JP7411824B2 - アミノ脂質化合物、その調製方法、およびその用途 - Google Patents

アミノ脂質化合物、その調製方法、およびその用途 Download PDF

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Description

本発明は、アミノ脂質化合物、その調製方法、および該アミノ脂質化合物を含有する脂質粒子に関する。該脂質粒子は、生理活性物質を細胞内に送達するために使用することができる。また、本発明は、アミノ脂質含有脂質粒子の医薬としての使用に関する。
遺伝子治療とは、目的とする遺伝物質を適切なベクターを通して特定の組織の細胞に導入し、適切に発現させることで、自身の遺伝子の構造や機能の異常を置き換えたり、修正したり、病気の細胞を殺したり、体の中から病気の細胞を排除する力を高めたりするなどして、治療目的を達成することをいう。しかし、核酸はヌクレアーゼにより加水分解されやすく、また、負電荷を多く持つため、細胞による貪食に不利である。そのため、高効率で安全性が高く、組織特異性の高い遺伝子導入システムの研究開発が特に重要である。
現在、研究されている遺伝子ベクターは、ウイルスベクターと非ウイルス性ベクターに分けられる。ウイルスベクターはトランスフェクション効率が高いものの、その毒性、免疫原性、安全性の問題から、臨床治療への応用は限られている。一方、非ウイルス性ベクターは、調製、輸送、保存が容易で、安全性、有効性、非免疫原性などの利点があるため、ますます多くの専門家や学者の注目を集めている。
非ウイルス性ベクターは、主にカチオン性ポリマーとカチオン性リポソームに分けられる。カチオン性ポリマーとは、カチオンを含む人工的に合成されたポリマーまたは天然に形成されたポリマーを指す。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、最も一般的なカチオン性ポリマー非ウイルス性遺伝子ベクターの１つである。負電荷の遺伝子をカプセル化してナノ複合体を形成することができ、これがエンドサイトーシスによって細胞に入り、リソソームから抜け出して良好なトランスフェクション効率を示すことができる。しかし、ＰＥＩは細胞毒性が強く、その毒性はトランスフェクション効率に正比例する。キトサンは生物学的安全性は高いが、トランスフェクション効率は低い。カチオン性脂質粒子は、二層膜を持つリン脂質小胞を人工的に調製したものである。これらの脂質粒子は、主に担持する電荷と微細構造が異なる。このような脂質粒子に標的ＤＮＡを混合すると、ＤＮＡは濃縮され、粒子と比較的安定な脂質粒子－ＤＮＡ複合体（リポプレックス）を形成することになる。脂質粒子はもともと生体膜と似ているため、脂質粒子とＤＮＡの複合体が細胞膜に接触すると、エンドサイトーシスにより細胞内に侵入する。高いトランスフェクション効率に加え、脂質粒子は免疫原性がなく、細胞毒性も低く、調製が容易である。したがって、カチオン性脂質粒子は、遺伝子導入のための最も一般的に使用されているベクターの１つとなっている。
カチオン性脂質粒子は広く報告されており、市販のトランスフェクション試薬もあるが、送達したい遺伝子構造の微細な違いと脂質粒子の電荷や微細構造とを合わせる必要があり、１つまたは複数のトランスフェクション試薬で全ての遺伝子物質の送達に対応することは困難である。また、遺伝物質を導入する細胞の微細な構造の違いにも、性質の異なる脂質粒子を合わせる必要がある。したがって、遺伝子治療の急速な発展と膨大な市場需要に比べ、構造の異なる核酸物質を送達するニーズに応えるプラットフォームとして、ミニタイプの送達システムの開発が急務である。
発明の概要
一態様において、本発明は、下記式Ｉで表される化合物である、アミノ脂質化合物を提供する：
式中、
Ｒ1およびＲ2は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ6－Ｃ24アルキル、Ｃ6－Ｃ24アルケニル、Ｃ6－Ｃ24アルキニルおよびＣ4－Ｃ24アシルからなる群より選択され、ここで、前記Ｃ6－Ｃ24アルキル、前記Ｃ6－Ｃ24アルケニル、前記Ｃ6－Ｃ24アルキニル、および前記Ｃ4－Ｃ24アシルはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換され；
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、およびＳ－Ｓからなる群より選択され；
Ｘ1がＣであるとき、ｍ＝２であり、２つのＲ6は互いに同一または異なり；Ｘ1がＮであるとき、ｍ＝１であり；Ｘ1がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、またはＳ－Ｓであるとき、ｍ＝０であり；
Ｘ2がＣであるとき、ｎ＝２であり、２つのＲ7は互いに同一または異なり；Ｘ2がＮであるとき、ｎ＝１であり；Ｘ2がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、またはＳ－Ｓであるとき、ｎ＝０であり；
Ｘ3がＣであるとき、ｐ＝２であり、２つのＲ8は互いに同一または異なり；Ｘ3がＮであるとき、ｐ＝１であり；Ｘ3がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、またはＳ－Ｓであるとき、ｐ＝０であり；
Ｒ3およびＲ4は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ1－Ｃ12アルキル、Ｃ2－Ｃ12アルケニル、およびＣ2－Ｃ12アルキニルからなる群より選択され、ここで、前記Ｃ1－Ｃ12アルキル、前記Ｃ2－Ｃ12アルケニル、および前記Ｃ2－Ｃ12アルキニルはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換され、または、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して、窒素、硫黄、および酸素から選択される１～６個のヘテロ原子を含む任意に置換された４～１０員複素環を形成しており；
Ｒ5は存在しないか、または、Ｒ5は水素もしくはＣ1－Ｃ12アルキルであり第四級アミンを提供し；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8は水素またはＣ1－Ｃ12アルキルであり；
Ｌは、Ｃ1－Ｃ12アルキレン、Ｃ2－Ｃ12アルケニレン、またはＣ2-Ｃ12アルキニレンであり、ここで、前記Ｃ1－Ｃ12アルキレン、前記Ｃ2－Ｃ12アルケニレン、および前記Ｃ2－Ｃ12アルキニレンはヒドロカルビル、カルボキシル、アシル、およびアルコキシからなる群より選択される１つ以上の置換基で任意に置換されているか、または、Ｌは、窒素、硫黄、および酸素から選択されるヘテロ原子を含む任意に置換された４～１０員複素環である。
別の態様では、本発明は、アミノ脂質化合物を調製する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、脂質粒子を調製するためのアミノ脂質化合物の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、アミノ脂質化合物を含む脂質粒子を提供する。
別の態様では、本発明は、医薬の調製における脂質粒子の使用を提供する。
図１は、代表的なアミノ脂質化合物によってオボアルブミンｍＲＮＡ（ＯＶＡ ｍＲＮＡ）の皮下投与で産生される体液性抗体価を示す。 図２は、実施例４によるＳ８Ｎ１２Ｄ６および参照試薬（Lipofectamine2000）で処理した後のＨＥＫ２９３細胞の顕微鏡画像を示す：ここで、図２（ａ）は、参照試薬（Lipofectamine2000）で処理した後のＨＥＫ２９３細胞の明視野画像を示し；図２（ｂ）は、実施例４によるＳ８Ｎ１２Ｄ６で処理した後のＨＥＫ２９３細胞の明視野画像を示し；図２（ｃ）は、参照試薬（Lipofectamine2000）で処理した後のＨＥＫ２９３核のヘキスト染色画像を示し；図２（ｄ）は、実施例４によるＳ８Ｎ１２Ｄ６で処理した後のＨＥＫ２９３核のヘキスト染色画像を示し；図２（ｅ）は、参照試薬（Lipofectamine2000）で処理した後のＨＥＫ２９３細胞のＧＦＰ画像を示し；および図２（ｆ）は、実施例４によるＳ８Ｎ１２Ｄ６で処理した後のＨＥＫ２９３細胞のＧＦＰ画像を示す
発明の詳細な説明
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本明細書において、用語「任意に置換され」は、原子または基に連結された１つ以上の水素原子が、独立して非置換であるか、または１つ以上の、例えば１、２、３または４個の置換基で置換されていることを意味し、置換基は独立して：重水素（Ｄ）、ハロゲン、－ＯＨ、メルカプト、シアノ、－ＣＤ3、Ｃ1－Ｃ6アルキル（好ましくは、Ｃ1－Ｃ3アルキル）、Ｃ2－Ｃ6アルケニル、Ｃ2－Ｃ6アルキニル、シクロアルキル（好ましくは、Ｃ3－Ｃ8シクロアルキル）、アリール、ヘテロシクリル（好ましくは、３－８員ヘテロシクリル）、ヘテロアリール、アリール－Ｃ1－Ｃ6アルキル－、ヘテロアリール－Ｃ1－Ｃ6アルキル、Ｃ1－Ｃ6ハロアルキル、－ＯＣ1－Ｃ6アルキル（好ましくは、－ＯＣ1－Ｃ3アルキル）、－ＯＣ2－Ｃ6アルケニル、ＯＣ1－Ｃ6アルキルフェニル、Ｃ1－Ｃ6アルキル－ＯＨ（好ましくは、Ｃ1－Ｃ4アルキル－ＯＨ）、Ｃ1－Ｃ6アルキル－ＳＨ、Ｃ1－Ｃ6アルキル－Ｏ－Ｃ1－Ｃ6アルキル、ＯＣ1－Ｃ6ハロアルキル、ＮＨ2、Ｃ1－Ｃ6アルキル－ＮＨ2（好ましくは、Ｃ1－Ｃ3アルキル－ＮＨ2）、－Ｎ（Ｃ1－Ｃ6アルキル）2（好ましくは、－Ｎ（Ｃ1－Ｃ3アルキル）2）、－ＮＨ（Ｃ1－Ｃ6アルキル）（好ましくは、－ＮＨ（Ｃ1－Ｃ3アルキル））、－Ｎ（Ｃ1－Ｃ6アルキル）（Ｃ1－Ｃ6アルキルフェニル）、－ＮＨ（Ｃ1－Ｃ6アルキルフェニル）、ニトロ、－Ｃ（Ｏ）－ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＯＣ1－Ｃ6アルキル（好ましくは、－Ｃ（Ｏ）ＯＣ1－Ｃ3アルキル）、－ＣＯＮＲｉＲｉｉ（式中、ＲｉおよびＲｉｉは、Ｈ、Ｄ、およびＣ1－Ｃ6アルキルであり、好ましくは、Ｃ1－Ｃ3アルキルである。）、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ1－Ｃ6アルキル）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル）、－Ｎ（Ｃ1－Ｃ6アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ1－Ｃ6アルキル）、－Ｎ（Ｃ1－Ｃ6アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ1－Ｃ6アルキル、－Ｃ（Ｏ）ヘテロアリール（好ましくは、－Ｃ（Ｏ）－５－７員ヘテロアリール）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ1－Ｃ6アルキルフェニル、－Ｃ（Ｏ）Ｃ1－Ｃ6ハロアルキル、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ1－Ｃ6アルキル（好ましくは、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ1－Ｃ3アルキル）、－Ｓ（Ｏ）2－Ｃ1－Ｃ6アルキル、－Ｓ（Ｏ）－Ｃ1－Ｃ6アルキル、－Ｓ（Ｏ）2－フェニル、－Ｓ（Ｏ）2－Ｃ1－Ｃ6ハロアルキル、－Ｓ（Ｏ）2ＮＨ2、－Ｓ（Ｏ）2ＮＨ（Ｃ1－Ｃ6アルキル）、－Ｓ（Ｏ）2ＮＨ（フェニル）、－ＮＨＳ（Ｏ）2（Ｃ1－Ｃ6アルキル）、－ＮＨＳ（Ｏ）2（フェニル）および－ＮＨＳ（Ｏ）2（Ｃ1－Ｃ6ハロアルキル）から選択され、ここで、上記のアルキル、シクロアルキル、フェニル、アリール、ヘテロシクリル、およびヘテロアリールの基は、それぞれ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＮＨ2、シクロアルキル、３－８員ヘテロシクリル、Ｃ1－Ｃ4アルキル、Ｃ1－Ｃ4ハロアルキル－、－ＯＣ1－Ｃ4アルキル、－Ｃ1－Ｃ4アルキル－ＯＨ、－Ｃ1－Ｃ4アルキル－Ｏ－Ｃ1－Ｃ4アルキル、－ＯＣ1－Ｃ4ハロアルキル、シアノ、ニトロ、－Ｃ（Ｏ）－ＯＨ、－Ｃ（Ｏ）ＯＣ1－Ｃ6アルキル、－ＣＯＮ（Ｃ1－Ｃ6アルキル）2、－ＣＯＮＨ（Ｃ1－Ｃ6アルキル）、－ＣＯＮＨ2、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ1－Ｃ6アルキル）、－ＮＨ（Ｃ1－Ｃ6アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ1－Ｃ6アルキル）、－ＳＯ2（Ｃ1－Ｃ6アルキル）、－ＳＯ2（フェニル）、－ＳＯ2（Ｃ1－Ｃ6ハロアルキル）、－ＳＯ2ＮＨ2、－ＳＯ2ＮＨ（Ｃ1－Ｃ6アルキル）、－ＳＯ2ＮＨ（フェニル）、－ＮＨＳＯ2（Ｃ1－Ｃ6アルキル）、－ＮＨＳＯ2（フェニル）、および－ＮＨＳＯ2（Ｃ1－Ｃ6ハロアルキル）からなる群より選択される１つ以上の置換基でさらに任意に置換されている。原子または基が複数の置換基で置換されているとき、当該複数の置換基は、同一であっても異なっていてもよい。
本明細書において、用語「ヒドロカルビル」は、脂肪族炭化水素の１つの水素原子を失った後の残りの基を意味し、直鎖または分岐の、飽和または不飽和のヒドロカルビルを含む。ヒドロカルビルはアルキル、アルケニルおよびアルキニルを含み；好ましくは、ヒドロカルビルは、Ｃ1－Ｃ10ヒドロカルビル、Ｃ1－Ｃ6ヒドロカルビル、またはＣ1－Ｃ3ヒドロカルビルである。
本明細書において、用語「アルキル」は、Ｃ1－Ｃ24アルキル、Ｃ1－Ｃ20アルキル、Ｃ1－Ｃ18アルキル、Ｃ1－Ｃ12アルキル、Ｃ1－Ｃ6アルキル、Ｃ3－Ｃ24アルキル、Ｃ3－Ｃ20アルキル、Ｃ3－Ｃ18アルキル、Ｃ3－Ｃ12アルキル、Ｃ3－Ｃ6アルキル、Ｃ6－Ｃ24アルキル、Ｃ6－Ｃ20アルキル、Ｃ6－Ｃ18アルキル、またはＣ6－Ｃ12アルキルを指す。
本明細書において、用語「アルケニル」は、Ｃ2－Ｃ24アルケニル、Ｃ2－Ｃ20アルケニル、Ｃ2－Ｃ18アルケニル、Ｃ2－Ｃ12アルケニル、Ｃ2－Ｃ6アルケニル、Ｃ3－Ｃ20アルケニル、Ｃ3－Ｃ18アルケニル、Ｃ3－Ｃ12アルケニル、Ｃ3－Ｃ6アルケニル、Ｃ6－Ｃ24アルケニル、Ｃ6－Ｃ20アルケニル、Ｃ6－Ｃ18アルケニル、またはＣ6－Ｃ12アルケニルを指す。アルケニルは１つまたはそれ以上（例えば、２、３または４）のＣ＝Ｃ二重結合を含んでいてもよい。
本明細書において、用語「アルキニル」は、Ｃ2－Ｃ24アルキニル、Ｃ2－Ｃ20アルキニル、Ｃ2－Ｃ18アルキニル、Ｃ2－Ｃ12アルキニル、Ｃ2－Ｃ6アルキニル、Ｃ3－Ｃ20アルキニル、Ｃ3－Ｃ18アルキニル、Ｃ3－Ｃ12アルキニル、Ｃ3－Ｃ6アルキニル、Ｃ6－Ｃ24アルキニル、Ｃ6－Ｃ20アルキニル、Ｃ6－Ｃ18アルキニル、またはＣ6－Ｃ12アルキニルを指す。
