NO314497B1 - Lipopolyamin i D-, L- eller DL-form, deres fremstilling og anvendelse samtpreparater inneholdende forbindelsene - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye forbindelser for overføring av nukleinsyre inn i celler. Disse nye forbindelser tilhører mer spesielt lipopolyamin-familien og omfatter amidinfunksjoner. Disse forbindelser er brukbare for overføring av nukleinsyrer av interesse i forskjellige celletyper, både in vitro, in vivo eller ex vivo.

Nærmere bestemt angår foreliggende oppfinnelse lipopolyaminer i D-, L- eller DL-form samt salter derav.

Oppfinnelsen angår også preparater inneholdende disse forbindelser.

Videre angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsene og likeledes angår oppfinnelsen anvendelsen av et preparat som beskrevet ovenfor for fremstilling av et medikament.

Med utviklingen av bioteknologien er muligheten for effektiv overføring av nukleinsyrer inn i celler blitt en nødvendighet. Det kan dreie seg om overføring av nukleinsyrer i celler in vitro, for eksempel for fremstilling av rekombinante proteiner, eller i laboratoriet, for å studere reguleringen av ekspresjonen av gener, kloningen av gener eller en hvilken som helst annen manipulering som implikerer DNA. Det kan likeledes dreie seg om å overføre nukleinsyrer i celler in vivo, for eksempel for å danne transgene dyr, realisering av vaksiner, studier av merking eller også terapeutiske metoder. Det kan likeledes dreie seg om overføring av nukleinsyrer i celler ex vivo, i forbindelse med poding av benmarg, immuniterapi eller andre metoder som implikerer overføring av gener i celler som er hentet fra en organisme, med henblikk på deres senere readministrering.

Forskjellige typer syntetiske vektorer er utviklet for å forbedre overføringen av nukleinsyrer i celler. Blant disse vektorer har kationiske lipider spesielt interessante egenskaper. Disse vektorer består av en kationisk, polar del som interagerer med nukleinsyrer og en hydrofob, lipidisk del som favoriserer cellulær penetrasjon. Spesielle eksempler på kationiske lipider er særlig de monokationiske lipider (DOTMA: "Lipofectin"), visse kationiske detergenser (DDAB), lipopolyaminene og særlig diokta-decylamidoglycyl-spermin (DOGS) eller 5-karboksy-spermylamid av palmitoyl-fosfatidyl-etanolamin (DPPES) hvis fremstilling for eksempel er beskrevet i EP 394,111. En annen familie lipopolyaminer representeres ved de forbindelser som er beskrevet i WO 97/18185.

Foreliggende oppfinnelse angår en ny type nukleinsyre-overføringsrnidler som har spesielt interessante egenskaper. Mer spesielt er forbindelsene ifølge oppfinnelsen kationiske lipider som bærer et opprinnelig kationisk område som gir molekylene forbedrede egenskaper. Denne kationiske del er mer spesielt representert ved et spesielt polyamin som bærer en eller flere amidinfunksjoner.

En første gjenstand for oppfinnelsen er således mer spesielt forbindelser i D-, L- eller DL-form, samt salter derav, med den generelle formel (I):

der

Ri, R2 ogR3 uavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom eller en gruppe -(CH2)<,-NR R', der

• q er et helt tall fra og med 1 til og med 6, idet verdiene av q er uavhengige av hverandre for de forskjellige grupper Ri, R2 og R3, og

R betyr en gruppe med formel (II):

der R er hydrogen og gruppene R5 et hydrogenatom, forutsatt at minst en av gruppene Ri, R2 og R3 bærer minst en gruppe med formel (II),

m og n uavhengig av hverandre betyr et helt tall fra og med 1 til og med 6, der, når n er større enn 1, m kan ha forskjellige verdier, og R3 forskjellige betydninger i den generelle formel (I),

p betyr et helt tall fra og med 1 til og med 6, og

R4 betyr en gruppe med den generelle formel (IH):

der:

. R7 og Rg uavhengig av hverandre betyr Ci2.22-alkyl,

. t er et helt tall fra og med 0 til og med 10,

. X betyr en aminogruppe,

. Y betyr en karbonylgruppe,

. Re betyr et hydrogenatom,

. s betyr et helt tall fra og med 1 til og med 10.

Uttrykket "DL-form" slik det er benyttet ovenfor, betyr en blanding av D- og L-formene i hvilke som helst andeler, og for eksempel i like andeler.

Fortrinnsvis har, når Ri, R2 og/eIlerR3 er forskjellige fra hydrogen, og omfatter den generelle formel (H), q verdien 2 eller 3.

Fortrinnsvis er m valgt blant 2,3 og 4 i den generelle formel (I).

Fortrinnsvis er den lipofile gruppe en alifatisk rest inneholdende 14, 17,18 eller 19 karbonatomer. Man kari særlig nevne de lipofile grupper (CH2)i3CH3j (CrkJisCHj, (CH2),6CH3, (CH2)i7CH3,(CH2)i<g>CH3, ogoleyl.

Oppfinnelsens forbindelser muliggjør i tillegg, sammen med et målsøkingselement, å orientere overføringen av en nukleinsyre. Dette målsøkingselement innarbeides fortrinnsvis på forbindelsen med den generelle formel (I) i sidekjeden som angis ved substituenten R&- Mer foretrukket er målsøkingselementet på eventuelt kovalent måte forbundet med forbindelsen ifølge oppfinnelsen.

Det kan dreie seg om et ekstracellulært målsøkingselement som tillater å orientere overføringen av nukleinsyren mot visse typer celler eller visse typer vev etter ønske (tumoralceller, hepatiske celler, metapoietiske celler, osv.). I denne forbindelse kan det dreie seg om en cellulær reseptorligand som er tilstede på overflaten av den innsiktede celletype, for eksempel et sukker, et folat, et transferin, et insulin, et asialo-orosomucoid protein eller et hvilket som helst bioaktivt molekyl som gjenkjennes av ekstracellulære reseptorer. Det kan likeledes dreie seg om et intracellulært målsøkingselement som tillater å orientere nukleinsyre-overføringen mot visse priviligerte cellulære rom (mitocondrier, kjerne, osv.) som for eksempel en nukleær lokaliserings-signalsekvens (nis) som priviligerer akkumulering av transfektert DNA i kjernen.

Mer spesielt omfatter målsøkingselementene som kan anvendes i forbindelse med oppfinnelsens forbindelser sukkere, peptider, oligo-nukleotider, steroider eller lipider. Fortrinnsvis dreier det seg om sukkere og/eller peptider som antistoffer eller fragmenter av antistoffer, ligander av cellulære reseptorer eller fragmenter av disse, reseptorer eller fragmenter av reseptorer osv. Særlig kan det dreie seg om ligander for reseptorer for vekstfaktorer, cytokin-reseptorer, cellulærlektin-reseptorer eller adhesjonsprotein-reseptorer som integriner. Man kan likeledes nevne reseptoren for transferrin, lipidene HDL og LDL. Målsøkingselementet kan likeledes være et sukker som tillater å sikte på lektiner som acialoglykoprotein-reseptorer, eller også et Fab-fragment av antistoff som tillater å sikte på reseptoren for fragmentet Fc av immunoglobulinene.

På samme måte er det mulig å ta sikte på assosiasjon til en forbindelse med den generelle formel (I) av et markørmiddel av typen for eksempel biotin, rhodamin eller folat, for eksempel på aminosyre-sidekjeden Rg. Dette markørmiddel kan likeledes være en peptidsekvens eller et rett eller cyklisk pseudopeptid omfattende epitopen Arg-Gly-Asp for gjenkjennelse av primære og/eller sekundære reseptorer for adhesjons-proteiner av typen integriner.

De nye forbindelser med den generelle formel (I) ifølge oppfinnelsen kan foreligge i form av salter, og fortrinnsvis ikke-toksiske og farmasøytisk akseptable salter. Disse ikke-toksiske salter omfatter salter dannet med mineralsyrer som salt-, svovel-, brom-hydrogen-, fosfor- eller salpeter-syre, eller salter som er dannet med organiske syrer som eddik-, propion-, rav-, malein-, hydroksymalein-, benzo-, fumar-, metansulfon- eller oksal-syre, eller også dannet med mineralbaser som natrium, kalium-, litium- eller kalsium-hydroksyd eller organiske baser, for eksempel tertiære aminer som trietylamin, pipieridin eller benzylamin.

