KR101000358B1

KR101000358B1 - 인테그린 αⅤβ３ 결합성 지질 유도체 및 그를 포함하는 지질 나노입자

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Publication number: KR101000358B1
Application number: KR1020100040290A
Authority: KR
Inventors: 오유경; 김지연; 한수은; 변영로
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-04-29
Filing date: 2010-04-29
Publication date: 2010-12-13

Abstract

본 발명은 암 세포, 줄기세포 등 인테그린(integrin)을 표면에 발현하는 세포를 선택적으로 인지하는 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 이를 포함하는 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자, 상기 지질 나노입자 및 약물을 포함하는 의약 조성물 및 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자의 제조를 위한 상기 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, 또는 상기 지질 나노입자의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체는 혈관형성이 활발한 암세포, 혈관 내피세포 등의 세포 표면에 있는 인테그린에 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 따라서, 상기 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 포함하는 지질 나노입자는 흑색종을 포함한 각종 암 세포에 대한 약물 전달 효율을 증강시켜준다. 이러한 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자는 비 선택적인 약물 전달의 독성을 감소하고, 암 세포를 포함한 각종 세포에서 약물의 효과를 증강시킬 수 있으므로 약물의 전신적 투여에 의한 부작용을 완화할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체는 줄기 세포의 표면에 과발현하는 인테그린에 특이적으로 결합할 수 있으므로, 상기 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 포함하는 지질 나노입자는 줄기세포에 분화 또는 유전자 치료를 위한 약물을 효율적으로 전달할 수 있다.

Description

인테그린 αⅤβ３ 결합성 지질 유도체 및 그를 포함하는 지질 나노입자{lipid derivatives with integrin αVβ3 affinity and lipid nanoparticles comprising the same}

본 발명은 암 세포, 줄기세포 등 인테그린(integrin)을 표면에 발현하는 세포를 선택적으로 인지하는 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 이를 포함하는 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자, 상기 지질 나노입자 및 약물을 포함하는 의약 조성물 및 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자의 제조를 위한 상기 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, 또는 상기 지질 나노입자의 용도에 관한 것이다.

암, 자가면역질환 등의 질병을 치료하기 위해 수술, 방사선 요법, 또는 표적 질환 세포에 직접 또는 간접적으로 작용하는 화학적 치료제나 생물학적 치료제를 이용한 약물 치료법이 행해지고 있다.

그러나, 상기 약물들, 특히 항암제들은 주로 빠르게 증식하는 세포에 작용하는 약물로서, 전신의 혈류를 타고 온몸으로 퍼져서 암세포 이외의 빠르게 증식하는 정상세포, 예를 들면, 혈액을 생성하는 골수세포, 머리 및 수염을 바르게 자라게 하는 모낭세포, 난자 및 정자를 생성하는 생식기 세포, 소화기 점막세포 등에 영향을 끼쳐 부작용을 나타내게 된다. 또한 기타 난치성 질환에 대한 약물들도 표적 질환 세포만을 표적화하는 능력의 부재로 여러 가지 부작용을 낳고 있다. 또한 단백질이나 핵산 등의 생물학적 치료제는 혈중에서 쉽게 분해되기 때문에 원하는 표적 지역까지 본래의 상태로 도달할 수 없어 효력을 나타낼 수 없다는 단점이 있다.

이러한 상기의 약물의 단점을 극복하기 위하여, 표적 조직의 특정 세포 내부로 약물을 효과적으로 전달하기 위한 약물 전달체로서 지질 나노입자에 대한 연구가 본격화되었다.

지질 나노입자 중 널리 연구되어온 리포좀은 생체막의 기본 구조인 인지질의 이중층(bilayer)으로 구성되어 있으며, 내부에는 친수성의 공간이 있고 외부로는 닫힌 이중의 지질막을 가지고 있는 미세 소포체를 가리킨다. 리포좀은 중앙의 친수성 공간에 수용성 분자(DNA 포함) 또는 약물을 내포할 수 있으며, 외부의 지질 이중막에는 지용성 약물을 붙이거나, 또는 양전하 또는 음전하 물질을 결합시킬 수 있다. 인지질은 양친매성(amphipathic) 물질로서, 음이온성 또는 양쪽성 이온의 극성 분자단과 탄화수소 16개 내외의 다양한 불포화도를 갖는 2개의 비극성 지용성 사슬을 가지고 있는 분자구조이기 때문에 인지질이 물에 분산되면 자발적으로 이중층을 형성한다.

이러한 지질 나노입자가 표적 질환 세포만을 표적화 한다면, 비표적 세포 또는 조직에 약물이 전달되어 일어나는 부작용을 최소화 할 수 있으며, 진단제를 봉입하여 표적 질환 세포 또는 조직의 비침투적 진단을 가능케 할 것이다. 따라서 비표적 세포에는 존재하지 않거나 발현량이 적으면서 표적 질환 세포 표면에는 과발현 되는 수용체를 표적화하는 약물전달체의 개발이 필요하다. 지질 나노입자를 통한 표적 세포의 표적화는 그의 유효량을 표적 세포에 선택적으로 전달하도록 지질 나노입자를 변형시켜 달성할 수 있다.

현재, 표적 전달체로서는 표적 세포에 특이적으로 과발현되는 분자들을 표적화하는 항체가 표면에 수식되어 있는 면역 리포좀(antigen-recognizing immunoliposome)에 대한 연구가 진행 중에 있다. 이러한 항체 수식 면역 리포좀은 항원을 과발현하는 질환세포 또는 조직으로 다양한 치료제 또는 진단제를 선택적으로 보낼 수 있는 장점이 있다. 예를 들어, 종양 세포에 과발현되는 수용체인 HER2를 표적화하는 항-HER2 항체를 함유하는 리포좀을 제조하고 이에 독소루비신등의 항암제를 봉입하여 표적화 약물 전달체를 제조하는 방법 등이 이용되어 왔다(미국공개특허 제US20060269542호). 그러나, 항체 수식형 면역 리포좀은 항체의 높은 제조 비용 및 반복 투여시 항체의 면역원성 등으로 산업화 면에서 해결해야할 과제가 많다. 산업화 면에서 표적화 리간드로는 제조 원가가 높은 항체 보다는 대량 생산시의 비용이 저렴한 화학물질을 사용하는 것이 보다 유리하나 아직 당분야에서는 효과적인 화학물질 소재의 표적화 리간드들에 대한 발굴이 미진한 실정이다.

혈관 내피 세포, 줄기세포 (Wong JC 등, 2010, Cell. Adh. Migr. 13, 4; Lee ST 등, 2010, Biomaterials, 31, 1219-26; Kusanagi R 등, 2009, Biochem. Biophys. Res. Commun., 389, 274-8), 및 특정 암세포는 비트로넥틴 수용체 αVβ3또는 αVβ5뿐 아니라, 콜라겐 유형 I 및 IV 수용체, 라미닌 수용체 α6β1 및 α3β1, 및 파이브로넥틴 수용체 α5β1 (Davis 등, 1993, J. Cell. Biochem. 51, 206) 을 비롯한 3 개 이상의 RGD-의존적 인테그린을 함유하는 것으로 알려져 있다. 평활근 세포는 αVβ3 또는 αVβ5를 비롯한 6 개 이상의 RGD-의존적 인테그린을 함유하는 것으로 알려져 있다.

인테그린과 리간드의 상호작용, 특히 리간드와 αVβ3 또는 αVβ5 인테그린의 상호작용은 특정한 활성을 유발할 수 있다. 예를 들어 αVβ3 인테그린에 결합하는 리간드는 혈관신생작용을 억제하는 인테그린 억제제로서 작용하고 생물학적인 활성을 나타낸다. 혈관 인테그린과 세포외 매트릭스 단백질의 상호작용과 혈관 신생의 연관성은 이미 알려진 바 있다 (P. C. Brooks, R. A. Clark and D. A. Cheresh, Science 264, 569-71). 이러한 상호작용을 억제할 경우, 환형 펩티드에의해 혈관신생 혈관 세포의 아폽토시스(프로그램된 세포 사멸)를 유도할 가능성이 있다는 것이 문헌(P. C. Brooks, R. A. Reisfeld 등, 1994, Cell 79, 1157-64)에 기술되어 있다.

인테그린 αVβ3는 암세포의 성장에 필수적인 신생혈관 생성시에 그 발현이 증가하는 것이 보고되었으며, 항암제 전달체의 표적으로써의 가능성을 보여준다. 인테그린 수용체와 리간드의 상호작용, 예를 들어 인테그린 αVβ3과 그 리간드의 상호작용을 차단하는 3,3'5,5'-tetraiodothyroacetic acid (Tetrac)은 인테그린 αVβ3길항물질로서 인테그린에 의한 종양 세포의 확산을 방지한다. 또한 암세포 표면에 발현하는 인테그린의 신호전달을 억제함으로써 아폽토시스를 유도하여 암세포의 사멸을 유도한다. 이러한 작용은 최근에 여러 문헌을 통해 확인되었으며, 예를 들어 문헌(Yalcin M 등, 2009, Anticancer Res. 10, 3825-31)에 기술된 방법에 따라 증명될 수 있다.

줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다. 이들은 유사 세포분열을 통해 스스로 재생할 수 있는 능력이 있고 다양한 범위의 특정화된 세포 유형으로 분화할 수 있다. 또한 줄기세포의 정의는 자가-재생 및 잠재능을 보유하는 것을 말한다. 자가-재생은 미분화된 상태를 유지하면서 수 많은 주기의 세포분열을 거칠 수 있는 능력으로 정의되는 반면, 잠재능은 특정화된 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력이다.

줄기세포의 유형은 배아줄기세포 (Embryonic stem cell, ES 세포)와 성체 조직에서 발견되는 성체 줄기세포이다. ES 세포는 특정 세포 유형에 대해 필요한 자극이 주어지면 성체의 200종 이상의 세포 유형으로 각각 분화할 수 있다. 성체줄기세포는 조직 또는 기관 내 분화된 세포들 중에서 발견되는 미분화된 세포이다. 성체줄기세포는 스스로 재생할 수 있고 조직 또는 기관의 주요 특정화된 세포 유형을 양산하도록 분화할 수 있다.

최근, 지방에서 유래된 줄기세포가 세포 치료제로써 새롭게 각광 받고 있다. (B. Cousin et al., BBRC, 301:1016, 2003;A. Miranville et al., Circulation, 110:349, 2004; S. Gronthos et al., J. Cell Physiol., 189:54, 2001; M.J. Seo et al., BBRC, 328:258, 2005). 지방흡입술(liposuction)에 의해 얻어진 지방조직에 미분화 세포군이 포함되어 있고, 이것이 in vitro상에서 지방세포, 골형성세포, 근원세포 및 연골모세포로의 분화능을 갖는다는 것이 보고되었다 (P.A. Zuk et al., Tissue Eng., 7:211, 2001; A.M. Rodriguez et al.,BBRC, 315:255, 2004). 아울러 지방 조직 유래 세포가 근육 재생능 및 신경혈관분화를 촉진하는 능력이 있다는 것이 동물 모델 실험을 통하여 알려진 바 있다. 이러한 지방 조직은 대량으로 추출할 수 있다는 장점이 있어, 기존의 단점을 보완하는 새로운 줄기세포의 소스로 주목받고 있다.

이러한 줄기세포의 세포 치료제로써 이용을 용이하게 하기 위해서는 줄기세포가 자가-재생하는 능력 및 분화 잠재능을 오랜 기간 동안 유지해야 한다. 줄기세포의 세포치료제로써 이용을 위해서는 줄기세포 내로의 약물이나 유전자 치료제의 전달을 용이하게 하기위해서는 전달체 개발이 필요하다. 전달체를 이용하여 약물이나 유전자 치료제의 세포내 전달 효율을 높이기 위해서는 줄기세포 표면에 과발현하는 인테그린을 이용할 수 있다.

본 발명에서는 인테그린을 표적할 수 있는 화합물을 이용한 지질 전달체를 개발하여 암 세포나 줄기세포에 화학요법제, 단백질 의약 또는 핵산 의약의 전달 효율을 높이고자 한다.

본 발명은 표적화 리간드로서 인테그린 αVβ3에 특이적으로 결합하는 화합물을 이용한 약물전달체를 제조하는 것을 목적으로 한다.

이를 위해, 인테그린을 발현하는 세포를 특이적으로 인지하는 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 이를 함유하는 약물전달체를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 포함하는 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자를 포함하는 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자의 제조를 위한 상기 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, 또는 상기 지질 나노입자의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 약물전달체의 표적화 리간드로서 인테그린 αVβ3에 특이적으로 결합하는 화합물을 이용하고자 연구한 결과, 갑상선 호르몬 유도체와 지질이 결합되어 있는 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 개발하게 되었다. 테트락(Tetrac)과 같은 갑상선 호르몬 유도체는 종래에는 갑상선암이나 갑상선의 비정상적인 성장을 억제하기 위해, 또는 인테그린에 결합하여 인테그린의 신호전달을 억제함으로써 항암 효과를 나타내는 항암제로서 사용될 수 있음이 공지되어 있다(미국등록특허 6,740,680; Yalcin M 등, 2009, Anticancer Res. 10, 3825-31; 미국공개공보 2009-0022806). 그러나, 이제까지 지질 나노입자와 같은 약물전달체에 표적 지향성을 부여하기 위해 갑상선 호르몬 유도체를 이용한 적은 없었다.

