와 핵산의 복합체를 대상체의 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 종양, 관절염, 심혈관계, 내분비계 질환 등을 포함하는 병인성 단백질의 과다발현으로 야기되는 각종 질환들의 치료 방법 을 제공한다.

본 발명의 핵산 의약 치료제를 통해 in vivo 또는 ex vivo 상에서 세포 내부로 목적하는 핵산을 도입하게 되면 표적 단백질의 발현을 선택적으로 감소시키거나 표적 유전자에 생긴 변이를 수정하는 역할을 하여 병인성 단백질의 과다 발현으로 발생되는 질환이나 표적 유전자로 인해 발생한 질환 등을 치료할 수 있게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산 전달체와 핵산의 복합체의 치료상 유효량은 질환 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 투여되는 핵산의 종류, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 치료 기간, 동시 사용되는 화학 항암제 등의 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인에게 상 기 핵산 의약 치료제를 예컨대 1일 1회 투여시 0.001 mg/kg ~ 100 ㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

다르게는 본 발명의 양이온성 지질은 핵산 대신 음이온성 단백질과 복합체를 형성하여 음이온성 단백질을 세포 내로 전달하는 용도로서도 이용가능하다.

본 발명은 상기 단백질 전달체와 음이온성 단백질의 복합체를 제공한다. 본 발명의 핵산 전달체의 제형과 마찬가지로 상기 단백질 전달체 또한 리포좀, 미셀, 에멀젼, 나노입자 등의 제형을 가질 수 있으며, 양이온성 지질 성분 외에 핵산 전달체가 추가로 포함할 수 있는 것으로 예시한 구성성분들을 또한 포함할 수 있다. 본 발명의 단백질 전달체는 양이온성 지질로 인해 양하전을 띠게 되므로, 전달체의 양하전과 수송되는 단백질의 음이온성 하전에 의해 단순한 혼합(mix)에 의해 정전기 결합을 통해 전달체와 음이온성 단백질 간의 복합체를 형성할 수 있다.

상기 단백질 전달체와 음이온성 단백질의 복합체는 종양, 관절염, 심혈관계, 내분비계 질환 등에 대한 치료 효능을 나타내는 음이온성 생리활성 단백질의 생체내 안정성 및 유효성 증가를 위하여 도입될 수 있다. 본 발명의 양이온성 지질로 구성된 단백질 전달체는 음이온성 단백질과 복합체 형성으로 생체 내에서 단백질 분해 효소에 대한 저항성을 부여해 줄 수 있으며, 세포 독성이 낮으므로 생체 내에서 향상된 치료 효과를 거둘 수 있다.

따라서 본 발명은 또한 상기 단백질 전달체와 음이온성 단백질의 복합체를 유효성분으로 포함하는 단백 의약 치료제, 단백 의약 치료제의 제조를 위한 상기 전달체와 음이온성 단백질의 복합체의 용도 및 치료상 유효량의 상기 전달체와 단 백질의 복합체를 대상체의 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 종양, 관절염, 심혈관계, 내분비계 질환 등을 포함하는 각종 질환들의 치료 방법을 제공한다.

또한 본 발명의 양이온성 지질은 체외에서 핵산 앱타머를 이용한 진단 키트의 구성 성분으로서도 이용가능하다. 예를 들면 진단용 플레이트의 표면을 양이온성 지질로 코팅하고 이 코팅 면 위에 앱타머를 결합시킬 경우 시료 중 앱타머와 선택적으로 반응하는 물질의 존재를 진단하는데 이용 가능하다. 따라서 본 발명은 본 발명의 양이온성 지질로 코팅된 플레이트를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 상기 진단 키트의 양이온성 지질 코팅면에는 앱타머가 결합되어 있을 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 양이온성 지질은 제조 및 정제 공정이 간편하여 대량 생산시의 경제성이 높다. 또한, 본 발명의 양이온성 지질을 포함하는 핵산 또는 단백질 전달체는 목적하는 데옥시리보핵산, 리보핵산, 작은 간섭 리보핵산, 안티센스 올리고핵산, 핵산 앱타머 (aptamer) 등의 핵산 의약이나 생리활성을 보유한 음이온성 단백질 들을 세포 내로 수송하는 효율을 현저히 증강시킬 뿐만 아니라, 세포 독성을 감소시켜 핵산 또는 단백질 소재 의약의 치료 효능을 증강시키는 용도로 유용하게 사용된다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<신규 양이온성 지질의 합성>

실시예 1. 디올레오일 글루타마이드 (dioleoyl glutamide)의 합성

1-1). 1당량(1.47g, 10mmol)의 글루탐산(glutamic acid)을 삼불화 초산 (trifluoroacetic acid) 5ml과 디클로로메탄(dichloromethane) 5ml에 넣고, 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. 교반 후 반응물을 얼음물 중탕에서 SOCl₂3당량(2.18ml, 30mmol)을 천천히 적하시키고 0~40℃로 6시간 동안 반응시켰다. 반응 후 삼불화 초산과 디클로로메탄을 감압 농축하여 제거시키고 박막층 크로마토그래피법 (thin layer chromatograpy, TLC)로 반응여부를 확인하였다.

1-2). 실시예 1-1)에서 얻어진 반응 생성물을 디클로로메탄에 녹인 후, 올레일아민(oleylamine) 1.5당량 (4.01g, 15mmol)을 디클로로메탄에 녹여 천천히 적하시켰다. 얼음물 중탕에서 1시간 교반 후 3차에틸아민(triethylamine) 3ml을 적하시켜 0~50℃로 4시간 동안 반응시켰다. 반응 후 3차에틸아민과 디클로로메탄을 감압 농축하여 제거시킨 후, 얻어진 생성물을 에틸아세테이트(ethylacetate)에 녹여 과포화 염화나트륨용액으로 2회 세척하여 미반응 글루탐산을 제거시켰다. 생성물이 녹아져있는 에틸아세테이트에 미량의 수분을 염화마그네슘(MgCl₂)로 제거한 후 TLC로 반응여부를 확인하였다. 생성물이 녹아져있는 에틸아세테이트를 감압 농축하여 제거시킨 후 진공상태에서 하룻밤 건조하여 연한 갈색의 강한 점도를 가진 액체생성물(4.12g, 수득율 92.8%)를 얻었다. 최종적으로 얻어진 생성물의 정확한 구조를 수소핵자기공명 분광기(¹H NMR spectrometer)를 이용하여 확인하였다. 도 1은, 글루탐산과 올레일 아민의 아마이드 결합(amide bond) 부분의 수소가 8.0 ppm에서 검출되고, 글루탐산에 의한 아민의 수소가 2.0 ppm에서 검출되며, 올레일아민의 특징적인 이중 결합 부분의 수소가 5.42 ppm에서 검출되는 것을 보여준다.

1H NMR(DMSO-d₆, ppm) : 8.0(1H, 글루탐산과 올레일아민의 -NH-CO)

2.0(2H, 글루탐산의 -NH₂)

5.42(2H, 올레일아민의 -CH=CH-)

하기 반응식 1에 상기 실시예 1의 반응과정을 나타내었다.

[반응식 1]

상기 반응식 1의 R₁과 R₂는 각각 탄소수 18의 불포화(C₉) 탄화수소이다.

실시예 2. 디미리스토일 글루타마이드 (dimyristoyl glutamide)의 합성

2-1). 2당량의 글루탐산(glutamic acid)을 실시예 1-1)과 동일한 방법으로 반응시켜 글루탐산 유도체 생성물을 얻었다.

