CZ201220A3

CZ201220A3 - Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému

Info

Publication number: CZ201220A3
Application number: CZ20120020A
Authority: CZ
Inventors: Drasar@Lukás; Ledvina@Miroslav; Korvasová@Zina; Turánek@Jaroslav
Original assignee: Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved CR, v.v.i.; Výzkumný ústav veterinárního lékarství, v. v. i.
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2012-01-13
Publication date: 2013-07-17
Also published as: CZ303963B6; EP2802556A1; WO2013104346A1; US20150018436A1; US9393200B2; EP2802556B1

Abstract

Lipopolyaminy sperminového typu obecného vzorce I, kde X je vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domény Y a atomem dusíku polyaminové cásti, nebo aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce II, kde n.sub.1 .n.= 1 az 13, nebo .omega.-hydroxy-alkylkarboxamidová spojka obecného vzorce III, kde n.sub.2.n.= 1 az 9, nebo .omega.-hydroxyalkylkarboxaminodopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce IV, kde n.sub.3.n.= 1 az 9 a n.sub.4.n.= 1 az 13, a hydrofobní doména Y je poloze C(2) symetricky vetvený acyl obecného vzorce V, kde n.sub.5.n.= 5 az 30, nebo (3.beta.)-cholest-5-en-3-yl vzorce VI. V prípade, kdyz X je vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domény a atomem dusíku polyaminové cásti, nebo aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka vzorce II, tak Y je v poloze C(2) symetricky vetvený acyl vzorce V, a v prípade, ze X je .omega.-hydroxyalkylkarboxamidová spojka vzorce III nebo .omega.-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka vzorce IV, tak hydrofobní doména Y je (3.beta.)-cholest-5-en-3-yl vzorce VI. Zpusob prípravy lipopolyaminu obecného vzorce I prevedením v poloze C(2) symetricky vetvené mastné kyseliny obecného vzorce VII, kde n.sub.1.n.= 5 az 30, nebo kyseliny obecného vzorce VIII, kde n.sub.1.n.= 1 az 13 a n.sub.5.n.= 5 az 30, nebo kyseliny obecného vzorce IX, kde n.sub.2.n.= 1 az 9, nebo kyseliny obecného vzorce X, kde n.sub.3.n.= 1 az 9 a n.sub.4.n.= 1 az 13, reakcí s bis(pentafluorfenyl)karbonátem v prítomnosti organické báze v polárním aprotickém rozpoustedle na pentafluorfenyl estery, které se reakcí s N.sup.2.n.N.sup.3.n.N.sup.4.n.-tri-(terc-butoxyka

Description

Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálmch transfekčních systémů

Oblast techniky

Vynález se týká nových lipopolyaminů, způsobu jejich přípravy konstrukci polykationických samoskladných fragmentů nukleových kyselin a využití těchto látek při nosičů léčiv na bázi negativně nabitých

Dosavadní stav techniky

Jedním z hlavních problémů, které v současnosti limitují zavedeni genové terapie a genetických vakcín do běžné klinické praxe, je nedostatečná účinnost transportu fragmentů nukleových kyselin (NK) přes buněčnou stěnu a jejich následná intemalizace do buněčného jádra, tj. tzv. transfekce (Miller, A. D. 2004; Zhang, S. B. a spol. 2010). V tomto případě je „léčivem“ fragment negativně nabité nukleové kyseliny, který musí proniknout buňkou a jadernými membránami. Jde vlastně o korekci genů vložením opravného genu (genů) a útlumem' aktivity nevhodných genů. DNA vakcfny jsou specifickým oblastí genové terapie, kde cílovými buňkami jsou buňky imunitního systému presentující antigen (zvláště dendritické buňky a monocyty; Saha, R. a spol. 2011).

Zasadm úlohu zde hraje proces penetrace negativně nabitého fragmentu NK přes fosfolipidovou dvojvrstvu buněčné stěny. Tato skutečnost iniciovala v posledním desetiletí rozsáhlý výzkum zaměřený na vývoj nosičů (tzv. vektorů), které by byly schopny efektivně transportovat NK přes buněčnou membránu. Tyto vektory musí současně zajistit ochranu NK před její degradací m vivo (Kirby, A. J. a spol. 2003; Miller, A. D. 1998; Zhang, S. B. a spol. 2010). S problémem efektivity transportu přes buněčnou membránu se rovněž setkáváme v pnpadě nukleotidových a oligonukleotidových antineoplastik a antivirotik (Holý, A. 2003).

Metody pro vpravení části NK do cílových buněk se obecně dělí na metodiky využívající virové, nebo nevirové vektory. Virové vektory představují v současnosti nejefektivnější transfekční systém, ale vzhledem k možným biologickým rizikům (zejména nepredvrdatelným imunitním reakcím) je zavedení virových vektorů do běžné klinické praxe více než problematické (Miller, A. D. 1992; Zhang, S.B. a spol. 2010). Nevirové vektory rozlišujeme podle způsobu, jakým je NK vpravována do intracelulámího prostoru, „a vektory '*2’ fyztitalm a chenncké. Fyzikální vektory pracují s fyzikálním nebo mechanickým narušením bunecne membrány, které umožní inzerci NK do intracelulámího prostoru (Andre F M a spol. 2010). Chemické vekto^ jsou založeny na polykationických polymerech nebo na supramolekulamích samoorganizujicích se lipidních systémech, které vytvoří s negativně nabitou NK komplex (tzv. polyplex, resp. lipoplex), schopný překonat buněčnou membránu a ve kterem je NK současně chráněna před degradací v krevním řečišti. Nejčastěji používanými katiomckýnu polymery jsou DEAE-dextran (Ohtani, K. a spol. 1989), chitosan (Hejazi, R. a spol. 2003; Koping-Hoggard, M. a spol. 2001), polylysin (Lemaitre, M. a spol 1987) polyethylenimin (Boussif, O. a spol. 1995), a polyamindendrimery (Haensler, J. a spol. 1993) ’

Nadějným, kandidáty na nosiče NK, aplikovateiné v humánní medicíně, se v současnosti jeví polykatiomcké samoskladné lipidní struktury (tzv. polykationické liposomy). Ty jsou nejčastěji tvořeny syntetickým lipopolyaminem (tzv. cytofektinem) a neutrálním kolipidem Polykatiomcké liposomy, na rozdíl od virových vektoru, jsou tvořeny strukturně definovaným, molekulami a lze proto strukturními změnami modulovat jejich fyzikální a biolog,cke vlastnosti a zvýšit tak transfekční schopnost a potlačit toxicitu. Tento fakt imc,oval rozsáhlý výzkum v oblasti polykationických lipidů. Byla připravena široká palem anomckych hpidů lišících se charakterem kationické a hydrofobní domény (NiculescuDuvaz, D. a spol. 2003; Zhi, D. F. a spol. 2010). Mnohé z těchto kationických lipidů jsou již komerčně dostupné jako transfekční činidla a několik liposomálních formulaci bylo použito vklmtckých testech v genové terapii pro léčení rakoviny a ostatních genetických poruch (Behr, J. P. 1994).

z hled,ska struktury kationické domény představují kationické lipidy, jejichž doména je tvořena polyammy odvozenými od přírodního sperminu nebo spermidinu, nejúspěšnější třídu kationtckych lipidů. To je dáno tím, že účinné neutralizují, srážejí a enkapsulují DNA a mají endozomální pufračni viastnosti (Stewart, L. a spol. 2001). Alternativními nejčastěji se vyskytujícím, kanonickými doménami jsou např. kvartemí amoniové ionty, guanidinový mot,v, dusíkaté heterocykly, bazické aminokyseliny a od nich odvozené krátké peptidy (Niculescu-Duvaz, D. a spol. 2003). Hydrofobní domény jsou nejčastéji tvořeny jedním nebo více alifatickými řetězci (nasycenými, nenasycenými nebo fluorovanými), nebo steroidním zbytkem.

- 3 '

Celková geometrie katiomckého lipidu, tj. poměr polární a nepolární části molekuly, má zásadní vliv na utváření strukturních fází v roztoku a transfekční aktivitu. Dvouřetězcové lipidy ve srovnání s jednořetězcovými nebo tři- a víceřetězcovými vytváří lépe lipidové dvojvrstvy, které se ve vodném roztoku samouzavírají do sférických liposomů. Naproti tomu katiomcké lipidy s jedním nebo třemi alifatickými řetězci mají zvýšenou tendenci vytvářet micely resp. reverzní micely a vykazují proto nižší transfekční aktivitu a mnohdy zvýšenou toxicitu (Niculescu-Duvaz, D. a spol. 2003; Tsukamoto, M. a spol. 1995). Proto drtivá většina používaných kationických lipidů obsahuje dva alifatické řetězce. Nejvíce používanou větvící doménou je glycerol, který, podobně jako v přírodních amfifilech, slouží k presentaci dvou hydrofobních řerězců (Zuhorn, I. S. a spol. 2002). Kationické lipidy s touto kostrou mohou být podle místa navázání hydrofobní domény symetrické nebo asymetrické. Zajímavým větvícím principem umožňujícím prezentaci dvou hydrofobních řetězců jsou synteticky dobře dostupné sekundární amidy aminokyselin (Behr, J. P.a spol. 1989). Dalšími strukturními motivy, sloužícími k násobné presentaci hydrofobních domén, jsou např. substituované aromatické kruhy a krátké peptidy (pro přehled ref. Niculescu-Duvaz, D. a spol. 2003). Specifickou skupinou hydrofobních domén jsou steroly s planámí strukturou. Předpokládá se, ze lipidy obsahující steroidní jednotku mají tendenci zpevňovat lipidní dvouvrstvu (Regelin, A. E. a spol. 2000). Většinou se jedná o deriváty cholesterolu presentující v poloze C(3) polykationickou doménu polyaminového typu via uretanová spojka. Do této kategorie patři i komerčně dostupný C-DAN, ref. (Gao, X. a spol. 1991; Keller, M. a spol. 2003; Petukhov, I. A.a spol. 2010). Jistým omezením z hlediska širšího použití těchto kationických lipidů je limitovaná stabilita jejich uretanové spojky. Jsou rovněž známy transfekční systémy založené na amidech cholových kyselin (Fujiwara, T. a spol. 2000).

Podstata vynálezu

Předmětný vynalez řeší problém: (a) syntetické náročnosti lipopolyaminů obsahujících dvě symetrické alifatické hydrofobní domény, založené na symetrických lipofilních diacylderivátech glycerolu a na symetrických sekundárních amidech aminokyselin, použitím amidů synteticky dobře dostupných v poloze C(2) symetricky větvených mastných kyselin, jakož i inzerci polyethylenglykolové spojky mezi hydrofobní a polykationickou doménou; (b) limitované stability uretanové spojky v případě lipopolyaminů odvozených od cholesterolu její náhradou spojkou typu amidu^~ro-hydr^^^ kyselin__nebo__ aminpolyěthýleňglykolkarboxylových kyselin, _

její náhradou spojkou typu amidů ω-hydroxykarboxylových kyselin nebo aminpolyethylenglykolkarboxylových kyselin.