Som eksempel kan man særlig nevne forbindelser ifølge oppfinnelsen som defineres ved de følgende generelle subformler:

Som illustrerende på overføringsmidler for nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen kan man nevne forbindelser med de følgende formler:

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles på forskjellige måter, særlig ved syntese, i oppløsning og/eller ved syntese, i fast fase på en polymer bærer.

Som nevnt innledningsvis angår oppfinnelsen også en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser som angitt ovenfor og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at man tildanner en amidingruppe ved innvirkning av et tio- eller oksoureaderivat på et lipopolyamin, eller ved at man poder et polyaminoamidin til et lipid ved peptidisk kobling.

I henhold til en første syntesevei kan således forbindelsene ifølge oppfinnelsen med den generelle formel (I) oppnås ved innvirkning av et tio- eller oksoureaderivat hvis aminogrupper eventuelt er beskyttet, på et lipopolyamin med formelen:

der R'i, R'2 ogR'3 uavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom eller en gruppe (CH2VNR9R10 , der q kan variere fra og med 1 til og med 6, idet de forskjellige q er uavhengig av hverandre,

R9 og Rio uavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom eller en gruppe med formelen (CH2)r-NH2, der r uavhengig kan variere fra hverandre fra og med 1 til og med 6, og m, n, p og R4 er som angitt ovenfor.

Innvirkningen av ureaderivater skjer generelt i nærvær av en base i et hensiktsmessig protisk eller aprotisk oppløsningsmiddel, og ved en temperatur mellom 0 og 100°C.

Den benyttede base er generelt en ikke-nukleofil base som for eksempel tertiære aminer, natriumkarbonat eller natriumbikarbonat. Fortrinnsvis benyttes tertiære aminer, for eksempel trietylamin (TEA) eller N-etyldiisopropylamin (DIEA).

Reaksjonen skjer fortrinnsvis i oppløsningsmidler som vann, alkoholer som metanol, etanol eller isopropanol, dimetylformamid, diklormetan, kloroform, toluen, karbontetraklorid, benzen, acetonitril, N-metylpyrrolidon, og så videre. Fortrinnsvis ligger reaksjons-temperaturen mellom 20 og 60°C, og aller helst mellom 30 og 50°C.

De mest interessante ureaderivater er for eksempel O-metyiisourea ("J. Med. Chem.", 38

(1995) 16, 3053-3061), semisulfatet av S-metylisotiourea ("Int. J. Pept. Prot. Res.", 40(1992), 119-126), bis-boc-tiourea ("Tet. Lett." 48 (1993), 7677-7680), N,N'-bis-(benzoyloksykarbonyl)-S-metylisotiourea eller N,N'-bis-(tert-butoksykarbonyl)-S-metylisotiourea ("Synth. Commun.", 26 (1996) 2,407-413).

Lipopolyaminene med den generelle formel (VIU) oppnås i henhold til metoder som er beskrevet i W097/18185, eller ved en hvilken som helst for fagmannen kjent, analog metode.

Ifølge oppfinnelsen kan overføringsmidlene med den generelle formel (I) også oppnås ved peptidisk kopling mellom en syre med den generelle formel (DC):

og det lipidiske molekyl R4H der R1? R2 og R3, m, n, p og R4 er som angitt ovenfor.

Peptidkoplingen skjer i henhold til klassiske metoder (M. Bodanski, "Principles and Practices of Peptides Synthesis", Ed. Springe-Verlag) eller ved en hvilken som helst analog metode fagmannen kjenner.

Særlig skjer reaksjonen i nærvær av en ikke-nukleofil base i hensiktsmessig aprotiske oppløsningsmidler ved en temperatur mellom 0 og 100°C, idet pH-verdien justeres til mellom 9 og 11.

Som eksempel kan kloroform, dimetylformamid, N-metylpyrrolidon, acetonitril, diklormetan, toluen eller benzen benyttes som oppløsningsmiddel.

De ikke-nukleofile baser som benyttes er fortrinnsvis tertiære aminer, kalsiumkarbonat eller natriumdikarbonat. Aller helst er de benyttede baser tertiære aminer som trietylamin (TEA) eller N-etyldiisopropylamin (DIEA).

Fortrinnsvis skjer reaksjonen ved en temperatur mellom 0 og 50°C, og aller helst mellom 10og30°C.

Lipidmolekylet med formel R4H, der R4 er som angitt ovenfor, kan oppnås ved peptidisk kopling mellom en kommersiell forbindelse med den generelle formel (X)

og aminet med formelen NHR7R8,

der X, Y, s, t, R^m R7 og K% er som angitt tidligere.

Peptidkoplingen skjer i henhold til klassiske metoder (M. Bodanski, "Principles and Practices of Peptides Synthesis", Ed. Springe-Verlag) eller på en hvilken som helst analog måte som er kjent for fagmannen.

Særlig skjer reaksjonen i nærvær av en ikke-nukleofil base i hensiktsmessige, aprotiske oppløsningsmidler, ved en temperatur mellom 0 og 100°C, der pH-verdien justeres til mellom 9 og 11, slik det er beskrevet ovenfor.

Syren med den generelle formel (IX) kan oppnås ad syntesevei i fast fase, i tre trinn, som følger:

Et polyamin med den generelle formel (XI):

der R'i, R'2, R'3, m og n er som angitt ovenfor, podes på en polymer bærer LPJ for å oppnå en podet forbindelse med den generelle formel (XII):

Reaksjonen skjer fortrinnsvis ved en temperatur mellom 0 og 100°C i nærvær av et hensiktsmessig aprotisk opp løsningsmiddel, foreksempel kloroform, diklormetan, dimetylformamid, N-rnerylpyrrolidon, acetonitril, toluen, benzen, osv. Fortrinnsvis er reaksjonstemperaturen omgivelsestemperatur.

Forskjellige typer polymere bærere kan brukes. Man velger fortrinnsvis harpikser som er kommersielt tilgjengelige for peptidsyntese i fast fase (Merrifield-syntese). Særlig kan man velge O-klortrityl-harpiks eller HMP-harpiks som gir produkter som bærer frie syrefunksjoner, eller en harpiks av Rink-typen. Polyaminosyren kan syntetiseres direkte på et på forhånd syntetisert peptid på den faste fase og bære en bromalkyl- eller en co-aldehyd-syrefunksjon.

Alkyleringsmidlene som benyttes for å oppnå den egnede harpiks velges som en funksjon av alkyleringsmetoden. For en klassisk alkylering velger man for eksempel bromeddiksyre eller to-halogenkarboksylsyrer. For en reduktiv alkylering velges for eksempel en co-aldehyd-karboksylsyre som glyoksalsyre, ravsyre-semialdehyd eller en ketosyre som acetoeddiksyre eller pyruvinsyre og så videre.

Utgangs-polyaminene med den generelle formel (XI) er enten kommersielt tilgjengelige, for eksempel spermidin, spermin, tris-(2-aminoetyl)-amin, fenylen-diamin, diaminoetan, (propan, butan, pentan, heksan, osv.), eller kan syntetiseres ved klassiske metoder, for eksempel ved cyanoetylering av kommersielt tilgjengelige aminer som diaminoetan (propan, butan, pentan, heksan, osv.), amin, spermidin, spermin, for derved å oppnå de forgrenede polyaminer.

I et andre trinn omsetter man den podede forbindelse med den generelle formel (XII) med et tio- eller oksoderivat av urea, hvis aminer eventuelt er beskyttet, for derved å oppnå en podet polyaminoamidin-forbindelse med den generelle formel (XHl):

der R'i, R'2jR'3, rn, n og p er som angitt ovenfor.

Reaksjonen skjer i henhold til i og for seg kjente metoder (R. J. Bergeron og McManis, "Total synthesis of 15-deoxyspergualin", "J.Org.Chem.", 1987,52, 1700-1703) eller analoge metoder.

Reaksjonen skjer vanligvis ved en temperatur mellom -20°C og +I00°C i nærvær av et protisk eller aprotisk oppløsningsmiddel.

Som eksempel benytter man som oppløsningsmiddel vann, alkoholer som metanol, etanol eller isopropanol, dimetylformamid, diklormetan, kloroform, aromatiske oppløsningsmidler som toluen eller benzen, karbontetraklorid, acetonitril, N-metylpyrrolidon og så videre.

De mest interessante ureaderivater er for eksempel O-metylisourea ("J. Med. Chem." 38

(1995), 16, 3053-3061), semisulfatet av S-metylisotiourea ("Int. J. Pept. Prot. Res.", 40

(1992), 119-126), bis-Boc-tiourea ("Tet. Lett." 48 (1993), 7677-7680), N,N'-bis-<£enzyIoksykarbonyI)-S-metylisotiourea eller N,N'-bis-(tert-butoksykarbonyl)-S-metylisotiourea ("Synth. Commun.", 26 (1996), 2, 407-413).

