JP2010537972A - 新規の正イオン性脂質、それの製造方法、およびそれを含む伝達体 - Google Patents
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Abstract
本発明の正イオン性脂質は、核酸または負イオン性生理活性タンパク質伝達体の製造のために用いられる。本発明の正イオン性脂質は、製造および精製工程が簡便で大量生産時の経済性が高い。また、本発明の正イオン性脂質を含む核酸またはタンパク質伝達体は、細胞内に伝達しようとするデオキシリボ核酸、リボ核酸、低分子干渉RNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマー(aptamer)等の核酸医薬や生理活性を保有した負イオン性タンパク質を細胞内に輸送する効率を顕著に増強させるだけでなく、細胞毒性を減少させて核酸またはタンパク質素材の医薬の治療効能を増強させる用途で有用にに用いられる。
Description
本発明の正イオン性脂質は多様な形態の核酸伝達体または生理活性を保有した負イオン性タンパク質の伝達体で製剤化して細胞内へ目的する物質の伝達を増強させることに用いることができる。
(実施例1.ジオレオイルグルタミド(dioleoyl glutamide)の合成)
1-1).1当量(1.47g,10mmol)のグルタミン酸(glutamic acid)をトリフルオロ酢酸(trifluoroacetic acid) 5mlとジクロロメタン(dichloromethane)5mlに入れて、40℃にて1時間の撹はんを行った。撹はんの後、反応物にアイスバス中でSOCl23当量(2.18ml,30mmol)を徐々に滴下させて、0〜40℃で6時間反応させた。反応の後、トリフルオロ酢酸とジクロロメタンを減圧濃縮して除去して薄層クロマトグラフィー法(thin layer chromatography,TCL)で反応可否を確認した。
2.0(2H,グルタミン酸の−NH2)
5.42(2H,オレイルアミンの−CH=CH−)
2-1).2当量のグルタミン酸(glutamic acid)を実施例1-1)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
2.0(2H,グルタミン酸の−NH2)
1.29(2H,ミリスチルアミンの−CH2−)
3−1).2当量のグルタミン酸(glutamic acid)を実施例1-1)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
2.0(2H,グルタミン酸の−NH2)
1.29(2H,パルミチルアミンの−CH2−)
4−1).2当量のグルタミン酸(glutamic acid)を実施例1-1)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
2.0(2H,グルタミン酸の−NH2)
1.29(2H,ステアリルアミンの−CH2−)
5-1).2当量のグルタミン酸(glutamic acid)を実施例1-1)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
2.0(2H,グルタミン酸の−NH2)
1.29(2H,ラウリルアミンの−CH2−)
6−1).2当量のグルタミン酸(glutamic acid)を実施例1-1)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
2.0(2H,グルタミン酸の−NH2)
5.49,2.63(3H,リノレイルアミンの=CH−CH2-)
7-1).2当量のグルタミン酸(glutamic acid)を実施例1-1)と同じ方法で反応させてグルタミン酸誘導体生成物を得た。
2.0(2H,グルタミン酸の−NH2)
1.29(2H,アラキジルアミンの−CH2−)
8-1).2当量のアスパラギン酸(aspartic acid)を実施例1-1)と同じ方法で反応させてアスパラギン酸誘導体生成物を得た。
2.0(2H、アスパラギン酸の−NH2)
1.29(2H、パルミチルアミンの−CH2−)
9−1).2当量のアスパラギン酸(aspartic acid)を実施例1-1)と同じ方法で反応させてアスパラギン酸誘導体生成物を得た。
2.0(2H,アスパラギン酸の−NH2)
1.29(2H、ステアリルアミンの−CH2−)
10-1.2当量のアスパラギン酸(aspartic acid)を実施例1-1)と同じ方法で反応させてアスパラギン酸誘導体生成物を得た。
2.0(2H,アスパラギン酸の−NH2)
5.42(2H,オレイルアミンの−CH=CH−)
