MX2010012326A - Metodos y composiciones que comprenden nuevos lipidos cationicos. - Google Patents

Metodos y composiciones que comprenden nuevos lipidos cationicos.

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Abstract

Se proporcionan en la presente nuevos lípidos catiónicos que comprenden los lípidos catiónicos, y métodos para utilizar los lípidos catiónicos. En algunas reivindicaciones, los lípidos catiónicos tienen actividad citotóxica y pueden utilizarse solos o en combinación con un compuesto bioactivo citotóxico para aniquilar una célula. En algunas de estas reivindicaciones, el lípido catiónico mejora la actividad citotóxica del compuesto bioactivo citotóxico. Se proporcionan métodos para tratar un sujeto afligido con una enfermedad o afección indeseada, en donde el método comprende administrar un sistema de distribución que comprende un nuevo lípido catiónico al sujeto. La invención además proporciona métodos para hacer sistemas de distribución que comprenden los nuevos lípidos catiónicos de la invención.

Description

METODOS Y COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN NUEVOS LIPIDOS CATIONICOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a lípidos catiónicos y su uso como vehículos para la distribución de agentes terapéuticos, tales como fármacos en las células.
Antecedentes de la Invención Los tratamientos para enfermedades tales como cáncer, en los cuales el objetivo final terapéutico es aniquilar las células enfermas o evitar o inhibir su reproducción, incluyen la administración - de fármacos citotóxicos. Los fármacos citotóxicos incluyen muchos agentes quimioterapéuticos que se utilizan en el tratamiento de cáncer, incluyendo agentes de alquilación, antimetabolitos y toxinas. La mayor parte de los fármacos citotóxicos son no selectivos, aniquiladores de células saludables así como células enfermas que contribuyen a efectos secundarios indeseables cuando estos agentes se suministran sistémicamente . De esta forma, existe una necesidad de agentes citotóxicos que sean más eficaces y más selectivos para células enfermas sobre las células saludables.
Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona nuevos lípidos catiónicos de la Fórmula (I) : Ref. 215256 en donde : m y n son cada uno independientemente números enteros de 1 a 8; Ri y R2 son cada uno independientemente -(CH2)P — CH3 en donde p es un número entero de 8 a 24; R3 y R4 son cada uno independientemente seleccionado del grupo que consiste de H, alquilo, y alquilo sustituido; Qi y Q2 se seleccionan. del grupo que consiste de: en donde por lo menos Qi o Q2 es: y sus sales farmacéuticamente aceptables.
También se presentan las composiciones que comprenden los nuevos lípidos catiónicos y los métodos para utilizar los lípidos catiónicos de la fórmula (I) en la presente. Las composiciones incluyen sistemas de distribución que comprenden un vehículo lípido y un compuesto bioactivo, en donde el vehículo lípido encapsula el compuesto bioactivo, y en donde el vehículo lípido comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) .
La presente invención también describe métodos para distribuir un compuesto bioactivo a una célula utilizando un sistema de distribución que comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) . Se proporcionan métodos para aniquilar una célula mediante el contacto de la célula con un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) o un sistema de distribución citotóxico.
Además, se proporcionan en la presente métodos para mejorar la actividad citotóxica de un compuesto bioactivo citotóxico en un sujeto que comprende administrar un compuesto bioactivo citotóxico y un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I), o administrar un sistema de distribución citotóxico que comprende un vehículo lípido que comprende un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) que encapsula el compuesto bioactivo citotóxico.
Los métodos para elaborar un sistema de distribución y un sistema de distribución citotóxico comprenden un vehículo lípido que -comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) que encapsula un compuesto bioactivo que también se proporciona en la presente.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 presenta las estructuras químicas de los lípidos 1-3.
La Figura 2 describe el esquema de reacción utilizado para sintetizar los lípidos 1, 2, y 3.
La Figura 3 describe el esquema de reacción utilizado para sintetizar el lípido de cloruro N-metil-N- (2-(arginoilamino) etil) -N, N-Di octadecil aminio o el cloruro de distearoil arginil amonio] (DSAA) .
La Figura 4 presenta la eficiencia de la transfección in vitro de los lípidos 1-3 en células H460 en la presencia de suero utilizando colesterol como un co-lípido (a una relación molar de lípido/colesterol de 1:1) . Se graficaron RLU/ gramo de proteína contra el lípido para la relaciones de carga de ADM (+/-) . La eficiencia en la transfección de los lípidos se comparó con la del cloruro N- (2 , 3-dioleoiloxi) propil) -N,N, N-trimetilamonio comercialmente disponible (DOTAP) y Lipofectamina™ 2000. Los valores de la transfección mostrados son el promedio de experimentos por triplicado llevados a cabo el mismo día.
Las Figuras 5A y 5B muestran los resultados de los ensayos de viabilidad llevados a cabo en células H460 que han sido tratadas con los lípidos 1-3 o DOTAP durante 48 horas (Figura 5A) o pre-tratados con 10 µ? de lípido 1-3 o DOTAP, y después reforzados con diferentes concentraciones de cisplatina 1 hora después. Los~valores de viabilidad celular mostrados son el promedio de " experimentos por triplicado llevados a cabo en el mismo día. La Figura 5C muestra una cinasa regulada por la señal extracelular fosforilada medida a través de Western blot (pERK) y ERK en células H460 después de la incubación con 1 µ? de lípido 1-3 o DOTAP durante varios tiempos. Datos = promedio, n = 3.
La Figura 6A presenta las fotografías de fluorescencia de las células H460 después de tratamiento con AR si marcado con 5 ' FAM contra un objetivo irrelevante en lípido/policatión/ADN-polietilenglicol (LPD-PEG) o nanopartículas de¦ lípido/policatión/ADN-polietilenglicol anisamida (LPD-PEG-AA) con cloruro (N,N-di-estearoil-N-metil-N-2 [?' - (N6 guanidino-L-lisinil ) ] aminoetilo amonio) DSGLA o DOTAP como el lípido catiónico durante 4 horas. El ARNsi fluorescente se extrajo de las células y se presentó la cuantificación fluorométrica en la Figura 6B. La Figura 6C muestra el porcentaje de células positivas para yoduro de propidio en las muestras de células¦ H460 tratadas con ARNsi de control en diferentes sistemas de distribución durante 4 horas y teñidas para yoduro de propidio. La Figura 6D muestra el análisis citométrico de flujo de las células H460 tratadas con ARNsi de control en diferentes sistemas de distribución durante 4 horas y teñidas con V-FITC de anexina .
. La Figura 7 describe un análisis Western blot del receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF ) y ß-actina en células H460 tratadas con nanopartículas de LPD-PEG con (AA+) o sin (AA-) el ligando de anisamida. Las nanopartículas se prepararon ya sea con DOTAP o DSGLA.
La ...Figura 8A. muestra la tinción TUNEL y la Figura 8B muestra la distribución del factor de' inducción de apoptosis (AIF) en células tratadas con diferentes nanopartículas LPD con (AA+) o sin (AA-) el ligando de anisamida durante 72 horas. Las células AIF nucleares se muestran por flechas. Las nanopartículas LPD se preparan ya sea con DOTAP o DSGLA.
La Figura . 9 presenta... las , fotografías de fluorescencia de células B16F10 después de un tratamiento de 4 horas con ARNsi marcado con 3' CY3 contra un objetivo irrelevante en LPD-PEG o nanopartículas de LPD- PEG-AA formuladas con el lípido catiónico DSAA, DSGLA, o DOTAP.
La Figura 10 muestra las actividades reporteras de luciferasa de células B16F10 que establemente expresan luciferasa y se incubaron con diferentes formulación de AFJSFsi a 30°C durante 24 horas, después de los cual, se analizaron las actividades de luciferasa de las células (2 x 105) . Datos = media ± DS (n=5) .
Descripción Detallada de la Invención La presente invención ahora se describirá con mayor detalle en la presente con referencia a las figuras anexas, en donde se muestran algunas, pero no todas las modalidades de la invención. Ciertamente, - estas invención pueden modalizarse en muchas diferentes formas y no deberá construirse como limitándose a las .modalidades establecidas en la presente.; más bien, estas modalidades son provistas de tal forma que esta descripción satisfará los requerimientos legales aplicables. Los números similares se refieren a elementos similares a lo largo de la descripción.
Muchas modificaciones y otras modalidades de las invenciones, establecidas en la presente se les ocurrirán a los expertos en la técnica a la cual pertenecen estas invenciones teniendo el beneficio . de las enseñanzas presentadas, en las descripciones anteriores y las figuras asociadas. Por consiguiente, se entiende que las invenciones no están limitadas a las modalidades específicas descritas y que las modificaciones y otras modalidades pretenden incluirse dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque se utilizan términos específicos., en la presente, se utilizan en un sentido genérico y descriptivo solamente y no para propósitos de limitación.
Se observa que el término "un, uno" o "uno, una" se refiere a uno o más de una entidad; por ejemplo, "un lípido catiónico" se entiende representando uno o más lípidos catiónicos. Es decir, los términos "uno" (o "uno"), "uno o más", .y "por lo menos uno" se pueden utilizar de manera intercambiable en la presente.
A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones, las palabras "comprender", "que comprende" y "comprende" se utilizan en un sentido no exclusivo, excepto cuando el contexto requiera lo contrario.
Como se utiliza en la presente, el término "aproximadamente" cuando se refiere a un valor significa que abarca variaciones de, en algunas modalidades ± 50%, en algunas modalidades + 20%, en algunas modalidades ± 10%, en algunas modalidades ± 5%, en algunas modalidades ± 1%, en algunas modalidades + 0.5%, y en algunas modalidades ± 0.1% de la cantidad especificada, ya que tales variaciones son apropiadas para llevar a cabo los métodos descritos o utilizadas con posiciones descritas I. Composiciones Se proporcionan en la presente nuevos lipidos catiónicos y composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos. Además se proporciona sistemas de distribución que comprenden los lipidos catiónicos de la invención A. Lipidos catiónicos La invención proporciona lipidos anfifílicos, catiónicos que contienen guanidinio que tienen un grupo principal de guanidinio individual o doble. El grupo de guanidinio permanece protonado durante un intervalo mucho más amplio de pH que otros 'grupos básicos debido a su alto valor pKa (13.5). Esta característica contribuye a la naturaleza catiónica de los lípidos.
Los nuevos lípidos catiónicos son de la fórmula (I) : en donde: m y n son cada uno independientemente números enteros de 1 a 8 ; Rx y R2 son cada uno independientemente - (CH2)P— CH3 , en donde p es un número entero de 8 a 24; R3 y R4 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de H, alquilo, y alquilo sustituido ; Qi y Q2 se seleccionan del grupo que consiste de: en donde por lo menos Qi o Q2 es : y sus sales farmacéuticamente aceptables.
En algunas modalidades del lípido catiónico de la fórmula (I) , m es 2, n es 4, p es 13, R3 y R4 son cada uno metilo y cada lípido catiónico puede seleccionarse del grupo que consiste de: cloruro de N, N-di-miristoil-N-metil-N-2 [N ' - (N6-guanidino-L-lisinil) ] aminoetil amonio (DMGLA) , en lo sucesivo referido como lípido 1 (ver Figura 1) ; cloruro de N,N-dimiristoil-N-metil-N-2 [N2 guanidino-L-lisinil] aminoetii1-amonio, en lo sucesivo referido como lípido 2 (ver Figura 1) ; y cloruro de N , N - d i mi r i s t o i 1 - N - me t i 1 - N - 2 [ N 1 - ( N2 , 6 - d i - guan i d i no - L - 1 i s i n i 1 ) ] am i noe t i 1 amonio, en lo sucesivo referido como lípido 3 (ver Figura 1 ) .
En ciertas modalidades el lípido catiónico de la fórmula (I) , m es 2, n es 3, p es 17, R3 es H, R4 es metilo, Q2 es y los lípidos tienen la siguiente estructura química NH HCI en lo sucesivo, referido como cloruro de N-metil-N-(2- (arginoilamino) etil) -N,N-Di octadecil aminio o cloruro de di estearoil arginil amonio] (DSAA) .
En otras modalidades del lípido catiónico de la fórmula (I), m es 2, n es 4, p es 17, R3 y R4 son cada metilo, T el lípido catiónico de la fórmula (I) tiene la siguiente estructura química: cloruro de N,N-di-estearoil-N-metil-N-2 [?' - (N6-guanidino-L-lisinil ) ] aminoetil amonio; en lo sucesivo referido como DSGLA. Para los propósitos de esta presente invención, DSAA. y DSGLA son referidos como derivados del lípido 1 (DMGLA) .
Como se utiliza en la presente, un "derivado" se refiere a un compuesto químico que se deriva de o se obtiene de un compuesto progenitor y contiene elementos esenciales del compuesto progenitor, pero típicamente tiene uno o más diferentes grupos funcionales. Los grupos funcionales pueden adicionarse al compuesto progenitor, por ejemplo, para mejorar la solubilidad, absorción, vida media biológica, propiedades fluorescentes y similares de la molécula o para disminuir la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula y similar. Se entiende que el término "derivado" abarca una sal farmacéuticamente aceptable, como se describe en la presente. Un "derivado activo" es un derivado que retiene una actividad descrita en la presente (por ejemplo, la habilidad de distribuir un compuesto bioactivo a una célula, actividad citotóxica) .
Se puede utilizar cualquier método conocido por el experto en la técnica para preparar los lípidos catiónicos de la fórmula (I), que incluyen los descritos en la presente. Los métodos sintéticos no limitantes para la síntesis de lípidos catiónicos se resumen en los Ejemplos 1 y 2 y se describen en las Figuras 2 y 3.
Será evidente para un experto en la técnica que un lípido catiónico de la fórmula (I) puede aislarse o purificarse de sus constituyentes utilizando métodos bien conocidos por el experto en la técnica. De esta forma, la invención modaliza lípidos catiónicos aislados de la fórmula (I) , en donde el término "aislado" cuando se refiere a una especie de -lípido significa que el lípido ha sido separado, completa o parcialmente, de todas las otras sustancias. Los lípidos aislados también pueden referirse como lípidos disueltos en un solvente. 1. Sales Farmacéuticamente Aceptables Los lípidos catiónicos como se" describen en la presente pueden formularse como una sal farmacéuticamente aceptable. La frase "sal(s) farmacéuticamente aceptables", como se utiliza en la presente, significa las sales de los compuestos actualmente descritos que son seguras y efectivas para utilizarse en un sujeto y que poseen la actividad biológica deseada. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de grupos ácidos o básicos presentes en los compuestos de la invención. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, nitrato, sulfato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, borato, isonicotinato, acetato, lactato, salicilato, citrato, tartrato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, . gluconato,. glucaronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metansulfonato, etansulfonato, bencensulfonato, p-toluensulfonato, pamoato (es decir, 1 , 1 ' -metilen-bis- ( 2 -hidroxi -3 -naftoato) ) , mesilato. Ciertos de los compuestos actualmente descritos pueden formar sales farmacéuticamente aceptables con varios aminoácidos. Las sales básicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio, zinc y dietanolamina . Para una revisión de las sales farmacéuticamente aceptables ver Berge et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19, que se incorpora aquí por referencia. Las sales de los lípidos descritas en la presente pueden prepararse, por ejemplo, mediante la reacción de un equivalente apropiado del compuesto con el ácido deseado o la base en solución. Después de que se completa la reacción, las sales se cristalizan de la solución- a través de la adición de una cantidad apropiada de solvente en donde la sal es insoluble . 2. Lípidos Citotóxicos En. algunas modalidades, los lípidos catiónicos de la fórmula (I) tienen actividad citotóxica. Como se utiliza en la presente, un compuesto que tiene "actividad citotóxica" comprende un compuesto (es decir, un lípido catiónico o fármaco) que, después del contacto con una célula o después de entrar en una célula, da como resultado la prevención o reducción del grado de reproducción celular, división celular, o crecimiento de una célula. La molécula citotóxica también puede inducir la muerte celular, ya sea a través de necrosis o apoptosis.
Los métodos para ensayar una molécula para actividad citotóxica son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero, no se limitan, a los siguientes ensayos in vi tro: el ensayo MTT, un ensayo colorimétrico, que mide la actividad de las reductasa enzimas de mitocondria con la sal de tetrazolio bromuro de 3- (4 , 5-Dimetiltiazol-2-il) -2 , 5-difeniltetrazolio, y ensayos similares utilizando otras sales de tetrazolio y tintas de formazano, tales como XTT, y el ensayo ST; el ensayo de azul de Tripano (TB) , el ensayo de Sulforhodamina B (SRB) , y el ensayo cologénico. Además, los métodos que se conocen en la técnica para medir los niveles de necrosis celular y la apoptosis pueden utilizarse para determinar sí un lípido catiónico o un fármaco tienen actividad citotóxica. Tales métodos para la detección de apoptosis incluyen, pero no se limitan a, el ensayo TUNEL, que mide la actividad de caspasa, fragmentación de ADN, activación de polimerasa (PARP) de poli (ADP-ribosa) , liberación de. citocromo C mitocondrio, desplazamiento del factor de inducción de apoptosis (AIF) , y tinción con Anexina-V.. En algunas modalidades, el porcentaje de células que se aniquilan o exhiben un grado reducido de reproducción, división celular o crecimiento celular después del contacto con la molécula citotóxica está en el intervalo de aproximadamente 1% a aproximadamente 100%, incluyendo, por ejemplo, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, y cualquier otro de estos valores entre aproximadamente 1% y aproximadamente 100%.
Aunque no se desea estar unido a ninguna teoría o mecanismo de acción se cree que el grupo guanidinio de los lípidos catiónicos de la fórmula (I) , que fácilmente dona un electrón, puede generar un superóxido, formando un radical de hidroxilo, que podría contribuir a la citotoxicidad de los compuestos (Hiramatsu (2003) Mol. Cell . Biochem. 244:57-62). Además, DSGLA, un derivado del lípido 1, puede inducir especies de oxígeno reactivas (ROS) (datos no mostrados) . Ya que no se desea estar unido a ninguna teoría o mecanismo de acción, ROS inducido por DSGLA puede causar el daño de la membrana y del ADN, mejorando la activación de poli (ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP-l)y el desplazamiento de la activación de AIF desde la mitocondria al núcleo, eventos clave en la inducción de la apoptosis (Fleury, Mignotte, and Vayssiere (2002) Biochimie 84:131-141; Zorov, Juhaszova, and Sollott (2006) Biochim. Biophys. Acta 1757:509-517). DSGLA también inhibe la activación de ERK (Figura 5C y Ejemplo Experimental 4) , que también podrían activar la apoptosis (Liu et al. (2006) Oncogéne 25:5640-5647). 3. Ligando selectores de objetivo Además se proporcionan composiciones que comprenden un lípido catiónico de la fórmula (I) y un ligando selector de objetivo que está físicamente asociado con el lípido catiónico. El algunas modalidades, el lípido catiónico de la fórmula (I) que está físicamente asociado con un ligando selector de objetivo tiene actividad citotóxica.
Por "ligando selector de objetivo" se entiende una molécula que selecciona como objetivo el lípido catiónico o una molécula físicamente asociada con una célula o tejido objetivo. Los ligandos de activación pueden incluir, pero no se limitan a, moléculas pequeñas, péptidos, lípidos, azúcares, oligonucleótidos , hormonas, vitaminas, antígenos, anticuerpos o sus fragmentos, ligandos del receptor de membrana específicos, ligandos capaces de reaccionar con un anti- ligando, péptidos fusogénicos, péptidos de localización nuclear, o una combinación de tales compuestos. Los ejemplos no limitantes de ligandos selectores incluyen asialoglicoproteína, insulina, lipoproteína de baja densidad (LDL) , folato, derivados de benzamida, y anticuerpos monoclonales y policlonales dirigidos contra moléculas de superficie celular. En algunas modalidades, la molécula pequeña comprende un derivado de benzamida . En algunas de estas modalidades, el derivado de benzamida comprende anisamida .
Por "célula objetivo" significa la célula para la cual un ligando selector de objetivo recluta una molécula físicamente asociada. El ligando selector de objetivo puede interactuar con uno o más constituyentes de una célula objetivo. La célula objetivo puede ser cualquier tipo celular o en cualquier etapa de desarrollo, que exhiba varios fenotipos, y puede estar en varios estados patológicos (por ejemplo, estado anormal y normal) . Por ejemplo, el ligando selector de objetivo puede asociarse con constituyentes normales, anormales y/o únicos o un microbio (es decir, una célula procariótica (bacteria), virus, hongo, protozoario o parásito) o una célula eucariótica (por ejemplo, células epiteliales, células musculares, células nerviosas, células sensoriales, células cancerígenas, células secretoras, células malignas, células eritroides y linfoides, y células madre) . De esta forma, el ligando selector de objetivo puede asociarse con un constituyente en una célula objetivo que es un antígeno asociado con la enfermedad que incluye, por ejemplo, antígenos asociados con el tumor y antígenos asociados con la enfermedad autoinmunitaria . Tales antígenos asociados con la enfermedad incluyen, por ejemplo, receptores del factor de crecimiento, reguladores del ciclo celular, factores angiogénicos , y factores de señalización.
En algunas modalidades, el ligando selector de objetivo interactúa con una proteína de superficie celular en la célula objetivo. En algunas de estas modalidades, el nivel de expresión de la proteína de la superficie celular que es capaz de unirse al ligando selector de objetivo es mayor en la célula objetivo con relación a las otras células. Por ejemplo, las células cancerígenas sobre-expresan ciertas moléculas de superficie celular, tales como el receptor HER2 (cáncer de pecho), o el receptor sigma. En ciertas modalidades en donde el ligando selector de objetivo comprende un derivado de benzamida, tal como anisamida, el ligando selector de objetivo selecciona la molécula asociada con las células que sobre-expresan el receptor sigma, que pueden incluir, pero no se limitan a, células cancerígenas tales como carcinoma de pulmón de célula pequeña y no pequeña, carcinoma renal, carcinoma de colon, sarcoma, cáncer de pecho, raelanoma, glioblastoma, neuroblastoma, y cáncer de próstata (Aydar, Palmer, and Djamgoz (2004) Cáncer Res. 64 :5029-5035) .
De esta forma, en algunas modalidades, la célula objetivo comprende una célula cancerígena. Los términos "cáncer" o "cancerígeno" se refieren a o describen la afección fisiológica en mamíferos que típicamente se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Como se utiliza en la presente, "células cancerígenas", o "células tumorales" se refiere a células que se caracterizan por su crecimiento celular no regulado. El término "cáncer" abarca todos los tipos de cáncer, incluyendo, pero no limitándose a, todas las formas de carcinoma, melanomas, sarcomas, linfornas y leucemias, incluyendo sin limitación, carcinoma de vejiga, tumores cerebrales, cáncer de pecho, cáncer cervical, cáncer colorrectal, cáncer esofágico, cáncer del endometrio, carcinoma hepatocelular, cáncer laríngeo, cáncer de pulmón, osteosarcoma, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer renal y cáncer de tiroides. En algunas modalidades, la célula cancerígena activada comprende una célula cancerígena de pulmón. El término "cáncer pulmonar" se refiere a todos los tipos de cáncer de pulmón, que incluyen pero se limitan a, cáncer de pulmón de célula pequeña (SCLC) , cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC, que incluye cáncer de pulmón de célula grande, cáncer de pulmón de células escamosas y adenocarcinoma de pulmón) , y cáncer de ulmón de célula pequeña/célula grande mixto.
El ligando selector de objetivo puede físicamente asociarse con un lípido catiónico de la fórmula (I) . Como se utiliza para la presente, el término "físicamente asociado" se refiere a cualquiera de una interacción covalente o no covalente entre dos moléculas. Como se utiliza en la presente, el término "enlace covalente" o "interacción covalente" se refiere a un enlace químico, en donde un par de electrones se comparten entre . dos átomos. Dos moléculas se dicen que están químicamente unidas entre sí cuando las moléculas tienen por lo. menos un. enlace químico entre átomos que forman las moléculas. Un enlace químico entre dos moléculas por consiguiente está comprendido de la compartición de un par de electrones entre un átomo y una molécula con un átomo en otra molécula. Por ejemplo, un ligando selector de objetivo puede covalentemente unirse a un lípido de la invención a través de uno de los átomos de nitrógeno o uno de los grupos R de los lípidos catiónicos. Un "conjugado" se refiere al complejo de moléculas que están covalentemente unidas . entre sí. Por ejemplo, el complejo de un lípido covalentemente unido a un ligando selector de objetivo puede referirse como un conjugado de ligando que activa el lípido.
Alterativamente, el ligando selector de objetivo puede estar no covalentemente unido a los lípidos de la fórmula (I) o sus derivados activos. "Enlaces no covalentes" o "interacciones no covalentes" no involucran la compartición de pares de electrones, sino más bien involucran variaciones más dispersas de interacciones electromagnéticas y pueden incluir el enlace de hidrógeno, interacciones iónicas, interacciones Van der Waals, y enlaces hidrófobos. Los conjugados de ligando que activan los lípidos pueden fácilmente obtenerse de acuerdo con las técnicas ampliamente descritas en la literatura.
B. Sistemas de Distribución La invención además proporciona sistemas de distribución. Como se utiliza en la presente, un "sistema de distribución", o "complejo del sistema de distribución" comprende un vehículo lípido y un compuesto bioactivo, en donde el vehículo lípido encapsula el compuesto bioactivo. Como se utiliza en la presente, "vehículo lípido" se refiere a una composición de lípido que es capaz de distribuir un compuesto bioactivo a un sitio o célula fisiológica. Los vehículos lípidos pueden incluir, pero no se limitan a, micelas, microemulsiones , macroemulsiones , y liposomas. Los vehículos lípidos están comprendidos de un lípido catiónico de la fórmula (I) . Los vehículos lípidos pueden nada más comprender por lo menos un tipo adicional de lípido, que incluyen, pero no se limita, a otro lípido catiónico o un co- lípido, como se describe en la presente.
Como se utiliza en la presente, el término "lípido" se refiere a un grupo de compuestos orgánicos que tienen propiedades lipófilas o anfifílicas, que incluyen, pero no se limitan a, grasas, aceites grasos, aceites esenciales, ceras, esteroides, esteróles, fosfolípidos , glicolípidos , sulfolípidos , aminolípidos , cromolípidos (lipocromo) , y ácidos grasos. El término "lípido" abarca tanto lípidos de existencia natural como sintéticamente producidos. "Lipófilo" se refiere a los compuestos orgánicos que se disuelven en grasas, aceites, lípidos y otros agentes no polares, tales como solventes orgánicos. Los compuestos lipófilos son moderadamente solubles o insolubles en agua. De esta forma, los compuestos, lipófilos son hidrófobos. Los lípidos anfifáticos, también referidos en la presente como "lípidos anfifílicos" se refieren a una molécula de lípido que tiene tanto características hidrófilas como hidrófobas. El grupo hidrófobo de un lípido anfifático, como se describe con mayor detalle inmediatamente a continuación, puede ser un grupo hidrocarburo de cadena larga. El grupo hidrófilo de un lípido anfifático puede incluir un grupo cargado, por ejemplo, un grupo aniónico o catiónico, o un grupo no cargado polar. Los lípidos anfifáticos pueden tener múltiples grupos hidrófobos, múltiples grupos hidrófilos, y una combinación de éstos. Debido a la presencia tanto de un grupo hidrófobo como un hidrófilo, los lípidos anfifáticos pueden ser solubles en agua, y en algún grado, solventes orgánicos no polares.
Como se utiliza en la presente, "hidrófilo" es una propiedad física de una molécula que es capaz de unirse al hidrógeno con una molécula de agua (H20) y es soluble en agua y otros solventes polares. Los términos "hidrófilo" y "polar" pueden utilizarse de manera intercambiable. Las características hidrófilas se derivan de., la presencia de grupos polares o cargados, tales- como carbohidratos, fosfato, carboxílico, sulfato, amino, sulfhidrilo, nitro, hidroxi y otros grupos similares.
Inversamente, el término "hidrófobo" es una propiedad física de una molécula que se repele de una masa de agua y puede referirse como "no polar" o "apolar" , todos estos términos pueden utilizarse de manera intercambiable con "hidrófobo" . La hidrofobicidad puede conferirse a través de la inclusión de grupos apolares que incluyen, pero no se limitan a, grupos hidrocarburo alifáticos saturados e insaturados de cadena larga y tales grupos sustituidos por uno o más grupo (s) aromático, cicloalifático o heterocíclico .
Los vehículos lípidos comprenden lípidos anfifáticos que incluyen, pero no se limitan a, fosfolípidos , aminolípidos , y esfingblípidos . Los ejemplos representativos de fosfolípidos - incluyen, pero no se limitan a, fosfatidil colina, fosfatidiletanolamaina, fosfatidilserina , fosfatidilinositol , ácido fosfatídico, palmitoiloleoil fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dioleilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina y dilinoleolilfosfatidilcolina . Otros compuestos que carecen de fósforo, tales como las familias - de esfingolípido, glicoesfingolípido, diacilgliceroles y ß-aciloxiácidos , también están dentro del grupo designado como lipidos anfifáticos. Los lipidos anfifáticos incluyen lipidos catiónicos, aniónicos, zwiteriónicos , o anfifáticos neutrales.