Til slutt blir i et siste trinn de podede polyaminoamidiner med den generelle formel (XIIT) spaltet på den polymere bærer for å gi syren med den generelle formel (IX) som angitt ovenfor. Spaltingen skjer i henhold til klassiske metoder. Særlig arbeider man under innvirkning av en svak syre som ikke bryter ned resten av molekylet. De foretrukne svake syrer er for eksempel fluorerte alkoholer og spesielt 1,1,1 -trilfuoretan-2-ol.

Polyaminoamidiner med den generelle formel (XIH) inneholder syre-, amino-, alkylamino-, og/eller amidin-funksjoner og det kan eventuelt være fordelaktig å beskytte disse før spalting på den polymere bærer. Beskyttelsen kan gjennomføres ved hjelp av en hvilken som helst kompatibel gruppe hvis anvendelse og eliminering ikke endrer resten av molekylet. Særlig arbeider man i henhold til de metoder som er beskrevet i T.W. Green, "Protective Grups in Organic Synthesis", A. Wiley-Interscience Publication (1981), eller av McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press (1973).

Den eventuelle fjerning av de beskyttende rester skjer eventuelt før peptid-koplingen mellom syren med den generelle formel (DC) som oppnås etter spalting av den polymere bærer og forbindelsen med den generelle formel R4H, i henhold til kjente metoder.

Som eksempel kan beskyttende grupper velges blant trimetylsilyl-, benzhydryl-, tetra-hydropyrannyl-, formyl-; acetyl-, kloracetyl-, trikloracetyl-, trifluoracetyl-, etoksy-karbonyl-, tert-butoksykarbonyl-, trikloretoksykarbonyl-, benzyloksykarbonyl-fluorenyl-oksykarbonyl-grupper og så videre.

En hvilken som helst annen for fagmannen kjent metode, og særlig de som er beskrevet av M. Bodanski, i "Principles and Practices of Peptides Synthesis", Ed. Springe-Verlag) og som fører til overføringsmidler for nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen, ligger likeledes innenfor oppfinnelsens ramme.

Som nevnt innledningsvis angår oppfinnelsen også et preparat som karakteriseres ved at det omfatter en forbindelse som beskrevet ovenfor og en nukleinsyre.

Fortrinnsvis er forbindelsen og nukleinsyren til stede i mengder slik at forholdet R mellom positive ladninger i forbindelsen og negative ladninger i nukleinsyren ligger mellom 0,1 og 50, og helst mellom 0,1 og 20. Dette forhold kan så lett justeres av fagmannen som en funksjon av den benyttede forbindelse, nukleinsyren samt de tilsiktede anvendelser (særlig typen celler som skal overføres).

Innenfor oppfinnelsens ramme menes med uttrykket "nukleinsyre" både en desoksy-ribonukleinsyre og en ribonukleinsyre. Det kan dreie seg om naturlige eller kunstige sekvenser og særlig genomisk DNA (gDNA), komplementær DNA (cDNA), meddeler RNA (rnRNA), overførings-RNA (tRNA), ribosomisk RNA (rRNA), hybridsekvenser eller syntetiske eller semi-syntetiske sekvenser, videre eventuelt modifiserte oligo-nukleotider. Disse nukleinsyrer kan være av human, animalsk, vegetabilsk, bakteriell eller viral opprinnelse eller annet. De kan oppnås på en hvilken som helst kjent måte og særlig ved avsøking av banker, ved kjemisk syntese eller også ved blandede metoder som inkluderer kjemisk eller enzymatisk modifisering av sekvenser som er oppnådd ved avsøking av banker. De kan modifiseres kjemisk.

Hva mer spesielt angår desoksy-ribonukleinsyrene kan disse være enkelt- eller dobbelt-strenget samt korte oligonukleotider eller lengre sekvenser. Særlig består nukleinsyrene fordelaktig av plasmider, vektorer, episomer, ekspresjonskassetter og så videre. Disse desoksy-ribonukleinsyrer kan bære en eventuelt funksjonell replikasjonsopprinnelse i målcellen, et eller flere markørgener, reguleringssekvenser for transkripsjon eller replikasjon, interessante terapeutiske gener, eventuelt modifiserte antiretnings-sekvenser, bindings-områder for andre cellulære forbindelser og så videre.

Fortrinnsvis omfatter nukleinsyren en ekspresjonskassett bestående av et eller flere terapeutiske gener av interesse under kontroll av en eller flere promotere og en transkripsjonen terminator som er aktiv i målcellene.

Innenfor rammen av oppfinnelsen menes med gen av terapeutisk interesse særlig et hvilket som helst gen som koder for et proteinprodukt med en terapeutisk virkning. Proteinproduktet som kodes på denne måte er særlig et protein eller et peptid. Proteinproduktet kan være homologt eksogent eller endogent vis a vis målcellen, det vil si et produkt som vanligvis uttrykkes i målcellen når denne ikke oppviser noen patologi. I dette tilfellet tillater ekspresjonen av et protein for eksempel å bøte på en utilstrekkelig ekspresjon i cellen, eller ekspresjon av et inaktivt eller lite aktivt protein på grunn av en modifikasjon, eller også å overeksprimere proteinet. Genet av terapeutisk interesse kan også kode for en mutant av et cellulært protein med økt stabilitet, modifisert aktivitet, og så videre. Proteinproduktet kan likeledes være heterologt vis a vis målcellen. I dette tilfellet kan et uttrykt protein for eksempel komplettere eller tilveiebringe en aktivitet som er defektiv i cellen og som tillater å kjempe mot en patologi, eller å stimulere en immunitær respons.

Blant de terapeutiske produkter innenfor oppfinnelsens ramme kan særlig nevnes enzymer, blodderivater, hormoner, lymfokiner: interleukiner, interferoner, TNF og så videre, (FR 93/05125), vekstfaktorer, neurotransmetorer eller deres forløpere eller synteseenzymer, trofiske faktorer (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleotrofmer, osv.), apolipoproteiner (ApoAI, ApoIV, ApoE, osv., FR 93/05125), dystrofin eller et minidystrofin (FR 91/11947), protein CFTR forbundet med mucoviscidose, tumorsupressorgener (p53, Rb, Rapi A, DCC, k-rev, osv., FR 93/04745)1 gener som koder for faktorer implikert i koagulering (faktorene VIL VIE, IX), gener som intervenerer i fordeling av DNA, selvmordsgener (thymidinkinase, cytosindeaminase), gener av hemoglobin eller andre proteintransportører, enzymer for metabolisme, katabolisme og så videre.

Nukleinsyren av terapeutisk interesse kan likeledes være et gen eller en anti retnings-sekvens hvis ekspresjon i målcellen tillater å kontrollere ekspresjonen av gener eller transkripsjonen av cellulær mRNA. Slike sekvenser kan for eksempel transkriberes i målcellen til RNA komplementær cellulær mRNA og derved blokkere traduksjonen til protein, i henhold til de teknikker som er beskrevet i EP 140308. De terapeutiske gener omfatter likeledes sekvenser som koder for ribocymer og som er i stand til selektivt å destruere mål-RNA (EP 321201).

Nukleinsyren kan likeledes omfatte et eller flere gener som koder for et antigenisk peptid, i stand til hos mennesker eller dyr å generere en immunrespons. I denne spesielle utførelsesform tillater oppfinnelsen realisering enten av vaksiner eller av immunoterapeutiske behandlinger anvendt på mennesker eller dyr, særlig mot mikro-organismer, vimser eller cancere. Det kan likeledes dreie seg om spesifikke antigeniske peptider av Epstein Barr-virusen, HIV-virusen, en hepatit-B-virus (EP 185573), pseudo-hundegalskapsvirusen, "syncitia forming virus", andre vimser eller også antigeniske peptider som er spesifikke mot tumorer (EP 259212).

Fortrinnsvis omfatter nukleinsyrene likeledes sekvenser som tillater ekspresjonen av det terapeutiske gen av interesse og/eller genet som koder for det antigeniske peptid i den ønskede celle eller det ønskede organ. Det kan dreie seg om sekvenser som naturlig er ansvarlig for ekspresjonen av det angjeldende gen når sekvensene er i stand til å funksjonere i den infekterte celle. Det kan likeledes dreie seg om sekvenser av annen opprinnelse (ansvarlig for ekspresjonen av andre proteiner, eller også syntetiske). Særlig kan det dreie seg om promote sekvenser for eukariotiske eller virale gener. Særlig kan det dreie seg om promote sekvenser fra genomet av cellen man ønsker å infektere. På samme måte kan det dreie seg om promote sekvenser fra genomet av en virus. I denne forbindelse kan man for eksempel nevne promotrene for genene EIA, MLP, CMV, RSV, og så videre. Videre kan ekspresjonssekvensene være modifisert ved addisjon av sekvenser for aktivering, regulering, og så videre.

