CZ303963B6 - Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému - Google Patents

Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému Download PDF

Info

Publication number
CZ303963B6
CZ303963B6 CZ20120020A CZ201220A CZ303963B6 CZ 303963 B6 CZ303963 B6 CZ 303963B6 CZ 20120020 A CZ20120020 A CZ 20120020A CZ 201220 A CZ201220 A CZ 201220A CZ 303963 B6 CZ303963 B6 CZ 303963B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
formula
general formula
hydrophobic domain
linker
cholest
Prior art date
Application number
CZ20120020A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ201220A3 (cs
Inventor
Drasar@Lukás
Ledvina@Miroslav
Korvasová@Zina
Turánek@Jaroslav
Original Assignee
Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved CR, v.v.i.
Výzkumný ústav veterinárního lékarství, v. v. i.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved CR, v.v.i., Výzkumný ústav veterinárního lékarství, v. v. i. filed Critical Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved CR, v.v.i.
Priority to CZ20120020A priority Critical patent/CZ201220A3/cs
Priority to EP13704708.0A priority patent/EP2802556B1/en
Priority to PCT/CZ2013/000004 priority patent/WO2013104346A1/en
Priority to US14/370,526 priority patent/US9393200B2/en
Publication of CZ303963B6 publication Critical patent/CZ303963B6/cs
Publication of CZ201220A3 publication Critical patent/CZ201220A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/17—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/18—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/34—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups
    • C07C233/35—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0055—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Lipopolyaminy sperminového typu obecného vzorce I, kde X je vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domény Y a atomem dusíku polyaminové cásti, nebo aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce II, kde n.sub.1 .n.= 1 az 13, nebo .omega.-hydroxy-alkylkarboxamidová spojka obecného vzorce III, kde n.sub.2 .n.= 1 az 9, nebo .omega.-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce IV, kde n.sub.3 .n.= 1 az 9 a n.sub.4 .n.= 1 az 13, a hydrofobní doména Y je v poloze C(2) symetricky vetvený acyl obecného vzorce V, kde n.sub.5 .n.= 5 az 30, nebo (3.beta.)-cholest-5-en-3-yl vzorce VI. V prípade, kdyz X je vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domény a atomem dusíku polyaminové cásti, nebo aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka vzorce II, tak Y je v poloze C(2) symetricky vetvený acyl vzorce V, a v prípade, ze X je .omega.-hydroxyalkylkarboxamidová spojka vzorce III nebo .omega.-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka vzorce IV, tak hydrofobní doména Y je (3.beta.)-cholest-5-en-3-yl vzorce VI. Zpusob prípravy lipopolyaminu obecného vzorce I prevedením v poloze C(2) symetricky vetvené mastné kyseliny obecného vzorce VII, kde n.sub.1 .n.= 5 az 30, nebo kyseliny obecného vzorce VIII, kde n.sub.1 .n.= 1 az 13 a n.sub.5 .n.= 5 az 30, nebo kyseliny obecného vzorce IX, kde n.sub.2 .n.= 1 az 9, nebo kyseliny obecného vzorce X, kde n.sub.3 .n.= 1 az 9 a n.sub.4 .n.= 1 az 13, reakcí s bis(pentafluorfenyl)karbonátem v prítomnosti organické báze v polárním aprotickém rozpoustedle na pentafluorfenyl estery, které se reakcí s N.sup.2.n.N.sup.3.n.N.sup.4.n.-tri-(ter