본 발명에서는 갑상선 호르몬 유도체를 인테그린을 억제하기 위해 사용하는 것이 아니라, 갑상선 호르몬 유도체가 암세포, 신생혈관, 및 줄기세포 등에 과발현하는 인테그린 αVβ3을 선택적으로 인지하는 특성을 약물전달체의 표적지향성을 부여하기 위해 활용하고자 한다.

본 발명은 갑상선 호르몬 유도체와 지질이 결합되어 있는 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 갑상선 호르몬 유도체는 테트락(Tetrac, 3,3'5,5'-Tetraiodothyroacetic acid), 트리악(TRIAC, Triiodothyroacetic acid), 레보티록신(Levothyroxine, T4), 트리이오도티로닌(Triiodothyronine, T3), 3,5-디메틸-4-(4'-하이드록시-3'-이소프로필벤질)-페녹시 아세트산)(3,5-dimethyl-4-(4'-hydroxy-3'-isopropylbenzyl)-phenoxy acetic acid, GC-1), 3,5-디이오티로프로피온산(3,5-diiodothyropropionic acid, DITPA), 3,5,3',5'-테트라이오도티로프로피온산(3,5,3',5'-tetraiodothyropropionic acid), 3,3',5-트리이오도티로아세트산(3,3',5-triiodothyroacetic acid), 3,5,3'-트리이오도티론아민(3,5,3'-triiodothyronamine), 디아이오도티로닌스(Diiodothyronines, T2), 4'-데옥시 디아이오도티로닌스(4'-deoxy-diiodothyronines, 4'-deoxy-T2), 3,5-디메틸-3'-이소프로필-티로닌(3,5-dimethyl-3'-isopropyl-thyronine, 4-DIMIT) 및 N-아세틸 DIMIT로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 갑상선 호르몬 유도체는 인테그린에 대해 선택적인 결합능을 나타내는 것으로 잘 알려져 있다. 하기 실시예에서는 테트락을 표적 리간드로서 사용하여 지질과 결합시킨 지질 유도체를 제조하고 이를 이용한 지질 나노입자를 제조하여, 이러한 지질 나노입자가 인테그린 발현 세포에 대해 높은 표적성을 나타냄을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 표적 리간드로서 사용되는 갑상선 호르몬 유도체와 결합되는 지질의 종류는 특별히 한정되지 아니한다. 약물전달체의 제조를 위해 일반적으로 사용되고 있는 지질이라면 어떠한 것이든 이용할 수 있다. 이러한 지질은 일반적으로 탄소수 3 내지 24의 포화 또는 불포화 탄화수소, 예컨대, 탄소수 10 내지 24의 포화 또는 불포화 탄화수소, 탄소수 14 내지 20의 포화 또는 불포화 탄화수소를 포함하는 공지의 지질일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 갑상선 호르몬 유도체들은 지질과 결합되는 말단에 카르복실기(-COOH)를 갖고 있다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 지질은 갑상선 호르몬 유도체와 결합되는 일 말단에 예를 들어, 아민기(-NH₂), 하이드록시기(-OH) 등과 같은 기능기를 갖고 있거나, 이들 기능기를 갖도록 변형되어 있을 수 있다. 예컨대, 본 발명에서 사용되는 지질로서 포스파티딜 에탄올아민 또는 포스파티딜 세린과 같이 아민기를 갖는 지질이나, 올레일 알코올, 엘라이딜 알코올, 팔미톨레일 알코올, 미리스톨레일 알코올과 같이 하이드록시기를 갖는 지질을 이용하면 별도의 변형없이도 갑상선 호르몬 유도체와의 결합을 유도하는 것이 가능하다. 아민기나 하이드록시와 같은 기능기를 갖고 있지 않은 지질이라고 하더라도 일 말단에 그러한 기능기를 갖도록 변형하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있을 뿐만 아니라, 시판되고 있는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 또한, 이러한 기능기는 링커(linker)를 사용하여 추가로 도입될 수도 있다. 예를 들어, 하이드록시기 또는 아민기 등의 기능기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜 등을 이용하여 지질이 갑상선 호르몬 유도체와 결합할 수 있는 기능기를 갖도록 개질할 수 있다. 이러한 지질 또한 공지의 방법을 통해 합성하거나 시판되고 있는 것을 구입하여 사용할 수 있다.

한 구체예에서, 상기 지질은 글리세로포스포리피드일 수 있다. 글리세로포스포리피드는 세포막을 구성하는 성분이므로 약물전달체의 제조에 사용할 경우 약물전달체의 세포내 도입을 용이하게 할 수 있다. 상기 글리세로포스포리피드는 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 이노시톨 및 포스파티딜 세린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 이들 지질은 갑상선 호르몬 유도체와 결합할 수 있는 기능기를 갖거나, 그러한 기능기를 갖도록 적절히 개질될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명에서 사용될 수 있는 지질은 이에 제한되는 것은 아니나, 하기 예시한 지질을 이용할 수 있다:

1,2-디스테마로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)2000](1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)2000]);

L-a-포스파티딜에탄올아민(L-a-phosphatidylethanolamine);

1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine);

1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine);

1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine);

1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine);

1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dielaidoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine);

1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine);

1,2-디도코사헥사엔오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine);

1-팔미토일-2-올레오일sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine);

1,2-디-(9Z)-옥타데센오일sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine);

1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)

1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine);

1,2-디펜타데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dipentadecanoyl-sn-glycero-3-phoshphoethanolamine);

1,2-디헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine);

1,2-디피탄올-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphaethanolamine);

1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioctanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine);

1,2-디-O-피타닐-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-di-O-phytanyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine);

1-(1Z-옥타데세닐)-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1-(1Z-octadecenyl)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine);

1-(1Z-옥타데세닐)-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1-(1Z-octadecenyl)-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine);

1-(1Z-옥타데세닐-2-오코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포데탄올아민(1-(1Z-octadecenyl)-2-docosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine);

1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(헥사노일아민)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(hexanoylamine));

1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-소프소에탄올아민-N-(라우로일아민)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lauroylamine)) 등.

한편, 상기 지질은 폴리에틸렌글리콜로 수식된 것일 수 있다. 지질의 일 말단에 폴리에틸렌글리콜을 결합시켜 사용하는 경우 폴리에틸렌글리콜이 스페이서(spacer)의 역할을 하므로 타겟에 대한 결합을 보다 용이하게 해 줄 수 있다.

상기 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체는 갑상선 호르몬 유도체에 존재하는 카복실기를 예를 들어, 지질에 존재하는 아민기나 하이드록시기와 결합시켜 제조될 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체는 갑상선 호르몬 유도체와 지질을 유기 용매의 존재하에 1 내지 10시간 동안 반응시켜 용이하게 제조할 수 있다. 상기 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체의 제조를 위한 갑상선 호르몬 유도체와 지질의 비율은 특별히 제한되지 않으나, 1:0.5 내지 1:2당량일 수 있다. 상기 유기 용매는 특별히 제한되는 것은 아니나, 디메틸포름아미드, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 클로로포름과 같은 용매를 사용할 수 있다. 또한, 예를 들어, 갑상선 호르몬 유도체와 지질의 아미드 결합을 위해서는 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide), NHS(N-Hydroxysuccinimide), CMC(cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimide), DCC(Dicyclohexyl carbodiimide), DIC(Diisopropyl carbodiimide), CDI(N,N' Carbonyldiimidazole) 등과 같은 결합제를 하나 이상 사용할 수 있으며, 이들 결합제는 지질의 0.5 내지 3당량, 예컨대, 1.5 당량 정도의 양으로 첨가할 수 있다.

하기 실시예에서는 갑상선 호르몬 유도체의 일종인 테트락의 카르복실기와 지질의 아민기를 아미드 결합을 통해 공유결합시켜 본 발명에 따른 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 제조하는 방법에 대해 구체적으로 예시한다.

이렇게 제조된 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체는 예컨대, 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 구조를 가질 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 식에서,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 탄소수 3 내지 24의 알킬, 또는 탄소수 3 내지 24의 알케닐을 나타내고,

R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 각각 독립적으로 H, I, Br 또는 C_1-4알킬을 나타내며,

R₇은OH 또는 H이고,

X는 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 6의 알킬렌을 나타내며,

Y는 -CH₂-; 아민으로 치환된 -(CH₂)₂-; 또는 -O-CH₂-를 나타내고,

Z는 산소 또는 탄소를 나타내며,

L은

,

, 또는

이고,

n은 1 내지 100의 정수를 나타낸다.

다른 구체예에서, 본 발명에 따른 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체는

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 탄소수 10 내지 24의 알킬, 또는 탄소수 10 내지 24의 알케닐을 나타내고,

R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 각각 독립적으로 H, I, Br, 메틸, 또는 이소프로필을 나타내며,

R_{7은 OH} 또는 H이고,

X는 카복시로 치환되거나 비치환된 -(CH₂)₂-을 나타내며,

Z는 산소 또는 탄소를 나타내며,

L은

,

, 또는

이고,

n은 1 내지 100의 정수를 나타내는 것일 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체는

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H, I, Br 또는 메틸이고,

R₅ 및 R₆는 각각 독립적으로 H, I, Br 또는 이소프로필이이며,

R_{7은 OH} 또는 H이고,

X는 카복시로 치환되거나 비치환된 -(CH₂)₂-을 나타내며,

Z는 산소 또는 탄소를 나타내며,

L은

,

, 또는

이고,

n은 1 내지 100의 정수를 나타내는 것일 수 있다.

R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 각각 I를 나타내며,

R₇은 OH이고,

X는 카복시로 치환되거나 비치환된 -(CH₂)₂-을 나타내며,

Y는 -CH₂-를 나타내고,

Z는 산소를 나타내며,

L은

,

, 또는

이고,

n은 1 내지 100의 정수를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체는 표적 리간드로서 작용하는 갑상선 호르몬 유도체에 의해 표면에 인테그린을 발현하는 암 세포, 줄기 세포 등에 대한 표적성을 나타내므로, 이들 세포를 표적 세포로 하는 약물전달체, 즉, 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자의 제조를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자의 제조를 위한 상기 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체의 용도, 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 포함하는 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자 제조용 조성물, 상기 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 이용한 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자의 제조 방법을 제공한다.

인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 포함하는 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자 제조용 조성물은 상기 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 외에도 양하전 지질, 중성 지질 및 음하전 지질로부터 선택되는 보조 지질을 추가로 포함할 수 있다.

예를 들어, 양이온성 리포좀의 제조를 위해서는 양하전 지질 및 중성 지질을, 중성 리포좀의 제조를 위해서는 중성 지질을, 음이온성 리포좀의 제조를 위해서는 음하전 지질 및 중성 지질을 사용할 수 있다.

예를 들어, 양하전 지질에는 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄프로판 (1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄프로판 (1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane), 1,2-디스테로일-3-트리메틸암모늄프로판 (1,2-distearoyl-3-trimethylammonium-propane), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로판 (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), 1,2-디미리스토일-3-디메틸암모늄-프로판 (1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane), 1,2-디팔미토일-3-디메틸암모늄-프로판 (1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane), 1,2-스테아로일-3-디메틸암모늄-프로판 (1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 (1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)carbamoyl] cholesterol; DC-Chol), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (dimethyldioctadecylammonium bromide), 1,2-디라유로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), 1,2-팔미토일올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-palmitoyloleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine) 등이 포함된다.

중성 지질에는 L-a-포스파티딜콜린 (L-a-phosphatidylcholine), 1,2-프로피오노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-propionoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2- 부타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-butanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-펜타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-pentanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-카프로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-caproyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-heptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-카프리로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-capryloyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-노나노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-nonanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-카프릴-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-capryl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-언데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-undecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-lauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-트리데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-tridecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-펜타데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-pentadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-heptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-노나데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-nonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-arachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-헤니에코사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-heniecosanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-베헤노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-behenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-트루시사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-trucisanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-리그노세로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-lignoceroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-미리스톨레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-myristoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-미리스텔라이도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-myristelaidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-팔미톨레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-palmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-팔미텔라이도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-palmitelaidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-페트로셀리노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-petroselinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-elaidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-linolenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-아이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-eicosenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-이루코일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-erucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-너보노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-nervonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), L-a-포스파티딜에탄올아민 (L-a-phosphatidylethanolamine), 1,2-디카프로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dicaproyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dioctanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디카프릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dicapryl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디펜타데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dipentadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디파이타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디팔미톨레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dielaidoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디리노에오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dilinoeoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-docosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 콜레스테롤(cholesterol) 등이 포함된다.