Det kan også dreie seg om induktible eller represible promotere. Videre kan nukleinsyren likeledes, særlig oppstrøms genet av terapeutisk interesse, omfatte en signalsekvens som styrer det syntetiserte, terapeutiske produkt inn i målcellens sekresjons veier. Denne signalsekvens kan være den naturlige signalsekvens for det terapeutiske produkt, men det kan likeledes dreie seg om en hvilken som helst annen funksjonell signalsekvens eller også en kunstig slik. Nukleinsyren kan likeledes omfatte en signalsekvens som styrer det syntetiske, terapeutiske produkt mot et spesielt cellulært rom.

I en annen utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse også preparater omfattende en nukleinsyre, et transfeksjonsmiddel (I) som definert ovenfor, og en eller flere adjuvanter i stand til å assosiere seg til det komplekse transfeksjon/nukleinsyremiddel og å forbedre transfeksjonsevnen. Nærværet av denne type adjuvanter (for eksempel lipider, peptider eller proteiner) kan på fordelaktig måte tillate å øke forbindelsenes transfeksjonskraft.

Under dette aspekt kan oppfinnelsens preparater som adjuvant omfatte en eller flere nøytrale lipider. Slike preparater er særlig fordelaktige, når forholdet R mellom de nukleolipidiske komplekser er lavt. Søker har kunnet påvise at tilsetning av et nøytralt lipid tillater å forbedre dannelsen av nukleolipidiske partikler og å favorisere penetrering av partikkelen inn i cellen ved destabilisering av membranen.

Mer spesielt er de nøytrale lipider som benyttes innenfor oppfinnelsens ramme lipider med to fettkjeder. På spesielt fordelaktig måte benyttes naturlige eller syntetiske lipider av zwitterionisk type eller slike som er berøvet for den ioniske ladning under fysiologiske betingelser. De kan mer spesielt velges blant dioleylfosfatidyl-etanolamin (DOPE), oleylpalmitoyl-fosfatidyletanolamin (POPE), di-stearoyl-, -palmitoyl-, eller - myristyl-fosfatidyl-etanolaminer samt deres 1-3 ganger N-metylerte derivater, fosfatidylglyceroler, diacylglyceroler, glykosyldiacylglyceroler, cerebrosider (som særlig galaktocerebrosider), sfingolipider (som for eksempel sfingomyelinene) eller også asialogangliosider (som særlig asialoGMl og GM2).

Disse forskjellige lipider kan oppnås enten ved syntese eller ved ekstrahering fra organer (som hjernen) eller egg, ved klassiske teknikker. Særlig kan ekstraheringen av naturlige lipider skje ved hjelp av organiske oppløsningsmidler (se Lehninger, "Biochemistry").

I den senere tid har foreliggende søker kunnet påvise at det likeledes er spesielt fordelaktig som adjuvant å benytte en forbindelse som eventuelt intervenerer direkte ved kondensasjonen av nukleinsyren (WO 96/25508). Nærværet av en slik forbindelse i et preparat ifølge oppfinnelsen tillater å redusere mengden transfeksjonsforbindelse med de fordelaktige konsekvenser dette medfører på det toksikologiske plan, uten å innvirke ugunstig på transfeksjonsakti vi teten. Med forbindelse som intervenerer ved kondensasjonen av nukleinsyren mener man å definere en forbindelse som eventuelt direkte kompakterer nukleinsyren. Mer spesielt kan denne forbindelse enten innvirke direkte på nukleinsyren som skal transfekteres, eller intervenere på en anneks-forbindelse som i sin tur direkte er implikert i kondensasjonen av nukleinsyren. Fortrinnsvis virker den direkte på nukleinsyren. For eksempel kan prekompakterings-midlet være et hvilket som helst polykation som for eksempel polylysin. I henhold tit en foretrukken utførelsesform stammer dette middel som intervenerer i kondensasjonen av nukleinsyren helt eller delvis fra et protamin, et histon eller et nukleolin og/eller et derivat derav. Et slikt middel kan likeledes helt eller delvis bestå av peptiddeler (KTPKKAKKP) og/eller (ATPAKKAA) der antallet deler kan variere mellom 2 og 10. I strukturen av forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan disse deler eventuelt foreligge repetativt. Her kan de foreligge separert av bindinger av biokjemisk art, for eksempel av en eller flere aminosyrer, eller av kjemisk art.

Fortrinnsvis omfatter preparatene ifølge oppfinnelsen 0,01 til 20 ekvivalenter adjuvant per ekvivalent nukleinsyre i mol per mol, fortrinnsvis 0,5 til 5.

I en spesielt fordelaktig utførelsesform omfatter preparatene ifølge oppfinnelsen i tillegg et målsøkende element som tillater å orientere overføringen av nukleinsyren. Dette målsøkende element kan være et ekstracellulært målelement som tillater å orientere overføringen av DNA mot visse cellulære typer eller visse ønskede vev (tumorale celler, hepatiske celler, hematopoietiske celler, og så videre). Det kan likeledes dreie seg om et målsøkingselement av intracellulær type som tillater å orientere overføringen av nukleinsyren mot visse priviligerte cellulære rom (mitokondrie, kjerne, osv.). Målsøkningselementet kan være forbundet med nukleinsyre-overføringsmidlet ifølge oppfinnelsen eller likeledes en nukleinsyre slik det er presisert ovenfor.

Blant målelementene som kan benyttes ifølge oppfinnelsen kan nevnes sukkere, peptider, proteiner, oligonykleotider, lipider, neuromediatorer, hormoner, vitaminer eller derivater derav. Fortrinnsvis dreier det seg om sukkere, peptider eller proteiner som antistoffer eller fragmenter av antistoffer, ligander for cellulære reseptorer eller fragmenter derav, reseptorer eller fragmenter av reseptorer, og så videre. Særlig kan det dreie seg om ligander for reseptorer av vekstfaktorer, reseptorer for cytokiner, reseptorer for cellulære lecitintyper eller ligander med DGR-sekvens med en affinitet for adhesjons-proteinreseptorer som integriner. Man kan likeledes nevne reseptorer for transferrin, HDL'er og LDL'er eller folat-transportører. Målelementet kan likeledes være et sukker som tillater å sikte på lektiner som reseptorer for asialoglykoproteiner eller sialyderte forbindelser, som syalider som sialydet Lewis X, eller også et Fab-antistoff-fragment eller et enkeltkjede-antistoff (ScFv).

Assosiasjonen av målelementene til nukleolipidiske komplekser kan gjennomføres ved en hvilken som helst av fagmannen kjent teknikk, for eksempel ved å kople en hydrofob del eller en del som interagerer med nukleinsyren i overføringsmidlet ifølge oppfinnelsen, eller også en gruppe som interagerer med overføringsmidlet ifølge oppfinnelsen eller en nukleinsyre. De angjeldende interaksjoner kan i henhold til en foretrukken utførelsesform være av ionisk eller kovalent art.

Til slutt angår oppfinnelsen, slik det også er antydet innledningsvis, anvendelsen av et preparat som beskrevet ovenfor for fremstilling av et medikament for behandling av en sykdom som er resultatet av en defektivitet i et protein eller et nukleinprodukt.