Description

Oblast techniky
Vynález se týká nových lipopolyaminů, způsobu jejich přípravy a využití těchto látek při konstrukci polykationických samoskladných nosičů léčiv na bázi negativně nabitých fragmentů nukleových kyselin
Dosavadní stav techniky
Jedním z hlavních problémů, které v současnosti limitují zavedení genové terapie a genetických vakcín do běžné klinické praxe, je nedostatečná účinnost transportu fragmentů nukleových kyselin (NK) přes buněčnou stěnu a jejich následná intemalizace do buněčného jádra, tj. tzv. transfekce (Miller, A. D. 2004; Zhang, S. B. a spol. 2010). V tomto případě je „léčivem“ fragment negativně nabité nukleové kyseliny, který musí proniknout buňkou a jadernými membránami. Jde vlastně o korekci genů vložením opravného genu (genů) a utlumení aktivity nevhodných genů. DNA vakcíny jsou specifickým oblastí genové terapie, kde cílovými buňkami jsou buňky imunitního systému prezentující antigen (zvláště dendritické buňky a monocyty; Saha, R. a spol. 2011).
Zásadní úlohu zde hraje proces penetrace negativně nabitého fragmentu NK přes fosfolipidovou dvojvrstvu buněčné stěny. Tato skutečnost iniciovala v posledním desetiletí rozsáhlý výzkum zaměřený na vývoj nosičů (tzv. vektorů), které by byly schopny efektivně transportovat NK přes buněčnou membránu. Tyto vektory musí současně zajistit ochranu NK před její degradací in vivo (Kirby, A. J. a spol. 2003; Miller, A. D. 1998; Zhang, S. B. a spol. 2010). S problémem efektivity transportu přes buněčnou membránu se rovněž setkáváme v případě nukleotidových a oligonukleotidových antineoplastik a antivirotik (Holý, A. 2003).
Metody pro vpravení části NK do cílových buněk se obecně dělí na metodiky využívající virové, nebo nevirové vektory. Virové vektory představují v současnosti nej efektivnější transfekční systém, ale vzhledem k možným biologickým rizikům (zejména nepředvídatelným imunitním reakcím) je zavedení virových vektorů do běžné klinické praxe více než problematické (Miller, A. D. 1992; Zhang, S. B. a spol. 2010). Nevirové vektory rozlišujeme podle způsobu, jakým je NK vpravována do intracelulámího prostoru, na vektory fyzikální a chemické. Fyzikální vektory pracují s fyzikálním nebo mechanickým narušením buněčné membrány, které umožní inzerci NK do intracelulámího prostoru (André, F. M. a spol. 2010). Chemické vektory jsou založeny na polykationických polymerech nebo na supramolekulámích samoorganizujících se lipidních systémech, které vytvoří s negativně nabitou NK komplex (tzv. polyplex, resp. lipoplex), schopný překonat buněčnou membránu a ve kterém je NK současně chráněna před degradací v krevním řečišti. Nejčastěji používanými kationickými polymery jsou DEAE-dextran (Ohtani, K. a spol. 1989), chitosan (Hejazi, R. a spol. 2003; Koping-Hoggard, M. a spol. 2001), polylysin (Lemaitre, M. a spol. 1987), polyethylenimin (Boussif, O. a spol. 1995), a polyamindendrimery (Haensler, J. a spol. 1993).
Nadějnými kandidáty na nosiče NK, aplikovatelné v humánní medicíně, se v současnosti jeví polykationické samoskladné íipidní struktury (tzv. polykationické liposomy). Ty jsou nejčastěji tvořeny syntetickým lipopolyaminem (tzv. cytofektinem) a neutrálním kolipidem. Polykationické liposomy, na rozdíl od virových vektorů, jsou tvořeny strukturně definovanými molekulami a lze proto strukturními změnami modulovat jejich fyzikální a biologické vlastnosti a zvýšit tak transfekční schopnost a potlačit toxicitu. Tento fakt inicioval rozsáhlý výzkum v oblasti polykationických lipidů. Byla připravena široká paleta kationických lipidů lišících se charakterem kationické a hydrofobní domény (Niculescu-Duvaz, D. a spol. 2003; Zhi, D. F. a spol. 2010). Mnohé z těchto kationických lipidů jsou již komerčně dostupné jako transfekční činidla a několik lipo- i CZ 303963 B6 somálních formulací bylo použito v klinických testech v genové terapii pro léčení rakoviny a ostatních genetických poruch (Behr, J. P. 1994).
Z hlediska struktury kationické domény představují kationické lipidy, jejichž doména je tvořena polyaminy odvozenými od přírodního sperminu nebo spermidinu, nejúspěšnější třídu kationických lipidů. To je dáno tím, že účinně neutralizují, srážejí a enkapsulují DNA a mají endozomální pufrační vlastnosti (Stewart, L. a spol. 2001). Alternativními nejčastěji se vyskytujícími kationickými doménami jsou např. kvarterní amoniové ionty, guanidinový motiv, dusíkaté heterocykly, bazické aminokyseliny a od nich odvozené krátké peptidy (Niculescu-Duvaz, D. a spol.
2003). Hydrofobní domény jsou nejčastěji tvořeny jedním nebo více alifatickými řetězci (nasycenými, nenasycenými nebo fluorovanými), nebo steroidním zbytkem.
Celková geometrie kationického lipidu, tj. poměr polární a nepolární části molekuly, má zásadní vliv na utváření strukturních fází v roztoku a transfekční aktivitu. Dvouřetězcové lipidy ve srovnání s jednořetězcovými nebo tři- a víceřetězcovými vytváří lépe lipidové dvojvrstvy, které se ve vodném roztoku samouzavírají do sférických liposomů. Naproti tomu kationické lipidy s jedním nebo třemi alifatickými řetězci mají zvýšenou tendenci vytvářet micely resp. reverzní micely a vykazují proto nižší transfekční aktivitu a mnohdy zvýšenou toxicitu (NiculescuDuvaz, D. a spol. 2003; Tsukamoto, M. a spol. 1995). Proto drtivá většina používaných kationických lipidů obsahuje dva alifatické řetězce. Nejvíce používanou větvící doménou je glycerol, který, podobně jako v přírodních amfifilech, slouží k prezentaci dvou hydrofobních řetězců (Zuhorn, I. S. a spol. 2002). Kationické lipidy s touto kostrou mohou být podle místa navázání hydrofobní domény symetrické nebo asymetrické. Zajímavým větvícím principem umožňujícím prezentaci dvou hydrofobních řetězců jsou synteticky dobře dostupné sekundární amidy aminokyselin (Behr, J. P. a spol. 1989). Dalšími strukturními motivy, sloužícími k násobné prezentaci hydrofobních domén, jsou např. substituované aromatické kruhy a krátké peptidy (pro přehled ref. Niculescu-Duvaz, D. a spol. 2003). Specifickou skupinou hydrofobních domén jsou steroly s planámí strukturou. Předpokládá se, že lipidy obsahující steroidní jednotku mají tendenci zpevňovat lipidní dvouvrstvu (Regelin, A. E. a spol. 2000). Většinou se jedná o deriváty cholesterolu prezentující v poloze C(3) polykationickou doménu polyaminového typu via uretanová spojka. Do této kategorie patří i komerčně dostupný C-DAN, ref. (Gao, X. a spol. 1991; Keller, M. a spol. 2003; Petukhov, I. A. a spol. 2010). Jistým omezením z hlediska širšího použití těchto kationických lipidů je limitovaná stabilita jej ich uretanové spojky. Jsou rovněž známy transfekční systémy založené na amidech cholových kyselin (Fujiwara, T. a spol. 2000).
Podstata vynálezu
Předmětný vynález řeší problém: (a) syntetické náročnosti lipopolyaminů obsahujících dvě symetrické alifatické hydrofobní domény, založené na symetrických lipofilních diacylderivátech glycerolu a na symetrických sekundárních amidech aminokyselin, použitím amidů synteticky dobře dostupných v poloze C(2) symetricky větvených mastných kyselin, jakož i inzercí polyethylenglykoiové spojky mezi hydrofobní a polykationickou doménou; (b) limitované stability uretanové spojky v případě lipopolyaminů odvozených od cholesterolu její náhradou spojkou typu amidů ω-hydroxykarboxylových kyselin nebo aminpolyethylenglykolkarboxylových kyselin.
Předmětem vynálezu jsou lipopolyaminy sperminového typu obecného vzorce I
NH
NH
NH—X—Y kde X je zvoleno ze skupiny, zahrnující
(I), vazbu mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobni domény Y a atomem dusíku polyaminové části, aminopolyethylenglykolkarboxamidovou spojku obecného vzorce II
NH
kde ni = 1-13, vázanou na polyaminovou část i na hydrofobni doménu Y amidickou vazbou, ωhydroxyalkylkarboxamidovou spojku obecného vzorce III
O
(lil), kde n2 = 1-9, vázanou na atom dusíku polyaminové části amidickou vazbou a prostřednictvím atomu kyslíku do polohy 2 cholesterylového skeletu, a ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidovou spojku obecného vzorce IV
kde n3 = 1-9 a n4 = 1-13, vázanou na atom dusíku polyaminové části amidickou vazbou a prostřednictvím atomu kyslíku do polohy 2 cholesterylového skeletu, a hydrofobni doména Y je zvolena ze symetricky v poloze C(2)větveného acylu obecného vzorce V
kde n5 = 5-30, nebo (3p)-cholest-5-en-3-ylu vzorce VI
-3CZ 303963 B6
(vi).
přičemž když X je vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domény Y a atomem dusíku polyaminové části nebo aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce II, tak Y je poloze C(2) symetricky větvený acyl obecného vzorce V, a když X je ωhydroxyalkylkarboxamidová spojka obecného vzorce III nebo ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce IV, tak Y je (3P)-cholest-5-en-3-yl vzorce VI.
Dále je předmětem vynálezu, že lipopolyaminy sperminového typu obecného vzorce I mají výhodně X tvořeno vazbou mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domény Y a atomem dusíku polyaminové části nebo spojkou výše zmíněného obecného vzorce II, kde ni = 3, a Y = acyl výše zmíněného obecného vzorce V, kde n5 = 13.
Význakem je také skutečnost, že látky obecného vzorce I mají X s výhodou tvořeno spojkou výše zmíněného obecného vzorce III, kde n2 = 1 či 3, nebo spojkou výše zmíněného obecného vzorce IV, kde Π3 = 1 či 3, n4 = 3 a Y je cholesterol výše zmíněného obecného vzorce VI.
Předmětem vynálezu je rovněž způsob přípravy lipopolyaminů sperminového typu obecného vzorce I. Taje založena na kondenzaci komerčně dostupného ÝXX-tri-C/ercHO'
Vlil
kde Π] = 1-13 a n5 = 5-30, nebo kyselin obecného vzorce IX
HO' kde n2 = 1-9, nebo kyselin obecného vzorce X
-4CZ 303963 B6
O
O
HO
kde n3 = 1-9 a n4 = 1-13;
přičemž kyseliny výše zmíněného obecného vzorce VII, VIII, IX nebo X se reakcí s bis(pentafluorfenyl)karbonátem v přítomnosti organické báze v polárním aprotickém rozpouštědle (s výhodou v přítomnosti 4-methylmorfoIinu v W-dimethylformamidu) převedou na své pentafluorfenylestery. Reakcí takto získaných pentafluorfenylesterů jmenovaných kyselin s V2W-tri-(fórcbutoxykarbonyljsperminem v přítomnosti organické báze v organickém aprotickém rozpouštědle (s výhodou v přítomnosti ethyldiisopropylaminu v /VjV-dimethylformarnidu) se připraví chráněné polykationické lipidy obecného vzorce XI, jmenovaných kyselin s ÝVÝ-tri-ýfórc-butoxykarbonyljsperminem v přítomnosti organické báze v organickém aprotickém rozpouštědle (s výhodou v přítomnosti ethyldiisopropylaminu v /V,^-dimethylformamidu) se připraví chráněné polykationické lipidy obecného vzorce XI,
Boc
Boc—NH
N „ 1 Boc
NH—X—Y
kde X je vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobni domény Y a atomem dusíku polyaminové části nebo aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka výše zmíněného vzorce II, nebo ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka výše zmíněného vzorce III, nebo ωhydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka výše zmíněného vzorce IV a Y je v poloze C(2) symetricky větvený acyl výše zmíněného vzorce V, nebo (33)-cholest—5— en-3-yl výše zmíněného vzorce VI, přičemž když X je vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobni domény Y a atomem dusíku polyaminové části nebo aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka výše zmíněného vzorce II, tak Y je v poloze C(2) symetricky větvený acyl výše zmíněného vzorce V, a když X je ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka výše zmíněného vzorce III nebo ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka výše zmíněného vzorce IV, tak Y je (3P)-cholest-5-en-3-yl výše zmíněného vzorce VI.