2-2). 실시예 2-1)에서 얻어진 반응 생성물을 디클로로메탄에 녹인 후, 미리스틸아민(myristylamine) 1.5당량(3.20g, 15mmol)을 사용하여 실시예 1-2)와 동일한 방법으로 반응 후, 연한 갈색의 고체생성물(3.22g, 수득율 85.7%)을 얻어 정확한 구조를 수소핵자기공명 분광기(¹H NMR spectrometer)를 이용하여 확인하였다.

1H NMR(DMSO-d₆, ppm) : 8.0(1H, 글루탐산과 미리스틸아민의 -NH-CO)

2.0(2H, 글루탐산의 -NH₂)

1.29(2H, 미리스틸아민의 -CH₂-)

하기 반응식 2에 상기 실시예 2의 반응과정을 나타내었다.

[반응식 2]

상기 반응식 2의 R₁과 R₂는 각각 탄소수 14의 포화탄화수소이다.

실시예 3. 디팔미토일 글루타마이드 (dipalmitoyl glutamide)의 합성

3-1). 2당량의 글루탐산(glutamic acid)을 실시예 1-1)과 동일한 방법으로 반응시켜 글루탐산 유도체 생성물을 얻었다.

3-2). 실시예 3-1)에서 얻어진 반응 생성물을 디클로로메탄에 녹인 후, 팔미틸아민(palmitylamine) 1.5당량(3.62g, 15mmol)을 사용하여 실시예 1-2)과 동일한 방법으로 반응 후, 연한 갈색의 고체생성물(3.74g, 수득율 90.1%)을 얻어 정확한 구조를 수소핵자기공명 분광기(¹H NMR spectrometer)를 이용하여 확인하였다.

1H NMR(DMSO-d₆, ppm) : 8.0(1H, 글루탐산과 팔미틸아민의 -NH-CO)

2.0(2H, 글루탐산의 -NH₂)

1.29(2H, 팔미틸아민의 -CH₂-)

하기 반응식 3에 상기 실시예 3의 반응과정을 나타내었다.

[반응식 3]

상기 반응식 3의 R₁과 R₂는 각각 탄소수 16의 포화탄화수소이다.

실시예 4. 디스테아로일 글루타마이드 (distearoyl glutamide)의 합성

4-1). 2당량의 글루탐산(glutamic acid)을 실시예 1-1)과 동일한 방법으로 반응시켜 글루탐산 유도체 생성물을 얻었다.

4-2). 실시예 4-1)에서 얻어진 반응 생성물을 디클로로메탄에 녹인 후, 스테아릴아민(stearylamine) 1.5당량(4.04g, 15mmol)을 사용하여 실시예 1-2)와 동일한 방법으로 반응 후, 연한 갈색의 고체생성물(3.96g, 수득율 87.1%)을 얻어 정확한 구조를 수소핵자기공명 분광기(¹H NMR spectrometer)를 이용하여 확인하였다.

1H NMR(DMSO-d₆, ppm) : 8.0(1H, 글루탐산과 스테아릴아민의 -NH-CO)

2.0(2H, 글루탐산의 -NH₂)

1.29(2H, 스테아릴아민의 -CH₂-)

하기 반응식 4에 상기 실시예 4의 반응과정을 나타내었다.

[반응식 4]

상기 반응식 4의 R₁과 R₂는 각각 탄소수 18의 포화탄화수소이다.

실시예 5. 디라우로일 글루타마이드 (dilauroyl glutamide)의 합성

5-1). 2당량의 글루탐산(glutamic acid)을 실시예 1-1)과 동일한 방법으로 반응시켜 글루탐산 유도체 생성물을 얻었다.

5-2). 실시예 5-1)에서 얻어진 반응 생성물을 디클로로메탄에 녹인 후, 라우릴아민(laurylamine) 1.5당량(2.78g, 15mmol)을 사용하여 실시예 1-2)와 동일한 방법으로 반응 후, 연한 갈색의 고체생성물(3.32g, 수득율 91.9%)을 얻어 정확한 구조를 수소핵자기공명 분광기(¹H NMR spectrometer)를 이용하여 확인하였다.

1H NMR(DMSO-d₆, ppm) : 8.0(1H, 글루탐산과 올레일아민의 -NH-CO)

2.0(2H, 글루탐산의 -NH₂)

1.29(2H, 라우릴아민의 -CH₂-)

하기 반응식 5에 상기 실시예 5의 반응과정을 나타내었다.

[반응식 5]

상기 반응식 5의 R₁과 R₂는 각각 탄소수 12의 포화탄화수소이다.

실시예 6. 디리놀레오일 글루타마이드 (dilinoleoyl glutamide)의 합성

6-1). 2당량의 글루탐산(glutamic acid)을 실시예 1-1)과 동일한 방법으로 반응시켜 글루탐산 유도체 생성물을 얻었다.

6-2). 실시예 6-1)에서 얻어진 반응 생성물을 디클로로메탄에 녹인 후, 리놀레일아민(linoleylamine) 1.5당량(3.98g, 15mmol)을 사용하여 실시예 1-2)와 동일한 방법으로 반응 후, 연한 갈색의 강한 점도를 가진 액체생성물(3.72g, 수득율 82.8%)을 얻어 정확한 구조를 수소핵자기공명 분광기(¹H NMR spectrometer)를 이용하여 확인하였다.

1H NMR(DMSO-d₆, ppm) : 8.0(1H, 글루탐산과 리놀레일아민의 -NH-CO)

2.0(2H, 글루탐산의 -NH₂)

5.49, 2.63(3H, 리놀레일아민의 =CH-CH₂-)

하기 반응식 6에 상기 실시예 6의 반응과정을 나타내었다.

[반응식 6]

상기 반응식 6의 R₁과 R₂는 각각 탄소수 18의 이중 불포화(C_9,C₁₂)탄화수소이다.

실시예 7. 디아라키도일 글루타마이드 (diarachidoyl glutamide)의 합성

7-1). 2당량의 글루탐산(glutamic acid)을 실시예 1-1)과 동일한 방법으로 반응시켜 글루탐산 유도체 생성물을 얻었다.

7-2). 실시예 7-1)에서 얻어진 반응 생성물을 디클로로메탄에 녹인 후, 아라키딜아민(arachidylamine) 1.5당량(4.46g, 15mmol)을 사용하여 실시예 1-2)과 동일한 방법으로 반응 후, 연한 갈색의 고체생성물(3.95g, 수득율 80.2%)을 얻어 정확한 구조를 수소핵자기공명 분광기(¹H NMR spectrometer)를 이용하여 확인하였다.

1H NMR(DMSO-d₆, ppm) : 8.0(1H, 글루탐산과 아라키딜아민의 -NH-CO)

2.0(2H, 글루탐산의 -NH₂)

1.29(2H, 아라키딜아민의 -CH₂-)

하기 반응식 7에 상기 실시예 7의 반응과정을 나타내었다.

[반응식 7]

상기 반응식 7의 R₁과 R₂는 각각 탄소수 20의 포화탄화수소이다.

실시예 8. 디팔미토일 아스파르타마이드 (dipalmitoyl aspartamide)의 합성

8-1). 2당량의 아스파르트산(aspartic acid)을 실시예 1-1)과 동일한 방법으로 반응시켜 아스파트르산 유도체 생성물을 얻었다.

8-2). 실시예 8-1)에서 얻어진 반응 생성물을 디클로로메탄에 녹인 후, 팔미틸아민(palmitylamine) 1.5당량(3.62g, 15mmol)을 사용하여 실시예 1-2)와 동일한 방법으로 반응 후, 연한 갈색의 고체생성물(3.59g, 수득율 88.6%)을 얻어 정확한 구조를 수소핵자기공명 분광기(¹H NMR spectrometer)를 이용하여 확인하였다.