本明細書において、用語「アシル」は、ヒドロカルビル－カルボニルを意味する。好ましくは、アシルはＣ4－Ｃ24アシル、Ｃ6－Ｃ18アシル、Ｃ6－Ｃ12アシル、Ｃ6－Ｃ10アシル、Ｃ4－Ｃ6アシルである。
本明細書において、用語「アルコキシ」は、アルキル－オキシを意味する。好ましくは、アルコキシはＣ1－Ｃ10アルコキシであり；より好ましくは、アルコキシはＣ1－Ｃ6アルコキシであり；および最も好ましくは、アルコキシはＣ1－Ｃ3アルコキシである。
本明細書において、用語「ヘテロ環」は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含む飽和または不飽和の環状基を意味する。好ましくは、ヘテロ環は任意で置換されているＮ、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子を１～６個含む４～１０員ヘテロ環であるか、または、任意で置換されているＮ、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子を１、２もしくは３個含む４～６員飽和ヘテロ環である。ヘテロ環の例としては、アゼチジン、オキセタニル、テトラヒドロフラン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、テトラヒドロピラン、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、好ましくはピロリジン、ピペリジン、ピペラジンおよびモルホリンがあげられるが、これらに限定されない。ヘテロ環は、1つ以上の置換基で任意に置換されていてもよく、その置換基の種類は、参照した上記「任意に置換され」の定義のとおりである。
一態様では、本発明は、下記式Ｉで表される化合物であるアミノ脂質化合物を提供する：
式中、
Ｒ1およびＲ2は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ6－Ｃ24アルキル、Ｃ6－Ｃ24アルケニル、Ｃ6－Ｃ24アルキニルおよびＣ4－Ｃ24アシルからなる群より選択され、ここで、前記Ｃ6－Ｃ24アルキル、前記Ｃ6－Ｃ24アルケニル、前記Ｃ6－Ｃ24アルキニル、および前記Ｃ4－Ｃ24アシルはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換され、好ましくは、Ｒ1およびＲ2は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ6－Ｃ18アルキルまたはＣ6－Ｃ18アルケニルである。
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、およびＳ－Ｓからなる群より選択され；
Ｘ1がＣであるとき、ｍ＝２であり、２つのＲ6は互いに同一または異なり；Ｘ1がＮであるとき、ｍ＝１であり；Ｘ1がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、またはＳ－Ｓであるとき、ｍ＝０であり；
Ｘ2がＣであるとき、ｎ＝２であり、２つのＲ7は互いに同一または異なり；Ｘ2がＮであるとき、ｎ＝１であり；Ｘ2がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、またはＳ－Ｓであるとき、ｎ＝０であり；
Ｘ3がＣであるとき、ｐ＝２であり、２つのＲ8は互いに同一または異なり；Ｘ3がＮであるとき、ｐ＝１であり；Ｘ3がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、またはＳ－Ｓであるとき、ｐ＝０であり；
Ｒ3およびＲ4は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ1－Ｃ12アルキル、Ｃ2－Ｃ12アルケニル、およびＣ2－Ｃ12アルキニルからなる群より選択され、ここで、前記Ｃ1－Ｃ12アルキル、前記Ｃ2－Ｃ12アルケニル、および前記Ｃ2－Ｃ12アルキニルはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換され、または、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して、窒素、硫黄、および酸素から選択される１～６個のヘテロ原子を含む任意に置換された４～１０員複素環を形成しており；
Ｒ5は存在しないか、または、Ｒ5は水素もしくはＣ1－Ｃ12アルキルであり第四級アミンを提供し；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8は水素またはＣ1－Ｃ12アルキルであり；
Ｌは、Ｃ1－Ｃ12アルキレン、Ｃ2－Ｃ12アルケニレン、またはＣ2-Ｃ12アルキニレンであり、ここで、前記Ｃ1－Ｃ12アルキレン、前記Ｃ2－Ｃ12アルケニレン、および前記Ｃ2－Ｃ12アルキニレンはヒドロカルビル、カルボキシル、アシル、およびアルコキシからなる群より選択される１つ以上の置換基で任意に置換されているか、または、Ｌは、窒素、硫黄、および酸素から選択されるヘテロ原子を含む任意に置換された４～１０員複素環である。
好ましくは、Ｌは、Ｃ1－Ｃ8アルキレン、Ｃ2－Ｃ6アルキレン、Ｃ2－Ｃ4アルキレン、またはＣ3－Ｃ4アルキレンであり、ここで、前記Ｃ1－Ｃ8アルキレン、前記Ｃ2－Ｃ6アルキレン、前記Ｃ2－Ｃ4アルキレン、または前記アルキレンはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換されている。
いくつかの実施形態では、本発明は、式Ｉのアミノ脂質化合物であって、Ｘ1がＣ、Ｒ6がＨ、およびｍ＝２であり；または、Ｘ1がＮ、Ｒ6がＨ、およびｍ＝１であり；または、Ｘ1がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、もしくはＳ－Ｓ、およびｍ＝０であり；代わりに、またはさらに、Ｘ2がＣ、Ｒ7がＨおよびｎ＝２であり；または、Ｘ2がＮ、Ｒ7がＨ、およびｎ＝１であり；または、Ｘ2がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、もしくはＳ－Ｓ、およびｎ＝０であり；代わりに、またはさらに、Ｘ3がＣ、Ｒ8がＨ、およびｐ＝２であり；または、Ｘ3がＮ、Ｒ8がＨ、およびｐ＝１であり；または、Ｘ3がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、もしくはＳ－Ｓ、およびｐ＝０である、アミノ脂質化合物を提供する。
他のいくつかの実施形態では、本発明は、式Ｉのアミノ脂質化合物であって、Ｘ1およびＸ2は、互いに同一または異なり、互いに独立してＮまたはＳであり；Ｘ1がＮのとき、ｍ＝１であり；Ｘ1がＳのとき、ｍ＝０であり；Ｘ2がＮのとき、ｎ＝１であり；Ｘ2がＳのとき、ｎ＝０であり；代わりに、またはさらに、Ｘ3がＮ、およびｐ＝１であり；または、Ｘ3がＯ、およびｐ＝０であり；代わりに、またはさらに、Ｒ5は存在せず；代わりに、またはさらに、Ｌは、Ｃ1－Ｃ12アルキレンであり、前記Ｃ1－Ｃ12アルキレンはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換されており、例えば、Ｌは（ＣＨ2）qであり、ここでｑは１～１２の整数であり、例えば、１～８もしくは１～６の整数である、アミノ脂質化合物を提供する。そのような実施形態のいくつかでは、ｍ＝１のときＲ6は水素であり；代わりに、またはさらに、ｎ＝１のときＲ7は水素であり；代わりに、またはさらに、Ｒ8は水素である。他のそのような実施形態では、本発明は、式Ｉのアミノ脂質化合物であって、Ｒ1およびＲ2は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ6－Ｃ24アルキルまたはＣ6－Ｃ24アルケニル（例えば、Ｃ12－Ｃ18アルケニル）であり；Ｘ1がＮ、Ｒ6がＨ、およびｍ＝１であるか；または、Ｘ1がＳ、およびｍ＝０であり；Ｘ2がＮ、Ｒ7がＨ、およびｎ＝１であるか；または、Ｘ2がＳおよびｎ＝０であり；Ｘ3がＮ、Ｒ8がＨ、およびｐ＝１であり；Ｒ3およびＲ4は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ1－Ｃ12アルキルであり、ここで、前記Ｃ1－Ｃ12アルキルはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換され、または、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して、窒素、硫黄、および酸素から選択される１～６個のヘテロ原子を含む任意に置換された４～１０員複素環を形成しており；そして、Ｒ5は存在しない、アミノ脂質化合物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、上記の式Ｉのアミノ脂質化合物であって、Ｌが、Ｃ1－Ｃ4アルキレンであり、前記Ｃ1－Ｃ4アルキレンはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換されており、例えば、ＬはＣ2－Ｃ4アルキレンであり、例えば（ＣＨ2）qであり、ここでｑは１、２、３、または４である、アミノ脂質化合物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、上記の式Ｉのアミノ脂質化合物であって、Ｒ1およびＲ2は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ6－Ｃ18アルキルまたはＣ6－Ｃ18アルケニルである、アミノ脂質化合物を提供する。いくつかの実施形態では、Ｒ1およびＲ2は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ6－Ｃ18アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ1およびＲ2の一方がＣ6－Ｃ18アルキルであり、他方がＣ6－Ｃ18アルケニルである。
いくつかの実施形態では、本発明は、上記の式Ｉのアミノ脂質化合物であって、
ｍ＝０または１であり、ｎ＝０または１であり、
および
が、互いに同一または異なり、互いに独立してＳ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｓ１６、Ｓ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１１、Ｎ１２、Ｎ１３、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１８，および2Ｎ12から選択される１つである、アミノ脂質化合物を提供する。
Ｓ６：ＣＨ3（ＣＨ2）5Ｓ－； Ｓ７：ＣＨ3（ＣＨ2）6Ｓ－； Ｓ８：ＣＨ3（ＣＨ2）7Ｓ－； Ｓ９：ＣＨ3（ＣＨ2）8Ｓ－； Ｓ１０：ＣＨ3（ＣＨ2）9Ｓ－； Ｓ１１：ＣＨ3（ＣＨ2）10Ｓ－； Ｓ１２：ＣＨ3（ＣＨ2）11Ｓ－； Ｓ１４：ＣＨ3（ＣＨ2）13Ｓ－； Ｓ１５：ＣＨ3（ＣＨ2）14Ｓ－； Ｓ１６：ＣＨ3（ＣＨ2）15Ｓ－； Ｓ１８：ＣＨ3（ＣＨ2）17Ｓ－；
いくつかの実施形態では、本発明は、上記の式Ｉのアミノ脂質化合物であって、
ｐ＝１であり、
が、下記のＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９およびＤ１０から選択される１つである、アミノ脂質化合物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、上記の式Ｉのアミノ脂質化合物であって、
Ｘ3がＯであり；
ｐが０であり；
Ｒ5は存在せず；そして、
が、下記のＯ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９およびＯ１０から選択される１つである、アミノ脂質化合物を提供する。
他のいくつかの実施形態では、本発明は、上記の式Ｉのアミノ脂質化合物であって、前記アミノ脂質化合物が下記の式Ｉ’で表される化合物であるアミノ脂質化合物を提供する：
式中
Ｘ1'およびＸ2'は、互いに同一または異なり、互いに独立して、ＮＨ、Ｏ、またはＳ、好ましくは、ＮＨまたはＳである；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびｑの定義は、上記式Ｉのアミノ脂質化合物の説明における定義と同じである。
他のいくつかの実施形態では、本発明は、上記の式Ｉのアミノ脂質化合物であって、前記アミノ脂質化合物が下記の式Ｉ’’で表される化合物であるアミノ脂質化合物を提供する：
式中：:
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびｑの定義は、上記式Ｉのアミノ脂質化合物の説明における定義と同じである。
別の態様では、本発明は、上記式Ｉのアミノ脂質化合物の調製方法であって、
（１）塩化シアヌルとＲ1（Ｒ6）m－Ｘ1Ｈで表される化合物との間の、－４０℃～３０℃の温度での、酸結合剤としての塩基の存在下での、式Ｉ－１の第一中間体を得る第一反応を行う工程；
（２）第一中間体を分離し、または（好ましくは）第一中間体を分離することなく、前記第一中間体とＲ2（Ｒ7）n－Ｘ2Ｈで表される化合物との間の、室温または加熱条件下での、酸結合剤としての塩基の存在下での、式Ｉ－２の第二中間体を得る第二反応を行う工程；
（３）第二中間体を分離し、または（好ましくは）第二中間体を分離することなく、前記第二中間体とＨＸ3（Ｒ8）p－Ｌ－ＮＲ3Ｒ4Ｒ5で表されるジアミンとの間の、加熱条件下での、式Ｉのアミノ脂質化合物を得る第三反応を行う工程を含む調製方法を提供する；
式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｌ、ｍ、ｎ、およびｐの定義は、上記式Ｉのアミノ脂質化合物の説明における定義と同じである
例えば、いくつかの実施形態では、Ｘ1およびＸ2は、互いに同一または異なり、互いに独立してＮまたはＳである。Ｘ1がＮのとき、ｍ＝１であり；Ｘ1がＳのとき、ｍ＝０である。Ｘ2がＮのとき、ｎ＝１であり；Ｘ2がＳのとき、ｎ＝０である。いくつかの実施形態では、Ｘ3はＮであり、ｐ＝１である。いくつかの実施形態では、Ｒ5は存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌは、Ｃ1－Ｃ12アルキレンであり、前記Ｃ1－Ｃ12アルキレンはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換されており、例えば、Ｌは（ＣＨ2）qであり、ここでｑは１～１２の整数であり、例えば、１～８もしくは１～６の整数である。いくつかの実施形態では、ｍ＝１のときＲ6は水素である。いくつかの実施形態では、ｎ＝１のときＲ7は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ8は水素である。