Hydrolytickým odštěpením /erc-butoxykarbylových chránících skupin (tzv. debocylací) látek výše zmíněného vzorce XI (s výhodou za použití kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu) se připraví lipopolyaminy výše zmíněného obecného vzorce I.
Kyseliny obecného vzorce VIII se připraví reakcí pentafluorfenylesterů kyselin výše zmíněného vzorce VII s aminopolyethylenglykolkarboxylovými kyselinami vzorce H2N-(CH2)2-[O-5CZ 303963 B6 (CH2)2]n-O-(CH2)2-COOH, n = 1-13, v přítomnosti organické báze v organickém aprotickém rozpouštědle (s výhodou v přítomnosti ethyldiisopropylaminu v A.-V-dimethylformamidu).
Kyseliny výše zmíněného vzorce IX se připraví: (a) bazicky katalyzovanou alkylací komerčně dostupného cholesterolu Zerc-butylesterem kyselin ω-bromalkanových o počtu atomů uhlíku C2 - Cio v aprotickém rozpouštědle a následnou kysele katalyzovaným odštěpením Zerc-butoxykarbonylové chránící skupiny (s výhodou kyselinou mravenčí v diethyletheru) získaného tercbutylesteru obecného vzorce XII
Ar (CH3)3C-O ' 'n2
kde n2 = 1-9;
(b) reakcí komerčně dostupného O-tosyl derivátu cholesterolu [(3P)-cholest-5-en-3-yloxy-4methylbenzensulfonátu] s ω-hydroxyalkannitrily s počtem atomů uhlíku C2 - Ci0 v nepolárním aprotickém rozpouštědle za zvýšené teploty (s výhodou v toluenu za varu) a následnou bazickou hydrolýzou (s výhodou ve směsi toluenu a vodného roztoku NaOH za zvýšené teploty) intermediálních O-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]-í0-hydroxyalkannitrilů.
Kyseliny výše zmíněného vzorce X se připraví reakcí pentafluorfenylesterů kyselin výše zmíněného vzorce IX s kyselinami aminopolyethylenglykolkarboxylovými vzorce H2N-(CH2)2-O[(CH2)2-O]n-(CH2)-COOH, n = 1-13, v přítomnosti organické báze v organickém aprotickém rozpouštědle (s výhodou v přítomnosti ethyldiisopropylaminu v ΛζΑ-dimethylformamidu).
Předmětem vynálezu je dále použití lipopolyaminů sperminového typu obecného vzorce I pro konstrukci polykationických liposomů, tedy samoskladných systémů, jako nosičů nukleotidových a oligonukleotidových terapeutik a terapeutických genových konstruktů.
Schopnost polykationických liposomů konstruovaných na bázi polykationických lipidů obecného vzorce 1 efektivně transportovat přes buněčnou membránu nukleotidová a oligonukleotidová terapeutika a terapeutické genové konstrukty byla ověřena v následujících in vitro testech.
(a) Zvýšením antivirálního účinku nukleotidového antivirotika Cidofovir na infekci buněk MDBK bovinním herpesvirem BHV—1.
(b) Transportem fluorescenčně značených modelových oligonukleotidů do buněk MCF-7.
(c) Efektivitou transfekce buněk MCF-7 plasmidem kódujícím enzym luciferázu.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1: Snímek liposomů s 20% obsahem kationického lipidu 1 z transmisního elektronového mikroskopu.
Obr. 2 A,B: Distribuce velikosti liposomů (A) a distribuce zeta-potenciálu liposomů (B) s 0, 10, 20, 30% obsahem lipidu 1.
Obr. 3: Závislost enkapsulační účinnosti liposomů pro Cidofovir na procentuálním zastoupení kationického lipidu 1 v liposomech.
-6CZ 303963 B6
Obr. 4 A,B,C: Toxicita kationických lipidů 1, 2, 3, 4 vůči buněčným liniím MDBK-1 (A), B16F10(B), MCF-7 (C).
Obr. 5: Cytotoxické křivky pro kationické liposomy, kationické liposomy s enkapsulovaným Cidofovirem a pro samotný Cidofovir.
Obr. 6: Antivirální efekt prázdných kationických liposomů, volného Cidofoviru, enkapsulovaného Cidofoviru v liposomech s 20 a 30% obsahem lipidu (sloupcové grafy pro jednotlivé titry viru (10’3, 105, 10'7, 10“9).).
Obr. 7: Nenormalizovaná transfekční účinnost různých preparátů kationických liposomů. Transfekční účinnost pro nukleotidy vykazovaly liposomy připravené z kationických lipidů 4 a 2. (Hodnoty v grafu jsou vyjádřeny jako průměr triplikátu ± SD. Množství oligonukleotidu na jamku bylo 500 ng.). EPC = vaječný fosfatidyl cholin
Obr. 8: Transfekční účinnost kationických liposomů na plasmid kódující luciferázu. EPC = vaječný fosfatidyl cholin, Trojene = liposomální transfekční kit.
Příklady provedení vynálezu
Seznam použitých zkratek
TLC
HR-MS
NMR
PBS
MEM
Buňky MDBK MTT test QRT-PCR
Buňky MCF7 chromatografie na tenké vrstvě hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením nukleární magnetická resonance fosfátem pufrovaný fyziologický roztok minimální esenciální médium linie buněk z bovinních ledvin (Madin-Darby Bovine Kidney Cells) test životnosti buněk založený na redukci substrátu MTT na formazan polymerázová řetězová reakce v reálném čase (Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction) estrogen responzivní linie buněk lidského adenokarcinomu prsu
Příklad 1
K 2-tetradecylhexadekanové kyselině VII (kde ni = 13; 51,5 mg, 0,11 mmol) v suchém N,Ndimethylformamidu (4 ml) se přidá bis(pentafluorfenyi)karbonát (49 mg, 0,12 mmol) a 4methylmorfolin (0,1 ml; 1 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 1 hod. Průběh reakce se monitoruje pomocí chromatografie na tenké vrstvě silikagelu (TLC) ve směsi toluen - ethylacetát (10:1). Směs se dvakrát lyofilizuje z dioxanu (2 x 20 ml). Získaný pentafluorfenylester kyseliny VI (kde n5 = 13; 67 mg, 0,1 mmol) se ihned použije ke kondenzaci s parciálně chráněným sperminem.
Směs pentafluorfenylesteru kyseliny Vil (kde n5 = 13) a VŮV’/V*-tr i—(/erc-butoxy karbony I)sperminu (49 mg, 0,079 mmol) se suší za sníženého tlaku při teplotě místnosti 1 hod. Aparatura se propláchne argonem a pod argonem se přidá suchý V,V-dimethylformamid (4 ml) a ethyldiizopropylamin (1 ml) a směs se míchá za laboratorní teploty 12 hod. Chromatografíí reakční směsi na sloupci silikagelu (100 ml) v systému toluen-ethylacetát (gradient 0-40% ethylacetát,
-7CZ 303963 B6 ml/min, 160 min) a následnou lyofilizaci odparku z dioxanu homogenní frakce se získá 75 mg (82% výtěžek) V1-(2-tetradecylhexadekanoyl)-A4V9Vl2-tris-/erc-butoxykarbonyl-4,9-diaza1,12-diaminododekanu XI (X = C-N vazba; Y = hydrofobní doména obecného vzorce V, kde n5 = 13). Pro C55HiogN407-Na HR-MS vypočteno m/z\ 937,8291 nalezeno m/z\ 937,8297; 'H NMR (400 MHz, CDCb) δ ppm: 3,00 - 3,37 m, 12 H (CH2N-); 1,90 - 2,11 m, 1 H (CHCOO); 1,56 1,73 m, 8 H (CH CH?N-); 1,36 - 1,55 m, 27 H (/erc-butyl); 1,17 - 1,34 m, 52 H; 0,80 - 0,94 m, 6 H (2-tetradecylhexadekanoyl).
Příklad 2
K roztoku látky XI (kde X = C-N vazba; Y = hydrofobní doména obecného vzorce V, kde n5 = 13; 253 mg, 0,26 mmol) v dichlormethanu (5 ml) se přidá kyselina trifluoroctová (1 ml, 13 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 4 hod. Potom se rozpouštědlo oddestiluje za sníženého tlaku a destilační zbytek lyofilizuje z dioxanu (20 ml). Získá se 171 mg (100%) trifluoracetátu /V1-(2-tetradecylhexadekanoyl)—4,9-diaza-l,12-diaminododekanu I (X = C-N vazba; Y = hydrofobní doména obecného vzorce V, kde n5 = 13). Pro C4oH84N40-H HR-MS, vypočteno m/z'. 637,67179 nalezeno m/z·. 637,67117; 'H NMR (400 MHz, Aceton-č/6) δ ppm: 3,98 t, >6,25 Hz, 2 H (CH2-2); 3,36 t, >6,13 Hz, 2 H (CH2-6); 3,27 - 3,32 m, 2 H (CH2-9);
3,13-3,21 m, 6 H (CH2-11, CH2-4); 3,101, >6,63 Hz, 2 H (CH2-13); 2,31 -2,38 m, 1 H (CH2'); 1,93 - 2,03 m, 6 H (CH2-3, CH2-7, CH2-8); 1,53 - 1,62 m, 2 H (CH2-12); 1,35 - 1,43 m, 4 H (CH2-3', CH2-1); 1,28 s, 36 H (CH24'-16', CH21-13”); 0,88 t, >7,00 Hz, 6 H (CH2-17', CH2-14).
Příklad 3
Ke kyselině ,V-(2-tetradecylhexadekanoyl)-15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanové VIII (kde ni = 5 a n5 = 13; 206 mg, 0,29 mmol) v suchém AUV-dimethylformamidu (10 ml) se přidá bis(pentafluorfenyl)karbonát (128 mg, 0,32 mmol) a 4-methylmorfoiin (0,25 ml, 2,45 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 1 hod. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC v ethylacetátu. Směs se dvakrát lyofilizuje z dioxanu (2 x 50 ml). Získaný pentafluorfenylester kyseliny VIII (kde n, = 5 a n5 = 13; 251 mg) se ihned použije ke kondenzaci s parciálně chráněným sperminem.
Směs pentafluorfenylesteru kyseliny VIII (kde n) = 5 a n5 = 13; 181 mg, 0,21 mmol) a/vW/V4tri-(/erc-butoxykarbonyl)sperminu (105 mg, 0,2 mmol) se suší za sníženého tlaku 1 hod. Aparatura se propláchne argonem a pod argonem se přidá suchý VV-dimethylformamidu (8 ml) a ethyldiizopropylamin (0,5 ml) a směs se míchá za laboratorní teploty 12 hod. Chromatografií směsi na sloupci silikagelu (150 ml) v systému toluen-ethylacetát (gradient 0-80% ethylacetát, 10 ml/min, 160 min) a následnou lyofilizaci odparku z dioxanu homogenní frakce se získá se 124 mg (50% výtěžek) V'-[V-(2-tetradecylhexadekanoyl)-15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanoyl]-VW),Vi2-tris-(/erc-butoxykarbonyl)—I,9-diaza-l,12-diami-nododekanu XI (X = aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce II, přičemž n, = 3 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce V kde n5 = 13). Pro C66H|29N5Oi2-H HR-MS, vypočteno m/z\ 1184,9711 nalezeno m/z·. 1184,9716; 'H NMR (400 MHz, CDCb) δ ppm: 5,34 - 5,38 m, 1 H (CH2-6); 3,75 t, >6,06 Hz, 2 H (CH2-14); 3,60 - 3,68 m, 12 H; 3,52 - 3,57 m, 2 H; 3,43 - 3,50 m, 2 H (8 x CH2O); 3,04 - 3,31 m, 12 H (6 x CH2N); 2,48 t, >5,87 Hz, 2 H (CH2-1); 2,00 td, >9,25, 9,25, 5,18, 4,74 Hz, 1 H (CH-2); 1,76 s, 4 H (CH2-7, CH2-8); 1,52 - 1,72 m, 4 H (CH2-3, CH2-12); 1,41 - 1,51 m, 27 H (/erc-butyl); 1,18 - 1,34 m, 48 H (CH2-4'-15', CH2-113); 0,88 t, >6,90 Hz, 6 H (CH2-16', CH2-14).
- 8 CZ 303963 B6
Příklad 4
K roztoku /V'-[íV-(2-tetradecylhexadekanoyl)-l 5-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanoyl]VW^V^-tri-ffórc-butoxykarbonylj^^-diaza-fL-diaminododekanu XI (X = aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce II, přičemž n, = 3 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce V, kde ns = 13; 83 mg, 0,07 mmol) v dichlormethanu (5 ml) se přidá kyselina trifluoroctová (2 ml, 26 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 4 hod. Potom se rozpouštědlo oddestiluje za sníženého tlaku a destilační zbytek lyofilizuje z dioxanu (20 ml). Získá se 61 mg (100% výtěžek) Arl-[A-(2-Tetradecylhexadekanoyl)-15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanoyl]-4,9-diaza-l,12-diaminododekanu I (X = aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce II, přičemž ni = 3 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce V kde n5 = 13). Pro C5iHio5N506-H HR-MS, vypočteno m/z\ 884,8138 nalezeno m/z·. 884,8128; 'H NMR (400 MHz, MeOH-74) δ ppm: 5,34 - 5,38 m, 1 H (CH2-6); 3,75 t, 7=5,94 Hz, 2 H (CH2-3ř); 3,63 d, 7=5,56 Hz, 10 H; 3,53 t, 7=5,60 Hz, 2 H (7 x CH2-O); 3,33 - 3,39 m, 4 H (CH2-2); 2,99 - 3,19 m, 10 H (6 x CH2N); 2,49 t, 7=6,00 Hz, 2 H (CH2-2'); 2,18 tt, 7=9,62, 4,85 Hz, 1 H (CH2-2); 2,09 dt, 7=15,16, 7,71 Hz, 2 H (CH2-3); 1,88 dt 7=13,50, 6,30 Hz, 2 H; 1,79 1,84 m, 4 H (CH2-7, CH2-8, CH2-12); 1,49 - 1.60 m, 4 H (CH2-3, CH2-1); 1,29 s. 52 H (CH2-4-15”, CH2-2'-13'); 0,87 - 0,93 m, 6 H (CH2-16, CH2-14').
Příklad 5
Směs pentafluorfenylesteru 2-tetradecylhexadekanové kyseliny VII (kde n5 = 13; 164 mg, 0,26 mmol) a 15-amino-4,7,10,13-tetraoxa_pentadekanové kyseliny (190 mg; 0,70 mmol) se suší za sníženého tlaku 1 hod. Aparatura se propláchne argonem a pod argonem se přidá suchý Λζ/V-dimethylformamid (8 ml) a ethyldiizopropylamin (1,5 ml) a směs se míchá za laboratorní teploty 12 hod. Chromatografií reakční směsi na sloupci silikagelu (150 ml) v systému toluenethylacetát (gradient 0-80% ethylacetát, 10 ml/min, 160 min) se získá 174 mg (94% výtěžek) kyseliny ;V-(2-tetradecylhexadekanoyl)-15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanové VIII (kde ni = 3 a n5 = 13). Pro C4iH8iNO7-Na HR-MS, vypočteno m/z·. 722,5905 nalezeno m/z·. 722.5906; 'H NMR (400 MHz, CDC13) δ ppm: 3,73 br.s., 16 H; 3,48 d, 7=4,93 Hz, 2 H (8 x CH2O); 2,53 t, 7=5,49 Hz, 2 H (CH2-1); 2,13 br.s., 1 H (CH-2'); 1,48 - 1,64 m, 2 H; 1,35 - 1,44 m, 2 H (CH23', CH2-1); 1,25 d, 7=5,94 Hz, 42 H (CH2-4'-15', CH2-1-13); 0,81 -0,95 m, 6 H (CH2-16', CH2-14).
Příklad 6