1H NMR(DMSO-d₆, ppm) : 8.0(1H, 아스파르트산과 팔미틸아민의 -NH-CO-)

2.0(2H, 아스파르트산의 -NH₂)

1.29(2H, 팔미틸아민의 -CH₂-)

하기 반응식 8에 상기 실시예 8의 반응과정을 나타내었다.

[반응식 8]

상기 반응식 8의 R₁과 R₂는 각각 탄소수 16의 포화탄화수소이다.

실시예 9. 디스테아로일 아스파르타마이드 (distearoyl aspartamide)의 합성

9-1). 2당량의 아스파르트산(aspartic acid)을 실시예 1-1)과 동일한 방법으로 반응시켜 아스파트르산 유도체 생성물을 얻었다.

9-2). 실시예 9-1)에서 얻어진 반응 생성물을 디클로로메탄에 녹인 후, 스테아릴아민(stearylamine) 1.5당량(4.04g, 15mmol)을 사용하여 실시예 1-2)와 동일한 방법으로 반응 후, 연한 갈색의 고체생성물(4.02g, 수득율 90.4%)을 얻어 정확한 구조를 수소핵자기공명 분광기(¹H NMR spectrometer)를 이용하여 확인하였다.

1H NMR(DMSO-d₆, ppm) : 8.0(1H, 아스파르트산과 스테아릴아민의 -NH-CO-)

2.0(2H, 아스파르트산의 -NH₂)

1.29(2H, 스테아릴아민의 -CH₂-)

하기 반응식 9에 상기 실시예 9의 반응과정을 나타내었다.

[반응식 9]

상기 반응식 9의 R₁과 R₂는 각각 탄소수 18의 포화탄화수소이다.

실시예 10. 디올레오일 아스파르타마이드 (dioleoyl aspartamide)의 합성

10-1. 2당량의 아스파르트산(aspartic acid)을 실시예 1-1)과 동일한 방법으로 반응시켜 아스파트르산 유도체 생성물을 얻었다.

10-2). 실시예 I-10-1)에서 얻어진 반응 생성물을 디클로로메탄에 녹인 후, 올레일아민(oleylamine) 1.5당량(4.01g, 15mmol)을 사용하여 실시예 1-2)와 동일한 방법으로 반응 후, 연한 갈색의 강한 점도를 가진 액체생성물(4.07g, 수득율 92.1%)을 얻어 정확한 구조를 수소핵자기공명 분광기(¹H NMR spectrometer)를 이용하여 확인하였다.

1H NMR(DMSO-d₆, ppm) : 8.0(1H, 아스파르트산과 올레일아민의 -NH-CO-)

2.0(2H, 아스파르트산의 -NH₂)

5.42(2H, 올레일아민의 -CH=CH-)

하기 반응식 10에 상기 실시예 10의 반응과정을 나타내었다.

[반응식 10]

상기 반응식 10의 R₁과 R₂는 각각 탄소수 18의 불포화(C₉)탄화수소이다.

<양이온성 지질을 함유하는 핵산 전달체의 제조>

실시예 11. 디올레일 글루타마이드를 함유하는 양이온성 리포좀의 제조

실시예 1에서 제조한 양이온성 지질인 디올레오일 글루타마이드(dioleoyl glutamide)와 세포 융합성 인지질인 DOPE(Avanti Polar Lipid Inc., USA)를 각각 1ml의 클로로포름에 녹인 후 몰비 1:1의 비율로 취해 파이렉스 10ml 유리 격막 바이얼에 넣어 혼합한 후 질소 환경에서 모든 클로로포름이 증발될 때까지 낮은 속도로 회전 증발시켜 지질 박막 필름으로 제조하였다. 지질 다층형 소구체 (multilamella vesicle)를 제조하기 위하여 이 박막필름에 인산완충용액 1ml을 첨가하고 바이얼을 37℃로 하여 밀봉 후 3분간 교반(vortexing)하였다. 균일한 크기를 만들기 위해 이를 입자 균질화 제조기 (extruder, Northern Lipid Inc., Canada)를 사용하여 0.2㎛ 폴리카보네이트 막을 3번 통과시켜 제조하였다. 얻어진 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.

실시예 12. 디미리스토일 글루타마이드를 함유하는 양이온성 리포좀의 제조

실시예 2에서 제조한 양이온성 지질인 디미리스토일 글루타마이드(dimyristoyl glutamide)와 세포 융합성 인지질인 DOPE(Avanti Polar Lipid Inc., USA)를 각각 1ml의 클로로포름에 녹인 후 몰비 1:1의 비율로 취해 파이렉스 10ml 유리 격막 바이얼에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하였다.

실시예 13. 디스테아로일 글루타마이드를 함유하는 양이온성 인지질 리포좀 제조

실시예 4에서 제조한 양이온성 지질인 디스테아로일 글루타마이드(distearoyl glutamide)와 세포 융합성 인지질인 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, DPhPE)(Avanti Polar Lipid Inc., USA)를 각각 1ml의 클로로포름에 녹인 후 몰비 1:1의 비율로 취해 파이렉스 10ml 유리 격막 바이얼에 넣어 혼합한 후 실시예 11과 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하였다.

실시예 14. 디미리스토일 글루타마이드를 함유하는 양이온성 미셀(micelle)의 제조

실시예 2에서 제조한 양이온성 지질인 디미리스토일 글루타마이드(dimyristoyl glutamide)와 계면활성제인 Tween 20을 1:1의 몰 비율로 취하여 혼합한 다음, 혼합액 대 인산완충용액을 1:10의 부피 비율로 혼합하고 수회 진탕혼합 (vortexing)한 다음 약 1분 동안 초음파 발생기를 사용하여 양이온성 미셀을 제조하였다.

실시예 15. 디아라키도일 글루타마이드를 함유하는 양이온성 미셀(micelle) 제조

실시예 7에서 제조한 양이온성 지질인 디아라키도일 글루타마이드(diarachidoyl glutamide)와 계면활성제인 폴리에틸렌 글리콜 모노올레일 에테르( polyethylene glycol monooleyl ether)를 1:2의 몰 비율로 취하여 혼합한 다음, 혼합액 대 인산완충용액을 1:10의 부피 비율로 혼합하고 수회 진탕혼합 (vortexing)한 다음 약 1분 동안 초음파 발생기를 사용하여 양이온성 미셀을 제조 하였다.

실시예 16. 디팔미토일 아스파르타마이드를 함유하는 양이온성 에멀젼(emulsion) 제조

실시예 8에서 제조한 양이온성 지질인 디팔미토일 아스파르타마이드(dipalmitoyl aspartamide)와 Tween 80을 1 : 0.1의 몰 비율로 혼합하고 혼합물을 인산 완충용액에 1:10의 부피 비율로 가한 다음, 균질기(homogenizer)를 이용하여 약 2분간 균질화시켜 유상이 수상 내에 분산된 수중유형 (o/w형) 양이온성 에멀젼을 제조하였다.

실시예 17. 디올레오일 아스파르타마이드를 함유하는 양이온성 에멀젼(emulsion) 제조

실시예 10에서 제조한 양이온성 지질인 디올레오일 아스파르타마이드(dioleoyl aspartamide)와 Tween 80을 1 : 0.1의 몰 비율로 혼합하고 혼합물을 인산 완충용액에 1:10의 부피 비율로 가한 다음, 균질기(homogenizer)를 이용하여 약 2분간 균질화 시켜 유상이 수상 내에 분산된 수중유형 (o/w형) 양이온성 에멀젼을 제조하였다.