(実施例11.ジオレイルグルタミドを含有する正イオン性リポソームの製造)
実施例1で製造した正イオン性脂質のジオレオイルグルタミド(dioleoyl glutamide)と細胞融合性リン脂質のDOPE(Avanti Polar Lipid Inc.,USA)をそれぞれ1mlのクロロホルムに溶かした後、モル比1:1の割合でパイレックス(登録商標)10mlガラス隔膜バイアルに入れて混合した後、窒素環境ですべてのクロロホルムが蒸発する時まで低い速度で回転蒸発させて脂質薄膜フィルムを製造した。多重層の脂質膜を有するリポソーム(lipid multilamellar vesicle)を製造するためにこの薄膜フィルムにリン酸緩衝溶液1mlを添加してバイアルを37℃にして密封後3分間撹はん(vortexing)した。均一な大きさを作るためにこれをエクストルーダー(extruder、Northern Lipid Inc.,Canada)を用いて0.2μmポリカーボネート膜を3回通過させて製造した。得られた正イオン性リポソームは用いる前まで4℃で保管した。
実施例2で製造した正イオン性脂質であるジミリストイルグルタミド(dimyristoyl glutamide)と細胞融合性リン脂質であるDOPE(Avanti Polar Lipid Inc.,USA)をそれぞれ1mlのクロロホルムに溶かした後、モル比1:1の割合でパイレックス(登録商標)10mlガラス隔膜バイアルに入れて混合した後、実施例11と同じ方法で正イオン性リポソームを製造した。
実施例4で製造した正イオン性脂質のジステアロイルグルタミド(distearoyl glutamide)と細胞融合性リン脂質である1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン,DphPE(1,2−diphytanoyl−sn−glycero−3−phosphoethanolamine) (Avanti Polar Lipid Inc.,USA)をそれぞれ1mlのクロロホルムに溶かした後、モル比1:1の割合でパイレックス(登録商標)10mlガラス隔膜バイアルに入れて混合した後、実施例11と同じ方法で正イオン性リポソームを製造した。
実施例2で製造した正イオン性脂質のジミリストイルグルタミド(dimyristoyl glutamide)と界面活性剤のTween 20を1:1のモル割合で混合した後、混合液対比リン酸緩衝溶液を1:10の体積割合で混合して数回振とう混合(vortexing)した後、約1分間、超音波発生器を使って正イオン性ミセルを製造した。
実施例7で製造した正イオン性脂質であるジアラキドイルグルタミド(diarachidoyl glutamide)と界面活性剤のポリエチレングリコールモノオレイルエーテル(polyethylene glycol monooleyl ether)を1:2のモル割合で混合した後、混合液対比リン酸緩衝溶液を1:10の体積割合で混合して数回振とう混合(vortexing)した後、約1分間、超音波発生器を使って正イオン性ミセルを製造した。
実施例8で製造した正イオン性脂質のジパルミトイルアスパルタミド(dipalmitoyl aspartamide)とTween80を1:0.1のモル割合で混合して混合物をリン酸緩衝溶液に1:10の体積割合で加えた後、ホモジナイザー(homogenizer)を用いて約2分間均質化させて油滴が水内に分散された水中油型(o/w型)正イオン性エマルションを製造した。
実施例10で製造した正イオン性脂質のジオレオイルアスパルタミド(dioleoyl aspartamide)とTween80を1:0.1のモル割合で混合して混合物をリン酸緩衝溶液に1:10の体積割合で加えた後、ホモジナイザーを用いて約2分間均質化させて油滴が水内に分散した水中油型(o/w型)正イオン性エマルションを製造した。
実施例3で製造した正イオン性脂質のジパルミトイルグルタミド(dipalmitoyl glutamide)、細胞融合性リン脂質であるDphPE(Avanti Polar Lipid Ind.,USA)、およびガラクトース脂質誘導体のセレブロシド(cerebroside) (Avanti Polar Lipid Ind.,USA)をそれぞれ1mlのクロロホルムに溶かした後1:1:0.05のモル割合で実施例11と同じ方法で正イオン性リポソームを製造して表面にガラクトース残基(galactose moiety)が存在する正イオン性リポソームを製造した。