Los vehículos lipidos de los sistemas de distribución comprenden un lípido catiónico de la fórmula (I) y pueden comprender otros lipidos catiónicos. Como se utiliza en la presente, "lípido catiónico" abarca cualquier número de especies dé lípido que llevan una carga positiva neta en el pH fisiológico, que puede determinarse utilizando cualquier método conocido por el experto en la técnica. Los lipidos incluyen, pero no se limitan a, los lipidos de la invención como se describen en la presente, y otros lipidos catiónicos previamente descritos, tales como cloruro de N,N-dioleil-N, -dimetilamonio ( "DODAC" ) ; cloruro de N- (2 , 3 -dioleoiloxi ) propil) -N, N, N-trimetilamonio ( "DOTAP" ) ; cloruro de N-(2,3-dioleiloxi)propil) -N, N, -trimetilamonio ( "DOTMA" ) u otros agentes tensioactivos de N- (N, -l-dialcoxi) -alquil-N,N,N-de amonio trisustituido ; bromuro de N, M-diestearil -N, N-dimetilamonio ( "DDAB" ) ; 3 - (N- (N ' , N 1 -dimetilaminoetan) -carbamoil) colesterol ("DC-Choi") y bromuro de N-(l,2-dimiristiloxiprop-3-il) -N, N-dimetil-N-hidroxietil amonio ( "DMRIE" ) ; 1 , 3 -dioleoil -3 -trimetilamonio-propano, trifluoro-acetato - der N- (1- (2, 3 -dioleiloxi ) propil) -N- (2- (espermincarboxamido) etil) -?,?-dimeti-l amonio (DOSPA) ; GAP-DLRIE; DMDHP; S- ß [4N- (¾, 8N-diguanidino .. espermidino) -carbamoil] colesterol (BGSC) ; 3-ß [N, N-diguanidinoetil-aminoetano) -carbamoil] colesterol (BGTC) ; , N1, N2 , N3 Tetra-metiltetrapalmitilespermina (celfectina) N-t-butil-N' -tetradecil-S-tetradecil-aminopropion-amidina (CLONfectina) ; bromuro de dimetildioctadecil amonio (DDAB) ; 1, 3-dioleoiloxi-2- (6-carboxiespermil) -propil amida (DOSPER) ; 4-(2,3-bis-palmitoiloxi-propil) -1-metil-lH-imidazol (DPIM) yoduro de ?,?,?' ,?' -tetrametil-?,?' -bis (2-hidroxietil) -2 , 3-dioleoiloxi-1, 4-butandiamonio) (Tfx-50) ; 1,2 dioleoil-3- (4 ' -trimetilamonio) butanol-sn-glicerol (DOBT) o butanoato de colesteril (4 ' trimetilamonio) (ChOTB) en donde el grupo de trimetilamonio está conectado a través de un brazo separador de butanol a cualquiera de los grupos de cadena doble (para DOTB) o colesterilo (para ChOTB); DORI (DL-1, 2-dioleoil-3-dimetilaminopropil^-hidroxietilamonio) o DORIE (DL-1, 2-0-dioleoil-3 -dimetilaminopropil- -hidroxietilamonio-m) (DORIE) o sus análogos como se describe en WO 93/03709; éster de 1,2- dioleoil-3-succinil-sn-glicerol colina (DOSC) ; éster de colesteril hemisuccinato (ChOSC) ; lipopoliarainas tales como dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS) y dipalmitoil fosfatidiletanolamilespermina (DPPES) o los lípidos catiónicos descritos en la Patente de E. U. A. No. 5,283,185; yoduro de colesteril-3 -carboxil-amido-etilentrimetilamonio; yoduro de l-dimetilamino-3-trimetilammonio-DL-2-propil-colesteril carboxilato; colesteril-3-ß-carboxiamidoetilenamina; yoduro de colesteril- 3- ß-oxisuccinamido-etilentrimetilamonio; yoduro de 1-dimetilamino-S-trimetilammonio-DL-2 -propil-coles eril -3 - ß-oxisuccinato; yoduro de 2- (2-trimetilammonio) -etilmetilamino etil-coleste il-3-ß-oxisuccinato,¦ y 3-ß-?- (polietilenimina) -carbamoilcolesterol .
En algunas modalidades, además de los lípidos catiónicos, los vehículos lípidos utilizados para sistemas de distribución comprenden un co-lípido. Como se utiliza en la presente, un "co-lípido" se refiere a un lípido no catiónico, que incluye lípidos neutrales (sin cargar) , zwiteriónicos o aniónicos. El término "lípido neutral" se refiere a cualquiera de un número de especies de lípidos que existen ya sea en una forma no cargada o zwiteriónica neutral de un pH fisiológico. El término "lípido aniónico" abarca cualquiera de un número de especies de lípidos que llevan una carga negativa neta en el pH fisiológico. Los co-lípidos pueden incluir, pero no se limitan a diacilfosfatídilcolma , diacilfosfatidiletanolamina, ceramida, esfingomielina, cefalina, colesterol, cerebrosidas y diacilgliceroles , materiales relacionados con fosfolípido, tales como lecitina, fosfatidiletanolamina, 1isoleeitina , lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilserina , fosfatidilinositol , cardiolipina, ácido fosfatídico, dicetilfosfato, distearoilfosfatidilcolina (DSPC) , dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) , dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) , dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG) , palmitoiloleiolfosfatidilglicerol (POPG) , dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) , dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) , palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE) y 4-(N-maleimidometil) -ciclohexan-1-carboxilato de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE-mal) , estearil amina, dodecilamina, hexadecilamina, acetil palmitato, glicerolricinoleato, hexadecil esterato, isopropil miristato, polímeros acrílicos anfotéricos, trietanolamina- lauril sulfato, amidas de ácido graso de alquil-aril sulfato polietiloxilados , lisofosfatidilcolina, y bromuro de dioctadecildimetil amonio y similares.
Los co-lípidos también incluyen polímeros con base en polietilenglicol tales como PEG 2000, PEG 5000 y polietilenglicol conjugado con fosfolípidos o con ceramidas, como se describe en la Patente de E . U. A. No. 5,820,873, que se incorpora aquí por referencia.
Los vehículos lípidos de^^'o's sistemas de distribución comprenden lípidos catiónicos de la fórmula I que pueden incluir, pero no se limitan a, micelas, microemulsiones , macroemulsiones y liposomas.
El término "micelas" se refiere a agregados coloidales de moléculas anfifáticas, tales como los nuevos lípidos catiónicos de la fórmula (I) , que se forman a una concentración bien definida conocida como la concentración de micela crítica. Las micelas se orientan con las porciones no polares de las moléculas lípidas hacia el interior de la micela y las porciones polares hacia la superficie exterior, expuestas al agua. El número típico de moléculas agregadas en una micela (número de agregación) tiene un intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 100. El término "micela" también se refiere a micelas inversas o en reversa, que se forman en un solvente no polar, en donde las porciones no polares están en la superficie exterior, expuestas al solvente no polar y la porción polar orientada hacia el interior de la micela.
Como se describe en la presente, las microemulsiones son micelas esencialmente dilatadas, aunque no todas las soluciones mis celares pueden dilatarse para formar una microemulsión . Las microemulsiones son termodinámicamente estables, se forman espontáneamente, y contienen partículas que son extremadamente pequeñas. Los diámetros de la gotículas en las microemulsiones típicamente están en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nm. En contraste, el término microemulsiones se refiere a gotículas que tienen diámetros mayores de aproximadamente 100 nm.
Los liposomas son vesículas sustancialmente esféricas de auto-ensamble que comprenden una bicapa lípida que rodea un interior o núcleo acuoso, en donde la bicapa lípida comprende lípidos anfifáticos que tienen grupos principales hidrófilos y colas hidrófobas, en donde los grupos principales hidrófilos de las moléculas lípidas anfifáticas están orientadas hacia · la solución acuosa, mientras las colas hidrófobas se orientan hacia el interior de la bicapa. La estructura de bicapa lípida por lo tanto comprende dos monocapas opuestas que son referidas como el "foliólo interno" y el "foliólo exterior" , en donde las colas hidrófobas se protegen del contacto con el medio circundante. El "foliólo interno" es la monocapa en donde el grupo principal hidrófilo se orienta hacia el núcleo acuoso del liposoma. El "foliólo exterior" ,es la monocapa que comprende lípidos anfifáticos, en donde los grupos principales hidrófilos se orientan hacia la superficie exterior del liposoma. Los liposomas típicamente tienen un diámetro en el intervalo de aproximadamente 25 a. aproximadamente 1 m. (Ver, por ejemplo, Shah (ed.) (1998) icelles, -Microemulsions , and Monolayers: Science and Technology, Marcel Dekker; Janoff (ed.) (1998) Liposómes: Rational Design, Marcel Dekker). El término "liposoma" abarca tanto liposomas multilaminares comprendidos de cualquiera de dos . a cientos de bicapas lípidas concéntricas alternantes -con capas de una fase acuosa y vesículas unilaminares que están comprendidas de una sola bicapa lípida. Los métodos para hacer liposomas son bien conocidos en la técnica y. se describen en cualquier lugar en la presente. Los liposomas que comprenden los lípidos catiónicos de la fórmula (I) , tienen lípidos catiónicos incorporados en la bicapa lípida del liposoma.
Como : se utiliza en la presente, el término "superficie exterior" tiene el. significado ordinario del término y se refiere a la superficie exterior del vehículo lípido, según opuesto, al núcleo interno del vehículo.
Los vehículos lípidos de los sistemas de distribución encapsulan un compuesto bioactivo. Los términos "encapsular" e "insuflar" se utilizan en la presente de manera intercambiable y se refieren a la incorporación o asociación de una sustancia o molécula (por ejemplo, un compuesto bioactivo) en o con un vehículo lípido. Por ejemplo, en las modalidades en donde el vehículo lípido es un liposoma,' la sustancia o molécula puede asociarse con la bicapa lípida (por ejemplo, si la sustancia o molécula es hidrófoba) o está presente en el interior acuoso del liposoma (por ejemplo, si la sustancia o molécula es hidrófila) , o ambas. Los fármacos hidrófobos también pueden encapsularse dentro de las micelas, una microemulsión, o una macroemulsi.ón . 1. Liposomas Catiónicos De acuerdo con la invención, el vehículo lípido del sistema de distribución puede ser un liposoma catiónico. El término "liposoma catiónico" como se utiliza en la presente pretende abarcar cualquier liposoma como se define anteriormente que tiene una carga positiva neta o tiene un potencial zeta mayor de 0 mV a un pH fisiológico. El potencial zeta o carga del liposoma puede medirse utilizando cualquier método conocido por un experto en la técnica. Se debe entender que el liposoma por sí mismo es la entidad que se está determinando como catiónica, lo que significa que el liposoma que tiene una carga positiva miscible a un pH fisiológico puede, dentro de un entorno in vivo unirse a otras sustancias. Estas otras sustancias pueden estar negativamente cargadas y por lo tanto dan como resultado la formación de una estructura que no tiene una carga positiva. Después de que se produce un sistema de distribución que comprende un liposoma catiónico, las moléculas tales como los conjugados lípidos-PEG pueden insertarse en la bicapa de liposoma como se describen en cualquier lugar en la presente, de esta forma protegiendo la carga de superficie y reduciendo el potencial zeta del sistema de distribución.
En las- modalidades en. donde el vehículo lípido del sistema de distribución es un liposoma catiónico, el liposoma catiónico comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) y opcionalmente comprende lipidos catiónicos adicionales, que incluyen, pero no se limitan a los descritos en cualquier lugar en: la presente. El liposoma catiónico no necesita estar comprendido completamente de , lipidos catiónicos, sin embargo, debe estar comprendido de una cantidad suficiente de lípido catiónico de tal forma que el -liposoma tenga una carga positiva a un pH fisiológico. Los liposomas catiónicos también pueden contener co- lipidos que están negativamente cargados o neutrales, mientras la carga neta de los liposomas sea positiva y/o la superficie del liposoma esté positivamente cargada a un pH fisiológico.
En estas modalidades, la relación de lipidos catiónicos.. a co- lipidos es tal que el cambio global de liposoma resultante es positivo a un pH fisiológico. Por ejemplo, el lípido catiónico está presente en el liposoma de aproximadamente 10% en moles a aproximadamente 100% en moles de lípido liposómico total, en algunas modalidades, de aproximadamente 20% en moles a aproximadamente 80% en moles, y, en otras modalidades, de aproximadamente 20% en moles a aproximadamente 60% en moles. El lípido neutral, cuando se incluye en el liposoma, puede estar a una concentración de aproximadamente 0% en moles a aproximadamente 90% en moles del lípido liposómico total, en algunas modalidades de aproximadamente 20% en moles a aproximadamente 80% en moles, y en otras modalidades de aproximadamente 40% en moles a aproximadamente 80% en moles. El lípido negativamente cargado, cuando se incluye en el liposoma, puede estar presente en la concentración en el intervalo de aproximadamente 0% en moles a aproximadamente 49% en moles de lípido liposómico total, y ciertas modalidades, de aproximadamente 0% en moles a aproximadamente 4.0% en moles.
En algunas modalidades, los liposomas catiónicos de los sistemas de distribución comprenden un lípido catiónico de la fórmula (I) y el co-lípido neutral de colesterol a una relación molar de 1:1.
En algunas modalidades en donde el vehículo lípido del sistema de distribución es un liposoma catiónico, el liposoma catiónico encapsula un compuesto bioactivo aniónico (es decir, un compuesto bioactivo que está negativamente cargado a un pH fisiológico) . En estas modalidades, los lípidos catiónicos positivamente cargados comprenden los liposomas catiónicos que están físicamente asociados con el compuesto bioactivo aniónico negativamente cargado a través de la. atracción entre las cargas moleculares opuestas.
En algunas modalidades en donde el vehículo lípido es un liposoma catiónico y el compuesto bioactivo es aniónico, el sistema de distribución tiene una carga positiva neta, como se describe en la Patente de E. U. A. No. 6,008,202, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Por "carga positiva neta" significa que las cargas positivas de lípido catiónico (y opcionalmente , policatión, como se describe en cualquier lugar en la presente) exceden la carga negativa del compuesto bioactivo aniónico. Se entiende, sin embargo, que la presente invención también abarca sistemas de distribución- que comprenden un vehículo lípido que tiene una superficie positivamente cargada independientemente de si la carga neta del complejo es positiva, neutral o aún negativa. La carga de la superficie de un liposoma catiónico de un sistema de distribución puede medirse a través de la migración del complejo en un campo eléctrico a través de métodos conocidos en la técnica, tales como la medición del potencial zeta (Martin, Swarick, and Cammarata (1983) Physical Pharmacy & Physical Chemical Principies in the Pharmaceutical Sciences, 3a ed. Lea and Febiger) o a través de afinidad de unión del complejo del sistema del distribución a las superficies celulares. Los complejos exhiben una superficie positivamente cargada que tiene una mayor afinidad de unión en las superficies celulares que los complejos que tienen una superficie neutral o negativamente cargada. Además, se entiende que la superficie positivamente cargada puede protegerse estéricamente a través de la adición de compuestos polares no iónicos, por ejemplo, polietilenglicol , como se describe en cualquier lugar en la presente . 2. Compuestos Bioactivos Por "compuesto bioactivo" significa cualquier agente que tiene un efecto sobre una célula viviente, tejido u organismo o un agente que puede interactuar con un componente (por ejemplo, enzima) de una célula, tejido u organismo vivo, que incluye, . pero no se limita a, polinucleótidos , polipéptidos , polisacáridos , o moléculas pequeñas orgánicas e inorgánicas. El término "compuesto bioactivo" abarca tanto compuestos bioactivos de existencia natural como sintéticos. El término -."compuesto bioactivo" también puede referirse a un agente de detección o diagnóstico que interactúa con una molécula biológica para proporcionar una lectura detectable que refleja un. evento fisiológico o patológico particular.
El compuesto bioactivo del sistema de distribución puede ser un fármaco, que incluye, pero no se limita a, antimicrobianos, antibióticos, antimicobacterianos, antifúngicos , antivíricos, agentes neoplásicos, agentes que afectan la respuesta inmunitaria, reguladores de calcio en la sangre, agentes útiles en la regulación de glucosa, anticoagulantes, antitrombóticos , agentes antihiperlipidémicos , fármacos cardiacos, fármacos tiromiméticos y antitiroides, adrenérgicos , agentes antihipertensivos , colinérgicos , anticolinérgicos , antiespasmódicos , agentes anti-úlcera, relajantes de esqueleto y el músculo suave, prostaglandinas , inhibidores generales de la respuesta alérgica, antihistaminas , anestésicos locales, analgésicos, antagonistas narcóticos, antitusivos, agentes sedantes-hipnóticos, anticonvulsivos , antipsicóticos , agentes anti -ansiedad, agentes antidepresivos, anorexigénicos , agentes anti - inflamatorios no esteroidales , agentes anti-inflamatorios esteroidales , antioxidantes, agentes vaso-activos, agentes óseo-activos , antiartríticos, y agentes de diagnóstico.
En ciertas modalidades, el compuesto bioactivo puede ser un compuesto bioactivo citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, que incluye los frecuentemente utilizados para tratar cáncer. Como se utiliza en la presente, un "compuesto bioactivo citotóxico" es uno que tiene actividad citotóxica como se describe en cualquier lugar en la presente. Los agentes quimioterapéuticos son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Gilman A. G. , et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics , 8a Ed. , Sec 12:1202-1263 (1990)) e incluyen, pero no se limitan a, agentes de alquilación, antimetabolitos , productos naturales y sus derivados, hormonas y esteroides (incluyendo análogos sintéticos), toxinas y sintéticos. Los. ejemplos de agentes de alquilación (por ejemplo, mostaza de nitrógeno, derivados de etilamina, alquilsulfonatos , nitrosoureas y triazenos) incluyen mostaza de uracilo, clormetina, ciclofosfamida (Cytoxan®) , ifosfamida, melfalano, clorambucil, pipobromano, trietilen-me-lamina , trietilentiofosforamina, busulfano, carmustina, lomustina, estreptozocina , dacarbazina, y temozolomida . Los antimetabolitos (incluyendo antagonistas de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de adenosina deaminasa) pueden incluir, por ejemplo, metotrexato, 5-fluorouracilo, floxuridina, citarabina, 6 -mercaptopurina , 6 -tioguanina , fosfato de fludarabina, pentostatina , y gemcitabina. Los productos naturales y sus derivados (incluyendo vinca-alcaloides, antibióticos antitumorales , enzimas, linfocinas y epipodofilotoxinas) también pueden utilizarse e incluirse, por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina, bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina , epirubicina, idarubicina, paclitaxel (paclitaxel está comercialmente disponible como taxol, mitramicina, desoxico-formicina, mitomicina-C, L-asparaginasa, interferones (especialmente IFN-alfa) , etoposida, y teniposida. Las hormonas y esteroides (incluyendo análogos sintéticos) incluyen, por ejemplo 17-alfa-etinilestradiol , dietilestilbestrol , testosterona, prednisona, fluoximesterona, propionato de dromoestanolona , testolactona, megestrolacetato, tamoxifeno, metilprednisolona , metiltestosterona , prednisolona, triamcinolona, clorotrian-iseno, hidroxiprogesterona, aminoglutetiraida, estramustina, medroxiprogesteronacetato, leuprolida, flutamida, toremifeno, o zoladex .. Los ejemplos no limitantes de toxinas incluyen ricina A y toxina de difteria. Los sintéticos ilustrativos (incluyendo complejos inorgánicos tales como los complejos de coordinación de platino) incluyen cisplatina, carboplatina , hidroxiurea, amsacrina, procarbazina , mitotano, mitoxantrona , levamisola, · y hexametilmelamina .
Como se utiliza en la presente, el término "distribuir" se refiere a transferir una sustancia o molécula (por ejemplo, un compuesto bioactivo) a un sitio fisiológico, tejido o célula. Esto abarca la distribución a la porción intracelular de una célula o al espacio extracelular .
Como se utiliza en la presente, el término "intracelular" o "intracelularmente" tiene su significado ordinario como se entiende la técnica. En general, el espacio interior de una célula, que se encircula por una membrana, se define como espacio "intracelular". Similarmente , como se utiliza en la presente, el término "extracelular" o "extracelularmente" tiene su significado ordinario como se entiende en la técnica. En general, el espacio exterior de la membrana celular se define como "espacio extracelular" .
En ciertas modalidades, el sistema de distribución comprende un sistema de distribución citotóxico. Como se utiliza en la -presente, un "sistema de distribución citotóxico" es uno que tiene una actividad citotóxica, como se describe en cualquier en la presente. El vehículo lípido del sistema de distribución citotóxico comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) . La actividad citotóxica del sistema de distribución citotóxico puede impartirse de un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) , un compuesto bioactivo citotóxico, o ambos. De esta forma, en algunas modalidades, el sistema de distribución citotóxico comprende un vehículo lípido y" encapsula un compuesto bioactivo citotóxico, en donde el vehículo lípido comprende un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) . a. Polinucleótido de Interés En algunas modalidades, el compuesto bioactivo del sistema de distribución comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) que comprende un polinucleótido . Ya que no se desea estar unido a ninguna teoría o mecanismo de acción, se cree que el grupo principal de guanidinio dentro de los lípidos catiónicos de la fórmula (I) funcionalmente simula los residuos de arginilo en las proteínas de unión a ADN, tales como histonas y protamina, y ayuda en la condensación de los polinucleótidos . El grupo principal de guanidinio también forma enlaces de hidrógeno zwiteriónicos paralelos característicos con iones de fosfato, tales como los encontrados en las estructuras del ácido, nucleico, y pueden formar enlaces de hidrógeno con -base de ácido nucleico, y contribuyen a la estabilidad de los sistemas de distribución de polinucleótido (Vigneron et al. (1996) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 93:9682-9686)-.-· - - ¦ El término "polinucleótido" pretende abarcar un ácido nucleico singular, así como ácidos nucleicos plurales, y se refiere a una molécula o constructo de ácido nucleico, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) , ADN de plásmido (ADNp) , o ARN de interferencia corta (ARNsi) . Un polinucleótido puede ser de estructura de cadena individual o de estructura de cadena doble, lineal o circular. Un polinucleótido puede comprender un enlace de fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace de amida, tal como el que se encuentra en los ácidos nucleicos de péptido (PNA por sus siglas en inglés) ) . El término "ácido nucleico" se refiere a cualquiera de los segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos . de ADN- o ARN, presentes en un polinucleótido. El término "polinucleótido" puede referirse a un ácido nucleico o polinucleótido aislado, en donde por ácido nucleico o polinucleótido "aislado" significa una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que ha sido removida de su entorno nativo. Los ejemplos de un polinucleótido. aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospederas heterólogas o polipéptidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Los polinucleótidos aislados o -- ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención además incluyen moléculas producidas sintéticamente. Los polinucleótidos aislados también pueden incluir vectores de expresión aislados, constructos de expresión,, o sus poblaciones. "Polinucleótido" también puede referirse a productos amplificados del mismo, como en una reacción de cadena de polimerasa. El "polinucleótido" puede contener ácidos nucleicos modificados, tales como fosforotionato, fosfato, derivados modificados del átomo anular, y similares. El "polinucleótido" puede ser un polinucleótido de existencia natural (es decir, uno que existe en la naturaleza sin la intervención humana) , o un polinucleótido recombinante (es decir, uno que existe solamente con ..la intervención humana) . Ya que los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido" ambos se refieren a un polímero de nucleótidos, como se utiliza en la presente, un oligonucleótido es típicamente menor de 100 nucleótidos en longitud .
Como se utiliza en la presente, el término "polinucleótido de interés" se refiere a un polinucleótido que se suministra a una célula para provocar un efecto deseado en la célula (por ejemplo, un efecto terapéutico, un cambio en la expresión del gen) . Un polinucleótido de interés puede ser de cualquier longitud y puede incluir, pero no se limita a un polinucleótido que comprende una secuencia de codificación- para un polipéptido de interés o un polinucleótido que comprende un elemento de silenciación. En ciertas modalidades, cuando el polinucleótido se expresa o introduce en - una célula, el polinucleótido de interés o polipéptido codificado- por lo tanto tiene actividad terapéutica.
El término "sistema de distribución de polinucleótido" se refiere a un sistema de distribución en donde el compuesto bioactivo comprende un polinucleótido .' Los sistemas de distribución de polinucleótido de la presente invención comprenden nuevos lípidos catiónicos de la fórmula (I) como se describe en cualquier lugar en la presente. Típicamente, el vehículo lípido del sistema de distribución de polinucleótido es un liposoma catiónico. En estas modalidades, el liposoma catiónico está físicamente asociado con el polinucleótido negativamente cargado a través de la atracción entre las cargas moleculares opuestas.
En particular, las modalidades no limitantes en donde el vehículo lípido comprende un liposoma catiónico, el sistema de distribución de polinucleótido tiene una relación de carga +:- de entre 0.5:1 y 100:1, incluyendo pero no limitándose a aproximadamente 0.5:1, aproximadamente 1:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 6:1, aproximadamente 7:1, aproximadamente 8:1, aproximadamente 9:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 15:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 40: 1, o aproximadamente 100:1. En algunas modalidades, la relación de la carga está entre aproximadamente 0.5:1 y aproximadamente 40:1, entre aproximadamente 0.5:1 y aproximadamente 20: 1, entre aproximadamente 0.5:1 y aproximadamente 10:1, entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 40:1, entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 20:1, entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente- 15:1, o entre aproximadamente 3:1 y aproximadamente 9:1. En una modalidad no limitante específica, la relación de carga +:- es de aproximadamente 5:1. La carga positiva se imparte desde el liposoma catiónico y en algunas modalidades desde el policatión también. La carga negativa se imparte a través del polinucleótido y en algunas modalidades, a través de una macromolécula portadora polianiónica también. De esta forma, en algunas modalidades, la relación de carga del liposoma (+) : policatión (+) polinucleótido/macromolécula portadora polianiónica (-) es de aproximadamente 4:1:1.
Los métodos para generar sistemas de distribución de polinucleótido comprenden liposomas como el vehículo lípido que se conocen en la técnica y se revisan en Li and Szoka (2007) Pharm. Res. 24:438-449. i. Polipéptidos que codifican polinucleótidos En algunas modalidades, los sistemas de distribución de polinucleótido comprenden un polinucleótido que comprende una secuencia de codificación para un polipéptido de interés.
Para- los propósitos de la presente invención, una • "secuencia....de codificación para un polipéptido de interés" o "región de codificación para un polipéptido de interés" se refiere a una secuencia de polinucleótido que codifica el ¦ polipéptido. Como se utiliza en la presente, los términos "codificación" o "codificado" como se utiliza en el contexto de un ácido nucleico especificado significa que el ácido nucleico comprende la información requisito para dirigir la transferencia de la secuencia de nucleótido en un polipéptido especificado. La información a través de la cual un polipéptido se codifica se especifica por el uso de codones . La "región de codificación" o "secuencia de codificación" es la porción del ácido nucleico que consiste de codones que pueden transferirse a los aminoácidos. Aunque un "codón de detención" o "codón de terminación de transferencia" (TAG, TGA, o TAA) no se transfiere al aminoácido, puede considerarse como siendo parte de una región de codificación. Igualmente, un codón de iniciación de transcripción (ATG) . puede o no puede considerarse como siendo parte de una región de codificación. Cualquier secuencia de flanqueo de la región de codificación, sin embargo, por "ejemplo, promotores, sitios de unión de ribosoma, terminadores de transcripción, intrones y similares, no se consideran- como parte, de la región de codificación. En algunas modalidades, sin embargo, ya que no se considera parte de la región de codificación per se, estas secuencias reguladoras y cualquier otra secuencia reguladora, particularmente ¦ secuencias de señal o secuencias de codificación de una etiqueta de péptido, pueden ser parte de la secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido. De esta forma, una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido de interés comprende la secuencia¦ de codificación y opcionalmente cualquier secuencia de flanqueo de la región de codificación que contribuye a la expresión, secreción y/o aislamiento del polipéptido de interés.
El término "expresión" tiene el significado como se entiende en la técnica y se refiere al procedimiento de convertir la información genética codificada en un gen o una secuencia de codificación en. ARN (por ejemplo, AR m, ARNr, ARNt, o ARNsn) a través de la "transcripción" de un polinucleótido (por ejemplo, a través de la acción enzimática de una polimerasa de ARN) , y para polinucleótidos que codifican polipéptidos , en un polipéptido a través de la "transferencia" del ARNm. De esta forma, un "producto de expresión" es, en general, un ARN transcrito del gen (por ejemplo, ya sea pre- o post-procesamiento) o polinucleótido, o un polipéptido codificado por un AR transcrito del gen (por ejemplo, ya sea pre- o post-modificación) .
Como se utiliza en la presente, el término "polipéptido" o "proteína", pretende abarcar un "polipéptido" singular así como "polipéptidos" plurales, y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácido) linealmente enlazados por enlaces de amida (también conocidos como enlaces de péptido) . El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. De esta forma, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos , "proteína" , "cadena de aminoácido" o cualquier otro término utilizado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, se incluyen dentro de la definición de "polipéptido" y el término "polipéptido". puede utilizarse en lugar de, o de manera intercambiable con cualquiera de estos términos .
El término "polipéptido de interés" se refiere a un polipéptido que se va a distribuir a una célula o se codifica por un polinucleótido que se va a distribuir a una célula para provocar un efecto deseado en la célula (por ejemplo, un efecto terapéutico) . El polipéptido de interés puede ser de cualquier especie y de cualquier tamaño. En ciertas modalidades, sin embargo, la proteína o polipéptido de interés es una proteína o polipéptido terapéuticamente útil. En algunas modalidades, la proteína puede ser una proteína de mamífero, por ejemplo una proteína de humano. En ciertas modalidades, el polinucleót ido comprende una secuencia de codificación para un supresor de tumor o una citotoxina (por ejemplo, la toxina de difteria (DT) , la exotoxina A de Pseudomonas (PE) 7 la toxina de tosferina (PT) y adenilato ciclasa de tosferina (CYA.) ) .— El término "supresor de tumor" se refiere a un polipéptido de un gen que codifica un polipéptido que es capaz de inhibir el desarrollo, crecimiento o avance de cáncer. Los polipéptidos supresores de tumor incluyen las proteínas que regulan la proliferación celular o las respuestas: al daño celular y genómico, o induce la apoptosis. Los ejemplos no limitantes de genes supresores de tumor incluyen p53, pllORb, y p72. De esta forma, en algunas modalidades, los . -sistemas de distribución de lípido/polinucleótido de la presente invención comprenden un polinucleótido que comprende una secuencia de codificación para un supresor tumoral .