Předmětem vynálezu jsou lipopolyaminy sperminového typu obecného vzorce I

H₂N NH zx ΑΛΑ

XZ XZ XZ XZ _NH XZ _NH—_X__Y (O.

kde X je zvoleno ze skupiny, zahrnující vazbu mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domény Y a atomem dusíku polyaminové části, aminopolyethylenglykolkarboxamidovou spojku obecného vzorce II

(II), kde ni = 1-13, vázanou na polyaminovou část i na hydrofobní doménu Y amidickou vazbou, ω-hydroxyalkylkarboxamidovou spojku obecného vzorce III

kde n₂ = 1-9, vázanou na atom dusíku polyaminové části amidickou vazbou a prostřednictvím atomu kyslíku do polohy 2 cholesterylového skeletu, a ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidovou spojku obecného vzorce IV

O θ (IV), kde n₃ = 1-9 a Π4 = 1-13, vázanou na atom dusíku polyaminové části amidickou vazbou a prostřednictvím atomu kyslíku do polohy 2 cholesterylového skeletu, a hydrofobní doména Y je zvolena ze symetricky v poloze C(2)větveného acylu obecného vzorce V

kde n₅ = 5-30, nebo (3p)-cholest-5-en-3-ylu vzorce VI

(VI), přičemž když X je vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domény Y a atomem dusíku polyaminové části nebo aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce II, tak Y je poloze C(2) symetricky větvený acyl obecného vzorce V, a když X je ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka obecného vzorce III nebo ωhydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce IV, tak Y je (3P)-cholest-5-en-3-yl vzorce VI.

Dále je význakem vynálezu, že lipopolyaminy sperminového typu obecného vzorce I mají výhodně X tvořeno vazbou mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domény Y a atomem dusíku polyaminové části nebo spojkou výše zmíněného obecného vzorce II, kde m = 3, a Y = acyl výše zmíněného obecného vzorce V, kde n₃ = 13.

Význakem je také skutečnost, že látky obecného vzorce I mají X s výhodou tvořeno spojkou výše zmíněného obecného vzorce III, kde n₃ — 1 či 3, nebo spojkou výše zmíněného obecného vzorce IV, kde n₃ - 1 či 3, 04 = 3 a Y je chlesteryl výše zmíněného obecného vzorce VI.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy lipopolyaminů sperminového typu obecného vzorce I. Ta je založena na kondenzaci komerčně dostupného ' 6 “

, , Vlil kde η, = 1-13 a n₅ = 5-30, nebo kyselin obecného vzorce IX

O

kden₂= 1-9, nebo kyselin obecného vzorce X

kden₃= 1-9 a a, = 1-13;

přičemž kyseliny výše zmíněného obecného vzorce VII, VIII IX bis(pentafluorfenyl)karbonátem v přítomnosti organické báze rozpouštědle (s výhodou v přítomnosti 4-methylmorfolinu v nebo X se reakcí s v polárním aprotickém M-V-dimethyformamidu) převedou „a sve pentafluorfenylestery. Reakci takto získaných pentafluorfenylestrt jmenovaných kyselin s v přítomnosti eze v organickém a_protlckém rozpouštědle (s výhodou v přítomnosti ethyldiisopropylaminu v , -dimethyformamidu) se připraví chráněné polykationické lipidy obecného vzorce XI,

jmenovaných kyselin s NWA^4ri-(terc-butoxykarbony)sperminem v přítomnosti organické báze v organickém aprotickém rozpouštědle (s výhodou v přítomnosti ethyldiisopropylaminu v V,jV-dimethyformamidu) se připraví chráněné polykationické lipidy obecného vzorce XI,

Boc

I

Boc—NH N/\ /X /\ \Z XZ XZ XZ _N XZ _ΝΗ_χ_γ _π I Boc (XI), kde X je vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domény Y a atomem dusíku polyaminové části nebo aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka výše zmíněného vzorce II, nebo ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka výše zmíněného vzorce III, nebo ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka výše zmíněného vzorce IV a Y je v poloze C(2) symetricky větvený acyl výše zmíněného vzorce V, nebo (3β)cholest-5-en-3-yl výše zmíněného vzorce VI, přičemž když X je vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domény Y a atomem dusíku polyaminové části nebo aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka výše zmíněného vzorce II, tak Y je v poloze C(2) symetricky větvený acyl výše zmíněného vzorce V, a když X je ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka výše zmíněného vzorce III nebo ωhydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka výše zmíněného vzorce IV, tak Y je (3β)-cholest-5-en-3-yl výše zmíněného vzorce VI.

Hydrolytickým odštěpením íerc-butoxykarbylových chránících skupin (tzv. debocylací) látek výše zmíněného vzorce XI (s výhodou za použití kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu) se připraví lipopolyaminy výše zmíněného obecného vzorce I.

Kyseliny obecného vzorce VIII se připraví reakcí pentafluorfenylesterů kyselin výše zmíněného vzorce VII s aminopolyethylenglykolkarboxylovými kyselinami vzorce H₂N(CH2)2-[O-(CH₂)2]n-O-(CH₂)2-COOH, n= 1-13, v přítomnosti organické báze v organickém aprotickém rozpouštědle (s výhodou v přítomnosti ethyldiisopropylaminu v Ν,Νdimethy formamidu).

Kyseliny výše zmíněného vzorce IX se připraví: (a) bazicky katalýzo vanou alky lácí komerčně dostupného cholesterolu terc-butylesterem kyselin ω-bromalkanových o počtu atomů uhlíku C2 - C10 v aprotickém rozpouštědle a následnou kysele katalýzo váným odštěpením terc-butoxykarbylové chránící skupiny (s výhodou kyselinou mravenčí v diethyletheru) získaného terc-butylesteru obecného vzorce XII

XII kde n2= 1- 9;

(b) reakcí komerčně dostupného (9-tosyl derivátu cholesterolu [(3p)-cholest-5-en-3-yloxy-4methylbenzenesulfonátu] s ω-hydroxyalkannitrily s počtem atomů uhlíku C2 - C10 v nepolárním aprotickém rozpouštědle za zvýšené teploty (s výhodou v toluenu za varu) a následnou bazickou hydrolýzou (s výhodou ve směsi toluenu a vodného roztoku NaOH za zvýšené teploty) intermediálních 0-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]-co-hydroxyalkannitrilů.

Kyseliny výše zmíněného vzorce X se připraví reakcí pentafluorfenylesterů kyselin výše zmíněného vzorce IX s kyselinami aminopolyethylenglykolkarboxylovými vzorce H₂N(CH₂)2-O-[(CH₂)2-O]n-(CH2)-COOH, n= 1-13, v přítomnosti organické báze v organickém aprotickém rozpouštědle (s výhodou v přítomnosti ethyldiisopropylaminu v Ν,Νdimethylformamidu).

Předmětem vynálezu je dále použití lipopolyaminů sperminového typu obecného vzorce I pro konstrukci polykationických liposomů, tedy samoskladných systémů, jako nosičů nukleotidových a oligonukleotidových terapeutik a terapeutických genových konstruktů.

Schopnost polykationických liposomů konstruovaných na bázi polykationických lipidů obecného vzorce I efektivně transportovat přes buněčnou membránu nukleotidová a oligonukleotidová terapeutika a terapeutické genové konstrukty byla ověřena v následujících in vitro testech.

·*^······· · <7 ,, .:..\.· ·..··..· .:..:..

-8a- (a) Zvýšením antivirálního účinku nukleotidového antivirotika Cidofovir na infekci buněk MDBK bovinním herpesvirem BHV-1.

(b) Transportem fluorescenčně značených modelových oligonukleotidů do buněk MCF-7.

(c) Efektivitou transfekce buněk MCF-7 plasmidem kódujícím enzym luciferázu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1: Snímek liposomů s 20% obsahem kationického lipidu 1 z trasmisního elektronového mikroskopu.

Obr. 2 A,B: Distribuce velikosti liposomů (A) a distribuce zeta-potenciálu liposomů (B) s 0, 10, 20, 30% obsahem lipidu 1.

Obr. 3: Závislost enkapsulační účinnosti liposomů pro Cidofovir na procentuáluim zastoupení kationického lipidu 1 v liposomech.

Obr. 4 A,B,C: Toxicita kationických lipidu 1, 2, 3,4 vůči buněčným liniím MDBK-1 B16F 10(B), MCF-7 (C).

Obr. 5: Cytotoxické křivky pro kationické liposomy, kationické liposomy s enkapsulovaným Cidofovirem a pro samotný Cidofovir.

Obr. 6: Antivirální efekt prázdných kationických liposomů, volného Cidofoviru, enkapsulovaného Cidofoviru v liposomech s 20 a 30% obsahem lipidu (sloupcové grafy pro jednotlivé titry viru (10’³, 10‘⁵, 10’⁷, 10’⁹))

Obr. 7: Nenormalizovaná transfekční účinnost různých preparátů kationických liposomů. Transfekční účinnost pro nukleotidy vykazovaly liposomy připravené z kationických lipidů 4 a 2. (Hodnoty v grafu jsou vyjádřeny jako průměr triplikátu ± SD. Množství oligonukleotidu na jamku bylo 500 ng.). EPC = vaječný fosfatidyl cholin

Obr. 8: Transfekční účinnost kationických liposomů na plasmid kódující luciferázu EPC = vaječný fosfatidyl cholin, Trojene = liposomální transfekční kit.

Příklady provedení vynálezu

Seznam použitých zkratek

TLC	chromatografie na tenké vrstvě
HR-MS	hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením
NMR PBS	nukleární magnetická resonance fosfátem pufrovaný fyziologický roztok
MEM	minimální esenciální médium

Buňky MDBK	linie buněk z bovinních ledvin (Madin-Darby Bovine Kidney Cells)
MTT test	test životnosti buněk založený na redukci substrátu MTT na formazan
QRT-PCR	polymerázová řetězová reakce v reálném čase (Quantitative Keal-lime Polymerase Chain Reaction)
Buňky MCF7	estrogen responzivní linie buněk lidského adenokarcinomu prsu

Příklad 1

K 2-tetradecylhexadekanové kyselině VII (kde n, = 13; 51,5 mg, 0,11 nunol) v suchém NJVdimethylformamidu (4 ml) se přidá bis(pentafluorfenyl)karbonát (49 mg, 0,12 mmol) a 4methylmorfolin (0,1 ml; 1 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 1 hod. Průběh reakce se monitoruje pomocí chromatografie na tenké vrstvě silikagelu (TLC) ve směsi toluen ethylacetát (10.1), Směs se dvakrát lyofilizuje zdioxanu (2 x 20 ml). Získaný pentafluorfenylester kyseliny VI (kde n, = 13; 67 mg, 0,1 mmol) se ihned použije ke kondenzaci s parciálně chráněným sperminem.