実施例7で製造した正イオン性脂質であるジアラキドイルグルタミド(diarachidoyl glutamide)と細胞融合性リン脂質であるDOPE(Avanti Polar Lipid Ind.,USA)、ポリエチレングリコール脂質誘導体の1,2−diacyl−sn−glycero−3−phsphoethanolamine−N−[methoxy(polyethylene glycol)−3000(Avanti Polar Lipid Ind.,USA)をそれぞれ1mlのクロロホルムに溶かした後、1:1:0.05のモル割合で実施例11と同じ方法で正イオン性リポソームを製造して表面にポリエチレングリコール グループが存在する正イオン性リポソームを製造した。
実施例9で製造した正イオン性脂質のジステアロイルアスパルタミド(distearoyl aspartamide)と葉酸脂質誘導体1,2-distearoyl−sn−glycero−3−phosphoethanolamine−N−[folate(polyethylene glycol)−2000 (Avanti Polar Lipid Ind.,USA)および界面活性剤のTween 20をそれぞれ1:0.05:1のモル割合で混合した後、1:10の混合液:リン酸緩衝溶液の体積割合で混合して数回振とう混合(vortexing)した後、約1分間、超音波発生器を使って正イオン性ミセルを製造した。
正イオン性脂質であるDC−Chol (Avanti Polar Lipid Ind.,USA)と細胞融合性リン脂質のDOPE(Avanti Polar Lipid Ind.,USA)をそれぞれ1mlのクロロホルムに溶かした後、モル比1:1の割合でパイレックス(登録商標)10mlガラス隔膜バイアルに入れて混合した後、窒素環境ですべてのクロロホルムが蒸発される時まで低い速度で回転蒸発させて脂質薄膜フィルムを製造した。多重層の脂質膜を有するリポソーム(lipid multilamellar vesicle)を製造するためにこの薄膜フィルムにリン酸緩衝溶液1mlを添加してバイアルを37℃にして密封後3分間撹はん(vortexing)した。均一な大きさを作るためにこれをエクストルーダー(extruder,Northern Lipid Inc.,Canada)を用いて0.2μmポリカーボネート膜を3回通過させて製造した。得られた正イオン性リポソームは用いる前まで4℃で保管した。
既存の販売されている正イオン性リポソームであるLipofectAMINE2000(Invitrogen,USA)を購入して説明書に記載された方法のとおりに使った。
(細胞培養)
人の子宮癌細胞株であるSiHaおよびHeLa、人の膣粘膜ケラチン細胞株(vaginal keratinocyte)であるVK2、人の肺癌細胞株であるA549、人の腎臓細胞株である293T、ネズミ(mouse)の肝癌細胞株であるHepa1−6は米国細胞株銀行(American Type Culture Collection,ATCC,USA)から購入して使った。SiHa、Hepa1−6細胞株は10%ウシ胎児血清w/v (CyClone laboratories Inc,USA)と100 unit/mlペニシリンまたは100μg/mlストレプトマイシンを含むDMEM(Dulbecco’s modified eagles medium,Gibco,USA)に培養した。A549細胞株は、10%のウシ胎児血清とペニシリン、ストレプトマイシンを含むRPMI 1640(Gibco,USA)で培養した。VK2細胞株は、0.1 ng/ml human再組合上皮細胞成長因子(Gibco,USA)、0.05mg/mlウシ脳下垂体抽出物(bovine pituitary extract(BPE,Gibco,USA))と100unit/mlペニシリンまたは100μg/mlストレプトマイシンを含むKeratinocyte−SFM(Gibco,USA)培地に培養した。
I-1.A549細胞株における低分子干渉RNAの伝達効率評価
A549細胞株を実験前日、24ウェルプレートにウェル当たり8×104個ずつ播種(seeding)し、各プレートの細胞が60−70%程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル当たり500μlずつ添加した。エッペンドルフ チューブに血清が含まれていない培地50μlずつを入れて蛍光標識のついている低分子干渉RNA物質であるBlock−iT(20μmol、Invitrogen、USA)2μlずつと比較例1と実施例11で製造された正イオン性リポソーム10μlをそれぞれ添加した。これらを徐々にピペット操作(pipetting)して混合した後、室温で20分間放置した。このように製造された複合体をウェルプレートに添加して37℃のCO2インキュベーターで24時間培養した。培養された細胞のメディアをウェル当たり500μlずつ新しいメディアに交換した後、蛍光顕微鏡で遺伝子伝達効率を観察した。