또한 음하전 지질에는 L-a-포스파티딜글리세롤 (L-a-phosphatidylglycerol), 1,2-디카프로일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dicaproyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dioctanoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디카프릴-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dicapryl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디파이타노일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dielaidoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-dilinolenoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), 1,2-도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포글리세롤 (1,2-docosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol), L-a-포스파티딜이노시톨 (L-a-phosphatidylinositol), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포이노시톨 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol), d-에리스로-스핑고실 포스포이노시톨 (d-erythro-sphingosyl phosphoinositol), L-a-포스파티딕산 (L-a-phosphatidic acid), 1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dioctanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디테카노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디도데카노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-didodecanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디테트라데카노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디헥사테카노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디파이타노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디옥타데카노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디옥타데카디에노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dioctadecadienoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디이코사테트라에노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dieicosatetraenoyl-sn-glycero-3-phosphate), 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphate), L-a-포스파티딜세린 (L-a-phosphatidylserine), 1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-dioctanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디데카노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디도데카노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-didodecanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디테트라데카노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디파이타노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디옥타데카노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디옥타데세노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-dioctadecenoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디옥타데카디에노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-dioctadecadienoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디이코사테트라에노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-dieicosatetraenoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포세린 (1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), 콜레스테릴 헤미숙시네이트 (cholesteryl hemisuccinate; CHEMS), 카디올리핀 (cardiolipin), 1',3'-비스[1,2-디테트라데카노일-sn-글리세로-3-포스포]-sn-글리세롤 (1',3'-bis[1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho]-sn-glycerol), 1',3'-비스[1,2-디옥타데세노일-sn-글리세로-3-포스포]-sn-글리세롤 (1',3'-bis[1,2-dioctadecenoyl-sn-glycero-3-phospho]-sn-glycerol) 등이 포함된다.

본 발명은 또한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 포함하는 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 지질 나노입자는 이에 제한되는 것은 아니나, 리포좀(liposome), 미셀(micelle), 에멀젼(emulsion) 및 고형 지질 나노입자(solid lipid nanoparticle)로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있다.

상기 지질 나노입자는 앞서 설명한 양하전 지질, 중성 지질 및 음하전 지질로부터 선택되는 보조 지질을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 지질 나노입자는 앞서 설명한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 포함하는 조성물을 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 지질 나노입자는 리포좀(liposome), 미셀(micelle), 에멀젼(emulsion) 또는 고형 지질 나노입자(solid lipid nanoparticle)의 일반적인 제조 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 즉, 지질 나노입자의 제조시 지질의 첨가 단계에서 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 첨가함으로써 용이하게 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 임의로 양하전 지질, 중성 지질 또는 음하전 지질 등의 보조 지질과 유기 용매상에서 혼합하고 유기 용매를 모두 증발시킨 후 중성 pH의 완충용액으로 수화시켜 제조할 수 있다.

한 구체예에서, 상기 지질 나노입자는 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 미셀 또는 에멀젼 제형의 형성을 위해서는 본 발명의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 보조 지질과 함께 계면활성제를 사용할 수 있다.

이러한 계면활성제는, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.

예를 들어 비온성 계면활성제는 트윈 20 (Tween 20) 또는 트윈 80 (Tween 80)과 같은 폴리솔베이트계; 트리톤 X-100(Triton-X-100)와 같은 알킬페놀 폴리에틸렌옥사이드계; 폴리에틸렌글리콜 모노올레일 에테르(polyethylene glycol monooleyl ether), 에틸렌글리콜 모노도데실 에테르 (ethylene glycol monododecyl ether), 디에틸렌글리콜 모노헥실 에테르 (diethylene glycol monohexyl ether), 트리에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르 (triethylene glycol monododecyl ether)와 같은 알킬(폴리)에틸렌 글리콜계; 플록사머계(Poloxamers); 옥틸 글루코사이드(octyl glucoside) 또는 사이클로헥실 베타 말토사이드 (cyclohexylmethyl β-D-maltoside)와 같은 알킬 폴리글루코사이드계; 라우릴에메틸아민옥사이드 (lauryldimethylamine-oxide) 또는 도데실 디메틸아민 산화물(dodecyl dimethylamine oxide)과 같은 알킬아민옥사이드계; 펜타에리스리틸 팔미테이트(pentaerythrityl palmitate) 또는 노나노일메틸글루카민 (N-nonanoyl-N-methylglucamine)를 포함한다.

양이온성 계면활성제는 4급 암모늄 이온을 포함하는 트리메틸헥사데실 암모늄 클로라이드(trimethylhexadecyl ammonium chloride), 도데실트리메틸 암모늄 클로라이드 (dodecyltrimethyl ammonium bromide), 세틸 브롬화 트리메틸암모늄염(cetyl trimethylammonium bromide), 또는 헥사데실 브롬화 암모늄염(hexadecyl trimethyl ammonium bromide)을 포함한다.

양쪽이온성 계면활성제는 도데실 베타인(dodecyl betaine)을 포함한다.

또한 음이온성 계면활성제는 디메틸팔미토일암모니오프로판 설포네이트(3-(N,Ndimethylpalmitylammonio) propane sulfonate)와 같은 설페이트, 설포네이트 또는 카르복실레이트 음이온을 포함하는 계면활성제 또는 라우로살코신 소듐염(N-lauroylsarcosine sodium salt) 등과 같은 지방산의 염을 포함한다.

본 발명의 인테그린 인지형 지질 나노입자를 통해 약물을 전달받는 표적 세포는 치료 또는 진단이 요구되는 세포일 수 있다. 본 발명에 따른 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자가 표적화하는 표적 세포는 인테그린 발현 세포이다. 이러한 인테그린 발현 세포로는 줄기 세포 또는 암 세포 등이 알려져 있다. 이러한 표적 세포는 예를 들어, 암 세포 (소세포 폐암 (SCLC, Small Cell Lung Cancer), 비-소 세포 폐암 (NSCLC, None Small Cell Lung Cancer), 두경부의 평편 세포암 (SCCHN, Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neack) 및 암 줄기세포 (Cancer Stem Cells)), 염증 세포, 혈관 내피세포 (Endothelial cells), 조혈모 줄기세포 (hematopoietic stem cells), 간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cells), 신경 줄기세포(Neural stem cells), 각막 윤부 줄기세포 (LESPC, Limbal epithelial side population cells), 치수줄기세포 (DPSC, Dental Pulp Stem Cells) 및 각막기질줄기세포 (CSSC, Corneal Stromal Stem Cells) 등일 수 있다. 하기 실시예에서는 사람의 흑색종 세포주, 유방암 세포주, 간엽줄기세포주에 속하는 지방유래 줄기세포, 각막기질줄기세포 및 각막윤부줄기세포 등을 이용하여 본 발명의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자의 인테그린 발현 세포 인지능 및 약물 전달능을 평가한다.

본 발명의 지질 나노입자에 포함되는 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체는 세포 표면의 인테그린과 결합할 수 있으므로, 본 발명의 인테그린 인지형 지질 나노입자는 표적 세포의 인테그린을 타겟팅하여 선택적으로 약물을 전달하는 약물전달체로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자 및 하나 이상의 약물을 포함하는 의약 조성물을 제공한다.

본 발명의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자를 이용하여 표적 세포로 전달할 수 있는 약물은 치료제(therapeutic agent), 진단제(diagnostic agent) 등일 수 있다. 또한 표적 세포가 줄기 세포일 경우, 줄기 세포의 특정 세포로의 분화를 유도할 수 있는 분화유도제일 수도 있다. 치료제 또는 진단제와 같은 약물은 지질 나노입자의 제조시 제형 내로 봉입하거나 제형의 표면에 결합시키는 등 공지의 방법을 통해 본 발명에 따른 지질 나노입자에 도입될 수 있다. 본 발명의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자는 치료제와 진단제를 동시에 전달할 수도 있다. 예를 들어, 리포좀의 중앙의 친수성 공간에 자성나노입자와 같은 진단제를, 외부의 지질 이중막에 지용성 약물이나 핵산과 같은 음전하 물질을 결합시킬 수 있다.

상기 치료제는 화학요법제, 단백질 의약 또는 핵산의약일 수 있다. 화학요법제는 임의의 질환에 대한 약리 효과를 나타내는 유기 화합물을 의미한다. 화학요법제는 대개 혈류를 통해 비선택적으로 세포에 전달되는 특성을 갖는데, 약물의 부작용을 감소시키기 위해 세포 또는 조직에 선택적인 치료가 요구되는 경우에는 본 발명의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 화학요법제의 대표적인 예로는 항암 화학요법제를 들 수 있다. 공지의 항암 화학요법제로는 예를 들어, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 발루비신(valubicin), 미토산트론(mitoxantrone), 커큐민(curcumin), 제피티닙(gefitinib), 에를로티닙(erlotinib), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 등이 있다.

본 발명의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자를 이용하여 표적세포에 전달할 수 있는 의약은 또한 단백질 의약 또는 핵산 의약일 수 있다. 예를 들어, 특정 수용체에 특이적으로 결합하여 신호 전달을 차단하거나 억제하는 펩타이드, 특정 유전자의 발현을 저해하는 siRNA 등이 이에 해당된다.

본 발명에 있어서, 핵산은 플라스미드 디옥시리보핵산(plasmid DNA), 리보핵산(RNA), 작은 간섭 리보핵산(siRNA), 안티센스 올리고핵산(antisense oligonucleotide), 마이크로 리보핵산 (microRNA), 잠금형 핵산 (locked nucleic acid), 핵산 앱타머(aptamer) 등을 포함한다.

한편, 상기 진단제는 표적 세포를 탐지해 내어 인식가능하게 할 수 있는 물질이면 어떠한 것이든 이용가능하다. 예를 들어, 상기 진단제는 MRI 등에서 사용하기 위한 자성나노입자나 공지의 조영제일 수 있다. 핵산 앱타머 또한 특정 항원에 대한 표적성을 가지므로 형광물질 등이 레이블링되어 있는 핵산 앱타머는 상기 진단제로 사용될 수 있을 것이다. 또한, 생체를 투과할 수 있는 근적외선(near infra-red) 계열의 형광물질; 또는 Calcium-47, Carbon-11, Carbon-14, Chromium-51, Cobalt-57, Cobalt-58, Erbium-169, Fluorine-18, Gallium-67, Gallium-68, Hydrogen-3, Indium-111, Iodine-123, Iodine-131, Technetium-99m와 같은 방사선의약품도 사용될 수 있다.

하기 실시예에서는 본 발명의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 포함하는 다양한 제형의 지질 나노입자를 제조하고, 지질 나노입자의 제조시 형광 지질, 항암제, siRNA 등을 지질 나노입자에 도입하여 본 발명의 지질 나노입자의 인테그린 리셉터 인지능과 약물전달능을 평가한다. 하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 기존의 지질 나노입자는 인테그린을 과발현하는 세포에 표적능이 없어 세포의 종류에 상관없이 무작위로 세포내로 약물을 전달하는 등 표적화 능력이 떨어지므로 일반세포에서 약물독성을 나타낼 수 있다. 이와 달리, 본 발명에서는 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 이용하여 인테그린을 과발현하는 세포에 표적함과 동시에 표적세포에 효과적으로 약물 및 핵산을 전달할 수 있는 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자를 제공하게 된다.

본 발명에 따른 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체는 혈관형성이 활발한 암세포, 혈관 내피세포 등의 세포 표면에 있는 인테그린에 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 따라서, 상기 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 포함하는 지질 나노입자는 흑색종을 포함한 각종 암 세포에 대한 약물 전달 효율을 증강시켜준다. 이러한 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자는 비 선택적인 약물 전달의 독성을 감소하고, 암 세포를 포함한 각종 세포에서 약물의 효과를 증강시킬 수 있으므로 약물의 전신적 투여에 의한 부작용을 완화할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체는 줄기 세포의 표면에 과발현하는 인테그린에 특이적으로 결합할 수 있으므로, 상기 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 포함하는 지질 나노입자는 줄기세포에 분화 또는 유전자 치료를 위한 약물을 효율적으로 전달할 수 있다.