La información de secuencia extensa requerida para genéticos moleculares y técnicas de modificación genética están públicamente disponibles. El acceso a secuencias de nucleótido completas de mamíferos, así como secuencias de humano, genes ADNc, secuencias de aminoácido y genomas pueden obtenerse de GenBank en el sitio web www.ncbi.nlra.nih.gov/Entrez. -La información adicional también obtenerse de GeneCards, una enciclopedia electrónica que integra la información acerca de los genes y sus productos de aplicaciones biomédicas de Weizmann Institute of Science Genome and Bioinformatics -. (bioinformatics.weizmann.ac.il/cards), información - de secuencia del nucleótido también puede obtenerse de la Base de Datos de Secuencias de Nucleótidos EMBL (www.ebi.ac.uk/embl) o el Banco de Datos de ADN o Japón (DDBJ, www.ddbi.nig.ac.jp). Los sitios adicionales para información sobre secuencias de aminoácido incluyen el sitio web de recursos de información de proteína de Georgetown (www.pir.georgetown.edu) y Swiss-Prot (au.expasy.org/sprot/sprot-top.html) . ii. Elementos de silenciación En algunas modalidades, el polinucleótido de los .sistemas de distribución de polinucleótidos de la invención comprenden elementos silenciadores, en donde la expresión o la introducción del elemento silenciador en la célula reduce la expresión de un polinucleótido objetivo o un polipéptido codificado por el mismo.
Como se utiliza en la presente, los términos "introduce" e "introduciendo" cuando se refieren a un polinucleótido del elemento de silenciación se refieren a la presentación del polinucleótido o elemento de silenciación a una célula en tal forma que " el polinucleótido o elemento de silenciación gana acceso a la región intracelular de la célula .
Como se utiliza en la presente, el término "elemento silenciador" se refiere a un polinucleótido, que cuando se expresa o introduce en una célula es capaz de reducir o eliminar el nivel de expresión de la secuencia de polinucleótido objetivo o el polipéptido codificado por la misma. El elemento silenciador puede comprender o codificar un oligonucleótido antisentido o un ARN de interferencia (iAR ) . El—término "AR de interferencia" o "iARN" se refiere a cualquier molécula de ARN que puede entrar en una trayectoria de iARN y por lo tanto reducir la expresión de un polinucleótido objetivo de interés. La trayectoria de iARN representa la nucleasa enzima Dicer y los complejos de silenciación inducidos por ARN (RISC) que funcionan para degradar o bloquear la transferencia de un ARNm objetivo. iARN es diferente de los oligonucleótidos antisentido en que funciona a través de mecanismos "antisentido" que típicamente involucran la inhibición de un transcripto objetivo a través de un oligonucleótido de estructura de cadena individual a través de una trayectoria mediada por RNasa H. Ver, Crooke (ed.) (2001) "Antisense Drug Technology: Principies, Strategies, and Applications" (la. ed) , Marcel Dekker; ISBN: 0824705661; la. edición.
Como se utiliza en la presente, un "polinucleótido objetivo" comprende cualquier secuencia de polinucleótido en donde se desea disminuir el nivel de expresión. Por "reduce" o "reduciendo" el nivel de expresión de un polinucleótido o un polipéptido codificado por lo tanto pretende significar, en nivel del polinucleótido o del polipéptido codificado que es estadísticamente inferior al del nivel- del polinucleótido objetivo o nivel del polipéptido codificado en un control apropiado que no se expone al elemento de silenciación . En modalidades particulares, la · reducción del nivel del polinucleótido objetivo y/o el nivel polipéptido codificado de acuerdo el tema de la presente descripción da como resultado en menos del 95%, menos de 90%, menos de 80%, menos de 70%, menos de 60%, menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, o menos de 5% del nivel de polinucleótido objetivo, o el nivel del polipéptido codificado por lo tanto en un control apropiado. Los métodos para ensayar- el nivel . del... transcripto, de AR , el nivel de polipéptido codificado, o la actividad del polinucleótido o polipéptido se explican en cualquier lugar en la presente.
En algunas modalidades, el polinucleótido objetivo es un oncogén o un proto-oncogén . El. término "oncogén" se utiliza en la presente de acuerdo con su significado aceptado en la técnica para referirse a las secuencias de polinucleótido que codifican un producto de gen que contribuye a la iniciación o el avance del cáncer. El término "oncogén" abarca proto-oncogénes, que son genes que no contribuyen a la carcinogénesis bajo circunstancias normales, pero que han sido mutados, sobre-expresados o activados en tal forma que funcionan como un oncogén. Los ejemplos no limitantes de oncogénes incluyen factores de crecimiento o mitógenos (por ejemplo, cSis) , tirosina cinasa de receptor (por ejemplo, receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) , receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGFR) , receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) , HER2/neu) , tirosina cinasas citoplásmicas (por ejemplo, src, Abl) serina citoplásmica/treonina cinasas (por ejemplo, raf cinasa, cinasas dependientes de ciclina) , reguladores GTPases (por ejemplo, ras), y factores de transcripción (por ejemplo, myc) . En algunas modalidades, el polinucleótido objetivo es EGFR .
El término "complementario" se utilizan en la presente de acuerdo con su significado aceptado en la técnica para referirse a la capacidad para precisamente emparejarse a través de enlaces de nitrógeno (por ejemplo, emparejamiento base de Watson-Crick o emparejamiento base de Hoogsteen) entre dos nucleósidos, nucleótidos o ácidos nucleicos, y similar, por ejemplo, si un nucleótido en una cierta posición de un primer ácido nucleico es capaz de establemente unirse a hidrógeno con un nucleótido localizado opuesto al nucleótido en un segundo ácido nucleico, cuando los ácidos nucleicos están alineados en la orientación 5' a 3' opuesta (es decir, en una orientación -anti-paralela) , entonces los ácidos nucleicos se consideran como siendo complementarios en esa posición (en donde la posición puede definirse con relación ya sea al extremo de cualquier ácido nucleico, generalmente con respecto al extremo 5'). Los nucleótidos localizados opuestos entre sí pueden referirse como un "par base" . Un par base complementario contiene dos nucleótidos complementarios, por ejemplo, A y U, A y T, G y C, y similar, mientras un par base no complementario contiene dos nucleótidos no complementarios (también referidos como incompatibilidad) . Dos polinucleótidos se dice que son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula está ocupada por nucleótidos que se unen al hidrógeno entre sí, es decir, un número suficiente de pares base son complementarios. - Como se utiliza en la presente, el término "gen" tiene su significado como se entiende en la técnica. En general, un gen se toma para incluir secuencias reguladoras de gen (por ejemplo, promotores, potenciadores y similares) y/o secuencias de intrón, además de secuencias de codificación (marcos de lectura abierto). Además, se aprecia que las definiciones de "gen" incluyen referencias a ácidos nucleicos que no codifican proteínas sino más bien codifican moléculas de ARN funcionales, o sus precursores, tales como microARN o precursores de ARNsi, sARNt, y similares.
El término "hibridiza" como se utiliza en la presente se refiere a la interacción entre dos secuencias de ácido nucleico complementarias en donde las dos secuencias permanecer asociadas entre sí bajo condiciones apropiadas.
Un elemento silenciador puede comprender el ARN de interferencia u oligonucleótido antisentido, un precursor del ARN de interferencia u oligonucleótido antisentido, una plantilla para la transcripción de una ARN de interferencia u oligonucleótido antisentido, o una plantilla para transcripción del ARN de interferencia precursor . u oligonucleótido antisentido, en donde el precursor se procesa dentro de la célula para producir un ARN de interferencia o oligonucleótido antisentido. De esta formar, por ejemplo, un •elemento silenciador de ARNds incluye una molécula ARNds, o un transcripto o polinucleótido capaz de formar un ARNds, más de un transcripto o polinucleótido capaz de formar un ARNds, un ADN que codifica una molécula de ARNds, o un ADN que codifica una estructura de una molécula de ARNds. Cuando el elemento de silenciación comprende una molécula de ADN que codifica una ARN de interferencia, se reconoce que el ADN puede temporalmente expresarse en una célula o establemente incorporarse en el genoma de- la célula. Tales métodos se explican con mayor ..detalle en cualquier lugar en la presente.
El elemento silenciador puede reducir o eliminar el nivel de expresión de un polinucleótido objetivo o polipéptido codificado por la influencia en el nivel del transcripto de ARN objetivo, mediante la influencia de la transferencia o por- la influencia de la expresión en el nivel pre-transcripción (es decir, a través de la modulación de la estructura de cromatina, el patrón de metilación, etc., para alterar, la expresión genética). Ver, por ejemplo, Verdel et al (2004) Science 303:672-676; Pal-Bhadra et al (2004) Science 303:669-672; Allshire (2002-) Science 297:1818-1819; Volpe et al (2002) Science 297:1833-1837; Jenuwein (2002) Science 297:2215-2218; y Hall et al (2002) Science 297:2232-2237. Los métodos para ensayar el ARN de interferencia funcional que son capaces de reducir o eliminar el nivel de una secuencia de interés se describen en cualquier lugar en la presente.
Cualquier región del polinucleótido objetivo puede utilizarse para diseñar un dominio del elemento silenciador que comparte suficiente identidad de secuencia para permitir que elemento de silenciación disminuya el nivel del polinucleótido objetivo o polipéptido codificado. Por ejemplo, el elemento silenciador puede diseñarse para compartir identidad de secuencia en la región sin transferir 5' del polinucleótido (s) objetivo, la región sin transferir 3' del polinucleótido (s) objetivo, las regiones exónicas del polinucleótido (s) objetivo, las regiones intrónicas del polinucleótido (s) objetivo, y cualquier combinación de éstos.
La habilidad de un elemento silenciador para reducir el nivel del polinucleótido objetivo puede evaluarse directamente midiendo la cantidad de transcripto objetivo utilizando, por ejemplo, Northern blots, ensayos de protección de nucleasa, . transcripción inversa (RT) -PCR, RT-PCR en tiempo real, análisis de microarreglo, y similar. Alternativamente, la habilidad del elemento silenciador para reducir el nivel del polinucleótido objetivo puede medirse directamente utilizando una variedad de métodos basados en afinidad (por ejemplo, utilizando un ligando o anticuerpo que específicamente se une al polipéptido objetivo) que incluyen, pero no se limitan a, Western, blots, inmunoensayos, ELISA, citometría de flujo, microarreglos de proteína, y similar. En aún otros métodos la habilidad del elemento silenciador para reducir el nivel del polinucleótido objetivo puede evaluarse indirectamente, por ejemplo, midiendo una actividad funcional del polipéptido codificado por el transcripto o midiendo una señal producida por el polipéptido codificado por el transcripto .
Se explican varios tipos de los elementos silenciadores con mayor detalle a continuación. 1) Elementos Silenciadores de ARN de Estructura de Cadena Doble En una modalidad, el elemento silenciador comprende o codifica una molécula de ARN de estructura de cadena doble. Como se utiliza en la presente, un "ARN de estructura de cadena doble", o "ARNds" se refiere a una estructura de polinucleótido formada ya sea por una molécula de ARN auto-complementaria individual o una estructura de poliribonucleótido formada por la expresión de por lo menos dos estructuras de cadena de ARN diferentes. Por consiguiente, como se utiliza en la presente, el término "ARNds" significa que abarca otros términos utilizados para definir moléculas de ácido nucleico que son capaces de mediar la interferencia de ARN o la silenciación del gen, incluyendo, por ejemplo, ARN pequeño (ARNs) , ARN de interferencia corta (ARNsi) , ARN de estructura de cadena doble (ARNds) , micro-ARN (miARN) , ARN de horquilla, ARN de horquilla corta (ARNsh) , y otros. Ver, por ejemplo, Meister and Tuschl (2004) Nature 431:343-349 and Bonetta et al. (2004) Nature Methods 1:79-86.
En modalidades específicas, por lo menos una estructura de la región de estructura de cadena dúplex o doble del ARNds comparte suficiente identidad de secuencia o complementariedad de secuencia con el polinucleótido objetivo para permitir que el ARNds reduzca el nivel de expresión del polinucleótido objetivo o polipéptido codificado. Como se utiliza en la presente, la estructura que es complementaria al polinucleótido objetivo es la "estructura antisentido", y la estructura homologa el polinucleótido objetivo que es la "estructura sentido" .
En una modalidad, el ARNds comprende un ARN de horquilla. Un ARN de horquilla comprende una molécula de ARN que es capaz de plegarse sobre sí misma para formar una estructura de cadena doble. Las múltiples estructuras pueden utilizarse como elementos de horquilla. Por ejemplo, la molécula de ARN de horquilla que se hibridiza a sí misma para formar una estructura de horquilla puede comprender una región de bucle de estructura de cadena doble y una célula madre emparejada base. La región madre emparejada base puede comprender una secuencia sentido que corresponde a todo o parte del polinucleótido objetivo y además comprende una secuencia antisentido que está completa o parcialmente complementaria a la secuencia sentido. De esta forma, la región madre emparejada base del elemento silenciador puede determinar la especificidad de la silenciación . Ver, por ejemplo, Chuang and eyerowitz (2000) Proc . Nati. Acad. Sci . USA 97:4985-4990, que se incorpora . aquí por referencia. Un ensayo temporal para la eficiencia de los constructos de ARNhp para la expresión del gen de silencio in vivo se ha «descrito por Panstruga et al. (2003) Mol. Biol . Rep . 30:135- 140, que se incorpora aquí por referencia. 2) Elementos de Silenciación de ARNsi Un "ARN de interferencia corto" o "ARNsi" comprende un dúplex de ARN (región de estructura de cadena doble) y además puede comprender uno o dos excedentes de estructura de cadena individual, por ejemplo, excedentes 3' o 5'. El dúplex puede ser de aproximadamente 19 pares base (bp) de largo, aunque las longitudes entre 17 y 29 nucleótidos, incluyendo 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25., 26, 27, 28, y 29 nucleótidos, pueden utilizarse. Un ARNsi puede formar de dos moléculas de ARN que se hibridizan juntas o que pueden alternativamente generarse de una molécula de ARN individual que incluye una porción auto-hibridizante . La porción dúplex de un ARNsi puede incluir una o más protuberancias que contienen uno o más nucleótidos desparejados y/o no coincidentes en una o ambas estructuras de cadena de dúplex o pueden contener uno o más pares de nucleótido no complementario. Una estructura de cadena de una ARNsi (referido en la presente como estructura de cadena antisentido) incluye una porción que se hibridiza con un transcripto objetivo. En ciertas modalidades, una estructura de cadena de ARNsi (la estructura de cadena antisentidó) es precisamente complementaria* a una región del transcripto objetivo sobre al menos aproximadamente 17 nucleótidos, 18 nucleótidos, 19 nucleótidos, 20 nucleótidos, 21 nucleótidos o más lo. que significa que la. estructura de cadena antisentido de ARNsi hibridiza el transcripto objetivo sin una sola falta de coincidencia (es decir, sin un par base no complementario individual) sobre esa longitud. En otras modalidades, una o más incompatibilidades entre la estructura de la cadena antisentido de ARNsi y la porción objetivo del transcripto objetivo pueden existir. En modalidades en donde no se logra la complementariedad perfecta, cualquier incompatibilidad entre la estructura de cadena antisentido ARNsi y el transcripto objetivo puede localizarse en o cerca del extremo 3' de una estructura de cadena antisentido ARNsi. Por ejemplo,, en ciertas modalidades, los nucleótidos 1-9, 2-9, 2-10, y/o 1-10 de la estructura de cadena antisentido son perfectamente complementarios al objetivo.
Las consideraciones para el diseño de moléculas ARN efectivas se discuten en Mc anus et al. (2002) Nature Reviews Genetics 3: 737-747 y en Dykxhoorn et al. (2003) Nature Reviews Molecular Cell Biology 4:457-467. Tales consideraciones incluyen la composición base del ARNsi, la posición de la porción del transcripto objetivo que es complementario a la estructura de cadena antisentido del ARNsi con relación a los extremos 3' y 5' del transcripto y similar. Una variedad de programas de computadora también están disponibles, para ayudar en la selección de las secuencias de AR si, por ejemplo, de Ambion (sito web que tiene- el- URL www.ambion.com), en el sitio .web que tiene el URL www.sinc.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html. Las consideraciones del diseño adicionales que también pueden utilizarse se describen en Semizarov et al. Proc . Nati. Acad. Sci . 100 : 6347-6352. 3) Elementos de Silenciación de ARN de Horquilla Corta . .
El término "ARN de horquilla corta" o "ARNsh" se refiere a una molécula de ARN que comprende por lo menos dos porciones complementarias .que hibridizan o son capaces de hibridizar para formar una estructura de .cadena doble (dúplex suficientemente larga para mediar iARN (generalmente entre aproximadamente 17 y 29 nucleótidos en longitud, incluyendo 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26> 27, 28, y 29 en longitud, y en algunas modalidades, típicamente al menos 19 pares bases en longitud) , y al menos una porción de estructura de cadena individual, típicamente entre aproximadamente l y 20 o 1 y 10 nucleótidos en longitud que forman una dúplex que- conecta a los dos nucleótidos que forman el par base en un extremo de la porción dúplex. La porción dúplex puede, pero no se requiere, tener una o más protuberancias que consisten de uno o más nucleótidos sin emparejar. En modalidad específicas, los ARNsh comprenden un exceso en 3' . De esta forma, los ARNsh son precursores de AR si y son, en general, similarmente capaces de inhibir la expresión de un transcripto objetivo.
En particular, las moléculas de ARN que tienen una estructura de horquilla (tallo-bucle) pueden procesarse intracelularmente a través de Dicer para producir una estructura de ARNsi referida como ARN de horquilla corta (ARNsh) , que contienen dos regiones complementarias que se hibridizan entre sí (auto-hibridación) para formar una región de estructura de cadena doble (dúplex) referida como un tallo, o un bucle de estructura de cadena individual que conecta los nucleótidos que forman el par base en un extremo del dúplex, y opcionalmente un exceso, por ejemplo, un exceso de 3' . El tallo puede comprender 19, 20, o 21 bp de longitud, sin embargo los tallos más cortos o más largos (por ejemplo, hasta aproximadamente 29 nt) también pueden utilizarse. El bucle puede comprender de aproximadamente 1-20, incluyendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 n , de aproximadamente 4-10, o aproximadamente 6-9 nt . El exceso, si está presente, puede comprender aproximadamente 1-20 nt o aproximadamente 2-10 nt . El bucle puede localizarse en cualquiera de los extremos 5' o 3' de la región que es complementaria al transcripto objetivo cuya inhibición se desea (es decir, la porción antisentido del ARNsh) .
Aunque las ARNsh contienen una molécula de ARN individual que se auto-hibridiza se apreciará que la estructura ¦ dúplex resultante puede configurarse para comprender estructuras de cadena sentido y antisentido o porciones relativas al AR m objetivo y de esta forma puede considerarse como la estructura de cadena doble. Por consiguiente será conveniente en la presente referirse a estructuras de cadena sentido y antisentido, o porciones sentido y antisentido, de - un ARNsh, en donde la porción o estructura antisentido es el segmento de la molécula que forma o es capaz de formar un dúplex con y es complementaria a la porción activada del polinucleótido objetivo, y la estructura de cadena sentido o porción es el segmento de la molécula que forma o es capaz de formar un dúplex con la estructura de cadena antisentido o porción y es sustancialmente idéntica en la secuencia para la porción activada del transcripto objetivo. En general, las consideraciones para la selección de las secuencias de la estructura de cadena antisentido de la molécula de ARNsh son similares a las de la selección de-- la secuencia de la estructura de cadena antisentido de la molécula de ARNsi que activa el mismo transcripto. 4) Elementos Silenciadores de MicroARN En una modalidad, el elemento de silenciación comprende o codifica un ARNmi o un precursor ARNmi . "MicroARN" o "ARNmi" son agentes reguladores que comprenden aproximadamente 19 ribonucleótidos que son altamente eficientes en la inhibición de la expresión de los polinucleótidos objetivo. Ver, por ejemplo, Saetrom et al. (2006) Oligonucleotides 16:115-144, Wang et al. (2006) Mol. Cell 22:553-60, Davis et al. (2006) Nucleic Acid Research 34:2294-304, Pasquinelli (2006) Dev. Cell 10:419-24, todas •las cuales se incorporan aquí por referencia. Para la interferencia del ARNmi , el elemento silenciador puede diseñarse para expresar una molécula de AR ds que forma una estructura, de horquilla que contiene una secuencia de 19 nucleótidos que es complementaria al polinucleotido objetivo de interés. El ARNmi puede sintéticamente hacerse, o transcribirse por un ARN más largo que posteriormente se divide para producir el ARNmi activo. Específicamente, el ARNmi puede comprenden 19 nucleótidos de la secuencia que tiene homología a un polinucleotido objetivo en la orientación sentido y 19 nucleótidos de una secuencia antisentido correspondiente que . es complementaria a la secuencia sentido.
Se reconoce que varias formas de ARNmi pueden transcribirse, incluyendo, por ejemplo, el transcripto primario (denominado el "pri -ARNmi") que se procesa a través de varios pasos de nucleolíticos a un ARNmi precursor más corto (denominado el "pre-ARNmi") ; el pre-ARNmi; o el ARNmi "maduro final" , que está presente en un dúplex, las dos estructuras de cadena son referidas como el ARNmi (la estructura de cadena que eventualmente será el par base con el objetivo) y ARNmi*. El pre-ARNmi es un sustrato para una forma Dicer que elimina el dúplex ARNmi/ARNmi* del precursor, después de lo cual, similarmente los ARNsi, el dúplex puede absorberse en el complejo RISC. Se ha demostrado que los ARNmi pueden transgénicamente expresarse y ser efectivos a través de la expresión de una forma receptora, en lugar de la forma primaria completa (McManus et al. (2002) RNA 8:842-50). En modalidades específicas, 2.-8 nucleótidos del ARNmi son perfectamente complementarios al objetivo. Un gran número de ARNmi humanos endógenos ha sido identificado. Para estructuras de un número de precursores de ARNmi endógeno de varios organismos, ver Lagos-Quintana et al. (2003) RNA 9(2):175-9; ver también Bartel (2004) Cell 116:281-297.
Un ARNmi o precursor de ARNmi pueden compartir por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91%. 92%, '93%, 94%, 95%, 96%, 97%., .98%, 99%, o 100% de complementariedad de secuencia con el transcripto objetivo para un alargamiento de por lo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos. En modalidades específicas, la región de la completaría de secuencia precisa se interrumpe por una protuberancia. Ver, Ruvkun (2001) Science 294:797-799, Zeng et al. (2002) Molecular Cell 9:1-20, y Mourelatos et al. (2002) Genes Dev 16:720-728. 5) Elementos de Silenciador! Antisentido En algunas modalidades, el elemento silenciador comprende o codifica un oligonucleótido antisentido. Una "oligonucleótido antisentido" es una secuencia de ácido nucleico de estructura de cadena individual que está completa o parcialmente complementaria ' a un polinucleótido objetivo, y puede - ser ADN o su contraparte- ARN (es decir, en donde los residuos T.del ADN son residuos U en la contraparte ARN) .
Los oligonucleótidos antisentido de esta invención se . diseñan para ser hibridizables con ARN objetivo (por ejemplo, ARNm) o ADN. Por ejemplo, un oligonucleótido (por ejemplo, · el oligonucleótido de ADN) que hibridiza a una molécula de ARNm puede utilizarse para activar el ARNm para la digestión RnaseH. Alternativamente, un oligonucleótido que hibridiza al sitio de iniciación de la transferencia de la molécula de ARNm, puede utilizarse para evitar la transferencia del ARNm. En otro método, los oligonucleótidos que se unen a ADN de estructura de cadena doble pueden administrarse. Tales oligonucleótidos pueden formar un constructo triple e inhibir la transfección de ADN. El emparejamiento de la hélice triple evita que la hélice doble se abra lo suficiente para permitir la unión de la polimerasa, los factores de transcripción o las moléculas reguladoras. Los recientes avances terapéuticos que utilizan ADN triple han sido descritos (ver, por ejemplo, J. E. Gee et al., 1994, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt . Kisco, N.Y.). Tales oligonucleótidos de la invención pueden construirse utilizando reglas de emparejamiento base de la formación de hélices triples y las secuencias de nucleótido de los genes objetivo.
Como ejemplos no limitantes, los oligonucleótidos antisentido ...pueden seleccionarse como objetivo para hibridizar las siguientes regiones: la región de cubierta ARNm; el sitio de iniciación de la transferencia; sitio de terminación de la transferencia; sitio de iniciación de la transcripción; sitio de terminación de la . transcripción; señal de poliadenilación; reacción no transferida 3'; región no transferida 5'; región de codificación 5'; región de codificación media; y región de codificación 3'. En algunas modalidades, el oligonucleótido complementario se diseña para hibridizar la secuencia 5' más única de un gen, incluyendo cualquiera de aproximadamente 15-35 nucleótidos que abarcan la secuencia de codificación 5' .
Por consiguiente, los oligonucleótidos antisentido de acuerdo con esta invención pueden comprender de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleótidos, que incluyen, pero no se limitan a, aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o aproximadamente 100 nucleótidos.
Los ácidos nucleicos antisentido pueden producirse a través de técnicas estándar (ver, por ejemplo, Shewmaker et al., Patente de E. U. A. No. 5,107,065). Los oligonucleótidos apropiados pueden diseñarse utilizando el software OLIGO (Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, Coló.,-http://www.oligo.net). 6) Preparación de Elementos de Silenciación Los expertos en la- técnica fácilmente apreciarán que un elemento de silenciación puede prepararse de acuerdo con cualquier técnica disponible que incluye, pero no se limita a, síntesis¦ química, división enzimática o química in vivo o in vitro, transcripción dé plantilla in vivo o in vifcro, o combinación de las anteriores. iii. Vectores de Expresión Recombinantes y Células Hospederas Como se explicó anteriormente, los elementos de silenciación utilizados en los métodos y composiciones de la invención_.pueden comprender una molécula de ADN que cuando se transfiere produce un ARN de interferencia o uno de sus precursores, o un oligonucleótido antisentido. En tales modalidades, la molécula de ADN que codifica el elemento de silenciación se encuentra en un cásete de expresión. Además, los polinucleótidos que comprende una secuencia de codificación para un polipéptido de interés se encuentran en un cásete de expresión.
El cásete de expresión comprende una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre las bases de las células a ser utilizadas para la expresión, operablemente enlazadas a un polinucleótido que codifica el elemento silenciador o -al polipéptido de interés. "Operablemente enlazado" pretende significar que la secuencia de nucleótido de interés (es decir, un . ADN que codifica un elemento silenciador o una secuencia de codificación para el polipéptido de interés) . se enlaza a la secuencia(s) reguladora en una forma que permite la expresión de la secuencia de nucleótido (por ejemplo, en un sistema de transcripción/transferencia in vitro o en una célula cuando el cásete de expresión o el vector se introduce en la célula). "Secuencia reguladora" incluye promotores, mejoradores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) . Ver, por ejemplo, Goeddel (1990) in Gene. Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, California) . Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótido en muchos tipos de células hospederas y las que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótido solamente en ciertas células hospederas (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas del tejido) . Se apreciará por los expertos en la técnica que el diseño del cásete de expresión puede depender de factores tales como la selección de la célula hospedera a ser transformada, el nivel- de expresión del elemento silenciador o polipéptido de . interés deseado, y similar. Tales casetes de expresión típicamente incluyen un o más sitios apropiadamente colocados para enzimas de restricción, para facilitar la introducción del ácido nucleico en un vector.
Además se apreciará ..que los elementos promotores y/o reguladores apropiados pueden fácilmente seleccionarse para permitir la expresión de las unidades de transcripción/elementos de silenciación relevantes en la célula de interés. En .ciertas, modalidades, el promotor utilizado para dirigir la expresión intracelular del elemento silenciador es un promotor para polimerasa III de . ARN (Pol III) . Las referencias explican varios promotores Pol III, que incluyen, por ejemplo, Yu et al. (2002) Proc . Nati. Acad. Sci. 99(9), 6047-6052;.. Sui et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. 99(8), 5515-5520 (2002); Paddison et al. (2002) Genes and Dev. 16, 948-958; Brummelkamp et al. (2002) Science 296, 550-553; Miyagashi (2002) .Biotech. 20, 497-500; Paul et al. -(2002) Nat. Biotech. 20, 505-508; Tuschl et al. (2002) Nat . Biotech. 20, 446-448. De acuerdo con otras modalidades, puede utilizarse un promotor para polimerasa I de ARN, por ejemplo, el promotor ARNt . Ver McCown et al. (2003) Virology 313 (2) : 514-24 ; Kawasaki (2003) Nucleic Acids Res. 31 (2):700-7. En algunas modalidades, en donde polinucleótido comprende una secuencia de codificación para un polipéptido de interés, puede utilizarse un promotor de polimerasa II y de ARN.
Las . secuencias reguladoras también pueden ser provistas a través de los elementos reguladores ..virales . Por ejemplo, los promotores comúnmente utilizados se derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus , y Virus 40 de simio. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procarióticas como eucarióticas , - ver los Capítulos 16 y 17 de Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (,2a ed.-, Cold Spr.ing Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Ver, Goeddel (1990) in Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, California) .. ^ La transcripción in vitro puede lograrse llevando a cabo utilizando una variedad de sistemas disponibles que incluyen los sistemas de promotor/polimerasa T7, SP6, y T3 (por ejemplo, los comercialmente disponibles de Promega, Clontech, New Ehgland Biolabs, y similares) . Los vectores incluyen el promotor T7 , SP6 , o T3 también conocidos en la técnica y pueden fácilmente . modificarse para dirigir la transcripción de los elementos de silenciación . Cuando los elementos ' de silenciación se sintetizan in vitro, las estructuras de cadena pueden dejarse hibridizar antes de introducirlas en las células o antes de la administración a un sujeto. Como se observó anteriormente, los elemento silenciadores pueden., distribuirse o introducirse en una célula utilizando una molécula de AR individual incluyendo porciones auto-complementarias (por ejemplo, un ARNsh que puede procesarse intracelularmente para producir un ARNsi) , o como dos estructuras de cadena que se hibridizan entre sí. En otras modalidades, los elementos de silenciación utilizados se transcriben in vivo. Como se explicó en cualquier lugar en la presente, independientemente de sí el elemento silenciador se transcribe in vitro o in vivo, en cualquier escenario, puede producirse un transcripto primario que después puede procesarse (por ejemplo, a través de una o más enzimas celulares) para generar el ARN de interferencia que logra la inhibición del gen.