図2は、比較例1(A,C)と実施例11(B,D)から製造された正イオン性リポソームの核酸伝達効率を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡で観察したものであって、Aは比較例処理時の位相差顕微鏡の写真であり、Bは実施例11の組成処理時の位相差顕微鏡の写真である。またCは、比較例処理時の蛍光マーカーで表示された低分子干渉RNAの細胞内への伝達を見せる蛍光顕微鏡の写真であり、Dは実施例11の組成処理時の蛍光顕微鏡の写真である。本図面から実施例11で本発明の正イオン性脂質を含有して製造された正イオン性リポソームが比較例1で製造された公知組成のリポソームよりA549細胞内で低分子干渉RNAの伝達効率を増加させることが分かる。
SiHa細胞株を実験前日24ウェルプレートにウェル当たり8×104個ずつ播種(seeding)した。各プレートの細胞が60−70%程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル当たり500μlずつ添加した。実験例I-1と同様の方法で比較例1および実施例13の正イオン性リポソームとBlock iTとの複合体をそれぞれ製造してウェルプレートに添加して37℃のCO2インキュベーターで24時間培養した。培養された細胞のメディアをウェル当たり500μlずつ新しいメディアに交換した後、蛍光顕微鏡で核酸伝達効率を観察した。図3は、比較例1(A,C)と実施例13(B,D)から製造された正イオン性リポソームの核酸伝達効率を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡とでそれぞれ観察したものであって、Aは比較例1のリポソーム処理時の位相差顕微鏡の写真であり、Bは実施例13のリポソーム処理時の位相差顕微鏡の写真である。またCは、比較例処理時の蛍光標識のついている低分子干渉RNAの細胞内の伝達を見せる蛍光顕微鏡の写真であり、Dは実施例13のリポソーム処理時の蛍光顕微鏡の写真である。 本図面から実施例13で製造された新規の正イオン性脂質含有リポソームが比較例1の公知の正イオン性脂質含有リポソームよりSiHa細胞内で低分子干渉RNAの伝達効率を増加させることがわかる。
VK2細胞株を実験前日24ウェルプレートにウェル当たり8×104個ずつ播種(seeding)し、各プレートの細胞が60−70%程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル当たり500μlずつ添加した。実験例I-1と同様の方法で比較例1の正イオン性リポソームおよび実施例14の正イオン性ミセルとBlock iTとの複合体をそれぞれ製造してウェルプレートに添加して37℃のCO2インキュベーターで24時間培養した。 培養された細胞のメディアをウェル当たり500μlずつ新しいメディアに交換した後、蛍光顕微鏡で核酸伝達効率を観察した。図4は比較例1(B,D)の正イオン性リポソームと実施例14(C,E)から製造された正イオン性リン脂質ミセルの核酸伝達効率を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡で観察したもので、本図面から実施例14で製造された正イオン性脂質含有ミセル(図4E)が比較例1で使われた公知の正イオン性脂質含有リポソーム(図4D)よりVK2細胞内で低分子干渉RNAの伝達効率を増加させることがわかる。また位相差顕微鏡で観察される細胞の形態の側面からも比較例1の組成を処理した場合の細胞状態(図4B)は、細胞が形の収縮した形態が多く、何も処理していない対照群状態の図4Aに比べて細胞の形態が変形されたものが観察される反面、実施例14の正イオン性ミセル処理時の細胞状態は、図4Cに示されるように何も処理していない対照群状態の図4Aの細胞と類似の様相を示して細胞形態面から細胞毒性が顕著に減少したことが分かる。
Hepa 1−6細胞株を実験前日24ウェルプレートにウェル当たり8×104個ずつ播種(seeding)し、各プレートの細胞が60−70%程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル当たり500μlずつ添加した。実験例I-1と同様の方法で比較例1の正イオン性リポソームおよび実施例16の正イオン性エマルションとBlock iTとの複合体をそれぞれ製造してウェルプレートに添加して37℃のCO2インキュベーターで24時間培養した。培養された細胞のメディアをウェル当たり500μlずつ新しいメディアに交換した後、蛍光顕微鏡で核酸伝達効率を観察した。