Směs pentafluorfenylesteru kyseliny VII (kde n₅ = 13) a vW-tri-(torbutoxykarbonyl)sperminu (49 mg, 0,079 mmol) se suší za sníženého tlaku při teplotě místnosti 1 hod. Aparatura se propláchne argonem a pod argonem se přidá suchý Ν,Νdimethylformamid (4 ml) a ethyldiizopropylamin (1 ml) a směs se míchá za laboratorní teploty 12 hod. Chromatografií reakční směsi na sloupci silikagelu (100 ml) v systému toluenethylacetát (gradient 0-40% ethylacetát, 10 ml/min, 160 min) a následnou lyofilizací odparku z dioxanu homogenní frakce se získá 75 mg (82% výtěžek) V-(2-tetradecylhexadekanoyl)V⁴,Vjv^l2-tris-/erc-butoxykarbonyl-4,9-diaza-l,12-diammododekanu XI (X = C-N vazba; Y = hydrofobní doména obecného vzorce V, kde n_s = 13). Pro C_!5H_1()!N₄O₇-Na HR-MS vypočteno m/z: 937,8291 nalezeno wz: 937,8297; 'H NMR (400 MHz, CDClj) δ ppm: 3,00 - 3,37 m, 12 H (CH₂N-); 1,90 - 2,11 m, 1 H (CHCOO); 1,56 - 1,73 m, 8 H (OhCHuN-); 1,36 - 1,55 m, 27 H (rerc-butyl); 1,17 - 1,34 m, 52 H; 0,80 - 0,94 m, 6 H (2tetradecylhexadekanoyl).

Příklad 2

Κ roztoku látky XI (kde X = C-N vazba; Y = hydrofobní doména obecného vzorce V, kde n₅- 13; 253 mg, 0,26 mmol) v dichlormethanu (5 ml) se přidá kyselina trifluoroctová (1 ml, 13 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 4 hod. Potom se rozpouštědlo oddestiluje za smzeneho tlaku a destilační zbytek lyofilizuje z dioxanu (20 ml). Získá se 171 mg (100%) trifluoracetátu ^‘-(2-tetradecylhexadekanoyl)-4,9-diaza-l,12-diaminododekanu I (X = C-N vazba; Y = hydrofobní doména obecného vzorce V, kde n₅ = 13). Pro C4oH₈₄N₄0-H HR-MS, vypočteno m/z- 637,67179 nalezeno m/z- 637,67117; *H NMR (400 MHz, Aceton-^) δ ppm: 3,98 t, >6,25 Hz, 2 H (CH₂-2); 3,36 t, >6.13 Hz, 2 H (CH₂-6); 3,27 - 3,32 m, 2 H (CH₂-9); 3,13-3,21 m, 6 H (CH₂-11, CH₂-4); 3,10 t, >6,63 Hz, 2 H (CH₂-13); 2,31 -2,38m, 1 H ^{(CH-2 );} 1,93 - 2,03 m, 6 H (CH₂-3, CH₂-7, CH₂-8); 1,53 - 1,62 m, 2 H (CH₂-12); 1,35 1,43 m, 4 H (CH₂-3\ CH₂-1); 1,28 s, 36 H (CH₂4'-16\ CH₂1-13); 0,88 t, >7,00 Hz, 6 H (CH₂-17’,CH₂-14”).

Příklad 3

Ke kyselině V-(2-tetradecylhexadekanoyl)-15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanové VIII (kde n, = 5 a n₅= 13; 206 mg, 0,29 mmol) v suchém AU-dimethylformamidu (10 ml) se přidá bis(pentafluorfenyl)karbonát (128 mg, 0,32 mmol) a 4-methylmorfolin (0,25 ml, 2,45 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 1 hod. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC v ethylacetátu. Směs se dvakrát lyofilizuje z dioxanu (2 x 50 ml). Získaný pentafluorfenylester kyseliny VIII (kde n, = 5 a n₅ = 13; 251 mg) se ihned použije ke kondenzaci s parciálně chráněným sperminem.

Směspentafluorfenylesteru kyseliny VIII (kde n, = 5 an₅= 13; 181 mg, 0,21 mmol) a V²W-tri-(/erc-butoxykarbonyl)sperminu (105 mg, 0,2 mmol) se suší za sníženého tlaku 1 hod. Aparatura se propláchne argonem a pod argonem se přidá suchý Wdimethylformamid (8 ml) a ethyldiizopropylamin (0,5 ml) a směs se míchá za laboratorní teploty 12 hod. Chromatografií směsi na sloupci silikagelu (150 ml) v systému toluen-ethylacetát (gradient 080% ethylacetát, 10 ml/min, 160 min) a následnou lyofilizací odparku z dioxanu homogenní frakce se získá se získá se 124 mg (50% výtěžek) A¹-[V-(2-tetradecylhexadekanoyl)-15amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanoylJ-A⁴ X,V¹²-tris-(^_C-butoxykarbonyl)-4,9-diaza-1,12diami-nododekanu XI (X = aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce II, pricemz ni = 3 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce V kde n₅ = 13). Pro C₆6H₁₂₉N₅O₁₂-H HR-MS, vypočteno m/z- 1184,9711 nalezeno m/z: 1184,9716; *H NMR

-fy - *··^: * ··· ’ (400 MHz, CDC_W δ ppm: 5,34 - 5,38 m, 1 H (CH₂-6); 3,75 t, 7=6,06 Hz, 2 H (CH₂-I4)· 3,60 - 3,68 m, 12 H; 3,52 - 3,57 m, 2 H; 3,43 - 3,50 m, 2 H (8 x CH₂O); 3,04 - 3 31 m 12 H (6 X CH₂N); 2,48 t, 7=5,87 Hz, 2 H (CH₂-1); 2,00 tdd, 7=9,25, 9,25, 5,18, 4,74 Hz, 1 H (CH2); 1,76 s, 4 H (CH₂-7, CH₂-8); 1,52 - 1,72 m, 4 H (CH₂-3, CH₂-12); 1,41 - 1 51 m 27 H (^-butyl); 1,18 _ 1,34 m, 48 H (CH₂.4'-15·, CW-ir); 0,88 t, 7=6,90 Hz, 6 H (CH₂16', CH₂-14”).

Příklad 4 “ ^{M W24et}^^ecylh^^ ¹S-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanoyljethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce II, přičemž n, = 3 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce V, kde n, = 13; 83 mg, 0,07 mmol) v dichlormethanu (5 ml) se přidá kyselina trifluoroctová (2 ml, 26 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 4 hod. Potom se rozpouštědlo oddestiluje za sníženého tlaku a destilační zbytek lyofilizuje z dioxanu (20 ml). Získá se 61 mg (100% výtěžek) V-[tV-(2-Tetradecylhexadekanoyl)-15-amino-4,7,10,13tetraoxapentadekanoyl]-4,9-diaza-l,12-diaminododekanu I (X = aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce II, přičemž n, = 3 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce V kde n, = 13). Pro C„H,_MN,0₆-H HR-MS, vypočteno m/z- 884,8138 nalezeno _m/z- 884,8128; Ή NMR (400 MHz, MeOH-7,) δ ppm: 5,34 - 5,38 m, 1 H (CH_r6 ); 3,75 t, 7=5,94 Hz, 2 H (CH₂-3')_; 3,63 d, 7=5,56 Hz , 10 H; 3,53 t, 7=5,60 Hz, 2 H (7 x CH₂-O); 3,33 - 3,39 m, 4 H (CH₂-2); 2,99 - 3,19 m, 10 H (6 x CH₂N); 2,49 t, ^6,00 Hz, 2 H (CH₂-2·); 2,18 tt, 7=9,62, 4,85 Hz, 1 H (CH₂-2); 2,09 dt, 7=15,16, 7,71 Hz, 2 H (CH₂-3); 1,88 dt, 7=13,50, 6,30 Hz, 2 H; 1,79 - 1,84 m, 4 H (CH₂-7, CH₂-8, CH₂-12); 1,49 - 1,60 m 4 H (CH₂-3“, CH₂-1-); 1,29 s, 52 H (CH₂-4--₁₅··, CH₂-2--13 '); 0,87 - 0,93 m, 6 H (CH₂16”, CH₂-14'”).

Příklad 5

Směs pentafluorfenylesteru 2-tetradecylhexadekanové kyseliny VII (kde n₅ = 13; 164 mg, 0,26 mmol) a 15-amino-4,7,10,13-tetraoxa-pentadekanové kyseliny (190 mg; 0,70 mmol) se susi za sníženého tlaku 1 hod. Aparatura se propláchne argonem a pod argonem se přidá suchý MMmethylformamid (8 ml) a ethyldiizopropylamin (1,5 ml) a směs se míchá za laboratorní teploty 12 hod. Chromatografií reakční směsi na sloupci silikagelu (150 ml) v systému toluen-ethylacetát (gradient 0-80% ethylacetát, lOml/min, 160 min) se získá 174 mg (94% výtěžek) kyseliny V-(2-tetradecylhexadekanoyl)-15-amino-4,7,10,13X I ♦ I · · *

13^/7 _ ' j .. . n .....

tetraoxapentadekanové VIII (kde - 3 a n₅ = 13). Pro C₄,H_S1NO₇-Na HR-MS, vypočteno 722,5905 nalezeno 722,5906; Ή NMR (400 MHz, CDC1₃) δ ppm: 3,73 br s 16 H· 3,48 d, 7=4,93 Hz, 2 H (8 x CH₂O); 2,53 t, 7=5,49 Hz, 2 H (CH₂-1); 2,13 br. s„ I H (CH-2·)· 1.48 - 1,64 m, 2 H; 1,35 - 1,44 m, 2 H (CH₂-3', CHr-l '); 1,25 d, 7=5,94 Hz, 42 H (CH₂4 -15 , CH₂-1 -13); 0,81-0,95 m, 6 H (CH₂-16', CH₂-14).

Ke kyselině 0-[(3p)-cholest-5-en-3-yl]glykoylové IX (kde n₂ = 1; 134 mg; 0,3 mmol) v suchém AyMimethylformamidu (4 ml) se přidá bis(pentafluorfenyl)karbonát (130 mg- 0 33 mmol) a 4-me.hylmorfolin (0,1 ml; 1 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 1’ hod Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC v toluenu. Směs se dvakrát lyofilizuje z dioxanu (2 x 20 ml) a získaný pentafluorofenylester kyseliny O-[(3p)-cholest-5-en-3-yl]glykolové IX (kde n₂ = 1; 140 mg) se ihned použije ke kondenzaci s parciálně chráněným sperminem.