실시예 18. 디팔미토일 글루타마이드 및 갈락토오스 지질 유도체를 함유하는 양이온성 리포좀 제조

실시예 3에서 제조한 양이온성 지질인 디팔미토일 글루타마이드(dipalmitoyl glutamide), 세포 융합성 인지질인 DPhPE(Avanti Polar Lipid Inc., USA), 및 갈락토오스 지질 유도체인 세리브로사이드(cerebroside) (Avanti Polar Lipid Inc., USA) 를 각각 1ml의 클로로포름에 녹인 후 1:1:0.05의 몰 비율로 취하여 실시예 11과 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하여 표면에 갈락토오즈 잔기 (galactose moiety)가 존재하는 양이온성 리포좀을 제조하였다.

실시예 19. 디아라키도일 글루타마이드 및 폴리에틸렌 글리콜 지질 유도체를 함유하는 양이온성 인지질 리포좀의 제조

실시예 7에서 제조한 양이온성 지질인 디아라키도일 글루타마이드(diarachidoyl glutamide)와 세포 융합성 인지질인 DOPE(Avanti Polar Lipid Inc., USA), 폴리에틸렌 글리콜 지질 유도체인 1,2-diacyl-sn-glycero- 3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-3000 (Avanti Polar Lipid Inc., USA)를 각각 1ml의 클로로포름에 녹인 후 1:1:0.05의 몰 비율로 취하여 실시예 11과 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하여 표면에 폴리에틸렌 글리콜 그룹이 존재하는 양이온성 리포좀을 제조하였다.

실시예 20. 디스테아로일 아스파르타마이드 및 엽산 지질 유도체를 함유하는 양이온성 인지질 미셀의 제조

실시예 9에서 제조한 양이온성 지질인 디스테아로일 아스파르타마이 드(distearoyl aspartamide)와 엽산 지질 유도체1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[folate(polyethylene glycol)-2000 (Avanti Polar Lipid Inc., USA) 및 계면활성제인 Tween 20을 각각 1:0.05:1의 몰 비율로 취하여 혼합한 다음, 혼합액 대 인산완충용액을 1:10의 부피 비율로 혼합하고 수회 진탕혼합(vortexing)한 다음 약 1분 동안 초음파 발생기를 사용하여 양이온성 미셀을 제조하였다.

[비교예 1] 기존의 양이온성 지질을 이용한 리포좀 제조

양이온성 지질인 DC-Chol (Avanti Polar Lipid Inc., USA)과 세포 융합성 인지질인 DOPE(Avanti Polar Lipid Inc., USA)를 각각 1ml의 클로로포름에 녹인 후 몰비 1:1의 비율로 취해 파이렉스 10ml 유리 격막 바이얼에 넣어 혼합한 후 질소 환경에서 모든 클로로포름이 증발될 때까지 낮은 속도로 회전 증발시켜 지질 박막 필름으로 제조하였다. 지질 다층형 소구체 (multilamella vesicle)를 제조하기 위하여 이 박막필름에 인산완충용액 1ml을 첨가하고 바이얼을 37℃로 하여 밀봉후 3분간 교반(vortexing)하였다. 균일한 크기를 만들기 위해 이를 입자 균질화 제조기 (extruder, Northern Lipid Inc., Canada)를 사용하여 0.2㎛ 폴리카보네이트 막을 3번 통과시켜 제조하였다. 얻어진 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.

[비교예 2] 기존 시판품인 양이온성 리포좀

기존의 판매되고 있는 양이온성 리포좀인 LipofectAMINE 2000 (Invitrogen, USA)을 구입하여 설명서에 기재된 방법대로 사용하였다.

[실험예] 양이온성 지질 함유 핵산 전달체의 핵산 전달 효율 평가

세포 배양

사람 자궁암 세포주인 SiHa 및 HeLa, 사람 질 점막 케라틴 세포주(vaginal keratinocyte)인 VK2, 사람 폐암 세포주인 A549, 사람 신장 세포주인 293T, 생쥐 (mouse)의 간암 세포주인 Hepa1-6는 미국 세포주 은행(American Type Culture Collection, ATCC, USA)으로부터 구입하여 사용하였다. SiHa, Hepa1-6 세포주는 10% 우태아 혈청 w/v (HyClone laboratories Inc, USA)과 100 unit/ml 페니실린 또는 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM (Dulbecco's modified eagles medium, Gibco, USA)에 배양하였다. A549 세포주는 10 % 우태아 혈청과 페니실린, 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640(Gibco, USA)에서 배양하였다. VK2 세포주는 0.1 ng/ml human 재조합 상피세포성장인자 (Gibco, USA), 0.05 mg/ml 우태아 뇌하수체 추출물 (Gibco, USA)과 100 unit/ml 페니실린 또는 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 포함하는 Keratinocyte-SFM (Gibco, USA)배지에 배양하였다.

[실험예 I] 형광마커로 표지된 작은 간섭 리보핵산을 이용한 핵산 전달 효율 평가

I-1. A549 세포주에서의 작은 간섭 리보핵산의 전달 효율 평가

A549 세포주를 실험 전날 24 웰 플레이트에 웰 당 8×10⁴개씩 분 주(seeding)하고 각 플레이트의 세포가 60-70%정도 균일하게 성장했을 때 플레이트안의 배지를 제거하고 새 배지를 웰 당 500 ㎕씩 첨가하였다. 에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕씩을 넣고 형광 마커로 표지된 작은 간섭 리보핵산 물질인 Block-iT(20μmol, Invitrogen, USA) 2 ㎕씩과 비교예 1과 실시예 11에서 제조된 양이온성 리포좀 10㎕를 각각 첨가하였다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하였다. 이렇게 제조된 복합체를 웰 플레이트에 첨가하여 37℃의 CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 미디어를 웰 당 500 ㎕씩 새 미디어로 교체하여 준 후 형광 현미경으로 유전자 전달 효율을 관찰하였다. 도 2는 비교예 1(A, C)과 실시예 11(B, D)으로부터 제조된 양이온성 리포좀의 핵산 전달 효율을 위상차 현미경과 형광 현미경으로 관찰한 것으로 A는 비교예 처리시의 위상차 현미경 사진이고, B는 실시예 11의 조성 처리시의 위상차 현미경 사진이다. 또한 C는 비교예 처리시의 형광 마커로 표지된 작은 간섭 리보핵산의 세포내 전달을 보여주는 형광 현미경 사진이고, D는 실시예 11의 조성 처리시의 형광 현미경 사진이다. 본 도면으로부터 실시예 11에서 본 발명의 양이온성 지질을 함유하여 제조된 양이온성 리포좀이 비교예 1에서 제조된 공지 조성의 리포좀 보다 A549 세포내에서 작은 간섭 리보핵산의 전달 효율을 증가시킨다는 사실을 알 수 있다.

I-2. SiHa 세포주에서의 작은 간섭 리보핵산의 전달 효율 평가

SiHa 세포주를 실험 전날 24 웰 플레이트에 웰 당 8×10⁴개씩 분 주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70%정도 균일하게 성장했을 때 플레이트안의 배지를 제거하고 새 배지를 웰 당 500 ㎕씩 첨가하였다. 실험예 I-1과 동일한 방법으로 비교예 1 및 실시예 13의 양이온성 리포좀과 Block iT 간의 복합체를 각각 제조하고 웰 플레이트에 첨가하여 37℃의 CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 미디어를 웰 당 500 ㎕씩 새 미디어로 교체하여 준 후 형광 현미경으로 핵산 전달 효율을 관찰하였다. 도 3은 비교예 1(A, C)과 실시예 13(B, D)로부터 제조된 양이온성 리포좀의 핵산 전달 효율을 위상차 현미경과 형광 현미경으로 각각 관찰한 것으로 A는 비교예 1의 리포좀 처리시의 위상차 현미경 사진이고, B는 실시예 13의 리포좀 처리시의 위상차 현미경 사진이다. 또한 C는 비교예 처리시의 형광 마커로 표지된 작은 간섭 리보핵산의 세포내 전달을 보여주는 형광 현미경 사진이고, D는 실시예 13의 리포좀 처리시의 형광 현미경 사진이다. 본 도면으로부터 실시예 13에서 제조된 신규 양이온성 지질 함유 리포좀이 비교예 1의 공지의 양이온성 지질 함유 리포좀보다 SiHa 세포내에서 작은 간섭 리보핵산의 전달 효율을 증가 시킨다는 사실을 알 수 있다.