For anvendelse in vivo, for eksempel for å studere reguleringen av gener, opprettelse av patologiske dyremodeller eller terapi, kan preparatene ifølge oppfinnelsen formuleres med henblikk på administrasjon ad topisk, kutan, oral, rektal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intraoculær, transdermisk, intratracheal eller intraperitoneal vei. Fortrinnsvis inneholder preparatene ifølge oppfinnelsen en farmasøytisk akseptabel bærer for en injiserbar formulering, særlig for en direkte-injeksjon i det ønskede organ, eller for en administrasjon ad topisk vei (på hud og/eller slimhinne). Det kan særlig dreie seg om de sterile, isotoniske oppløsninger eller tørre og særlig lyofiliserte preparater, som ved tilsetning av sterilisert vann eller fysiologisk serum tillater konstituering av injiserbare preparater. Nukleinsyredosene som benyttes for injeksjon samt antallet administreringer kan tilpasses som funksjon av de forskjellige parametere, og særlig som funksjon av den benyttede administreringsvei, den angjeldende patologi, genet som skal uttrykkes eller også den tilsiktede behandlings-varighet. Hva mer spesielt angår administreirngsmåten kan det enten dreie seg om en injeksjon direkte i vevene, for eksempel i tumorer, eller sirkulasjons-veiene, eller en behandling av cellene i kulturer fulgt av deres reimplantering in vivo ved injeksjon eller poding. De angjeldende vev eller sirkulatoriske veier innenfor rammen av oppfinnelsen er for eksempel musklene, huden, hjernen, lungene, leveren, milten, ryggmargen, tymus, hjerte, lymfen, blodet, knoklene, bindevev, pancreas, brystene, kar, magen, involler,

testikler, ovariene, rektum, nervesystemet, øynene, kjertlene, bindevev, og så videre.

Foreliggende oppfinnelse muliggjør en overføringsmetode for nukleinsyrer i celler om omfatter de følgende trinn: (1) å bringe nukleinsyren i kontakt med et overføringsmiddel som definert ovenfor for å danne et kompleks, og

(2) å bringe cellene i kontakt med komplekset dannet under (1).

Kontakten mellom cellene og komplekset kan realiseres ved inkubering av cellene med komplekset (for anvendelser in vitro eller ex vivo) eller ved injeksjon av komplekset i en organisme (for anvendelser in vivo). Inkuberingen gjennomføres fortrinnsvis i nærvær for eksempel av 0,01 til 1000 ug nukleinsyre per IO<6> celler. For en administrering in vivo kan det for eksempel benyttes nukleinsyredoser mellom 0,01 og 10 mg.

I det tilfellet der preparatene ifølge oppfinnelsen i tillegg inneholder en eller flere adjuvanter og/eller et målsøkingselement som definert ovenfor, kan adjuvanten(e) eller målsøkingselementet(ene) på forhånd blandes med overføringsmidlet ifølge oppfinnelsen eller med nukleinsyren.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en spesielt fordelaktig mulighet for overføring av nukleinsyre, særlig ved behandling av sykdommer, omfattende administrering in vitro, in vivo eller ex vivo, av en nukleinsyre i stand til å korrigere sykdommen, assosiert med et overføringsmiddel med den generelle formel (I) under de betingelser som er definert ovenfor. Mer spesielt er denne metode anvendelig for sykdommer som skyldes en defekt i et protein- eller nuklein-produkt, og der den administrerte nukleinsyre koder for proteinprodukt eller transkriberes til et nuklein-produkt, eller også utgjør det nevnte nukteinprodukt.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er særlig anvendelige for overføring av nukleinsyre i primærceller eller i etablerte linjer. Det kan dreie seg om fibroblastiske, muskel-, nerve-(neuroner, astrocyter, glialceller), hepatiske celler, den hematopoietiske linje (lymfocyter, CD34, dendritiske, osv.), epitelialceller, og så videre, i differensierte eller pluri-potens-(fbrløpere)-form.

I tillegg til det som er beskrevet ovenfor omfatter oppfinnelsen likeledes andre karakteristika og fordeler som fremgår av de følgende figurer, som skal illustrere oppfinnelsen ytterligere.

Figurer.

Fig. 1/ 15: Et synteseskjema for forbindelse (I) ifølge oppfinnelsen.

Fig. 2/ 15: Mål på effektiviteten for transfeksjon in vitro av forbindelse (I) ifølge oppfinnelsen i celler NIH3T3, HepG2 og HeLa, i fravær av seriske proteiner og i sammenligning med sin aminohomolog (RPR120535). Med "aminohomolog" menes det kationiske lipid som er identisk, bortsett fra amidin- og/eller guanidin-funksjonene, som er erstattet med aminofunksjoner.

Målingene ble gjennomført under forskjellige ladningsforhold som er angitt som absisse. Ekspresjonen av luciferase er angitt på ordinataksen og uttrykt som relative lysenheter, RLU, per brønn.

Fig. 3/ 15: Måling av effektiviteten for transfeksjon in vitro av forbindelse 1 ifølge oppfinnelsen i celler NIH3T3, HepG2 og HeLa, i fravær av (åpne stolper) og i nærvær av (sorte stolper) seriske proteiner og sammenlignet med sin aminohomolog (RPR120535).

Målingene ble gjennomført under forskjellige ladningsforhold som er angitt som absisse. Ekspresjonen av luciferase er angitt på ordinataksen og uttrykt som relative lysenheter, RLU, per brønn.

Fig. 4/ 15: Måling av transfeksjons-effektiviteten in vitro av forbindelse 2 ifølge oppfinnelsen i HeLa-celler, i fravær av seriske proteiner. Målingene skjer for forbindelse 2 i micellær form og i assosiasjon med et nøytralt kolipid (DOPE) og kolesterol.

Absisse-aksen representerer ladningsforholdet for komplekset som dannes mellom det kationiske lipid og DNA. Ordinataksen viser ekspresjonen av uttrykt luciferase i pg/brønn, idet hver brønn inneholder 100 000 celler.

Fig. 5/ 15: Måling av transfeksjons-effektiviteten in vitro av forbindelse 3 ifølge oppfinnelsen i HeLa-celler, i fravær av seriske proteiner. Målingene skjer for forbindelse 3 i micellær form og i assosiasjon med et nøytralt kolipid (DOPE) og kolesterol.

Absisse-aksen representerer ladningsforholdet for komplekset som dannes mellom det kationiske lipid og DNA. Ordinataksen viser ekspresjonen av uttrykt luciferase i pg/brønn, idet hver brønn inneholder 100 000 celler.

Fig. 6/ 15: Måling av transfeksjons-effektiviteten in vitro av forbindelse 5 ifølge oppfinnelsen i HeLa-celler, i fravær av seriske proteiner. Målingene skjer for forbindelse 5 i micellær form og i assosiasjon med et nøytralt kolipid (DOPE) og kolesterol.

Absisse-aksen representerer ladningsforholdet for komplekset som dannes mellom det kationiske lipid og DNA. Ordinataksen viser ekspresjonen av uttrykt luciferase i pg/brønn, idet hver brønn inneholder 100 000 celler.

Fig. 7/ 15: Måling av transfeksjons-effektiviteten in vitro av forbindelse 6 ifølge oppfinnelsen i HeLa-celler, i fravær av seriske proteiner. Målingene skjer for forbindelse 6 i micellær form og i assosiasjon med et nøytralt kolipid (DOPE og kolesterol).

Absisse-aksen representerer ladningsforholdet for komplekset som dannes mellom det kationiske lipid og DNA. Ordinataksen viser ekspresjonen av uttrykt luciferase i pg/brønn, idet hver brønn inneholder 100 000 celler.

Fig. 8/ 15: Tabell som antyder den fysikokjemiske fase (fase A, B eller C) i hvilken befinner seg de nukleolipidiske komplekser dannet med forbindelse 2 sammenlignet med sin aminoanalog, som funksjon av ladningen.

Bestemmelsen av fasene er gjennomført for forbindelse 2 og for aminohomologen i micellær form og i assosiasjon med et nøytralt kolipid (DOPE og kolesterol).

Ved sammenligning av de to tabeller observerer man en forskyvning av den ustabile fase B mot det lavere ladningsforhold når det gjelder forbindelse 2.

Fig. 9/ 15: Tabell som antyder den fysikokjemiske fase (fase A, B eller C) i hvilken befinner seg de nukleolipidiske komplekser dannet med forbindelse 3 sammenlignet med sin aminoanalog, som funksjon av ladningen.

Bestemmelsen av fasene er gjennomført for forbindelse 3 og for aminohomologen i micellær form og i assosiasjon med et nøytralt kolipid (DOPE og kolesterol).

Ved sammenligning av de to tabeller observerer man en forskyvning av den ustabile fase B mot det lavere ladningsforhold når det gjelder forbindelse 3.

Fig. 10/ 15: Tabell som antyder den fysikokjemiske fase (fase A, B eller C) i hvilken befinner seg de nukleolipidiske komplekser dannet med forbindelse 5 sammenlignet med sin aminoanalog, som funksjon av ladningen.

Bestemmelsen av fasene er gjennomført for forbindelse 5 og for aminohomologen i micellær form og i assosiasjon med et nøytralt kolipid (DOPE og kolesterol).

Ved sammenligning av de to tabeller observerer man en forskyvning av den ustabile fase B mot det lavere ladningsforhold når det gjelder forbindelse 5.