En las modalidades en donde el elemento silenciador es un ARN de interferencia, el ARN de interferencia puede generarse a través de la transcripción de un promotor, ya sea in vitro o in vivo. Por ejemplo, puede proporcionarse un constructo que contiene dos regiones transíeribles separadas, cada una de las cuales genera un transcripto 21 nt que contiene una región 19 nt complementaria entre sí. Alternativamente, un solo constructo puede utilizarse el cual contiene promotores opuestos y terminadores colocados de tal forma que se generan dos transcriptos diferentes, cada uno de los cuales es al menos parcialmente complementario al otro. Alternativamente,, se puede generar un agente de inducción de ARN con un solo transcripto, por ejemplo a través de la transcripción de regiones auto-complementarias de codificación de la unidad de transcripción- individual. Se ' utiliza una plantilla que incluye primera y segunda regiones complementarias, y opcionalmente incluye una región dúplex que conecta las porciones. Tal plantilla puede utilizarse para la transcripción in vi tro o transcripción in vivo, con la selección apropiada del promotor, . y, opcionalmente, otros elementos reguladores, por ejemplo, un terminador.
En algunas modalidades, . el sistema, de distribución del polinucleótido comprende un sistema de distribución de polinucleótido citotóxico. Como se utiliza en la presente, un "sistema de distribución del polinucleótido citotóxico" es uno que tiene una actividad citotóxica, como se describe en la presente. El vehículo lípido del sistema de distribución del polinucleótido citotóxico comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) . La actividad citotóxica del sistema de distribución del polinucleótido citotóxico debe impartirse desde un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) un polinucleótido citotóxico, o- ambos. Un "polinucleótido. citotóxico" tiene actividad citotóxica cuando se expresa o introduce en una célula. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos citotóxicos incluyen polinucleótidos que codifican un polipéptido que es capaz de inducir la muerte celular, tal como un gen que induce la apoptosis. Otros polinucleótidos citotóxicos incluyen polinucleótidos que comprenden un elemento silenciador que cuando se expresa o introduce en una -célula · reduce la expresión de un polinucleótido objetivo que es esencial para la supervivencia o crecimiento celular. Por ejemplo, un elemento silenciador que activa el receptor del factor de crecimiento epidérmico tiene actividad citotóxica. De esta forma, en algunas modalidades, el - sistema de distribución de lípidos citotóxicos/polinucleótido comprende un vehículo lípido que encapsula un polinucleótido citotóxico, en donde el vehículo lípido comprende un lípido catiónico..citotóxico de la fórmula (I) · b. ' Polipéptidos de Interés En algunas modalidades, los sistemas de distribución actualmente descritos comprenden un vehículo lípido que encapsula el ..polipéptido de interés que será distribuido en las células. Los sistemas de distribución descritos en la presente son capaces de introducir el polipéptido en la región intracelular de una célula. De manera importante, los sistemas de distribución activados comprenden un vehículo lípido que encapsula un polipéptido que es capaz de específicamente distribuir un polipéptido dado en una célula.
En algunas modalidades, el sistema de distribución capaz de distribuir un polipéptido de interés en una célula comprende un liposoma catiónico que encapsula el polipéptido.
En ciertas modalidades ;-· el liposoma catiónico comprende el lípido catiónico DOTAP . y el co-lípido de - colesterol en una reducción molar de 1:1. En algunas de estas modalidades, el polipéptido que se · distribuye en la célula comprende un polipéptido aniónico. Como se utiliza en la presente, un "polipéptido aniónico" es un polipéptido como se describe en la presente que tiené una carga negativa neta a un pH fisiológico. El polipéptido aniónico puede comprender por lo menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, -50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o- 100% residuos de aminoácido que tienen una carga negativa a un pH fisiológico. Estos incluyen ácido aspártico (D) , asparagina (N) , ácido glutámico (E) , y glutamina (Q) . En modalidades particulares, el polipéptido de interés está acetilado en el término amino y/o carboxilo para mejorar. la carga negativa del polipéptido.
En algunas modalidades, el sistema de distribución además comprende un policatión, . como se describe en cualquier lugar en la presente.. En otras modalidades, el sistema de distribución comprende una macromolécula portadora polianiónica, tal como sulfato de heparina. En modalidades particulares, el sistema de distribución comprende una nanopartícula LPH, que comprende un liposoma catiónico que encapsula el polipéptido de interés, sulfato de heparina y un policatión (por ejemplo, protamina) . En algunas de estas modalidades, el polipéptido comprende un polipéptido aniónico; En ciertas modalidades, el sistema de distribución comprende . un liposoma catiónico que encapsula un polipéptido aniónico, y opcionalmente una macromolécula portadora polianiónica (por ejemplo, sulfato de heparina) y un policatión (por ejemplo, protamina) y la carga de la superficie del liposom catiónico se protege . a través de la • post-inserción del · conjugado de lípido-polietilenglicol en la bicapa lípida del liposoma. En algunas de estas modalidades, el sistema de -distribución es un sistema de distribución disimulado. Para proporcionar la activación específica de una célula o tejido activado, el foliólo exterior de la bicapa lípida del liposoma del sistema de distribución además puede comprenden un ligando selector de objetivo.
En - -algunas.- - modalidades, ·- los sistemas de distribución comprenden un polipéptido de interés que comprende polipéptidos de interés que tienen por lo menos aproximadamente 2, 3, .4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, .18, 19, 20,. 25, 30,.35,.40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, .150, 200, 250, .300, 350, 400, .450, 500, o más residuos de aminoácido. En algunas modalidades, el polipéptido de interés comprende de aproximadamente 5 y aproximadamente 50 residuos de aminoácido.
En algunas modalidades, el polipéptido de interés es citotóxico. En algunas de estas modalidades, el polipéptido de interés . es capaz de bloquear un evento de señalización intracelular esencial después de distribuirse a la célula . 3. Policatión En algunas modalidades, el sistema de distribución además puede comprender un policatión, en donde el vehículo lípido encapsula al policatión. Los policationes pueden físicamente asociarse con un compuesto bioactivo aniónico, tal como un polinucleótido, a través de la atracción de las cargas opuestas. .De esta forma, en algunas modalidades en donde el sistema de distribución comprende un policatión, el compuesto bioactivo aniónico es un polinucleótido. En las modalidades en donde el vehículo lípido del sistema de distribución comprende un liposoma catiónicó y el compuesto bioactivo es un polinucleótido, y en donde el sistema de distribución además comprende un policatión que físicamente se asocia con el polinucleótido dentro del centro del liposoma catiónicó, el compuesto resultante puede referirse como "nanopartículas de lípido/policatión/polinucleótido" o "LPP" . El componente del polinucleótido de la "nanopartícula de lípido/policatión/polinucleótido" o "LPP" puede ser ADN o ARN (ver, por ejemplo, Patente de E. U. A. No. 5,795,587 y Patente de E. U. A. No. 6,008,202, incorporadas aquí por referencia. En las modalidades en donde la macromolécula portadora polianiónica de la nanopartícula LPP comprende ácido hialurónico o sulfato de heparina, el complejo es referido como una "nanopartícula de lípido/policatión/ácido hialurónico (o sulfato de heparina) " o "nanopartículas LPH" o "LPH-NP." En ciertas modalidades, la carga neta global de la nanopartícula de lípido/policatión/polinucleótido positiva a un pH fisiológico. - Sin desear apegarse a alguna teoría o mecanismo de acción, se cree que el policatión sirve para condensar el polinucleótido, permitiendo que el tamaño del complejo del sistema de distribución se reduzca según comparado con los complejos del sistema de distribución del polinucleótido que carecen de un policatión, y contribuye a la estabilización del complejo global. Igualmente, los policationes sirven para asociarse con y condensar otros compuestos bioactivos aniónicos. En general, las nanopartículas LPP son de aproximadamente 100 nm en diámetro. En modalidades no limitantes particulares, las nanopartículas LPP tienen un diámetro de aproximadamente 50 nm, aproximadamente 60 nm, aproximadamente 70 nm, aproximadamente 80 nm, aproximadamente 90 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 125, aproximadamente 150, aproximadamente 175, aproximadamente 200 nm, aproximadamente 225 nm, o aproximadamente 250 nm.
Como se utiliza en la presente, un "policatión" se refiere a una macromolécula con muchos grupos positivamente cargados que están positivamente cargados a un pH fisiológico. El policatión puede seleccionarse de policationes orgánicos que tienen · un peso molecular de entre aproximadamente 300 y aproximadamente 200,000. En algunas modalidades, estos policationes tienen una valencia de entre aproximadamente 3 y aproximadamente .1000 a un pH de 7.0. Los policationes pueden incluir, pero no se limitan a, aminoácidos, péptidos, polipéptidos , poliaminas, carbohidratos naturales o sintéticos y -cualquier polímero catiónico sintético. Los ejemplos no . limitantes de polipéptidos incluyen poliarginina, . oliornitina , protaminas y polilisina, polibreno (bromuro ..de hexadimetrina) , histona, dendrímero catiónico, espermina, espermidina y polipéptidos sintéticos derivados del antígeno T de SV40 que tienen cargas positivas en exceso y representan una señal de localización nuclear. . _ En algunas modalidades, el policatión es un polipéptido policatiónico que tiene una composición de aminoácido en donde los residuos de arginina comprenden por lo menos 30% de los residuos de aminoácido del polipéptido y residuos de lisina que comprenden menos del 5% de los residuos de aminoácido del polipéptido. En ciertas modalidades, la histidina, lisina y arginina juntas forman hasta aproximadamente 45% a 85% de los residuos de aminoácido del polipéptido y serina, treonina y glicina, que forman de aproximadamente 10% a aproximadamente 25% de los residuos de aminoácido del polipéptido. En aún otras modalidades, los residuos de arginina constituyen de aproximadamente 65 a aproximadamente 75% de los residuos de aminoácidos del polipéptido y los residuos de lisina constituyen de aproximadamente 0 a aproximadamente · 3% de los residuos de aminoácido del polipéptido.
Además de los porcentajes anteriormente recitados de los residuos de arginina y lisina, los polipéptido policatiónicos también pueden contener de aproximadamente 20% a aproximadamente 30% de residuos hidrófobos, o de aproximadamente 25% de residuos hidrófobos. El polipéptido policatiónico a ser utilizado en la producción de los complejos del sistema de distribución del polinucleótido pueden ser de hasta 500 aminoácidos en longitud, de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 aminoácidos en longitud, o de. aproximadamente 25 a aproximadamente 50 aminoácidos en longitud, y en" otras modalidades, de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 aminoácidos en longitud.
En una modalidad, los residuos de arginina presentes en el polipéptido catiónico se encuentran en clusters de 3-8 residuos de arginina contiguos o en clusters de 4-6 residuos de arginina contiguos.
En otra modalidad, el polipéptido policatiónico es de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 aminoácidos en longitud, y de aproximadamente 65 a aproximadamente 70% de sus residuos- de arginina y 0 a 3% ~ de sus residuos son residuos de lisina. .. ..... ..
Los polipéptidos policatiónicos a ser utilizados en la; formulación- de complejos de la invención pueden ser provistos como proteínas de existencia natural, particularmente ciertas protaminas que tienen una alta relación de arginina a lisina como se explicó anteriormente, como un polipéptido químicamente sintetizado, como un polipéptido recombinante expresado de una secuencia de ácido nucleico que codifica el . polipéptido, o como una sal de cualquiera de los polipéptido anteriores en donde tales sales incluyen, pero no se limitan a, sales de fosfato, cloruro y sulfato. En ciertas modalidades, el policatión comprende sulfato de protamina.- En algunas modalidades, la nanopartícula de lípido/policatión/polinucleótido comprende una nanopartícula de lípido/policatión/polinucleótido citotóxica. Como se utiliza en la presente, "nanopartícula de lípido/policatión/polinucleótido citotóxica" es una que tiene una actividad -citotóxica, como se describe en cualquier lugar en la presente. El vehículo lípido de la nanopartícula de lípido/policatión/polinucleótido citotóxica comprende un lípido catiónico. de la fórmula (I) . La actividad citotóxica de la nanopartículas LPP citotóxicas puede impartirse desde el lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I), un polinucleótido citotóxico, o ambos. De esta forma, en algunas modalidades, la nanopartícula de lípido/policatión/polinucleótido citotóxica comprende un vehículo lípido que encapsula un policatión y un polinucleótido citotóxico, en donde el vehículo lípido comprende un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) . Los métodos para generar nanopartículas LPP y nanopartículas LPP citotóxicas se describen en cualquier lugar en la presente . 4. Macromoléculas portadoras polianiónicas La presente invención modaliza sistemas que comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) . En algunas modalidades en donde el vehículo lípido del sistema de distribución comprende un liposoma catiónico, el complejo además comprende una macromolecula portadora polianiónica que se encapsula por el vehículo lípido, en donde la macromolécula portadora polianiónica ayuda en la distribución del polinucleótido. Una "macromolécula portadora polianiónica" se refiere a cualquier molécula que lleva más de una carga negativa a un pH fisiológico (por ejemplo, multivalente) que puede interactuar con los lípidos catiónicos del liposoma catiónico de un sistema de distribución a través de interacciones de carga-carga en tal forma que permiten al sistema de distribución distribuir el compuesto bioactivo encapsulado a una célula, ya sea en un sistema in vitro o in vivo. La habilidad de un sistema de distribución para distribuir un compuesto bioactivo que encapsula a la célula puede medirse utilizando los ensayos descritos en cualquier lugar en la presente (ver, por ejemplo, Ejemplos Experimentales 2 . y 3) . En algunas modalidades, la macromolécula portadora polianiónica tiene un peso molecular de entre aproximadamente " 5 y aproximadamente aproximadamente 20,000 kDa, incluyendo pero no limitándose de aproximadamente 5 kDa, de aproximadamente 10 kDa, de aproximadamente 20 kDa, de aproximadamente 30 kDa, de aproximadamente 40 kDa, de aproximadamente 50 kDa, de aproximadamente 60 kDa, de , aproximadamente ¦ 70 kDa, de aproximadamente 80 kDa, de aproximadamente 90 kDa, de aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 200 kDa, de aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 500 kDa, de aproximadamente 600 kDa, de aproximadamente 700 kDa, de aproximadamente 800 kDa, de aproximadamente 900 kDa, de aproximadamente 1, 000 kDa, de aproximadamente 5,000 kDa, de aproximadamente 10,000 kDa, Y de aproximadamente 20,000 kDa En algunas modalidades, la macromolécula portadora polianiónica tiene una valencia de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100,000, incluyendo pero no limitándose a, de aproximadamente 20, de aproximadamente 30, de aproximadamente 40, de aproximadamente 50, de aproximadamente 60, de aproximadamente 70, de aproximadamente 80, de aproximadamente 90, de aproximadamente 100, de aproximadamente 500, de aproximadamente 1,000, de aproximadamente 10,000, y de aproximadamente 100,000 a un pH fisiológico. Los ejemplos no limitantes de macromoléculas portadoras polianiónicas incluyen polímeros, tales como polisacáridos polianiónicos , polipéptidos polianiónicos y sus combinaciones (por ejemplo, glicoproteínas, proteoglicanos) , y polinucleótidos polianiónicos. Las macromoléculas portadoras polianiónicas pueden ser de. existencia natural (es decir, una que existe en la. naturaleza sin la intervención humana), químicamente sintetizadas, o en el caso de polinucleótidos, puede ser un polinucleótido recombinante (es decir, uno que existe solamente con la intervención humana) .
En algunas modalidades, la macromolécula portadora polianiónica comprende un polinucleótido portador, en donde un polinucleótido portador es un polinucleótido que puede utilizarse en los sistemas de distribución del polinucleótido para mejorar la distribución de. un polinucleótido de interés a una célula. Generalmente, a -diferencia del polinucleótido de interés, una vez que se distribuye la célula, el polinucleótido portador no ejerce un cambio fenotípico deseado en una célula (por ejemplo, un efecto terapéutico, expresión de un polipéptido de interés, un cambio en el nivel de expresión de un gen endógeno cuando se distribuye a una célula in vitro o in vivo) . Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos portadores son ADN genómico (por ejemplo, ADN de timo de becerro) y ADN de plásmido bacterialmente producido. En algunas modalidades, la macromolécula portadora polianiónica es ADN de timo de becerro.
En algunas modalidades, la macromolécula portadora polianiónica comprende un polisacárido portador polianiónico . El término- "polisacárido" se refiere a una molécula de carbohidrato que comprende de dos o más monómeros (monosacáridos) unidos juntos a través de enlaces glucosídicos . De esta forma, los disacáridos, trisacáridos , oligosacáridos , o cualquier otro término utilizado para referirse a una molécula de carbohidrato comprenden más de un monosacárido enlazado junto a través de un enlace glucosídico e incluyendo dentro de la definición de "polisacárido" , y el término ."polisacárido". puede utilizarse en lugar de, o de manera intercambiable con cualquiera de estos términos . El término "polisacárido" abarca tanto homopolisacáridos (un polisacárido que comprende el único tipo de monosacárido) y heteropolisacáridos (un polisacárido que comprende más de un tipo de monosacárido). Un: heteropolisacárido puede incluir polisacáridos que comprenden unidades de disacárido de repetición, unidades de trisacárido, unidades de tetrasacáridó o una unidad de repetición de cualquier longitud. Un "polisacárido polianiónico''. es un polisacárido que comprende una multiplicidad de cargas negativas a un pH fisiológico. En algunas modalidades, el polisacárido polianiónico comprende de 2 a 2000 unidades de monosacárido, incluyendo pero no limitándose de aproximadamente 2, de aproximadamente 5, de aproximadamente 10, de aproximadamente 20, de aproximadamente 30, de aproximadamente 40, de aproximadamente 50, de- aproximadamente 60,. de aproximadamente 70, de aproximadamente 80, de aproximadamente 90, de aproximadamente 100, de aproximadamente 125, de aproximadamente 150, de aproximadamente 175, y aproximadamente 200 unidades, de monosacárido. En algunas modalidades, de aproximadamente 10%, de aproximadamente 20%, de aproximadamente 30%, de aproximadamente 40%,- de aproximadamente 50%, de aproximadamente 60%, de aproximadamente 70%, de aproximadamente 80%, de aproximadamente 90%, de aproximadamente 100% de unidades de monosacárido que forman las macromoléculas poiianiónicas que tienen por lo menos una carga negativa.
En algunas modalidades, el polisacárido portador polianiónico comprende .un glucosaminoglicano polianiónico. Un glucosaminoglicano es un polisacárido. no - ramificado que comprende unidades de disacárido de repetición, en donde una de las unidades de monosacárido del disacárido comprende un azúcar amino, incluyendo, pero no limitándose a, D-galactosamina o D-glucosamina . En algunas modalidades, la otra unidad de. monosacárido del disacárido de repetición comprende ácido urónico, incluyendo pero no limitándose a ácido D-glucorónico (GIcA) o ácido L-idurónico (IdoA) . En general, por lo menos uno de los monómeros del monosacárido de la unidad del disacárido tiene un grupo lateral negativamente cargado (por ejemplo, carboxilato, sulfato) . En algunas de estas modalidades, el glucosaminoglicano comprende heparina, sulfato de heparina, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatina y sulfato de dext ina. En ciertas modalidades, el glucosaminoglicano comprende ácido hialurónico. En algunas modalidades, el glucosaminoglicano no es heparina o sulfato de heparina.
En otras modalidades, la macromolécula portadora polianiónica comprende un polipeptido portador polianiónico . Un "polipéptido polianiónico" es un polipéptido, como se define en cualquier lugar en la presente, que comprende una multiplicidad de cargas negativas a un pH fisiológico. A diferencia de un polipéptido de interés, un polipéptido portador polianiónico no ejerce un cambio fenotípico deseado en la célula después de la distribución a la célula. Los polipéptidos portadores polianiónicos - pueden comprender residuos de ácido glutámico, residuos de ácido aspártico, o ambos. En algunas modalidades, el polipéptido portador polianiónico tiene una composición de aminoácido en donde los residuos de ácido glutámico, residuos de ácido aspártico o ambos residuos comprenden por lo menos 30% de los residuos de aminoácido o el polipéptido, por lo menos 40% de los residuos de aminoácido y el polipéptido, por lo menos 50% de los residuos de aminoácido del polipéptido, por lo menos 60% de los residuos de aminoácido del polipéptido, al menos 70% de los residuos de aminoácido del polipéptido, al menos 80% de los residuos de aminoácido del polipéptido, al menos 90% de los residuos de aminoácido del polipéptido, al menos 95% de los residuos de aminoácido del polipéptido, al menos 96% de los residuos de aminoácido del polipéptido, al menos 97% de los residuos de aminoácido, al menos 98% de los residuos de aminoácido del polipéptido, al menos 99% de los residuos de aminoácido del polipéptido, o al menos 100% de los residuos de aminoácido del polipéptido.
En algunas modalidades, el polipéptido portador polianiónico es de aproximadamente 2 aminoácidos . a aproximadamente 100,000 aminoácidos en longitud, incluyendo pero no limitándose a aproximadamente 2, aproximadamente .5 , aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 500, aproximadamente 1,000, aproximadamente 10,000, aproximadamente 50,000, y aproximadamente 100,000 aminoácidos en longitud.
Los polipéptidos portadores polianiónicos a ser utilizados en la formulación de complejos de la invención pueden provistos como proteínas de existencia natural, como polipéptidos químicamente sintetizados, como un polipéptido recombinante expresado de una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido, o como una sal de cualquiera de los polipéptido anteriores en donde las sales incluyen, pero no se limitan a, sales de fosfato, cloruro y sulfato.
En ciertas modalidades, la macromolécula portadora polianiónica comprende un proteoglicano polianiónico o un glucopéptido polianiónico. Un proteoglucano comprende un glucosaminoglicano covalentemente unido a un polipéptido. Los proteoglucanos polianiónicos pueden estar comprendidos de un glucosaminoglicano polianiónico unido a un polipéptido no polianiónico (por ejemplo, neutral,. catiónico) o polianiónico. Un glucopéptido comprende un monosacárido o polisacárido covalentemente unido a un polipéptido. Los glucopéptidos polianiónicos pueden estar comprendidos un polisacárido polianiónico unido a un polipéptido no polianiónico, y un polisacárido no...polianiónico a un polipéptido polianiónico, o un polisacárido polianiónico unido a un polipéptido polianiónico.
En algunas modalidades, la relación molar de una macromolécula portadora polianiónica al polinucleótido de interés (macromolécula portadora polianiónica -.polinucleótido de interés) comprende de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 100:1, incluyendo pero no limitándose a aproximadamente 1:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 6:1, aproximadamente 7:1, aproximadamente 8:1, aproximadamente 9:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 30:1, aproximadamente 40:1,. aproximadamente 50:1, aproximadamente 60:1, aproximadamente 70:1, aproximadamente 80:1, aproximadamente 90:1, y aproximadamente 100:1. 5. Sistemas de Distribución PEGilados En algunas modalidades, la carga de superficie del vehículo lípido de sistema de distribución puede minimizarse incorporando lípidos que comprenden fracciones de polietilenglicol (PEG) en el vehículo lípido. La reducción de la carga de superficie del vehículo lípido del sistema de distribución puede reducir la cantidad., de agregación entre los complejos del sistema de distribución y las proteínas en suero y mejoran la vida media circulatoria del complejo (Yan, Scherphof, and Kamps (2005) J Liposome Res 15:109-139). De esta forma en algunas modalidades, la superficie exterior del vehículo lípido del sistema de distribución comprende una molécula PEG. Tales complejos son referidos en la presente como sistemas de distribución PEGilados. Los sistemas de distribución PEGilados pueden generarse a través de la post-mutación de un conjugado de lípido-PEG en el vehículo lípido del sistema de distribución a través de la incubación del sistema de distribución con micelas que comprenden derivados de lípido-PEG, como se conoce en la técnica y de se describe en cualquier lugar en .la presente (Ishida et al. (1999) FEBS Lett. 460:129-133; Perouzel et al. (2003) Bioconjug. Chem. 14:884-898; ver Sección Experimenta). Por "conjugado de lípido-polietilenglicol" o "conjugado de lípido-PEG" significa una molécula de lípido que está covalentemente unida a por lo menos una molécula de polietilenglicol . En algunas modalidades, el conjugado . lípido-PEG comprende 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-carboxi-polietilenglicol (DSPE-PEG) .- Como-se describe inmediatamente a continuación, estos conjugados de lípido-PEG pueden además modificarse para incluir un ligando selector de objetivo (por ejemplo, DSPE-PEG-AA) . El término "conjugado de lípido-PEG" también se refiere a estos conjugados de ligando selector de objetivo de lípido-PEG en sistemas de distribución que comprenden el vehículo lípido que comprende el conjugado de ligando selector de objetivo de lípido-PEG que se consideran como sistemas de distribución PEGilados y activados, como se describe inmediatamente a continuación.
La PEGilación de los vehículos lípidos mejoran la vida media circulatoria del sistema de distribución reduciendo la depuración del complejo del sistema de distribución mediante" el sistema reticuloendotelial (RES) . Ya que no se desea estar unido a ninguna teoría o mecanismo en particular de acción, se cree que el vehículo PEGilado puede evadir el sistema RES bloqueando estéricamente la opsonización de las partículas (Owens and Peppas (2006) Int J Pharm 307:93-102). Con el fin de proporcionar suficiente inhibición estérica para evitar la opsonización, la superficie exterior del vehículo lípido debe completamente cubrirse con las moléculas de PEG en la configuración "de cepillo". A una cobertura de baja superficie, las cadenas PEG típicamente tendrán una configuración "de hongo" en donde las moléculas PEG se localizarán más cerca de la superficie del vehículo lípido. En la configuración "de cepillo", las moléculas PEG se extienden más lejos de la superficie a la partícula, mejorando el efecto de inhibición estérico. Sin embargo, las sobre-aglomeración de PEG en la superficie puede disminuir la movilidad de las cadenas de polímero y de esta forma disminuir el efecto inhibidor estérico (Owens and Peppas (2006) Int J Pharm 307:93-102). La configuración de PEG depende de la densidad de superficie y la masa molecular del PEG en la superficie del vehículo lípido. El factor de control es la distancia entre las cadenas PEG en la superficie del vehículo (D) con relación a su dimensión Flory, RF, que se define como oc 3 5, en donde a es la longitud persistente del monómero, y N es el número de unidades de monómero en el PEG (Nicholas et al. (2000) Biochim Biophys Acta 1463:167-178). Se pueden definir tres regímenes: (1) cuando D>2 RF (hongos interdigitados) ; (2) cuando D<2 RF (hongos); y (3) cuando D< RF (cepillos) (Nicholas et al).
En ciertas modalidades, el sistema de distribución PEGilado comprende un sistema de distribución disimulado. Por "sistema de distribución disimulado" significa un sistema de distribución que comprende un vehículo lípido, en donde la • superficie exterior del vehículo lípido comprende un número suficiente de moléculas PEG en una configuración que permite al sistema de distribución exhibir una absorción reducida por el sistema RES en el hígado según comparado por el sistema de distribución no PEGilado cuando se administra a un sujeto. La absorción RES puede medirse utilizando ensayos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan al ensayo de perfusión de hígado descrito en cualquier lugar en la presente (ver Ejemplo Experimental 4) . En algunas de estas modalidades, el sistema de distribución disimulado comprende un vehículo lípido, en donde la superficie exterior del vehículo lípido comprende moléculas PEG, en donde D<RF.
En modalidades en donde el sistema de distribución PEGilado es un sistema de distribución disimulado, el foliólo exterior de la bicapa lípida del liposoma catiónico comprende un conjugado de lípido-PEG a una concentración de aproximadamente 4% en moles a aproximadamente 15% en moles de los lípidos de foliólos exteriores, incluyendo, pero no limitándose a aproximadamente 4% en moles, aproximadamente 5% en moles, aproximadamente 6% en moles, aproximadamente 7% en moles, 8% en moles, aproximadamente 9% en moles, aproximadamente 10% en moles, aproximadamente 11% en moles, aproximadamente 12% en moles, aproximadamente 13% en moles, aproximadamente 14% en moles, y aproximadamente 15% en moles PEG. En ciertas modalidades, el foliólo exterior de la bicapa lípida del liposoma catiónico del sistema de distribución del polinucleótido disimulado comprende aproximadamente 10.6% en moles ' de PEG. La fracción de polietilenglicol de conjugados de lípidos-PEG puede tener un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 20,000 g/moles, incluyendo pero no limitándose a aproximadamente 100 g/moles, aproximadamente 200 g/moles, aproximadamente 300 g/moles, aproximadamente 400 g/moles, aproximadamente 500 g/moles, aproximadamente 600 g/moles, aproximadamente 700 g/moles, aproximadamente 800 g/moles, aproximadamente 900 g/moles, aproximadamente 1000 g/moles, aproximadamente 5000 g/moles, aproximadamente 10,000 g/moles, aproximadamente 15,000 g/moles, y aproximadamente 20,000 g/mol. En algunas de estas modalidades, el conjugado de lípido-PEG comprende una molécula PEG que tiene un peso molecular de aproximadamente 2000 g/moles. En ciertas modalidades, el conjugado de lípido-PEG comprende DSPE-PEG20oo · 6. Sistemas de distribución con una bicapa soportada - · El sistema de distribución -de la invención puede comprenden una bicapa soportada. Un sistema de distribución comprende una bicapa soportada que puede ser puede ser PEGilada, por ejemplo, a través de un paso de post-inserción para la neutralizar la carga de la superficie y reducir la absorción de RES, limitar la unión no específica y mejorar las propiedades farmacocinéticas del sistema de distribución. Una "bicapa soportada" cuando se refiere a un sistema de distribución es una bicapa en donde uno o ambos foliólos (por ejemplo, el foliólo interior, el foliólo exterior) de la bicapa ha sido suficientemente estabilizada a través de una fuerza electroestática o covalentemente unida para permitir que la bicapa permanezca intacta mientras se incorpora lo suficientemente alto porcentaje de los conjugados dé lípidos -PEG para completamente proteger la carga de superficie (por ejemplo, el potencial zeta de.,... liposoma tiene un potencial zeta de aproximadamente 0) o para reducir la absorción RES del sistema de distribución PEGilado. cuando se compara con un sistema de distribución que carece de PEG. Una bicapa se dice que (permanece intacta) cuando no existe un aumento sustancial en la permeabilidad de la bicapa lípida, que se ha medido utilizando técnicas conocidas en la técnica (Nicholas et al. (2000) Biochim. Biophys . Acta 1463:167-178), o un aumento sustancial en una pequeña población de partículas (por ejemplo, menos de 50 nm, no incluyendo micelas de lípido-PEG) , que pueden medirse utilizando técnicas conocidas en la técnica.