도 1은 인테그린 αVβ3를 과발현하는 사람의 흑색종 세포주인 WM 266.4 에서 테트락 유도체 지질에 의한 선택 결합된 형광 지질 함유 음이온성 리포좀의 WM 266.4세포 표면 인테그린 αVβ3인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 2는 인테그린 αVβ3를 과발현하는 사람의 흑색종 세포주인 WM 266.4 에서 테트락 유도체 지질에 의한 선택 결합된 형광 지질 함유 음이온성 리포좀의 WM 266.4 세포 표면 인테그린 αVβ3 인지능을 형광 현미경을 사용해 이미지화한 결과이다.
도 3은 인테그린 αVβ3를 과발현하는 사람의 흑색종 세포주인 A375 에서 테트락 유도체 지질에 의한 선택 결합된 형광 지질 함유 음이온성 리포좀의 A375 세포 표면 인테그린 αVβ3인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 4는 인테그린 αVβ3를 과발현하는 사람의 유방암 유래 세포주인 MDA-MB-231에서 테트락 유도체 지질에 의한 선택 결합된 형광 지질 함유 양이온성 리포좀의 MDA-MB-231 세포 표면 인테그린 αVβ3인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 5은 인테그린 αVβ3를 과발현하는 사람의 지방유래 줄기세포인 ASC 에서 테트락 유도체 지질에 의한 선택 결합된 형광 지질 함유 중성 리포좀의 ASC 세포 표면 인테그린 αVβ3인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 6은 인테그린 αVβ3를 과발현하는 사람의 흑색종 세포주인 WM 266.4 에서 테트락 유도체 지질에 의한 선택 결합된 형광 지질 함유 에멀젼, 미셀 및 고형 지질 나노입자의 WM 266.4 세포 표면 인테그린 αVβ3인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 7은 인테그린 αVβ3를 과발현하는 사람의 유방암 유래 세포주인 MDA-MB-231에서 테트락 유도체 지질에 의한 선택 결합된 형광 지질 함유 에멀젼, 미셀 및 고형 지질 나노입자의 MDA-MB-231 세포 표면 인테그린 αVβ3 인지능을 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 8는 인테그린 αVβ3를 과발현하는 사람의 지방유래 줄기세포인 ASC 세포에서 테트락 유도체 지질 함유 양이온성 리포좀의 ASC 세포 표면 인테그린 αVβ3인지능에의해 세포내에 전달된 형광 표지된 siRNA를 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 9는 인테그린 αVβ3를 과발현하는 사람의 흑색종 세포주인 A375 에서 테트락 유도체 지질 함유 양이온성 리포좀의 A375 세포 표면 인테그린 αVβ3인지능에의해 세포내에 전달된 형광 표지된 siRNA를 형광 유세포분석기 (FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 10은 인테그린 αVβ3인지가능한 테트락 유도체 지질 함유 파클리탁셀 음이온성 리포좀에 의한 암세포 사멸 효능을 MTT 염색법을 사용하여 사람 흑색종 WM 266.4 세포주에서 확인한 결과이다.
도 11은 인테그린 αVβ3인지가능한 테트락 유도체 지질 함유 독소루비신과 음이온성 리포좀과 파클리탁셀 함유 중성 리포좀에 의한 암세포 사멸 효능을 MTT 염색법을 사용하여 사람 흑색종 A375 세포주에서 확인한 결과이다.
도 12는 양하전 리포좀을 이용하여 서바이빈 발현 억제 siRNA에 의해 매개된 서바이빈 전사체 발현 억제 효능을 WM 266.4 세포주에서 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 13은 양하전 리포좀을 이용하여 서바이빈 발현 억제 siRNA에 의해 매개된 서바이빈 전사체 발현 억제 효능을 A375 세포주에서 역전사 중합효소 연쇄반응을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 14는 양하전 리포좀을 이용하여 서바이빈 발현 억제 siRNA에 의해 매개된 서바이빈 단백질 발현 억제 효능을 A375 세포주에서 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 보여준다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체의 합성>

실시예 1. 테트라시미도 폴리에틸렌글리콜 디스테아로일 포스포에탄올아민(Tetracimido polyethyleneglycol distearoyl phosphoethanolamine)의 합성

3,3',5,5'-테트라이오도티로아세트산 (Tetrac, 10mg, 0.013mmole, sigma-Aldrich, USA)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF, Sigma-Aldrich, USA)에 녹인 후 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)2000] (DSPE PEG2000 Amine, 26mg, 0.0094mmole, Avanti Polar Lipids Inc., USA ), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 (EDC, 3.84mg, 0.02mmole, Sigma-Aldrich, USA), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP, 4.9mg, 0.04mmole, FLUKA, USA)을 첨가한 후 12시간 정도 교반하였다. 반응 후 얻어진 생성물을 감압 농축하여 에틸아세테이트(ethylacetate, Sigma-Aldrich, USA)에 녹여 과포화 중탄산나트륨용액, 과포화 염화나트륨용액으로 각각 3회씩 세척하여 미반응 물질을 제거시키고, 여분의 수분을 무수황화마그네슘(Sigma-Aldrich, USA)으로 제거한 후 건조하여 무색 필름형의 생성물을 얻었다. 반응 여부는 박막층 크로마토그래피법 (TLC, thin layer chromatograpy, Merck & Co., Inc. USA)로 확인하였다.

실시예 2. 테트라시미도 포스파티딜에탄올아민(Tetracimido phosphatidylethanolamine)의 합성

3,3',5,5'-테트라이오도티로아세트산 (Tetrac, 10mg, 0.013mmole, sigma-Aldrich, USA)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF, Sigma-Aldrich, USA)에 녹인 후 L-α-포스파티딜에탄올아민 (PE, 6.96mg, 0.0094mmole, Avanti Polar Lipids Inc., USA ), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 (EDC, 3.84mg, 0.02mmole, Sigma-Aldrich, USA), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 4.9mg, 0.04mmole, FLUKA, USA)를 첨가한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 반응시켜 테트락과 지질이 결합된 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 얻었다.

실시예 3. 테트라시미도 디라우로일 포스포에탄올아민(Tetracimido dilauroyl phosphoethanolamine)의 합성

3,3',5,5'-테트라이오도티로아세트산 (Tetrac, 10mg, 0.013mmole, sigma-Aldrich, USA)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF, Sigma-Aldrich, USA)에 녹인 후 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 ( 12:0 PE, 5.45mg, 0.0094mmole, Avanti Polar Lipids Inc., USA ), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 (EDC, 3.84mg, 0.02mmole, Sigma-Aldrich, USA), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 4.9mg, 0.04mmole, FLUKA, USA)를 첨가한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 반응시켜 테트락과 지질이 결합된 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 얻었다.

실시예 4. 테트라시미도 디팔미토일 포스포에탄올아민(Tetracimido dipalmitoyl phosphoethanolamine)의 합성

3,3',5,5'-테트라이오도티로아세트산 (Tetrac, 10mg, 0.013mmole, sigma-Aldrich, USA)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF, Sigma-Aldrich, USA)에 녹인 후 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (16:0 PE, 6.52mg, 0.0094mmole, Avanti Polar Lipids Inc., USA ), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 (EDC, 3.84mg, 0.02mmole, Sigma-Aldrich, USA), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 4.9mg, 0.04mmole, FLUKA, USA)를 첨가한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 반응시켜 테트락과 지질이 결합된 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 얻었다.

실시예 5. 테트라시미도 디팔미톨레오일 포스포에탄올아민(Tetracimido dipalmitoleoyl phosphoethanolamine)의 합성

3,3',5,5'-테트라이오도티로아세트산 (Tetrac, 10mg, 0.013mmole, sigma-Aldrich, USA)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF, Sigma-Aldrich, USA)에 녹인 후 1,2-디팔미톨레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (16:1 PE, 6.47mg, 0.0094mmole, Avanti Polar Lipids Inc., USA ), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 (EDC, 3.84mg, 0.02mmole, Sigma-Aldrich, USA), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 4.9mg, 0.04mmole, FLUKA, USA)를 첨가한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 반응시켜 테트락과 지질이 결합된 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 얻었다.

실시예 6. 테트라시미도 디올레오일 포스포에탄올아민(Tetracimido dioleoyl phosphoethanolamine)의 합성

3,3',5,5'-테트라이오도티로아세트산 (Tetrac, 10mg, 0.013mmole, sigma-Aldrich, USA)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF, Sigma-Aldrich, USA)에 녹인 후 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (18:1 PE, 6.96mg, 0.0094mmole, Avanti Polar Lipids Inc., USA ), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 (EDC, 3.84mg, 0.02mmole, Sigma-Aldrich, USA), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 4.9mg, 0.04mmole, FLUKA, USA)를 첨가한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 반응시켜 테트락과 지질이 결합된 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 얻었다.

실시예 7. 테트라시미도 디엘라이도일 포스포에탄올아민(Tetracimido dielaidoyl phosphoethanolamine)의 합성

3,3',5,5'-테트라이오도티로아세트산 (Tetrac, 10mg, 0.013mmole, sigma-Aldrich, USA)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF, Sigma-Aldrich, USA)에 녹인 후 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (18:1 PE, 6.96mg, 0.0094mmole, Avanti Polar Lipids Inc., USA ), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 (EDC, 3.84mg, 0.02mmole, Sigma-Aldrich, USA), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 4.9mg, 0.04mmole, FLUKA, USA)를 첨가한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 반응시켜 테트락과 지질이 결합된 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 얻었다.

실시예 8. 테트라시미도 디리놀레노일 포스포에탄올아민(Tetracimido dilinolenoyl phosphoethanolamine)의 합성

3,3',5,5'-테트라이오도티로아세트산 (Tetrac, 10mg, 0.013mmole, sigma-Aldrich, USA)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF, Sigma-Aldrich, USA)에 녹인 후 1,2-디리놀레노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (18:3 PE, 6.92mg, 0.0094mmole, Avanti Polar Lipids Inc., USA ), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 (EDC, 3.84mg, 0.02mmole, Sigma-Aldrich, USA), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 4.9mg, 0.04mmole, FLUKA, USA)를 첨가한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 반응시켜 테트락과 지질이 결합된 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 얻었다.

실시예 9. 테트라시미도 디도코헥사에노일 포스포에탄올아민(Tetracimido didocosahexaenoyl phosphoethanolamine)의 합성

3,3',5,5'-테트라이오도티로아세트산 (Tetrac, 10mg, 0.013mmole, sigma-Aldrich, USA)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF, Sigma-Aldrich, USA)에 녹인 후 1,2-디도코헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (22:6 PE, 7.86mg, 0.0094mmole, Avanti Polar Lipids Inc., USA ), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 (EDC, 3.84mg, 0.02mmole, Sigma-Aldrich, USA), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 4.9mg, 0.04mmole, FLUKA, USA)를 첨가한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 반응시켜 테트락과 지질이 결합된 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 얻었다.

실시예 10. 테트라시미도 팔미토일 올레오일 포스포에탄올아민(Tetracimido palmitoyl oleoyl phosphoethanolamine)의 합성

3,3',5,5'-테트라이오도티로아세트산 (Tetrac, 10mg, 0.013mmole, sigma-Aldrich, USA)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF, Sigma-Aldrich, USA)에 녹인 후 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (16:0-18:1 PE, 6.75mg, 0.0094mmole, Avanti Polar Lipids Inc., USA ), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 (EDC, 3.84mg, 0.02mmole, Sigma-Aldrich, USA), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 4.9mg, 0.04mmole, FLUKA, USA)를 첨가한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 반응시켜 테트락과 지질이 결합된 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 얻었다.

실시예 11. 테트라시미도 스테아로일 리놀레오일 포스포에탄올아민(Tetracimido stearoyl linoleoyl phosphoethanolamine)의 합성

3,3',5,5'-테트라이오도티로아세트산 (Tetrac, 10mg, 0.013mmole, sigma-Aldrich, USA)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF, Sigma-Aldrich, USA)에 녹인 후 1-스테아로일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (18:0-18:2 PE, 7mg, 0.0094mmole, Avanti Polar Lipids Inc., USA ), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 (EDC, 3.84mg, 0.02mmole, Sigma-Aldrich, USA), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 4.9mg, 0.04mmole, FLUKA, USA)를 첨가한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 반응시켜 테트락과 지질이 결합된 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 얻었다.

실시예 12. 테트라시미도 올레일아민(Tetracimido oleylamine)의 합성

3,3',5,5'-테트라이오도티로아세트산 (Tetrac, 10mg, 0.013mmole, sigma-Aldrich, USA)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF, Sigma-Aldrich, USA)에 녹인 후 올레일아민 (2.5mg, 0.0094mmole, Sigma-Aldrich, USA ), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 (EDC, 3.84mg, 0.02mmole, Sigma-Aldrich, USA), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 4.9mg, 0.04mmole, FLUKA, USA)를 첨가한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 반응시켜 테트락과 지질이 결합된 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 얻었다.

<지질 나노입자의 제조>

실시예 13. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 형광 지질을 함유하는 음이온성 리포좀(anionic liposome)의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, 중성 지질인L-a-포스파티딜콜린(Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'PC'라 함), 음하전 지질인 L-a-포스파티딜글리세롤 (Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'PG'라 함), 콜레스테롤(cholesterol, Sigma, USA)과 형광 지질인 N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)-1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'NBD-PE'라 함)을 각각 0.05:1:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 질소 환경에서 모든 클로로포름이 증발될 때까지 낮은 속도로 회전 증발시켜 지질 박막 필름으로 제조하였다. 지질 다층형 소구체 (multilamella vesicle)를 제조하기 위하여 이 박막필름에 인산완충용액 1 ml을 첨가하고 바이알을 37℃로 하여 밀봉 후 3 분간 교반(vortexing)하였다. 균일한 크기를 만들기 위해 이를 입자 균질화 제조기 (extruder, Northern Lipid Inc., Canada)를 사용하여 0.2㎛ 폴리카보네이트 막을 3 번 통과시켜 제조하였다. 수득된 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.