好ましくは、工程（３）において、上記第三反応は酸結合剤としての塩基の存在下で行なわれる。
いくつかの実施形態では、本発明は、上記式Ｉ’のアミノ脂質化合物の調製方法であって：
（１）塩化シアヌルとＲ1－Ｘ1'Ｈで表される化合物との間の、－４０℃～３０℃の温度での酸結合剤としての塩基の存在下での、式Ｉ’－１の第一中間体を得る第一反応を行う工程；
（２）第一中間体を分離し、または（好ましくは）第一中間体を分離することなく、前記第一中間体とＲ2－Ｘ2'Ｈで表される化合物との間の、室温または加熱条件下での、酸結合剤としての塩基の存在下での、式Ｉ’－２の第二中間体を得る第二反応を行う工程；
（３）第二中間体を分離し、または（好ましくは）第二中間体を分離することなく、前記第二中間体とＨ2Ｎ－（ＣＨ2）q－ＮＲ3Ｒ4で表されるジアミンとの間の、加熱条件下での、式Ｉ’のアミノ脂質化合物を得る第三反応を行う工程を含む調製方法を提供する；
式中、Ｘ1'、Ｘ2'、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびｑの定義は、上記式Ｉ’のアミノ脂質化合物の説明における定義と同じである。
好ましくは、工程（３）において、上記第三反応は酸結合剤としての塩基の存在下で行なわれる。
いくつかの実施形態では、本発明は、上記式Ｉ’’のアミノ脂質化合物の調製方法であって：
（１）塩化シアヌルとＲ1－ＳＨで表される化合物との間の、－４０℃～３０℃の温度での酸結合剤としての塩基の存在下での、式Ｉ’’－１の第一中間体を得る第一反応を行う工程；
（２）第一中間体を分離し、または（好ましくは）第一中間体を分離することなく、前記第一中間体とＲ2－ＳＨで表される化合物との間の、室温または加熱条件下での、酸結合剤としての塩基の存在下での、式Ｉ’’－２の第二中間体を得る第二反応を行う工程；
（３）第二中間体を分離し、または（好ましくは）第二中間体を分離することなく、前記第二中間体とＨＯ－（ＣＨ2）q－ＮＲ3Ｒ4で表されるヒドロキシルアミンとの間の、室温または加熱条件下での、酸結合剤としての塩基の存在下での、式Ｉ’’のアミノ脂質化合物を得る第三反応を行う工程を含む調製方法を提供する；
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびｑの定義は、上記式Ｉのアミノ脂質化合物の説明における定義と同じである。
上述したいずれかの方法の好ましい実施態様において、上記第一反応は、２０℃未満（例えば、反応温度について特に下限の制限なく、１５℃未満、１０℃未満、５℃未満、０℃未満、－１０℃未満、または－２０℃未満）かつ－４０℃超の温度（例えば、－３５℃超、または好ましくは－３０℃以上）で行なわれる。
本明細書において、用語「室温」は、大気圧での常温を指し、０℃～３０℃、０℃～２５℃、０℃～２０℃、５℃～３０℃、５℃～２０℃、１０℃～３０℃、１０℃～２５℃、１５℃～３０℃、または、１５℃～２５℃の範囲の温度を示していればよい。
本明細書において、用語「加熱条件下」は、具体的には、５０℃～１２０℃、５０℃～１１０℃、５０℃～８０℃、６０℃～１２０℃、６０℃～１１０℃、６０℃～１００℃、７０℃～１２０℃、７０℃～１００℃、または７０℃～９０℃の範囲の温度への加熱を指す。
本明細書において、用語「塩基」は、当該技術分野で一般的に使用される塩基化合物であることができ、例えば、トリエチルアミン、ＤＩＰＥＡ、ピリジン、ＤＭＡＰなどの有機塩基；または水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムのような無機塩基があげられるが、これらには限定されない。
好ましくは、ｑは１～８の整数であり、好ましくは、１～６の整数であり；より好ましくは、ｑは１～４の整数であり、例えば、１，２，３または４である。
いくつかの実施形態では、本発明は、以下の式１に従って実施することができる式ＩＩのアミノ脂質化合物の調製方法を提供する。
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、およびＸ2の定義は、上記式Ｉのアミノ脂質化合物の調製方法の上記説明におけるそれらの定義と同じである。
いくつかの実施形態では、本発明は、以下の式２に従って実施することができる式ＩＩＩのアミノ脂質化合物の調製方法を提供する。
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、およびＸ2の定義は、上記式Ｉのアミノ脂質化合物の調製方法の上記説明におけるそれらの定義と同じである。
いくつかの実施形態では、本発明は、以下の式３に従って実施することができる式ＩＶのアミノ脂質化合物の調製方法を提供する。
式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ2、およびｑの定義は、上記式Ｉのアミノ脂質化合物の説明における定義と同じであり；
好ましくは、Ｘ2はＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2およびＳ－Ｓからなる群より選択され、好ましくは、ＯまたはＳであり、より好ましくは、Ｓである。
いくつかの実施形態では、本発明は、以下の式４に従って実施することができる式Ｖのアミノ脂質化合物の調製方法を提供する。
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ2、およびｑの定義は、上記式Ｉのアミノ脂質化合物の説明における定義と同じであり；
好ましくは、Ｘ2はＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2およびＳ－Ｓからなる群より選択され、好ましくは、ＯまたはＳであり、より好ましくは、Ｓである。
本発明によるアミノ脂質化合物の調製方法は、非常に汎用性が高く、アミノ脂質化合物ライブラリーの迅速な合成や、細胞を用いた迅速なスクリーニング実験に、低コストで利用できることがわかる。
別の態様では、本発明は、式Ｉ、Ｉ’、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶのいずれか１つのアミノ脂質化合物の、脂質粒子の調製のための使用を提供する。
別の態様では、本発明は、上記の本発明のアミノ脂質化合物を含む脂質粒子を提供する。
本発明のアミノ脂質化合物に含まれる長い非極性残基により、得られた化合物はいずれも疎水性の特性を有し、同時にアミン基による親水性の特性も有している。この両性の特性は、脂質ナノ粒子、脂質二重層、ミセル、リポソームなどの脂質粒子の形成に有用でありうる。
本発明の範囲において、「脂質粒子」という用語は、アミノ脂質化合物を水溶液中に配置することによって調製されるナノサイズの物質を意味する。これらの粒子は、特に脂質ナノ粒子、二層脂質小胞（リポソーム）、多層小胞またはミセルである。
本発明の好ましい実施形態では、脂質粒子は、上述した本発明のアミノ脂質化合物を含むリポソームである。 本発明の範囲では、リポソームは、水性コンパートメントを取り囲む脂質両親媒性分子の二重層からなる微小小胞である。
リポソームの形成は自然なプロセスではない。脂質小胞は、まず、水中に脂質を加えることで二重層または一連の二重層が形成され、それぞれが水分子によって分離される。リポソームは、水中の脂質小胞を超音波処理することによって形成することができる。
本発明の範囲において、「脂質二重層」という用語は、脂質分子が2層に分かれて形成された薄膜を意味する。ミセル」という用語は、液体コロイド中に分散した界面活性剤分子の凝集体を意味する。水溶液中の典型的なミセルは、水と接触すると親水性の頭部領域で会合体を形成し、ミセルの中心にある疎水性のシングルテール領域をキレートする。
本発明の範囲において、「細胞」とは一般的な用語を意味し、例としては、個々の細胞、組織、器官、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、両生類細胞、哺乳類細胞、初代細胞、連続細胞株、幹細胞および/または遺伝子組換え細胞（異種ポリペプチドやタンパク質を発現する組換え細胞など）の培養物があげられる。組換え細胞には、例えば、成長因子や血液因子などの異種ポリペプチドやタンパク質を発現する細胞などがあげられる。
いくつかの好ましい実施形態では、脂質粒子またはリポソームは、さらに、ヘルパー脂質、ステロールおよび生理活性物質のうちの１つ以上を含む。
例えば、いくつかの実施形態では、脂質粒子またはリポソームは、ヘルパー脂質を含む。好ましい実施形態では、ヘルパー脂質は、非カチオン性脂質である。より好ましい実施形態では、ヘルパー脂質は、非カチオン性リン脂質である。本発明の範囲内において、非カチオン性脂質は、カチオン性官能基（例えば、アンモニウム）を含みうるが、少なくとも分子を中和するためにアニオン性官能基を含むことが望ましい。脂質分子に含まれるすべての官能基の合計が非カチオン性であることが望ましい。本発明によるアミノ脂質と非カチオン性（中性）リン脂質の混合物からなるリポソームは、核酸を細胞内に送達するのに最も効果的である。さらに好ましい実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、またはそれらの組み合わせである。いくつかの好ましい実施形態では、脂質粒子中のアミノ脂質化合物のヘルパー脂質に対するモル比が約（２～１０）：１であり、好ましくは約（３～８）：１であり、より好ましくは約（４～６）：１であり、例えば、約４：１、約４．５：１、または約５：１である。
いくつかの代替的またはさらなる実施形態において、脂質粒子またはリポソームは、ステロールを含む。コレステロールなどのステロールは、細胞膜の天然成分である。粒子を安定化させ、細胞膜との統合を助けるために有用でありうる。ステロールは、コレステロール、シトステロール、スチグマステロールおよびエルゴステロールからなる群より選択される1つ以上であってもよく、好ましくはコレステロールである。いくつかの好ましい実施形態では、脂質粒子におけるアミノ脂質化合物のステロールに対するモル比は、約（１～１．５）：１であり、好ましくは約（１～１．４）：１、例えば、約（１～１．３）：１である。
いくつかの代替的またはさらなる実施形態において、脂質粒子またはリポソームは、生理活性物質を含有する。本発明の範囲内において、生理活性物質は、例えば、免疫反応または炎症反応を刺激することによって、酵素活性を発揮することによって、または相補的変異によって、細胞または宿主に導入されたときに生物学的効果を有する物質である。生理活性物質は、特に、核酸、ペプチド、タンパク質、抗体、および低分子である。また、リポソームを用いて、脂質二重膜に薬物を包み込んだり、リポソーム内の水性空間に薬物を包み込んだりする場合には、「脂質粒子薬物」という用語を用いることができる。
最も好ましい実施形態では、生理活性物質は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、プラスミド、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、転位ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）を含むがそれらに限定されない核酸である。いくつかの他の好ましい実施形態では、生理活性物質は、抗腫瘍剤、抗生物質、免疫調節剤、抗炎症剤、中枢神経系に作用する薬剤、抗原またはその断片、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ポリペプトイド、ワクチンおよび低分子、ならびにこれらの混合物からなる群より選択される。
他のいくつかの実施形態では、脂質粒子またはリポソームは、脂質粒子またはリポソームは、少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質をさらに含む。ＰＥＧ脂質は、インビトロまたはインビボでの分解から粒子およびその内容物を保護することに寄与する。さらに、ＰＥＧは、リポソーム表面に保護層を形成し、インビボでの循環時間を増加させる。リポソーム薬物（ＰＥＧ－リポソーム）の送達に使用することができる。好ましくは、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ１０００－ＤＭＧ、ＰＥＧ５０００－ＤＭＧ、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧおよびＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥから選択される１つ以上であり得、好ましくはＰＥＧ２０００－ＤＭＧである。いくつかの好ましい実施形態では、脂質粒子におけるアミノ脂質化合物のＰＥＧ－脂質に対するモル比は、約（９～４２）：１であり、好ましくは約（１２～３８）：１であり、より好ましくは約（１６～３６）：１、例えば約（１８～３４）：１である。
本発明の脂質粒子またはリポソームは、生理活性物質をカプセル化する際に優れた性能を発揮する。生理活性物質を含む脂質粒子またはリポソームは、様々な治療薬のいずれかを細胞内に送達するために使用することができる。本発明は、上記のような脂質粒子（特に、リポソーム）の、生理活性物質を細胞内に送達するための使用を含む。また、本発明は、本発明の生理活性物質を含有する脂質粒子またはリポソームを細胞に接触させることを含む、生理活性物質を細胞内に送達する方法を提供するものである。
以上で示したように、本発明のアミノ脂質化合物を含有する脂質粒子またはリポソームは、生理活性物質を細胞内に送達するのに好適である。一般的な合成方法により合成された種々のアミノ脂質化合物により付与されるリポソームの具体的な特性はスクリーニングすることができる。重要な特性は、例えば、トランスフェクション効率、細胞毒性、細胞内に送達する薬剤の接着性、リポソームの安定性、リポソームの大きさなどである。本発明の方法は、特定の用途のための特定の適応リポソームを形成するために使用することができる。
例えば、脂質粒子またはリポソームは、多細胞組織または器官にトランスフェクションを行うために使用することができる。したがって、本発明は、本発明による核酸を含む脂質粒子またはリポソームを細胞に接触させることを含む、細胞、多細胞組織または器官にトランスフェクションを行うための方法も提供する。これにより、患者に新たな治療処置の可能性を提供することができる。
本発明によれば、患者は、任意の哺乳類、好ましくはマウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、ヤギ、ウシおよびサルおよび／またはその他から選択することができる。いくつかの好ましい実施形態では、患者はヒトである。