Ke kyselině č)-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]glykolové IX (kde n2 = 1; 134 mg; 0,3 mmol) v suchém VV-dimethylformamidu (4 ml) se přidá bis(pentafluorfenyl)karbonát (130 mg, 0,33 mmol) a 4methylmorfolin (0,1 ml, 1 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 1 hod. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC v toluenu. Směs se dvakrát lyofilizuje z dioxanu (2 x 20 ml) a získaný pentafluorfenylester kyseliny O-[(3p)-cholest-5-en-3-yl]glykolové IX (kde n2 = 1; n2 = 1; 140 mg) se ihned použije ke kondenzaci s parciálně chráněným sperminem.
Směs pentafluorfenylesteru kyseliny O-[(3p)-cholest-5-en-3-yl]glykolové IX (kde n2 = 1; 140 mg, 0,23 mmol) a V^M-tri^terc-butoxykarbonyljsperminu (112 mg, 0,23 mmol) se suší za sníženého tlaku a při teplotě místnosti 1 hod. Aparatura se propláchne argonem a pod argonem se přidá suchý V.V-dimethylformamid (4 ml) a ethyldiizopropylamin (1 ml) a směs se míchá za laboratorní teploty 12 hod. Chromatografií reakční směsi na sloupci silikagelu (100 ml) v systému toluen-ethylacetát (gradient 0-40% ethylacetát, 10 ml/min, 160 min) se získá 178 mg (86% výtěžek) Vl-{<7-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]glykoyl}-/V47V9Vl2-tris-{Zer£?-butoxykarbony 1)-4,9diaza-l,12-diaminododekanu XI (X = ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka obecného vzorce
-9CZ 303963 B6
III, přičemž n2 = 1 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce VI). Pro C54Hg6N4O8-H HR-MS, vypočteno m/z: 929,7301 nalezeno m/z: 929,7304; 'Η NMR (400 MHz, CDCI3) δ ppm: 5,30 5,38 m, 1 Η (H-6); 3,98 s, 2 H (CH2-2'); 3,02 - 3,35 m, 12 H (6 x CH2N); 2,18 - 2,46 m, 2 H (CH2-4); 1,37 - 1,51 m, 27 H (ZerZ-butyl); 1,01 s, 3 H (CH3-19); 0,92 d, 7=6,57 Hz, 3 H (CH3-21); 0,88 d, 7=1,77 Hz, 3 H (CH3-26); 0,86 d, 7=1,89 Hz, 3 H (CH3-27); 0,80 - 2,06 m, 22 H (cholesteryl); 0,68 s, 3 H (CH3-18).
Příklad 7
K roztoku yVl-{(7-[(3P)-cholest_5-en-3-yl]glykoyl}-.<V,iVJvl2-tris-(Z<?rc-butoxykarbonyl)- 4,9diaza-l,12-diaminododekanu XI (kde X = ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka obecného vzorce III, přičemž n2 = 1 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce VI; 148 mg, 0,16 mmol) v dichlormethanu (5 ml) se přidá kyselina trifluoroctová (1 ml, 13 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 4 hod. Potom se rozpouštědlo oddestiluje za sníženého tlaku a destilační zbytek lyofilizuje z dioxanu (20 ml). Získá se 100 mg (100% výtěžek) Ý-{č>-[(3P)-cholest-5-en3-yl]glykoyl}-4,9-diaza-l,12-diaminododekanu I (kde X = ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka obecného vzorce III, přičemž n2 = 1 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce VI). Pro C39H72N4O2-H HR-MS, vypočteno m/z: 629,5728 nalezeno m/z: 629,5715; 'HNMR (400 MHz, MeOH-74) δ ppm: 5,36 - 5,40 m, 1 Η (H-6); 4,01 s, 2 H (CH2-2'); 3,37 t, 7=6,51 Hz, 2 H; 3,24 tt, 7=11,20, 4,60 Hz, 2 H; 2,96 - 3,17 m, 8 H (6 x CH2N); 2,35 - 2,44 m, 1 H (CH2-4a); 2,21 2,32 m, 1 H(CH2-4b); 1,72-2,14 m, 13 H(CH-1, H-12, H-2, H-7, H-16, CH2-7, CH27); 1,04 s, 3 H (CH3-19); 0,95 d, 7=6,57 Hz, 3 H (CH3-19); 0,89 d, 7=1,52 Hz, 3 H (CH3-19) 0,87 d, 7=1,39 Hz, 3 H (CH3-19); 0,83 - 1,68 m, 16 H (cholesteryl, CH2-3, CH2-9); 0,72 s, 3 H (CH3-19).
Příklad 8
Ke kyselině č?-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanové IX (kde n2 = 3; 283 mg, 0,6 mmol) v suchém A/A-dimethylformamidu (4 ml) se přidá bis(pentafluorfenyl)karbonát (260 mg, 0,66 mmol) a 4-methylmorfolin (0,1 ml, 1 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 1 hod. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC ve směsi toluen - ethylacetát (10:1). Směs se dvakrát lyofilizuje z dioxanu (2 x 20 ml) získaný pentafluorfenylester kyseliny O-[(3P)-cholest5-en-3-yl]-4-hydroxybutanové IX (kde n2 = 3; 382 mg) se ihned použije ke kondenzaci s parciálně chráněným sperminem.
Směs pentafluorofenylesteru kyseliny O-[(3p)-cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanové IX (kde n2 = 3; 216 mg, 0,34 mmol) a V2V3ZV4-tri-(Zerc-butoxykarbonyl)sperminu (170 mg, 0,34 mmol) se suší za sníženého tlaku a při teplotě místnosti 1 hod. Aparatura se propláchne argonem, pod argonem se přidá suchý N,N-dimethylformamid (4 ml) a ethyldiizopropylamin (1 ml) a směs se míchá za laboratorní teploty 12 hod. Chromatografií reakční směsi na sloupci silikagelu (100 ml) v systému toluen-ethylacetát (gradient 0-40% ethylacetát, 10 ml/min, 160 min) se získá 302 mg (93% výtěžek) Vl-{č?-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanoyl}-A4A/92V’2-tris-(Zercbutoxykarbonyl)-4,9-diaza-l,12-diaminododekanu XI (kde X = ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka obecného vzorce III, přičemž n2 = 3 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce VI). Pro C56H,ooN408-H HR-MS, vypočteno m/z: 957,7614 nalezeno m/z: 957,7621; 'H NMR (400 MHz, CDC13) δ ppm: 5,32 - 5,35 m, 1 H (H-6); 3,50 t, 7=6,32 Hz, 2 H (CH2^P); 3,03 - 3,34 m, 12 H (6 x CH2N); 2,31 - 2,39 m, 1 H (H-4a); 2,29 t, 7= 7,39 Hz, 2 H (CH2-2'); 2,12 - 2,23 m, 1 H (H-4b); 1,77 - 2,06 m, 7 H (CH-1, H-12, H-2, H-7, H-16, CH2-3'); 1,60 - 1,75 m, 8 H (CH2-3, CH2-7, CH2-8, CH2-12); 1,43 - 1,47 m, 27 H (Zerc-butyl); 1,00 s, 3 H (CH3-19); 0,92 d, 7=6,57 Hz, 3 H (CH3-21); 0,88 d, 7=1,77 Hz, 2 H (CH3-26); 0,86 d, 7=1,77 Hz, 2 H (CH327); 0,81 - 1,58 m, 17 H (cholesteryl); 0,68 s, 2 H (CH3-18).
Příklad 9
K roztoku j'V1-{0-[(33)-cholest-5-en-3-yl]>-hydroxybutanoyl}-/V4V9jVl2-tris-(/É’rc-butoxykarbonyl)-4,9-diaza-l,12-diaminododekanu XI (kde X = ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka obecného vzorce III, přičemž n2 = 3 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce VI; 259 mg, 0,27 mmol) v dichlormethanu (5 ml) se přidá kyselina trifluoroctová (1 ml; 13 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 4 hod. Potom se rozpouštědlo oddestiluje za sníženého tlaku a destilační zbytek se lyofilizuje zdioxanu (20 ml). Získá se 175 mg (98% výtěžek) ^-(0-((33)cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanoyl}-4,9-diaza-l,12-diaminododekanu I (kde X = ωhydroxyalkylkarboxamidová spojka obecného vzorce III, přičemž n2 = 3 a Y = hydrofobní doména vzorce VI). Pro C4|H76N4O2-Na HR-MS, vypočteno m/z\ 679,6017 nalezeno m/z·. 679,6042; 'H NMR (400 Mhz, MeOH-ίΛ) δ ppm: 5,35 - 5,39 m, 1 H (CH-6”); 3,52 t, 7=6,25 Hz, 2 H (CH2-4); 2,97 - 3,20 m, 12 H (16 x CH2-NH); 2,38 dd, 7=4,74, 1,83 Hz, 1 H (CH-4a); 2,32 t, 7=7,40 Hz, 2 H (CH2-2'); 1,96 - 2,22 m, 7 H (cholesteryl); 1,75 - 1,95 m, 14 H (CH2-3; CH2-7; CH2-8; CH2-7; CH2-12; CH2-3'; CH2-2); 1,04 s, 3 H (CH3-19); 0,96 d, 7=6,57 Hz, 3 H (CH3-21); 0,93 - 1,67 m, 29 H (cholesteryl); 0,91 d, 7=1,52 Hz, 3 H (CH3-26”); 0,89 d, 7=1,52 Hz, 3 H (CH3-27); 0,74 s, 3 H (CH3-18).
Příklad 10
Ke kyselině N-(0-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]glykoyl}-l 5-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanové obecného vzorce X (kde n3 = 1 a n4 = 3; 149 mg, 0,22 mmol) v suchém Ύ,Υ-dimethylformamidu (5 ml) se přidá bis(pentafluorfenyl)karbonát (100 mg, 0,39 mmol) a 4-methylmorfolin (0,25 ml, 2,45 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 1 hod. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC v ethylacetátu. Směs se dvakrát lyofilizuje z dioxanu (2 x 50 ml) a získaný pentafluorfenylester kyseliny V-(O-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]glykoyl}-15-amino4,7,10,13-tetraoxapentadekanové obecného vzorce (X, kde n3 = la n4 = 3; 184 mg) se ihned použije ke kondenzaci s parciálně chráněným sperminem.
Směs pentafluorofenylesteru kyseliny jV-(O-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]glykoyl}-15-amino4,7,10,13-tetraoxapentadekanové obecného vzorce X (kde n3 = 1 a n4 = 3; 184 mg, 0,21 mmol) a A^zVW7—tri-(fórc—butoxykarbonyl)sperminu (170 mg, 0,34 mmol) se suší za sníženého tlaku a při teplotě místností 1 hod. Aparatura se propláchne argonem a pod argonem se přidá suchý YA-dimethylformamid (8 ml) a ethyldiizopropylamin (0,5 ml) a směs se míchá za laboratorní teploty 12 hod. Chromatografií reakční směsi na sloupci silikagelu (100 ml) v systému toluenethylacetát (gradient 0-40% ethylacetát, 10 ml/min, 160 min) se získá 50 mg (19% výtěžek) N'(V-{O-[(33)-cholest-5-en-3-yl]glykoyl}-l 5-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanoyl)V4.VíVl2-tris—(Zerc-butoxykarbonyl)-4,9—diaza-1,12—diaminododekanu XI (kde X = ωhydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce IV, přičemž n3 = 1, n4 = 3 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce VI). Pro C65H|I7N5O|3-H HR-MS, vypočteno m/z\ 1176,87206 nalezeno zw/z: 1176,87174; 'H NMR (400 MHz, CDCI3) δ ppm: 5,36 m, 7=5,05 Hz, 1 H (CH2-5); 3,98 s, 2 H (CH2COO); 3,72 - 3,77 m, 2 H (CHt-3); 3,64 d, 7=4,04 Hz, 12 H (6 x CH2O); 3,58 t, 7=4,90 Hz, 3 H, (CH2O); 3,50 q, 7=5,50 Hz, 2 H (CH2-14'); 3,05 - 3,30 m, 13 H (6 x CH2N); 2,48 t, 7=5,94 Hz, 2 H (CH2-2'); 2,31 - 2,38 m, 1 H (CH=4”a); 2,18 - 2,28 m, 1 H (CH-4b); 1,76 - 2,06 m, 6 H (cholesteryl); 1,61 - 1,73 m, 4 H (CH2-3, CH27,CH2-8, CHr-12); 1,41 - 1,51 m, 27 H (terZ-butyl); 1,01 s, 3H (CH3-19”); 0,94- 1,41 m, 17 H (cholesteryl); 0,92 d, 7=6,57 Hz, 3 H (CH3-21); 0,87 d, 7=1,77 Hz, 3 H (CH3-26); 0,86 d, 7=1,77 Hz, 3 H (CH3-27); 0,68 s, 3 H (CH3-18).
- 11 CZ 303963 B6
Příklad 11
K roztoku íVl-(,V-{0-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]glykoyl}-l 5-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanoylj-ÝíVíV^-tris-Á/erc-butoxykarbonylLTV-diaza-l.l 2-diaminododekanu XI (kde X = ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce IV, přičemž n3 = 1, n4 = 3 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce VI; 51 mg, 0,04 mmol) v dichlormethanu (5 ml) se přidá kyselina trifluoroctová (1 ml, 13 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 4 hod. Potom se rozpouštědlo oddestiluje za sníženého tlaku a destilační zbytek lyofilizuje z dioxanu (5 ml). Získá se 32 mg (84% výtěžek) V-(V-{O-[(3P)-cholest-5-en3—y l]gly koy 1}—1 5-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanoyl)-4,9-diaza-l, 12-diaminododekanu I (kde X = ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce IV, přičemž n3 = 1, n4 = 3 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce VI). Pro CsoH^NíCf-H HR.-MS, vypočteno m/z: $16,1 nalezeno m/z: 876,71418; 'H NMR (400 MHz, CDC13) δ ppm: 5,32 br.s., 2 H (CH2-6); 3,73 - 3,86 m, 2 H; 3,54 - 3,72 m, 14 H; 3,48 - 3,54 m, 2H (8 x CH2-O, PEG); 3,26 - 3,47 m, 1 OH; 3,11 - 3,25 m, 2H; 2,87 - 3,09 m, 2 H (6 x CH2-N, spermin; CH2-N, PEG); 2,54 t, ./=8,20 Hz, 2 H (CH2-4); 2,24 - 2,47 m, 4 H (CH2-2', CH2-2 yloxy acetyl); 1,99 - 2,14 m, 8 H (cholesteryl); 1,76 - 1,99 m, 8 H (4 x CH2-spermin); 1,55 dt, 7=13,1, 6,28 Hz, 15 H (CH2-3, butanoyl); 0,84 - 1,43 m, 37H (cholesteryl); 1,018 s 3H (CH3-19); 0,93 d, 7=6,2 Hz, 3 H (CH3-21); 0,91 d, 7=1,50 Hz, 3 H (CH3-26); 0,87 d, 7=1,28 Hz, 3 H (CH327); 0,69 s, 3 H (CH3-18).
Příklad 12
Ke kyselině .V-{O-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanoyl}-l 5-amino-4,7,l 0,13tetraoxapentadekanové obecného vzorce X (kde n3 = 3 a n4 = 3; 117 mg, 0,17 mmol) v suchém V.yV-dimethylformamidu (5 ml) se přidá bis(pentafluorfenyl)karbonát (73 mg, 0,18 mmol) a 4methylmorfolin (0,1 ml, 1 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 1 hod. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC v ethylacetátu. Směs se dvakrát lyofilizuje z dioxanu (2 x 50 ml) a získaný pentafluorfenylester kyseliny V-{O-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanoyl}15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanové obecného vzorce X kde n3 = 3, n4 = 3; 184 mg) se ihned použije ke kondenzaci s parciálně chráněným sperminem.