실시예 14. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 파클리탁셀이 함유된 음이온성 리포좀의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, PC, PG, 콜레스테롤과 항암제인 파클리탁셀(paclitaxel, Sigma, USA)을 각각 0.05:1:1:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 파클리탁셀 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 파클리탁셀 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.

실시예 15. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 형광 지질이 함유된 음이온성 리포좀의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, PC, 음하전 지질인 콜레스테릴 헤미숙시네이트(Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'CHEMS'라 함), NBD-PE를 각각 0.05:2:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 형광 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 형광 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.

실시예 16. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 독소루비신이 함유된 음이온성 리포좀의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, PC, CHEMS를 각각 0.05:2:1 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 음이온성 리포좀을 제조하였다. 여기에 양전하로 하전 된 독소루비신(doxorubicin, Sigma, USA) 100 μg을 혼합하여 음이온성 리포좀 표면에 정전기적으로 결합시킨 다음, 리포좀에 함유되지 않고 남아있는 독소루비신은 PD-10 Column(GE healthcare, UK)을 사용하여 제거하였다. 얻어진 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 독소루비신 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 17. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 형광 지질이 함유된 음이온성 리포좀의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, PC, 음하전 지질인 bovine heart cardiolipin (Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'CA'라 함), 콜레스테롤과 형광 표지를 위한NBD-PE를 각각 0.05:1:0.5:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 형광 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 형광 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.

실시예 18. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 파클리탁셀이 함유된 음이온성 리포좀의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, PC, CA, 콜레스테롤과 항암제인 파클리탁셀을 각각 0.05:1:0.5:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 파클리탁셀 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 파클리탁셀 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.

실시예 19. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 형광 지질을 함유하는 양이온성 리포좀 (cationic liposome)의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, 양하전 지질인 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸 설페이트(Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'DOTAP'이라 함), 중성 지질인 L-알파-디올레오일 포스파티딜에탄올아민(Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'DOPE'라 함)와 형광 표지를 위한 NBD-PE를 각각 0.05:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 인테그린 aVb3 표적을 위한 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 20. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 함유하는 양이온성 리포좀의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, DOTAP, DOPE를 각각 몰비 0.05:1:1의 비율로 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하고 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 21. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 형광 지질을 함유하는 양이온성 리포좀의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, 양하전 지질인 콜레스테릴-3(베타)N-디메틸 아미노에틸(Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'DC-chol'이라 함), DOPE와 형광 표지를 위한 NBD-PE를 각각 0.05:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 인테그린 aVb3 표적을 위한 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 22. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 함유하는 양이온성 리포좀의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, DC-chol, DOPE를 각각 몰비 0.05:1:1의 비율로 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하고 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 23. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 형광 지질을 함유하는 양이온성 리포좀의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, 양하전 지질인 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'DOEPC'라 함), DOPE와 형광 표지를 위한 NBD-PE를 각각 0.05:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 인테그린 aVb3 표적을 위한 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 24. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 함유하는 양이온성 리포좀의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, DOEPC, DOPE를 각각 몰비 0.05:1:1의 비율로 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하고 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 25. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 형광 지질을 함유하는 중성 리포좀 (neutral liposome)의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, PC, 콜레스테롤과 형광 표지를 위한 NBD-PE를 각각 0.05:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 인테그린 표적을 위한 중성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 중성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 26. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 파클리탁셀을 함유하는 중성 리포좀의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, DOPE, 콜레스테롤과 파클리탁셀을 각각 0.05:1:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 인테그린 표적을 위한 중성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 파클리탁셀 함유 중성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 27. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 파클리탁셀을 함유하는 중성 리포좀의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 'DPPC'라 함), 콜레스테롤과 파클리탁셀을 각각 0.05:1:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 인테그린 표적을 위한 중성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 파클리탁셀 함유 중성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 28. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 형광 지질을 함유하는 에멀젼(emulsion)의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, 계면활성제인 Tween 80, NBD-PE를 각각 0.05:1:0.025μmole씩 취하여 유리 격막 바이알에 혼합한 다음 스쿠알렌(squalene, Sigma, USA) 100 μl와 인산완충용액 1 ml을 첨가하고 3분 동안 초음파 발생기를 사용하여 인테그린 표적을 위한 에멀젼을 제조하였다. 얻어진 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 에멀젼은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 29. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 형광 지질을 함유하는 미셀 (micelle) 나노입자 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, 계면활성제인 Tween 20, NBD-PE를 각각 0.05:1:0.025 μmole씩 취하여 유리 격막 바이알에 혼합한 다음 인산완충용액 1 ml을 첨가하고 3분 동안 초음파 발생기를 사용하여 인테그린 표적을 위한 미셀을 제조하였다. 얻어진 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 미셀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 30. 실시예 1의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 형광 지질을 함유하는 고형 지질나노입자 (solid lipid nanoparticles)의 제조

실시예 1에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, 계면활성제인 Twenn 20, Tween 80, NBD-PE, 라우릭산(lauric acid, Sigma, USA)을 각각 0.05:10:10:0.025:100 μmole씩 취하여 유리 격막 바이알에 혼합한 다음 70 ℃에서 완전히 용융시킨 후 70 ℃의 인산완충용액 1 ml을 첨가하고 5분 동안 초음파 발생기를 사용하여 고형 지질나노입자를 제조하였다. 얻어진 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 고형지질나노입자는 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 31. 실시예 2의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 형광 지질이 함유된 음이온성 리포좀의 제조

실시예 2에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, PC, PG, 콜레스테롤과 형광 표지를 위한NBD-PE를 각각 0.05:1:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 형광 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 형광 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.

실시예 32. 실시예 3의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 형광 지질이 함유된 음이온성 리포좀의 제조

실시예 3에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, PC, CHEMS와 형광 표지를 위한NBD-PE를 각각 0.05:2:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 형광 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 형광 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.

실시예 33. 실시예 4의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 형광 지질이 함유된 음이온성 리포좀의 제조

실시예 4에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, PC, CA, 콜레스테롤과 형광 표지를 위한NBD-PE를 각각 0.05:1:0.5:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 형광 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 형광 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.

실시예 34. 실시예 5의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 함유하는 양이온성 리포좀의 제조

실시예 5에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, DOTAP, DOPE를 각각 몰비 0.05:1:1의 비율로 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하고 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 35. 실시예 6의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 함유하는 양이온성 리포좀의 제조

실시예 6에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, DC-chol, DOPE를 각각 몰비 0.05:1:1의 비율로 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하고 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 36. 실시예 7의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 함유하는 양이온성 리포좀의 제조

실시예 7에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, DOEPC, DOPE를 각각 몰비 0.05:1:1의 비율로 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하고 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 37. 실시예 8의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 파클리탁셀을 함유하는 중성 리포좀의 제조

실시예 8에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, PC, 콜레스테롤과 파클리탁셀을 각각 0.05:1:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 인테그린 표적을 위한 중성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 파클리탁셀 함유 중성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 38. 실시예 9의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 파클리탁셀을 함유하는 중성 리포좀의 제조

실시예 9에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, DOPE, 콜레스테롤과 파클리탁셀을 각각 0.05:1:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 인테그린 표적을 위한 중성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 파클리탁셀 함유 중성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 39. 실시예 10의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 형광 지질을 함유하는 에멀젼(emulsion)의 제조

실시예 10에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, 계면활성제인 Tween 80, NBD-PE를 각각 0.05:1:0.025μmole씩 취하여 유리 격막 바이알에 혼합한 다음 스쿠알렌(squalene, Sigma, USA) 100 μl와 인산완충용액 1 ml을 첨가하고 3분 동안 초음파 발생기를 사용하여 인테그린 표적을 위한 에멀젼을 제조하였다. 얻어진 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 에멀젼은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 40. 실시예 11의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 형광 지질을 함유하는 미셀 (micelle) 나노입자 제조

실시예 11에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, 계면활성제인 Tween 20, NBD-PE를 각각 0.05:1:0.025 μmole씩 취하여 유리 격막 바이알에 혼합한 다음 인산완충용액 1 ml을 첨가하고 3분 동안 초음파 발생기를 사용하여 인테그린 표적을 위한 미셀을 제조하였다. 얻어진 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 미셀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

실시예 41. 실시예 12의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 및 형광 지질을 함유하는 고형 지질나노입자 (solid lipid nanoparticles)의 제조

실시예 12에서 제조한 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체, 계면활성제인 Twenn 20, Tween 80, NBD-PE, 라우릭산(lauric acid, Sigma, USA)을 각각 0.05:10:10:0.025:100 μmole씩 취하여 유리 격막 바이알에 혼합한 다음 70 ℃에서 완전히 용융시킨 후 70 ℃의 인산완충용액 1 ml을 첨가하고 5분 동안 초음파 발생기를 사용하여 고형 지질나노입자를 제조하였다. 얻어진 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체 함유 고형지질나노입자는 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

비교예 1. 형광 지질을 함유하는 음이온성 리포좀의 제조

폴리에틸렌 글리콜 사슬의 분자량이 2000인 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 mPEG-DSPE라 함.), PC, PG, 콜레스테롤과 형광 표지를 위한 지질인 NBD-PE를 각각 0.1:1:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 형광 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

비교예 2. 형광 지질을 함유하는 음이온성 리포좀의 제조

폴리에틸렌 글리콜 사슬의 분자량이 2000인 mPEG-DSPE, PC, CHEMS와 형광 표지를 위한 지질인 NBD-PE를 각각 0.05:2:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 형광 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

비교예 3. 파클리탁셀을 봉입한 음이온성 리포좀의 제조

폴리에틸렌 글리콜 사슬의 분자량이 2000인 mPEG-DSPE, PC, CA, 콜레스테롤과 파클리탁셀을 각각 0.05:1:0.5:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 파클리탁셀 함유 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

비교예 4. 독소루비신이 봉입된 음이온성 리포좀의 제조

mPEG-DSPE, PC, PG, 콜레스테롤을 각각 0.05:1:1:1 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 음이온성 리포좀을 제조하였다. 여기에 양전하로 하전 된 독소루비신(doxorubicin, Sigma, USA) 100 μg을 혼합하여 음이온성 리포좀 표면에 정전기적으로 결합시킨 다음, 리포좀에 함유되지 않고 남아있는 독소루비신은 PD-10 Column(GE healthcare, UK)을 사용하여 제거하였다. 얻어진 독소루비신 함유 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

비교예5. 양이온성 리포좀의 제조

mPEG-DSPE, 양하전 지질인 DOTAP, 중성 지질인DOPE를 각각 0.05:1:1 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 19와 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

비교예 6. 형광 지질을 함유하는 양이온성 리포좀의 제조

mPEG-DSPE, DC-chol, DOPE와 형광 표지된 지질인NBD-PE를 각각 0.05:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 21와 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 형광 지질 함유 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

비교예 7. 형광 지질을 함유하는 중성 리포좀의 제조

mPEG-DSPE, PC, 콜레스테롤과 형광 표지를 위한 NBD-PE를 각각 0.05:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 25와 동일한 방법으로 중성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 형광 지질 함유 중성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

비교예 8. 파클리탁셀을 봉입한 중성 리포좀의 제조

mPEG-DSPE, DPPC, 콜레스테롤과 파클리탁셀을 각각 0.05:1:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 27과 동일한 방법으로 중성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 파클리탁셀 봉입 중성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

비교예 9. 형광 지질을 함유하는 미셀 (micelle) 나노입자 제조

mPEG-DSPE, 계면활성제인 Tween 20, NBD-PE를 각각 0.05:1:0.025 μmole씩 취하여 유리 격막 바이알에 혼합한 다음 인산완충용액 1 ml을 첨가하고 3분 동안 초음파 발생기를 사용하여 형광 지질을 함유하는 미셀을 제조하였다. 얻어진 형광 미셀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

비교예 10. 형광 지질을 함유하는 음이온성 리포좀의 제조

PC, PG, 콜레스테롤과 NBD-PE를 각각 1:1:1:0.025 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 형광 지질을 함유하는 음이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 형광 지질 함유 음이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

비교예 11. 양이온성 리포좀의 제조

DOEPC, DOPE 를 각각 1:1 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 23과 동일한 방법으로 양이온성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 양이온성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

비교예 12. 파클리탁셀을 봉입한 중성 리포좀의 제조

DPPC, 콜레스테롤과 파클리탁셀을 각각 1:1:0.02 μmole씩 취하여 1 ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10 ml 유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 실시예 13과 동일한 방법으로 중성 리포좀을 제조하였다. 얻어진 파클리탁셀 봉입 중성 리포좀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

비교예 13. 형광 지질을 함유하는 미셀 (micelle) 나노입자 제조

계면활성제인 Tween 20, NBD-PE를 각각 1:0.025 μmole씩 취하여 유리 격막 바이알에 혼합한 다음 인산완충용액 1 ml을 첨가하고 3분 동안 초음파 발생기를 사용하여 미셀을 제조하였다. 얻어진 미셀은 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

비교예 14. 형광 지질을 함유하는 고형 지질나노입자 (solid lipid nanoparticles)의 제조

계면활성제인 Twenn 20, Tween 80, NBD-PE, 라우릭산(lauric acid, Sigma, USA)을 각각 10:10:0.025:100 μmole씩 취하여 유리 격막 바이알에 혼합한 다음 70 ℃에서 완전히 용융시킨 후 70 ℃의 인산완충용액 1 ml을 첨가하고 5분 동안 초음파 발생기를 사용하여 고형 지질나노입자를 제조하였다. 얻어진 고형지질나노입자는 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.