別の態様では、本発明はさらに、式Ｉ、Ｉ’、Ｉ’’、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶのアミノ脂質化合物のいずれか１つを含む脂質粒子またはリポソームの医薬としての使用を提供する。別の態様では、本発明は、さらに、式Ｉ、Ｉ’、Ｉ’’、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、およびＶのアミノ脂質化合物のいずれか１つを含む脂質粒子またはリポソームの医薬の調製における使用を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、前記脂質粒子は、生理活性物質をカプセル化するためのベクターとして使用される。
特に、脂質粒子もしくはリポソーム、または医薬は、遺伝子治療、遺伝子ワクチン接種、アンチセンス治療、またはＲＮＡ干渉による治療のために患者に投与することができる。具体的な用途としては、以下のものがあげられるが、これらに限定されるものではない：
（１）本発明の脂質粒子は、遺伝子治療用の核酸を送達することができる。本発明のアミノ脂質を介して外来遺伝子を標的細胞に導入し、欠陥遺伝子や異常遺伝子に起因する疾患を修復・治療することにより、治療目的を達成することができる。その中には、遺伝子組換え技術の応用、すなわち、遺伝子導入技術によって外来遺伝子を患者の適切な受容細胞に挿入し、外来遺伝子の産生する産物が特定の疾患、例えば一般的な肺がん、胃がん、肝臓がん、食道がん、大腸がん、すい臓がん、脳腫瘍、リンパ系がん、血液系がん、前立腺がんなどを治療できるようにすることも含まれている。また、遺伝子編集核酸物質は、血友病、サラセミア、ゴーシェ病など、さまざまな遺伝性疾患の治療にも導入することができる。
（２）本発明の脂質粒子は、ワクチン接種に使用することができる。本発明の脂質粒子またはリポソームは、抗原または抗原をコードする核酸を送達するために使用することができる。また、本発明の脂質粒子は、癌、アレルギー、毒性および病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌および他の病原性生物）感染などの様々な障害の治療および／または予防に用いられる様々な抗原に対する免疫応答の開始のために使用することができる。
本発明はまた、生理活性物質（例えば、所望の核酸または抗原）を含む本発明の脂質粒子またはリポソームを、それを必要とする患者に投与することを含む、遺伝子治療、遺伝子ワクチン接種、アンチセンス治療またはＲＮＡ干渉による治療のための方法を提供するものである。
本発明の脂質粒子は、核酸導入用医薬の調製に用いることができる。好ましくは、核酸はＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、プラスミド、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、転位ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）である。
また、非生理活性物質のカプセル化も、本発明の脂質粒子またはリポソームの目的の一つである。したがって、本発明は、非生理活性物質を含むこのような脂質粒子またはリポソームも提供する。非生理活性物質の例としては、例えば化粧品に使用されるような、酸化防止剤、顔料、染料、香料、着香料があげられるが、これらに限定されない。本発明の脂質粒子またはリポソームは、非生理活性物質をカプセル化する際にも優れた性能を発揮することが期待される。
本発明は、また、以下の実施形態を含む。
１．下記式Ｉで表される化合物である、アミノ脂質化合物：
式中、
Ｒ1およびＲ2は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ6－Ｃ24アルキル、Ｃ6－Ｃ24アルケニル、Ｃ6－Ｃ24アルキニルおよびＣ4－Ｃ24アシルからなる群より選択され、ここで、前記Ｃ6－Ｃ24アルキル、前記Ｃ6－Ｃ24アルケニル、前記Ｃ6－Ｃ24アルキニル、および前記Ｃ4－Ｃ24アシルはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換され；
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、およびＳ－Ｓからなる群より選択され；
Ｘ1がＣであるとき、ｍ＝２であり、２つのＲ6は互いに同一または異なり；Ｘ1がＮであるとき、ｍ＝１であり；Ｘ1がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、またはＳ－Ｓであるとき、ｍ＝０であり；
Ｘ2がＣであるとき、ｎ＝２であり、２つのＲ7は互いに同一または異なり；Ｘ2がＮであるとき、ｎ＝１であり；Ｘ2がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、またはＳ－Ｓであるとき、ｎ＝０であり；
Ｘ3がＣであるとき、ｐ＝２であり、２つのＲ8は互いに同一または異なり；Ｘ3がＮであるとき、ｐ＝１であり；Ｘ3がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、またはＳ－Ｓであるとき、ｐ＝０であり；
Ｒ3およびＲ4は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ1－Ｃ12アルキル、Ｃ2－Ｃ12アルケニル、およびＣ2－Ｃ12アルキニルからなる群より選択され、ここで、前記Ｃ1－Ｃ12アルキル、前記Ｃ2－Ｃ12アルケニル、および前記Ｃ2－Ｃ12アルキニルはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換され、または、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して、窒素、硫黄、および酸素から選択される１～６個のヘテロ原子を含む任意に置換された４～１０員複素環を形成しており；
Ｒ5は存在しないか、または、Ｒ5は水素もしくはＣ1－Ｃ12アルキルであり第四級アミンを提供し；
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8は水素またはＣ1－Ｃ12アルキルであり；
Ｌは、Ｃ1－Ｃ12アルキレン、Ｃ2－Ｃ12アルケニレン、またはＣ2-Ｃ12アルキニレンであり、ここで、前記Ｃ1－Ｃ12アルキレン、前記Ｃ2－Ｃ12アルケニレン、および前記Ｃ2－Ｃ12アルキニレンはヒドロカルビル、カルボキシル、アシル、およびアルコキシからなる群より選択される１つ以上の置換基で任意に置換されているか、または、Ｌは、窒素、硫黄、および酸素から選択されるヘテロ原子を含む任意に置換された４～１０員複素環である。
２．項目１のアミノ脂質化合物であって、
Ｘ1がＣ、Ｒ6がＨ、およびｍ＝２であり；または、Ｘ1がＮ、Ｒ6がＨ、およびｍ＝１であり；または、Ｘ1がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、もしくはＳ－Ｓ、およびｍ＝０であり；
Ｘ2がＣ、Ｒ7がＨ、およびｎ＝２であり；または、Ｘ2がＮ、Ｒ7がＨ、およびｎ＝１であり；または、Ｘ2がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、もしくはＳ－Ｓ、およびｎ＝０であり；
Ｘ3がＣ、Ｒ8がＨ、およびｐ＝２であり；または、Ｘ3がＮ、Ｒ8がＨ、およびｐ＝１であり；または、Ｘ3がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、もしくはＳ－Ｓ、およびｐ＝０である、
アミノ脂質化合物。
３．項目１のアミノ脂質化合物であって、
Ｒ1およびＲ2は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ6－Ｃ24アルキルであり；
Ｘ1がＮ、Ｒ6がＨ、およびｍ＝１であるか；または、Ｘ1がＳ、およびｍ＝０であり；
Ｘ2がＮ、Ｒ7がＨ、およびｎ＝１であるか；または、Ｘ2がＳおよびｎ＝０であり；
Ｘ3がＮ、Ｒ8がＨ、およびｐ＝１であり；
Ｒ3およびＲ4は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ1－Ｃ12アルキルであり、ここで、前記Ｃ1－Ｃ12アルキルはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換され、または、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して、窒素、硫黄、および酸素から選択される１～６個のヘテロ原子を含む任意に置換された４～１０員複素環を形成しており；
Ｒ5は存在しない、アミノ脂質化合物。
４．項目１～３のいずれか１つのアミノ脂質化合物であって、ＬがＣ1－Ｃ4アルキレンであり、前記Ｃ1－Ｃ4アルキレンがＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換されているアミノ脂質化合物。
５．項目１～３のいずれか１つのアミノ脂質化合物であって、Ｒ1およびＲ2は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ6－Ｃ18アルキルである、アミノ脂質化合物。
６．項目１のアミノ脂質化合物であって、
ｍ＝０、ｎ＝０、ｐ＝０であり、
Ｒ1－Ｘ1－およびＲ2－Ｘ2－は、互いに同一または異なり、互いに独立して上記のＳ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｓ１６、Ｓ１８、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１１、Ｎ１２、Ｎ１３、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１８、2Ｎ12から選択される１つであり、
－Ｘ3－Ｌ－Ｎ（Ｒ3）（Ｒ4）（Ｒ5）は、上記のＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、Ｄ１０から選択される１つである、アミノ脂質化合物。
７．項目１～６のいずれか１つに記載のアミノ脂質化合物を調製するための方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）塩化シアヌルとＲ1－Ｘ1Ｈで表される化合物との間の、－３０℃～３０℃の温度での酸結合剤としての塩基の存在下での、第一中間体を得る第一反応を行う工程、ここで、Ｘ1はＮＨまたはＳであり；
（２）第一中間体を分離することなく、Ｒ2－Ｘ2Ｈで表される化合物を添加することにより、室温または加熱条件下での、酸結合剤としての塩基の存在下での、第二中間体を得る第二反応を行う工程、ここで、Ｘ2はＮＨまたはＳであり；
（３）第二中間体を分離することなく、Ｈ2Ｎ－（ＣＨ2）q－ＮＲ3Ｒ4で表されるジアミンを添加して、加熱条件下での、アミノ脂質化合物を得る第三反応を行う工程；
ここで、ｑは１～１２の整数であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の定義は、項目１～６のいずれかにおけるそれらの定義と同じである。
８．本発明のアミノ脂質化合物を調製するための方法であって、以下式１にしたがって行うことができる方法:
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ2の定義は、上記アミノ脂質化合物の調製方法の上記説明におけるそれらの定義と同じである。
９．本発明のアミノ脂質化合物を調製するための方法であって、以下式２にしたがって行うことができる方法：
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ2の定義は、上記アミノ脂質化合物の調製方法の上記説明におけるそれらの定義と同じである。
１０．脂質粒子を調製するための項目１～６のいずれか１つに記載のアミノ脂質化合物の使用であって、前記脂質粒子は脂質ナノ粒子、リポソーム、多層小胞またはミセルであり、より好ましくは、前記脂質粒子は脂質ナノ粒子である、使用。
１１．項目１～６のいずれか１つに記載のアミノ脂質化合物を含む脂質粒子であって、好ましくは、前記脂質粒子は脂質ナノ粒子、リポソーム、多層小胞またはミセルであり、より好ましくは、前記脂質粒子は脂質ナノ粒子である、脂質粒子。
１２．項目１１に記載の脂質粒子であって、さらに、ヘルパー脂質、ステロールおよび生理活性物質のうちの１つ以上を含み；
好ましくは、前記ヘルパー脂質は非カチオン性脂質であり；より好ましくは、前記ヘルパー脂質は非カチオン性リン脂質であり；さらに好ましくは、前記非カチオン性脂質はＤＯＰＥであり；
好ましくは、前記ステロールはコレステロールであり；
好ましくは、前記生理活性物質が、核酸、抗腫瘍剤、抗生物質、免疫調節剤、抗炎症剤、中枢神経系に作用する薬剤、抗原またはその断片、ペプチド、タンパク質、抗体、ワクチンおよび低分子のうちの１つ以上であり、より好ましくは、前記核酸が、ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、プラスミド、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、転位ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）である、脂質粒子。
１３．項目１１または１２の脂質粒子の遺伝子治療、遺伝子ワクチン接種、アンチセンス治療またはＲＮＡ干渉による治療のための医薬の調製における使用であって；
好ましくは、前記遺伝子治療は、癌および遺伝性疾患の治療に有用であり；より好ましくは、前記癌が肺癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、大腸癌、膵臓癌、脳腫瘍、リンパ系癌、血液癌、または前立腺癌のいずれか一つ以上であり、前記遺伝性疾患が血友病、サラセミア、およびゴーシェ病のいずれか一つ以上であり、
好ましくは、前記遺伝子ワクチン接種は癌、アレルギー、毒性および病原体感染の治療に有用であり；より好ましくは、前記病原体が、ウイルス、細菌、または真菌の１つ以上である、使用。
１４．項目１１または１２の脂質粒子の核酸導入用医薬の調製における使用であって、好ましくは、前記核酸がＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、プラスミド、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、転位ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）である、使用。
有益な効果
本発明のアミノ脂質化合物は、多様で大量の官能基を有することを特徴とし、アミノ脂質化合物の調製方法は、入手しやすい原料、穏やかな反応条件、優れた反応選択性、高い反応収率、低い設備要件、簡単な操作などの利点を有する；そして、本発明の調製方法は、非常に普遍的で、イオン化できるアミノ脂質化合物のライブラリーの迅速合成、および低コストでの迅速な細胞を用いたスクリーニング実験に利用することができる。