En algunas modalidades, la bicapa soportada comprende una "bicapa soportada central" . Por "bicapa soportada central" significa una bicapa que ha sido estabilizada a través de una interacción electroestática o covalente entre -miembros de - la bicapa y el contenido del centro interno del vehículo lípido. Un ejemplo no limitante de un sistema de distribución que comprende un vehículo lípido comprende una bicapa soportada central que es la nanopartícula LPP descrita en la - presente, en donde . los componentes negativamente cargados del centro del liposoma (por ejemplo, · polinucleótido. de- interés, macromolécula portadora polianiónica) interactúan con los lípidos catiónicos del liposoma catiónico a través de interacciones de carga-carga.
En otras modalidades, la bicapa soportada comprende una bicapa soportada de foliólo. Como se utiliza en la presenta, una "bicapa soportada de foliólo" comprende una bicapa que ha sido estabilizada a través interacciones electroestáticas o covalentes entre los miembros de las secuelas que comprenden la bicapa (por ejemplo, foliólo interno, foliólo externo) . Una bicapa de soportada de foliólo covalente se refiere a una bicapa covalente como se describe en la Solicitud Internacional No. , titulada "Methods and Compositions for Stabilizing Delivery System Complexes" , presentada concurrentemente en la presente y se incorpora por referencia en su totalidad, que se estabiliza lo suficiente a través del - enlace covalente entre por lo menos dos moléculas anfifáticas dentro del foliólo interior, entre por lo menos dos moléculas anfifáticas dentro del foliólo exterior, o entre por lo menos dos moléculas anfifáticas dentro del foliólo interior y entre por lo menos dos moléculas anfifáticas dentro del foliólo exterior para permitir que la bicapa permanezca intacta mientras se incorpora lo suficientemente un alto porcentaje de conjugados de lípido-PEG para completamente proteger la carga de superficie (por ejemplo, el potencial zeta del vehículo lípido tiene un potencial zeta de aproximadamente 0) o para reducir la absorción RES del sistema de distribución PEGilado cuando se compara con un sistema de distribución que carece de PEG. La bicapa soportada del foliólo, en donde la estabilidad se imparte a través de las interacciones entre los miembros de la bicapa es diferente de una bicapa soportada central, en donde la estabilidad se imparte por las interacciones entre los miembros de la bicapa y los componentes del centro del vehículo. Sin embargo, un sistema de distribución podría comprender una bicapa soportada, en donde el soporte se imparte de ambas interacciones entre los componentes de la bicapa (una bicapa soportada de folíolos) y de interacciones entre los componentes centrales y la bicapa (una bicapa soportada central). Un ejemplo de tal sistema.de sistema de distribución es una bicapa soportada de foliólo covalente como se describe en' la presente, en donde los grupos principales hidrófilos o las cadenas laterales dentro del foliólo interno de la bicapa son catiónicos y existen interacciones de carga-carga entre estas moléculas anfifáticas catiónicas del foliólo interno y un agente bioactivo aniónico" presente dentro del centro del vehículo lípido .
Se debe entender que en algunas modalidades de la invención, un sistema de distribución que comprende una bicapa soportada de foliólo puede ser una en donde los miembros del foliólo interior' de la bicapa interactúan con miembros del foliólo exterior de la bicapa.
En algunas de estas modalidades en donde la bicapa soportada ha sido estabilizada a través de enlaces covalentes entre los miembros de la bicapa y el contenido del centro interior del vehículo lípido o entre las moléculas anfifáticas dentro de los foliólos de la bicapa, los enlaces covalentes comprenden enlaces covalentes biodivisibles . Los enlaces biodivisibles son los que pueden dividirse o separarse después de entrar a una célula o un organismo. La presencia de los enlaces covalentes biodivisibles facilita la liberación del compuesto bioactivo encapsulado.
En algunas modalidades, los enlaces covalentes biodivisibles son los que están más específicamente divididos después de entrar en la célula (división intracelular) . En algunas modalidades, los enlaces covalentes biodivisibles son divisibles en condiciones ácidas como los encontrados en lisosomas. Un ej.emplo no limitante es un enlace de hidrazona sensible al ácido (o lábil al ácido) tal como un enlace de acetil hidrazona como se describe .por Greenfield et al. (1990) Cáncer Res. 50, 6600-6607., que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Otro ejemplo no limitante son ciertos enlaces o uniones sujetas a hidrólisis que incluyen varios enlaces de aldehido con grupos amino o sulfhidrilo. También se incluyen enlaces de amida tales como cuando el éster de N-hidrosuccinimida . (éster NHS) reacciona con la amina. Otro ejemplo no limitante es un enlace de maleamato lábil con ácido (ver Rozema et al. (2007) Proc Nati Acad Sci USA 104: 12982-12987, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) . En ciertas modalidades, los enlaces covalentes biodivisibles son divisibles a través de enzimas más comúnmente encontradas en endosomas o lisosomas, tales como hidrolasas de ácido lisosómico.
Se entiende que la presente invención abarca cualquier sistema de distribución que comprende un vehículo lípido que encapsula un compuesto bioactivo (por ejemplo, polinucleótido , polipéptido> molécula pequeña, fármaco) y es capaz de distribuir el compuesto bioactivo a una célula o tejido, en donde el vehículo lípido comprende una bicapa soportada y un lípido catiónico de la fórmula (I) . En algunas modalidades, el. sistema de distribución comprende un sistema de distribución de. polinucleótido como se describe en la presente, que incluye pero no se. limita a, nanopartícula LPP o LPH . 7. Sistemas de distribución seleccionados (como objetivo) .
En algunas modalidades, los sistemas de distribución comprenden un- vehículo lípido en donde la superficie exterior del vehículo lípido comprende un ligando selector de objetivo, que forma un sistema de distribución objetivo. Como se explica en la presente, un ligando selector de objetivo es una molécula que activa una molécula físicamente asociada o complejo a una célula o tejido activado. En esta forma, un "sistema de distribución objetivo" es uno en donde la superficie exterior del vehículo lípido del sistema de distribución comprende un ligando selector de objetivo que activa el sistema de distribución objetivo a una célula o tejido activado. En ciertas modalidades, el ligando selecto de objetivo comprende un derivado de benzamida. En algunas de estas modalidades, el derivado de benzamida comprende anisamida.
El: . ligando selector :de objetivo puede covalentemente unirse a los..lípidos. catiónicos de la fórmula (I) descritos en la presente, otros lípidos catiónicos, o co-lípidos que comprenden -el vehículo lípido del sistema de distribución, formando un conjugado de . lípido-ligando selector de objetivo. Algunos conjugados de lípido-ligando selector de objetivo comprenden una molécula de intervención entre el lípido y el ligando selector de objetivo, que está covalentemente unida a ambos,, el lípido y el ligando selector de objetivo. En algunas de estas modalidades, la molécula de intervención es polietilenglicol (PEG) , de esta forma se elabora un conjugado de lípido-PEG-ligando selector de objetivo. Un ejemplo de tal conjugado de lípido-activación es DSPE-PEG-AA, en donde el lípido -1, 2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-carboxilo (DSPE) se une a polietilenglicol (PEG), que se une al ligando selector de objetivo de anisamida (AA) . De esta forma, en algunas modalidades, el vehículo lípido del sistema de distribución objetivo comprende un conjugado de lípido-ligando selector de objetivo DSPE-PEG-AA.
En ciertas modalidades, el ligando selector de objetivo selecciona el sistema de distribución objetivo a una célula objetivo, en donde la célula objetivo es una célula cancerígena. En algunas de esas modalidades, que incluyen aquellas en donde el ligando selector de objetivo es anisamida, la célula cancerígena es una célula de cáncer pulmonar .
C. Composiciones Farmacéuticas Los lípidos y sistemas de distribución de la invención son útiles en sistemas de cultivo de tejido de mamífero, en . estudios de animales, y para propósitos terapéuticos. Los lípidos catiónicos citotóxicos de la fórmula (I) , y los sistemas de distribución que comprenden un lípido catiónico de la fórmula (I) , en donde lípidos catiónicos de la fórmula (I) tienen actividad citotóxica, los sistemas de distribución que comprenden un lípido catiónico de la fórmula (I) , en donde el compuesto bioactivo tiene actividad terapéutica, y los sistemas de distribución que comprenden: un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) y compuesto bioactivo con actividad terapéutica pueden utilizarse en aplicaciones terapéuticas. El tema actualmente descrito por consiguiente proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden lípidos catiónicos citotóxicos de la fórmula (I) o sistemas de distribución que comprenden lípidos catiónicos de la fórmula (I) .
Las composiciones actualmente descritas pueden formularse para la distribución, es decir, administración al sujeto, a través de cualquier ruta disponible incluyendo, pero no limitándose a, parenteral (por ejemplo, intravenosa) , intradérmica, subcutánea, oral, nasal, bronquial, oftálmica, transdérmica (tópica), transtnucosal , rectal y vaginal. En algunas modalidades, la ruta de distribución es intravenosa, parenteral, transmucosal , nasal, bronquial, vaginal y oral.
Las composiciones farmacéuticas actualmente descritas también pueden incluir un · lípido catiónico citotóxico de la fórmula. (I) o un sistema de distribución que comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en la presente, el término "portador farmacéuticamente aceptable" incluye solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y retardantes de l absorción y similares, compatibles por la administración farmacéutica o cosmética. Los compuestos activos complementarios también pueden incorporarse en las composiciones .
Como un experto en la técnica apreciará, una composición farmacéutica actualmente descrita se formula para ser compatible con su ruta prevista de administración. Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación parenteral (por ejemplo, intravenosa), intramuscular, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles , glicerina, propilenglicol o solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metilparabenos ; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelatadores, tal como ácido etilenodiamina tetraacético ; reguladores de pH, tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o contenedores de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico.
• Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable típicamente incluyen soluciones acuosas estériles (en donde son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen salina fisiológica, agua bacteroestática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o salina regulada en su pH con fosfato (PBS) . La composición deberá ser estéril y deberá ser fluida al grado que exista una fácil capacidad de inyectar. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas son estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y deberán conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. En general, el portador relevante puede ser un medio solvente o de dispersión que contiene por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol , y polietilenglicol líquido, y similar) y sus mezclas adecuadas La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, a través del uso de un recubrimiento tal como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y a través del uso de agentes tensioactivos . La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse a través de varios agentes antibacterianos y antifúngicos , por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido ascórbico, timerosal y similar. En algunas modalidades, los agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes , tales como manitol o sorbitol, o cloruro de sodio se incluyen en la formulación. La absorción prolongada de la formulación inyectable puede obtenerse incluyendo la formulación de un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (por ejemplo, lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) o un sistema de distribución que comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización por filtración.
En ciertas modalidades, la solución para inyección está libre de endotoxinas. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En las modalidades en donde se utilizan polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, las soluciones pueden prepararse por secado al vacío y secado por congelamiento que producen un - polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada estérilmente previamente del mismo.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte y un portador comestible. Para el propósito de administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y utilizarse en la forma de tabletas, trociscos o cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina. Las composiciones orales también prepararse utilizando un portador fluido para utilizarse como un lavado bucal. Los agentes aglutinantes farmacéutica o cosméticamente compatibles, y/o los materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición. Las tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos o similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o los compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente, tal como almidón o lactosa, un agente disgregante, tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante, tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante, tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; un agente saborizante, tal como hierbabuena, metilsalicilato o sabor de naranja. Las composiciones para distribución oral pueden ventajosamente incorporar agentes para mejorar la estabilidad dentro del tracto gastrointestinal y/o mejorar la absorción.
Para administración por inhalación, las composiciones actualmente descritas pueden distribuirse en la forma de una aspersión en aerosol de un contenedor o dosificador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador. Los aerosoles líquidos, los polvos secos y similares también pueden utilizarse.
La administración sistémica de las composiciones actualmente descritas también ser a través de medios transmucosales o transdérmicos . Para administración transmucosal o transdérmica, los penetrantes apropiados de la barrera a ser perneados se utilizan en la formulación. Tales penetrantes generalmente conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, para administración transmucosal, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosal puede lograrse a través del uso de aspersiones nasales o supositorios. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas como generalmente se conocen en la técnica.
Los compuestos también pueden prepararse en la forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como mantequilla de cacao y otros diglicéridos) o enemas de retención para distribución rectal.
Es ventajoso formular composiciones orales o parenterales en formas de dosis unitarias para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria como se utiliza en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a ser tratado; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado junto con el portador farmacéutico o cosmético. La especificación de las formas de dosis unitarias de la invención se dictan a través de y directamente dependiente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a ser logrado, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la formación del compuestos tales como un compuesto para el tratamiento de individuos. Las instrucciones con respecto a la dosificación se' proporcionan en cualquier lugar en la presente .
I. Artículos de Fabricación La presente invención también incluye un artículo de fabricación que proporciona un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) , o un sistema de distribución que comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) .
El artículo de fabricación puede incluir un frasco u otro contenedor que contiene una .composición adecuada para el presente método junto con cualquier portador, ya sea seco o en forma líquida. El artículo de fabricación además incluye instrucciones en la forma de una etiqueta en el contenedor y/o en la forma de un inserto incluido en una caja en donde el contendor se empaca, para llevar a cabo el método de la invención..: Las instrucciones también pueden imprimirse en la caja en donde se empaca el frasco. Las instrucciones contienen información tal como la dosis suficiente y la información de la administración para así permitir al sujeto o al" trabajador en el campo administrar la composición farmacéutica. Se anticipa que el trabajador en el campo abarca cualquier doctor, enfermera, técnica, esposa u otro cuidador que podría administrar la composición. La composición farmacéutica también puede auto-administrarse por el sujeto.
II. Métodos La presente invención proporciona métodos para distribuir un fármaco a una célula, para aniquilar una célula, o para tratar una enfermedad con un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) , o sistemas de distribución que comprenden un lípido catiónico de la fórmula (I) . Además se proporciona en la presente métodos para hacer sistemas de distribución que comprenden lípidos catiónicos. de la fórmula (I).
A. Métodos de distribución Los sistemas de distribución que comprenden vehículos lípidos comprenden un lípido catiónico de la fórmula (I) que puede utilizarse para distribuir un compuesto bioactivo a una célula. Los métodos comprenden poner en contacto una célula con sistema- de distribución que comprende un vehículo lípido encapsulando el compuesto bioactivo, en donde el vehículo lípido comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) . Como se describe en cualquier lugar en la presente, el término "distribuir" cuando se refiere a una composición de- la invención (por ejemplo, un compuesto bioactivo, un lípido citotóxico) se refiere al procedimiento resultante de la colocación de la composición dentro del espacio intracelular de la célula o el espacio extracelular que rodea a la célula. El término "célula" abarca células que están en cultivo y células dentro de un sujeto. En las modalidades en donde el compuesto bioactivo es un polinucleótido, la distribución de un polinucleótido en un espacio intracelular se refiere como "transfección" .
La distribución de un polinucleótido a una célula puede comprender un método in vi tro, un método ex vivo, en donde la transfección del polinucleótido en la célula ocurre fuera de un sujeto (células transíectadas que después pueden trasplantarse al sujeto) , y el método in vivo en donde la transfección ocurre dentro del sujeto mismo.
En algunas, .modalidades, el polinucleótido se suministra a través de un sistema de distribución de polinucleótido, en donde el vehículo lipido del sistema de distribución comprende un lipido catiónico de la fórmula (I) , y un co-lípido. En ciertas modalidades, el co-lípido es colesterol . ¦¦-¦ ¦·· .
B. Métodos, para hacer un sistema de distribución La presente invención proporciona métodos para hacer un sistema de distribución, en donde el vehículo lipido del sistema de distribución comprende un lipido catiónico de la fórmula (I) . Los métodos para hacer un sistema de distribución que comprenden un vehículo. lipido y un compuesto bioactivo, en donde el vehículo lipido encapsula el compuesto bioactivo comprenden mezclar un vehículo lipido que comprende un lipido catiónico de la fórmula (I) , con un compuesto bioactivo, por medio de lo cual forma el sistema de distribución.- En algunas modalidades, el paso de mezclado produce un vehículo lípido que comprende una bicapa soportada central .
En algunas modalidades, el vehículo lípido comprende un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) . De esta forma, se proporcionan en la presente métodos para hacer un sistema de distribución citotóxico que comprende un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) . En algunas de estas modalidades, el compuesto bioactivo del sistema de distribución citotóxico comprende un compuesto bioactivo citotóxico. En ciertas modalidades en donde se hace un sistema de distribución citotóxico, el sistema de distribución citotóxico comprende un vehículo lípido que comprende un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) que encapsula un compuesto bioactivo citotóxico.
También se proporcionan métodos para hacer un sistema de distribución de polinucleotido que comprenden un vehículo lípido que encapsula un policatión y un polinucleotido, el método comprende los pasos de: a) mezclar un polinucleotido y un policatión, por medio de lo cual forma una solución de polinucleótido/policatión; y b) mezclar un vehículo lípido que comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) con la solución de polinucleótido/policatión, por medio de lo cual forma el sistema de distribución.
Alternativamente, en algunas modalidades, el método para hacer un sistema de distribución de un polinucleótido comprende un vehículo lípido que encapsula un policatión y un polinucleótido, que comprende los pasos de: a) mezclar un vehículo lípido que comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) y un policatión, por medio de lo cual forma una solución de vehículo lípido/policatión; y b) mezclar la solución de vehículo lípido/policatión con un polinucleótido por medio de lo cual forma un sistema de distribución.
En algunas de estas modalidades en donde se hace un sistema de distribución de polinucleótido, el sistema de distribución además comprende una macromolécula portadora polianiónica . En estas modalidades, la macromolécula portadora polianiónica puede mezclarse con el polinucleótido antes de la adición del policatión. En otras modalidades, el polinucleótido, la macromolécula portadora polianiónica y el policatión pueden mezclarse juntos simultáneamente.
En ciertas modalidades en donde se hace un sistema de distribución del polinucleótido, el paso b) produce un vehículo lípido que comprende una bicapa soportada central.
En algunas modalidades, el vehículo lípido comprende un liposoma. En algunas de estas modalidades, el liposoma comprende un liposoma catiónico. Las modalidades en donde el vehículo lípido comprende un liposoma, el polinucleótido puede agregarse lentamente a la solución de liposomas o liposomas más policatión y mezclarse con una barra agitadora, en donde el mezclado se deja avanzar en segundo lugar después de la adición del polinucleótido. Alternativamente, el liposoma o la solución del liposoma/polication pueden adicionarse en una sola cámara desde una primera entrada al mismo tiempo que se agrega el polinucleótido a la cámara a través de una segunda entrada. Los componentes después se mezclan simultáneamente a través de medios mecánicos en una cámara común. Los complejos también pueden producirse primero mezclando el polinucleótido con el policatión y después agregando los liposomas preparados.
Los métodos para preparar liposomas son conocidos en la técnica. Por ejemplo, una revisión de las metodologías para preparación de liposomas pueden encontrarse en Liposome Technology (CFC Press NY 1984); Liposomes by Ostro (Marcel Dekker, 1987) ; Lichtenberg and Barenholz (1988) Methods Biochem Anal. 33:337-462 y Patente de E. U. A. No. 5,283,185. Por ejemplo, una mezcla de lípidos catiónicos de la fórmula (I) y opcionalmente lípidos catiónicos adicionales y/o co- lípidos, de los cuales los solventes se han eliminado, pueden emulsionarse a través del uso de homogeneizador, liofilizarse -y fundirse para obtener liposomas multilaminares .
Alternativamente, los liposomas unilaminares pueden producirse a través del método de evaporación de fase inversa (Szoka and Papahadjopoulos (1978) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:4194-4198). En algunas -modalidades, los liposomas se producen utilizando hidratación dé película delgada, como se describe en cualquier en la presente (ver sección Experimental; Bangham et al. (1965) J. Mol. Biol . 13:238-252). En ciertas modalidades, la formulación de liposomas pueden brevemente sonicarse e incubarse a 50 °C durante un corto periodo de tiempo (por ejemplo, de aproximadamente 10 minutos) antes del dimensionamiento (ver, Templeton et al. (1997) Nat re Biotechnology 15:647^652)...
En algunas modalidades, el método para hacer un sistema de distribución además comprende el paso de dimensionamiento después de que los liposomas han sido preparados, en donde el paso de dimensionamiento comprende seleccionar una población de liposomas con base en el tamaño (por ejemplo, diámetro) de los liposomas. Los liposomas pueden dimensionarse utilizando técnicas tales como ultrasonicación, homogenización de alta velocidad, y filtración por presión (Hope et al. (1985) Biochimica et Biophysica Acta 812:55; Patentes de E. U. A. Nos. 4,529,561 y 4,737,323). La sonicación de la suspensión del liposoma ya sea a través de un baño o sonicación de sonda produce una reducción progresiva del tamaño hacia vesículas unilaminares más pequeñas menores de aproximadamente 0.5 mieras en tamaño. Las vesículas multilaminares pueden recircularse a través de un homogenizador de emulsión estándar al tamaño- de liposoma deseado, típicamente entre aproximadamente 0.1 mieras y aproximadamente 0.5 mieras. El -tamaño de las vesículas liposómicas puede determinarse por difusión de luz cuasi -elásticas (QELS) (Bloomfield (1981) Ann. Rev. Biophys . Bioeng. 10:421-450). El diámetro, de liposoma promedio puede reducirse por sonicación de los liposomas formados. Los ciclos de sonicación intermitentes pueden alternarse con evaluación QELS para guiar la síntesis de ^liposoma eficiente. Alternativamente, los liposomas . pueden extruirse a través de una membrana de policarbonato de poro pequeño o una membrana de cerámica asimétrica para producir una distribución de tamaño bien definida. Típicamente, una suspensión se cicla a través de la membrana una o más veces hasta que se logra la distribución de tamaño de liposoma deseado. Los liposomas pueden extruirse a través de membranas de poro más pequeño sucesivamente, para lograr una reducción gradual en el tamaño de liposoma.
En ciertas modalidades, los métodos para hacer el sistema de distribución además pueden comprender un paso de purificación después del paso final, en donde los complejos del sistema de distribución se purifican de exceso de agente bioactivo libre, vehículo lípido libre, y n algunas modalidades policatión libre. La purificación puede lograrse a través de cualquier método conocido en la técnica, que incluyen, pero no se limita a, centrifugación a través de un gradiente de densidad de sacarosa u otro medio que es adecuado para formar un gradiente de densidad. Se entiende, sin embargo, que otros métodos de purificación tales como cromatografía, filtración, división de fase, precipitación o absorción también pueden utilizarse.- En un método, la purificación a través de centrifugación a través de un gradiente de densidad de sacarosa de utiliza. El gradiente de sacarosa puede estar en el intervalo de aproximadamente 0% de sacarosa a aproximadamente 60% de sacarosa o de 5% de sacarosa a aproximadamente 30% de sacarosa. El regulador de pH en donde se hace el gradiente de sacarosa puede ser cualquier regulador de pH acuoso adecuado para almacenamiento de la fracción que contiene- los complejos y en algunas modalidades, un regulador de pH adecuado para la administración del complejo a las células y a los tejidos.
En algunas modalidades, se elabora un sistema de distribución objetivo o un sistema de distribución PEGilado, en donde los métodos además comprenden un paso de post-inserción después de la preparación del vehículo lípido o después del paso final en los métodos, en donde por lo menos un conjugado de lípido- ligando selector de objetivo y un lípido PEGilado se post-inserta en el vehículo lípido (por ejemplo, liposoma) . Los vehículos lípidos que comprenden un conjugado de lípido- ligando selector de objetivo o un lípido PEGilado pueden prepararse siguiendo las técnicas conocidas en la técnica, que incluyen pero no se limitan a las presentadas en la presente (ver -sección Experimental; Ishida et al. (1999) FEBS Lett . 460:129-133; Perouzel et al. (2003) Bioconjug. Chem. 14:884-898). El paso de post-inserción puede comprender mezclar el vehículo lípido con el conjugado de lípido- ligando selector de objetivo o un lípido PEGilado e incubar las partículas a aproximadamente 50°C a aproximadamente 60 °C durante un breve periodo de tiempo (por ejemplo de aproximadamente 5 minutos, de aproximadamente 10 minutos) .
En algunas modalidades, los sistemas de distribución de polinucleótido se incuban con un conjugado de lípido-PEG a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 20% en moles, incluyendo pero no limitándose a aproximadamente 5% en moles, aproximadamente 6% en moles, aproximadamente 7% en moles, aproximadamente 8% en moles, aproximadamente 9% en moles, aproximadamente 10% en moles, aproximadamente 11% en moles, aproximadamente 12% en moles, aproximadamente 13% en moles, aproximadamente 14% en moles, aproximadamente 15% en moles, aproximadamente 16% en moles, aproximadamente 17% en moles, aproximadamente 18% en moles, aproximadamente 19% en moles, y aproximadamente 20% en moles, para formar un sistema de distribución de polinucleótido disimulado. En algunas de estas modalidades, la concentración del conjugado de lípido-PEG es de aproximadamente 10% en moles. La fracción de polietilenglicol del conjugado de lípido-PEG puede tener un peso - molecular en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 20,000 g/moles, incluyendo pero no limitándose a aproximadamente 100 g/moles, aproximadamente 200 g/moles, aproximadamente 300 g/moles, aproximadamente 400- g/moles, aproximadamente 500 g/moles, aproximadamente. 600 g/moles, aproximadamente 700 g/moles, aproximadamente 800 g/moles, aproximadamente 900 g/moles, aproximadamente 1000 g/moles, aproximadamente ...5000 .g/moles, aproximadamente 10,000 g/moles, aproximadamente 15,000 g/moles, y aproximadamente 20,000 g/moles. En ciertas modalidades, el conjugado de lípido-PEG comprende una molécula de PEG que tiene un peso molecular de aproximadamente 2000 g/moles. En. algunas ^modalidades, el conjugado de lípido-PEG comprende DSPE-PEG20oo · En ciertas modalidades en donde el complejo del sistema de distribución tiene una carga positiva neta y/o el vehículo lípido del sistema de. distribución tiene una superficie positivamente cargada a un pH fisiológico, las cantidades y relaciones de lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I), el policatión, y el polinucleótido que se mezclan son tales que la relación- de polinucleótido a lípido permite que el complejo del sistema de distribución tenga una carga positiva neta a un pH fisiológico (ver, por ejemplo, Patente de E. U. A. No. 7,335,509, que se incorpora aquí por referencia) .
En. algunas modalidades, en donde un sistema de distribución de polinucleótido comprende un vehículo lípido que encapsula un policatión y se se hace un polinucleótido, el vehículo lípido comprende . un lípido catiónico citotóxico de la fórmula. (I). En algunas modalidades, el compuesto bioactivo del sistema de distribución citotóxico comprende un polinucleótido citotóxico. En aún otras modalidades, el sistema de distribución del polinucleótido citotóxico se hace, en donde el sistema de distribución citotóxico comprende un vehículo lípido que comprende un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) que encapsula un policatión y polinucleótido citotóxico.
C. Métodos para aniquilar células La -invención abarca métodos para aniquilar una célula en donde la célula se pone en contacto con un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) o un sistema de distribución citotóxico. Los sistemas de distribución citotóxicos comprenden un lípido catiónico de la fórmula (I) y la actividad citotóxica puede impartirse a través de un compuesto bioactivo citotóxico, un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I), o ambos.
Como se utiliza en la presente el término "aniquilar" con relación a una célula se refiere a un procedimiento que da como resultado una célula que ya no es capaz de reproducirse, ya no está metabólicamente activa, o está en cualquier estado de _ apoptosis o necrosis (por ejemplo, etapa temprana, etapa tardía) . Estos métodos pueden utilizarse in vi tro para aniquilar células que están en cultivo o in vivo- para poner en contracto y aniquilar células con dentro de un sujeto. Los - métodos para medir la muerte celular son bien conocidos en la técnica y se presentan en cualquier lugar en la presente.
Cuando _una célula, se combina con otros tipos de células en cultivo o dentro de una configuración in vivo, en donde la célula es parte de un sujeto, un tipo de célula particular puede seleccionarse como objetivo y selectivamente aniquilarse a través del uso de un conjugado de lípido-ligando selector de objetivo, en donde el lípido es un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) . De esta forma, la invención proporciona métodos para selectivamente aniquilar una célula objetivo, en donde el método comprende poner en contacto la célula objetivo con un conjugado de lípido-ligando selector de objetivo, en donde el lípido es un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) . Adicionalmente , la invención presenta métodos para selectivamente aniquilar una célula objetivo que comprende poner en contacto la célula objetivo con un sistema de distribución citotóxico seleccionado, en donde la superficie exterior del vehículo lípido del sistema de distribución objetivo comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) . En algunas de estas modalidades, el lípido catiónico de la fórmula (I) tiene actividad citotóxica. En otras modalidades, el compuesto bioactivo tiene actividad citotóxica. En aún otras modalidades, tanto el lípido catiónico como el compuesto bioactivo tienen la actividad citotóxica.
En estas modalidades, la célula objetivo se aniquila selectivamente sobre una célula de control. Una célula de control puede ser cualquier tipo de célula de control adecuada conocida por el experto en la técnica. Por ejemplo, una célula de control puede ser una célula que no es capaz de interactuar con el ligando selector de objetivo (es decir, no expresa la proteína de la superficie celular que interactúa con el ligando selector de objetivo) o la célula de control podría interactuar con el ligando selector de objetivo a un grado menor de la célula objetivo (por ejemplo, la célula de control expresa la proteína de la superficie celular que interactúa con el ligando selector de objetivo a un grado menor que la célula objetivo) . En algunas modalidades, aproximadamente - 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 500, o aproximadamente 1000 veces el número de la célula objetivo se aniquila sobre el número de células-de control aniquiladas.