Fig. 11/ 1S: Tabell som antyder den fysikokjemiske fase (fase A, B eller C) i hvilken befinner seg de nukleolipidiske komplekser dannet med forbindelse 6 sammenlignet med sin aminoanalog, som funksjon av ladningen.

Bestemmelsen av fasene er gjennomført for forbindelse 6 og for aminohomologen i micellær form og i assosiasjon med et nøytralt kolipid (DOPE og kolesterol).

Ved sammenligning av de to tabeller observerer man en forskyvning av den ustabile fase B mot det lavere ladningsforhold når det gjelder forbindelse 6. Fig. 12/ 15: Tabell som viser reduksjonen av fluorescens etter tilsetning av etidiumbromid for forbindelsene 2,3, 5 og 6, i form av miceller. Erstatningen av etidiumbromidet av DNA med lipidet er en indikasjon på bindingen til DNA. Fluorescensen som oppnås for DNA alene er definert til 100 %. Fig. 13/ 15: Tabell som viser reduksjonen av fluorescens etter tilsetning av etidiumbromid for forbindelsene 2, 3,5 og 6, i form av kolesterol. Erstatningen av etidiumbromidet av DNA med lipidet er en indikasjon på bindingen til DNA. Fluorescensen som oppnås for DNA alene er definert til 100 %. Fig. 14/ 15: Tabell som viser reduksjonen av fluorescens etter tilsetning av etidiumbromid for forbindelsene 2, 3,5 og 6, i form av DOPE. Erstatningen av etidiumbromidet av DNA med lipidet er en indikasjon på bindingen til DNA. Fluorescensen som oppnås for DNA alene er definert til 100 %.

Fig. 15/ 15: viser plasmidet pX13031.

Forkortelser og symboler

Materiell og metoder for kjemiske synteser

a) Forbindelser

Utgangspolyaminene er kommersielt tilgjengelige, for eksempel spermidin, spermin,

tris-(2-aminoetyl)-amin, fenylendiamin, diaminoetan (propan, butan, pentan, heksan, osv.), eller kan syntetiseres ved klassiske metoder, for eksempel ved cyanoetylering av aminer som er kommersielt tilgjengelige, for eksempel diaminoetan (propan, butan, pentan, heksan, osv.), amin, spermidin, spermin, for å oppnå forgrenede polyaminer.

De benyttede polymerer er harpikser som er kommersielt tilgjengelige for peptid-syntese i fast fase (Merryfield-syntese), særlig O-klortritylklorid-harpiks, HMP-harpiks, som gir produkter som bærer frie syrefunksjoner, eller en harpiks av Rink-typen. Polyaminosyrene kan syntetiseres direkte på et peptid som er forsyntetisert i fast fase og bærer en bromalkyl-funksjon eller en eo-aldehydsyre-funksjon.

Dioktadecylamin, trietylamin-trifluoreddiksyreamin, BOP, DMAP, benzylklorformat er kommersielle produkter; NaCl-oppløsningene og NaHC03-oppløsningene er mettede; KHS04-oppløsningen er 0,5 M.

b) Fysikalske målinger

Proton NMR-spektrene registreres på et Bruker 400 og 600 MHZ spektrometer.

Massespektrene (MS) gjennomføres på en API-MS/ffl.

c) Renseteknikker og analyse

a) Betingelser for kromatografi i direkte fase

- Tynnsjiktkromatografi gjennomføres på Merck silikagel-plater med tykkelse 0,2 mm.

De fremkalles enten med UV (254 nm), med ninhydrin, ved fordampning (lett spray) av en etanolisk ninhydrinoppløsning (40 mg/100 ml EtOH) for å fremkalle aminene eller amidene ved oppvarming til 150°C, med fluorescamin ved fordampning av en oppløsning (40 mg/100 ml aceton) for fremkalling av primæramin, eller jod for å dekke platen med jodpulver. - Kolonnekromatografi i direkte fase gjennomføres på Merck 60 silikagel med granulometri 0,063-0,200 mm.

b) Analytiske kromatografi-teknikker

HPLC- analysene gjennomføres på en Merck-Hitachi-apparatur utstyrt med en

integrator-kalkulator D 2500 HITACHI, en AS-2000A autosampler, en L-6200A intelligentpumpe, en L-4000 UV-detektor med regulerbar bølgelengde satt til 220 nm for analytiske separasjoner. Kolonner for analytiske separasjoner er kolonnene BU-300 akvapor butyl 7m, 300 A 300x4,6 mm, fra Perkin-Elmer. De mobile faser er demineralisert vann inneholdende 0,1 % TFA og acetonitril inneholdende 0,1 % TFA. Injeksjonene av en oppløsning på rundt 1 mg/ml i en sløyfeventil på 100 ul er 20 ul. Mengden for analysen reguleres til 1 ml/minutt.

Separasjonsbetingelser:

Gradient:

c) Preparative kromatografi-teknikker

Apparaturen er en enhet for kromatografi i væskefase ved gradientmetoden som tillater

en UV-deteksjon. Denne preparative kjede består av de følgende elementer:

Pumpe A: GILSON modell 305 utstyrt med et 50 SC-hode.

Pumpe B: GILSON modell 303 utstyrt med et 50 SC-hode.

Inieksionssløvfe: GILSON modell 303 utstyrt med et 25 SC-hode.

Trvkkmodul: GILSON modell 806.

Blander: GILSON modell 811C utstyrt med 23 ml hode.

UV- detektor: GILSON modell 119 utstyrt med en preparativ celle. Fraksionskollektor: GILSON modell 202 utstyrt med mottakere nr. 21.

Integrator: SHIMADZU modell C-R6A.

Kolonne: kolonne C4 (10 mm) i rustfritt stål med mengde 25 cm og diameter 2,2 cm, markedsført av VYDAX, modell 214 TP 1022.

Oppløsningen av produkter som skal renses fylles på kolonnen med injeksjonspumpen i en mengde av 15 ml/minutt og eluatet samles per fraksjon i et rør i 30 sek. Detektoren reguleres til bølgelengder på 220 nm og 235 nm.

De mobile faser defineres som følger:

Gradient:

d) Peptid-synteseteknikk i fast fase (SPPS)

Syntesen i fast fase gjennomføres i en manuell peptidsyntese (SPPS)-reaktor av artisanal

fabrikasjon og røreverket er en Flask Shaker modell A5-6021. Utviklingen av koplingen av polyaminer til den faste fase samt utviklingen av beskyttelsen av

polyaminene i SPPS følges ved Kaiser-testen [E. Kaiser, D. L. Colescolt, CD. Bossinger og P.I. Cook, "Anal. Biochem." 34(2), 595 (1970)]. Harpiksen som benyttes i eksemplene for SPPS er "Klortritylklorid-harpiks" fra Novabiochem.

Eksempler

Eksempel 1:

Syntese av forbindelse 1 (N-dioktadecyl-karbamoylmetyl-2-{3-[4-(3-guanidino-propylamino)-butylamino]-propylamino}-acetamid) fra forbindelse RPR 120535 (hvis fremstilling er beskrevet i WO 97/18185).

Syntesetrinnet er vist i fig. 1/15.

0,784 mmol RPR 120535 oppløses i 25 ml metanol i en kolbe utstyrt med magnetrører. Man tilsetter 10,21 mmol trietylamin TEA. Deretter helles det langsomt i denne blanding (5 min.) 1,173 mmol av en oppløsning av O-metylisourea/svovelsyre H2SO4

i 9 ml vann. Etter ferdig ihelling opptrer det en uklarhet. Blandingen holdes ved 40°C

i 16 timer og deretter fordampes oppløsningen til tørr tilstand. Det oppnådde produkt blir deretter renset ved preparativ HPLC. De interessante fraksjoner slås sammen og lyofiliseres.

Man oppnår 0,157 mmol saltdannet forbindelse 1, dvs. et utbytte på 20,1 %.

HPLC analytisk: Rt= 14,94 min.

' HNMR- spektrum: (400 MHz, (CD3)2SO d6, 5 en ppm): 0,86 (t, J=7 Hz, 6H : CH3 av fettkjeder); 1,24 (mt, 60H : (CH2)15 sentral i fettkjeder); 1,43 et 1,53 (2 mts, 2H hver : 1 CH2 av hver fettkjede); 1,63 (mt, 4H : (CH2)2 sentral av butyl); 1,81 og 1,96 (2 mts, 2H hver : CH2 sentral av propylene); fra 2,85 til 3,10 og 3,22 (2 mts, 16H tilsammen : NCH2 av butyl - NCH2 av propylene og NCH2 av fettkjedene); 3,81 (s stor, 2H : NCH2CON); 4,03 (d, J=4,5 Hz, 2H : CONCH2CON av glycyl); 7,32 - 7,97 - 8,62 - 7,75 og 9,02 (respektivt mf -1 -1 - mf og mf: H tilsvarende utbyttbare protoner). MH' = 863.