図5は比較例1(A,C)の正イオン性リポソームと実施例16(B,D)から製造された正イオン性リン脂質エマルションの核酸伝達効率を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡で観察したもので、Aは比較例1のリポソーム処理時の位相差顕微鏡の写真であり、Bは実施例16の正イオン性エマルション処理時の位相差顕微鏡の写真である。またCは、比較例1のリポソーム処理時の蛍光標識のついている低分子干渉RNAの細胞内伝達を示す蛍光顕微鏡の写真であり、Dは、実施例16の正イオン性エマルション処理時の蛍光顕微鏡の写真である。前記図5から実施例16で製造された新規の正イオン性脂質含有エマルションが比較例1で製造された既存の正イオン性脂質含有製剤よりHepa1−6細胞内で低分子干渉RNAの伝達効率を増加させるということがわかる。
II-1.A549細胞株における低分子干渉RNA伝達効能評価
A549細胞株を実験前日、24ウェルプレートにウェル当たり細胞を8×104ずつ播種(seedning)した。各プレートの細胞が60−70%程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル(well)当たり250μlずつ添加した。エッペンドルフチューブに血清が含まれていない培地50μlずつを入れてスタット3に選択的な低分子干渉RNAと比較例1、2と実施例12、14、17で製造された正イオン性リポソーム、ミセル、エマルションの複合体をそれぞれ添加した。スタット3(Stat3)遺伝子(Gene bank accession number:NM_213662)の発現抑制を誘導するためのsiRNAはsiGENOME SMARTpool(Dahrmacon,Lafayette,CO,USA)を用いて製作した。 メディアに含まれた低分子干渉RNA(siRNA)の最終濃度は、100nMとなるようにした。これらを徐々にピペット操作(pipetting)して混合した後、室温で20分間放置し、このように製造された複合体をウェルプレートに添加して37℃のCO2インキュベーターで24時間培養した。24時間の後、Trizol試薬(Invirtogen,Carlsbad,CA,USA)を用いて細胞内に存在する全体リボ核酸(RNA)を分離し、このRNAはAccuPower RT PreMix(Bioneer,Daejeon,Korea)を用いてcDNAに逆転写した。スタット3(Stat3)に特異的なプライマーの配列は5'−AGTTCTCCTCCACCACCAAG−3’(左側)、5’−CCTTCTCCACCCAAGTGAAA−3’(右側)であり、PCR生成物の大きさは348塩基対であった。スタット3(Stat3)転写体(transcript)発現の程度は、スタット3特異的なPCR生成物のバンド密度をGAPDH(glyceraldehyde−3−phosphate dehydrogenase)遺伝子を増幅して示されるバンド密度に補正して定量的な発現の変化を測定した。図6は、それぞれの組成を処理した場合の、SiHa細胞内でターゲット遺伝子スタット3の転写体発現を比較したものであって、Aは対照群、Bは低分子干渉RNA単独処理群、Cは比較例2処理群、Dは比較例1処理群、Eは実施例12処理群、Fは実施例14処理群、Gは実施例17処理群である。 対照群(A)と低分子干渉RNA単独処理群(B)は、低分子干渉RNAが細胞内に伝達されなくてスタット3転写体の発現に変化がなく、比較例1で製造されたリポソームは、実施例12、14、17で製造されたリポソーム、ミセル、エマルションより、スタット3転写体の発現の減少が少なかった。また実施例12、14、17で製造されたリポソーム、ミセル、エマルションは、市販品の比較例2の組成と同じように、スタット3転写体発現を効率的に減少させた。よって、図6から実施例12、14、17で製造された正イオン性脂質含有リポソーム、ミセル、エマルションが、それぞれSiHa細胞内に低分子干渉RNA物質を効率的に伝達して標的タンパク質の発現を選択的に抑制させることが分かる。
HeLa細胞株を実験前日24ウェルプレートにウェル当たり8×104個ずつ播種(seeding)した。各プレートの細胞が60−70%程度に均一に成長した時、プレート中の培地を除去して新しい培地をウェル当たり250μlずつ添加した。エッペンドルフ チューブに血清の含まれていない培地50μlずつを入れてスタット3選択的な低分子干渉RNAと比較例1、2と実施例11、16、20で製造された正イオン性脂質含有リポソーム、エマルション、およびミセルとの複合体をそれぞれ添加した後、実験例II-1と同様の方法と条件で実験を遂行した。図7は、それぞれの組成で処理した場合の、HeLa細胞内でターゲット遺伝子スタット3の転写体発現を比較したもので、Aは対照群、Bは低分子干渉RNA単独処理群、Cは比較例2処理群、Dは比較例1処理群、Eは実施例11処理群、Fは実施例16処理群、Gは実施例20処理群である。 対照群(A)と低分子干渉RNA単独処理群(B)は、細胞内への伝達効率が低くてスタット3転写体の発現に変化がなく、比較例1で製造されたリポソームは、実施例11、16、20で製造されたリポソーム、エマルション、ミセル剤形より、スタット3転写体の発現の減少が少なかった。したがって、図7から実施例11、16、20で製造された正イオン性脂質含有剤形は、それぞれHeLa細胞内に低分子干渉RNA物質を効率的に伝達して標的タンパク質の発現を選択的に抑制させることが分かる。