本発明が提供するアミノ脂質化合物は、種々の種類や組み合わせ態様を含む官能基を有し、トランスフェクション効率、細胞毒性、細胞へ送達すべき薬剤の接着性、脂質粒子の安定性、脂質粒子の大きさおよびその他の性質に関して、従来のスクリーニングにより、異なる核酸物質の異なる細胞への送達に都合よく適合させ、送達システムの特異性と効果を向上させることが可能である。
本発明のアミノ脂質化合物は、コンビナトリアルケミストリーの方法により、高スループットかつ高効率に合成することができ、その合成方法は、簡便かつ高収率である。
本発明のアミノ脂質化合物からなる脂質粒子またはリポソームは、生理活性物質をカプセル化する性能に優れ、生理活性物質、特に難水溶性薬剤や易分解性または易崩壊性の活性物質（核酸など）を送達してそのバイオアベイラビリティや効力を向上させるために使用することができる。
本発明の目的、技術的解決策および利点をより明確にするために、以下、具体的な実施例を参照して本発明を説明する。記載された実施例は、本発明の実施形態の一部であるが、その全てではない。本発明の実施例に基づき、当業者が創意工夫することなく得られる他のすべての実施形態は、本発明の範囲に含まれる。
実施例
特に断りのない限り、実施例で使用した化学試薬はすべて分析的に純粋で、ＴＣＩ、Ａｌａｄｄｉｎ、Ｊ＆Ｋなどから購入したものである。
実施例１：アミノ脂質化合物の合成
アルキル鎖の長さ、アルキル鎖の組合せ様式、イオン化可能な頭部基などの構造とトランスフェクション能との関係を系統的に調べるため、炭素数６～１８の鎖を持つ直鎖アルキルチオール１１種（Ｓ６～Ｓ１８）、炭素数６～２４の鎖を持つアルキルアミン１１種（Ｎ６～２Ｎ１２）、互いに構造の異なるジアミン１０種（Ｄ１～Ｄ６）を選定した。２つのアルキル鎖とイオン化可能な頭部基を含む２５３０種の化合物のライブラリーをコンビナトリアルケミストリーによりハイスループットに合成した。合成経路は以下の通りである：
式中、ｎ３＝１、２、または３；－ＮＲＲは、前述のジアミンＤ１～Ｄ１０におけるジアルキルアミノ部位または環状アミノ部位を表し；そして、Ｒ1およびＲ2は上記の定義のとおりである。
合成された化合物は、以下の表Ｉに示す構造の１つを有する。
式中、各Ｓｚは独立して以下表ＩＩに列挙されるＳ６～Ｓ１２、Ｓ１４～Ｓ１６、およびＳ１８から選択される基を示し；
各Ｎｘは独立して以下表ＩＩに列挙されるＮ６～Ｎ９、Ｎ１１～Ｎ１３、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１８および2Ｎ12から選択される基を示し；そして
各Ｄｙは独立して以下表ＩＩに列挙されるＤ１～Ｄ１０から選択される基を示す。
合成した化合物について測定したマススペクトル（［Ｍ＋Ｈ］+）のデータを下記表ＩＩＩに示す。
実施例１．１：Ｓ８ＮｘＤｙ系アミノ脂質化合物ライブラリーのパラレル合成と特性評価
式中、ｎ３、－ＮＲＲ、Ｒ1、およびＲ2は上記の定義のとおりである。
塩化シアヌル（２ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（１０ｍＬ）を５０ｍＬ乾燥反応瓶に加え、冷浴中で撹拌しながら－２０℃まで冷却し、その後、１－オクタンチオール（２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２．４ｍｍｏｌ）を順次添加し、すぐに反応液に多量の析出物が生じた。５分間反応させた後、ＴＬＣ検出を行ったところ、反応は完了していた。反応液を１５ｍＬの遠心管に移し、１５ｍＬの容量に固定した後、遠心機で遠心分離した（２０００ｒ／ｍｉｎ，１分）。その後、工程Ｉの反応液（１５ｍＬ，０．１３Ｍ）を得た。
工程Ｉの反応液をピペットで１１本の１．５ｍＬ反応瓶（各１．１５ｍＬ，０．１５ｍｍｏｌ）に移し、直鎖アルキルアミン（０．１５ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡのＴＨＦ溶液（０．３５ｍＬ，０．５Ｍ）を対応する反応瓶に添加し、室温で撹拌しながら２時間反応させた。ＴＬＣ検出では工程Ｉの原料は検出されなかった。
各工程ＩＩの反応液をピペットで１．５ｍＬＥＰ反応管１０本（各０．１ｍＬ，０．０１ｍｍｏｌ）に移し、ジアミンのＴＨＦ溶液（０．１２ｍＬ，０．０１２ｍｍｏｌ，０．１Ｍ）およびＤＩＰＥＡのＴＨＦ溶液（０．０２ｍＬ，０．１Ｍ）を対応するＥＰ反応管に加えた後、加熱振とう反応器（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｈａｋｅｒ）中、７８℃で１時間反応させた。ＴＬＣ検出では工程ＩＩの原料は検出されなかった。反応終了後、反応管内の溶媒を常温で蒸発乾固し、１１０のアミノ脂質化合物Ｓ８ＮｘＤｙを得た。その中から代表的な１０化合物を選び、質量分析で測定した。結果を以下表１に示す。
実施例１．１．１：代表的なアミノ脂質化合物Ｓ８Ｎ１１Ｄ６のワンポット合成と特性評価
塩化シアヌル（１ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（１０ｍＬ）を２０ｍＬ乾燥反応瓶に加え、冷浴中で撹拌しながら－２０℃まで冷却し、その後、１－オクタンチオール（１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．２ｍｍｏｌ）を順次添加し、すぐに反応液に多量の析出物が生じた。５分間反応させた後、ＴＬＣ検出を行ったところ、反応は完了していた。反応液を室温まで温めた後、ウンデシルアミン（１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．２ｍｍｏｌ）を添加し、室温で撹拌しながら２時間反応させた。ＴＬＣ検出では工程Ｉの原料は検出されなかった。次にＮ，Ｎ－ジメチルプロパンジアミン（１．２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２ｍｏｌ）を加え、撹拌しながら７８℃に温め、１時間反応させた。ＴＬＣ検出では工程ＩＩの原料は検出されなかった。自動精製システムによる精製を行い（フォワードシリカカラム、０～１０％ＤＣＭ：ＭｅＯＨのグラジエントで溶出）、白色固体４４０．４ｍｇを３工程の反応の収率８９％ 純度＞９９％で得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.54 (m, 2H), 3.34 (m, 2H), 3.01 (m, 4H), 2.80-2.73 (m, 6H), 2.07 (m, 2H), 1.67 (m, 2H), 1.53 (m, 2H), 1.38 (m, 2H), 1.28 (m, 2H), 1.24 (m, 24H), 0.88-0.84 (m, 6H). ESI-MS 計算値 C27H55N6S+ [M+H]+ 495.4, 測定値 495.6.
実施例１．２：Ｓ６ＳｘＤｙ系アミノ脂質化合物ライブラリーのパラレル合成と特性評価
式中、ｎ３、－ＮＲＲ、Ｒ1およびＲ2は上記の定義のとおりである。
塩化シアヌル（２ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（１０ｍＬ）を５０ｍＬ乾燥反応瓶に加え、冷浴中で撹拌しながら－２０℃まで冷却し、その後、１－ヘキサンチオール（２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２．４ｍｍｏｌ）を順次添加し、すぐに反応液に多量の析出物が生じた。５分間反応させた後、ＴＬＣ検出を行ったところ、反応は完了していた。反応液を１５ｍＬの遠心管に移し、１５ｍＬの容量に固定した後、遠心機で遠心分離した（２０００ｒ／ｍｉｎ，１分）。その後、工程Ｉの反応液（１５ｍＬ，０．１３Ｍ）を得た。
工程Ｉの反応液をピペットで１１本の１．５ｍＬ反応瓶（各１．１５ｍＬ，０．１５ｍｍｏｌ）に移し、直鎖アルキルチオール（０．１５ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡのＴＨＦ溶液（０．３５ｍＬ，０．５Ｍ）を対応する反応瓶に添加し、室温で撹拌しながら２時間反応させた。ＴＬＣ検出では工程Ｉの原料は検出されなかった。
各工程ＩＩの反応液をピペットで１．５ｍＬＥＰ反応管１０本（各０．１ｍＬ，０．０１ｍｍｏｌ）に移し、ジアミンのＴＨＦ溶液（０．１２ｍＬ，０．０１２ｍｍｏｌ，０．１Ｍ）およびＤＩＰＥＡのＴＨＦ溶液（０．０２ｍＬ，０．１Ｍ）を対応するＥＰ反応管に加えた後、加熱振とう反応器（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｈａｋｅｒ）中、７８℃で１時間反応させた。ＴＬＣ検出では工程ＩＩの原料は検出されなかった。反応終了後、反応管内の溶媒を常温で蒸発乾固し、１１０のアミノ脂質化合物Ｓ６ＳｘＤｙを得た。その中から代表的な１０化合物を選び、質量分析で測定した。結果を以下表２に示す。
実施例１．２．１：代表的なアミノ脂質化合物Ｓ６Ｓ１１Ｄ６のワンポット合成と特性評価
塩化シアヌル（１ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（１０ｍＬ）を２０ｍＬ乾燥反応瓶に加え、冷浴中で撹拌しながら－２０℃まで冷却し、その後、１－ヘキサンチオール（１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．２ｍｍｏｌ）を順次添加し、すぐに反応液に多量の析出物が生じた。５分間反応させた後、ＴＬＣ検出を行ったところ、反応は完了していた。反応液を室温まで温めた後、ウンデシルチオール（１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．２ｍｍｏｌ）を添加し、室温で撹拌しながら２時間反応させた。ＴＬＣ検出では工程Ｉの原料は検出されなかった。次にＮ，Ｎ－ジメチルプロパンジアミン（１．２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２ｍｏｌ）を加え、撹拌しながら７８℃に温め、１時間反応させた。ＴＬＣ検出では工程ＩＩの原料は検出されなかった。自動精製システムによる精製を行い（フォワードシリカカラム、０～１０％ＤＣＭ：ＭｅＯＨのグラジエントで溶出）、白色固体の４４５．１ｍｇを３工程の反応の収率９２％および純度９９％で得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.51 (m, 2H), 3.04-3.01 (m, 4H), 2.81-2.74 (m, 6H), 2.09 (m, 2H), 1.68 (m, 2H), 1.55 (m, 2H), 1.33 (m, 2H), 1.29 (m, 2H), 1.23 (m, 22H), 0.88-0.84 (m, 6H). ESI-MS 計算値 C25H50N5S2 + [M+H]+ 484.4, 測定値 484.4.
実施例１．３：Ｎ６ＮｘＤｙ系アミノ脂質化合物ライブラリーのパラレル合成と特性評価
式中、ｎ３、－ＮＲＲ、Ｒ1およびＲ2は上記の定義のとおりである。
塩化シアヌル（２ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（１０ｍＬ）を５０ｍＬ乾燥反応瓶に加え、冷浴中で撹拌しながら－２０℃まで冷却し、その後、１－ヘキシルアミン（２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２．４ｍｍｏｌ）を順次添加し、すぐに反応液に多量の析出物が生じた。５分間反応させた後、ＴＬＣ検出を行ったところ、反応は完了していた。反応液を１５ｍＬの遠心管に移し、１５ｍＬの容量に固定した後、遠心機で遠心分離した（２０００ｒ／ｍｉｎ，１分）。その後、工程Ｉの反応液（１５ｍＬ，０．１３Ｍ）を得た。
工程Ｉの反応液をピペットで１１本の１．５ｍＬ反応瓶（各１．１５ｍＬ，０．１５ｍｍｏｌ）に移し、直鎖アルキルアミン（０．１５ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡのＴＨＦ溶液（０．３５ｍＬ，０．５Ｍ）を対応する反応瓶に添加し、室温で撹拌しながら２時間反応させた。ＴＬＣ検出では工程Ｉの原料は検出されなかった。
各工程ＩＩの反応液をピペットで１．５ｍＬのＥＰ反応管１０本（各０．１ｍＬ，０．０１ｍｍｏｌ）に移し、ジアミンのＴＨＦ溶液（０．１２ｍＬ，０．０１２ｍｍｏｌ，０．１Ｍ）およびＤＩＰＥＡのＴＨＦ溶液（０．０２ｍＬ，０．１Ｍ）を対応するＥＰ反応管に加えた後、加熱振とう反応器（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｈａｋｅｒ）中、７８℃で１時間反応させた。ＴＬＣ検出では工程ＩＩの原料は検出されなかった。反応終了後、反応管内の溶媒を常温で蒸発乾固し、１１０のアミノ脂質化合物Ｎ６ＮｘＤｙを得た。その中から代表的な１０化合物を選び、質量分析で測定した。結果を表３に示す。
実施例１．３．１：代表的なアミノ脂質化合物Ｎ６Ｎ１１Ｄ６のワンポット合成と特性評価
塩化シアヌル（１ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（１０ｍＬ）を２０ｍＬ乾燥反応瓶に加え、冷浴中で撹拌しながら－２０℃まで冷却し、その後、１－ヘキシルアミン（１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．２ｍｍｏｌ）を順次添加し、すぐに反応液に多量の析出物が生じた。５分間反応させた後、ＴＬＣ検出を行ったところ、反応は完了していた。反応液を室温まで温めた後、ウンデシルアミン（１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．２ｍｍｏｌ）を添加し、室温で撹拌しながら２時間反応させた。ＴＬＣ検出では工程Ｉの原料は検出されなかった。次にＮ，Ｎ－ジメチルプロパンジアミン（１．２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２ｍｏｌ）を加え、撹拌しながら７８℃に温め、１時間反応させた。ＴＬＣ検出では工程ＩＩの原料は検出されなかった。自動精製システムによる精製を行い（フォワードシリカカラム、０～１０％ＤＣＭ：ＭｅＯＨのグラジエントで溶出）、白色固体の３９５．７ｍｇを３工程の反応の収率８８％および純度９９％で得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.54 (m, 2H), 3.05-3.02 (m, 4H), 2.82-2.73 (m, 6H), 2.08 (m, 2H), 1.69 (m, 2H), 1.54 (m, 2H), 1.34 (m, 2H), 1.30 (m, 2H), 1.24 (m, 22H), 0.89-0.85 (m, 6H). ESI-MS 計算値 C25H52N7 + [M+H]+ 450.4, 測定値 450.4.