[실험예]

세포 배양

사람의 흑색종 세포인 WM 266.4 및 A375 세포주, 유방암 유래 MDA-MB-231 세포주는 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 사람 지방유래 줄기세포 ASC(Adipose derived stem cell), 각막윤부줄기세포 LESPC(Limbal epithelial side population cells), 각막기질 줄기세포 CSSC(Corneal stromal stem cells) 및 조혈모줄기세포 (HSC, Hematopoietic stem cells)는 아산병원(김승후 박사님 연구실)에서 기부받아 사용하였다. A375 세포주, ASC, LESPC, HSC및 CSSC 세포는 DMEM(Dulbecco's modified eagles medium, Gibco, USA), WM 266.4 및 MDA-MB-231 세포주는 MEM(Minimum Essential Medium, Gibco, USA)에 10% 우태아 혈청 w/v (HyClone laboratories Inc, USA)와 100 unit/ml 페니실린 또는 100㎍/ml 스트렙토마이신을 포함하여 배양하였다.

실험예 1. 테트락이 결합된 지질을 포함하는 리포좀의 WM 266.4 세포 표면 인테그린 αVβ3 인지능 측정 : FACS 분석

인테그린 αVβ3를 과발현하는 것으로 알려진 사람 흑색종 WM 266.4 세포주를 실험 전날 12웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵ 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60~70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 1과 2의 형광지질 함유 음이온성 리포좀, 실시예 13, 15 와 17의 테트락이 표면수식된 인테그린 αVβ3표적형 형광 음이온성 리포좀을 각각 첨가한 후 37℃의 CO₂ 배양기에서 30 분 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2 번 세척하였다. 비교예 1, 2 및 실시예 13, 15, 17 에서 사용된 리포좀들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하고 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 αVβ3인지능을 분석하였고, 이를 도 1에 나타내었다.

도 1A 의 세포에서 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도 1B는 비교예 1의 음이온성 리포좀, 도 1C는 비교예 2의 조성이 다른 음이온성 리포좀, 도 1D는 실시예 13의 테트락이 표면수식된 음이온성 리포좀, 도 1E는 실시예 15의 조성이 다른 음이온성 리포좀, 도 1F는 실시예 17의 테트락이 표면 결합된 조성이 다른 음이온성 리포좀을 처리한 세포군으로 도 1B는 32.85 %, 도 1C는 35.03 %의 세포를 리포좀이 인지하여 결합한 반면, 본 발명의 실시예 13의 인테그린 αVβ3 인지형 테트락 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 98.99 % 를 나타내어 비교예 1의 음이온성 리포좀 처리군에 비하여 세포 표면의 인테그린 αVβ3 인지능이 현저히 증가되었고 조성이 다른 비교예 2의 음이온성 리포좀 보다도 65 % 이상 증가되었음을 알 수 있다.

실험예 2. 테트락이 결합된 지질을 포함하는 리포좀의 WM 266.4 세포 표면 인테그린 αVβ3 인지능 관찰 : 형광 현미경 이미지 분석

인테그린 αVβ3를 과발현하는 것으로 알려진 사람 흑색종 WM 266.4 세포주를 실험 전날 12웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵ 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60~70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예1과 2의 형광지질 함유 음이온성 리포좀, 실시예 13, 15 와 17의 테트락이 표면수식된 인테그린 αVβ3표적형 형광 음이온성 리포좀을 각각 첨가한 후 37℃의 CO₂ 배양기에서 30 분 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2 번 세척하였다. 비교예 1, 2 및 실시예 13, 15, 17 에서 사용된 리포좀들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 현미경(Leica, DM Il, Germany)을 사용하여 세포 표면의 인테그린 αVβ3 인지능을 분석하였고, 이를 도 2 에 나타내었다.

도 2A 의 세포에서 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 형광이 관찰되지 않았고, 도 2B는 비교예 1의 음이온성 리포좀, 도 2C는 비교예2의 조성이 다른 음이온성 리포좀, 도 2D는 실시예 13의 테트락이 표면수식된 음이온성 리포좀, 도 2E는 실시예 15의 조성이 다른 음이온성 리포좀, 도 2F는 실시예 17의 테트락이 표면 결합된 조성이 다른 음이온성 리포좀을 처리한 세포군으로, 도 2B, 도 2C는 형광이 관찰되지 않았고, 본 발명의 실시예 13의 인테그린 αVβ3 인지형 테트락 리포좀 처리군의 경우 형광이 강하게 발현하였고, 비교예 1의 음이온성 리포좀 처리군에 비하여 세포 표면의 인테그린 αVβ3인지능이 현저히 증가되었고 조성이 다른 비교예 2의 음이온성 리포좀 보다도 형광이 강하게 발현 되었음을 알 수 있다.

실험예 3. 테트락이 결합된 지질을 포함하는 리포좀의 A375 세포 표면 인테그린 αVβ3인지능 측정 : FACS 분석

인테그린 αVβ3를 과발현하는 것으로 알려진 사람 흑색종 A375 세포주를 실험 전날 12웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵ 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60~70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 10의 형광지질 함유 음이온성 리포좀, 실시예 31, 32, 33 의 테트락이 표면수식된 인테그린 αVβ3 표적형 형광 음이온성 리포좀을 각각 첨가한 후 37℃의 CO₂ 배양기에서 30 분 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2 번 세척하였다. 비교예 10 및 실시예 31, 32, 33에서 사용된 리포좀들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하고 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 αVβ3 인지능을 분석하였고, 이를 도 3에 나타내었다.

도 3A 의 세포에서 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도 3B는 비교예 10의 음이온성 리포좀, 도 3C는 실시예 31의 테트락이 표면수식된 음이온성 리포좀, 도 3D는 실시예 32의 테트락이 표면수식된 음이온성 리포좀, 도 3E는 실시예 33의 조성이 다른 음이온성 리포좀을 처리한 세포군으로 도 3B는 18.55 % 의 세포를 리포좀이 인지하여 결합한 반면, 본 발명의 실시예 31, 32 및 33의 인테그린 αVβ3 인지형 테트락 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 각각 94.03 %, 91.19 % 및 96.94 % 를 나타내어 비교예 10의 음이온성 리포좀 처리군에 비하여 세포 표면의 인테그린 αVβ3 인지능이 현저히 증가되었다. 또한 조성이 다른 테트락이 표면수식된 음이온성 리포좀 처리군에서도 모두 60 % 이상 증가되었음을 알 수 있다.

실험예 4. 테트락이 결합된 지질을 포함하는 리포좀의 MDA-MB-231 세포 표면 인테그린 αVβ3 인지능 측정 : FACS 분석

인테그린 αVβ3 를 과발현하는 것으로 알려진 사람 유방암 유리 MDA-MB-231 세포주를 실험 전날 12웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵ 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60~70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 6의 형광지질 함유 양이온성 리포좀, 실시예 19, 21, 23 의 테트락이 표면수식된 인테그린 αVβ3 표적형 형광 양이온성 리포좀을 각각 첨가한 후 37℃의 CO₂ 배양기에서 30 분 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2 번 세척하였다. 비교예 6 및 실시예 19, 21, 23 에서 사용된 리포좀들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하고 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 αVβ3 인지능을 분석하였고 이를 도 4에 나타내었다.

도 4A 의 세포에서 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도 4B는 비교예 6의 양이온성 리포좀, 도 4C는 실시예 19의 테트락이 표면수식된 양이온성 리포좀, 도 4D는 실시예 21의 테트락이 표면수식된 양이온성 리포좀, 도 4E는 실시예 23의 조성이 다른 양이온성 리포좀을 처리한 세포군으로 도 4B는 3.21 % 의 세포를 리포좀이 인지하여 결합한 반면, 본 발명의 실시예 19, 21 및 23의 인테그린 αVβ3 인지형 테트락 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 각각 91.47 %, 93.12 % 및 97.37 % 를 나타내어 비교예 6의 양이온성 리포좀 처리군에 비하여 세포 표면의 인테그린 αVβ3 인지능이 현저히 증가되었고 조성이 다른 테트락이 표면수식된 양이온성 리포좀 처리군에서 평균 90 % 이상 증가되었음을 알 수 있다.

실험예 5. 테트락이 결합된 지질을 포함하는 리포좀의 ASC 세포 표면 인테그린 αVβ3 인지능 측정 : FACS 분석

인테그린 αVβ3를 과발현하는 것으로 알려진 사람의 지방유래 줄기세포인 ASC 세포를 실험 전날 12웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵ 개씩 분주(seeding)하였다. 플레이트의 세포가 60~70 % 정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 7의 형광지질 함유 중성 리포좀, 실시예 25 의 테트락이 표면수식된 인테그린 αVβ3 표적형 형광 중성 리포좀을 각각 첨가한 후 37℃의 CO₂ 배양기에서 30 분 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2 번 세척하였다. 비교예 7 및 실시예 25 에서 사용된 리포좀들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하고 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 αVβ3 인지능을 분석하였고, 이를 도 6 에 그래프로 나타내었다.

도 5의 세포에서 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 비교예 7의 중성 리포좀과 실시예 25의 테트락이 표면수식된 중성 리포좀을 세포에 처리하였다. 인테그린 αVβ3를 과발현하는 ASC 세포에서는 비교예 7의 중성 리포좀 처리군에서 16.8 %, 실시예 25의 처리군에서 79.46 % 를 나타내었다.

실험예 6. 테트락이 결합된 지질을 포함하는 에멀젼, 미셀 및 고형 지질 나노입자의 LESPC 세포 표면 인테그린 αVβ3 인지능 측정 : FACS 분석

인테그린 αVβ3를 과발현하는 것으로 알려진 토끼 각막윤부 추출 줄기세포인 LESPC 세포를 실험 전날 12웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵ 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60~70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 8의 형광지질 함유 미셀, 실시예 28, 29, 30 의 테트락으로 표면이 수식된 인테그린 αVβ3 표적형 형광 에멀젼, 미셀 및 고형 지질 나노입자를 각각 첨가한 후 37℃의 CO₂ 배양기에서 30 분 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2 번 세척하였다. 비교예 8및 실시예 28, 29, 30 에서 사용된 에멀젼, 미셀 및 고형 지질 나노입자들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하고 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 αVβ3 인지능을 분석하였고, 이를 도 6에 나타내었다.

도 6A 의 세포에서 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도 6B 는 비교예 8 의 미셀, 도 7C 는 실시예 28의 테트락이 표면수식된 에멀젼, 도 6D 는 실시예 29의 테트락이 표면수식된 미셀, 도 6E는 실시예 30 의 테트락의 지질을 포함하는 고형 지질 나노입자를 처리한 세포군으로 도 6B 는 9.56 %를 나타낸 반면, 테트락으로 표면 수식된 형광표지 에멀젼이 세포 표면의 인테그린 αVβ3를 인지하여 결합하여 이러한 결과를 확인하였으며, 본 발명의 실시예 28, 29 및 30의 인테그린 αVβ3 인지형 테트락 에머젼, 미셀 및 고형 지질 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 각각77.99 %, 87.43 % 및 96.22 % 를 나타내어 비교예 8의 미셀 처리군에 비하여 세포 표면의 인테그린 αVβ3 인지능이 현저히 증가되었고 실시예 28, 29 및 30에 따른 조성이 다른 테트락이 표면수식된 에멀젼, 미셀 및 고형 지질 나노입자 처리군에서도 평균 80 % 이상 증가되었음을 알 수 있다.

실험예 7. 테트락이 결합된 지질을 포함하는 에멀젼, 미셀 및 고형 지질 나노입자의 HSC 세포 표면 인테그린 αVβ3 인지능 측정 : FACS 분석

인테그린 αVβ3를 과발현하는 것으로 알려진 사람의 조혈모줄기세포인 HSC 세포를 실험 전날 12웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵ 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60~70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 13, 14 의 형광 지질 함유 에멀젼, 미셀 및 고형 지질 나노입자, 실시예 39, 40, 41 의 테트락이 표면수식된 인테그린 αVβ3 표적형 형광 에멀젼, 미셀 및 고형 지질 나노입자를 각각 첨가한 후 37℃의 CO₂ 배양기에서 30 분 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2 번 세척하였다. 비교예 13, 14및 실시예 39, 40, 41 에서 사용된 에멀젼, 미셀 및 고형 지질 나노입자들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하고 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 αVβ3 인지능을 분석하였고 이를 도 7에 나타내었다.