SiHa細胞株を実験前日24ウェルプレートにウェル当たり細胞を8×104ずつ播種(seeding)した。各プレートの細胞が60−70%程度に均一に成長した時、プレート内の培地を除去して新しい培地をウェル(well)当たり250μlずつ添加した。エッペンドルフチューブに血清が含まれていない培地50μlずつを入れてアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較例1、2と実施例12、15、17で製造された正イオン性脂質含有リポソーム、ミセル、エマルションとの複合体をそれぞれ添加した。Bcl2遺伝子(Gene bank accession number:NM_000633)の発現抑制を誘導するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドではバイオニーア(Bioneer,Daejeon,Korea)で合成注文したもの(5'−TCT CCC AGC GTG CGC CAT−3’)を使った。メディアに含まれたアンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度は100nMとなるようにした。これらを徐々にピペット操作(pipetting)して混合した後、室温で20分間放置してこのように製造された複合体をウェルプレートに添加し37℃のCO2インキュベーターで24時間培養した。24時間の後、Trizol試薬(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を使って細胞内に存在する全体リボ核酸(RNA)を分離し、このRNAはAccuPower RT PreMix(Bioneer,Daejeon,Korea)を使ってcDNAに逆転写した。Bcl2に特異的なプライマーの配列は5'−ATG GCG CAC GCT GGG AGA AC−3’(左側)、5'−GCG GTA GCG GCGGGA GAA GT−3’(右側)であり、PCR生成物の大きさは348塩基対であった。Bcl2転写体発現の程度はBcl2特異的なPCR生成物のバンド密度をglyceraldehyde−3−phosphate dehydrogenase(GAPDH)遺伝子を増幅して示されるバンド密度に補正して定量的な発現の変化を測定した。図8は、それぞれの組成で処理した場合の、SiHa細胞内でターゲット遺伝子Bcl2の転写体発現を比較したものであって、Aは対照群、BはBcl2選択的アンチセンスオリゴヌクレオチド単独処理群、Cは比較例2とアンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体処理群、Dは比較例1のリポソームとアンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体処理群、Eは実施例12の正イオン性リポソームとアンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体処理群、Fは実施例15の正イオン性ミセルとアンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体処理群、Gは実施例17の正イオン性エマルションとアンチセンスオリゴヌクレオチドの複合体処理群である。細胞に何も処理していない対照群である図8Aに比べてアンチセンスオリゴヌクレオチド単独処理群(図8B)は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞内に伝達されなくてBcl2転写体の量に変化がなかった。市販品である比較例2の組成や(図8C)、比較例1で製造されたリポソーム(図8D)と比較した場合、本発明の実施例12、15、17で製造された正イオン性脂質含有剤形は、細胞内でBcl2転写体の量を効果的に減少させた。したがって、図8から実施例12、15、17で製造された正イオン性脂質含有剤形はSiHa細胞内にアンチセンスオリゴヌクレオチド物質を伝達して標的物質であるBcl-2の細胞内発現を効果的に抑制させることが分かる。