Směs pentafluorofenylesteru kyseliny O-[(3p)-cholest-5-en-3-yi]glykolové IX (kde n₂ = 1· 140 mg, 0,23 mmol) a vW-tri-(,_OT-butoxyka^^ _{(1I2m& 0},23mmol) _seza smzeneho tlaku a při teplotě místnosti 1 hod. Aparatura se propláchne argonem a pod argonem se přidá suchý W,V-dimethylformamid (4 ml) a ethyldiizopropylamin (1 ml) a směs se míchá za laboratorní teploty 12 hod. Chromatografu reakěnl směsi na sloupci silikagelu (100 ml) v systému toluen-ethylacetát (gradient 0-40% ethylacetát, 10 ml/min, 160 min) se Získá 178 mg (86% výtěžek) v‘-{<H(3p)-cholest-5-en-3-yl]^^ butoxykarbonyl)-4,9-diaza-l,12-diaminododekanu XI (kde X = ω-hydroxyalkylkarboxanudová spojka obecného vzorce III, přičemž n₂ = 1 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce VI). Pro WfeUOpH HR-MS, vypočteno m/z: 929,7301 nalezeno m/z: 929,7304; H NMR (400 MHz, CDCIj) δ ppm: 5,30 - 5,38 m, 1 Η (H-6); 3,98 s, 2 H (CHrf')· 3 02 3,35m, 12H(6xCH₂N); 2,18-2,46 m, 2 H (CH₂-4''); 1,37-1,51 m, 27 H (fórt-butyl); l,Oi s, 3 H (CH3-I9-); 0,92 d, 7=6.57 Hz, 3 H (CH3-2I); 0,88 d, 7=1,77 Hz, 3 H (CH₃-26··); ,86 d, 7 1,89 Hz, 3 H (CH₃-27 ); 0,80-2,06 m, 22 H (cholesteryl); 0,68 s, 3 H (CH3-I8'·).

Kroztoku ^-(<H(3P)-cholest-5-en-3.yl]glykoyl}-M,A^ diaza-l,12-diaminododekanu XI (kde X = ω-hydroxyalkylkarbox-amidová spojka obecného orce III, přičemž n₂ - 1 a Y - hydrofobní doména obecného vzorce VI; 148 mg, 0,16

14' //' · ¹ * · · »

V / — til l t ·« i « · nunol) v dichlormethanu (5 ml) se přidá kyselina trifluoroctová (1 ml, 13 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 4 hod. Potom se rozpouštědlo oddestiluje za sníženého tlaku a destilační zbytek lyofilizuje z dioxanu (20 ml). Získá se 100 mg (100% výtěžek) Μ-{Ο-[(3β> cholest-5-en-3-yl]glykoyi}-4,9-diaza-l,12-diaminododekanu I (kde X = ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka obecného vzorce III, přičemž n₂ - 1 a Y = hydrofobní doména vzorce VI). Pro C39H72N4O2-H HR-MS, vypočteno m/z: 629,5728 nalezeno m/r. 629,5715; 'h NMR (400 MHz, McOH-7,) δ ppm: 5,36 - 5,40 m, 1 Η (H-6); 4,01 s, 2 H (CH₂-2)· 3 371 7=6,51 Hz, 2 H; 3,24 tt, 7=11,20, 4,60 Hz, 2 H; 2,96 - 3,17 m, 8 H (6 x CH₂N); 2,35 -’₂,44 m, 1 H (CH₂-4a); 2,21 - 2,32 m, 1 H (CH₂-4b)_; 1,72 - 2,14 m, 13 H (CH-1, H-12, H2 , H-7”, H-16”, CH₂-7, CH₂-7); 1,04 s, 3 H (CHj-W); 0,95 d, 7=6,57 Hz, 3 H (CHj-19)· 0.89 d, 7=1.52 Hz, 3 H ₍CH₃-I9); 0.87 d, 7=1.39 Hz, 3 H (CH3-I9-); 0.83 - 1.68 m,' 16 H (cholesteryl, CH₂-3, CH₂-9); 0.72 s, 3 H (CH₃-19).

Příklad 8

Ke kyselině O-[(3p)-cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanové IX (kde n₂ = 3; 283 mg, 0,6 nunol) v suchém V,V-dimethylformamidu (4 ml) se přidá bis(pentafluorfenyl)karbonát (260 mg, 0,66 nunol) a 4-methylmorfolin (0,1 ml, 1 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 1 hod. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC ve směsi toluen - ethylacetát (10:1). Směs se dvakrát lyofilizuje z dioxanu (2 x 20 ml) získaný pentafluorofenylester kyseliny Ο-[(3β). cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanové IX (kde n₂ = 3; 382 mg) se ihned použije ke kondenzaci s parciálně chráněným sperminem.

Směs pentafluorofenylesteu kyseliny O-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanové IX (kde n₂ - 3; 216 mg, 0,34 mmol) a ^W-tri-^rc-butoxykarbonyísperminu (170 mg, 0,34 nunol) se suší za sníženého tlaku a při teplotě místnosti 1 hod. Aparatura se propláchne argonem, pod argonem se přidá suchý V,V-dimethylformamid (4 ml) a ethyldiizopropylamin (1 ml) a směs se míchá za laboratorní teploty 12 hod. Chromatografií reakční směsi na sloupci sihkagelu (100 ml) v systému toluen-ethylacetát (gradient 0-40% ethylacetát, 10 ml/min, 160 min) se získá se 302 mg (93% výtěžek) V-{O-[(3p)-cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybytanoyl}. MXy<tris-(_(erc-butoxykarbo^^^ XI (kde X = _a.

hydroxyalkylkarbox-amidová spojka obecného vzorce III, přičemž n₂ = 3 a Y = hydrofobní doména vzorce VI). Pro C_MH_m,_N1O_s-H HR-MS, vypočteno _m/z; 957,7614 nalezeno m/z·. 957,7621; Ή NMR (400 MHz, CDC1₃) δ ppm: 5,32 - 5,35 m, 1 Η (H-6); 3,501,7=6,32 Hz iG

H (CH₂-4'); 3,03 - 3,34 m, 12 H (6 x CH₂N); 2,31 -2,39 m, 1 H (H-4a)· 2 29 t 7 = 7 39 Hz, 2 H (CH₂-2'); 2,12 - 2,23 m, I H (H-4b ·); 1,77 - 2,06 m, 7 _H (CH-1 -, Η-Ο”, H-2 H7 , H-16 , CH₂-3'); 1,60 - 1,75 m, 8 H (CH₂-3, CH₂-7, CH₂-8, CH₂-12); 1,43 - 1 47 m 27 “ ^^{00 S}’ ^{3 H <CH}”¹⁹ ^); θ’“ ^^{7 H2}’ ^{3 H} °’⁸⁸ * Hz, hZ θ’⁸' ^d’ ^HZ’^{2 H} °’⁸¹ -^{158 17 H} ™ *

Příklad 9

Kroztoku ^{«HOPMolea-S-e^^ karbonyl)-4,9-diaza-l,12-diaminododekanu XI (kde X = ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka obecného vzorce III, přičemž n₂ = 3 a Y = hydrofobní doména vzorce VI· 259 mg 0,27 mmol) v dichlormethanu (5 ml) se přidá kyselina trifluoroctová (1 ml; 13 mmol) a směs se mícha za laboratorní teploty 4 hod. Potom se rozpouštědlo oddestiluje za sníženého tlaku a estilacni zbytek se lyofilizuje zdioxanu (20 ml). Získá se 175 mg (98% výtěžek) N'-_{0. [(3P)-cholest-5-en.3-yl].4-hydroxybutanoyl).4,9-diaza-l,12-diaminododekanu I (kde X = _ω. hydroxyalkylkarbox-amidová spojka obecného vzorce III, přičemž n₂ = 3 a Y = hydrofobní omena vzorce VI). Pro C₄₁H₇₆N₄O₂-Na HR-MS, vypočteno m/z: 679,6017 nalezeno m/z· 679,6042; H NMR (400 MHz, MeOH-4) δ ppm: 5,35 - 5,39 m, 1 H (CH-6''); 3,52 t, J^, 25 Hz, 2 H (CH₂-4); 2,97 - 3,20 m, 12 H (6 x CH₂-NH); 2,38 dd, 7=4.74, 1,83 Hz, 1 H (CH4a ); 2,32 t, ./=7,40 Hz, 2 H ÍCH₂-2)· 1 9fi 9 99 ™ 7 u z u !

I n₂ z ), 1,90 2,22 m, 7 H (cholesteryl); 1,75 - 1 95 m 14 H (CH₂-3; CH₂-7; CH₂-8; CH,7; CH₂.₁₂; CH,3; CH^); 1,04 s, 3 H (^-1^): ^96 d 7 6,57 Hz, 3 H (CH₃-21 ); 0,93 - 1,67 m, 29 H (cholesteryl); 0,91 d, 7=1,52 Hz 3 H (CH.2O0,89d,^,52Hz,3H(CH₃-27_O;0,74s,3H^

Příklad 10

Ke kyselině ^O-KWholest-S-en-S-yljglykoylM nové obecného vzorce X (kde n₃ = 1 a m = 3; 149 mg, 0,22 mmol) v suchém VcV-dunethylformamidu (5 ml) se přidá bis(pentafluorfenyl)karbonát (100 mg, 0,39 mmol) a 4-methylmorfohn (0,25 ml, 2,45 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 1 hod. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC v ethylacetátu. Směs se dvakrát lyofilizuje z dioxanu (2 x 50 ml) a z>skany pentafluorofenylester kyseliny ^{O-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]glykoyl}-15-amino4,7,10,13-tetraoxapentadekanové obecného vzorce (X, kde n₃ = la n. = 3; 184 mg) se ihned použije ke kondenzaci s parciálně chráněným sperminem.