Eksempel 2 :

Syntese av forbindelse 2 (2-{2-[bis-(2-guanidinoetyl)-amino]-etylamino}-N,N-dioktadecyl-acetamid) fra forbindelse RPR 120527 (hvis fremstilling er beskrevet i WO 97/18185). 48 mmol RPR 120527 oppløses i 10 ml metanol og deretter tilsettes 85 ul DIEA (10 ekvivalenter) og 32 mg l,3-bis-(tert-butoksykarbonyl)-2-metyl-2-tiopseudourea (2,3 ekvivalenter). Reaksjonen følges ved HPLC. Etter 24 timer fordampes oppløsningsmidlet og til den oppnådde rest settes 20 ml TFA : diklormetan i volumforholdet 1:1. Etter fordampning under vakuum renses resten ved preparativ HPLC. De interessante fraksjoner blandes, fryses under flytende nitrogen og lyofiliseres.

Man oppnår på denne måte 0,035 mmol forbindelse 2, dvs. et utbytte på 73 %.

HPLC analytisk: R, = 16,20 min.

' HNMR- spektrum: (400 MHz, (CD3)2SO d6, 8 en ppm): 0,9 (m : 6H : CH3) 1,2 (m : 60H : CH2) 1,6 (m : 4H : CH2CH2N) 2,7-2,9 (m : 6H : CH2N(CH2)2) 3,0 (m : 2H : CH2CH2N(CH2)2) 3,2 (m : 8H : CH2N) 3,8 (m : 4H : CH2NCOCH2N).

MH>793.

Eksempel 3 :

Syntese av forbindelse 3 (N-ditetradecyl-karbamoylmetyl-2- {3-[4-(3-guanidino-propylamino)-butylamino]-propylamino}-acetamid) fra forbindelse RPR 122766 (hvis fremstilling er beskrevet i WO 97/18185).

0,784 mmol RPR 122766 oppløses i 25 ml metanol i en kolbe utstyrt med magnetrører. Man tilsetter 10,21 mmol trietylamin TEA. Deretter helles det langsomt i (5 min.) 1,173 mmol av en oppløsning av O-metylisourea/svovelsyre H2S04 i 9 ml vann. Ved slutten av ihellingen opptrer det en uklarhet. Blandingen holdes ved 40°C i 16 timer og deretter fordampes oppløsningen til tørr tilstand. Det oppnådde produkt blir deretter renset ved preparativ HPLC. De interessante fraksjoner slås sammen og lyofiliseres.

Man oppnår på denne måte 0,2289 mmol av forbindelse 3, dvs. et utbytte på 29 %.

' H NMR- spektrum: (400 MHz, (CD3)2SO d6, 8 en ppm): 0,87 (t, J=7 Hz, 6H : CH3 av fettkjeder); 1,15 til 1,40 (mt, 44H : (CH2)n sentral i fettkjeder); 1,46 og 1,55 (2 mts, 2H hver: 1 CH2 av hver fettkjede); 1,63 (mt, 4H : (CH2)2 sentral av butyl); 1,81

og 1,95 (2 mts, 2H hver : CH2 sentral av propylene); fra 2,85 til 3,10 (mt, 10H : de 2 NCH2 av butyl - de 2 NCH2 av en av de 2 propyler og 1-2 NCH2 av den andre propyl); 3,15-3,25 (mt, 6H : av den andre NCH2 av den andre propyl og NCH2 av fettkjedene), 3,82 (mf, 2H : NCH2CON); 4,04 (d, J= 5 Hz, 2H : CONCH2CON av glycyl); fra 7,00 til 7,60 - fra 8,60 til 8,75 og 9,00 (respektivt mf bred og 2 mfs - 3H - 5H og 2H : NH3<+>CF3COO<-> - NH2<+> CFaCOO" og =NH); 7,78 (t stor, J = 5,5 Hz, 1H : N=CNH); 8,65(mf: 1H tilsvarendeCONH).

MH<+> = 751.

Eksempel 4:

Syntese av forbindelse 4 (2-{2-[bis-(2-guanidinoetyl)-amino]-etylamino} -N-ditetradecyl-karbamoyl-metylacetamid)

Trinn A: 10 molare overskudd av tris(aminoetyl)amin oppløses i 50 ml diklormetan og oppløsningen innføres i reaktoren inneholdende en bromacetyl(klor)-tritylharpiks (oppnådd på forhånd ved omsetning av bromeddiksyre med klortrityl-harpiks. Reaktoren omrøres deretter i 2 timer ved omgivelsestemperatur. Oppløsnings-midlet filtreres og harpiksen vaskes med 10 x 50 ml diklormetan og isopropanol. Kaiser-testen er positiv.

Trinn B: De oppnådde harpikser bringes i kontakt med et overskudd på 10 ekvivalenter l,3-bis-(tert-butoksykarbonyl)-2-metyl-e-tiopseudourea oppløst i diklormetan, under omrøring, i 24 timer. Oppløsningsmidlet filtreres og harpiksen vaskes med 10 x 50 ml diklormetan og isopropanol. Kaiser-testen på koldt materiale i 3 min. er negativ.

Trinn C: 50 mmol DIEA oppløses i 50 ml diklormetan og blandingen innføres i reaktoren inneholdende produktet som ble oppnådd i trinn B. Deretter helles det til 48 mmol di-tert-butyldikarbonat. Reaktoren omrøres over natten. Dagen etter er Kaiser-testen negativ. Oppløsningsmidlet filtreres og harpiksen vaskes alternativt med 10 x 50 ml diklormetan og isopropanol, 2 x 50 ml metanol og 2 x 50 ml eter, hvoretter harpiksen tørkes under en nitrogenstrøm. Kaiser-testen er fremdeles negativ.

Trinn D: Harpiksene oppnådd i trinn C innføres i en 250 ml kolbe utstyrt med magnetrører. Man tilsetter en oppløsning bestående av 50 ml diklormetan og 25 ml l,l,l-trifluoretan-2-ol, hvoretter blandingen omrøres i 2 timer. Oppløsningen filtreres og harpiksen vaskes med 2 x 10 ml diklormetan. De således oppnådde organiske faser samles og fordampes under undertrykk. Produktene renses deretter på siliciumdioksydgel og elueres med kloroform : metanol i volumforholdet 8:2. De interessante fraksjoner slås sammen og fordampes under undertrykk, og man oppnår 168 mg av en forbindelse med følgende struktur:

i et utbytte på 20 %.

CCM: Rf =0,9.

Mit = 789.

Trinn E: 9 mmol Boc-glycinyl-di-tetradecylamid innføres i en kolbe utstyrt med magnetrører. 30 ml trifluoreddiksyre tilsettes ved 4°C. Oppløsningen omrøres i 1 time og TFA fordampes under undertrykk. Det oppnådde produkt oppløses på ny ved tilsetning av 70 ml DMF og deretter tilsettes 30 mmol TEA og 90 mmol av den tidligere oppnådde syre. pH-verdien justeres til 10 og det tilsettes 33 mmol BOP. Oppløsningen omrøres i 2 timer fulgt av tynnsjiktkromatografi. Når koplingen er påvist, blir 70 ml av en kaliumsulfatoppløsning tilsatt og produktet ekstrahert med 3 x 100 ml etylacetat. Den organiske fase vaskes med 3 x 50 ml kaliumsulfat, 3 x 50 ml natriumkarbonat og 3 x 50 ml natriumklorid. Deretter tørkes det over magnesiumsulfat, filtreres og fordampes under undertrykk. Det oppnådde produkt analyseres ved NMR, tynnsjiktkromatografi og MS, og beskyttelsen fjernes med 50 ml TFA som settes til det oppnådde produkt uten forutgående rensing. Oppløsningen omrøres deretter i 1,5 time. Til slutt blir TFA fordampet og sluttproduktene renset ved semipreparativ HPLC.

Man oppnår til slutt 8,1 mmol av forbindelse 4 i et utbytte på 90 % for dette siste trinn.

HPLC-analytisk: Rt = 11,4 min.