実施例１．４：Ｓ６ＳｘＯｙ系アミノ脂質化合物ライブラリーのパラレル合成と特性評価
式中、ｎ４＝１、２、３または４；－ＮＲ’Ｒ’は、上記Ｏ１～Ｏ１０におけるジアルキルアミノまたは環状アミノ部位を表し；そして、Ｒ1およびＲ2は上記の定義のとおりである。
塩化シアヌル（２ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（１０ｍＬ）を５０ｍＬ乾燥反応瓶に加え、冷浴中で撹拌しながら－２０℃まで冷却し、その後、１－ヘキサンチオール（２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２．４ｍｍｏｌ）を順次添加し、すぐに反応液に多量の析出物が生じた。５分間反応させた後、ＴＬＣ検出を行ったところ、反応は完了していた。反応液を１５ｍＬの遠心管に移し、１５ｍＬの容量に固定した後、遠心機で遠心分離した（２０００ｒ／ｍｉｎ，１分）。その後、工程Ｉの反応液（１５ｍＬ，０．１３Ｍ）を得た。
工程Ｉの反応液をピペットで１１本の１．５ｍＬ反応瓶（各１．１５ｍＬ，０．１５ｍｍｏｌ）に移し、直鎖ヒドロカルビルチオール（０．１５ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡのＴＨＦ溶液（０．３５ｍＬ，０．５Ｍ）を対応する反応瓶に添加し、室温で撹拌しながら２時間反応させた。ＴＬＣ検出では工程Ｉの原料は検出されなかった。
各工程ＩＩの反応液をピペットで１．５ｍＬのＥＰ反応管１０本（各０．１ｍＬ，０．０１ｍｍｏｌ）に移し、ヒドロキシルアミンのＴＨＦ溶液（０．１２ｍＬ，０．０１２ｍｍｏｌ，０．１Ｍ）およびＤＩＰＥＡのＴＨＦ溶液（０．０２ｍＬ，０．１Ｍ）を対応するＥＰ反応管に加えた後、振とう反応器（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｈａｋｅｒ）中、室温で２時間反応させた。ＴＬＣ検出では工程ＩＩの原料は検出されなかった。反応終了後、反応管内の溶媒を常温で蒸発乾固し、１１０のアミノ脂質化合物Ｓ６ＳｘＯｙを得た。その中から代表的な１０化合物を選び、質量分析で測定した。結果を以下表１．４に示す。
実施例１．４．１：代表的なアミノ脂質化合物Ｓ１９Ｓ９Ｏ８のワンポット合成と特性評価
塩化シアヌル（１ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（１０ｍＬ）を２０ｍＬ乾燥反応瓶に加え、冷浴中で撹拌しながら－２０℃まで冷却し、その後、１－オレイルチオール（１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．２ｍｍｏｌ）を順次添加し、すぐに反応液に多量の析出物が生じた。５分間反応させた後、ＴＬＣ検出を行ったところ、反応は完了していた。反応液を室温まで温めた後、１－ノニルチオール（１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．２ｍｍｏｌ）を添加し、室温で撹拌しながら２時間反応させた。ＴＬＣ検出では工程Ｉの原料は検出されなかった。次に、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－ピロリジン（１．２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２ｍｏｌ）を加え、室温で２時間反応させた。ＴＬＣ検出では工程ＩＩの原料は検出されなかった。自動精製システムによる精製を行い（フォワードシリカカラム、０～１０％ＤＣＭ：ＭｅＯＨのグラジエントで溶出）、白色固体の５４６．２ｍｇを３工程の反応の収率８６％および純度９９％で得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.35 (m, 2H), 4.21 (m, 2H), 3.51 (m, 4H), 2.67-2.54 (m, 6H), 2.19 (m, 4H), 1.68 (m, 4H), 1.55-1.23 (m, 38H), 0.88-0.84 (m, 6H). ESI-MS 計算値 C36H67N4OS2 + [M+H]+ 635.5, 測定値 635.7.
実施例２：アミノ脂質化合物から調製した脂質ナノ粒子によるルシフェラーゼｍＲＮＡのインビボ送達性能の評価
１．脂質ナノ粒子の調製
配合法１．
本発明のアミノ脂質化合物をＤＯＰＥ、コレステロール、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧと４５：１０：４２．５：２．５のモル比で混合し、アミノ脂質化合物のモル濃度が０．００１～０．０１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように絶対エタノールに溶解させた。マイクロインジェクションポンプを用いて、得られたエタノール溶液とルシフェラーゼｍＲＮＡ（Fluc mRNA、ＴｒｉＬｉｎｋ社製）を溶解した酢酸ナトリウム溶液（５０ｍＭ、ｐＨ＝４．０）を、マイクロチャンネルチップ内で１：３の容量比で混合して脂質ナノ粒子の粗液を調製し、これを透析ボックス（Fisher, MWCO 20,000）を用いて１Ｘ ＰＢＳ中で６時間、４℃に制御しながら透析し、０．２２μｍの微多孔膜でろ過してから使用した。アミノ脂質化合物のFluc mRNAに対する質量比は約１０：１であった。得られた脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の溶液を、皮下投与により試験動物に投与した。
脂質ナノ粒子の特性評価：
粒子径の特性評価：調製した脂質ナノ粒子の粒子径とＰＤＩをＮａｎｏ－ＺＳＺＥＮ３６００（Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定した。ＬＮＰ溶液４０μＬを採取し、１回３０秒の循環を３回行い、粒子径測定を行った。カプセル化率の検出：ＬＮＰ ＲＮＡの濃度はＱｕｂｉｔ（登録商標）ＲＮＡ ＨＳアッセイキットを用いて検出した。理論上のＲＮＡ濃度は、投入したＲＮＡの総量を最終溶液の総量で割った値で与えた。
配合法２：
アミノ脂質化合物、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧを５０：１０：３８．５：１．５のモル比で使用した以外は配合法１と同じ方法で調製した。得られた脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）溶液を尾静脈注射および筋肉内注射により試験動物に投与した。
２．動物実験
動物の調製：体重約２０ｇの６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを選択し、ＳＰＦグレードの給餌室で飼育した。動物実験は、国立保健医療機関の指針および動物倫理の要求事項に従って厳重に実施した。
インビボ送達：９匹のマウスを各群にランダムに割り当て、脂質ナノ粒子溶液を皮下、筋肉内および尾静脈注射の３つの投与経路、Fluc mRNAの投与量を０．５ｍｇ／ｋｇで注射した（各投与経路とも３匹ずつ）。１２時間後、１０ｍｇ／ｍＬ Ｄ－フルオレセインカリウム塩（パーキンエルマー社製）２００μＬを尾静脈から各マウスに注射した。１０分後、マウスをインビボイメージングシステム（IVIS-200、Xenogen）下に置き、各マウスの総蛍光強度を観察し、記録用写真を撮影した。代表的なアミノ脂質化合物が３つの投与経路で送達するFluc mRNAの発現強度を表５－７に示す。DLin-MC3は対照として用いた。
実施例３：アミノ脂質化合物から調製した脂質ナノ粒子のオボアルブミンｍＲＮＡおよび免疫のインビボ送達における性能の評価
製剤化方法：
本発明のアミノ脂質化合物をＤＯＰＥ、コレステロール、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧと５０：１０：３８．５：１．５のモル比で混合し、アミノ脂質化合物のモル濃度が０．００１～０．０１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように絶対エタノールに溶解させた。オボアルブミンｍＲＮＡ（ＯＶＡ ｍＲＮＡ、ＴｒｉＬｉｎｋ）を酢酸ナトリウム溶液（５０ｍＭ、ｐＨ＝４．０）に溶解させた。マイクロインジェクションポンプを用いて、得られたエタノール溶液と酢酸ナトリウム溶液（５０ｍＭ、ｐＨ＝４．０）をマイクロチャンネルチップ内で体積比１：３で混合して脂質ナノ粒子の粗液を調製し、透析ボックス（Ｆｉｓｈｅｒ、ＭＷＣＯ ２０，０００）を用いて１Ｘ ＰＢＳ中で４℃の温度制御下で６時間透析し、０．２２μｍのマイクロポーラスフィルター膜でろ過してから使用した。アミノ脂質化合物とオボアルブミンｍＲＮＡ（ＯＶＡ ｍＲＮＡ）の質量比は約１０：１であった。
動物の調製：体重約２０ｇの６週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを選択し、ＳＰＦグレードの給餌室で飼育した。動物実験は、国立保健医療機関のガイドラインおよび動物倫理の要件に厳重に従って実施された。
インビボ送達：各群に３匹のマウスを無作為に割り当て、脂質ナノ粒子溶液を０．５ｍｇ／ｋｇ ｍＲＮＡの用量で脚部に筋肉内注射した（０日目）。７日後、同用量でブースター注射を１回行った（７日目）。２１日目に、血清学的分析のために尾静脈から採血を行った。ＤＬｉｎ－ＭＣ３はコントロールとして使用した（図１）。
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）：平底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）にプレコートし、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中に１ウェルあたり０．５μｇタンパク質の濃度のＯＶＡタンパク質を入れ、４℃で一晩静置し、５％グリシンでブロッキングを行った。ｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子溶液を投与した動物から得た血清をｐＨ７．４のＰＢＳ－０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ－Ｔ）で１０2から１０6倍に希釈し、ウェルに加え、室温でインキュベートし３７℃で１時間置いた。ヤギ抗マウスに結合したＩｇＧ西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ，Invitrogen）を１：１０，０００希釈率のＰＢＳ－Ｔ－１％ ＢＳＡ中で標識に使用した。ＨＲＰ基質を添加した後、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。図１に示すように、Ｓ７Ｓ１８Ｄ３、Ｓ１６Ｎ７Ｄ９、Ｓ１９Ｓ９Ｏ８、Ｓ１９Ｓ９Ｏ９のＩｇＧ抗体価は、コントロールのそれよりも顕著に優れていた。
実施例４：ＤＮＡベクターとしてのアミノ脂質化合物の予備的スクリーニング
細胞株：ＨＥＫ２９３細胞（ATCC CRL-1573TM）
培地：１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ（Invitrogen）
スクリーニング方法：９６ウェルプレートへの細胞トランスフェクション
検出（読み出し）：細胞総数に対するＧＦＰ蛍光細胞数の割合（細胞総数は核染色剤ヘキストを用いて測定－図２参照）。陽性対照として、Lipofectamine2000（Invitrogen）を製造元の説明書に従って使用した。
方法：試料の添加には、８チャンネルピペットを使用した。示した内容は９６ウェルフラットプレートの単一ウェルのものである。
１．実施例１で調製した化合物（０．０１ｍｍｏｌ）を無水エタノール１ｍＬに溶解させた。超音波溶解後、得られたエタノール中のアミノ脂質溶液１０μＬを取り、エタノール中のＤＯＰＥ溶液（０．０１ｍ）５μＬと混合し、得られた混合物に０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）３５μＬを加え、３０秒間一定の回転速度でボルテックスしリポソーム溶液５０μＬを調製した。５０μＬのリポソーム溶液から４μＬを取り、４６μＬの０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）に加え、３０秒間一定の回転速度でボルテックスして最終リポソーム溶液を形成させた。最終リポソーム溶液から５μＬを取り、５μＬの０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解した７５ｎｇプラスミドＤＮＡ（psin-EGFP-IRES-Puro, Clontech）と混合し、室温で３０分静置して脂質／ＤＮＡトランスフェクション複合体を形成させた。
２．１０μＬの脂質／ＤＮＡトランスフェクション複合体を室温で３０分間インキュベートした後、９０μＬの新鮮な再懸濁細胞（３－５×１０4細胞）を加え、ピペットで混合した。１００μＬの細胞＋脂質／ＤＮＡ複合体を９６ウェル培養プレートの別々のウェルに直ちに移し、３７℃で５％ＣＯ2を含むインキュベーターに入れた。
３．Hoechst33258（Invitrogen）を最終濃度０．２μｇ／ｍＬで、最初の細胞トランスフェクションから２０～２４時間後に添加し、３７℃、暗黒下で１５分間培養を行った。その後、細胞をＰＢＳ溶液で１回洗浄し、培地を加えて２０～２４時間培養した。
４．細胞をハイスループット共焦点顕微鏡（Molecular Devices ImageXpress）内に設置し、各ウェルについて４視野の細胞像を撮影し、各サンプルについて３つのレーザー波長での画像を撮影した：細胞の明視野画像（図２（ａ）、図２（ｂ））、全核を示すヘキスト染色画像（図２（ｃ）、図２（ｄ））、プラスミドＤＮＡのトランスフェクション成功とＧＦＰの発現を示すＧＦＰ像（図２（ｅ）、図２（ｆ））の３つの画像を取得した。MetaXpressソフトウェアを用いて、ヘキスト染色画像とＧＦＰ像の細胞を別々にカウントし、ＧＦＰを発現している細胞数を核の総数で割って、絶対細胞トランスフェクション効率を出した。絶対トランスフェクション効率は、以下のように算出した：
結果：２５３０化合物のＨＥＫ２９３細胞におけるＤＮＡトランスフェクション効率を表８に示す。
実施例５：ｍＲＮＡベクターとしてのアミノ脂質化合物の予備的スクリーニング
細胞株：ＨＥＫ２９３細胞（ATCC CRL-1573TM）
培地：１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ（Invitrogen）
スクリーニング：９６ウェルプレートへの細胞トランスフェクション