Směs pentafluorofenylesteu kyseliny kyseliny V-{O-[(3p).cholest-5-en-3.y^^ ammo-4,7,10,13-tetraoxapentadekanové obecného vzorce X (kde n₃ = la m = 3; 184 mg, 0,21 mmol) a Wy.tri-^c-butoxykarbonyDsperminu (170 mg, 0,34 mmol) se suší za smzeneho tlaku a při teplotě místnosti 1 hod. Aparatura se propláchne argonem a pod argonem se pndá suchýV>-dimethylformamid (8 ml) a ethyldiizopropylamin (0,5 ml) a směs se nneha za laboratorní teploty 12 hod. Chromatografií reakčni směsi „a sloupci silikagelu ml) v systému toluen-ethylacetát (gradient 0-40% ethylacetát, 10 ml/min, 160 min) se získá se 50 mg (19% výtěžek) **-(ΛΓ-{α[(3β)^ο1«^^ 4,7,10,13-tet_raoxapentadekanoyl)-y,^ nododekanu X! (kde X = ro-hydroxyalkylkarboxamidopo.yethylenglykoikarboxamidová spojka obecného vzorce IV, přičemž n₃ = 1, n, = 3 a Y = hydrofobní doména vzorce VI). Pro C«H,„N_SO₁₃-H HR-MS, vypočteno m/z, 1176,87206 nalezeno m/z- 1176,87174; Ή NMR (400 MHz, CDC1₃) δ ppm: 5,36 d, >5.05 Hz, 1 H (CH₂-5); 3,98 s, 2 H (CHzCOO); 3,72 3,77 m, 2 H (CH₂-3)_; 3,64 d, >4,04 Hz, 12 H (6 x CH₂O); 3,58 t, ./=4,90 Hz, 3 H (CH₂O)· 3,50 q, >5,50 Hz, 2 H (CHz-U'); 3,05 - 3,30 m, 13 H (6 x CH₂N); 2,48 t, >5,94 Hz, 2 H (CH₂-2 ); 2,31 - 2,38 m, 1 H (CH-4a); 2,18 - 2,28 m, 1 H (CH-4”b); 1,76 - 2,06 m, 6 H (cholesteryl); 1,61 - 1,73 m, 4 H (CH₂-3, CH₂-7,CH₂-8, CH₂-12); 1,41 - 1,51 m, 27 H (_tm. butyl), 1,01 s, 3 H (CH₃-19 ); 0,94 - 1,41 m, 17 H (cholesteryl); 0,92 d, >6,57 Hz, 3 H H Xí ^HZ’ ^{3 H <CH3}’²⁶ °’^{86 7=}'^H2’ ^{3 H <CH3}’²⁷''^); °’⁶* ^S’ ³

Příklad 11

K roztoku ^-(V.{O-[(3_P).cholest-5-en-3-yl]glykoyl}.15-amino-4,7,10,13-te^^^ _{H (kde χ=} ^Obydroxyaikylkarboxamidopolyethylenglykoikarboxamidová spojka obecného vzorce IV, pncemz n₃ = 1, m = 3 a Y = hydrofobní doména vzorce VI; 51 mg, 0,04 mmol) vdrchlonnethanu (5 ml) se přidá kyselina trifluoroctová (1 ml, 13 mmol) a směs se míchá za a oratorní teploty 4 hod. Potom se rozpouštědlo oddestiluje za sníženého tlaku a destilační zbytek lyofilizuje z dioxanu (5 ml). Získá se 32 mg (84% výtěžek) y-(A4O-[(3_P).cholest-5en-3-yl]glykoyl}-15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanoyl)-4,9-diaza-l,12-diaminododekanu I (kde X = ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce IV, přičemž n₃ = 1 a m = 3 a Y = hydrofobní doména vzorce VI). Pro C₅r,H,₃N₅O,-H HR-MS, vypočteno „/z, 876,71478 nalezeno _m/z·. 876,71418; Ή NMR (400

MHz, CDCW δ ppm: 5,32 br. s. 2 H (CH₂.6-); 3,73 - 3,86 m, 2 H; 3,54 - 3,72 m 14 H' 3 48 ^{<8 X PE}°^{); 3}’²⁶ ’ ^{3,47 ,0H; 34} ‘ - ³·²⁵ ^{2H; 2} ⁷ - W ”· 2 H 6 x CH₂ K spermin; CH,N, P_EG); 2,54 _t, _{2 H r} (CH₂-2 , CH₂-2 yloxy acetyl); 1,99 - 2,14 m, 8 H (cholesteryl); 1,76 - 1,99 m, 8 H (4 x CH,spermi„); 1,55 dt, >13,1, 6,28 Hz, 15 H (CH₂-3, butanoyi); 0,84 - 1,43 m 7H °’’³ ^'^{2 HZ}’ ^{3 H} °'’^{1 4}

H (CH₃-26 ); 0,87 d, >1,28 Hz, 3 H (CH₃-27)_; 0,69 s, 3 H (CH3-I8).

Příklad 12

Ke kyše me pentadekanové obecného vzorce X (kde n, = 3 a m = 3; , 17 m_g, 0,1 7 mmol) _v suchém _WZ “ ^{(5 Se ΡΜί} “««karbonát (73 mg, 0,18 mmol) a 4me hyimorfohn (0,1 ml, 1 mmol) a smés se míchá za laboratorní teploty 1 hod. Průběh reakce monitoruje pomocí TLC v ethylacetátu. Směs se dvakrát lyofilizuje z dioxanu (2 x 50 ml) a ™ any pentafluorofenyiester kyseliny *-{0.[(3p)-eh₀lest.₅.en.3-yl].4.hydr₀xybutanoyl}. ⁵’⁷’10,13-tetraoxapentadekanové obecného vzorce X (kde = 3, „ = 3; 184 mg) se ihned použije ke kondenzaci s parciálně chráněným sperminem.

Směs pentafluorofenylesteru kyseliny kyseliny ^[(33)^1^.5^^ ammo-4,7J 0,13-tetraoxapentadekanové obecného vzorce X (kde n₂ = 3, m 3; 80 mg 0 09 mmol) a Λ1V V-tri-(_tere.butoxykarbonyl)sperminu (60 mg, 0,11 mmol) se suěí za snivého •laku a pn teplotě místnosti 1 hod. Apamtura se propiáchne argonem, pod argonem se pHdá suchy V>dime_thyiformamid (4 ml) a ethyldiizopropylamin (! ml) a směs se míchá za laboratorní teploty 12 hod. Chromatograíií re^ní směsi na sloupci silikageiu (100 ml) v systému toluen-ethylacetát _{(gradient 0}._{40% ethylacetát;} ,θ 23/0 vytezek) * nu XI (kde X = o-hydroxyalkyHrarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce IV, ořičemž nc = 7 η — ί xr , _c „ _{KT n} > 4 3 a Y - hydrofobní doména vzorce VI). Pro ^67^1(211515013-11 HR-MS, vypočteno mh· onaonni i ’ vypočteno m/z. 1204,90337 nalezeno m/z·. 1204,90298· 'H NMR (400 MHz, CDClj) δ ppm: 5,34 - 5,38 m, 1 H (CH^ ); 3,741, >6,10 Hz, 2 H (CH₂-3)· 3 58 , ^{X CH2}'°^{); 3}'⁵³ - ³’^{57 m}’ ^{2 H (CH2}-'^ - H (CH₂.4 ); 3,44 _q, >5,05 Hz, 1 H (CH-3-); 3,04 - 3,30 m, 12 H (CH₂-_N); 2,481, >6,06 Hz 1

H (CH₂-2); 2,34 ddd, >13,20, 4,70,2,10 Hz, 1 H (H^a); 2,291,>7,39 Hz, 2 H (CHz-Z); 1,76 - 2,25 m, 13 H (cholesteryl); 1,60 - 1,75 m, 8 H (CH_r3, CH₂-7, CH₂-8, CH₂-12); 1,41 M7 m, 27 H (terc-butyl); 0,99 s, 3 Η (CH₃-19''); 0,92 d,>6,57 Hz, 3 H (CH₃-2D; 0,87 d, /-1,77 Hz, 3 H (CH3-26-); 0,86 d, >1,77 Hz, 3 H (CH₃-27); 0,84 - 1,57 m, 33 H (cholesteryl); 0,68 s, 3 H (CH₃-18).

Příklad 13

K roztoku VwO-Ksp^holest-S-en-J-y^^ 15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanoyl)-M,v>'^is.(_ZOT._to^^

XI (kde X = ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce IV, přičemž n₃ = 3, n, = 3 a Y = hydrofobní doména vzorce VI; 83 mg, 0,07 mmol) v dichlormethanu (5 ml) se přidá kyselina trifluoroctová (2 ml, 26 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 4 hod. Potom se rozpouštědlo oddestiluje za sníženého tlaku a destilační zbytek lyofilizuje zdioxanu (2 x 20 ml). Získá se 61 mg (98% výtěžek) cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanoyl}-15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanoyl)-4,9diaza-l,12-diami-nododekanu obecného vzorce (I, kde X = ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykol karboxamidová spojka obecného vzorce IV, přičemž n₃ = 3, n, = 3 a Y = hydrofobní doména vzorce VI). Pro C₅₂H,₇N₅O,-H HR-MS, vypočteno rtó: 904 74608 nalezeno m/z: 904,74595; >H NMR (400 MHz, CDC1₃) δ ppm; 5,36 br. s„ 2 H (CH₂-6'·); 3,73 - 3,85 m, 2 H; 3,54 - 3,72 m 14 H; 3,46 - 3,54 m, 2 H (8 x CH₂-O, PEG); 3,58 t, >6,57 Hz (CH₂-4, butanoyl); 3,26 - 3,46 m, 10 H; 3,10 - 3,24 m, 2 H; 2,87 - 3,09 m s, 2 H (6 x CH₂N, spermin; CH₂-N, PEG); 2,54 t, >8,20 Hz, 2 H (CH^”); 2,24 - 2,47 m 4 H (CH₃-2' CH₂-3 butanoyl); 1,99 - 2,14 m, 8 H (cholesteryl); 1,76 - 1,99 m, 8 H (4 x CH₂-spermin),’ 1,55 dt, J 13,07, 6,22 Hz, 15 H (CH₂-3, butanoyl); 0,84 - 1,43 m, 37 H (cholesteryl); 1,018 S, 3 H (CH3-19-); 0,945 d, >6,6 Hz, 3 H (CHj-21'); 0,90 d, >1,52 Hz, 3 H (CH₃-26); 0,89 d, J-1,26 Hz, 3 H (CH₃-27)_; 0,71 s, 3 H (CH₃-18).