Směs pentafluorofenylesteru kyseliny jV-{O-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]glykoyl}-l 5-amino4,7,10,13-tetraoxapentadekanové obecného vzorce X (kde n3 = 3 a n4 = 3; 80 mg, 0,09 mmol) a VÚV’/V-tri-(/erc-butoxykarbonyl)sperminu (60 mg, 0,11 mmol) se suší za sníženého tlaku a při teplotě místnosti 1 hod. Aparatura se propláchne argonem a pod argonem se přidá suchý N,Ndimethylformamid (4 ml) a ethyldiizopropylamin (1 ml) a směs se míchá za laboratorní teploty 12 hod. Chromatografií reakční směsi na sloupci silikagelu (100 ml) v systému toluen-ethylacetát (gradient 0-40% ethylacetát, 10 ml/min, 160 min) se získá 50 mg (23% výtěžek) Nl-(N{O-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanoyl}-l 5-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanoyl)-/VÁ\7vl2-trjs-(/fc’rč'-butoxykarbonyl)-4,9-diaza-l,l2-diaminododekanu XI (kde X = ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce IV, přičemž n3 = 3, n4 = 3 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce VI). Pro C67Hi2|N5O|3-H HRMS, vypočteno m/z: 1204,90337 nalezeno m/z: 1204,90298; ’H NMR (400 MHz, CDC13) δ ppm:
5,34 - 5,38 m, 1 H (CH2-6); 3,74 t, 7=6,10 Hz, 2 H (CH2-3); 3,58 - 3,66 m, 14 H (7 x CH2-O); 3,53 - 3,57 m, 2 H (CH2-14); 3,50 td, 7=6,20, 0,90 Hz, 1 H (CH2-4'); 3,44 q, 7=5,05 Hz, 1 H (CH-3); 3,04 - 3,30 m, 12 H (CH2-N); 2,48 t, 7=6,06 Hz, 1 H (CH2-2); 2,34 ddd, 7=13,20, 4,70, 2,10 Hz, 1 H (H-4a); 2,29 t, 7=7,39 Hz, 2 H (CH2-2'); 1,76 - 2,25 m, 13 H (cholesteryl); 1,60 - 1,75 m, 8 H (CH2-3, CH2-7, CH2-8, CH2-12); 1,41-1,47 m, 27 H (terc-butyl); 0,99 s, 3 H (CH3-19); 0,92 d, 7=6,57 Hz, 3 H (CH3-21); 0,87 d, 7=1,77 Hz, 3 H (CH3-26); 0,86 d, 7=1,77 Hz, 3 H (CH3-27); 0,84 - 1,57 m, 33 H (cholesteryl); 0,68 s, 3 H (CH3-18”).
- 12 CZ 303963 B6
Příklad 13
K roztoku yV'-(^V-{O-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanoyl}-l 5-amino-4,7,10,13— tetraoxapentadekanoyl)-/V4V9/Vl2-tris-(/erc-butoxykarbonyl)-4,9-diaza-l, 12-diaminododekanu XI (kde X = ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce IV, přičemž n3 = 3, n4 = 3 a Y = hydrofobní doména obecného vzorce VI; 83 mg, 0,07 mmol) v dichlormethanu (5 ml) se přidá kyselina trifluoroctová (2 ml, 26 mmol) a směs se míchá za laboratorní teploty 4 hod. Potom se rozpouštědlo oddestiluje za sníženého tlaku a destilační zbytek lyofilizuje zdioxanu (2 x 20 ml). Získá se 61 mg (98% výtěžek) Nl-(N-{O[(3p)-cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanoyl}-l 5-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanoyl)4,9-diaza-l,12-diaminododekanu obecného vzorce (I, kde X = ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykol karboxamidová spojka obecného vzorce IV, přičemž n3 = 3, n4 = 3 a Y = hydrofobní doména vzorce VI). Pro C52H97N5O7-H HR-MS, vypočteno m/z: 904,74608 nalezeno m/z: 904,74595; 'H NMR (400 MHz, CDC13) δ ppm: 5,36 br.s., 2 H (CH2-6); 3,73 - 3,85 m, 2 H; 3,54 - 3,72 m, 14 H; 3,46 - 3,54 m, 2H (8 x CH2-O, PEG); 3,58 t, 7=6,57 Hz (CH2-4, butanoyl); 3,26 - 3,46 m, 10 H; 3,10 - 3,24 m, 2 H; 2,87 - 3,09 m s, 2 H (6 x CH2-N, spermin; CH2-N, PEG); 2,54 t, .7=8,20 Hz, 2 H (CH2^1); 2,24 - 2,47 m, 4 H (CH2-2', CH2-3 butanoyl); 1,99 - 2,14 m, 8 H (cholesteryl); 1,76 - 1,99 m, 8 H (4 x CH2-spermin); 1,55 dt, 7=13,07, 6,22 Hz, 15 H (CH2-3, butanoyl); 0,84 - 1,43 m, 37 H (cholesteryl); 1,018 s 3H (CH3-19); 0,945 d, 7=6,6 Hz, 3 H (CH3-21); 0,90 d, 7=1,52 Hz, 3 H (CH3-26); 0,89 d, 7=1,26 Hz, 3 H (CH3-27); 0,71 s, 3 H(CH3-18).
Příklad 14
Ke směsi cholesterolu (387 mg; 1 mmol) a NaH (400 Mg, 10 mmol, 60% emulze v minerálním oleji promyté hexanem) se přidá tetrahydrofuran (30 ml) a směs se za míchání pod sušícím uzávěrem zahřívá kvaru 12 hod. Následně se přidá /erc-butylbromoacetát (585 mg; 3 mmol) a v zahřívání se pokračuje dalších 12 hod. Přebytečný hydrid se opatrně rozloží vodou (50 ml) a produkt se vezme do diethyletheru (2 x 50 ml). Spojené organické vrstvy se vysuší nad síranem hořečnatým. Síran hořečnatý se odfiltruje a filtrát se za sníženého tlaku odpaří. Chromatografií odparku na sloupci silikagelu (200 ml) v systému hexanová frakce/řerc-butylmethylether s gradientem od 0% do 30% /erc-butylmethyletheru (10 ml/min) se získá 131 mg (26,2% výtěžek) /erc-butyl [(3p)-cholest-5-en-3-yl]glykolátu XII (kde n2 = 1). Pro C33H56O3-Na HR-MS, vypočteno m/z: 523,41217 nalezeno m/z: 523,41201; 'H NMR (400 MHz, CDC13) δ ppm: 5,34 5,38 m, 1 H (H-6); 4,01 s, 2 Η (H-l'); 3,24 tt, 7=11,23, 4,56 Hz, 1 H (H-3); 2,37 - 2,43 m, 1 H (H-4a); 2,22-2,32 m, 1 H (H-4b); 1,76-2,07 m, 5 H (CH-1, H-l 2, H-2, H-7, H-l 6); 1,48 s, 9 H (/-butyl); 1,01 s, 3 H (CH3-19); 0,92 d, 7=6,60 Hz, 3 H (CH3-21); 0,88 d, 7=1,80 Hz, 3 H (CH3-26); 0,86 d, 7=1,80 Hz, 3 H (CH3-27); 0,83 - 1,63 m, 42 H (cholesterol + /-butyl); 0,68 s, 3 H(CH3-18).
Příklad 15
Térc-butyl [(3p)-cholest-5-en-3-yl]glykolát XII (kde n2 = 1; 111 mg, 0,22 mmol) se rozpustí v etheru (8 ml) a přidá se kyselina mravenčí (5 ml; 132 mmol) a směs se míchá při 64 °C 5 hod. Potom se rozpouštědlo oddestiluje za sníženého tlaku a destilační zbytek lyofilizuje z dioxanu (20 ml). Získá se 99 mg (100% výtěžek) kyseliny [(3p)-cholest-5-en-3-yl]glykolové IX (kde n2 = 1). Pro C29H48O3-Na HR-MS, vypočteno m/z: 467,3496 nalezeno m/z: 467,3496; ’H NMR (400 MHz, CDC13) δ ppm: 5,33 - 5,41 m, 1 H (H-6); 4,16 s, 2 H (H-4b); 1,76 - 2,07 m, 5 H (CH-1, H-12, H-2, H-7, H-16); 1,01 s, 3 H (CH3-19); 0,92 d, 7=6,57 Hz, 3 H (CH3-21); 0,88 d, 7=1,77 Hz, 3 H (CH3-26); 0,86 d, 7=1,64 Hz, 3 H (CH-,-27); 0,79 - 1,67 m, 33 H (cholesteryl); 0,68 s, 3 H(CH3-18).
- 13 CZ 303963 B6
Příklad 16
Ke kyselině [(3P)-choIest-5-en-3-yl]glykolové IX (kde n2 = 1; 160 mg; 0,36 mmol) v suchém Λ/yV-dimethylformamidu (5 ml) se přidá bis(pentafluorfenyl)karbonát (156 mg, 0,39 mmol) a 4methylmorfolin (0,25 ml, 2,45 mmol). Směs se míchá jednu hodinu za laboratorní teploty. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC v toluenu. Směs se dvakrát lyofilizuje v dioxanu (2 x 50 ml). Získá se 184 mg pentafluorfenylester kyseliny /erc-butyl [(3p)-cholest-5-en-3-yl]glykoIové IX kde n2 = 1), který se ihned použije ke kondenzaci s 15-amino-4,7,10,13-tetraoxa-pentadekanovou kyselinou.
K pentafluorofenyl kyselině /erc-butyl [(3P)-cholest-5-en-3-yl]glykolové IX (kde m = 1; 175 mg; 0,29 mmol) se přidá 15-amino-4,7,10,13-tetraoxa-pentadekanová kyselina (160 mg; 0,60 mmol) a směs se hodinu dosuší na vakuu. Pod argonem se přidá suchý N-dimethylformamid (6 ml) a N-ethyldiizopropylamin (2 ml). Reakce se míchá za laboratorní teploty do druhého dne a hned se chromatografuje na sloupci silikagelu (200 ml) v systému ethylacetát-methanol (gradiente 0-30% methanol, 10 ml/min, 160 min, methanol je okyselen kyselinou mravenčí (10:1). Získá se 167 mg kyseliny jV-{í)-[(3p)-cholest-5-en-3-yl]glykolové}-15-amino-4,7,10,13tetraoxapentadekanové obecného vzorce X (n3=l; n4=3; 84,3% výtěžek). Pro C40H69NO8-Na HR-MS, vypočteno m/z·. 714,4915 nalezeno m/z·. 714,4916; 'H NMR (400 MHz, CDC13) δ ppm:
5,34 - 5,38 m, 1 H (CH2-5'); 4,00 s, 2 H (CH2COO); 3,78 t, 7=6,06 Hz, 2 H (CH2-3); 3,59 - 3,68 m, 14 H (7 x CH2O); 3,52 q, 7=5,47 Hz, 2 H (CH2-14); 3,23 tt, 7=11,24, 4,36 Hz, 1 H (CH-3'); 2,61 t, 7=6,00 Hz, 2 H (CH2-2); 2,36 ddd, 7=13,20, 4,70 (CH-4'a); 2,19 - 2,29 m, 1 H (CH-4'b); 1,77 - 2,06 m, 5 H (cholesteryl); 1,00 s, 3 H (CH3-19'); 1,29 d, 7=3,66 Hz, 24 H (cholesteryl); 0,92 d, 7=6,57 Hz, 3 H (CH3-2T); 0,88 d, 7=1,89 Hz, 3 H (CH3-26'); 0,86 d, 7=1,77 Hz, 3 H (CH3-27ř); 0,68 s, 3 H (CH3-18').
Příklad 17
Komerčně dostupný cholesterol tosylát (2,8 g; 5,1 mmol) se rozpustí v toluenu (10 ml) a přidá se 4-hydroxybutannitril (0,61 g; 7,1 mmol). Reakční směs se pak 24 hodin míchá při 120 °C, odpaří se a rozpustí v izopropanolu (60 ml). K meziproduktu se přidá 12% vodný roztok NaOH (100 ml) a 4 dny se míchá při 100 °C. Přidá se 10% HC1 (100 ml) a extrahuje diethyletherem (4 x 30 ml). Produkt se přečistí na silikagelu (320 ml) v systému toluen ethylacetát (10 ml/min; gradient 040% ethylacetát). Získá se 345 mg (10% výtěžek) kyseliny <9-[(3p)-cholest-5-en-3-yl]-4hydroxybutanové IX (n2 = 3). Pro C3|H52O3 vypočteno: 78,86% C, 11,09% H; nalezeno: 78,80% C, 11,18% Η; 'H NMR (400 MHz, CDC13) δ ppm: 5,32 - 5,39 m, 1 H (H-6); 3,55 td, 7=5,90, 1,40 Hz, 2 H (CH2—T); 3,17 tt, 7=11,21, 4,39 Hz, 1 H (H-3); 2,49 t, 7=7,01 Hz, 2 H (CH2-3'); 2,36 ddd, 7=13,17, 4,71, 2,08 Hz, 1 H (H-4a); 2,14 - 2,24 m, 1 H (H-Mb); 1,93 - 2,05 m, 2 H (CH2-1, H-12); 1,90 t, 7=6,20 Hz, 2 H (CH2-2'); 1,78 - 1,88 m, 3 Η (H-2, H-7, H-l 6); 1,02 1,63 m, 22 H (chol. skelet); 1,01 s, 3 H (CH3-19); 0,92 d, 7=6,57 Hz, 3 H (CH3-21); 0,88 d, 7=1,77 Hz, 3 H (CH3-26); 0,86 d, 7=1,77 Hz, 3 H (CH3-27); 0,68 s, 3 H (CH3-18).
Příklad 18
Ke kyselině 0-[(3p)-cholest-5-en-3-yl]^4-hydroxybutanové IX (n2 = 3; 283 mg; 0,6 mmol) v suchém N,N-dimethylformamidu (4 ml) se přidá bis(pentafluorfenyl)karbonát (260 mg; 0,66 mmol) a 4-methylmorfolin (0,1 ml; 1 mmol). Směs se míchá jednu hodinu za laboratorní teploty. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC ve směsi toluen-ethylacetát (10:1). Směs se dvakrát lyofilizuje v dioxanu (2 x 20 ml). Získá se 382 mg pentafluorfenyl kyseliny Ο—[(3β)— cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanové IX (n2 = 3), který se ihned použije ke kondenzaci s 15amino-4,7,10,13-tetraoxa-pentadekanovou kyselinou.
- 14 CZ 303963 B6
K pentafluorfenyl kyselině č>-[(3P)-cholest-5-en-3-yl]-4-hydroxybutanové IX (n2 = 3; 121 mg; 0,19 mmol) se přidá 15-amino-4,7,10,13-tetraoxa-pentadekanová kyselina (104 mg; 0,39 mmol) a směs se hodinu dosuší na vakuu. Pod argonem se přidá suchý N-dimethylformamid (4ml) a N-ethyldiizopropylamin (1 ml). Reakce se míchá za laboratorní teploty do druhého dne a hned se chromatografuje na sloupci silikagelu (100 ml) v systému toluen-ethylacetát (gradient 0-40% ethylacetát, 10 ml/min, 160 min). Získá se 280 mg (88% výtěžek) kyseliny tV-{O-[(3P)cholest-5-en-3-yl]^J-hydroxybutanoyl}-l 5-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadekanové obecného vzorce (X; n3 = 3; n4 = 3). Pro C42H73NO8-H HR-MS, vypočteno m/z: 720,5409 nalezeno m/z: 720,5407; 'H NMR (400 MHz, Aceton) δ ppm: 3,71 t, 7=6,32 Hz, 2 H (CH2-3); 3,55 3,60 m, 14 H (7 x CH2-O); 3,51 t, 7=5,60 Hz, 2 H (CH2-14); 3,45 t, 7=6,32 Hz, 2 H (CH2-4');
3,34 q, 7=5,73 Hz, 1 H (CH-3); 2,53 t, 7=6,32 Hz, 2 H (CH2-2); 2,34 ddd, 7=13,20, 4,70, 2,10 Hz, 1 H (H-4a); 2,24 t, 7=7,45 Hz, 2 H (CH2-2'); 1,82 - 2,17 m, 5 H (cholesteryl); 1,76 1,82 m, 2 H (CH2-3'); 1,01 s, 3 H (CH3-19); 0,94 d, 7=6,57 Hz, 3 H (CH3-21); 0,87 d, 7=1,26 Hz, 3 H (CH3-26); 0,86 d, 7=1,52 Hz, 3 H (CH3-27); 0,81 - 1,66 m, 34 H (cholesteryl); 0,71 s,3 H(CH3-18).
Příklady provedení - biologické aktivity
Příklad 19
Enkapsulace anionických antivirotik do kationických liposomů a zvýšení antivirální aktivity in vitro
Metody: Liposomy byly připraveny standardními postupy např. hydratací lipidního filmu aextruzí liposomů přes póly karbonátové filtry Nucleopore s velikostí pórů 100 nm. Velikost a zeta-potenciál byly měřeny na přístroji Nanosizer ZS (Malvem).
Koncentrace enkapsulovaného nukleotidového antivirotika Cidofoviru ® [(S)-l-(3-hydroxy-2phosphonylmethoxypropyl)cytosinu] byla stanovena spektrofotometricky po separaci liposomů od volného Cidofovoru pomocí ultracentrifugace a lyži liposomů 20 mM kyselinou cholovou. UV absorbance byla měřena při 272 nm (extinkční koeficient ε = 9000, pH = 7,0).
Výsledky: Kationické lipidy 1-6 jsou schopny spolu s dalšími pomocnými lipidy (např. EPC = vaječný fosfatidyl cholin) tvořit stabilní lipidní dvojvrstvu a tudíž je lze použít na přípravu liposomů. Tento fakt je dokumentován na Obr. 1. Velikost liposomů koresponduje s velikostí pórů použitého filtru pro extruzi (ukázka pro lipid 1 je Obr. 2), Zeta potenciál liposomů závisí na poměru kationického lipidu k celkovému množství lipidu. V neutrálním pH roztoku PBS dosahuje pro 20 - 30% kationického lipidu ve směsi hodnot nad 30 mV. Ukázka vlivu obsahu kationického lipidu v liposomech na jejich ξ-potenciál je na Obr. 2.