I-3. VK2 세포주에서의 작은 간섭 리보핵산의 전달 효율 평가

VK2 세포주를 실험 전날 24 웰 플레이트에 웰 당 8×10⁴개씩 분주(seeding)하고 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때 플레이트안의 배지를 제거하고 새 배지를 웰 당 500 ㎕씩 첨가하였다. 실험예 I-1과 동일한 방법으로 비교예 1의 양이온성 리포좀 및 실시예 14의 양이온성 미셀과 Block iT 간의 복합 체를 각각 제조하고 웰 플레이트에 첨가하여 37℃의 CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 미디어를 웰 당 500 ㎕씩 새 미디어로 교체하여 준 후 형광 현미경으로 핵산 전달 효율을 관찰하였다. 도 4는 비교예 1(B, D)의 양이온성 리포좀과 실시예 14(C, E)로부터 제조된 양이온성 인지질 미셀의 핵산 전달 효율을 위상차 현미경과 형광 현미경으로 관찰한 것으로 본 도면으로부터 실시예 14에서 제조된 양이온성 지질 함유 미셀(도 4E)이 비교예 1에서 사용된 공지의 양이온성 지질 함유 리포좀(도 4D)보다 VK2 세포내에서 작은 간섭 리보핵산의 전달 효율을 증가 시킨다는 사실을 알 수 있다. 또한 위상차 현미경으로 관찰되는 세포의 형태 측면에서도 비교예 1의 조성을 처리한 경우의 세포 상태(도 4B)는 세포들이 모양이 수축된 형태가 대부분으로서 아무것도 처리하지 않은 대조군 상태인 도 4A에 비하여 세포들의 형태가 변형된 것이 관찰되는 반면, 실시예 14의 양이온성 미셀 처리시의 세포상태는 도 4C에서 나타나듯이 아무것도 처리하지 않은 대조군 상태인 도 4A의 세포와 유사한 양상을 보여 세포 형태면에서 세포 독성이 현저히 감소된 것을 알 수 있다.

I-4. Hepa 1-6 세포주에서의 작은 간섭 리보핵산의 전달 효율 평가

Hepa 1-6 세포주를 실험 전날 24 웰 플레이트에 웰 당 8×10⁴개씩 분주(seeding)하고 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때 플레이트안의 배지를 제거하고 새 배지를 웰 당 500 ㎕씩 첨가하였다. 실험예 I-1과 동일한 방법으로 비교예 1의 양이온성 리포좀 및 실시예 16의 양이온성 에멀젼과 Block iT 간의 복합체를 각각 제조하고 웰 플레이트에 첨가하여 37℃의 CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 미디어를 웰 당 500 ㎕씩 새 미디어로 교체하여 준 후 형광 현미경으로 핵산 전달 효율을 관찰하였다. 도 5는 비교예 1(A, C)의 양이온성 리포좀과 실시예 16(B, D)로부터 제조된 양이온성 인지질 에멀젼의 핵산 전달 효율을 위상차 현미경과 형광 현미경으로 관찰한 것으로 A는 비교예 1의 리포좀 처리시의 위상차 현미경 사진이고, B는 실시예 16의 양이온성 에멀젼 처리시의 위상차 현미경 사진이다. 또한 C는 비교예 1의 리포좀 처리시의 형광 마커로 표지된 작은 간섭 리보핵산의 세포내 전달을 보여주는 형광 현미경 사진이고, D는 실시예 16의 양이온성 에멀젼 처리시의 형광 현미경 사진이다. 상기 도 5으로부터 실시예 16에서 제조된 신규 양이온성 지질 함유 에멀젼이 비교예 1에서 제조된 기존의 양이온성 지질 함유 제제보다 Hepa1-6 세포내에서 작은 간섭 리보핵산의 전달 효율을 증가시킨다는 사실을 알 수 있다.

[실험예 II] 유전자 발현 확인을 통한 핵산 전달 효능 평가

II-1. A549 세포주에서의 작은간섭 리보핵산 전달 효능 평가

A549 세포주를 실험 전날 24 웰 플레이트에 웰 당 세포를 8×10⁴씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70%정도 균일하게 성장했을 때 플레이트 안의 배지를 제거하고 새 배지를 웰(well) 당 250㎕ 씩 첨가하였다. 에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50㎕씩을 넣고 스탯3에 선택적인 작은간섭 리보핵산과 비교예 1, 2와 실시예 12, 14, 17에서 제조된 양이온성 리포좀, 미셀, 에멀젼의 복합체를 각각 첨가하였다. 스탯3(Stat3) 유전자(Gene bank accession number: NM_213662)의 발현 억제를 유도하기 위한 siRNA로는 siGENOME SMARTpool(Dahrmacon, Lafayette, CO, USA)을 사용하여 제작하였다. 미디어에 포함된 작은간섭 리보핵산(siRNA)의 최종 농도는 100nM이 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하고 이렇게 제조된 복합체를 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 Trizol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포내에 존재하는 전체 리보핵산(RNA)을 분리하고 이 RNA는 AccuPower RT PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA로 역전사 하였다. 스탯3 (Stat3)에 특이적인 프라이머의 서열은 5'-AGTTCTCCTCCACCACCAAG-3'(왼쪽), 5'-CCTTCTCCACCCAAGTGAAA-3'(오른쪽)이며 중합효소연쇄반응 생성물의 크기는 348염기쌍이었다. 스탯3(Stat3) 전사체(transcript) 발현의 정도는 스탯3 특이적인 연쇄반응 생성물의 밴드 밀도를 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 증폭하여 나타나는 밴드 밀도로 보정하여 정량적인 발현의 변화를 측정하였다. 도 6은 각각의 조성을 처리한 경우 SiHa 세포내에서 타겟 유전자인 스탯3의 전사체 발현을 비교한 것으로, A는 대조군, B는 작은간섭 리보핵산 단독처리군, C는 비교예 2 처리군, D는 비교예 1 처리군, E는 실시예 12 처리군, F는 실시예 14처리군, G는 실시예 17 처리군이다. 대조군(A)과 작은 간섭 리보핵산 단독처리군(B)은 작은간섭 리보핵산이 세포 내로 전달되지 않아 스탯3 전사체의 발현에 변화가 없었고, 비교예 1에서 제조된 리포좀은 실시예 12, 14, 17에서 제조된 리포좀, 미셀, 에멀젼보다 스탯3 전사체의 발현이 적게 감소하였다. 또한 실시예 12, 14, 17에서 제조된 리포좀, 미셀, 에멀젼은 시판품인 비교예 2의 조성과 유사하게 스탯3 전사체 발현의 감소를 효율적으로 나타내었다. 따라서 도6으로부터 실시예 12, 14, 17에서 제조된 양이온성 지질 함유 리포좀, 미셀, 에멀젼이 각각 SiHa 세포 내로 작은간섭 리보핵산물질을 효율적으로 전달하여 표적 단백질의 발현을 선택적으로 억제시키는 것을 알 수 있다.