도 7A 의 세포에서 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도 7B 및 7C 는 비교예 13 및 14의 형광 지질 함유 에멀젼 및 고형 지질 나노입자, 도 7D 실시예 39의 테트락이 표면수식된 에멀젼, 도 7E 는 실시예 40의 테트락이 표면수식된 미셀 및 도 7F 는 실시예 41의 테트락이 표면 수식된 고형 지질 나노입자를 처리한 세포군으로, 도 7B는 1.86 %, 도 7C는 19.00 % 의 세포를 리포좀이 인지하여 결합한 반면, 도 7D는 47.61 %, 도 7E는 68.57 % 및 도7F 72.80 % 로 나타났다. 본 발명의 실시예 39, 40, 41의 인테그린 αVβ3 인지형 테트락 에멀젼, 미셀 및 고형 지질 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 평균 70 % 를 나타내어 비교예 13 및 14의 에멀젼 및 고형 지질 나노입자 처리군에 비하여 세포 표면의 인테그린 αVβ3 인지능이 현저히 증가되었고 실시예 39, 40 및 41 에 따른 조성이 다른 테트락이 표면수식된 에멀젼, 미셀 및 고형 지질 나노입자 처리군에서도 평균 55 % 이상 증가되었음을 알 수 있다.

실험예 8. 테트락이 결합된 지질을 포함하는 리포좀의 ASC 세포 표면 인테그린 αVβ3 인지능 측정 : FACS 분석

인테그린 αVβ3를 과발현하는 것으로 알려진 사람의 지방유래 줄기세포인 ASC 세포를 실험 전날 12웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵ 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60~70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 5 의 양이온성 리포좀, 실시예 20, 22, 24 의 테트락이 표면수식된 인테그린 αVβ3 표적형 양이온성 리포좀과, 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ml씩을 넣고 형광 마커로 표지된 리보핵산 물질인 Block-IT(Invitrogen, 미국) 10 pmole씩을 각각 첨가하였다. 20분 후 각각 세포에 처리하여 37℃의 CO₂ 배양기에서 6 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2 번 세척하였다. 비교예 5 및 실시예 20, 22, 24 에서 사용된 리포좀에 의해 형광 siRNA인 Block-IT 를 세포내에 전달함으로써 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하고 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 αVβ3 인지능을 분석하였고, 이를 도 8에 나타내었다.

도 8A의 세포에서 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도 8B는 비교예 5 의 양이온성 리포좀, 도 8C, 8D 및 8E는 실시예 20, 32 및 34의 테트락이 표면수식된 양이온성 리포좀을 처리한 세포군으로 도 8B는 15.86 % 의 세포에 양이온성 리포좀과 형광표지된 리보핵산물질이 전달된 반면, 본 발명의 실시예 20, 22 및 24의 인테그린 αVβ3 인지형 테트락 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 리보핵산 물질이 세포에 전달된 비율이 각각 85.66 %, 80.67 % 및 92.48 % 를 나타내어 비교예 5 의 양이온성 리포좀 처리군에 비하여 세포 표면의 인테그린 αVβ3 인지능에 의해 형광표지된 리보핵산물질의 전달효율이 현저히 증가되었음을 알 수 있다.

실험예 9. 테트락이 결합된 지질을 포함하는 리포좀의 CSSC 세포 표면 인테그린 αVβ3 인지능 측정 : FACS 분석

인테그린 αVβ3를 과발현하는 것으로 알려진 토끼의 각막기질 줄기세포 CSSC세포를 실험 전날 12웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵ 개씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60~70 %정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 11 의 양이온성 리포좀, 실시예 34, 35, 36 의 테트락이 표면수식된 인테그린 αVβ3 표적형 양이온성 리포좀과, 혈청이 포함되지 않은 배지 50 ml씩을 넣고 형광 마커로 표지된 리보핵산 물질인 Block-IT(Invitrogen, 미국) 10 pmole씩을 각각 첨가하였다. 20분 후 각각 세포에 처리하여 37℃의 CO₂ 배양기에서 6 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2 번 세척하였다. 비교예 11 및 실시예 34, 35, 36 에서 사용된 리포좀들에 의해 형광 siRNA를 세포내로 전달함으로써 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR(BD Bioscience, USA)를 사용하고 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 αVβ3 인지능을 분석하였고, 이를 도 9에 나타내었다.

도9A의 세포에서 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 도 9B는 비교예 11 의 양이온성 리포좀, 도 9C, 9D 및 9E는 실시예 34, 35 및 36의 테트락이 표면수식된 양이온성 리포좀을 처리한 세포군으로 도 9B는 47.57 % 의 세포에 양이온성 리포좀과 형광표지된 리보핵산물질이 전달된 반면, 본 발명의 실시예 34, 35 및 36의 인테그린 αVβ3 인지형 테트락 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 리보핵산 물질이 세포에 전달된 비율이 각각 80.27 %, 78.29 % 및 83.19 % 를 나타내어 비교예 11 의 양이온성 리포좀 처리군에 비하여 세포 표면의 인테그린 αVβ3 인지능에 의해 형광표지된 리보핵산물질의 전달효율이 현저히 증가되었음을 알 수 있다.

실험예 10. 테트락이 결합된 지질을 포함한 파클리탁셀 리포좀의 항암 효능 평가 : MTT 분석

본 발명의 테트락이 비공유 결합된 지질을 포함하는 파클리탁셀 리포좀의 표적세포 내 항암제 전달 효율에 관한 평가를 하기 위하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다. 인테그린 αVβ3를 과발현하는 것으로 알려진 WM 266.4 세포에 비교예 3 의 파클리탁셀이 봉입된 음이온성 리포좀과 비교예 8 의 파클리탁셀 중성 리포좀, 실시예 14 와 18의 테트락이 결합된 지질을 포함하는 파클리탁셀 음이온성 리포좀과 실시예 26과 27의 테트락이 결합된 지질을 포함하는 파클리탁셀 중성 리포좀을 각각 처리하고 세포 내로 전달된 항암제에 의한 암세포의 생존율을 평가하였다. 항암 효능은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 시약에 의한 방법으로 세포 생존율을 측정하여 평가하였다.

세포를 웰 당 3×10⁴ 세포가 되도록 48 웰(well)에 분주(seeding)하고 24시간 배양한 후 비교예 3의 파클리탁셀이 봉입된 음이온성 리포좀, 비교예 8의 파클리탁셀 중성 리포좀, 실시예 14와 18의 테트락이 결합된 지질을 포함하는 파클리탁셀 음이온성 리포좀, 실시예 26과 27의 테트락이 비공유 결합된 지질을 포함하는 중성 리포좀을 각각 10 μl를 각각 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 MTT 용액(Sigma, USA)을 배지의 10%가 되도록 가하고, 2시간 더 배양한 다음 상층액을 제거하고 0.04 N 염산 이소프로판올 용액을 첨가한 후에 엘라이져 리더 (ELISA reader, Sunrise-Basic TECAN, Mannnedorf, Switzerland)를 이용하여 570 nm에서 그 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다. 도 10은 상기의 파클리탁셀이 봉입된 리포좀 제형들의 항암 효능을 평가한 결과로 비교예 3의 파클리탁셀 함유 음이온성 리포좀이나 비교예 8의 파클리탁셀함유 중성 리포좀보다 실시예 14, 18 및 26, 27의 테트락이 표면에 표지된 파클리탁셀 리포좀 조성이 더 증강된 암세포 사멸효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 이러한 도10의 항암 효능 결과로부터 실시예 14, 18, 26 및 27의 테트락이 표면에 표지된 결합된 파클리탁셀 리포좀의 경우 인테그린 αVβ3를 세포 표면에 발현하는 WM 266.4 세포주에 보다 효과적으로 결합하여 파클리탁셀을 암세포내로 전달하여 증강된 항암 효능을 나타내는 것을 추론할 수 있다.

실험예 11. 테트락이 결합된 지질을 포함한 파클리탁셀 리포좀의 항암 효능 평가 : MTT 분석

본 발명의 테트락이 결합된 지질을 포함하는 음이온성 리포좀과 독소루비신의 혼합물과 파클리탁셀 봉입한 중성 리포좀의 표적세포 내 항암제 전달 효율에 관한 평가를 하기 위하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다. 인테그린 αVβ3를 과발현하는 것으로 알려진 A375 세포에 비교예 4 의 음이온성 리포좀과 독소루비신의 혼합물, 비교예 12 의 파클리탁셀 봉입한 중성 리포좀과, 실시예 16의 테트락이 결합된 지질을 포함하는 음이온성 리포좀과 독소루비신의 혼합물과, 실시예 37 및 38의 테트락이 결합된 지질을 포함하는 파클리탁셀 중성 리포좀을 각각 처리하고 세포 내로 전달된 항암제에 의한 암세포의 생존율을 평가하였다. 항암 효능은 3-(4,5-디메틸thiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 시약에 의한 방법으로 세포 생존율을 측정하여 평가하였다.

세포를 웰 당 3×10⁴ 세포가 되도록 48 웰(well)에 분주 (seeding)하고 24시간 배양한 후 비교예 4의 독소루비신이 로딩된 음이온성 리포좀, 비교예 13의 파클리탁셀 중성 리포좀 및 실시예 16 의 테트락이 결합된 지질을 포함하는 음이온성 리포좀과 독소루비신의 혼합물, 실시예 37 및 38의 테트락이 표면에 표지된 지질을 포함하는 파클리탁셀 중성 리포좀을 각각 10 μl를 각각 웰 플레이트에 첨가하여 37℃의 CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 MTT 용액(Sigma, USA)을 배지의 10%가 되도록 가하고, 2시간 더 배양한 다음 상층액을 제거하고 0.04 N 염산 이소프로판올 용액을 첨가한 후에 엘라이져 리더 (ELISA reader, Sunrise-Basic TECAN, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 570 nm에서 그 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다. 도 11은 상기의 파클리탁셀이 봉입된 리포좀 제형들의 항암 효능을 평가한 결과로 비교예 4의 독소루비신 함유 음이온성 리포좀이나 비교예 12의 파클리탁셀 리포좀 보다 실시예 16이나 37 및 38의 테트락이 결합된 독소루비신 함유 음이온성 리포좀이나 파클리탁셀 함유 중성 리포좀 조성이 더 감소된 암세포 사멸효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 도 11의 항암 효능 결과로부터 실시예 16, 37 및 38의 테트락이 표면에 표적을 포함하는 음이온성 리포좀과 독소루비신 혼합한 물질과 파클리탁셀 함유 리포좀의 경우 인테그린 αVβ3를 세포 표면에 과발현하는 A375 세포주에 보다 효과적으로 결합하여 독소루비신 및 파클리탁셀을 암세포내로 전달하여 증강된 항암 효능을 나타내는 것을 추론할 수 있다.

실험예 12. 테트락이 결합된 지질을 포함하는 양하전 리포좀의 작은간섭 리보핵산 전달 효능 평가: 역전사 효소 중합 반응에 의한 mRNA 분석

인테그린 αVβ3을 세포 표면에 과발현하는 것으로 알려진 WM 266.4 세포주를 실험 전날 12 웰 플레이트에 웰 당 세포를 2×10⁵씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 에펜도르프 튜브에 서바이빈 유전자 발현을 선택적으로 억제하는 siRNA (siSurvivin) 20 pmole 과 비교예 5의 리간드가 결합되지 않은 양이온성 리포좀 10 μl, 실시예 20 및 24의 테트락이 선택적으로 비공유 결합된 양이온성 리포좀을 각각 첨가하였다. 서바이빈 (survivin) 유전자(Gene bank accession number: NM_001168)의 발현 억제를 유도하기 위한 siRNA는 삼천리제약 (Samchully Pharmaceuticals, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 미디어에 포함된 siRNA의 최종 농도는 50 nM이 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하고 이렇게 제조된 리포좀과 작은간섭 리보핵산의 복합체를 각각 웰 플레이트에 첨가하여 37℃의 CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 트리졸 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포내에 존재하는 전체 리보핵산 (RNA)을 분리하였으며, 이 RNA는 AccuPowerRT PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA로 역전사 하였다. 중합효소연쇄반응은 95℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성화시킨 후, 95℃/1분; 57℃/1분; 및 72℃/1분을 한 사이클로 하여 최종 30회 반복한 다음, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시키는 조건으로 수행하였다. 서바이빈(survivin)에 특이적인 프라이머의 서열은 5'-GGACCACCGCATCTCTACAT-3'(정방향), 5'-CTTTCTCCGCAGTTTCCTCA-3'(역방향)이며 중합효소연쇄반응 생성물의 크기는 347 염기쌍이었다. 서바이빈(survivin) 유전자 발현의 정도는 1 % 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 서바이빈 특이적인 연쇄반응 생성물의 밴드 밀도를 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 증폭하여 나타나는 밴드 밀도로 보정하여 정량적인 발현의 변화를 측정하였다.