Zvyšování ξ-potenciálu vede k výraznému zvýšení enkapsulační účinnosti pro anionická analoga nukleotidů díky silné elektrostatické interakci mezi pozitivně nabitou polyaminovou skupinou fosfolipidů v liposomální membráně a negativně nabitou fosfátovou nebo fosfonátovou skupinou v léčivu. Závislost enkapsulační účinnosti na zvyšujícím se obsahu kationického lipidu je na Obr. 3. Je dosaženo téměř trojnásobné enkapsulační účinnosti ve srovnání s neutrálními liposomy, kde dochází pouze k pasivní enkapsulaci s účinností kolem 20%.
- 15 CZ 303963 B6
Příklad 20
Cytotoxicita kationických liposomů
Metody: Pro analýzu cytotoxicity byl použit standardní MTT test cytotoxicity doplněný mikroskopickou analýzou. Buňky byly inkubovány s liposomy 24 h. Koncentrace celkového lipidu je udávána v mg/ml. Pro testování byly použity buněčné linie MDBK, B16F10, MCF-7 (Obr. 4).
Výsledky: Testované kationické lipidy nevykazují výraznou cytotoxicitu in vitro vůči buněčným liniím. Volné kationické lipidy ve formě micel vykazují cytotoxický účinek v rozmezí koncentrací 10-100 μΜ. Cytotoxický efekt liposomální formulace (20% kationického lipidu) se projevuje až za hranicí 10 mg/ml celkového liposomálního lipidu. Tyto koncentrace daleko převyšují koncentrace používané pro in vitro aplikace.
Liposomální formulace kationických lipidů výrazně snižují toxicitu volných kationických lipidů. Jako příklad jsou zde uváděny křivky in vitro cytotoxicity pro liposomální Lipid 1 na buněčných liniích MDBK (Obr. 4). Srovnány jsou cytotoxické křivky pro prázdné liposomy, liposomy s enkapsulovaným Cidofovirem a pro samotný Cidofovir. Toxicita není pozorována do koncentrace 100 mg/ml lipidu. Enkapsulace Cidofoviru nemá vliv na cytotoxicitu.
Příklad 21
Antivirální účinek in vitro na modelu BHV-1 virové infekce buněk MDBK
Metody: Testování antivirálního účinku bylo provedeno na in vitro modelu bovinního herpesviru 1 (BHV-1) na buněčné linii MDBK. Tento model skýtá několik výhod pro testování antivirálního účinku. BHV-1 virus není přenosný na člověka a je možné jej kultivovat na MDBK buněčné linii. Kvantifikace virové infekce je možné jednak hodnocením cytopatického efektu a velmi přesně je hodnotitelná pomocí QRT-PCR. Buňky byly inkubovány 6 h s testovanými preparáty, poté bylo médium vyměněno a buňky byly infikovány virem BHV-1 o různém titru (ΙΟ“3, 10“5, 10 7, 10“9). Produkce virové DNA byla kvantifikována standardním testem kvantitativní PCR (polymerázové řetězové reakce) v reálném čase (QRT-PCR).
Výsledky: Kationické liposomy představují vhodný nosičový systém pro hydrofilní antivirotika na bázi derivátů nukleotidů (např. Cidofovir). Liposomální formulace Cidofoviru zvyšuje antivirální účinek in vitro proti BHV-1 viru více než o dva řády ve srovnání s volnou látkou (Obr. 6). Po rychlém proniknutí liposomálního léčiva do buňky inhibuje Cidofovir syntézu virové DNA a dochází k produkci defektních virových částic, které nejsou schopny infikovat další buňky.
Množství virové DNA bylo kvantifikováno pomocí metody QRT-PCR.
Kationický lipid 1 je označen zkratkou LD1. Liposomy byly připraveny s přídavkem 20% kationických lipidů (zde je ukázka opět s lipidem 1) Buňky MDBK byly inkubovány 6 h s jednotlivými preparáty, potom bylo vyměněno medium a buňky byly infikovány virem BHV-1. Produkce virové DNA byla kvantifikována pomocí QRR-PCR po 24 h.
- 16CZ 303963 B6
Příklad 22
Zvýšení intemalizace oligonukleotidu s využitím kationických liposomů
Metody: Kationické liposomy byly připraveny z EPC (85%) a kationických lipidů 1-6 (15%). Tento poměr byl shledán jako optimální pro transfekcí nukleotidů. Transfekční účinnost byla testována na standardním in vitro modelu s buněčnou linií MCF-7. Buňky byly kultivovány v mikrotitračních deskách (48 jamek) se sérem po dobu 24 hodin. Koncentrační řada liposomů se naředí v médiu Opti-MEM (Life Technologies Corporation, Invitrogen ) a přidají se oligonukleotidy značené FAM (ss 32-mer) rovněž v Opti-MEM. Liposomy se smíchají s oligonukleotidy, mixují 20 min, centrifugují a nechají inkubovat 30 minut. Poté se přidá komplex liposomů a oligonukleotidy k buňkám po kapkách do média Opti-MEM, které bylo předem vyměněno za čerstvé. Buňky se inkubují dalších 24 hodin a pak se opláchnou lxPBS, přidá se CellScrub buffer, který odmyje komplexy liposom/oligonukleotid, zachycený na membránách. Následuje ještě jeden oplach PBS a poté se buňky lyžují lyzačním roztokem lxCell Culture Lysis Reagent (Promega). Lyžuje se na třepačce 30 minut při laboratorní teplotě. V lyzátu se stanoví proteiny modifikovanou metodou dle Lowryho. Kvantifikace oligonukleotidu se provede fluorometricky v 96 jamkových deskách. Hodnoty fluorescence se normalizují na celkový obsah proteinů (Obr. 7).
Výsledky: Liposomy připravené z kationických lipidů 1 až 6 vykazují schopnost doručit oligonukleotidy do cílových buněk (podobně jako nízkomolekulámí nukleotidové antivirotikum - Cidofovir). Neutrální liposomy připravené pouze z vaječného fosfatidylcholinu tuto aktivitu nevykazují.
Příklad 23
Transfekce plasmidu
Metody: Lipopolyaminy byly použity k přípravě transfekčních liposomů o složení kationický lipid:DOPE 1:1. (DOPE - dioleylfosfatidyletanolamin). Liposomy byly připraveny metodou hydratace lipidního filmu a extruzí přes polykarbonátové filtry. K transfekci byl použit plasmid kódující luciferázu. Transfekce byla provedena standardním testem na buňkách MCF7 (150 000 bb/j. v 500 μΐ OptiMEM). Test byl proveden v 24 jamkových destičkách při konfluenci buněk 90—95%. Transfekční účinnost se stanoví měřením luminiscence na destičkovém luminometru po 24 h kultivaci. Komplexy kationických liposomů s DNA byly připraveny v poměrech DNA (pg) : liposomy (pg) 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:30, 1:50, 1:70. Jako kontrola byl použit komerční liposomální transfekční kit Trojene® (Avanti Polar lipids, USA). U tohoto kitu bylo postupováno podle přiloženého manuálu.
Výsledky: Ukázka transfekční účinnosti je pro lipidy 2 a 4 s objemnou cholesterylovou hydrofobní skupinou. Tyto lipidy jsou pro transfekci pDNA nejvhodnější. Liposomy připravené z těchto kationických lipidů vykazovaly transfekční účinnost srovnatelnou s komerčním kitem Trojene, avšak tyto nové lipidy vykazují nižší toxicitu in vitro.
Přehled použité literatury
André F. M., Mir L. M.: Nucleic acids electrotransfer in vivo: mechanisms and practical aspects, Curr. Gene Ther. 2010,10, 267-280.
Behr J. P.: Gene-Transfer with Synthetic Cationic Amphiphiles - Prospects for Gene-Therapy, Bioconjugate Chemistry 1994, 5, 382-389.
- 17 CZ 303963 B6
Behr J. P., Demeneix B., Loeffler, J. P., Mutul J. P.: Efficient Gene-Transfer Into Mammalian Primary Endocrine-Cells with Lipopolyamine-Coated Dna, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1989, 86, 6982-6986.
Boussif O., Lezoualch F., Zanta M. A., Mergny M. D., Scherman D., Demeneix B., Behr J. P.: A Versatile Vector for Gene and Oligonucleotide Transfer Into Cells in Culture and In-Vivo Polyethylenimine, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1995, 92, 7297-7301.
Fujiwara T., Hasegawa S., Hirashima N., Nakanishi M., Ohwada T.: Gene transfection activities of amphiphilic steroid-polyamine conjugates, Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes 2000,1468, 396-402.
Gao X., Huang L.: A Novel Cationic Liposome Reagent for Efficient Transfection of Mamma1 ian—Cells, Biochemical and Biophysical Research Communications 1991,179, 280-285.
Haensler J., Szoka F. C.: Polyamidoamine Cascade Polymers Mediate Efficient Transfection of Cells in Culture, Bioconjugate Chemistry 1993, 4, 372-379.
Hajazi R., Amiji M.: Chitosan-based gastrointestinal delivery systems, Journal of Controlled Release 2003, 89, 151-165.
Holý A.: Phosphonomethoxyalkyl analogs of nucleotids, Current Pharmaceutical Design 2003, 9, 2567-2592.
Keller M., Jorgensen M. R., Perouzel E., Miller A. D.: Thermodynamic aspects and biological profile of CDAN/DOPE and DC-Chol/DOPE lipoplexes, Biochemistry 2003, 42, 6067-6077.
Kirby A. J., Camilleri P., Engberts J. B. F. N., Feiters M. C., Nolte R. J. M., Soderman O., Bergsma M., Bell P. C., Fielden M. L., Rodriguez C. L. G., Guedat P., Kremer A., McGregor C., Perrin C., Ronsin G., van Eijk M. C. P.: Gemini surfactants: New synthetic vectors for gene transfection, Angewandte Chemie-International Edition 2003, 42, 1448-1457.
Koping-Hoggard M., Tubulekas 1., Guan H., Edwards K., Nilsson M., Varům K. M., Artursson P.: Chitosan as a nonviral gene delivery systém. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo, Gene Therapy 2001, 8, 1108-1121.
Kusumoto S., Inage M., Shiba T., Azuma I., Yamamura Y.: Synthesis of Long—Chain Fatty—Acid Esters of Normal-Acetylmuramyl-L-Alanyl-D-Isoglutamine in Relation to Anti-Tumor Activity, Tetrahedron Letters 1978, 4899-4902.
Lemaitre M., Bayard B., Lebleu B.: Specific Antiviral Activity of A Poly(L-Lysine)-Conjugated Oligodeoxyribonucleotide Sequence Complementary to Vesicular Stomatitis-Virus N-Protein Messenger-Rna Initiation Site, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1987, 84, 648-652.
Miller A. D.: Human Gene-Therapy Comes of Age, Nátuře 1992, 357, 455-460.
Miller A. D.: Cationic liposomes for gene therapy, Angewandte Chemie-International Edition 1988,37, 1769-1785.
Miller A. D.: Gene therapy needs robust synthetic nonviral platform technologies, Chembiochem 2004, 5, 53-54.
- 18 CZ 303963 B6
Niculescu-Duvaz D., Heyes J., Springer C. J.: Structure-activity relationship in cationic lipid mediated gene transfection, Current Medicinal Chemistry 2003,10, 1233-1261.
Ohtani K.., Nakamura M., Saito S., Nagata K., Sugamura K., Hinuma Y.: Electroporation Application to Human Lymphoid-Cell Lines for Stable Introduction o A Transactivator Gene of Human T-Cell Leukemia-Virus Type-1, Nucleic Acids Research 1989,17, 1589-1604.
Petukhov I. A., Maslov M. A., Morozova N. G., Serebrennikova G. A.: Synthesis of polycationic lipids based on cholesterol and spermine, Russian Chemical Bulletin 2010, 59, 260—268.
Regelin A. E., Fankhaenel S., Gurtesch L., Prinz C., von Kiedrowski G., Massing U.: Biophysical and lipofection studies of DOTAP analogs, Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes 2000, 1464, 151-164.
Saha R., Killian S., Donofrio R. S.: DNA vaccines: a mini review, Recent Pat DNA Gene Seq. 2011, 5, 92-96.
Stewart L., Manvell M., Hillery E., Etheridge C. J., Cooper R. G., Stark H., van-Heel M., Preuss M., Alton E. W. F. W., Miller A. D.: Cationic lipids for gene therapy part 4 - Physicochemical analysis of cationic liposome-DNA complexes (lipoplexes) with respect to in vitro and in vivo gene delivery efficiency, Journal of the Chemical Society-Perkin Transactions 2 2001, 624-632.
Tsukamoto M., Ochiya T., Yoshida S., Sugimura T., Terada M.: Gene-Transfer and Expression in Progeny After Intravenous Dna Injection Into Pregnant Mice, Nátuře Genetics 1995, 9, 243248.
Zhang S. B., Zhao Y. A., Zhao B. D., Wang B.: Hybrids of Nonviral Vectors for Gene Delivery, Bioconjugate Chemistry 2010, 21, 1003-1009.
Zhi D. F., Zhang S. B. Wang B., Zhao Y. N., Yang B. L., Yu S. J.: Transfection Efficiency of Cationic Lipids with Different Hydrophobic Domains in Gene Delivery, Bioconjugate Chemistry 2010, 21, 563-577.
Zuhorn I. S., Oberle V., Visser W. H., Engberts J. B. F. N., Bakowsky U., Polushkin E., Hoekstra D.: Phase behavior of cationic amphiphiles and their mixtures with helper lipid influences lipoplex shape, DNA translation, and transfection efficiency, Biophysical Journal 2002, 83, 2096-2108.