検出（読み出し）：細胞総数に対するＧＦＰ蛍光細胞数の割合（細胞総数は核染色剤ヘキストを用いて測定）。陽性対照として、Lipofectamine2000（Invitrogen）を使用した。
方法：実験方法は基本的に実施例４と同様であり、トランスフェクション用のＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ）の質量は５０ｎｇ／ウェルであった。
結果：２５３０化合物のＨＥＫ２９３細胞における絶対ｍＲＮＡトランスフェクション効率を表９に示す。
実施例６：アミノ脂質化合物をＤＮＡベクターとして用いたＨｅｌａ細胞株のトランスフェクション
細胞株：Ｈｅｌａ細胞（ATCC35241）
培地：１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ（Invitrogen）
スクリーニング：９６ウェルプレートでの細胞トランスフェクション
検出（読み出し）：全細胞数に対するＧＦＰ蛍光細胞数の割合（全細胞数は核染色剤ヘキストを用いて求めた）。陽性対照として、Lipofectamine2000（Invitrogen）を製造元の説明書に従って使用した。
方法：実験方法は基本的に実施例４と同様であった。
結果：１７０化合物のＨｅｌａ細胞における絶対ＤＮＡトランスフェクション効率を表１０に示す。
実施例７：アミノ脂質化合物をｍＲＮＡベクターとして用いたＨｅｌａ細胞株のトランスフェクション
細胞株：Ｈｅｌａ細胞（ATCC 35241）
培地：１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ（Invitrogen）
スクリーニング：９６ウェルプレートでの細胞トランスフェクション
検出（読み出し）：全細胞数に対するＧＦＰ蛍光細胞数の割合（全細胞数は核染色剤ヘキストを用いて求めた）。陽性対照として、市販のリポソームトランスフェクション試薬Lipofectamine2000（Invitrogen）を製造元の説明書に従って使用した。
方法：実験方法は実施例４と基本的に同じであり、トランスフェクション用のＥＧＦＰ ｍＲＮＡの質量は１ウェルあたり５０ｎｇであった。
結果：１７０化合物のＨｅｌａ細胞における絶対ｍＲＮＡトランスフェクション効率を表１１に示す。
実施例８：アミノ脂質化合物をＤＮＡベクターとして用いたＭＣＦ７細胞株のトランスフェクション
細胞株：ＭＣＦ７細胞（ATCC HTB-22）
培地：１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ
スクリーニング：９６ウェルプレートでの細胞トランスフェクション
検出（読み出し）：全細胞数に対するＧＦＰ蛍光細胞数の割合（全細胞数は核染色剤ヘキストを用いて測定）。陽性対照として、Lipofectamine2000を製造元の指示に従い使用した。
方法：実験方法は、基本的に実施例４と同じである。
結果：１０２化合物のＭＣＦ７細胞における絶対ＤＮＡトランスフェクション効率を表１２に示す。
実施例９：アミノ脂質化合物をｍＲＮＡベクターとしたＭＣＦ７細胞株のトランスフェクション
細胞株：ＭＣＦ７細胞（ATCC HTB-22）
培地：１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ（Invitrogen）
スクリーニング：９６ウェルプレートでの細胞トランスフェクション
検出（読み出し）：全細胞数に対するＧＦＰ蛍光細胞数の割合（全細胞数は核染色剤ヘキストを用いて求めた）。陽性対照としてLipofectamine2000（Invitrogen）を使用した。
方法：実験方法は基本的に実施例４と同様であり、トランスフェクション用のＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ）の質量は５０ｎｇ／ウェルであった。
結果：１０２化合物のＭＣＦ７細胞における絶対ｍＲＮＡトランスフェクション効率を表１３に示す。
実施例１０：トランスフェクションが困難な細胞株（胚性幹細胞）におけるアミノ脂質化合物のＤＮＡベクターとしてのスクリーニング
細胞株：胚性幹細胞（ｈＥＳＣ２、報告されている方法（Stem Cells, 2005, 23, 544-549）に従って培養。）
培地：ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）
スクリーニング方法：９６ウェルプレートへの細胞トランスフェクション
検出（読み出し）：全細胞数に対するＧＦＰ蛍光細胞数の割合。陽性対照としてLipofectamine Stemを使用した。
方法：試料の添加には、８チャンネルピペットを使用した。示した内容は９６ウェルフラットプレートの単一ウェルのものである。
１．幹細胞は、マトリゲルで処理した９６ウェルプレートで、１ウェルあたり３～５×１０4 個になるように培養した。
２．実施例１で調製した化合物（０．０１ｍｍｏｌ）を無水エタノール１ｍＬに溶解させた。超音波溶解後、得られたエタノール中のアミノ脂質溶液１０μＬを取り、エタノール中のＤＯＰＥ溶液（０．０１ｍ）５μＬと混合した。次に、得られた混合液に３５μＬの０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）を加え、一定の回転速度で３０秒間ボルテックスした。次に、得られた生成物から４μＬを取り、４６μＬの０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）に加え、３０秒間一定の回転速度でボルテックスしてリポソーム溶液を形成した。このリポソーム溶液５μＬを０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液５μＬに溶解したプラスミドＤＮＡ（pSin-EGFP-IRES-Puro）７５ｎｇと混合し、室温で３０分間静置して脂質／ＤＮＡトランスフェクション複合体を形成させた。
３．脂質／ＤＮＡトランスフェクション複合体１０μＬを室温で３０分間インキュベートした後、９０μＬ ｍＴｅＳＲ１培地を加え、ピペットで混合した。１００μＬの混合物を９６ウェル培養プレートの別々のウェルに加え、５％ＣＯ2を含むインキュベーターに３７℃で静置した。
４．トランスフェクションから４８時間後、細胞を０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡで消化した。細胞をＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、濾過した。細胞懸濁液をフローサイトメーターに入れ、細胞トランスフェクションの絶対効率を得るために、２０００個以上の細胞におけるＧＦＰ発現細胞数を測定した。細胞トランスフェクションの相対効率は、陽性対照であるLipofectamine Stemと細胞トランスフェクション効率を比較することにより求めた。
結果：６０化合物の胚性幹細胞における絶対ＤＮＡトランスフェクション効率を表１４に示す。
実施例１１：トランスフェクションが困難な細胞株（胚性幹細胞）におけるアミノ脂質化合物のｍＲＮＡベクターとしてのスクリーニング
細胞株：胚性幹細胞（ｈＥＳＣ２、報告されている方法（Stem Cells, 2005, 23, 544-549）に従って培養。）
培地：ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）
スクリーニング方法：９６ウェルプレートへの細胞トランスフェクション
検出（読み出し）：全細胞数に対するＧＦＰ蛍光細胞数の割合。陽性対照としてLipofectamine Stemを使用した。
方法：実験方法は実施例１０と基本的に同じであり、トランスフェクション用のＥＧＦＰ ｍＲＮＡの質量は１ウェルあたり５０ｎｇであった。
結果：６０化合物の胚性幹細胞における絶対ｍＲＮＡトランスフェクション効率を表１５に示す。
実施例１２：トランスフェクションが困難な細胞株（心筋細胞）におけるアミノ脂質化合物のｍＲＮＡベクターとしてのスクリーニング
細胞株：心筋細胞（ｈＥＳＣを報告されている方法（J. Mol.Cell.Cardiol.2011, 51, 288-298）に従って分化誘導して得たもの。）
培地：１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ（Invitrogen）
スクリーニング方法：９６ウェルプレートへの細胞トランスフェクション
検出（読み出し）：全細胞数に対するＧＦＰ蛍光細胞数の割合（全細胞数は核染色剤ヘキストを用いて測定）。陽性対照として、Lipofectamine Stem（Invitrogen）を製造元の説明書に従って使用した。
方法：実験方法は、基本的に実施例４と同じである。
結果：６０化合物の心筋細胞における絶対ＤＮＡトランスフェクション効率を表１６に示す。
実施例１３：トランスフェクションが困難な細胞株（心筋細胞）におけるアミノ脂質化合物のｍＲＮＡベクターとしてのスクリーニング
細胞株：心筋細胞（ｈＥＳＣを報告されている方法（J. Mol.Cell.Cardiol.2011, 51, 288-298）に従って分化誘導して得たもの。）
培地：１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ（Invitrogen）
スクリーニング方法：９６ウェルプレートへの細胞トランスフェクション
検出（読み出し）：全細胞数に対するＧＦＰ蛍光細胞数の割合（全細胞数は核染色剤ヘキストを用いて測定）。陽性対照として、Lipofectamine Stem（Invitrogen）を製造元の説明書に従って使用した。
方法：実験方法は実施例４と基本的に同じであり、トランスフェクション用のＥＧＦＰ ｍＲＮＡの質量は１ウェルあたり５０ｎｇであった。
結果：６０化合物の心筋細胞における絶対ｍＲＮＡトランスフェクション効率を表１７に示す。
略語の一覧：
ＤＭＥＭ 基本高グルコース培地
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ＤＯＰＥ ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＳＰＣ ジステアロイルホスファチジルコリン
ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ １，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００
ＧＦＰ 緑色蛍光タンパク質
ＥＧＦＰ エンハンスドＧＦＰ
ＫＤ キロダルトン
ＲＮＡ リボ核酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＤＩＰＥＡ Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＰＢＳ リン酸緩衝液
本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な変更は、前述の説明から当業者には明らかになるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることが意図されている。本願で引用した全ての文献（全ての特許、特許出願、雑誌記事、書籍およびその他の出版物を含む）は、参照することによりその全体が本願に組み込まれる。

Claims (31)

  1. アミノ脂質化合物であって、
    前記アミノ脂質化合物が式Ｉで表される化合物である、アミノ脂質化合物；
    式中、
    Ｒ1およびＲ2は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ6－Ｃ24アルキル、Ｃ6－Ｃ24アルケニル、Ｃ6－Ｃ24アルキニルおよびＣ4－Ｃ24アシルからなる群より選択され、ここで、前記Ｃ6－Ｃ24アルキル、前記Ｃ6－Ｃ24アルケニル、前記Ｃ6－Ｃ24アルキニル、および前記Ｃ4－Ｃ24アシルはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換され；
    Ｘ1は、Ｃ、Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、およびＳ－Ｓからなる群より選択され；
    Ｘ2およびＸ3は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、およびＳ－Ｓからなる群より選択され；
    Ｘ1がＣであるとき、ｍ＝２であり、２つのＲ6は互いに同一または異なり；Ｘ1がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、またはＳ－Ｓであるとき、ｍ＝０であり；
    Ｘ2がＣであるとき、ｎ＝２であり、２つのＲ7は互いに同一または異なり；Ｘ2がＮであるとき、ｎ＝１であり；Ｘ2がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、またはＳ－Ｓであるとき、ｎ＝０であり；
    Ｘ3がＣであるとき、ｐ＝２であり、２つのＲ8は互いに同一または異なり；Ｘ3がＮであるとき、ｐ＝１であり；Ｘ3がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、またはＳ－Ｓであるとき、ｐ＝０であり；
    Ｒ3およびＲ4は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ1－Ｃ12アルキル、Ｃ2－Ｃ12アルケニル、およびＣ2－Ｃ12アルキニルからなる群より選択され、ここで、前記Ｃ1－Ｃ12アルキル、前記Ｃ2－Ｃ12アルケニル、および前記Ｃ2－Ｃ12アルキニルはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換され、または、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して、窒素、硫黄、および酸素から選択される１～６個のヘテロ原子を含む任意に置換された４～１０員複素環を形成しており；
    Ｒ5は存在しないか、または、Ｒ5は水素もしくはＣ1－Ｃ12アルキルであり第四級アミンを提供し；
    Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8は水素またはＣ1－Ｃ12アルキルであり；
    Ｌは、Ｃ1－Ｃ12アルキレン、Ｃ2－Ｃ12アルケニレン、またはＣ2-Ｃ12アルキニレンであり、ここで、前記Ｃ1－Ｃ12アルキレン、前記Ｃ2－Ｃ12アルケニレン、および前記Ｃ2－Ｃ12アルキニレンはヒドロカルビル、カルボキシル、アシル、およびアルコキシからなる群より選択される１つ以上の置換基で任意に置換されているか、または、Ｌは、窒素、硫黄、および酸素から選択されるヘテロ原子を含む任意に置換された４～１０員複素環である。