緑色蛍光タンパク質を発現する293T−GFP細胞株を実験前日24ウェルプレートにウェル当たり8×104個ずつ播種(seeding)して各プレートの細胞が60−70%程度に均一に成長した時、プレート中の培地を除去して新しい培地をウェル当たり500μlずつ添加した。エッペンドルフチューブに血清が含まれていない培地25μlずつを入れて緑色蛍光が発現するプラスミドの発現を抑制するsiRNAと比較例2および実施例12で製造された正イオン性リポソームをそれぞれ添加して複合体を製造してウェルプレートに添加して37℃のCO2インキュベーターで24時間培養した。培養された細胞のメディアをウェル当たり500μlずつ新しいメディアに交換した後、蛍光顕微鏡で遺伝子伝達効率を観察した。緑色蛍光タンパク質の発現を抑制するための低分子干渉RNAは、バイオニーア(Bioneer,Korea)で販売する製品を用い、その配列は5'−GCA UCA AGG UGA ACU UCA A−3’(正方向)、5'−UUG AAG UUC ACC UUG AUG C−3’(逆方向)であった。メディアに含まれた低分子干渉RNAの最終濃度は、300nMとなるようにした。図9は、それぞれの組成で処理した場合の、293T細胞内で緑色蛍光タンパク質の発現を位相差顕微鏡と蛍光顕微鏡で観察したものであって、Aは緑色蛍光タンパク質発現293T細胞を何も処理していない場合の位相差顕微鏡の写真であり、Bは比較例2組成処理時の位相差顕微鏡の写真であり、Cは実施例12の組成処理時の位相差顕微鏡の写真である。またDは、何も処理していない293T細胞の蛍光顕微鏡の写真であり、Eは比較例2の組成処理時の蛍光顕微鏡の写真であり、Fは実施例12組成処理時の蛍光顕微鏡の写真である。何も処理していない293T細胞は、緑色蛍光タンパク質の発現が抑制されなくて蛍光発現が蛍光顕微鏡下で明確に観察されるのに対して、比較例2と実施例12の組成で処理した細胞は、蛍光タンパク質の発現を抑制する低分子干渉RNAが細胞内に伝達されて緑色蛍光の発現が抑制されることが分かる。
IV−1.正イオン性脂質含有核酸伝達体のA549細胞株に対する毒性評価
本発明の新規正イオン性脂質を含む核酸伝達体の細胞毒性に関する評価をするために下記のような方法で実験を実施した。
人の肺癌細胞株であるA549細胞を、実施例11、13、16で製造した正イオン性脂質含有リポソーム、エマルションと低分子干渉RNA(siRNA)の複合体組成、そして低分子干渉RNA(siRNA)遺伝子単独組成で処理して細胞毒性を評価した。核酸伝達体のみの細胞毒性を明確に評価するために低分子干渉RNAは、細胞内で活性がないスクランブルRNA(scrambled RNA)を用いた。細胞毒性は、3−(4,5−dimethylthiazole−2−yl))−2、5−diphenyl tetrazolium bromide(MTT)試薬による方法で評価した。
SiHa細胞に実験例12、18、19で製造した正イオン性リン脂質リポソームと低分子干渉RNA(siRNA)の複合体組成、そして低分子干渉RNA(siRNA)遺伝子自体の組成を製造し、実験例IV−1に記載されたものと同様の方法で細胞毒性を評価した。 図11は、実施例12、18、19でそれぞれ製造された正イオン性脂質含有リポソームとスクランブル低分子干渉RNA複合体のSiHa細胞に対する毒性実験を遂行した結果であって、実施例12、18、19の正イオン性リポソームと低分子干渉RNAの複合体は対照群と比較して大きい細胞毒性を示さなかった。よって、本図面から実施例12、18、19で製造された本発明の正イオン性脂質含有リポソームは、子宮頸癌細胞株にて深刻な細胞毒性を示さないことが分かる。
VK2細胞に実施例11、14、17で製造した正イオン性リン脂質リポソーム、ミセル、エマルションと低分子干渉RNA(siRNA)の複合体組成、そして低分子干渉RNA(siRNA)遺伝子自体組成を製造し、実験例IV−1に記載されたのと同様の方法で細胞毒性を評価した。図12は、実施例11、14、17で製造された正イオン性リポソーム、ミセル、エマルション組成物とスクランブルRNAの膣粘膜ケラチン細胞株であるVK2で細胞毒性実験を実施した結果であって、実施例11、14、17の正イオン性リポソーム、ミセル、エマルションと低分子干渉RNAの複合体は、対照群と比較して大きい細胞毒性を示さなかった。よって、本図面から実施例11、14、17で製造された正イオン性脂質含有リポソーム、ミセル、エマルション剤形はVK2で深刻な細胞毒性を示さないことが分かる。
Claims (21)