Claims (8)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Lipopolyaminy sperminového typu obecného vzorce I
    NH—X—Y
    O).
    kde X je zvoleno ze skupiny, zahrnující
    - 19CZ 303963 B6 vazbu mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobni domény Y a atomem dusíku polyaminové části, aminopolyethylenglykolkarboxamidovou spojku obecného vzorce II kde ni = 1-13, vázanou na polyaminovou část i na hydrofobni doménu Y amidickou vazbou, ω-hydroxyalkylkarboxamidovou spojku obecného vzorce III (III), kde n2 = 1-9, vázanou na atom dusíku polyaminové části amidickou vazbou a prostřednictvím atomu kyslíku do polohy 2 cholesterylového skeletu, a ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidovou spojku obecného vzorce IV kde n3 = 1-9 a n4 = 1-13, vázanou na atom dusíku polyaminové části amidickou vazbou a prostřednictvím atomu kyslíku do polohy 2 cholesterylového skeletu, a hydrofobni doména Y je zvolena ze symetricky v poloze C(2) větveného acylu obecného vzorce V kde n5 = 5-30, nebo (3P)-cholest-5-en-3-ylu vzorce VI (VI) h3c ch3 přičemž když X je vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domény Y a atomem dusíku polyaminové části, nebo aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce II, tak Y je v poloze C(2) symetricky větvený acyl obecného vzorce V, a když X je ωhydroxyalkylkarboxamidová spojka obecného vzorce III nebo ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce IV, tak Y je (3P)-cholest-5-en-3-yl vzorce VI.
  2. 2. Lipopolyaminy sperminového typu obecného vzorce I podle nároku 1, kde X je vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobní domény Y a atomem dusíku polyaminové části, nebo spojka obecného vzorce II uvedeného v nároku 1, kde ni = 3 a hydrofobní doména Y je v poloze C(2) symetricky větvený acyl obecného vzorce V uvedeného v nároku 1, kde n5 = 13.
  3. 3. Lipopolyaminy sperminového typu obecného vzorce I podle nároku 1, kde X je spojka obecného vzorce III uvedeného v nároku 1, kde n2 = 1 či 3; nebo spojka obecného vzorce IV uvedeného v nároku 1, kde n3 = 1 či 3 a n4 = 3 a hydrofobní doména Y je (3P)-cholest-5-en-3-yl vzorce VI, uvedeného v nároku 1.
  4. 4. Způsob přípravy lipopolyaminů sperminového typu obecného vzorce 1 podle nároku 1, vyznačující se tím, že v prvním kroku se kyseliny, zvolené ze skupiny, zahrnující v poloze C(2) symetricky větvené mastné kyseliny obecného vzorce VII kde m = 5-30, kyseliny obecného vzorce Vlil
    HO‘
    Vlil kde ni = 1-13 a Π5 = 5-30, kyseliny obecného vzorce IX
    -21 CZ 303963 B6 kde n3 = 1-9 a n4 = 1-13, převedou reakcí s bis(pentafluorfenyl)karbonátem v přítomnosti organické báze v polárním aprotickém rozpouštědle na své pentafluorfenyl estery, tyto pentafluorfenyl estery se v druhém kroku převedou v přítomnosti organické báze reakcí s /V2JV\\'4-tri-(Zč'rc-butoxykarbonyl)spetminem v organickém aprotickém rozpouštědle na chráněné polykationické lipidy obecného vzorce XI kde X je vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobni domény Y a atomem dusíku polyaminové části, nebo aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce II, popsaného v nároku 1, nebo ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka obecného vzorce III, popsaného v nároku 1, nebo ω-hydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka obecného vzorce IV, popsaného v nároku 1, a hydrofobni doména Y je v poloze C(2) symetricky větvený acyl obecného vzorce V popsaného v nároku 1, nebo (3P)-cholest-5-en-3-yl vzorce VI popsaného v nároku 1, přičemž když X = vazba mezi atomem uhlíku koncové skupiny CO hydrofobni domény Y a atomem dusíku polyaminové části nebo aminopolyethylenglykolkarboxamidová spojka zmíněného vzorce II platí, že Y je v poloze C(2) symetricky větvený acyl obecného vzorce V popsaného v nároku 1, a pro X = ω-hydroxyalkylkarboxamidová spojka zmíněného vzorce III nebo ωhydroxyalkylkarboxamidopolyethylenglykolkarboxamidová spojka uvedeného vzorce IV platí, že hydrofobni doména Y je (3P)-cholest-5-en-3-yl zmíněného vzorce VI, ve třetím kroku se chráněné polykationické lipidy popsaného vzorce XI převedou na lipopolyaminy obecného vzorce I popsaného v nároku 1 odštěpením /erc-butoxykarbylových chránících skupin působením kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu.
  5. 5. Způsob přípravy podle nároku 4, vyznačující se tím, že kyseliny obecného vzorce VIII se připraví bazicky katalyzovanou reakcí pentafluorfenyl esterů kyselin obecného vzorce VII s aminopolyethylenglykolkarboxylovými kyselinami H2N-(CH2)2-C)-[(CH2)2-O]n-(CH2)COOH, kde η = 1 až 13, v organickém aprotickém rozpouštědle.
  6. 6. Způsob přípravy podle nároku 4, vyznačující se tím, že kyseliny obecného vzorce IX se připraví bazicky katalyzovanou alkylací cholesterolu pomocí /erc-butylesteru kyselin ω-bromalkanových s počtem atomů uhlíku C2 - C,o v aprotickém rozpouštědle a následným kysele katalyzovaným odštěpením /erc-butoxykarbylové chránící skupiny v předchozím kroku získaného Zerc-butylesteru obecného vzorce XII kde n2 = 1-9, nebo reakcí O-tosyl derivátu cholesterolu [(3P)-cholest-5-en-3-yloxy-4-methylbenzensulfonátu] s ω-hydroxyalkannitrily s počtem atomů uhlíku C2 - Cio v nepolárním aprotickém rozpouštědle za zvýšené teploty a následnou bazickou hydrolýzou intermediálního 0-[(3P)-cholest5-en-3-yl]-a>-hydroxyalkanoylnitrilu.
  7. 7. Způsob přípravy podle nároku 4, vyznačující se tím, že kyseliny X se připraví bazicky katalyzovanou reakcí pentafluorfenyl esterů kyselin obecného vzorce IX s aminopolyethylenglykolkarboxylovými kyselina {H2N-(CH2)2-O-[(CH2)2-O]n-(CH2)-COOH}, kde n = 1 až 13 v organickém aprotickém rozpouštědle.
  8. 8. Použití lipopolyaminů sperminového typu obecného vzorce I podle nároku 1 pro konstrukci polykationických samoskladných systémů jako nosičů nukleotidových a oligonukleotidových terapeutik a terapeutických genových konstruktů.
CZ20120020A 2012-01-13 2012-01-13 Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému CZ201220A3 (cs)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20120020A CZ201220A3 (cs) 2012-01-13 2012-01-13 Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému
EP13704708.0A EP2802556B1 (en) 2012-01-13 2013-01-14 Lipopolyamines of spermine type for construction of liposomal transfection systems
PCT/CZ2013/000004 WO2013104346A1 (en) 2012-01-13 2013-01-14 Lipopolyamines of spermine type for construction of liposomal transfection systems
US14/370,526 US9393200B2 (en) 2012-01-13 2013-01-14 Lipopolyamines of spermine type for construction of liposomal transfection systems