도 12는 각각의 조성을 처리한 경우 WM 266.4 세포내에서 타겟 유전자인 서바이빈의 전사체 발현을 밴드의 밀도로 비교한 것이다. 대조군은 서바이빈 특이적인 작은간섭 리보핵산이 세포 내로 전달되지 않아 서바이빈 유전자의 발현에 변화가 없었고, 비교예 5의 리간드가 존재하지 않는 양이온성 리포좀과 리보핵산의 복합체 처리군, 실시예 20 및 24의 테트락이 결합한 지질을 포함하는 양이온성 리포좀과 서바이빈 특이적 작은간섭 리보핵산의 복합체 처리군의 경우 세포 내에서 서바이빈 유전자 발현이 현저히 억제되었다. 실시예 20 및 24에서 서바이빈 유전자의 mRNA 수준의 발현 억제능이 가장 증가한 것은 테트락이 비공유 결합된 지질을 포함하는 리포좀 표면에서 테트락이 세포 표면의 인테그린 αVβ3에 의해 세포내로 서바이빈 특이적인 작은간섭 리보핵산을 전달하는 효율이 증가한 결과 나타나는 현상으로 해석된다.

실험예 13. 테트락이 결합된 지질을 포함하는 양하전 리포좀의 작은간섭 리보핵산 전달 효능 평가: 역전사 효소 중합 반응에 의한 mRNA 분석

인테그린 αVβ3을 세포 표면에 과발현하는 것으로 알려진 A375 세포주를 실험 전날 12 웰 플레이트에 웰 당 세포를 2×10⁵씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 에펜도르프 튜브에 서바이빈 유전자 발현을 선택적으로 억제하는 siRNA (siSurvivin) 20 pmole 과 비교예 11의 리간드가 결합되지 않은 양이온성 리포좀 10 μl, 실시예 35 및 36의 테트락이 선택적으로 비공유 결합된 양이온성 리포좀을 각각 첨가하였다. 서바이빈 (survivin) 유전자(Gene bank accession number: NM_001168)의 발현 억제를 유도하기 위한 siRNA는 삼천리제약 (Samchully Pharmaceuticals, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 미디어에 포함된 siRNA의 최종 농도는 50 nM이 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하고 이렇게 제조된 리포좀과 작은간섭 리보핵산의 복합체를 각각 웰 플레이트에 첨가하여 37℃의 CO₂세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 트리졸 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포내에 존재하는 전체 리보핵산 (RNA)을 분리하였으며, 이 RNA는 AccuPowerRT PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA로 역전사 하였다. 중합효소연쇄반응은 95℃에서 5분간 주형 DNA를 전변성화시킨 후, 95℃/1분; 57℃/1분; 및 72℃/1분을 한 사이클로 하여 최종 30회 반복한 다음, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시키는 조건으로 수행하였다. 서바이빈(survivin)에 특이적인 프라이머의 서열은 5'-GGACCACCGCATCTCTACAT-3'(정방향), 5'-CTTTCTCCGCAGTTTCCTCA-3'(역방향)이며 중합효소연쇄반응 생성물의 크기는 347 염기쌍이었다. 서바이빈(survivin) 유전자 발현의 정도는 1 % 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 서바이빈 특이적인 연쇄반응 생성물의 밴드 밀도를 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 증폭하여 나타나는 밴드 밀도로 보정하여 정량적인 발현의 변화를 측정하였다.

도 13은 각각의 조성을 처리한 경우 A375 세포내에서 타겟 유전자인 서바이빈의 전사체 발현을 밴드의 밀도로 비교한 것이다. 대조군은 서바이빈 특이적인 작은간섭 리보핵산이 세포 내로 전달되지 않아 서바이빈 유전자의 발현에 변화가 없었고, 비교예 11의 리간드가 존재하지 않는 양이온성 리포좀과 리보핵산의 복합체 처리군, 실시예 35 및 36의 테트락이 결합한 지질을 포함하는 양이온성 리포좀과 서바이빈 특이적 작은간섭 리보핵산의 복합체 처리군의 경우 세포 내에서 서바이빈 유전자 발현이 현저히 억제되었다. 실시예 35 및 36에서 서바이빈 유전자의 mRNA 수준의 발현 억제능이 가장 증가한 것은 테트락이 비공유 결합된 지질을 포함하는 리포좀 표면에서 테트락이 세포 표면의 인테그린 αVβ3에 의해 세포내로 서바이빈 특이적인 작은간섭 리보핵산을 전달하는 효율이 증가한 결과 나타나는 현상으로 해석된다.

실험예 14. 테트락이 결합된 지질을 포함하는 양하전 리포좀의 작은간섭 리보핵산 전달 효능 평가: 웨스턴 블랏(Western blot)에 의한 단백질 발현률 확인

인테그린 αVβ3을 세포 표면에 과발현하는 것으로 알려진 WM 266.4 세포주를 실험 전날 6 웰 플레이트에 웰 당 세포를 5×10⁵씩 분주(seeding)하였다. 각 플레이트의 세포가 60-70 %정도 균일하게 성장했을 때, 에펜도르프 튜브에 서바이빈 유전자 발현을 선택적으로 억제하는 siRNA (siSurvivin) 50 pmole 씩과 비교예 11의 리간드가 결합되지 않은 양이온성 리포좀 10 μl, 실시예 35 및 36의 테트락이 결합된 지질을 함유하는 양이온성 리포좀을 각각 첨가하였다. 서바이빈 (survivin) 유전자(Gene bank accession number: NM_001168)의 발현 억제를 유도하기 위한 siRNA는 삼천리제약 (Samchully Pharmaceuticals, Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 미디어에 포함된 siRNA의 최종 농도는 50 nM이 되게 맞추었다. 이들을 서서히 피펫팅(pipetting)하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치하고 이렇게 제조된 리포좀과 작은간섭 리보핵산의 복합체를 각각 웰 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂세포배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후 cell lysis buffer를 사용하여 세포내 존재하는 전체 단백질을 얻었으며, 이 단백질은 BCA 정량법에 의해 단백질의 농도를 측정하였다. 전체 단백질 양이 100 mg이 되도록하고, PBS로 전체 볼륨을 맞춰준 후 5X SDS loading dye(글리세롤, 2-mercaptoethanol)를 섞어 100 ℃에서 10 분간 단백질을 변성시켰다. 10 % SDS-PAGE gel을 이용하여 단백질 전기영동법(SDS-PAGE : Polyacrylamide gel electrophoresis)를 실시하여 단백질을 분리하고, nitrocellulose membrane으로 옮긴 후 서바이빈에 대한 항체(primary antibody : 1/1000 희석)를 4 ℃에서 16 시간동안 처리한다. 그 후 AP(alkaline phosphatase)용 2차 항체(secondary antibody : 1/2000 희석)를 2 시간 동안 처리하고, NBT(nitrobluetetrazolium) 와 BCIP(3-bromo-4-chloro-5-indolyl phosphatage)를 통해 발색을 시킴으로써 단백질의 발현을 확인하였다.

도 14는 각각의 조성을 처리한 경우 WM 266.4 세포내에서 타겟 유전자인 서바이빈의 단백질 발현을 밴드의 밀도로 비교한 것이다. 대조군은 서바이빈 특이적인 작은간섭 리보핵산이 세포 내로 전달되지 않아 서바이빈 단백질의 발현에 변화가 없었고, 비교예 11의 리간드가 존재하지 않는 양이온성 리포좀과 리보핵산의 복합체 처리군, 실시예 35 및 36의 테트락이 결합한 지질을 함유하는 양이온성 리포좀과 서바이빈 특이적 작은간섭 리보핵산의 복합체 처리군의 경우 세포 내에서 서바이빈 단백질 발현이 현저히 억제되었다. 실시예 35 및 36에서 서바이빈 유전자의 단백질 수준의 발현 억제능이 가장 증가한 것은 테트락이 결합된 지질을 함유하는 리포좀 표면에서 테트락이 세포 표면의 인테그린 αVβ3에 의해 세포내로 서바이빈 특이적인 작은간섭 리보핵산을 전달하는 효율이 증가한 결과 나타나는 현상으로 해석된다.

Claims

하기 화학식 1 또는 화학식 2의 구조를 갖는 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체:
[화학식 1]

[화학식 2]

상기 식에서,
R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 탄소수 3 내지 24의 알킬, 또는 탄소수 3 내지 24의 알케닐을 나타내고,
R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 각각 I를 나타내며,
R₇은 OH이고,
X는 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 6의 알킬렌을 나타내며,
Y는 -CH₂-; 아민으로 치환된 -(CH₂)₂-; 또는 -O-CH₂-를 나타내고,
Z는 산소 또는 탄소를 나타내며,
L은
,
, 또는
이고,
n은 1 내지 100의 정수를 나타낸다.
제1항에 있어서,
R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 탄소수 10 내지 24의 알킬, 또는 탄소수 10 내지 24의 알케닐을 나타내고,
R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 각각 I를 나타내며,
R₇은 OH이고,
X는 카복시로 치환되거나 비치환된 -(CH₂)₂-을 나타내며,
Y는 -CH₂-; 아민으로 치환된 -(CH₂)₂-; 또는 -O-CH₂-를 나타내고,
Z는 산소 또는 탄소를 나타내며,
L은
,
, 또는
이고,
n은 1 내지 100의 정수를 나타내는 것인 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체.
제1항에 있어서,
R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 탄소수 10 내지 24의 알킬, 또는 탄소수 10 내지 24의 알케닐을 나타내고,
R₃, R₄, R₅ 및 R₆은 각각 I를 나타내며,
R₇은 OH이고,
X는 카복시로 치환되거나 비치환된 -(CH₂)₂-을 나타내며,
Y는 -CH₂-를 나타내고,
Z는 산소를 나타내며,
L은
,
, 또는
이고,
n은 1 내지 100의 정수를 나타내는 것인 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 포함하는 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자 제조용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 조성물은 양하전 지질, 중성 지질 및 음하전 지질로부터 선택되는 보조 지질을 추가로 포함하는 것인 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자 제조용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 포함하는 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자.
제6항에 있어서,
상기 지질 나노입자가 리포좀(liposome), 미셀(micelle), 에멀젼(emulsion) 및 고형 지질 나노입자(solid lipid nanoparticle)로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가진 것인 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자.
제6항에 있어서,
상기 지질 나노입자가 양하전 지질, 중성 지질 및 음하전 지질로부터 선택되는 보조 지질을 추가로 포함하는 것인 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자.
제6항에 있어서,
상기 지질 나노입자가 계면활성제를 추가로 포함하는 것인 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자.
제9항에 있어서,
상기 계면활성제는 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽이온성(zwitterionic) 계면활성제 및 비이온성 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자.
제6항에 있어서,
상기 표적 세포가 인테그린 발현 세포인 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자.
제6항에 있어서,
상기 표적 세포가 암 세포, 염증 세포, 혈관 내피세포 (Endothelial cells), 조혈모 줄기세포 (hematopoietic stem cells), 간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cells), 신경 줄기세포(Neural stem cells), 각막 윤부 줄기세포 (LESPC, Limbal epithelial side population cells), 치수줄기세포 (DPSC, Dental Pulp Stem Cells) 또는 각막기질줄기세포 (CSSC, Corneal Stromal Stem Cells)인 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인테그린 αVβ3 결합성 지질 유도체를 포함하는 표적 세포의 인테그린 αVβ3 인지형 지질 나노입자; 및
하나 이상의 약물을 포함하는 의약 조성물.
제13항에 있어서,
상기 약물이 화학요법제, 단백질 의약 또는 핵산 의약인 의약 조성물.
제14항에 있어서,
상기 화학요법제가 항암 화학요법제인 의약 조성물.
제15항에 있어서,
상기 항암 화학요법제가 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 발루비신(valubicin), 미토산트론(mitoxantrone), 커큐민(curcumin), 제피티닙(gefitinib), 에를로티닙(erlotinib), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 빈블라스틴(vinblastine) 및 빈크리스틴(vincristine)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 의약 조성물.
제14항에 있어서,
상기 핵산은 플라스미드 디옥시리보핵산(plasmid DNA), 리보핵산(RNA), 작은 간섭 리보핵산(siRNA), 안티센스 올리고핵산(antisense oligonucleotide), 마이크로 리보핵산 (microRNA), 잠금형 핵산 (locked nucleic acid), 및 핵산 앱타머(aptamer)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 의약 조성물.
제13항에 있어서,
상기 약물이 진단제인 의약 조성물.
제18항에 있어서,
상기 진단제는 근적외선(near infra-red) 계열의 형광물질, 방사성의약품(radiopharmaceuticals) 또는 조영제(contrast agent)인 의약 조성물.
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