Příklad 14

Ke směsi cholesterolu (387 mg; 1 mmol) a NaH (400 mg, 10 mmol, 60»/, emulze v minerálním oleji promyté hexanem) se přidá tetrahydrofuran (30 ml) a směs se za míchání pod sušícím uzávěrem zahřívá k varu 12 hod. Následně se přidá tor-butylbromoacetát (585 mg; 3 mmol) a v zahřívání se pokračuje dalších 12 hod. Přebytečný hydrid se opatrně rozloží vodou (50 ml) a produkt se vezme do diethyletheru (2 x 50 ml). Spojené organické vrstvy se , /] · · · » · » » 4 ♦ * Í, » Mt 1 vysuší nad síranem hornatým. Síran horečnatý se odfiltruje a filtrů se za sníženého tlaku odpan Chromatografií odparku na sloupei silikagelu (200 ml) v systému hexanová r ce/rerc-butylmethylether s gradientem od 0% do 30% Zere-butylmethyletheru (10 mVmin) se získá 131 mg (26,2% výtěžek) l^-bulvl [(3_P)-cholest-5-en-3-yl]glykolátu XII (kde n₂ =

). Pro CsaHséOa-Na HR-MS, vypočteno m/7· S9t inn 1 , vypočteno m/z. 523,41217 nalezeno m/z\ 523,41201· ^!H NMR ^Hz, CDCI3) δ ppm: 5,34 - 5,38 m, 1 H (H-6); 4,01 s, 2 Η (Η-Γ); 3,24 tt, >11 23^5^ ^{1 2}·22 -2,32 m, 1 H (H-4b); 1,76 - 2,07 m, 5 ^1

H (CH n 0^ ^{1,48 S}’^{9 H (}''^buty‘^{); 1,01 s}’^{3 H (CIW9);} °’^{92 d}- ^Hz·

H (CH3-21); 0,88 d,>l,80 Hz, 3 H (CH₃-26); 0,86 d,>l,80 Hz, 3 H (CHr-27); 0,83 - 1,63 m, 42 H (cholesterol + Z-butyl); 0.68 s, 3 H (CH3-I8).

Příklad 15 a směs se míchá při 64 °C 5

7m>butyl [(3P)-cholest-5-en-3-yI]glykolát XII (kde n₂ = 1 1i1 O 99 n v etheru (8 ml) a přidá se kyselina mravenčí (5 ml; 132 mmol) hod. Potom _se rozpouštědio oddestiluje _{za snfženého a des}

Z .oxanu (_{20 ml)}. _{Z(ská se} „ _{mg (lw)%} y g y o ove IX (kde n₂ 1). Pro CaHisOj-Na HR-MS, vypočteno m/z·. 467,3496 nalezeno 467,3496; H NMR (400 MHz, CDCh) δ ppm; 5,33 - 5,41 m, 1 H (H-6); 4 16 s 2 Η (H ^3,31 tt,>11,20,4,60 H^^

X 3 HICH 7? ^{5 H H}'¹²· ^H'²’ ^H'⁷’ '’°^{1 S}' ^{3 H (CHH9);} °’^{92 d}’

Hz, 3 H (CH3-21); 0,88 d, >1,77 Hz, 3 H (CH₃-26); 0,86 d, >1,64 Hz, 3 H (CH₃-27); 0,79 1,67 m, 33 H (cholesteryl); 0,68 s, 3 H (CH3-I8).

Příklad 16

Ke kyselině [pp^holest-S^-ylJglykolové IX (kde n₂ - 1; 160 mg; 0,36 mmol) v suchém Ν,Ν-dtmethylfonnamidu (5 ml) se přidá bis(pe„tafluorfenyl)karbonát (!56 mg; 0 39 mmol) a 4-methylmorfoíin (0,25 ml; 2,45 mmo». Směs se míchá jednu hodinu za ^oratorní teploty Průběh reakce se monitoruje pomoci TLC v toluenu. Směs se dvakrát lyofilizuje v dioxanu (2 V” ^Z'^{Ska 184} '^{8 penlafluorofen}>'¹ kyseliny to-c-butyl [(3_P)-cholest-5-en-3y g y o ove IX (kde n₂ - 1), který se ihned použije ke kondenzaci s 15-amino-4,7,10 13tetraoxa-pentadekanovou kyselinou.

K pentafluorofenyl kyselině zerc-butyl [(3_P)-eholest-5-en-3-yl]_glykolové IX (kde m = 1- 175 mg; 0,29 mmol) se přidá 15-amino-4,7,10,I3-tetraoxa-pentadekanová kyselina (160 mg;’o,6O

- J.- J * J.¹ λ mmol) a směs se hodinu dosuší na vakuu. Pod argonem se přidá suchý N-dimethylformamid (6ml) a N-ethyldiizopropylamin (2 ml). Reakce se míchá za laboratorní teploty do druhého dne a hned se chromatografuje na sloupci silikagelu (200 ml) v systému ethylacetát-methanol (gradient 0-30% methanol, 10 ml/min, 160 min, methanol je okyselen kyselinou mravenčí (10:1). Získá se 167 mg kyseliny ^-{0-[(3p)-cholest-5-en-3-yl]glykolové}-15-amino4,7,10,13-tetraoxapentadekanové obecného vzorce X (n₃=l; ru=3; 84,3% výtěžek). Pro C₄oH₆₉N0₈-Na HR-MS, vypočteno m/z\ 714,4915 nalezeno m/z: 714,4916; *H NMR (400 MHz, CDC1₃) δ ppm: 5,34 - 5,38 m, 1 H (CH₂-5'); 4,00 s, 2 H (CH₂COO); 3,78 t, >6,06 Hz, 2 H (CH₂-3); 3,59 - 3,68 m, 14 H (7 x CH₂O); 3,52 q, >5,47 Hz, 2 H (CH₂-14); 3,23 tt, >11,24, 4,36 Hz, 1 H (CH-3'); 2,611, >6,00 Hz, 2 H (CH₂-2); 2,36 ddd, >13,20,4,70 (CH4 a), 2,19 - 2,29 m, 1 H (CH-4 b); 1,77 - 2,06 m, 5 H (cholesteryl); 1,00 s, 3 H (CH3-I9'); 1,29 d, >3,66 Hz, 24 H (cholesteryl); 0,92 d, >6,57 Hz, 3 H (CH₃-21'); 0,88 d, >1,89 Hz, 3 H (CH3-26'); 0,86 d, >1,77 Hz, 3 H (CH₃-27'); 0,68 s, 3 H (CH3-I8').

Příklad 17

Komerčně dostupný cholesterol tosylát (2,8 g; 5,1 mmol) se rozpustí v toluenu (10 ml) a přidá se 4-hydroxybutannitril (0,61 g; 7,1 mmol). Reakční směs se pak 24 hodin míchá při 120 °C, odpaří se a rozpustí v izopropanolu (60 ml). K meziproduktu se přidá 12% vodný roztok NaOH (100 ml) a 4 dny se míchá při 100 °C. Přidá se 10% HC1 (100 ml) a extrahuje diethyletherem (4 x 30 ml). Produkt se přečistí na silikagelu (320 ml) v systému toluen ethylacetát (10 ml/min; gradient 0-40% ethylacetát). Získá se 345 mg (10% výtěžek) kyseliny O-[(3p)-cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanové IX (n₂= 3). Pro C₃iH₅₂O₃ vypočteno: 78,86% C, 11,09% H; nalezeno: 78,80% C, 11,18% H; *H NMR (400 MHz, CDC1₃) δ ppm: 5,32 5,39 m, 1 H (H-6); 3,55 td, >5,90, 1,40 Hz, 2 H (CH₂-r); 3,17 tt, >11,21, 4,39 Hz, 1 H (H3); 2,491, >7,01 Hz, 2 H (CH₂-3'); 2,36 ddd, >13,17, 4,71, 2,08 Hz, 1 H (H-4a); 2,14-2,24 m, 1 H (H-4b); 1,93 - 2,05 m, 2 H (CH₂-1, H-12); 1,90 t, >6,20 Hz, 2 H (CH₂-2')_; 1,78 1,88 m, 3 Η (H-2, H-7, H-16); 1,02 - 1,63 m, 22 H (chol. skelet); 1,01 s, 3 H (CH₃-19); 0,92 d, >6,57 Hz, 3 H (CH₃-21); 0,88 d, >1,77 Hz, 3 H (CH₃-26); 0,86 d, >1,77 Hz, 3 H (CH₃-27); 0,68 s, 3 H (CH₃-18).

Příklad 18

Ke kyselině O-[(3p)-cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanové IX (n₂ = 3; 283 mg; 0,6 mmol) v suchém N,N-dimethylformamidu (4 ml) se přidá bis(pentafluorfenyl)karbonát (260 mg;

0,66 mmol) a 4-methylmorfolin (0,1 ml; 1 mmol). Směs se míchá jednu hodinu za laboratorní teploty. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC ve směsi toluen-ethylacetát (10:1). Směs se dvakrat lyofilizuje v dioxanu (2 x 20 mi). Získá se 382 mg pentafluorfenyl kyseliny 04(30)cholest-5.en-3._yl]-4-hydrox_ybutanové IX (n₂ = 3; ), který se ihned použije ke kondenzaci S 15-amino-4,7,10,13-tetraoxa-pentadekanovou kyselinou.

K pentafluorfenyl kyselině O-[(3_P)-cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanové IX (n₂ = 3- 121 mgl 0,19 mmol) se přidá 15-amino-4,7,10,13-tetraoxa-pentadekanová kyselina (104 mg’o 39 mmol) a směs se hodinu dosuší na vakuu. Pod argonem se přidá suchý N-dimethylformamid 4ml) a N-ethyldiizopropylamin (1 ml). Reakce se míchá za laboratorní teploty do druhého ne a hned se chromatograluje na sloupci silikagelu (100 ml) v systému toluen-ethylacetát (gradient 0-40»/. ethylacetát, 10 ml/min, 160 min). Získá se 280 mg (88% výtěžek) kyseliny hH<H(3_P)-cholest-5-en-3^^^ nové obecného vzorce (X; n₃ = 3; m = 3). Pro C₄₂H,₃NO₈-H HR-MS, vypočteno 720,5409 nalezeno m/c: 720,5407; Ή NMR (400 MHz, Aceton) δ ppm; 3,71 t, >6,32 Hz 2 H (CH₂-3); 3,55 - 3,60 m, 14 H (7 x CH₂-O); 3,51 t, >5,60 Hz, 2 H (CH₂-14); 3,45 t >6 32 ^13,20, 4,70, 2,10 Hz, 1 H (H-4a); ₂,_{24 t}, >₇,_{45 Hz}, _{2 H (CH2}.₂._{); 182} _ _{217 m 5 H}(Cholesteryl); 1,76 - 1,82 m, 2 H (CHz-3’); 1,01 s, 3 H (CH₃-19”); 0,94 d, >6,57 Hz 3 H (CH,21-_); 0,87 d, >1,26 Hz, 3 H (CH^'); 0,86 d, >!,52 Hz, 3 H (CH₃-27-); O.Í 1,66 m, 34 H (cholesteryl); 0,71 s, 3 H (CH3-I8).

Příklady provedení - biologické aktivity

Příklad 19

Enkapsulace anionických antivirotik do kationických liposomů a zvýšení antivirální aktivity in vitro ^J

Metody: Liposomy byly připraveny standardními postupy např. hydratací lipidního filmu a extruzi hposomů přes polykarbonátové filtry Nucleopore s velikostí pórů 100 nm. Velikost a zeta-potencial byly měřeny na přístroji Nanosizer ZS (Malvem).