  2. 請求項１に記載のアミノ脂質化合物であって、
    式中、
    Ｘ1がＣ、Ｒ6がＨ、およびｍ＝２であり；または、Ｘ1がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、もしくはＳ－Ｓ、およびｍ＝０であり；
    ならびに／または
    Ｘ2がＣ、Ｒ7がＨおよびｎ＝２であり；または、Ｘ2がＮ、Ｒ7がＨ、およびｎ＝１であり；または、Ｘ2がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、もしくはＳ－Ｓ、およびｎ＝０であり；
    ならびに／または
    Ｘ3がＣ、Ｒ8がＨ、およびｐ＝２であり；または、Ｘ3がＮ、Ｒ8がＨ、およびｐ＝１であり；または、Ｘ3がＯ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、Ｓ（＝Ｏ）2、もしくはＳ－Ｓ、およびｐ＝０である、
    アミノ脂質化合物。
  3. 請求項１に記載のアミノ脂質化合物であって、
    Ｘ2が、ＮまたはＳであり；
    Ｘ1がＳのとき、ｍ＝０であり；
    Ｘ2がＮのとき、ｎ＝１であり；Ｘ2がＳのとき、ｎ＝０であり；
    ならびに／または、
    Ｘ3がＮ、およびｐ＝１であり；または、Ｘ3がＯ、およびｐ＝０であり；
    ならびに／または、
    Ｒ5は存在せず； ならびに／または、
    Ｌは、Ｃ1－Ｃ12アルキレンであり、前記Ｃ1－Ｃ12アルキレンはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換されている、アミノ脂質化合物。
  4. 請求項３に記載のアミノ脂質化合物であって、Ｌが（ＣＨ2）qであり、ここでｑは１～１２の整数である、アミノ脂質化合物。
  5. 請求項４に記載のアミノ脂質化合物であって、ｑが１～８の整数である、アミノ脂質化合物。
  6. 請求項４に記載のアミノ脂質化合物であって、ｑが１～６の整数である、アミノ脂質化合物。
  7. 請求項３～６のいずれか一項に記載のアミノ脂質化合物であって、
    ｎ＝１のときＲ7は水素であり; および／または、
    Ｒ8は水素である、アミノ脂質化合物。
  8. 請求項１、３～７のいずれか一項に記載のアミノ脂質化合物であって、
    Ｒ1およびＲ2は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ6－Ｃ24アルキルまたはＣ6－Ｃ24アルケニルであり；
    Ｘ1がＳおよびｍ＝０であり；
    Ｘ2がＮ、Ｒ7がＨ、およびｎ＝１であるか；または、Ｘ2がＳおよびｎ＝０であり；
    Ｘ3がＮ、Ｒ8がＨ、およびｐ＝１であり；
    Ｒ3およびＲ4は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ1－Ｃ12アルキルであり、ここで、前記Ｃ1－Ｃ12アルキルはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換され、または、Ｒ3およびＲ4は互いに結合して、窒素、硫黄、および酸素から選択される１～６個のヘテロ原子を含む任意に置換された４～１０員複素環を形成しており；そして
    Ｒ5は存在しない、アミノ脂質化合物。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載のアミノ脂質化合物であって、
    Ｌが、Ｃ1－Ｃ4アルキレンであり、前記Ｃ1－Ｃ4アルキレンはＣ1－Ｃ6ヒドロカルビルで任意に置換されている、アミノ脂質化合物。
  10. 請求項９に記載のアミノ脂質化合物であって、ＬがＣ2－Ｃ4アルキレンである、アミノ脂質化合物。
  11. 請求項９に記載のアミノ脂質化合物であって、Ｌが（ＣＨ2）qであり、ここで、ｑは１、２、３、または４である、アミノ脂質化合物。
  12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のアミノ脂質化合物であって、
    Ｒ1およびＲ2は、互いに同一または異なり、互いに独立してＣ6－Ｃ18アルキルまたはＣ6－Ｃ18アルケニルである、アミノ脂質化合物。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のアミノ脂質化合物であって、
    Ｘ 1 がＳであり、Ｘ 2 がＮであり、Ｘ 3 がＮである、アミノ脂質化合物。
  14. 請求項１～６および８～１２のいずれか一項に記載のアミノ脂質化合物であって、
    Ｘ 1 がＳであり、Ｘ 2 がＳであり、Ｘ 3 がＮである、アミノ脂質化合物。
  15. 請求項１～６および９～１２のいずれか一項に記載のアミノ脂質化合物であって、
    Ｘ 1 がＳであり、Ｘ 2 がＳであり、Ｘ 3 がＯである、アミノ脂質化合物。
  16. 請求項１、３～１５のいずれか一項に記載のアミノ脂質化合物であって、
    ｍ＝０であり、ｎ＝０または１であり、
    が、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｓ１６、Ｓ１８、Ｓ１９、およびＳ２０から選択される１つであり、
    が、Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ１１、Ｓ１２、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｓ１６、Ｓ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１１、Ｎ１２、Ｎ１３、Ｎ１５、Ｎ１６、Ｎ１８，および2Ｎ12から選択される１つである、アミノ脂質化合物。
    Ｓ６：ＣＨ3（ＣＨ2）5Ｓ－； Ｓ７：ＣＨ3（ＣＨ2）6Ｓ－； Ｓ８：ＣＨ3（ＣＨ2）7Ｓ－； Ｓ９：ＣＨ3（ＣＨ2）8Ｓ－； Ｓ１０：ＣＨ3（ＣＨ2）9Ｓ－； Ｓ１１：ＣＨ3（ＣＨ2）10Ｓ－； Ｓ１２：ＣＨ3（ＣＨ2）11Ｓ－； Ｓ１４：ＣＨ3（ＣＨ2）13Ｓ－； Ｓ１５：ＣＨ3（ＣＨ2）14Ｓ－； Ｓ１６：ＣＨ3（ＣＨ2）15Ｓ－； Ｓ１８：ＣＨ3（ＣＨ2）17Ｓ－；
    Ｎ６：ＣＨ3（ＣＨ2）5ＮＨ－； Ｎ７：ＣＨ3（ＣＨ2）6ＮＨ－； Ｎ８：ＣＨ3（ＣＨ2）7ＮＨ－； Ｎ９：ＣＨ3（ＣＨ2）8ＮＨ－； Ｎ１１：ＣＨ3（ＣＨ2）10ＮＨ－； Ｎ１２：ＣＨ3（ＣＨ2）11ＮＨ－； Ｎ１３：ＣＨ3（ＣＨ2）12ＮＨ－； Ｎ１５：ＣＨ3（ＣＨ2）14ＮＨ－； Ｎ１６：ＣＨ3（ＣＨ2）15ＮＨ－； Ｎ１８：ＣＨ3（ＣＨ2）17ＮＨ－； 2Ｎ12：（ＣＨ3（ＣＨ2）11）2Ｎ－
  17. 請求項１、３～１６のいずれか一項に記載のアミノ脂質化合物であって、
    ｐ＝１であり、
    が、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９およびＤ１０から選択される１つである、アミノ脂質化合物。
  18. 請求項１、３～１７のいずれか一項に記載のアミノ脂質化合物であって、
    Ｘ3がＯであり；
    ｐが０であり；
    Ｒ5は存在せず；
    が、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４、Ｏ５、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ９およびＯ１０から選択される１つである、アミノ脂質化合物。
  19. 請求項１～１８のいずれか一項に記載のアミノ脂質化合物の調製方法であって、
    （１）塩化シアヌルとＲ1（Ｒ6）m－Ｘ1Ｈで表される化合物との間の、－４０℃～３０℃の温度での酸結合剤としての塩基の存在下での、式Ｉ－１の第一中間体を得る第一反応を行う工程；
    （２）第一中間体を分離し、または第一中間体を分離することなく、前記第一中間体とＲ2（Ｒ7）n－Ｘ2Ｈで表される化合物との間の、室温または加熱条件下での、酸結合剤としての塩基の存在下での、式Ｉ－２の第二中間体を得る第二反応を行う工程；
    （３）第二中間体を分離し、または第二中間体を分離することなく、前記第二中間体とＨＸ3（Ｒ8）p－Ｌ－ＮＲ3Ｒ4Ｒ5で表されるジアミンとの間の、加熱条件下での、式Ｉのアミノ脂質化合物を得る第三反応を行う工程
    を含む、調製方法；
    式中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、ｍ、ｎ、およびｐの定義は、請求項１～１５のいずれか一項の定義と同じである。
  20. 請求項１９に記載の調製方法であって、
    工程（１）の前記温度が－３０℃～３０℃であり、
    工程（２）において、第二反応が第一中間体を分離することなく行なわれ、および／または
    工程（３）において、第三反応が第二中間体を分離することなく行なわれ、および／または
    工程（３）において、さらに酸結合剤としての塩基の存在下で第三反応が行なわれる、調製方法。
  21. 請求項１～１８のいずれか１項に記載のアミノ脂質化合物を含む脂質粒子。
  22. 請求項２１に記載の脂質粒子であって、前記脂質粒子が脂質ナノ粒子、リポソーム、多層小胞またはミセルである、脂質粒子。
  23. 請求項２１または２２に記載の脂質粒子であって、前記脂質粒子が、さらに、ヘルパー脂質、ステロールおよび生理活性物質のうちの１つ以上を含む脂質粒子。
  24. 請求項２３に記載の脂質粒子であって、前記脂質粒子は、さらにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含み；および／または
    前記脂質粒子におけるアミノ脂質化合物とヘルパー脂質のモル比が（２～１０）：１であり；および／または
    前記脂質粒子中のアミノ脂質化合物とステロールのモル比が（０．５～１．５）：１であり；および／または
    前記ヘルパー脂質は非カチオン性脂質であり；および／または
    前記ステロールは、コレステロール、シトステロール、スチグマステロールおよびエルゴステロールからなる群から選択される１つ以上であり；および／または
    前記生理活性物質が、核酸、抗腫瘍剤、抗生物質、免疫調節剤、抗炎症剤、中枢神経系に作用する薬剤、抗原またはその断片、ペプチド、タンパク質、抗体、ワクチンおよび低分子のうちの１つ以上である、脂質粒子。
  25. 請求項２４に記載の脂質粒子であって、
    前記脂質粒子におけるアミノ脂質化合物とヘルパー脂質のモル比が（３～８）：１であり；および／または
    前記脂質粒子中のアミノ脂質化合物とステロールのモル比が（１～１．４）：１であり；および／または
    前記脂質粒子中のアミノ脂質化合物とＰＥＧ－脂質のモル比が（９～４２）：１であり；および／または
    前記ヘルパー脂質が非カチオン性リン脂質であり；および／または
    前記ステロールがコレステロールであり；および／または
    前記ＰＥＧ－脂質がＰＥＧ１０００－ＤＭＧ、ＰＥＧ５０００－ＤＭＧ、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧおよびＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥからなる群から選択される１つ以上であり；および／または
    前記核酸が、ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、プラスミド、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、転位ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）である、脂質粒子。
  26. 請求項２５に記載の脂質粒子であって、
    前記脂質粒子におけるアミノ脂質化合物とヘルパー脂質のモル比が、（４～６）：１であり；および／または
    前記脂質粒子中のアミノ脂質化合物とステロールのモル比が（１～１．３）：１であり；および／または
    前記脂質粒子中のアミノ脂質化合物とＰＥＧ－脂質のモル比が（１２～３８）：１であり；および／または
    前記非カチオン性リン脂質がＤＯＰＥ、ＤＳＰＣまたはそれらの組み合わせであり；および／または
    前記ＰＥＧ－脂質がＰＥＧ２０００－ＤＭＧである、脂質粒子。
  27. 請求項２６に記載の脂質粒子であって、
    好ましくは、前記脂質粒子におけるアミノ脂質化合物とヘルパー脂質のモル比が４：１、４．５：１または５：１であり；および／または
    前記脂質粒子中のアミノ脂質化合物とＰＥＧ－脂質のモル比が（１６～３６）：１である、脂質粒子。
  28. 請求項２７に記載の脂質粒子であって、
    前記脂質粒子中のアミノ脂質化合物とＰＥＧ－脂質のモル比が（１８～３４）：１である、脂質粒子。
  29. 請求項２１～２８のいずれか一項に記載の脂質粒子を含む医薬であって、核酸導入、遺伝子治療、遺伝子ワクチン接種、アンチセンス治療またはＲＮＡ干渉による治療における使用のための医薬。
  30. 請求項２９に記載の使用のための医薬であって、
    前記脂質粒子は、生理活性物質をカプセル化するためのベクターとして使用され；および／または
    前記遺伝子治療は、癌および遺伝性疾患の治療に有用であり；および／または
    前記遺伝子ワクチン接種は癌、アレルギー、毒性および病原体感染の治療に有用であり；および／または
    前記核酸がＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、プラスミド、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、転位ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）である、医薬。
  31. 請求項３０に記載の使用のための医薬であって、
    前記癌が肺癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、大腸癌、膵臓癌、脳腫瘍、リンパ系癌、血液癌、または前立腺癌のいずれか一つ以上であり；および／または
    前記遺伝性疾患が血友病、サラセミア、およびゴーシェ病のいずれか一つ以上であり；および／または
    前記病原体が、ウイルス、細菌、真菌のいずれか１つ以上である、医薬。
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