En algunas modalidades en donde una célula objetivo se aniquila selectivamente utilizando los métodos actualmente descritos, la célula objetivo es una célula cancerígena. De esta forma,- la presente invención proporciona métodos para selectivamente aniquilar una célula cancerígena mediante el contacto de una célula cancerígena con un conjugado de lípido-ligando selector de objetivo o un sistema de distribución objetivo que comprende un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I). El sistema de - distribución objetivo puede opcionalmente comprender un compuesto citotóxico.
En algunas modalidades en donde una célula cancerígena se aniquila selectivamente y el compuesto bioactivo del sistema de distribución objetivo comprende un polinucleótido citotóxico, el polinucleótido comprende un elemento silenciador que cuando se expresa o introduce en la célula reduce la expresión de un oncogén. En ciertas modalidades, el oncogén comprende EGFR.
D. Métodos para Tratamiento o Prevención Los lípidos catiónicos citotóxicos de la fórmula (I) , los sistemas de distribución que comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) , en donde el lípido catiónico de la fórmula (I) —tiene actividad citotóxica, sistemas de sistemas de distribución que comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) y un compuesto bioactivo que tiene actividad terapéutica, y sistemas de distribución que comprende un lípido catiónico citotóxico de la -fórmula (I) y un compuesto bioactivo con actividad terapéutica pueden utilizarse para el tratamiento de un sujeto afligido con .una enfermedad o una afección indeseada.
Como se utiliza en la presente, "actividad terapéutica" cuando se refiere a un compuesto bioactivo pretende ser una que es capaz de provocar un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado cuando se administra a un sujeto en la necesidad del mismo.
De esta forma, los métodos para el tratamiento de una enfermedad o una afección indeseada en un sujeto comprende la administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un- lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) , una composición farmacéutica que comprende un sistema de distribución que comprénde un., lípido catiónico de la fórmula (I) , en donde el lípido catiónico de la fórmula (I) tiene actividad citotóxica, una composición farmacéutica que comprende un sistema de distribución que comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) , y un compuesto bioactivo que tiene actividad . terapéutica, contra la enfermedad o afección indeseada (por ejemplo, es capaz de tratar la enfermedad o la afección indeseada). En algunas modalidades, el compuesto bioactivo con actividad terapéutica comprende un compuesto bioactivo citotóxico.
Como se en la presente, los términos "tratamiento" o "prevención" se refiere a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de completa o parcialmente evitar una infección o enfermedad particular o signo o síntoma del mismo y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de una infección o enfermedad y/o efecto adverso atribuido a la infección o enfermedad. Por consiguiente, el método "previene" (es decir,, retrasa o inhibe) y/o "reduce" (es decir, disminuye, alenta o mejora) los efectos perjudiciales de una enfermedad o trastorno en el sujeto que recibe las composiciones de la invención. El sujeto puede ser cualquier animal, incluyen un mamífero, tal como un humano, incluyendo, pero en ninguna forma limitando, animales domésticos, tales como sujetos felinos, o caninos, animales de granja, tales como, pero no limitándose a bovino, equino, caprino, ovino y porcino, animales salvajes (ya sea no domesticados o en un jardín zoológico) , animales de investigación, tales como ratones, ratas, conejos, cabras, ovejas, puercos, perro, gatos, etc., - especies aviarias, tales como pollos, pavos, canarios, etc .., es decir, .para uso médico , veterinario.
Cualquier tipo de afección o enfermedad indeseada puede tratarse terapéuticamente con las composiciones actualmente- descritas. En algunas modalidades, la enfermedad o la afección indeseada que se va a tratar es un cáncer. Como se describe en cualquier en cualquier lugar en la presente, el término "cáncer" abarca cualquier tipo de crecimiento celular no regulado e incluye,, las formas de cáncer. En algunas modalidades, el cáncer a ser tratado es cáncer pulmonar. Los métodos para detectar la inhibición del crecimiento o el avance del cáncer se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan . a,—.medieión~del tamaño del tumor primario para detectar una reducción en su tamaño, retraso de la aparición de tumores secundarios, y su inhibición del desarrollo de tumores secundarios, disminución de la aparición de " tumores secundarios, y alentamiento o disminución de la severidad de los efectos secundarios de la enfermedad.
Se entenderá por un experto en la técnica que la administración de lípidos catiónicos citotóxicos de la fórmula (I) y los sistemas de distribución de la invención pueden utilizarse solos o juntó con otras modalidades terapéuticas, que incluyen, pero no se limitan a, terapia quirúrgica, radioterapia o tratamiento con cualquier tipo de agente terapéutico, tal como un fármaco. En las modalidades en donde el sujeto está afligido con cáncer, los lípidos catiónicos citotóxicos de la fórmula (I) y los sistemas de distribución pueden distribuirse en combinación con cualquier agente quimioterapéutico bien conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, los agentes quimioterapéuticos descritos en cualquier lugar en la presente, y cualquier otro fármaco citotóxico, como se describe en cualquier lugar en la presente o inmunoterapia .
En una modalidad, la actividad citotóxica de un compuesto bioactivo citotóxico se mejora en un sujeto en la necesidad del mismo a través de la administración al sujeto del compuesto -bioactivo citotóxico. y un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I)'. Como se utiliza en la presente, los términos "mejora", "mejorado", o "mejoramiento" se refiere a un aumento aditivo o sinergístico . De esta forma, cuando la actividad citotóxica de un compuesto bioactivo citotóxico se mejora a través de la administración de un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I), un sistema de distribución citotóxico, la actividad citotóxica se aumenta aditiva o sinergísticamente con relación a la administración del compuesto bioactivo citotóxico o de lípido catiónico citotóxico solo.
En algunas modalidades, el compuesto bioactivo citotóxico y el lípido catiónico citotóxico pueden administrarse simultáneamente al sujeto, en donde el compuesto bioactivo citotóxico y el lípido catiónico citotóxico ambos están presentes dentro de una sola composición que se administra al sujeto. Alternativamente, en otras modalidades, el compuesto bioactivo citotóxico y el lípido catiónico citotóxico se administran en composiciones separadas secuencialmente. Por "secuencialmente" significa que dos compuestos se administran uno después del otro al sujeto, con dos administraciones separadas de dos composiciones diferentes, en donde una composición comprende el compuesto bioactivo citotóxico y la otra composición comprende el lípido catiónico citotóxico. En algunas de las modalidades en donde el- compuesto bioactivo citotóxico y el lípido catiónico citotóxico se administran secuencialmente, el compuesto bioactivo citotóxico se administra primero, seguido por el lípido catiónico citotóxico. En otras modalidades, el lípido catiónico citotóxico se administra al sujeto en la necesidad del mismo antes de la administración del compuesto bioactivo citotóxico. En ciertas modalidades, el compuesto bioactivo citotóxico comprende cisplatina.
En otras modalidades de la invención, la actividad citotóxica de un compuesto bioactivo citotóxico se mejora en un sujeto a través de la administración del sistema de distribución que comprende un vehículo lípido que encapsula el compuesto bioactivo citotóxico, en donde el vehículo lípido comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) con actividad citotóxica. En algunas de estas modalidades, el compuesto bioactivo citotóxico comprende un polinucleótido citotóxico.
Cuando se administra a un sujeto en la necesidad del mismo, el lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) o los sistemas de distribución que comprenden el lípido catiónico de la fórmula (I) además pueden comprender un ligando selector de objetivo como se explicó en cualquier lugar en la presente. En estas modalidades, el ligando selector de objetivo, activará el ligando o complejo físicamente asociado a una célula o tejido activado dentro del sujeto. En algunas modalidades, el sistema. de distribución objetivo es citotóxico. En ciertas modalidades, la célula o tejido activado estará enfermo o se caracterizará por una afección indeseada. 1. Dosificación La distribución de una cantidad terapéuticamente efectiva de un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) o un sistema de distribución que comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) puede obtenerse a través de la administración de una composición farmacéutica que comprende una dosis terapéuticamente efectiva de este agente. Por "cantidad terapéuticamente efectiva" o "dosis" significa la concentración de un lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) o un complejo del sistema del distribución que comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) que es suficiente para provocar el efecto terapéutico deseado.
Como se utiliza en la presente, "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para obtener los resultados benéficos o- clínicos o bioquímicos deseados. Una cantidad efectiva puede administrarse una o más veces.
"La cantidad efectiva del lípido catiónico citotóxico de la fórmula (I) o un complejo del sistema de distribución que comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) variará de acuerdo con el peso, sexo, edad, e historial médico del sujeto. Otros factores que influencian la cantidad efectiva pueden incluir, pero no se limitan a, la severidad de la afección del sujeto, el trastorno que se está tratando, la estabilidad del compuesto complejo, y, si se desea, el agente terapéutico adyuvante que se está administrando junto con el lípido o el complejo que comprende lípido. Los métodos para determinar la eficacia y la dosificación son conocidos por el experto en la técnica. Ver, por ejemplo, Isselbacher et al. (1996) Harrison's Principies of Internal Medicine 13a ed. , 1814-1882, que se incorpora aquí por referencia.
La composición farmacéutica puede administrarse a varios intervalos y por diferentes periodos de tiempo según se reqúiera, por ejemplo, múltiples veces por día, diariamente, cada día alterno, una vez por semana, entre aproximadamente de 1 a 10 semanas, entre 2 a 8 semanas, entre aproximadamente 3 a 7 semanas, entre 4, 5 o 6 semanas, y similar. El experto en la -técnica apreciará' que ciertos factores pueden influenciar la dosificación y el cronometraje requerido para, eficientemente tratar a. un sujeto, incluyendo pero no limitándose a la- severidad de la - enfermedad, el trastorno o la afección indeseada, tratamiento previo, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades o afecciones indeseadas presentes.. Generalmente, el tratamiento del un sujeto puede incluir un. solo tratamiento o, en muchos casos, puede incluir una serie de tratamientos.
Se entiende que dosis apropiada de un compuesto depende de su' potencia y puede opcionalmente personalizarse al receptor particular, por ejemplo, a través de la administración de dosis incremento hasta que se logra la respuesta deseada preseleccionada . Se entiende que el nivel de dosis específico para un sujeto o animal en particular puede depender de una variedad de factores que incluyen la actividad del. compuesto específico utilizado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, y la dieta del sujeto, el tiempo de administración, la ruta de administración, el grado de excreción,- cualquier combinación de fármacos y el grado de expresión o actividad a ser modulada.
- En otra modalidad de la invención, una dosis terapéuticamente efectiva del lípido catiónico citotóxico de -la' fórmula (I) o el sistema de distribución que comprende un lípido catiónico de la fórmula (I) se administra intermitentemente. Por "administración intermitente" significa la administración de una dosis terapéuticamente efectiva de lípido o del complejo que comprende lípido, seguido por un periodo de tiempo dé suspensión, que después es seguido por otra administración de una dosis terapéuticamente efectiva, etc. La - administración de la dosis terapéuticamente efectiva puede lograrse en una forma continua, como por ejemplo, con una formulación de liberación sostenida, o puede lograrse de acuerdo con un régimen de dosificación diario deseado, como por ejemplo, con 1, 2, 3, o más administraciones por día. Por "periodo de tiempo de suspensión" significa descontinuar la administración de liberación sostenida continua o diaria de lípido o el complejo que comprende lípido. El periodo de tiempo de suspensión puede ser mayor o menor que el periodo de administración de liberación sostenida continua o diaria. Durante el periodo de tiempo de suspensión, el nivel de lípido catiónico o de los complejos que comprenden el lípido de la invención en el tejido relevante está sustancialmente por debajo del nivel máximo obtenido durante el tratamiento. En algunas modalidades, el periodo de suspensión depende de la concentración de la dosis efectiva. El periodo de suspensión puede de ser de al menos 2 días, al menos 4 días, o al menos. 1 semana. En otras modalidades, el periodo de suspensión es de al menos 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses o más. Cuando se utiliza una formulación de liberación sostenida, el periodo de suspensión puede extenderse para representar el tiempo de residencia máximo del lípido o del complejo que comprende lípido en el sitio terapéutico. Alternativamente, la frecuencia de administración de la dosis efectiva de la formulación de liberación sostenida puede disminuirse por consiguiente. Un programa intermitente en la administración de lípido o los complejos que comprenden lípido puede continuar hasta que el efecto terapéutico deseado, y finalmente el tratamiento de la enfermedad o la afección indeseada se logre.
Un experto en la técnica después de la revisión del tema de la presente descripción apreciará que los compuestos actualmente descritos, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables y sus composiciones farmacéuticas, pueden administrarse directamente en una célula, un cultivo celular, un medio de cultivo celular, un tejido, un cultivo tisular, un medio de cultivo tisúlar y similar. Cuando se refiere a nuevos lípidos catiónicos de la invención o sistemas de distribución de la invención, el término "administrar" y sus derivaciones, comprenden cualquier método que permita que el compuesto se ponga en contacto con una célula. Los compuestos actualmente descritos, o las sales farmacéuticamente aceptables ' o sus composiciones farmacéuticas pueden administrarse a (o ponerse en contacto con) una célula o un tejido in vi tro o ex vivo. Los compuestos actualmente descritos, o las sales farmacéuticamente aceptables, o sus composiciones farmacéuticas, también pueden administrarse a (o ponerse en contacto con) una célula o tejido in vivo a través de la administración a un sujeto individual, por ejemplo un paciente, por ejemplo, a través de -administración sistémica (por ejemplo, administración intravenosa, intraperitoneal , intramuscular, sub-dérmica o intracraneal) o aplicación tópica, como se describe en cualquier lugar en la presente.
III. Definición de Términos Químicos Ya que se cree que los siguientes términos son bien entendidos por un experto en la técnica, se establecen las siguientes definiciones para facilitar la explicación del tema actualmente descrito.
En toda la especificación y las reivindicaciones, una fórmula o nombre químico dado deberá abarcar todos los ópticos y estereoisómeros , así como mezclas racémicas en donde existen tales isómeros y mezclas.
Cuando se utiliza el término "independientemente seleccionado", los sustituyentes a los que se refiere (por •ejemplo, grupos R,~ tales como los grupos Ri, R2, y similares, o grupos Qi y Q2) , pueden ser idénticos o diferentes. Por ejemplo, tanto Ri como R2 pueden ser alquilo sustituidos, o Ri puede ser hidrógeno y R2 puede ser un alquilo sustituido y similar.
Un grupo denominado "R" o "Q"¦. generalmente tendrá la estructura que se reconoce en la técnica como" correspondiendo a un grupo que tiene nombre, a menos que se especifi8que lo contrario en la presente. Para propósitos de ilustración, ciertos grupos "R" y "Q" como se establecen anteriormente se definen a continuación.
Estas definiciones pretenden . complementar e ilustrar, no excluir, las definiciones que serán evidentes a un experto en la técnica después de la revisión de la presente descripción.
-..Como se utiliza en., la presente, el término "alquilo" se refiere a cadenas hidrocarbonadas de Ci-2o inclusive, lineales (es decir, de "cadena recta") , ramificadas o cíclicas, saturadas o por lo menos parcialmente y en algunos casos completamente insaturadas (es decir, alquenilo y alquinilo) , incluyendo por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, ter-butilo, pentilo,- hexilo, octilo, etenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo, octenilo, butadienilo, propinilo, butinilo-, - pentinilo, · hexinilo, heptinilo, y alenilo. "Ramificado" se refiere a un grupo alquilo en donde el grupo alquilo inferior, tal como metilo, etilo o propilo, se unen a la cadena de alquilo lineal. "Alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que tiene 1 a aproximadamente 8 átomos de carbono (es decir, un alquilo de Ci-8) , por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 átomos de~ carbono. "Alquilo superior" se refiere a un grupo alquilo que tiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 átomos de carbono, por ejemplo 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 átomos de carbono. En ciertas modalidades, "alquilo" se refiere en particular a alquilos de cadena recta de Ci-8. En otras modalidades, "alquilo" se refiere en particular a alquilos de cadena ramifica de Ci-8.
Los grupos alquilo pueden opcionalmente estar sustituidos (un "alquilo sustituido") con uno o más sustituyentes del grupo alquilo, que pueden ser iguales o diferentes. El término "sust ituyente del grupo alquilo" incluye pero no se limita, a alquilo, alquilo sustituido, halo, arilamino, acilo, hidroxilo, ariloxilo, alcoxilo, alquiltio, ariltio, aralquiloxilo, aralquiltio, carboxilo, alcoxicarbonilo, oxo y cicloalquilo . Puede haber opcionalmente insertados en la cadena de alquilo uno o más átomos de oxígeno, azufre, o de nitrógeno sustituido o sin sustituir, en donde el sustituyente de nitrógeno es hidrógeno, alquilo inferior (también referido en la presente - "alquilaminoalquilo" ) , o arilo.
De esta forma, como se utiliza en la presente, el término "alquilo sustituido" incluye grupos alquilos como se definen en la presente, en donde uno o más de los átomos o grupos funcionales del grupo alquilo están reemplazados con otro átomo o grupo funcional, que incluyen por ejemplo, alquilo, alquilo sustituido, halógeno, arilo, arilo sustituido, alcoxilo, hidroxilo, nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, sulfato, y mercapto.- "Cíclico" y "cicloalquilo" se refiere a un sistema anular no aromático mono- o multicíclico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 átomos de carbono, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 átomos de carbono. El grupo cicloalquilo puede estar opcionalmente parcialmente insaturado. El grupo cicloalquilo también puede estar opcionalmente sustituido con un grupo alquilo sustituyente como se define en la presente, oxo, y/o alquileno. Puede opcionalmente insertarse en la cadena de alquilo cíclica uno o más átomos de oxígeno, azufre o nitrógeno sustituido o sin sustituir, en donde el sustituyente de nitrógeno es hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido, de esta forma proporcionando un grupo heterocíclico . Los anillos cicloalquilo monocíclicos representativos incluyen ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo . Los anillos cicloalquilo multicíclicos incluyen adamantilo, octahidronaftilo , decalino, alcanfor, alcanfano y noradamantilo .
El término "cicloalquilalquilo" como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo cicloalquilo como se define en la presente anteriormente, que se une a la fracción molecular progenitora a través de un grupo alquilo, también como se define anteriormente. Los ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen ciclopropilmetilo y ciclopentiletilo.
Los términos "cicloheteroalquilo" o "heterocicloalquilo" se refieren' a un sistema anular no aromático, tal como un sistema anular cicloalquilo sustituido o sin sustituir de 3 a 7 miembros, que incluyen uno o más heteroátomos que pueden ser iguales o diferentes, y se seleccionan del grupo que consiste de N, O y S, y opcionalmente pueden incluir uno o más enlaces dobles. El anillo cicloheteroalquilo puede opcionalmente fusionarse a o por el contrario unirse a otros anillos cicloheteroalquilo y/o anillos de hidrocarburo no aromáticos. Los sistemas anulares de cicloheteroalquilo representativos incluyen, pero no se limitan a, pirrolidinilo, pirrolinilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperidilo, piperazinilo, indolinilo, quinuclidinilo , morfolinilo, tiomorfolinilo, tiadiazinanilo, tetrahidrofuranilo, y similares .
El término "alquenilo" como se utiliza en la presente se refiere a un hidrocarburo recto o ramificado de un número designado de átomos de carbono que contienen por lo menos un enlace doble del carbono-carbono . Los ejemplos "alquenilo" incluyen vinilo, alilo, 2-metil-3-hepteno, y similares .
El término "cicloalquenilo" como se utiliza en la presente se refiere a un hidrocarburo cíclico que contiene por lo menos un enlace doble de carbono-carbono . Los ejemplos de grupos cicloalquenilo incluyen ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, - ciclopentadieno, ciclohexenilo, 1, 3-ciclohexadieno, cicloheptenilo, cicloheptatrienilo, y ciclooctenilo .
El término "alquinilo" como se utiliza en la-presente se refiere a un hidrocarburo recto o ramificado de un número designado de átomos de carbono que contiene por lo menos un enlace triple de. carbono-carbono . Los ejemplos "alquinilo" incluyen propargilo, propino, y 3-hexino.
"Alquileno" se refiere a un grupo hidrocarburo alifático divalente de cadena recta o ramificado que tiene de 1 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 átomos de carbono. El grupo alquileno puede ser recto o ramificado o cíclico. El grupo alquileno también puede se opcionalmente insaturado y/o sustituido con uno o más "sustituyentes del grupo alquilo" . Puede opcionalmente insertarse en el grupo alquileno uno o- más átomos de oxígeno, azufre o nitrógeno sustituido o sin sustituir "también referido en la presente como "alquilaminoalquilo" ) , en donde el sustituyente del nitrógeno es alquilo como se describió previamente. Los grupos alquileno ilustrativos incluyen metilen ( -CH2- ) ; etilen ( -CH2-CH2-) ; propilen ( - (CH2) 3- ) ; cicl-ohexilen ( -C6Hi0- ) ; -CH=CH- CH=CH-; -CH=CH-CH2-; . - ( CH2 ) q-N (R) - ( CH2 ) r- en donde cada uno de q y r es independientemente un número entero de 0 a aproximadamente 20, por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18.,. 19, O 20, y R es hidrógeno o alquilo inferior; metilendioxil ( -0-CH2-0- ) ; y etilendioxil ( -0- (CH2) 2-0- ) . Un grupo alquileno puede tener de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 átomos de carbono y además puede tener 6-20 carbonos.
Como se utiliza en la presente, el término "acilo" se refiere a un grupo ácido orgánico en donde el -OH del grupo carboxilo ha sido reemplazado con otro sustituyente (es decir, como se representa por RCO-, en donde R es un grupo alquilo o un arilo como se define en la presente) . Es decir, el término "acilo" específicamente incluye grupos arilacilo, tales como un grupo acetilfurano y un grupo fenatilo. Los ejemplos específicos de grupos acilo incluyen acetilo y benzoilo.
"Alcoxilo" se refiere a un grupo alquil -0 en donde el alquilo es como se describió previamente. El término "alcoxilo" como se utiliza en la presente puede referirse a cadenas oxo-hidrocarbonada de ' Ci"_2ó inclusive, lineales, ramificadas o cíclicas, saturadas o insaturadas, que incluyen, por ejemplo, metoxilo, etoxilo, propoxilo, isopropoxilo, butoxilo, t-butoxilo, y pentoxilo.
El término "alcoxialquilo" como se utiliza en la presente se refiere a un éter alquil-O-alquilo, por ejemplo, un grupo metoxietilo o etoximetilo. - "Ariloxilo" se refiere .a un grupo aril-O- en donde el grupo arilo es como se describe previamente, incluyendo un arilo sustituido. El término "ariloxilo" como se utiliza en la presente puede referirse a feniloxilo o hexiloxilo, y alquilo, alquilo sustituido, halo o feniloxilo o hexiloxilo' sustituido con alcoxilo El término "alquil -tio-alquilo" como se utiliza en la presente se refiere a un tioéter de alquil-S-alquilo, por ejemplo, un metiltiomet ilo o un grupo met ilt ioet ilo .
"Aralquilo" se refiere a un grupo aril -alquilo en donde el arilo y el alquilo son como se definieron previamente, y se incluyen- arilo sustituido y alquilo sustituido. Los grupos arilalquilo sustituido incluyen pentilo, feniletilo y naftilmet ilo .
"Aralquiloxilo" se refiere a un grupo aralquil-0 en donde el grupo aralquilo- es como se define previamente. Un grupo aralquiloxilo ilustrativo es benciloxilo.
"Alcoxicarbonilo" se- refiere a un grupo alquil -0- CO. Los grupos alcoxicarbonilo ilustrativos incluyen raetoxicarbonilo, etoxicarbonilo, butiloxicarbonilo, y t-butiloxicarbonilo . "Ariloxicarbonilo" se refiere a un grupo aril-0-CO. Los grupos ariloxicarbonilo ilustrativos incluyen fenoxi -naftoxi-carbonilo .
"Aralcoxicarbonilo" se refiere a un grupo aralquil -0-C0-. Un grupo aralcoxicarbonilo ilustrativo es benciloxicarbonilo .
"Carbamoilo" se refiere a un grupo H2N-CO- . "Alquilcarbamoilo" se refiere a un grupo R'RN-CO- en donde uno de R y R' es hidrógeno y el otro de R y R' es alquilo y/o alquil sustituido como se describe previamente. "Dialquilcarbamoilo" se refiere a un grupo R'RN-CO- en donde cada R y R' es independientemente alquilo y/o alquilo sustituido como se describe previamente.
"Aciloxilo" se refiere a un grupo acil-O- en donde el acilo es como se describe previamente.
El término "amino" se refiere a un grupo -NH2 y también se refiere a un grupo que contiene nitrógeno como se conoce en la técnica derivado de amonio a través del reemplazo de uno o más radicales de hidrógeno a través de radicales orgánicos. Por ejemplos, los términos "acilamino" y "alquilamino" se refieren a radicales orgánicos N-sustituidos con grupos sustituyentes de acilo y alquilo respectivamente.
El término "alquilamino" se refiere a un grupo - NHR, en donde R es un grupo alquilo y/o un grupo alquilo sustituido como se describe previamente. Los grupos alquilamino ilustrativos incluyen alquilamino, etilamino y similares .
- "Dialquilamino" se refiere a un grupo -NRR' en donde cada uno de R y R1 es independientemente . un grupo alquilo y/o un grupo alquilo sustituido como se describe previamente. Los grupos dialquilamino ilustrativos incluyen etilmetilamino, dimetilamino y dietilamino.
"Acilamino" se refiere a un grupo acil-NH- en donde el acilo es como se describe previamente. "Aroilamino" se refiere a un grupo aroil-NH- en donde el aroilo es como se' describe previamente.
El término "carbonilo" se refiere a un grupo - (C=0)-.
El término "carboxilo" se refiere a un grupo -COOH.
Los términos "halo" , "haluro" , o "halógeno" como se utiliza en la presente se refieren a grupos fluoro, cloro, cromo y yodo .
El término "hidroxilo" se refiere al grupo -OH.
El término "hidroxialquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo -OH.
El término "mercapto" se refiere al grupo -SH.
El término "oxo" se refiere a un compuesto descrito previamente en la presente en donde el átomo de carbono está reemplazado por un átomo de oxígeno.
El término "nitro" se refiere al grupo -N02.
El término "tio" se refiere a un compuesto descrito previamente en la presente en donde el átomo de carbono u oxígeno está reemplazado por un átomo de azufre .
El término "sulfato" se refiere al grupo -S04.
El término" guanidino" se refiere a un radical que tiene estructura química general de: en donde cada R puede independientemente ser, por ejemplo, H o alquilo.
El término "guanidinio" se refiere a un grupo catiónico que tiene la estructura química general de: Un experto en la técnica reconocerá que el catión guanidinio puede existir en las siguientes formas canónicas de resonancia: Se ofrecen los siguientes ejemplos a manera de ilustración y no a manera de limitación.
EXPERIMENTAL Materiales y Métodos para los Ejemplos 1-8 Los datos de la espectrometría de masa de bombardeo de átomos rápida (FABMS, por sus siglas en inglés) se adquirieron por la técnica de espectrometría de masa de ión secundario líquida (LSIMS, por sus siglas' en inglés) utilizando alcohol meta-hidrobencílico como la matriz. El análisis LSIMS se llevó a cabo en el intervalo de exploración de 100-1000 amu a la velocidad de 3 exploraciones/s . El espectro 1H NMR se registró en un espectrómetro Gemini 300 MHz . La tetradecilamina, ' bromótetradecan N, 1 -diciclohexil carbodiimida, N-épsilon-benciloxicarbonil-L-lisina, N-alfa-benciloxicarbonil-L-lisina, bromhidrato de bromoetilamina, N-hidroxisuccinimida, resina de intercambio de ión Amberlite Cl, ácido trifluoroacético, ácido acético glacial, 10% de Pd-C, formiato de amonio, celite, yoduro de metilo, tiourea, cloruro de . mercurio, Boc-anhídrido, hidruro de sodio, y bromohidruro de bromoetilamina se obtuvieron de Sigma Aldrich. Los solventes como diclorometano, cloroformo, metanol, dimetilformamida, tetrahidrofurano, acetato de etilo y éter de petróleo se compraron en Acros Organics. El DOTAP y el colesterol se compraron en Avanti Polar Lipids, Inc.
(Alabaster, AL) . El sulfato de protamina (fracción X de salmón) y ADN de timo de becerro (para hibridación, fenol-cloroformo extraído y etanol precipitado) fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) .
El avance de la reacción se monitoreó por cromatografía de capa delgada en en placas con gel de sílice de 0.25 mm compradas de Sigma Aldrich. La cromatografía de columna se ~ realizó con gel-- de.- sílice : (Sigma Aldrich, Grade 62, malla 60-200, 150Á) . - El EGFR y las secuencias, de control de AR si se adoptaron de estudios previos (Banerjee et al. (2004) Int. J. Cáncer 112:693-700). Los ARNsi sintéticos se compraron en Dharmacon (Lafayette, CO) . La estructura de cadena sentido del ARNsi de EGFR tiene la. secuencia 5'-AACACAGUGGAGCGAAUUCCU-31 (representada í en .SEC ID NO: 1) y la estructura de cadena sentido del ARNsi de control de alta pureza es 5 ' -AAUUCUGCGAACGUGUCACGU-3 (SEC ID NO: 2). Para los estudios cuantitativos, FAM se conjugó en el extremo 5' de la secuencia sentido. .El ARNsi marcado con 5' FAM también se obtuvo de Integrated DNA Technologies.
Síntesis de lípidos 1-3..
Los lípidos 1-3 (Figura 1) se sintetizaron siguiendo los procedimientos descritos esquemáticamente en la Figura 2. El procedimiento sintético para un lípido representativo, lípido 2, se detalla a continuación. Para los otros dos lípidos, solamente los datos de TLC, NMR y de espectro de masa se proporcionan a continuación. Debido a la extensiva línea que se extiende en el espectro 1H NMR de los lípidos desprotegidos finales (particularmente en la región d/ppm = 3-5) , todos los lípidos finales se caracterizaron por LSIMS.