Koncentrace enkapsulovaného nukleotidového antivirotika Cidofoviru ® [(S)-l-(3-hyd_roxy2'Phosphonylmethoxypropyl)cytosinu] byla stanovena spektrofotometricky po separaci liposomů od volného Cidofovoru pomocí ultracentrifugace a lyži liposomů 20 mM kyselinou cholovou. UV absorbance byla měřena při 272 nm (extinkční koeficient ε = 9000, pH = 7,0).

Výsledky, Kationické lipidy 1-6 jsou schopny spolu s dalšími pomocnými lipidy (např. EPC = vaječný fosfatidyl cholin) tvořit stabilní lipidní dvojvrstvu a tudíž je lze použít na přípravu liposomů. Tento fakt je dokumentován na Obr. 1. Velikost liposomů koresponduje s velikostí pórů použitého filtru pro extruzi (ukázka pro lipid 1 je Obr. 2.). Zeta potenciál liposomů závisí na poměru kationického lipidu k celkovému množství lipidu. V neutrálním pH roztoku PBS dosahuje pro 20 - 30% kationického lipidu ve směsi hodnot nad 30 mV. Ukázka vlivu obsahu kationického lipidu v liposomech na jejich ζ-potenciál je na Obr. 2.

Zvyšovaní ζ-potenciálu vede k výraznému zvýšení enkapsulační účinnosti pro anionická analoga nukleotidů díky silné elektrostatické interakci mezi pozitivně nabitou polyaminovou skupinou fosfohpidů v liposomální membráně a negativně nabitou fosfátovou nebo fosfonátovou skupinou v léčivu. Závislost enkapsulační účinnosti na zvyšujícím se obsahu kationického lipidu je na Obr 3. Je dosaženo téměř trojnásobné enkapsulační účinnosti ve srovnaní s neutrálními hposomy, kde dochází pouze k pasivní enkapsulaci s účinností kolem 20%.

Příklad 20

Cytotoxicita kationických liposomů —^Pro cytotoxicity byl použit standardní MTT test cytotoxicity doplněný mikroskopickou analýzou. Buňky byly inkubovány s liposomy 24 h. Koncentrace celkového lipidu je udávána v mg/ml. Pro testování byly použity buněčné linie MDBK, B16F10, MCF-7 (Obr. 4).

Výsledky: Testované kationické lipidy nevykazují výraznou cytotoxicitu in vitro vůči buněčným liniím. Volné kationické lipidy ve formě micel vykazují cytotoxický účinek v rozmezí koncentrací 10-100 μΜ. Cytotoxický efekt liposomální formulace (20% kationického lipidu) se projevuje až za hranicí 10 mg/ml celkového liposomálního lipidu. Tyto koncentrace daleko převyšují koncentrace používané pro in vitro aplikace.

Liposomální formulace kanonických lipidů výrazně snižují toxicitu volných kationických lipidu. Jako poklad jsou zde uváděny křivky in vitro cytotoxicity pro liposomální Lipid 1 „a buněčných liniích MDBK (Obr. 4). Srovnány jsou cytotoxické kfivky pro prázdné liposomy liposomy s enkapsulovaným Cidofovirem a pro samotný Cidofovir. Toxicita není pozorováni do koncentrace 100 mg/ml lipidu. Enkapsulace Cidofoviru nemá vliv „a cytotoxicitu.

Příklad 21

Antivirální účinek in vitro na modelu BHV-1 virové infekce buněk MDBK

Metody: Testování antivirálního účinku bylo provedeno na in vitro modelu bovinního heipesviru 1 (BHV-1) na buněčné linii MDBK. Tento model skýtá několik výhod pro testování antivirálního účinku. BHV-1 virus není přenosný na člověka a je možné jej kultivovat na MDBK buněčné linii. Kvantifikace virové infekce je možná jednak hodnocením cytopatickeho efektu a velmi přesně je hodnotitelná pomocí QRT-PCR. Brníky byly inkubovány 6 h s testovanými preparáty, poté bylo médium vyměněno a buňky byly infikovány virem BHV-1 o různém thru (10^J, 10 ^s, 10'’, 10^. Produkce virové DNA byla kvantifikována standardním testem kvantitativní PCR (polymerázové řetězové reakce) V reálném čase (QRT-PCR).

Výsledky: Kationické liposomy představují vhodný nosičový systém pro hydrofilní antivirotika na bázi derivátů nukleotidů (např. Cidofovir). Lipsomální formulace Cidofoviru zvyšuje antivirální účinek in vitro proti BHV-1 viru více než o dva řády ve srovnání s volnou látkou (Obr. 6). Po rychlém proniknutí liposomálního léčiva do buňky inhibuje Cidofovir syntézu virové DNA a dochází k produkci defektních virových částic, které nejsou schopny infikovat další buňky.

Množství virové DNA bylo kvantifikováno pomocí metody QRT-PCR.

Kationický lipid 1 je označen zkratkou LD1. Lipsosomy byly připraveny spřídavkem 20% ationickych hp.dů (zde je ukázka opět s lipidem 1) Buňky MDBK byly inkubovány 6 h s jednotlivými preparáty, potom bylo vyměněno medium a buňky byly infikovány virem BHV-1. Produkce virové DNA byla kvantifikována pomocí QRR-PCR po 24 h.

Příklad 22

Zvýšeni mtemalizace oligonukleotidu s využitím kationických liposomů

Metody; Kationické liposomy byly připraveny z EPC (85%) a kationických lipidů 1-6 (15%). Tento poměr byl shledán jako optimální pro transfekci nukleotidů. Transfekční účinnost byla testována na standardním in vitro modelu s buněčnou linii MCF-7. Buňky byly kultivovány v mikrotitračních deskách (48 jamek) se sérem po dobu 24 hodin. Koncentrační řada hposomu se naředí v médiu Opti-MEM (Life Technologies Corporation, Invitrogen ™) a pndají se oligonukleotidy značené FAM (ss 32-mer) rovněž v Opti-MEM. Liposomy se smíchají s oligonukleotidy, mixují 20 min, centrifiigují a nechají inkubovat 30 minut Poté se přidá komplex liposomů a oligonukleotidy k buňkám po kapkách do média Opti-MEM které bylo předem vyměněno za čerstvé. Buňky se inkubují dalších 24 hodin a pak se opláchnou IxPBS, pnda se CellScrub buffer, který odmyje kompiexy liposom/oligonukleotid, zachycený na membránách. Následuje ještě jeden oplach PBS a poté se buňky lyžují lyzačním roztokem IxCelI Culture Lysts Reagent (Promega). Lyžuje se na třepačce 30 minut při laboratorní teplotě. V lyzátu se stanoví proteiny modifikovanou metodou dle Lowryho. Kvantifikace oligonukleotidu se provede fluorometricky v 96 jamkových deskách. Hodnoty fluorescence se normalizují na celkový obsah proteinů (Obr. 7).

Výsledky; Liposomy připravené z kationických lipidů 1 až 6 vykazují schopnost doručit oligonukleotidy do cílových buněk (podobně jako nízkomolekulámi nukleotidové antivirotikum - Cidofovir). Neutrální liposomy připravené pouze z vaječného fosfatidylcholinu tuto aktivitu nevykazují.

Příklad 23

Transfekce plasmidu

Metody; Lipopoliaminy byly použity k přípravě transfekčních liposomů o složení kationický h_pld:DOPE 1:1. (DOPE - dioleylfosfatidyletanolamin). Liposomy byly připraveny metodou hydratace ladního filmu a extruzí přes polykarbonátové filtry. K transfekci byl použit plasmid kódující luciferázu. Transfekce byla provedena standardním testem na buňkách MCF7 (150 000 bb/j. v 500 pl OptiMEM). Test byl proveden v 24 jamkových destičkách při konfluenci buněk 90-95%. Transfekční účinnost se stanoví měřením luminiscence na destičkovém luminometru po 24 h kultivaci. Komplexy kationických lipsomů s DNA byly

J.-J* .:. ' připraveny v poměrech DNA (pg): liposomy(pg) 1:1, 1:5, 1:10, 1:15,1:20, 1:30, 1:50,1:70. Jako kontrola byl použit komerční liposomální transfekční kit Trojene® (Avanti Polar lipids, USA). U tohoto kitu bylo postupováno podle přiloženého manuálu.

Výsledky: Ukázka transfekční účinnosti je pro lipidy 2 a 4 s objemnou cholesterylovou hydrofobní skupinou. Tyto lipidy jsou pro transfekci pDNA nejvhodnější. Liposomy pnpravene z těchto katiomckých lipidů vykazovaly transfekční účinnost srovnatelnou s komerčním kitem Trojene, avšak tyto nové lipidy vykazují nižší toxicitu in vitro.

Přehled použité literatury

Andre F.M., Mir L.M.: Nucleic acids electrotransfer in vivo: mechanisms and practical aspects, Curr. Gene Ther. 2010,10, 267-280.

Behr J.P.: Gene-Transfer with Synthetic Cationic Amphiphiles - Prospects for Gene-Therapy, Bioconjugate Chemistry 1994, 5, 382-389.

Behr J.P., Demeneix B„ Loeffler J.P., Mutul J.P.: Efficient Gene-Transfer Into Mammalian Primary Endocrine-Cells with Lipopolyamine-Coated Dna, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1989, 86, 6982-6986.

Boussif O., Lezoualch F., Zanta M.A., Mergny M.D., Scherman D., Demeneix B., Behr J.P.: A Versatile Vector for Gene and Oligonucleotide Transfer Into Cells in Culture and In-Vivo Polyethylenimine, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1995, 92, 7297-7301.

Fujiwara T„ Hasegawa S„ Hirashima N., Nakanishi M., Ohwada T.: Gene transfection activities of amphiphilic steroid-polyamine conjugates, Biochimica et Biophysica ActaBiomembranes 2000,1468, 396-402.

Gao X, Huang L.: A Novel Cationic Liposome Reagent for Efficient Transfection of Mammalian-Cells, Biochemical and Biophysical Research Communications 1991,179, 280285.

Haensler J., Szoka F.C.: Polyamidoamine Cascade Polymers Mediate Efficient Transfection of Cells in Culture, Bioconjugate Chemistry 1993, 4, 372-379.

Hejazi R., Amiji M.: Chitosan-based gastrointestinal delivery systems, Journal of Controlled Release 2003, 89, 151 -165.

Holy A.: Phosphonomethoxyalkyl analogs of nucleotides, Current Pharmaceutical Design 2003, 9, 2567-2592.

Keller M„ Jorgensen M.R., Perouzel E„ Miller A.D.: Thermodynamic aspects and biological profile of CDAN/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes, Biochemistry 2003, 42, 6067-6077.