II-2. HeLa 세포주에서의 작은간섭 리보핵산 전달 효능 평가

HeLa 세포주를 실험 전날 24 웰 플레이트에 웰 당 8×10⁴개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70%정도 균일하게 성장했을 때 플레이트 안의 배지를 제거하고 새 배지를 웰 당 250㎕씩 첨가하였다. 에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ㎕씩을 넣고 스탯3 선택적인 작은간섭 리보핵산과 비교예 1, 2와 실시예 11, 16, 20에서 제조된 양이온성 지질 함유 리포좀, 에멀젼, 및 미셀과의 복합체를 각각 첨가한 후 실험예 II-1와 동일한 방법과 조건으로 실험을 수행하였다. 도 7은 각각의 조성을 처리한 경우 HeLa 세포내에서 타겟 유전자인 스탯3의 전사체 발현을 비교한 것으로, A는 대조군, B는 작은간섭 리보핵산 단독처리군, C는 비교예 2 처리군, D는 비교예 1 처리군, E는 실시예 11 처리군, F는 실시예 16처리군, G는 실시예 20 처리군이다. 대조군(A)과 작은간섭 리보핵산 단독처리군(B)은 세포 내로의 전달 효율이 낮아 스탯3 전사체의 발현에 변화가 없었고, 비교예 1에서 제조된 리포좀은 실시예 11, 16, 20에서 제조된 리포좀, 에멀 젼, 미셀 제형 보다 스탯3 전사체의 발현이 적게 감소하였다. 따라서 도7로부터 실시예 11, 16, 20에서 제조된 양이온성 지질 함유 제형은 각각 HeLa 세포 내로 작은간섭 리보핵산물질을 효율적으로 전달하여 표적 단백질의 발현을 선택적으로 억제시키는 것을 알 수 있다.

II-3. SiHa 세포주에서의 안티센스 올리고핵산의 세포내 전달 효율 측정

SiHa 세포주를 실험 전날 24 웰 플레이트에 웰 당 세포를 8×10⁴씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70%정도 균일하게 성장했을 때 플레이트안의 배지를 제거하고 새 배지를 웰(well) 당 250㎕ 씩 첨가하였다. 에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 50㎕씩을 넣고 안티센스 올리고핵산과 비교예 1, 2와 실시예 12, 15, 17에서 제조된 양이온성 지질 함유 리포좀, 미셀, 에멀젼과의 복합체를 각각 첨가하였다. 비씨엘2 (Bcl2) 유전자(Gene bank accession number: NM_000633)의 발현 억제를 유도하기 위한 안티센스 올리고핵산으로는 바이오니아(Bioneer, Deajeon, Korea)에서 합성 주문한 것(5'-TCT CCC AGC GTG CGC CAT-3')을 사용하였다. 미디어에 포함된 안티센스 올리고핵산의 최종 농도는 100nM이 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하고 이렇게 제조된 복합체를 웰 플레이트에 첨가하여 37℃의 CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 Trizol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포내에 존재하는 전체 리보핵산 (RNA)을 분리하고 이 RNA는 AccuPower RT PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA로 역전사 하였다. 비씨엘2 (Bcl2)에 특이적인 프라이머의 서열은 5'-ATG GCG CAC GCT GGG AGA AC-3'(왼쪽), 5'-GCG GTA GCG GCG GGA GAA GT-3'(오른쪽)이며 중합효소연쇄반응 생성물의 크기는 348염기쌍이었다. 비씨엘2 (Bcl2) 전사체 발현의 정도는 비씨엘2 특이적인 연쇄반응 생성물의 밴드 밀도를 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 증폭하여 나타나는 밴드 밀도로 보정하여 정량적인 발현의 변화를 측정하였다. 도 8은 각각의 조성을 처리한 경우 SiHa 세포내에서 타겟 유전자인 비씨엘2의 전사체 발현을 비교한 것으로, A는 대조군, B는 비씨엘2 선택적 안티센스 올리고핵산 단독처리군, C는 비교예 2와 안티센스 올리고 핵산의 복합체 처리군, D는 비교예 1의 리포좀과 안티센스 올리고 핵산의 복합체 처리군, E는 실시예 12의 양이온성 리포좀과 안티센스 올리고 핵산의 복합체 처리군, F는 실시예 15의 양이온성 미셀과 안티센스 올리고 핵산의 복합체 처리군, G는 실시예 17의 양이온성 에멀젼과 안티센스 올리고 핵산의 복합체 처리군이다. 세포에 아무것도 처리하지 않은 대조군인 도 8A에 비하여 안티센스 올리고핵산 단독처리군(도 8B)은 안티센스 올리고 핵산이 세포 내로 전달되지 않아 비씨엘2 전사체의 양에 변화가 없었다. 시판품인 비교예 2의 조성이나 (도 8C), 비교예 1에서 제조된 리포좀(도 8D)에 비교할 때, 본 발명의 실시예 12, 15, 17에서 제조된 양이온성 지질 함유 제형들은 세포내에서 비씨엘2 전사체의 양을 효과적으로 감소시켰다. 따라서 도 8로부터 실시예 12, 15, 17에서 제조된 양이온성 지질 함유 제형들은 SiHa 세포 내로 안티센스 올리고핵산 물질을 전달하여 표적 물질인 Bcl-2의 세포내 발현을 효과적으로 억제시키는 것을 알 수 있다.

[실험예 III] 형광 단백질 발현 세포주 293T-GFP를 이용한 작은 간섭 리보핵산의 전달 효율 평가

녹색 형광 단백질을 발현하는 293T-GFP 세포주를 실험 전날 24 웰 플레이트에 웰 당 8×10⁴개씩 분주(seeding)하고 각 플레이트의 세포가 60-70%정도 균일하게 성장했을 때 플레이트 안의 배지를 제거하고 새 배지를 웰 당 500 ㎕씩 첨가하였다. 에펜도르프 튜브에 혈청이 포함되지 않은 배지 25㎕씩을 넣고 녹색 형광이 발현되는 플라스미드의 발현을 억제하는 siRNA와 비교예 2와 실시예 12에서 제조된 양이온성 리포좀을 각각 첨가하여 복합체를 제조하고 웰 플레이트에 첨가하여 37℃의 CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 미디어를 웰 당 500 ㎕씩 새 미디어로 교체하여 준 후 형광 현미경으로 유전자 전달 효율을 관찰하였다. 녹색 형광 단백질의 발현을 억제하기 위한 작은간섭 리보핵산은 바이오니아 (Bioneer, Korea)에서 판매하는 제품을 사용하였으며 그 서열은 5'-GCA UCA AGG UGA ACU UCA A-3'(정방향), 5'-UUG AAG UUC ACC UUG AUG C-3'(역방향)이었다. 미디어에 포함된 작은간섭 리보핵산의 최종 농도는 300 nM이 되게 맞추었다. 도 9는 각각의 조성을 처리한 경우 293T 세포내에서 녹색 형광 단백질의 발현을 위상차 현미경과 형광 현미경으로 관찰한 것으로, A는 녹색 형광 단백질 발현 293T 세포를 아무것도 처리하지 않은 경우의 위상차 현미경 사진이고, B는 비교예 2 조성 처리시의 위상차 현미경 사진이고, C는 실시예 12의 조성 처리시의 위상차 현미경 사진이다. 또한 D는 아무것도 처리하지 않은 293T 세포의 형광 현미경 사진이고, E는 비 교예 2의 조성 처리시의 형광 현미경 사진이고, F는 실시예 12 조성 처리시의 형광 현미경 사진이다. 아무것도 처리하지 않은 293T세포는 녹색 형광 단백질의 발현이 억제되지 않아 형광 발현이 형광 현미경 하에서 명확하게 관찰되는 반면, 비교예 2와 실시예 12의 조성을 처리한 세포는 형광 단백질의 발현을 억제하는 작은간섭 리보핵산이 세포 내로 전달되어 녹색 형광의 발현이 억제되는 것을 볼 수 있다.