Síntesis de cloruro de N, N-Dimiristoil-N-metil-N-2 [N 1 - (N2-guanidin-L Lisinil )] aminoetil amonio (Lípido 2): Paso (a) HOSu sólido (0.15 g, 1.3 mmoles) y DCC (0.29 g, 1.4 mmoles) se agregaron secuencialmente a una solución helada y agitada de ?e , -ter-butoxicarbonil -N™-benciloxicarbonil-L-Lisina (0.48 g, 1.3 mmoles, preparada de Na-benciloxicarbonil -L-Lisina y di-ter-butildicarbonato como se describe previamente (Bodanszky . y Bodanszky (1984) Springer-Verlag, Berlín, Heidelberg, p. 20) en DCM seco/DMF seco (9:1, v/v) . Después de media hora, se agregó N-aminoetil-N, -di-n-tetradecilamina (0.57 g, 1.3 mmoles, preparada como se describe previamente (Kumar et al. (2003) Gene Ther. 10:1206-1215) y DMAP (catalítico) disuelto en DCM seco a la mezcla de reacción. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente por 24 h, el DCU sólido se filtró y el solvente del filtrado se evaporó. El residuo se disolvió en acetato de etilo (100 mi) y lavó secuencialmente con 1N HCl helado (3 x 100 mi) , bicarbonato de sodio saturado (3 x 100 mi) y agua (3 x 100 mi) . La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio . anhidro, se filtró, y el solvente del filtrado se eliminó por evaporación giratoria. El residuo se cargó sobre una columna de purificación cromatográfica con una malla de 60-120 de gel de sílice utilizando 2-2.5% de metanol-diclorometano (v/v) como eluyente, lo cual dio 0.612 g (58%) del intermediario puro, N-2- [?' - (?e-???,?0?-Benciloxicarbonil-L-Lisini-1) ] aminoetil-N,N-di-n-tetradecilamina . (Rf = 0.6, 10% metanol-diclorometano, v/v) . XH NMR (300 MHz, CDCl3): d/ppm =0.9 [t, 6H, CH3- (CH2) n- ] ; 1.2-1.4 [m, 44H, -(CH2)n-]; 1.3-1.6 [m, 4H, LysCYH2+ LysC¾] ; 1.4 [s, 9H, -CO-0-C(CH3) 3] ; 1.5 [m, 4H, -N ( -CH2-CH2- ) 2] ; 1.8 [m, 2H, LysCpH2] ; 2.4-2.6 [bm, 6H, -N ( -CH2-CH2- ) 2 + -N-CH2-CH2-NH-CO-0-] ; 3.1 [m, 2H, LysuCH2] ; 3.3 [m, 2H, -N-CH2-CH2-NH-CO- ] ; 4.0-4.2 [2 m, 2H, LysCaH + -CH2-CH2-NH-CO- ] ; 4.6 [m, 1H, BOC -NH] ; 5.1 (s, 2H , Z- CH2) ; 5.5 (m, 1H, Z-NH) ; 7.3 (m, 5H, Ar-H) .
Paso (b) . El intermediario (0.62g, 0.76 mmoles) obtenido en el paso (a) se disolvió en metanol seco (10 mi) conteniendo unas cuantas gotas de ácido acético glacial. Se agregó formiato de amonio (0.38 g, 6.0 mmoles) y 10% de Pd/C (0.25 g) y la mezcla de reacción se dejó en ágitación bajo atmósfera de nitrógeno por 6 h. El catalizador se eliminó por filtración a través de celite y después el filtrado se secó por evaporación. El residuo se disolvió en acetato de etilo (50 mi) y lavó secuencialmente con 30% de carbonato de potasio acuoso (3 x 50 mi) , cloruro de sodio saturado (3 x 50 mi) y agua (3 x 50 mi) . La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y la evaporación giratoria del solvente del filtrado dio 0.51 g (69%) del intermediario N-2- [N 1 - (NE-BOC-L-Lisinil) ] aminoetil-N, N-di-n-tetradecilamina (Esquema de Reacción I) (Rf=0.2, 10% metanol en dicloroetano, v/v) . Este intermediario, se utilizó directamente sin purificación adicional en el paso (c) .
Paso (c) Se agregó cloruro de mercurio (0.16 g, 0.57. inmoles) a una mezcla de N-2 - [ ' - (NE-BOC-L-Lisinil) ] aminoetil-N, -di-n-tetradecilamina (0.35g. 0.5 mmoles), bis-BOC tiourea (0.15 g, 0.5 mmoles), y trietilamina ( 0.1 Ir, 1.1 mmoles) disuelta en DMF seco (5 mi) y DCM seco (2 mi) a 0°C con agitación continua. La mezcla resultante se agitó a 0°C bajo nitrógeno por 40 min, diluyó con acetato de etilo (20 mi) y se filtró filtró a través de una almohadilla de celite. La solución del filtrado se lavó con agua (2 X 20 mi), y después solución de salmuera (2 X 20 mi). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y el solvente del filtrado se eliminó por evaporación giratoria. El residuo se cargó sobre una columna de purificación cromatográfica con una malla de 60-120 de gel de sílice utilizando 2-2.5% de metanol-diclorometano (v/v) como eluyente, lo cual dio 0.25 g (53 %) del intermediario ,puro N-2- [N 1 - (NE-BOC,Na- (DiBenciloxicarbonil guanidino-L-Lisinil) ] aminoetil-N, -di-n-tetradecilamina. (Rf = 0.8, 10% metanol-diclorometano, (v/v) . 1H NMR (300 MHz, CDC13) : d/ppm =0.9 [t, 6H, CH3- (CH2)n-] ; 1.2-1.4 [m, 44H, -(CH2)Hn]; 1.3- 1.6 [m, 4 H, LysCYH2+LysC°H2] ; 1.4-1.6 [3s, 27H, CO-O-C (CH3) 3] ; 1.5 [m, 4H, -N(-CH2-CH2-)2] ; 1.75 [m, 2H, LysCpH2] ; 2.4 [t, 4H, -N(-CH2-CH2-) 2] ; 2.5 [t, 2H, -N-CH2-CH2-NH-CO] ; 3.1 (m, 2H, Lys^Hs) ; 3.3 [m, 2H, -N-CH2-CH2-NH-CO] ; 4.6 [m, 1H, LysCaH] ; 6.7 [m, 1H, BOC-NH-CH2] ; 7.9 [m, 1H, -CH2-NH-CO- ] ; 8.8 [d, 1H, -CH2-NH-] ; 11.4[s, 1H, C-NHBOC] .
Paso (d) : El intermediario obtenido en el paso (c) (0.25 g) se disolvió en 3 mi de diclorometano/metanol (2:1, v/v) y se agregaron 3 mi de yoduro de metilo. La solución se agitó a temperatura ambiente durante la noche y el solvente se eliminó en un evaporador giratorio. El residuo se cargó sobre una columna de purificación cromatográfica con malla de tamaño 60-120 en gel de sílice, y 3-4% metanol en cloroformo (v/v) como eluyente dio 0.16 g (56% de rendimiento) del intermediario cuaternizado (Rf= 0.6, 10% metanol en cloroformo, v/v) .
XH NMR (300 MHz , CDCl3) : d/ppm =0.9 [t, 6H, CH3- (CH2)n-]; 1.2-1.4 [m, 44H, - (CH2) -];. 1.3-1.6 [m, 4 H, LysCYH2+ LysC¾] ; 1.4-1.6 [3s, 27H, CO-O-C (CH3) 3] ; 1.5 [m, 4H, -N+(-CH2-CH2-)2] ; 1.7 [m, 2H, LysCpH2] ; 3.1[m, 2H, LysuCH2] ; 3.2 [s, 3H, (-N+-CH3)]; 3.3 [m, 4H, -N ( -CH2-CH2- ) 2] ; 3.7 [m, 2H, -N+-CH2-CH2- NH-CO] ; 3.8 [m, 2H, -N+-CH2-CH2- NH-CO] ; 4.5 [m, 1H, LysC^H] ; 4.7 [m, 1H, BOC -NH] ; 8.2 [t, 1H, -CH2-NH-C0-] ; 8.7 [d, 1H, -CH-NH-C-] ; 11.3 [s, 1H, -NHBOC] .
Paso (e) : El intermediario obtenido en el paso (d) (0.16 g) se disolvió en DCM seco (2 mi) y se agregó TFA (2 mi) a 0°C. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche para asegurar la completa desprotección. Se eliminó el exceso de TFA descargando nitrógeno para dar el compuesto del título como una sal de trifluoroacetato . La purificación cromatográfica en columna utilizando malla de tamaño 60.-120 en gel de sílice con 12-15% (v/v) de . metanol-cloroformo como eluyente seguido por cromatografía de intercambio de ion de cloruro (utilizando resina de intercambio de ion de cloruro de amberlist A-26) dio 0.08 g (69% -de rendimiento) del compuesto del título puro 2 (Rf =0.3, 20% . metanol . en cloroformo, v/v). LSIMS (lípido 2) : m/z: 637.8 [MH+] (calculado para C38H8iON6, 74%).
Los lípidos 1 y 3 se sintetizaron siguiendo los mismos pasos descritos anteriormente para el lípido 2 (Figura 2) . Las características de TLC, datos de espectro 1H NMR para el precursor inmediato de los lípidos finales restantes, y los datos LSIMS para los lípidos finales, restantes se proporcionan a continuación.
Lípido 1: —-- 1H NMR (300 MHz, CDC13) del precursor inmediato de cloruro de N,N-di-miristoil-N-metil-N-2 [?' - (N6-guanidino-L-Lisinil) ] aminoetil amonio (lípido 1, DMGLA) , (Rf = 0.6, 10% de metanol en diclorometano, v/v:) 1H NMR (200 MHz, CDC13) : d/ppm =0.9 [t, 6H, CH3- (CH2) 13-] ; 1.2-1.4 [m, 44H, -(CH2)13-] ; I.3-1.6 [m, 4 H, LysCYH2+ LysC°H2] ; 1.4-1.6 [3s, 27H, C0-0-C(CH3)3] ; 1.5 [m, 4H, -N+ ( -CH2-CH2- ) 2] ; 1.7 [m, 2H, LysCpH2] ; 3.2 [s, 3H, -N+-CH3] ; 3.3 [t, 6H, - N ( - CH2 - CH2 - ) 2 ; LysuCH2] ; 3.7 [m, 4H, -N+-CH2-CH2- NH-CO] ; 4.1 [m, 1H, LysCaH] ; 5.2 [m, 1H, BOC -NH] ; 8.1-8.3 [2t, 2H, -CH2-NH-C0- ; -CH2-NH-C-] ; II.45 [s, 1H, -NHBOC] .
LSIMS (lípido 1) : m/z: 637.9 [MH+] (calculado paraC38H81ON6, 57%) .
Lípido 3 : 1H NMR (300 MHz , CDC13) del precursor inmediato de cloruro de N, -Dimiristoil-N-metil-N-2 [N 1 - (N2 , N6-di-guanidin-L-Lisinil )] aminoetil . amonio (lípido 3) , (Rf = 0.6, 10% de metanol en diclorometano, v/v) XH NMR (200 MHz, CDCl3) : d/ppm =0.9 [t, 6H, CH3- (CH2)i5-] ; 1.2-1.4 [m, 44H, --(CH2) 15- ] ; 1.3-1.6 [m, 4H, LysCYH2+ LySC°H2] ; 1.4 [m, 36H, CO-O-C (CH3) 3] ; 1.5-1.7 [m, 6H, -N+(-CH2-CH2-)2 + LysCpH2] ; 3.25 [s, 3H, -N+-CH3] ; 3.3 [t, 6H, -N(-CH2-CH2-)2; LySraCH2] ; 3.7 [m, 2H, -N+-CH2-CH2-NH-CO] ; 3.8 [m, 2H, -N+-CH2-CH2- NH-CO] ; 4.5 [m, 1H, LysCaH] ; 8.1-8.3 [2t, 2H, -CH2-NH-CO-; -CH2-NH-C-] ; 8.7 [d, 1H, CH-NH-C-] ; 11.3 - 11.5 [2s , 2H, -NHBOC] .
LSIMS (lípido 3) : m/z: 679.8 [MH+] (calculado para C39H83ON8, 36%) . 1H NMR (300 MHz, CDCl3) del precursor inmediato of cloruro de N,N-di-stearoil-N-metil-N-2 [?' - (N6-guanidin-L-Lisinil) ] aminoetil amonio (lípido 1, DSGLA) , (Rf = 0.6, 10% de metanol in diclorometano, v/v:) H NMR (200 MHz, CDC13) : d/ppm =0.9 [t, 6H, CH3- (CH2)i3-] ; 1.2-1.4 [m, 60H, -(CH2)13-]; 1.3-1.6 [m, 4 H, LysCYH2+ LysC°H2,] ; 1.4-1.6 [3s, 27H, CO-O-C (CH3) 3] ; 1.5 [m, 4H, -N+ (-CH2-CH2-) 2] ; 1.7 [m, 2H, LysCpH2] ; 3.2 [s , 3H, -N+-CH3] ; 3.3 [t, 6H, -N(-CH2-CH2-) 2 ; Lys^Hs] ; 3.7 [m, 4H, -N+-CH2-CH2- NH-CO] ; 4.1[m,lH, LysCaH] ; 5.2 [m, 1H, BOC -NH] ; 8.1-8.3 [2t, 2H, -CH2-NH-CO- ; -CH2-NH-C-]; 11.45[s, 1H, - NHBOC] .
LSIMS (lípido 1): m/z: 749.8 [MH+] (calculado para C46H97ON6, 47%) .
Síntesis del lípido mono-arginilado DSAA Paso (a): N- [2-ter-butiloxicarbonilamino etil]-N,N-di -n-octadecilamina : Una mezcla de 0.6 g (4.13 mmoles) de N-Boc-Etilenodiamina ( I ) y 4.127 g (12.39 mmoles) de octadecilbromuro se llevó a reflujo en EtoAc en la presencia de carbonato de potasio anhidro (2.2 g; 16.52 mmoles) por 24 h. La mezcla de reacción se diluyó con 100 mi de acetato de etilo, lavó con agua (2 X 100 mi) , secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró. El acetato de etilo se eliminó del filtrado en un evaporador giratorio. La purificación cromatográfica en columna de gel de sílice del residuo resultante (10% acetato de etilo en hexano, v/v, como eluyente) dio 1.78 g (sólido amarillo claro, 65% de rendimiento) del compuesto del título (Rf= 0.4 en 30% de acetato de etilo en hexano, v/v, como el solvente de desarrollo TLC) . 1H NMR (300 MHz, CDCD) : d / ppm=0.9 [t, 6H, CH3-(CH2)16-]; 1.2-1.4 [m, 64H, - (CH2 ) 16 -CH3 ] ; 1.5 [s, 9H, -OCO-C(CH3)3]; 2.4 [t-, 4H, -N (CH2 - (CH2- ) 16] ; 2.5 [t, 2H, - N(CH2-CH2 -NHBoc] ; 3.1 [m, 2H, (CH2 -CH2 -NHBoc) ] ; 4.9 [bm, 1H, NHBoc] .
Paso (b) : N-2 -aminoetil -N, -di-n-octadecilamina : El producto obtenido anteriormente (1.7 g; 2.85 mmoles) se disolvió en 10 mi de diclorometano anhidro (DCM) , y se agregaron 4 mi de .ácido trifluoroacético neto (TFA) . La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El TFA se eliminó enjuagando con nitrógeno y el residuo restante se mantuvo al vacío 15 min. La sal de trifluoroacetato resultante del compuesto del título se disolvió en 25 mi de DCM, y se agregaron 25 mi de 1N de NaOH acuoso. La mésela bifásica resultante se agitó a temperatura ambiente por 2 h. La capa orgánica se lavó con agua (3 X 50 mi) , secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y el solvente del filtrado se evaporó en un evaporador giratorio. La purificación cromatográfica en columna del residuo (2-3% metano! en cloroformo, v/v., como eluyente) dio 1.068 g del compuesto del título (74% de rendimiento, /= 0.4 utilizando 10% de cloroformo metanólico, v/v, como el solvente de desarrollo TLC) .
XH NMR (300 MHz , CDC13): d / ppm=0.9[t, 6H, CH3-(CH2)15-]; 1.2-1.4 [m,60- (CH2)15-]; 1.5 [m, 4H, N(-CH2- CH2 -)2]; 2.5 [m, 4H, N (CH2 -CH2 - ) 2] ; 2.6 [t, 2H, - N(CH2- CH2 -NH2 ) ] ; 2.9 [t, 2H, - (CH2 -CH2 -NH2 ) ] ; 3.5-3.7 [bm, 2H, NH2] .
Paso (c) : Tri-Boc-Arginina (N,N-di-n-octadecilamina) etilamida: Una mezcla de N-2-aminoetil-N,N-di-n-octadecilamina (1.05 g; 1.94 mmoles) , Clorhidrato de N-(3-Dimetilaminopropil) -N' -etilcarbodiimida (0.372 g 1.94 mmoles), N-hidroxisuccinimida (0.223 g; 1.9 mmoles) y tri-Boc-Arginina (0.92g, 1.944 mmoles) disueltos en una mezcla de 10 mi de DCM seco y.5 mi DMF seco de agito por 16 horas. En total, se agregaron 50 mi de DCM a la mezcla de reacción, y la mezcla se lavó con agua (3 X 100 mi) y secó con sulfato de sodio anhidro. La purificación cromatográfica en columna con gel de sílice (10% acetona en forma de hexano, v/v, como eluyente) del residuo dio 1.17- g del producto acoplado puro (rendimiento=62% , R/= 0.5 utilizando 40% acetona en hexano, v/v, como el solvente de desarrollo TLC) . 1H NMR (CDC13, 300 MHz): 5/ppm=0.9[t, 6H, CH3 - (CH2 ) 16 - ] ; 1.2-1.3 [m, 64H, CH3 - (CH2)16]; 1.4-1.6 [2s, 27H, -C0-0- (CH3 ) 3 , ] ; 1.6-1.8 [m,4H, CH2-CH2-Arg] 2.4-2.5 [m, 6H, -N-CH2- (CH2) 16-CH3 ; -NCH2-CH2-NH-C0-] ; - 3.2-3.3 [2 dd, 2H, -CH2 -CH2 -NH-CO- ]; 3.9 [m, 2H, Arg CH2-N] ; 4.2 [m, 1H, -CH (NHBoc) -C0-] ; 5.7 [m, 3H, -NH-CO-0- (CH3) 3] .
Paso (d) : Tri-Boc-Arginina (N,N-di-n-octadecilamina, -metil) etilamida : El Compuesto IV (1.1 g, 1.0772 mmoles) obtenido en el paso (c) se disolvió en 5 mi de DCM, y se agregaron 3 mi de yoduro de metilo. La solución se agitó durante la noche. El solvente se eliminó en un evaporador giratorio y cromatografía de columna en gel de sílice (2% cloroformo metanólico, v/v, como eluyente) del residuo dio 0.964 g del compuesto del título (89% de rendimiento) .
!H MR (CDC13 , 300 MHz) : d / ppm = 0.9 [t, 6H, CH3- (CH2)16 ]; 1.2-1.3' [m, 64H, CH3- (CH2 ) 16 - ] ; 1.4-1.6 [2s, 27H, C0-0-C(CH3) 3] ; 1.6-1.8 [m, 8H, --CH2-CH2 -N+- , -CH2 -CH2 -Arg] ; 3.9 [2H, Arg CH2-N]; 3.2 [S( 3H/ CH3-N+-] ; 3.4 [m, 4H,-N+-CH2- (CH2)16-CH3] ; 3.6-3.7 [bm, 4H, -N+-CH2 -CH2 -NHCO- ] ; 4.19 [m, 1H, -CH(NHBoC)CO-] ; 5.7 [s, 3H, - NH-CO-O- (CH3 ) 3 ] .
Paso (e) : L- Arginina (N, N-di-n-octadecilamina, N-metil) etilamida (DASS) : El Compuesto V (0.9 g, 0.868 mmoles) obtenido en el paso (d) se disolvió en 5 mi -de 3N de HCl en dioxano y la solución se agitó por 12 h. El solvente se eliminó con enjuague de nitrógeno y el residuo se mantuvo al vacío una hora más. La cromatografía de columna en gel de sílice (12% cloroformo metanólico, v/v, como eluyente) seguida por cromatografía de intercambio de ion de cloruro (utilizando cloruro resina de intercambio de ión Amberlist-A 26) del residuo seco dio 450 mg del compuesto del título puro (71% rendimiento) . 1H NMR (CD30D, 300 MHz) : d / ppm = 0.9 [s, 6H, CH3-(CH2)15-]; 1.2-1.3 [m, 60H, CH3- (CH2 ) 15-] ; 1.6-1.7 [m, 4H, CH3- (CH2) 15-CH2-CH2-N+-] ; 3.4-3.7 [2 m, 6H, Arg] ; 3.1 [S, 3H, CH3-N+-CH2-CH2-] ; 3.2-3.4 [m, 8H, (CH3- (CH2) 16-CH2) 2-N+ (CH3) -CH2-CH2-NHC0-] ; 3.9 [t, 1H, -CH (NH3+ ) C0- ] ..
ESI-MS : m/z : 736 (90%) .
Preparación de Liposomas El lípido catiónico y el co-lípido (colesterol o DOPE) en una relación molar de 1:1 se disolvieron en una mezcla de cloroformo y metanol (3:1, v/v) en un frasco de vidrio. El solvente se eliminó con un delgado flujo de gas nitrógeno sin humedad, y la" película de lípido seca después se mantuvo bajo alto vacío por 8 h. Se agregó agua desionizada estéril (5 mi) a la película de lípido secada al vacío, y la mezcla se dejo dilatar por 2-3 minutos a temperatura ambiente y se sónico ocasionalmente en un sonicador de baño para producir vesículas multilaminares (MLV) . Las MLV después se sonicaron en un baño helado hasta que se hicieron transparentes utilizando un sonicador Branson 450 a 100% de ciclo de trabajo y 25 de energía de salida. Los liposomas acuosos transparentes resultantes se utilizaron en la formación de las nanopartículas LPD.
Transfección Se sembraron células de carcinoma de pulmón grandes humanas H460 a una densidad de 20,000 células por cavidad en una placa de 96 cavidades 18-24 h antes de la transfección. El ADN de plásmido (0.3 yg) se formó en complejos con cantidades variables de lípidos (0.9-7.2 nmoles) en medio RPMI simple (volumen total de 100 µ?) por 20 min. Las relaciones de carga variaron.de 1:1 a 8:1 (+/-) sobre estos intervalos de los lípidos. Los complejos después se agregaron a las células. Después de 3 horas de incubación, se agregaron 100 µ? de RPMI con 20% FBS a las células. La actividad del gen reportero se estimó después de 24 h. Las células se lavaron dos veces con salina regulada en pH con fosfato (PBS, 100 µ? cada una) y se lisaron en 100 µ? de regulador de pH de lisis (0.1 M de Tris-HCl, 2 mM de EDTA, 0.5% de Tritón X100, pH 7.8) . Se tuvo cuidado de asegurar la lisis completa. El lisato celular después se centrifugó a 14,000 rpm por 5 min. Se tomó una alícuota de 10 µ? del sobrenadante para análisis de actividad de luciferasa. La concentración de la proteína dentro de los lisatos celulares se cuantificó con los estándares BSA del kit de ensayo de proteína Micro BSA™ suministrado por Pierce Chemical Company (Rockford, IL) . La actividad de luciferasa para cada ensayo se presenta como unidades de luz relativas por µg de proteína soluble (RL?/µg de proteína) . El experimento de transfección se llevó a cabo por triplicado, y los valores de eficiencia en la transfección mostrados en la Figura 4 son el promedio de los experimentos por triplicados realizados en el mismo día. Cada experimento de transfección se repitió tres veces. Los perfiles de la transfección obtenidos en diferentes días fueron idénticos.
Preparación de Composiciones LPD PEGiladas Las.-nanopartículas de lípido/policatión/ADN (LPD) se prepararon como se describé previamente con ligeras modificaciones (Cui et al. (2005) Mol. Pharm. 2:22-28). Brevemente, pequeños liposomas unilaminares que consisten de DOTAP (o DSGLA) y colesterol (relación molar de 1:1) se prepararon por hidratación de película delgada seguida por extrusión de membrana. La concentración total de lípido del liposoma se fijó a 10 mM. LPD se compuso de DOTAP (o DSGLA) /liposoma de colesterol, protamina, y la mezcla de oligonucleótido y -ADN de timo de becerro (relación en peso 1:1) . Para preparar LPD, se mezclaron 6 µ? de protamina (2 mg/ml) , 47 µ? de agua desionizada, y 8 µ? de DOTAP (o DSGLA) /liposoma de colesterol (concentración total de lípido = 10 mM) . Las nanopartículas de LPD se mantuvieron a temperatura ambiente por otros 10 min antes de la aplicación adicional. Las composiciones LPD PEGiladas se prepararon por el método de post-inserción (Ishida et al. (1999) FEBS Lett. 460 : 129-133 ;· Perouzel et al. (2003) Bioconjug. Chem. 14:884- 898) . Brevemente, se mezclaron 100 µ? de LPC preformado con 0.63-16 µ? de DSPE-PEG o DSPE-PEG-AA (20 mg/ml) y después se incubaron a 50-60°C por 10 min. Las composiciones resultantes se dejaron enfriar a temperatura ambiente antes de uso. Las partículas se mezclaron con el oligonucleótido y ADN de timo de becerro (2 mg/ml) en un tubo de 1.5 mi. El complejo se dejó reposar a temperatura ambiente por 10 min antes de medir el LPD y el LPD PEGilado utilizando un dimensionador de partículas Coulter N4 Plus (Beckman ..Coulter, San Francisco, CA) . Los tamaños de las partículas se reportaron como la media ± desviación estándar.
Estudio de inhibición- de crecimiento celular Se sembraron células. H460 (1 x 104 por cavidad) en placas de 12 cavidades. Las células se trataron con diferentes lípidos a varias concentraciones en medio conteniendo suero a 37°C por 72 h. La viabilidad celular después se detectó mediante un ensayo MTT. Brevemente, 100 µ? de solución MTT (15 mg en 50 mi de PBS) se agregaron a cada cavidad, y las células se incubaron por 4 horas a 37°C. El medio se removió, y los cristales de formazano formados en las células si disolvieron en DMSO . La absorbencia a 570 nm se midió en un Sistema Formador de Imágenes de Microplaca Ultramark. Los datos se expresaron como el porcentaje de células viables comparado con células de control sin tratar.
Estudio de Quimiosensibilización Se sembraron células H460 (1 x 104 por cavidad) en placas de 12 cavidades. Las células se incubaron con diferentes lípidos a 10 µ? y cisplatina (Sigma- Aldrich, St . Louis, MO) a diferentes concentraciones en medio conteniendo suero a 37°C. La viabilidad se detectó por medio del ensayo MTT 48 horas después. .. .
Estudio de Absorción Celular Se sembraron células H460 (1 x 105 por cavidad) en placas de 12 cavidades (Corning Inc., Corning, NY) 12 h antes de los experimentos. Las células se trataron con diferentes composiciones a una concentración de 100 nM por ARNsi marcado con 5' FAM en conteniendo suero a 37°C durante 4 horas. Las células se lavaron dos veces con PBS, seguido por incubación con ' regulador de pH de lisis (0.3% de Tritón X-100 in PBS) a temperatura ambiente por 1 h. La intensidad de la fluorescencia del lisato celular se determinó mediante un espectrómetro de luminiscencia Perkin-Elmer LS 50B (Norwalk, CT) (Aex, 494.nm; Aem, 519 nm) .
Tinción y Cuantificación de Anexina V y Yoduro de Propidio (PI) Se sembraron células H460 (5 x 104 por cavidad) en placas de 6 cavidades. Las células se trataron con diferentes composiciones a una concentración de 500 nM para ARNsi en medio conteniendo suero a 37° C por 72 h. Las células se lavaron una vez con PBS, tripsinisaron, y volvieron a suspender en PBS a una concentración de 1 x 106 células/ml. Las células después se tiñeron con V-FITC Anexina utilizando un kit (BD Biosciences Pharmingen, San José, CA) y 1.25 pg/ml de PI . Las células teñidas con V-FITC Anexina y PI se detectaron y cuantificaron por citometría de flujo (Becton-Dickinson, Heidelberg, Alemania) . Los resultados se procesaron utilizando el software Cellquest (Becton-Dickinson) .
Evaluación de Apoptosis por Tinción TUNEL El ensayo TUNEL se condujo utilizando un kit TACS TM TdT (R&D Systems, Minneapolis, N) . Las células H460 (5 x 104 por cavidad) se sembraron en placas de 24 cavidades. Las células se ^trataron con diferentes composiciones a una concentración de 500 nM para AR si en medio que contiene suero a 37°C por 72 horas. Las células se lavaron una vez con PBS, y después se fijaron en 4% de PBS formaldehidp regulado en pH (pH 7.4) por 30 min a temperatura ambiente. La peroxidasa endógena se inactivo con 0.3% de H202 metanol por 15 min a temperatura ambiente. Las placas después se enjuagaron con PBS, y después se procesaron con Regulador de pH de Permeabilización, Regulador de pH de marcación conteniendo desoxinucleotidil transferesa terminal y se agregó y fluoresceína isotiocianato-desoxiuridina 5 trifosfato la placa. La placa se incubó en una atmósfera húmeda a 37°C por 60 min. La reacción se terminó por medio de la solución de detención y se desarrolló con DAB de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se hicieron imágenes de las muestras utilizando un microscopio Nikon icrophot SA.
Análisis Western Blot Las células se lisaron en regulador de pH de lisis por 20 minutos en hielo y el extracto soluble se recuperó por centrifugación. Los extractos se separaron en un gel de acrilamida al 10% y se transfirieron a una membrana PVDF. Las membranas se bloquearon por 1 hora en 5% de leche descremada y después se incubaron por 1 hora con anticuerpos monoclonales dirigidos contra pERK (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) o anticuerpos policlonales contra EGFR (BD Transduction Labs) . Las membranas también se incubaron con anticuerpos que reconocen ERK 2 y actina (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) para estandarización. Las membranas se lavaron en PBST (PBS, 0.1% de Tween-20) y después se incubaron por 1 hora con anticuerpos secundarios apropiados. Las membranas se volvieron a lavar y después se desarrollaron a través de un sistema quimioluminiscente mejorado de acuerdo con las instrucciones del fabricante (PerkinElmer) .