Kirby A.J, Camilleri P., Engberts J.B.F.N., Feiters M.C., Nolte R.J.M., Soderman 0., Bergsma M., Bell P.C., Fielden M.L., Rodriguez C.L.G., Guedat P„ Kremer A., McGregor C., Pemn C., Ronsin G., van Eijk M.C.P.: Gemini surfactants: New synthetic vectors for gene transfection, Angewandte Chemie-International Edition 2003, 42, 1448-1457.

Koping-Hoggard M., Tubulekas I., Guan H„ Edwards K„ Nilsson M„ Varum K.M., Artursson P.: Chitosan as a nonviral gene delivery system. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo, Gene Therapy 2001, 8, 1108-1121.

Kusumoto S„ Inage M„ Shiba T„ Azuma I., Yamamura Y.: Synthesis of Long-Chain FattyAcid Esters of Normal-Acetylmuramyl-L-Alanyl-D-lsoglutamine in Relation to Anti-Tumor Activity, Tetrahedron Letters 1978, 4899-4902.

Lemaitre M., Bayard B., Lebleu B.: Specific Antiviral Activity of A Poly(L-Lysine)Conjugated Oligodeoxyribonucleotide Sequence Complementary to Vesicular StomatitisVirus N-Protein Messenger-Rna Initiation Site, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1987, 84, 648-652.

Miller A.D.: Human Gene-Therapy Comes of Age, Nature 1992, 357, 455-460.

Miller A.D.: Cationic liposomes for gene therapy, Angewandte Chemie-International Edition 1998,57, 1769-1785.

Miller A.D.: Gene therapy needs robust synthetic nonviral platform technologies, Chembiochem 2004, 5, 53-54.

Niculescu-Duvaz D„ Heyes J„ Springer C.J.: Structure-activity relationship in cationic lipid mediated gene transfection, Current Medicinal Chemistry 2003,10, 1233-1261

Ohtani K„ Nakamura M., Saito S., Nagata K., Sugamura K. Hinuma Y.: Electroporation Application to Human Lymphoid-Cell Lines for Stable Introduction of A Transactivator Gene of Human T-Cell Leukemia-Virus Type-I, Nucleic Acids Research 1989,17, 1589-1604. Petukhov I.A., Maslov M.A., Morozova N.G., Serebrennikova G.A.: Synthesis of polycationic lipids based on cholesterol and spermine, Russian Chemical Bulletin 2010 59 260-268. ’ ’

Regelm A.E., Fankhaenel S„ Gurtesch L., Prinz C., von Kiedrowski G., Massing U.: Biophysical and lipofection studies of DOTAP analogs, Biochimica a Biophysica AdaBiomembranes 2000,1464, 151-164.

Saha R., Killian S., Donofrio R.S.: DNA vaccines: a mini review, Recent Pat DNA Gene Seo 2011, 5, 92-96.

Stewart L., Manvell M„ Hillery E„ Etheridge C.J, Cooper R.G., Stark H., van-Heel M Preuss M„ Alton E.W.F.W., Miller A.D.: Cationic lipids for gene therapy part 4 - Physicochemical analysis of cationic liposome-DNA complexes (lipoplexes) with respect to in vitro and in vivo gene delivery efficiency. Journal of the Chemical Society-Perkin Transactions 2 2001, 624-632.

..... . ...

Tsukamoto M„ Ochiya T„ Yoshida S„ Sugimura T„ Terada M.: Gene-Transfer and Expression in Progeny After Intravenous Dna Injection Into Pregnant Mice, Nature Genetics 1995, 9,243-248.

Zhang S.B., Zhao Y.A., Zhao B.D., Wang B.: Hybrids of Nonviral Vectors for Gene Delivery. Bioconjugate Chemistry 2010, 27, 1003-1009.

Zhi D.F., Zhang S.B., Wang B„ Zhao Y.N., Yang B.L., Yu S.J.: Transfection Efficiency of Cationic Lipids with Different Hydrophobic Domains in Gene Delivery, Bioconjugate Chemistry 2010, 27, 563-577.

Zuhom I.S., Oberle V., Visser W.H., Engberts J.B.F.N., Bakowsky U„ Polushkin E„ Hoekstra D.: Phase behavior of cationic amphiphiles and their mixtures with helper lipid influences hpoplex shape, DNA translocation, and transfection efficiency, Biophysical Journal 2002, 83, 2096-2108.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Lipopolyaminy sperminového typu obecného vzorce I

(i), kde X je zvoleno ze skupiny, zahrnující γ vazbu mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní doményA atomem dusíku polyaminové části, aminopolyethylenglykolkarboxamidovou spojku obecného vzorce II

(II), kde ni = 1-13, vázanou na polyaminovou část i na hydrofobní doménu amidickou vazbou, ω-hydroxyalkylkarboxamidovou spojku obecného vzorce III

(lil), kde n2 = 1-9, vázanou na atom dusíku polyaminové části amidickou vazbou a prostřednictvím atomu kyslíku do polohy 2 cholesterylového skeletu, a ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidovou spojku obecného vzorce IV

(iv), kde Π3= 1-9 an4 = 1-13,

vázanou na atom dusíku polyaminové části amidickou vazbou a prostřednictvím atomu kyslíku do polohy 2 cholesterylového skeletu, a hydrofobní doména Y je zvolena ze symetricky v poloze C(2)pětveného acylu obecného vzorce V

kde ns = 5-30, nebo (3P)-cholest-5-en-3-ylu vzorce VI

(VI), přičemž když X je vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domény a atomem dusíku polyaminové části, nebo aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce II, tak Y je poloze C(2) symetricky větvený acyl obecného vzorce V, a když X je ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka obecného vzorce III nebo ω-

- hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce IV, tak

Y je (3P)-cholest-5-en-3-yl vzorce VI. ₇
2. Lipopolyaminy sperminového typu obecného vzorce Γ podle nároku 1, kde X je vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domén^aatomem dusíkp polyaminové části_znebo spojka obecného vzorce II uvedeného v nároku 1, kde ni — 3 a Y je v poloze C(2) symetricky větvený acyl obecného vzorce V uvedeného v nároku 1, kde ns = 13.
3. Lipopolyaminy sperminového typu obecného vzorce I podle nároku 1, kde X je spojka obecného vzorce III uvedeného v nároku 1, kde n₂ = 1 či 3; nebo spojka obecného vzorce IV /'7 uvedeného v nároku 1, kde 03 = 1 či3an4 = 3aYje (3P)-cholest-5-en-3-yl vzorce VI, uvedeného v nároku 1.
4. Způsob přípravy lipopolyaminů sperminového typu obecného vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, že v prvním kroku se kyseliny, zvolené ze skupiny, zahrnující v poloze C(2) symetricky větvené mastné kyseliny obecného vzorce VII

HOOC

kde ni = 5-30, kyseliny obecného vzorce VIII

(Vlil), kde ni= 1-13 a 05 = 5-30, kyseliny obecného vzorce IX

kde n2= 1-9, a kyseliny obecného vzorce X

kde n3= 1-9 an4= 1-13, převedou reakcí s bis(pentafluorfenyl)karbonátem v přítomnosti organické báze v polárním aprotickém rozpouštědle na své pentafluorfenyl estery, tyto pentafluorfenyl estery se v druhém kroku převedou v přítomnosti organické báze, reakcí s A^AW-tri^/erc-butoxykarbonyljsperminem v organickém aprotickém rozpouštědle_yna chráněné polykationické lipidy obecného vzorce XI

Boc I BOC—NH N v V _N xz _NH__X__Y„ I Boc (XI), kde X je vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domény Y a atomem dusíku polyaminové části_z nebo aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce II, popsaného v nároku 1, nebo ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka obecného vzorce III, popsaného v nároku 1, nebo ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce IV, popsaného v nároku 1, a ^/Y je v poloze C(2) symetricky větvený acyl obecného vzorce V popsaného v nároku 1, nebo (3P)-cholest-5-en-3-yl vzorce VI popsaného v nároku 1, tygr přičemž pre X = vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domény Y a atomem dusíku polyaminové části nebo aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka zmíněného vzorce II platí, že Y je v poloze C(2) symetricky větvený acyl obecného vzorce V popsaného v nároku 1, a pro X = ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka zmíněného vzorce III nebo ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka uvedeného vzorce IV platí, že Y je (3P)-cholest-5-en-3-yl zmíněného vzorce VI, ve třetím kroku se chráněné polykationické lipidy popsaného vzorce XI převedou na lipopolyaminy obecného vzorce I popsaného v nároku 1 odštěpením fórc-butoxykarbylových chránících skupin působením kyseliny trifluoroctovoé v dichlormethanu.
5. Způsob přípravy podle nároku 4, vyznačující se tím, že kyseliny obecného vzorce VIII se připraví bazicky katalyzovanou reakcí pentafluorfenyl esterů kyselin obecného vzorce VII s aminopolyethylenglykolkarboxylovými kyselinami H2N-(CH₂)2-O-[(CH₂)2-O]_n-(CH2)COOH^kde n = 1 /13, v organickém aprotickém rozpouštědle.
6. Způsob přípravy podle nároku 4, vyznačující se tím, že kyseliny obecného vzorce IX se připraví bazicky katalyzovanou alkylací cholesterolu pomocí terc-butylesteru kyselin ro-

-bromalkanových s počtem atomů uhlíku C₂ - Cio v aprotickém rozpouštědle a následným kysele katalyzovaným odštěpením terc-butoxykarbylové chránící skupiny v předchozím kroku získaného /erc-butylesteru obecného vzorce XIV

kde n₂ = 1- 9, nebo reakcí O-tosyl derivátu chlesterolu [(3p)-cholest-5-en-3-yloxy-4-methylbenzensulfonátu] s ω-hydroxyalkannitrily s počtem atomů uhlíku C₂ - Cio v nepolárním aprotickém rozpouštědle za zvýšené teploty a následnou bazickou hydrolýzou intermediálního Ο-[(3β)- cholest-5-en-3-yl]-o-hydroxyalkanoylnitrilu.
7. Způsob přípravy podle nároku 4, vyznačující se tím, že kyseliny X se připraví bazicky katalyzovanou reakcí pentafluorfenyl esterů kyselin obecného vzorce IX s aminopojyethylpnglykolkarboxylovými kyselinami {H₂N-(CH₂)₂-O-[(CH₂)₂-O]_n-(CH₂)ÁzZez “ COOH( n = 1 -13 ^v organickém aprotickém rozpouštědle.
8. Použití lipopolyaminů sperminového typu obecného vzorce I podle nároku 1 pro konstrukci polykationických samoskladných systémů jako nosičů nukleotidových a oligonukleotidových terapeutik a terapeutických genových konstruktů.