[실험예 IV] 양이온성 지질 함유 핵산 전달체의 독성 평가

IV-1. 양이온성 지질 함유 핵산 전달체의 A549 세포주에 대한 독성 평가

본 발명의 신규 양이온성 지질을 포함하는 핵산 전달체의 세포 독성에 관한 평가를 하기 위하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다.

사람의 폐암 세포 주인 A549세포에 실시예 11, 13, 16에서 제조한 양이온성 지질 함유 리포좀, 에멀젼과 작은간섭 리보핵산(siRNA)의 복합체 조성 그리고 작은간섭 리보핵산(siRNA)유전자 단독 조성을 처리하고 세포 독성을 평가하였다. 핵산 전달체만의 세포 독성을 명확히 평가하기 위하여 작은간섭 리보핵산은 세포내에서 활성이 없는 스크램블 리보핵산을 사용하였다. 세포 독성은 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 시약에 의한 방법으로 평가하였다.

세포를 웰 당 2×10⁴세포가 되도록 48 웰(well)에 분주 (seeding)하고 12시간 배양한 후 실시예 11, 13, 16에서 제조한 양이온성 지질 함유 리포좀, 에멀젼과 작은간섭 리보핵산의 복합체 조성 그리고 작은간섭 리보핵산(siRNA)만을 각각 처리하였다. 24시간 경과 후 각각 MTT 용액을 배지의 10 %가 되도록 가하고, 4시간 더 배양한 다음 상층액을 제거하고 0.04 N 염산 이소프로판올 용액을 첨가한 후에 엘라이져 리더 (ELISA reader)를 이용하여 570 nm에서 그 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다. 도 10은 실시예 11, 13, 16에서 제조된 양이온성 지질 함유 리포좀, 에멀젼과 작은간섭 리보핵산 복합체의 폐암 세포주 (A549)에서 세포독성 실험을 수행한 결과로 실시예 11, 13, 16의 양이온성 리포좀, 에멀젼과 작은 간섭 리보핵산의 복합체는 대조군과 비교하여 큰 세포 독성을 나타내지 않았고 따라서 도 10으로부터 실시예 11, 13, 16에서 제조된 본 발명의 양이온성 지질 함유 리포좀이나 에멀젼 제형은 사람의 폐암 세포주에 대해 심각한 독성을 나타내지 않는다는 사실을 알 수 있다.

IV-2. 양이온성 지질 함유 핵산 전달체의 SiHa 세포주에 대한 독성 평가

SiHa 세포에 실험예 12, 18, 19에서 제조한 양이온성 인지질 리포좀과 작은간섭 리보핵산(siRNA)의 복합체 조성 그리고 작은간섭 리보핵산(siRNA)유전자 자체 조성을 제조하고 실험예 IV-1에 기재된 것과 같은 방법으로 세포 독성을 평가하였다. 도 11은 실시예 12, 18, 19에서 각각 제조된 양이온성 지질 함유 리포좀과 스크램블 작은간섭 리보핵산 복합체의 SiHa세포에 대한 독성 실험을 수행한 결과로 실시예 12, 18, 19의 양이온성 리포좀과 작은 간섭 리보핵산의 복합체는 대조군과 비교하여 큰 세포 독성을 나타내지 않았고 따라서 본 도면으로부터 실시예 12, 18, 19에서 제조된 본 발명의 양이온성 지질 함유 리포좀은 자궁 경부암 세포주에서 심각한 세포 독성을 나타내지 않는다는 사실을 알 수 있다.

IV-3. 양이온성 지질 함유 핵산 전달체의 VK2 세포주에 대한 독성 평가

VK2 세포에 실시예 11, 14, 17에서 제조한 양이온성 인지질 리포좀, 미셀, 에멀젼과 작은간섭 리보핵산(siRNA)의 복합체 조성 그리고 작은간섭 리보핵산(siRNA)유전자 자체 조성을 제조하고 실험예 IV-1에 기재된 것과 같은 방법으로 세포 독성을 평가하였다. 도 12는 실시예 11, 14, 17에서 제조된 양이온성 리포좀, 미셀, 에멀젼 조성물과 스크램블 리보핵산의 질 점막 케라틴 세포주인 VK2에서 세포독성 실험을 수행한 결과로 실시예 11, 14, 17의 양이온성 리포좀, 미셀, 에멀젼과 작은 간섭 리보핵산의 복합체는 대조군과 비교하여 큰 세포 독성을 나타내지 않았고 따라서 본 도면으로부터 실시예 11, 14, 17에서 제조된 양이온성 지질 함유 리포좀, 미셀, 에멀젼 제형은 VK2에서 심각한 세포 독성을 나타내지 않는다는 사실을 알 수 있다.

도 1은 실시예 1에서 글루탐산과 올레인아민을 결합시켜 제조한 양이온성 지질 디올레오일 글루타마이드(dioleoyl glutamide)의 수소 핵자기 공명 분광기(¹H NMR spectromer) 측정 결과를 나타낸 것이고,

도 2는 형광 표식이 붙어있는 이중나선 리보핵산을 사용하여 비교예 1의 양이온성 리포좀과 복합체 형태로 전달한 경우(A, C)와, 본 발명의 양이온성 지질을 포함하는 실시예 11의 리포좀 제형을 이용한 경우(B, D)의 이중나선 리보핵산의 전달 정도를 사람의 폐 종양 세포주인 A549 세포주에서 위상차 현미경 (A, B)과 형광 현미경 (C, D)을 이용하여 각각 관찰한 사진이다.

도 3은 형광 표식이 붙어있는 이중나선 리보핵산을 사용하여 비교예 1의 양이온성 리포좀과 복합체 형태로 전달한 경우(A, C)와, 본 발명의 양이온성 인지질을 포함하는 실시예 13의 리포좀 제형을 이용한 경우(B, D)의 이중나선 리보핵산의 전달 정도를 사람의 자궁경부암 상피세포인 SiHa 세포주에서 위상차 현미경(A, B)과 형광 현미경(C, D)을 이용하여 각각 관찰한 사진이다.

도 4는 형광 표식이 붙어있는 이중나선 리보핵산을 사용하여 비교예 1의 양이온성 리포좀과 복합체 형태로 전달한 경우(B, D)와, 본 발명의 양이온성 인지질을 포함하는 실시예 14의 미셀 제형을 이용한 경우(C, E)의 이중나선 리보핵산의 전달 정도를 사람의 자궁암 세포인 VK2 세포주에서 위상차 현미경(B, C)과 형광 현미경(D, E)을 이용하여 각각 관찰한 사진이다(도 4A는 대조군으로서 아무것도 처리 하지 않은 VK2 세포주의 위상차 현미경 사진이다).

도 5는 형광 표식이 붙어있는 이중나선 리보핵산을 사용하여 비교예 1의 양이온성 리포좀과 복합체 형태로 전달한 경우(A, C)와, 본 발명의 양이온성 지질을 포함하는 실시예 16의 에멀젼 제형을 이용한 경우(B, D)의 이중나선 리보핵산의 전달 정도를 쥐의 간암 세포주인 Hepa1-6 세포주에서 위상차 현미경(A, B)과 형광 현미경(C, D)을 이용하여 관찰한 사진이다.

도 6은 비교예 1, 2의 리포좀 제형(D, C)과 본 발명의 양이온성 지질을 포함하는 실시예 12, 14, 17의 리포좀, 미셀, 에멀젼 제형을 각각 사용한 경우(E, F, G)의 스탯3(stat3) 선택적 이중나선 리보핵산의 사람 폐암 세포주인 A549 세포내 전달 효능을 역전사 중합효소 연쇄반응으로 평가하여 타겟 유전자인 스탯3의 전사체 발현을 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 전사체 발현과 비교한 사진이다(A는 아무것도 처리하지 않은 세포 자체를 사용한 대조군, B는 스탯3 선택적 작은간섭 리보핵산 단독 처리군을 나타낸다).