Microscopía de Inmunofluorescencia Las células H460 se lavaron, se fijaron con metanol/acetona (1:1), y permeabilizaron con Tritón X100 (1%) . Las células se incubaron con Factor Inductor anti-apoptosis policlonal de conejo (AIF) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (1:100) por 1 h. Después del lavado con PBS, el anticuerpo secundario marcado fluorescentemente se agregó e incubó por 1 h. El núcleo se contra-tiñó con solución de montaje Vectashield (Vector Laboratories, Inc., Burlingame; CA) conteniendo DAPI .
Análisis Estadístico Todos los análisis estadísticos se realizaron a través de la prueba t de student . Los datos se consideraron estadísticamente significativos cuando el valor p fue menor de 0.05.
Ejemplo 1. Diseño y síntesis de nuevos lípidos 1-3 Los lípidos 1 y 2 se sintetizaron por Acoplamiento DCC de los intermediarios de amina terciaria-primaria mixtos apropiados (Figura 2), preparados convencionalmente por la reacción de la N,N-di-n-alquilamina- correspondiente con 2-bromometilamina protegida con N-ter-butoxicarbonilo en acetato de etilo en la presencia de carbonato de potasio anhidro, seguido por desprotección y neutralización con derivados de Na, -ter-butoxicarbonil-Ne-benciloxicarbonil-L-Lisina y Na-benciloxicarbonil-NE, -ter-butoxicarbonil-L-Lisina, respectivamente, seguido por desprotección de benciloxicarbonilo con formiato de amonio y 10% Pd-C.
El lípido 3 se sintetizó por acoplamiento DCC de los mismos intermediarios de amina terciaria-primaria mixtos con el derivado de N01, NE-di-ter-butoxicarbonil-L-Lisina, seguido por desprotección de ter-butoxicarbonilo con ácido trifluoroacético y neutralización. Las aminas intermediarias resultantes de los lípidos se hicieron reaccionar de manera separada con la cantidad deseada de N, N-di -ter-butoxicarbonil tiourea (Figura 2) , preparada por la reacción de tiourea con 2 equivalentes de BOC-anhídrido en la presencia de 2 equivalentes de hidruro de sodio en tetrahidrofurano anhidro (Iwanowicz et al-. (1993) Synth. Commun. 23:1443-1445), cloruro mercúrico, ' y trietilamina en N,N-dimetilformamida/diclorometano anhidro bajo atmósfera de nitrógeno a 0°C seguido por el desarrollo usual. Los intermediarios de amina terciaria resultantes (Figura 2) , después de la cuaternización con yoduro de metilo en exceso seguido por la desprotección de ácido y cromatografía de intercambio de ión de cloruro, dieron los lípidos 1, 2 y 3 (Figura 2) . Las estructuras de todos los intermediarios sintéticos mostrados en la Figura 2 se confirmaron por ""? NMR. La presencia de funciones de amina primaria protonadas altamente intercambiables en las regiones del grupo principal de los lípidos finales (1-3) , sin embargo, causaron un ensanchamiento lineal severo de los picos en el espectro XH NMR, particularmente en el intervalo de d 3-5 ppm. De esta forma, los lípidos finales se caracterizaron por el pico iónico molecular en LSIMS. La síntesis y la caracterización del espectro de un lípido representativo, lípido 2 y todos sus intermediarios (Figura 2) , se describen en la sección de Materiales y Métodos. Los Lípidos 1 y 3 se sintetizaron siguiendo esencialmente los mismos protocolos adoptados por ' la síntesis del lípido 2.
Ejemplo... 2. Distribución genética in vitro con lípidos 1-3 La Figura 4 resume la eficacia, de la distribución genética in vitro de los lípidos 1-3 en transfecciones de células en la presencia de suero de becerro fetal. En estos experimentos de transfección in vitro, los liposomas catiónicos.- de los lípidos 1-3 se prepararon en combinación con una cantidad equimolar de colesterol .como el co-lípido, y se utilizó ADN de plásmido pCMV-Luc plásmido como el gen receptor en varias proporciones de carga de lípido/ADN de 8:1 a 1:1. La eficiencia de la transfección del lípido 1 (con un grupo guanidina en la posición N6) y el lípido 3 (con dos grupos guanidina en las posiciones N6 y N2) son comparables con las de DOTAP y Lipofectamina 2000 (Fig. 4) . La eficiencia de la transfección del lípido 2 con un grupo guanidina en la posición N2 se vio seriamente comprometido a relaciones de carga más bajas en las células H46. De manera interesante, se encontró que el colesterol es un co-lípido más eficaz que 1 , 2-dioleoilsn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) (datos no mostrados) . Estos experimentos demuestran la actividad de distribución del gen de los lípidos.
Ejemplo 3. Los Lípidos 1-3 exhiben actividad citotóxica Se observó que los lípidos exhiben actividad citotóxica en los experimentos de transfección y se decidió estudiarla con más detalle. Los efectos citotóxicos de los tres nuevos lípidos a varias concentraciones se evaluaron en células H460 después de la exposición a los lípidos 1-3 y DOTAP por 48 h utilizando el ensayo MTT (Fig. 5A) . En ambas líneas celulares, DOTAP mostró una ligera citotoxicidad a las concentraciones examinadas, mientras los lípidos 1-3 fueron más tóxicos. La Figura 5A muestra que el ED50 del lípido 1 y 3 fue de aproximadamente 16 µ?, mientras el del lípido 2 es de aproximadamente 22 µ? en la línea celular H460. También se ensayó la citotoxicidad de estos lípidos en la línea celular BL6 y se obtuvieron valores ED50 similares que en las células H460 (datos no mostrados) . Colectivamente, la citotoxicidad disminuyó en el orden del lípido 1> lípido 3 > lípido' 2> DOTAP a una concentració9n de 20 µ? de los lípidos correspondientes. Para evaluar la habilidad de quimio-sensibilización de estos lípidos para fármacos anticancerígenos tal como cisplatina, las células ?460 se expusieron a cada uno de estos agentes por 48 h, solos y en combinación con cisplatina. Como se muestra en la Figura 5B, los lípidos 1-3 (10 µ?) , pero no DOTAP (10 µ?) , podrían sintetizar las células a cisplatina. El IC50 de cisplatina se redujo de aproximadamente 12 µ? a 3.5 µ? después del tratamiento con los lípidos 1-3. Estos resultados establecen la citotoxicidad de los nuevos lípidos.
Ejemplo 4. Los Lípidos 1-3 inhiben la activación de ERK1/2 Para identificar el mecanismo responsable para la citotoxicidad mejorada exhibida por los lípidos, las células H460 se trataron con los lípidos 1-3 en diferentes intervalos de tiempo, y fosforilación ERKl/2 que conduce a la activación de la actividad de MAP cinasa (McCubrey et al. (2007) Biochim. Biophys. Acta 1773:1263-1284) se midió por análisis western blot. Como se muestra en la Figura 5C, 1 uM de los lípidos 1-3 solos podría disminuir la activación de ERKl/2. La expresión de ERKl/2 total permaneció sin perturbar bajo todas las condiciones. DOTAP a bajas concentraciones (1 uM) , aumentó la activación de ERKl/2 en células dendríticas, consistente con los hallazgos previos (Yan et al. (2007) Mol. Immunol. 44:3672-3681) . Estas observaciones sugieren que la interrupción de la trayectoria de señalización de MEK/ERK por los lípidos 1-3, puede jugar un papel funcional importante en el efecto citotóxico y la inducción sinergística de la muerte celular cuando se combina con tratamiento con cisplatina.
Un análogo del lípido 1, DSGLA (ambos Rx y R2 = CiSH37) , se utilizó para estudios de formulación adicionales debido a su más alta compatibilidad en suero. La citometría de flujo con tinción PI mostró que los grados de apoptosis de las células H460 tratadas con con 10 µ? de DSGLA y el lípido 1 por 3h fueron 7.9+2.5% y 10.4+3.0% (n=6, p=0.13), respectivamente, y fueron significativamente más altas que las tratadas con DOTAP (4.7+0.5%) (n=3, p<0.05). No hubo una diferencia estadísticamente significativa entre las citotoxicidades de DSGLA y el lípido 1. Además, DSGLA solo también podría disminuir la activación de ERKl/2 (Figura 5C) .
Ejemplo 5. Los liposomas que contienen DSGLA eficientemente distribuyen ARNsi a células tumorales Para lograr la distribución activada en terapia genética de cáncer, se utilizó LPD, un vector no viral desarrollado en nuestro laboratorio (Li y Huang (2006) Mol. Pharm. 3:579-588) como un nano-portador para la distribución de ARNsi. Se post-insertaron lípidos PEGilados en nuestra formulación LPD para aumentar la estabilidad en suero. Además, también se precipitó anisamida, un compuesto que específicamente se une al receptor signa, para el extremo distal de PEG como un ligando selector de objetivo (Banerjee et al. (2004) Int. J. Cáncer 112:693-700) . Como se muestra en la Figura 6A, la absorción del ARNsi fluorescentemente marcado fue mucho mayor en células H460, que expresan el receptor sigma, tratado con la formulación preparada con DSGLA que la preparada con DOTAP. Además, la señal de fluorescencia en las células tratadas con LPD-PEG-AA fue mucho más fuerte- que el de las células tratadas con LPD-PEG. Cuantitativamente (Fig. 6B) , la absorción del ARNsi fluorescentemente marcado por LPD- PEG-AA que contiene DSGLA fue aproximadamente dos veces mayor que el de LPD-PEG-AA conteniendo DOTAP. La Figura 6B también muestra que la conjugación del ligando aumentó la eficiencia en la distribución de LPG PEGilada preparado con DSGLA en cinco veces. De esta forma, los resultados indican que LPD-PEG-AA preparado con el DSGLA nuevo, pueden eficientemente distribuir ARNsi a la célula tumoral y la distribución es altamente dependiente del ligando.
Ejemplo 6. DSGLA induce apoptosis Para demostrar que la citotoxicidad del lípido catiónico es independiente de ARNsi y altamente dependiente después de la activación del ligando, se formuló DSGLA con ARNsi de control (contra un objetivo irrelevante) en LPD-PEG-AA. Estos resultados además se compararon con el mismo ARNsi de control formulado en LPD-PEG-AA conteniendo DOTAP. La citometría de flujo se utilizó para analizar la absorción de yoduro de propidio (PI) y la unión de anexina V marcada con FITC con las células apoptóticas . Como se muestra en la Figura 6C, el porcentaje de células PI-positivas se incrementó cuando las células se trataron con LPD-PEG- AA conteniendo DSGLA, lo que sugiere que las células se indujeron para experimentar apoptosis. Además, el aumento en la señal de FITC-Anexina V también se observó cuando las células se trataron con LPD-PEG-AA conteniendo DSGLA. Tal aumento no se encontró cuando las células se trataron con LPD-PEG conteniendo DSGLA o LPD-PEG-AA conteniendo DOTAP. Las células tratadas con ya sea LPD-PEG-AA o LPD-PEG conteniendo DOTAP mostraron solamente un pequeño aumento en FITC-Anexina V (Fig. 6D) . Los resultados claramente indican que la formulación que contiene DSGLA puede más eficientemente mejorar la apoptosis que las que contienen DOTAP, y que la citotoxicidad inducida depende del ligando.
Ejemplo 7. Inhibición de la expresión de EGFR en células H460 por composiciones LPD DSGLA Para . además demostrar la actividad biológica de la • formulación -de -nanopartícula, el- ARNsi contra EGFR se distribuyó mediante composiciones LPD conteniendo .ya sea DSGLA o DOTAP. El efecto resultante en los niveles de , EGFR se determinó por western blot. Se compararon diferentes- composiciones en la presencia o ausencia del ligando activador AA. El ARNsi anti-EGFR libre tuvo poco efecto debido a la pobre absorción celular de este oligonucleótido negativamente cargado (datos- no mostrados) . Las células H460 se trataron con ARNsi anti-EGFR conteniendo - LPD-PEG-AA preparado con DSGLA o DOTAP. Después de 72 horas, la expresión de la proteína EGFR se inhibió significativamente (Fig. 7) . Las composiciones de LPD-PEG- AA con ya sea DSGLA o DOTAP. fueron eficientemente iguales en la destrucción de la expresión de EGFR en H460. El ARNsi anti-EGFR .conteniendo LPD-PEG (sin AA) preparado con ya sea DSGLA o DOTAP, sin embargo, solamente puede ligeramente regular hacia abajo EGFR. Los datos indican que - el ARNsi podría eficientemente suprimir la expresión de EGFR y la actividad de silenciación fue dependiente de la formulación.
Ejemplo 8. Inducción apoptótica sinergística por LPD que comprende DSGLA y ARNsi anti-EGFR El efecto citotóxico de la combinación de ARNsi anti-EGFR y DSGLA se estudio adicionalmente . Para determinar si la depleción de EGFR podría promover la muerte de la célula tumoral, se realizaron ensayos TUNEL a 72 h después del tratamiento con ya sea una formulación ARNsi anti-EGFR o de control. La Figura 8A indica que aproximadamente 15 ± 3% de las células H460 tratadas con ARNsi EGFR conteniendo LPD-PEG-AA preparadas con DSGLA experimentaron apoptosis. Este valor fue más alto que el de las células tratadas con ARNsi EGFR conteniendo LPD-PEG (sin AA) preparado con DSGLA, ARNsi EGFR conteniendo LPD-PEG-AA preparado con ARNsi DOTAP, o de control conteniendo LPD-PEG-AA preparado con DSGLA (Fig. 8A) . También se observó que aproximadamente 4 ± 1% de células H460 tratadas con ARNsi EGFR conteniendo LPD-PEG-AA preparado con DOTAP experimentaron apoptosis, comparado con menos de 1% en el ARNsi de control y ARNsi EGFR conteniendo LPD-PEG (Fig. 8A) . De esta forma, el efecto citotóxico mediato por ARNsi fue específico de la secuencia y dependiente de la eficiente distribución a través del vector de nanopartícula. Además, aproximadamente 2.5% de células H460 tratadas con ARNsi de control conteniendo LPD-PEG-AA preparado con DSGLA experimentaron apoptosis según opuesto a menos de 1% de ARNsi de control conteniendo LPD-PEG (Fig. 8A) . Los datos indican que la citotoxicidad de DSGLA fue dependiente de ARNsi, pero fue dependiente del ligando, consistente con los datos mostrados en las Figs. 6C y 6D. De esta forma, se observó el efecto sinergístico entre ARNsi contra EGFR y DSGLA, pero no DOTAP, en la promoción de la apoptosis celular y la sinergia fue dependiente del ligando.
La redistribución de citocromo c y AIF es un evento anterior en el proceso apoptótico (Daugas et al. (2000) FASEB J. 14:729-739; Fehlberg et al. (2003) Br. J. Pharmacol. 139:495-500). Para evaluar el mejoramiento de la citotoxicidad de la célula H460 por la combinación de ARNsi EGFR ARNsi y DSGLA, se examinó la participación de AIF a través de microscopía inmunofluorescente (Fig. 8B) . La detección inmunofluorescente de Alf en células de control sin tratar normalmente produjo un patrón de tinción citoplásmico punteado con alguna preferencia para el área perinuclear, que es un patrón típico para la localización de la mitocondria (Lorenzo et al. (1999) Cell Death Differ. 6:516-524; Loeffier et al. (2001) FASEB J. 15:758-767; Modjtahedi et al. (2006) Trends Cell Biol. 16:264-272). Las células tratadas con ARNsi EGFR conteniendo LPD-PEG-AA preparado con DSGLA mostraron una transferencia aumentada de AIF del citoplasma en el núcleo (Fig. 8B) . No se observó una transferencia significativa en otros grupos de tratamiento. Los resultados indican que ARNsi EGFR y DSGLA sinergísticamente promueven la muerte celular en H460 y el efecto sinergístico depende del ligando.
Ejemplo 9. Síntesis del lípido DSAA catiónico mono-arginilado DSAA, un lípido catiónico mono-arginilado, se sintetizó mezclando amina primaria-terciaria (III) y arginina Boc-protegida por el método de acoplamiento convencional de EDCI clorhidrato de (N- (3-Dimetilaminopropil) - ' -etilcarbodiimida) . La cuaternización con yoduro de metilo y desprotección Boc del producto acoplado produjo DSAA (VI) . La amina III terciaria-primária mixta se preparó por la reacción de N-Boc-Etilenodiamina con octadecilbromuro en acetato de etilo (EtoAc) en la presencia de carbonato de potasio anhidro, seguido por desprotección y neutralización del intermediario II resultante. Ver Figura 3 para la representación esquemática de la síntesis de DSAA.
Ejemplo 10. Absorción Intracelular de ARNsi distribuida con LPD formulado con DSAA Se post-insertaron lípidos PEGilados en una formulación de LPD, un vector no viral desarrollado en nuestro laboratorio como un nano-portador para la distribución de ARNsi, para aumentar la estabilidad sérica. Además, también se precipitó anisamida, un compuesto que -específicamente se une al receptor sigma, en el extremo distal de PEG como un ligando selector de objetivo. Como se muestra en la Figura 9, la absorción de ARNsi fluorescentemente marcado fue mucho- mayor en células de -melanoma Bl 6F10, que expresan el receptor sigma, tratadas con la formulación preparada con DSAA o DSGLA que la preparada con DOTAP. Además, la señal fluorescente en las células tratadas con LPD-PEG-AA fue mucho más fuerte que la de las células tratadas con LPD-PEG.
Ejemplo 11; Silenciación del gen de luciferasa in vitro Se examinó el efecto silenciador del gen por ARNsi en diferentes composiciones. Como se muestra en la Figura 10, el efecto silenciador del ARNsi anti-luciferasa fue mayor en células Bl 6F10 (que expresa establemente luciferasa) tratadas con la formulación preparada con DSAA que las preparadas con DOTAP y aún DSGLA. Además, el efecto silenciador en las células tratadas con LPD-PEG-AA fue mucho más fuente que el de las células tratadas con LPD-PEG.
Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación indican el nivel de experiencia de los expertos en la técnica a la cual pertenece la invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan por referencia al mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente individual fuera específica e individualmente indicada a ser incorporada por referencia. Aunque la invención anterior ha sido descrita con algo de detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y entendimiento, será obvio que pueden practicarse ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1.- Un lípido catiónico de la Fórmula (I) : caracterizado porque: m y n son cada uno independientemente números enteros de 1 a 8 ; Ri.y R2 son cada uno independientemente -(CH2)P— CH3 , en donde p es un número entero de 8 a 24; R3 y R4 son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de H, alquilo, y alquilo sustituido; Qi y Q2 se seleccionan del grupo que consiste de: en donde por lo menos Qx o Q2 es: y sus sales farmacéuticamente aceptables. 2.- El lípido catiónico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque: m es 2 ; n es 4 ; p es 13; R3 y R4 son cada uno metilo; y el lípido catiónico de la fórmula (I) se seleccionada del grupo que consiste de: NHoHCI HC 3.- El lípido catiónico de conformidad con ivindicación 1, caracterizado porque: m es 2 ; n es 3 ; es H; es metilo; T los lípidos catiónicos de la fórmula (I) tienen iente estructura química: 4. - El lípido catiónico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: m es 2 ; n es 4; p es 17; R3 y R4 son cada uno metilo; el lípido catiónico de la fórmula (I) tiene la siguiente estructura química: 5. - El lípido catiónico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque tiene actividad citotóxica. 6. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un lípido catiónico de conformidad con la reivindicación 5, y un portador farmacéuticamente aceptable. 7. - Un sistema de distribución caracterizado porque comprende un vehículo lípido y un compuesto bioactivo, en donde el vehículo lípido encapsula el compuesto bioactivo, y en donde el vehículo lípido comprende un lípido catiónico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5. 8. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el vehículo lípido comprende un co-lípido. 9. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el co-lípido comprende colesterol o dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE) . 10. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el vehículo lípido comprende un liposoma. 11. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el liposoma comprende un liposoma catiónico. 12. - El sistema de distribución de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-11, caracterizado porque además comprende un policatión, en donde el vehículo lípido encapsula el policatión. 13. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el policatión comprende un polipéptido policatiónico . 14. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el polipéptido policatiónico comprende protamina . 15. - El sistema de distribución de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-14, caracterizado porque el compuesto bioactivo comprende un compuesto bioactivo citotóxico. 16. - El sistema de distribución de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-14, caracterizado porque el compuesto bioactivo comprende un polinucleótido. 17. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el polinucleótido comprende un elemento silenciador, en donde la expresión o la introducción del elemento silenciador en la célula reduce la expresión de un polinucleótido objetivo o del polipéptido codificado por el mismo. 18. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el elemento silenciador comprende un ARN de interferencia. 19.- El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el ARN de inferencia comprende un ARNsi. 20.- El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polinucleótido ob etivo comprende un oncogén. 21. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el oncogén comprende un receptor de factor de crecimiento epidérmico. 22. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el polinucleótido comprende una secuencia de codificación para un polipéptido de interés . 23. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el polipéptido de interés comprende un supresor de tumor. 24. - El sistema de distribución de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-23, caracterizado porque además comprende una macromolécula portadora polianiónica , en donde la macromolécula portadora polianiónica se encapsula por un vehículo lípido. 25. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la macromolécula portadora polianiónica comprende un polinucleótido portador. 26. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la macromolécula portadora polianiónica comprende un polisacárido portador polianiónico, un polipéptido portador polianiónico, o una combinación de éstos. 27. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el polisacárido portador polianiónico comprende un glucosaminoglicano . 28. El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el glucosaminoglicano se selecciona del grupo que consiste de sulfato de heparina, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatina, sulfato de queratano, y sulfato de dextrano. 29. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación . 28, caracterizado porque el glucosaminoglicano comprende ácido hialurónico . 30. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el polipéptido portador polianiónico comprende ácido poli-glutámico, o un ácido poli -aspártico . 31.- El sistema de distribución de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-30, caracterizado porque el vehículo lípido comprende una superficie exterior, en donde la superficie exterior comprende una molécula de polietilenglicol (PEG) . 32.- El. sistema de distribución de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-31, caracterizado porque el vehículo lípido comprende una bicapa soportada. 33.- El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 31 ó 32, caracterizado porque el sistema de distribución comprende un sistema de distribución disimulado. 34. - El sistema de distribución de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-33, caracterizado porque el vehículo lípido del sistema de distribución comprende una superficie exterior, en donde la superficie exterior comprende un ligando selector de objetivo,, por medio de lo cual forma un sistema de distribución objetivo, en donde el ligando selector de objetivo selecciona el sistema de distribución objetivo hacia la célula objetivo. 35. - El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el ligando selector de objetivo comprende un derivado de benzamida. -36.- El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el derivado de benzamida comprende anisamida. 37.- El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la anisamida (AA) se conjuga a 1 , 2 -distearoil -sn-glicero-3 -fosfoetanolamin-N-carboxi -polietilenglicol (DSPE-PEG) , por medio de lo cual produce DSPE-PEG-AA. 38.- El sistema de distribución de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-37, caracterizado porque la célula objetivo comprende una célula cancerígena. 39.- El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste cáncer de vejiga, tumores cerebrales, cáncer de pecho, cáncer cervical, cáncer colorrectal, cáncer esofágico, cáncer del endometrio, carcinoma hepatocelular, cáncer laríngeo, cáncer de pulmón, osteosarcoma, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer próstata, cáncer renal y cáncer de tiroides. 40.- El sistema de distribución de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el cáncer comprende cáncer de pulmón. 41..- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el sistema distribución de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-40 y un portador farmacéuticamente aceptable. 42. - Un método para distribuir un compuesto bioactivo de una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con el sistema de distribución de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-40. 43. - Un método., para aniquilar una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un lípido catiónico de conformidad con la reivindicación 5. 44. - Un método para aniquilar una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con el sistema de distribución de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-40, en donde el lípido catiónico tiene actividad citotóxica. 45. - Un método para selectivamente aniquilar una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un conjugado de lípido- ligando selector de objetivo, en donde el conjugado de lípido- ligando selector de objetivo comprende el lípido catiónico de conformidad con la reivindicación 5, y en donde el lípido catiónico está físicamente asociado con un ligando selector de objetivo. 46. - Un método para selectivamente aniquilar una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un sistema de distribución objetivo, en donde el sistema de distribución objetivo comprende un vehículo lípido que encapsula el compuesto bioactivo, y en donde el vehículo lípido comprende lípido catiónico de conformidad con la reivindicación 5, en donde el vehículo lípido comprende una superficie exterior, y en donde la superficie exterior del vehículo lípido comprende un ligando selector de objetivo. 47. - El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el compuesto bioactivo comprende un compuesto bioactivo citotóxico. 48.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45-47, caracterizado porque el ligando selector de objetivo comprende un derivado de benzamida. 49.- El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el derivado de benzamida comprende anisamida. 50.- Un método para- tratar cáncer en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6. 51.- Un método para tratar" una- enfermedad o una afección indeseada en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 41, en donde el compuesto bioactivo tiene actividad terapéutica contra la enfermedad o la afección indeseada. 52. - El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la enfermedad comprende un cáncer. 53. - El método de conformidad con la reivindicación 50 ó 52, caracterizado porque el cáncer comprende cáncer pulmonar. 54. - Un método para mejorar la actividad citotóxica de un compuesto bioactivo citotóxico en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, y el compuesto bioactivo citotóxico. 55. - Un método para mejorar la actividad citotóxica de un compuesto bioactivo citotóxico en un sujeto,, caracterizado porque comprende administrar la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 41 al sujeto, en donde el lípido catiónico y el compuesto bioactivo del sistema de distribución tiene la actividad citotóxica. 56.- Un método para hacer un sistema de distribución citotóxico que comprende un vehículo lípido y un compuesto bioactivo, dende el vehículo lípido encapsula el compuesto bioactivo, caracterizado -porque comprende mezclar un vehículo lípido que comprende el lípido catiónico de conformidad con la reivindicación 5 con un compuesto bioactivo, por medio de lo cual forma el sistema de distribución citotóxico. 57.- El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el compuesto bioactivo comprende un compuesto bioactivo citotóxico. 58. - Un método para hacer un sistema de distribución del polinucleótido citotóxico que comprende un vehículo lípido que encapsula un policatión y un polinucleótido, caracterizado porque comprende- los pasos de: a) mezclar un polinucleótido y un policatión, por medio de lo cual forma una solución de polinucleótido/policatión; y b) mezclar un vehículo lípido que comprende un lípido catiónico de conformidad con la reivindicación 5, con la- solución de polinucleótido/policatión, por medio de lo cual forma el sistema de distribución citotóxico. 59. - Un - método para hacer un sistema de distribución de polinucleótido citotóxico que comprende un vehículo lípido que encapsula un policatión y un polinucleótido, caracterizado porque comprende los pasos dé: a) mezclar un vehículo lípido que comprende lípido catiónico de conformidad con la reivindicación 5 y un policatión, por medio de lo cual forma la solución de vehículo lípido/policatión; y b) mezclar la solución de vehículo/policatión con un polinucleótido, por medio de lo cual forma el sistema de distribución citotóxico. 60. - El método .de conformidad con la reivindicación 58 ó 59, caracterizado porque el polinucleótido comprende un polinucleótido citotóxico. 61. - El método de conformidad con la reivindicación 58 ó 59, caracterizado porque el paso b) produce un vehículo lípido que comprende una bicapa soportada central. 6-2. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-61, caracterizado porque el vehículo lípido comprende un liposoma. 63. - El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el liposoma comprende un liposoma catiónico . 64. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 56-63, caracterizado porque además comprende un paso de post - inserc ión , en donde por lo menos un conjugado de lípido-ligando activador y- un conjugado de lípido-PEG se post-inserta en -el vehículo l-ípido, en donde el paso de post - inserción se lleva a cabo después de formar el sistema de distribución o el sistema de distribución de pol i - nucleót ido . 65.- El método de..... conformidad con la reivindicación. 64, caracterizado porque el sistema de distribución- citotóxico o el sistema de distribución de pol inucleót ido citotóxico comprende un sistema de distribución citotóxico disimulado o un sistema de distribución de polinucleót ido citotóxico disimulado. 66. - El método de conformidad con la reivindicación 64 ó 65, caracterizado porque el paso de post - inserción comprende incubar el sistema de distribución o el sistema de · distribución del pol inucleót ido con un conjugado de lípido-PEG _a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 % en moles . . _ . .6.7.- El. método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la concentración del conjugado de lípido-PEG comprende aproximadamente 10% en moles. 68.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 64-67, caracterizado porque el conjugado de lípido-PEG comprende una molécula PEG que tiene un .peso molecular de aproximadamente 2000 g/moles . 69.- El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el conjugado de lípido-PEG comprende un 1 , 2 - di stearoi 1 - sn- gl i cero - 3 -fos foetanolamina-N- carboxi -polietilenglicol2ooo (DSPE -PEG2000) · RESUMEN DE LA INVENCION Se proporcionan en la presente nuevos lípidos catiónicos que comprenden los lípidos catiónicos, y métodos para utilizar los lípidos catiónicos. En algunas reivindicaciones, los lípidos catiónicos tienen actividad citotóxica y pueden utilizarse solos o en combinación con un compuesto bioactivo citotóxico para aniquilar una célula. En algunas de estas reivindicaciones, el lípido catiónico mejora la actividad citotóxica del compuesto bioactivo citotóxico. Se proporcionan métodos para tratar un sujeto afligido con una enfermedad o afección indeseada, en - donde el método comprende administrar un sistema de distribución que comprende un nuevo lípido catiónico al sujeto. La invención además proporciona métodos para hacer sistemas de distribución que comprenden los nuevos lípidos catiónicos de la invención. 1 LISTADO DE SECUENCIAS <110> Leaf Huang Yunching Chen Joyeeta Sen Surendar Reddy Bathula Sumió C ono Shyh-Dar Li ichael Hackett <120> Métodos y Composiciones que comprenden nuevos lípidos catiónicos <130> 035052/371908 <150> 61/054,328 <151> 2008-05-19 <150> 61/054,351 <151> 2008-05-19 <150> 61/054,338 <151> 2008-05-19 <160> 2 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 '<210> 1 <211> 21 <212> ARN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido ARNsi <400> 1 aacacagugg agcgaauucc u 21 <210> 2 <211> 21 <212> ARN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido ARNsi <400> 2 aauucuccga acgugucacg u 21
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