- 前記オリゴ核酸伝達体は、低分子干渉RNAの細胞内の運搬のためのものであることを特徴とする請求項2に記載のオリゴ核酸伝達体。
- 前記オリゴ核酸伝達体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内の運搬のためのものであることを特徴とする請求項2に記載のオリゴ核酸伝達体。
- 前記オリゴ核酸伝達体は、アプタマーの細胞内の運搬のためのものであることを特徴とする請求項2に記載のオリゴ核酸伝達体。
- 前記オリゴ核酸伝達体は、リポソーム、ミセル、エマルション、およびナノ粒子からなる群より選択される剤形からなることを特徴とする請求項2〜請求項5のいずれか一項に記載のオリゴ核酸伝達体。
- ガラクトース脂質誘導体、マンノース脂質誘導体、葉酸脂質誘導体、ポリエチレングリコール脂質誘導体、ビオチン脂質誘導体を追加的に含むことを特徴とする請求項6に記載のオリゴ核酸伝達体。
- 前記オリゴ核酸伝達体は、前記正イオン性脂質および細胞融合性リン脂質を含有するリポソーム剤形からなることを特徴とする請求項6に記載のオリゴ核酸伝達体。
- 前記細胞融合性リン脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)であることを特徴とする請求項8に記載のオリゴ核酸伝達体。
- 前記細胞融合性リン脂質は、1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンであることを特徴とする請求項8に記載のオリゴ核酸伝達体。
- 前記オリゴ核酸伝達体は、前記正イオン性脂質および界面活性剤を含有するミセル剤形からなることを特徴とする請求項6に記載のオリゴ核酸伝達体。
- 前記界面活性剤は、Tween 20、ポリエチレングリコールモノオレイルエーテル、エチレングリコールモノドデシルエーテル、ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、トリメチルヘキサデシルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、シクロヘキシルメチルβ−D−マルトシド、ペンタエリスリチルパルミテート、ラウリルジメチルアミンオキサイド、またはN−ラウロイルサルコシンソジウム塩であることを特徴とする請求項11に記載のオリゴ核酸伝達体。
- 前記オリゴ核酸伝達体は、前記正イオン性脂質および界面活性剤を含有するエマルション剤形からなることを特徴とする請求項6に記載のオリゴ核酸伝達体。
- 前記界面活性剤は、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルベタイン、ドデシルジメチルアミン酸化物、3−(N,N−ジメチルパルミチルアンモニオ)プロパンスルホネート、Tween 20、Tween 80、トリトンX−100、ポリエチレングリコールモノオレイルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクチルグルコシド、またはN−ノナノイル−N−メチルグルカミンであることを特徴とする請求項13に記載のオリゴ核酸伝達体。
- 請求項2のオリゴ核酸伝達体とオリゴヌクレオチドの複合体。
- 請求項15のオリゴ核酸伝達体とオリゴヌクレオチドの複合体を有効成分として含む病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患の予防および治療用組成物。
- 病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患が、腫瘍、関節炎、心血管系疾患、および内分泌系疾患から選択されたものであることを特徴とする請求項16に記載の組成物。
- 請求項15のオリゴ核酸伝達体とオリゴヌクレオチドの複合体を、人間又は人間ではない哺乳類に投与して病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患を予防または治療する方法。
- 病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患が、腫瘍、関節炎、心血管系疾患、および内分泌系疾患から選択されるものであることを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患の治療剤を製造するための請求項15のオリゴ核酸伝達体とオリゴヌクレオチドの複合体の使用。
- 病因性タンパク質の過多発現から発生する疾患は、腫瘍、関節炎、心血管系疾患、および内分泌系疾患から選択されたものであることを特徴とする請求項20に記載の使用。
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