도 7은 비교예 1, 2의 리포좀 제형(D, C)과 본 발명의 양이온성 지질을 포함하는 실시예 11, 16, 20의 리포좀, 에멀젼, 미셀 제형을 각각 사용한 경우(E, F, G)의 스탯3(stat3) 선택적 이중나선 리보핵산의 사람 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포내 전달 효능을 역전사 중합효소 연쇄반응으로 평가하여 타겟 유전자인 스탯3의 전사체 발현을 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 전사체 (transcript) 발현과 비교한 사진이다(A는 아무것도 처리하지 않은 세포 자체를 사용한 대조군, B는 스탯3 선택적 작은간섭 리보핵산 단독 처리군을 나타낸다).

도 8은 타겟 유전자인 비씨엘-2(bcl-2)에 선택적인 안티센스 올리고핵산을 사용하여 비교예 1, 2의 리포좀 제형(D, C)과 본 발명의 양이온성 지질을 포함하는 실시예 12, 15, 17의 리포좀, 미셀, 에멀젼 제형을 각각 이용한 경우(E, F, G)의 비씨엘-2 안티센스 올리고핵산의 세포내 전달 효능을 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하여 타겟인 비씨엘-2 전사체(transcript) 발현 억제를 비교한 사진이다(A는 아무것도 처리하지 않은 세포 자체를 사용한 대조군, B는 비씨엘-2 선택적 안티센스 올리고핵산 단독 처리군을 나타낸다).

도 9는 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein)의 발현을 선택적으로 억제하는 이중간섭 리보핵산을 사용하여 비교예 2의 리포좀 제형(B, E)과 본 발명의 양이온성 지질을 포함하는 실시예 12의 리포좀 제형을 이용한 경우(C, F)의 이중간섭 리보핵산의 사람의 신장 세포주인 293T 세포내 전달 효능을 녹색 형광 단백질의 발현 억제 정도로서 위상차 현미경 (B, C) 및 형광 현미경 (E, F)으로 각각 비교한 사진이다(도 9A는 아무것도 처리하지 않은 293T 세포의 위상차 현미경 관찰결과이고 도 9D는 형광현미경 관찰결과를 보여준다).

도 10은 본 발명의 양이온성 지질을 포함하는 실시예 11, 13, 16의 리포좀, 에멀젼 제형과 이중나선 리보핵산의 복합체를 폐암 세포주인 A549에 대해 세포 독성 실험을 수행한 결과이다.

도 11은 본 발명의 양이온성 지질을 포함하는 실시예 12, 18, 19의 리포좀제형과 이중나선 리보핵산의 복합체를 사람의 자궁 경부암 세포주인 SiHa에 대해 세포독성 실험을 수행한 결과이다.

도 12는 본 발명의 양이온성 지질을 포함하는 실시예 11, 14, 17의 리포좀, 미셀, 에멀젼 제형과 이중나선 리보핵산의 복합체를 사람 질 점막 케라틴 세포주(vaginal keratinocyte)인 VK2에 대해 세포독성 실험을 수행한 결과이다.

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하기 일반식 (I)의 양이온성 지질을 포함하는 음이온성 단백질 전달체(anionic protein delivery system):

(I)

상기 식에서,

n은 1 또는 2이고,

R₁과 R₂는 각각 탄소수 12내지 20개의 포화 또는 불포화 탄화수소이다.
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하기 일반식 (I)의 양이온성 지질을 포함하는 올리고핵산 전달체(oligonucleic acid delivery system):

(I)

상기 식에서,

n은 1 또는 2이고,

R₁과 R₂는 각각 탄소수 12내지 20개의 포화 또는 불포화 탄화수소이다.
제28항에 있어서, 상기 올리고핵산 전달체가 작은 간섭 리보핵산(small interfering RNA)의 세포 내 운반을 위한 것인 올리고핵산 전달체.
제28항에 있어서, 상기 올리고핵산 전달체가 안티센스 올리고핵산 (antisense oligonucleotide)의 세포 내 운반을 위한 것인 올리고핵산 전달체.
제28항에 있어서, 상기 올리고핵산 전달체가 앱타머(aptamer)의 세포 내 운반을 위한 것인 올리고핵산 전달체.
제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고핵산 전달체는 리포좀, 미셀, 에멀젼 및 나노입자로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형으로 이루어진 올리고핵산 전달체.
제32항에 있어서, 갈락토오스 지질 유도체, 만노오스 지질 유도체, 엽산 지질 유도체, 폴리틸렌 글리콜 지질 유도체, 바이오틴 지질 유도체를 추가적으로 포함하는 올리고핵산 전달체.
제32항에 있어서, 상기 올리고핵산 전달체가 상기 양이온성 지질 및 세포 융합성 인지질을 함유하는 리포좀 제형으로 이루어진 것인 올리고핵산 전달체.
제34항에 있어서, 상기 세포 융합성 인지질이 디올레오일 포스파티딜 에탄올아민 (dioleoylphosphatidylethanolamine; DOPE)인 올리고핵산 전달체.
제34항에 있어서, 상기 세포 융합성 인지질이 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-diphytanoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine)인 올리고핵산 전달체.
제32항에 있어서, 상기 올리고핵산 전달체가 상기 양이온성 지질 및 계면활성제를 함유하는 미셀 제형으로 이루어진 것인 올리고핵산 전달체.
제37항에 있어서, 상기 계면활성제가 트윈 20 (Tween 20), 폴리에틸렌 글리콜 모노올레일 에테르(polyethylene glycol monooleyl ether), 에틸렌글리콜 모노도데실 에테르 (ethylene glycol monododecyl ether), 디에틸렌글리콜 모노헥실 에테르 (diethylene glycol monohexyl ether), 트리메틸헥사데실 암모늄 클로라이드 (trimethylhexadecyl ammonium chloride), 도데실트리메틸 암모늄 클로라이드 (dodecyltrimethyl ammonium bromide), 사이클로헥실 베타 말토사이드 (cyclohexylmethyl β-D-maltoside), 펜타에리스리틸 팔미테이트 (pentaerythrityl palmitate), 라우릴에메틸아민옥사이드 (lauryldimethylamine-oxide), 또는 라우로살코신 소듐염(N-lauroylsarcosine sodium salt)인 올리고핵산 전달체.
제32항에 있어서, 상기 올리고핵산 전달체가 상기 양이온성 지질 및 계면활성제를 함유하는 에멀젼 제형으로 이루어진 것인 올리고핵산 전달체.
제39항에 있어서, 상기 계면활성제가 세틸 브롬화 트리메틸암모늄염(cetyl trimethylammonium bromide), 헥사데실 브롬화 암모늄염(hexadecyl trimethyl ammonium bromide), 도데실 베타인(dodecyl betaine), 도데실 디메틸아민 산화물(dodecyl dimethylamine oxide), 디메틸팔미토일암모니오프로판 설포네이트(3-(N,N-dimethylpalmitylammonio)propane sulfonate), 트윈-20 (Tween 20), 트윈-80(Tween 80), 트리톤 X-100 (Triton-X-100), 폴리에틸렌 글리콜 모노올레일 에테르(polyethylene glycol monooleyl ether), 트리에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 (triethylene glycol monododecyl ether), 옥틸 글루코사이드(octyl glucoside), 또는 노나노일메틸글루카민 (N-nonanoyl-N-methylglucamine)인 올리고핵산 전달체.
제28항의 올리고핵산 전달체와 올리고핵산의 복합체.