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20120020A CZ201220A3 (cs) 2012-01-13 2012-01-13 Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ303963B6 true CZ303963B6 (cs) 2013-07-17
CZ201220A3 CZ201220A3 (cs) 2013-07-17

Family

ID=47721890

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20120020A CZ201220A3 (cs) 2012-01-13 2012-01-13 Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9393200B2 (cs)
EP (1) EP2802556B1 (cs)
CZ (1) CZ201220A3 (cs)
WO (1) WO2013104346A1 (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018082723A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Vysoka Skola Chemicko-Technologicka V Praze Aminooxylipids for the construction of self-assembling liposomal systems enabling their subsequent modification by biologically functional molecules

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ201220A3 (cs) * 2012-01-13 2013-07-17 Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved CR, v.v.i. Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému
KR101709127B1 (ko) * 2015-06-16 2017-02-22 경동제약 주식회사 Dpp-iv 억제제의 제조를 위한 신규 중간체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 dpp-iv 억제제의 제조방법
WO2018112278A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Ligandal, Inc. Methods and compositions for nucleic acid and protein payload delivery

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996017823A1 (fr) * 1994-12-05 1996-06-13 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Lipopolyamines comme agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
WO1997018185A1 (fr) * 1995-11-14 1997-05-22 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Lipopolymamines comme agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
DE19607686A1 (de) * 1996-02-29 1997-09-04 Chemicon Lab Gmbh Neue metabolisierbare Lipopolyamine, deren Darstellung und Anwendung
WO1997045442A1 (en) * 1996-05-24 1997-12-04 Imperial College Of Science Technology And Medicine Polycationic sterol derivatives as transfection agents
CZ418599A3 (cs) * 1998-05-25 2000-02-16 Rhone-Poulenc Rorer S. A. Sloučeniny, způsob jejich přípravy a jejich použití pro přenos nukleových kyselin do buněk
US20020007073A1 (en) * 1996-08-02 2002-01-17 Max-Delbruck-Centrum Fur Molekulare Medizin Novel cationic amphiphiles for liposomal gene transfer

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2458473A (en) * 2008-03-17 2009-09-23 Imuthes Ltd 3'-O-allyl- and 3'-O-carboxymethyl- 2'-aminosaccharide derivatives, & amides thereof with peptides, as adjuvants
US20100260830A1 (en) * 2009-04-08 2010-10-14 Brian A Salvatore Liposomal Formulations of Tocopheryl Amides
CZ201220A3 (cs) * 2012-01-13 2013-07-17 Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved CR, v.v.i. Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996017823A1 (fr) * 1994-12-05 1996-06-13 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Lipopolyamines comme agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
WO1997018185A1 (fr) * 1995-11-14 1997-05-22 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Lipopolymamines comme agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques
DE19607686A1 (de) * 1996-02-29 1997-09-04 Chemicon Lab Gmbh Neue metabolisierbare Lipopolyamine, deren Darstellung und Anwendung
WO1997045442A1 (en) * 1996-05-24 1997-12-04 Imperial College Of Science Technology And Medicine Polycationic sterol derivatives as transfection agents
US20020007073A1 (en) * 1996-08-02 2002-01-17 Max-Delbruck-Centrum Fur Molekulare Medizin Novel cationic amphiphiles for liposomal gene transfer
CZ418599A3 (cs) * 1998-05-25 2000-02-16 Rhone-Poulenc Rorer S. A. Sloučeniny, způsob jejich přípravy a jejich použití pro přenos nukleových kyselin do buněk

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018082723A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Vysoka Skola Chemicko-Technologicka V Praze Aminooxylipids for the construction of self-assembling liposomal systems enabling their subsequent modification by biologically functional molecules
US11492327B2 (en) 2016-11-03 2022-11-08 Vysoka Skola Chemicko-Technologicka V Praze Aminooxylipids for the construction of self-assembling liposomal systems enabling their subsequent modification by biologically functional molecules

Also Published As

Publication number Publication date
US9393200B2 (en) 2016-07-19
WO2013104346A1 (en) 2013-07-18
EP2802556B1 (en) 2017-01-04
CZ201220A3 (cs) 2013-07-17
EP2802556A1 (en) 2014-11-19
US20150018436A1 (en) 2015-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Habrant et al. Design of ionizable lipids to overcome the limiting step of endosomal escape: application in the intracellular delivery of mRNA, DNA, and siRNA
US8759104B2 (en) Cationic lipids
US8678686B2 (en) Multi-chain lipophilic polyamines
JP5796113B2 (ja) トランスフェクションエンハンサー要素を含む脂質および脂質集合体
JP4176831B2 (ja) トランスフェクション剤としてのリポポリアミン及びその医薬的使用
WO1999058152A1 (en) Cationic lipids with disulphide bonds for the intracellular delivery of therapeutic substances
JP4467084B2 (ja) 核酸を細胞に導入するための化合物、その製法及びその使用
JP2022502451A (ja) 核酸送達のための脂質化カチオン性ペプチド化合物を含む脂質ナノ粒子製剤
US20100305198A1 (en) Cationic lipids
CZ303963B6 (cs) Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému
US6281371B1 (en) Lipopolyamines, and the preparation and use thereof
US6268516B1 (en) Cationic amphiphilic lipids for liposomal gene transfer
JP6605477B2 (ja) 核酸送達のためのカチオン性脂質
JP2005515990A (ja) 化合物
US20230127080A1 (en) Novel cationic lipid having cystine skeleton
JP5653348B2 (ja) ポリアミドアミンデンドロンを含む遺伝子導入剤組成物
Wu et al. Evaluation of pentaerythritol-based and trimethylolpropane-based cationic lipidic materials for gene delivery
US20030109699A1 (en) Amphiphilic quinolylpolyamines as transfer agents for biologically active macromolecules
US7297712B2 (en) Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules and its composition, process and method of treatment
EP1492876B1 (en) Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules, composition, process and use thereof
WO1999043752A1 (fr) Compositions pour transporter des substances chargees negativement
TW202400189A (zh) 可離子化脂質
JP2008143844A (ja) Ｎ１−ベンジルエタン−１，２−ジアミン誘導体およびその塩ならびにそれを用いた遺伝子キャリア

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20230113