' HNMR- spektrum: (400 MHz, (CD3)2SO d6, 5 en ppm): 0,89 (t, J=7 Hz, 6H : CH3

av fettkjedene); fra 1,15 til 1,35 (mt, 44H : (CH2)n sentral i fettkjedene); 1,45 og 1,54

(2 mts, 2H hver: 1 CH2 av hver fettkjede); 2,65 til 2,78 - 3,06 og 3,23 (respektivt t, J

= 6,5 Hz -1 stor, J = 6,5 Hz - mf og mt, respektivt 4H - 2H - 2H og 8H : NCH2CH2N

- fra 2 NCH2CH2NC=N og NCH2 fra fettkjedene); 3,83 (s stor, 2H : NCH2CON);

4,04 (d, ] = 5 Hz, 2H : CONCH2CON av glycyl); 7,34 (mf trinnet, =NH og NH2); 7,61

(t, J = 5,5 Hz, 2H : NH); 8,65 (t, J=5 Hz, 1H : NH); 8,75 (mf: NH).

MH<+> =737.

Det glycinyl-di-tetradecylamid som benyttes i trinn E oppnås på forhånd på følgende måte: 10 mmol glycin, beskyttet med substituentene Boe og 10 mmol ditetradecylamin innføres i en 250 ml kolbe. Man tilsetter 100 ml kloroform og blandingen omrøres inntil fullstendig oppløsning. Man tilsetter deretter 30 mmol TEA og 33 mmol BOP. pH-verdien holdes ved 10 ved hjelp av trietylamin. Reaksjonsblandingen omrøres i 2 timer. Når reaksjonen, fulgt av tynnsjiktkromatografi, er ferdig, blir kloroformen fordampet. Man oppnås et fast stoff som på ny oppløses i 300 ml etylacetat. Den organiske fase vaskes deretter med 4 x 100 ml kaliumsulfat, 4 x 100 ml natriumkarbonat og 4 x 100 ml natriumklorid. Deretter tørkes den organiske fase over magnesiumklorid, filtreres og fordampes under undertrykk. Det oppnådde produkt analyseres ved tynnsjiktkromatografi, NMR og MS, og benyttes uten ytterligere rensing.

Eksempel 5:

Syntese av forbindelse 5 (N-ditetradecyl-karbamoylmetyl-2-{(3-guanidinopropyl)-[4-(3-guanidino-propylamino)-butyl]-amino)-acetamid).

Man oppnår på samme måte som tidligere for forbindelse 4, men går ut fra spermin som utgangs-polyamin for derved å oppnå syren med den følgende struktur:

Etter å ha spaltet harpiksen, renses resten på siliciumdioksydgel og elueres med kloroform : metanol i volumforholdet 8:2. De interessante fraksjoner blandes og fordampes under undertrykk og man oppnår 0,69 mmol av molekylet, dvs. et utbytte på 50 %.

CCM: Rf =0,5.

MH<+> = 845.

Forbindelse 5 oppnås ved kopling mellom den tidligere syntetiserte syre og glycinyl-ditetradecylamid i henhold til den samme metode som er beskrevet i eksempel 4. Glycinyl-di-tetradecylamid oppnås også på samme måte som tidligere.

Man oppnår på denne måte 0,65 mmol forbindelse 5, dvs. et utbytte på 94 % for dette siste trinn.

HPCL-analytisk: Rt = 10,1 min.

' HNMR- spektrum: (400 MHz, (CD3)2SO d6, ved en temperatur av 393 K, 8 en ppm): 0,92 (t, J=7 Hz, 6H : CH3 av fettkjeder); 1,25 til 1,45 (mt, 44H: (CH2)„ sentral i fettkjeder); 1,57 (mt, 4H : av 2 CH2 sentral av butyl); 1,57 og 1,67 (2 mts, 2H hver : 1 CH2 sentral av fettkjedene); 1,74 og 1,91 (2 mts, 2H hver : CH2 sentral av propylen); 2,62 - 2,85 til 3,20 - 3,35 (3mts, 16H til sammen: av NCH2'ene - av CH2NC=N'ene og NCH2'ene av fettkjedene); 3,17 (s, 2H : NCH2CON); 4,02 (d, J= 5 Hz, 2H : CONCH2CON av glycyl); 6,89 til 7,30 - fra 7,55 til 7,55 (respektivt mf - mf trinnet og mf: H'ene utbyttbare).

MH<+> = 845.

Eksempel 6:

Syntese av forbindelse 6 (2-{3-[{4-[bis-(3-guanidinopropyl)-amino]-butyl}-(3-guanidinopropyl)-amino]-propylamino}-N-ditetradecyl-karbamoylmetyl-acetamid)

Man arbeider på samme måte som tidligere for forbindelsene 4 og 5, men går ut fra N,NJN',N'-(tetraaminopropyl)-butylendiamin som utgangspolyamin, for derved å oppnå syren med den følgende struktur:

Etter å ha spaltet av harpiksen, blir den oppnådde rest renset på silisiumdioksydgel og eluert med kloroform.:, metanol i volumforholdet 8:2. De interessante fraksjoner blandes og fordampes under undertrykk, og man oppnår 0,099 mmol produkt, dvs. et utbytte på 20 %.

CCM: Rf =0,3.

MIT' =1201.

Forbindelse 6 oppnås ved kopling mellom den tidligere syntetiserte syre og glycinyl-ditetradecylamid i henhold til samme metode som beskrevet i eksempel 4. Glycinyl-di-tetradecylamid oppnås likeledes på samme måte som ovenfor.

Man oppnår på denne måte 0,09 mmol forbindelse 6, dvs. et utbytte på 90 % for dette trinn.

HPCL-analytisk: Rt = 11,2 min.

<1> NMR- spektrum: (400 MHz, (CD3)2SO d6, med tilsetning av noen dråper CD3COOD d4, (8 en ppm): 0,87 (t, J=7 Hz, 6H : CH3 av fettkjeder); fra 1,20 til 1,40 (mt, 44H : (CH2)n sentral i fettkjeder); 1,45 og 1,54 (2 mts, 2H hver : 1 CH2 sentral av fettkjedene); 1,67 (mt, 4H : CH2 sentral av butyl); fra 1,80 til 2,10 (mt, 8H : CH2 central av propylene); 2,95 til 3,30 (mt, 20H : av NCH2'ene - av propylene og NCH2'ene av butyl); fra 3,15 til 3,30 (mt, 4H : fra NCH2'ene av fettkjeder); 3,84 (s, 2H : CONCH2CON); 4,05 (s, 2H : CONCH2CON av glycyl).

MH+ = 949.

Eksempel 7:

Anvendelse av forbindelse 1 for transfeksjon in vitro av genetisk materiale

Benyttet genetisk materiale:

Den benyttede nukleinsyre er plasmid pXL2774 (WO97/10343) omfattende genet som koder for luciferase under kontroll av promotoren av human cytomegalovirus (CMV).

Nukleinsyre-oppløsningen fortynnes til 20 ug/ml i fysiologisk serum (natriumklorid NaCl 0,15 M).

Transfeksionsoppløsninger (umiddelbar fremstilling)

Produktene som beskrevet ifølge oppfinnelsen bringes i oppløsning i vann ved konsentrasjoner mellom 60 og 240 uM og blandes volum for volum med DNA-oppløsningen. Den endelige saltoppløsningskonsentrasjon er 75 mM.

Transfeksjon

Cellene dyrkes under egnede betingelser på mikroplater med 24 brønner (2 cn<v>Vbrønn) og transfekteres når de er i eksponensiell vekstfase og ved 50-70 % konfluens.

Cellene vaskes med 2 x 500 ul medium berøvet seriske proteiner, og holdes under vekst i medium uten serum (transfeksjon i fravær av serum), eller i komplett medium (transfeksjon i nærvær av serum). 50 ul transfeksjonsblanding (dvs. 0,5 ug DNA/brønn) settes til cellene (3 brønner per kondisjonsvektor-DNA). Når cellene transfekteres i fravær av medium, suppleres vekstmediet med det egnede medium av serum 2 timer etter transfeksjonen.

Transfeksjonseffektiviteten bedømmes 48 timer etter transfeksjonen ved en måling av ekspresjonen av luciferase i henhold til de anbefalinger som gis for anvendelse av en Promega-kit (Luciferase Assay System). Toksisiteten for transfeksjonsblandingene anslås ved en måling av proteinkonsentrasjonene i cellelysatene.

Resultater

Forbindelse 1 benyttes som sammenligning med det kationiske lipid RPR 120535 (TFA-salt), (beskrevet i W097/18185), som vektor for DNA, for å transfektere tre forskjellige cellelinjer: NIH3T3-celler, HepG2-celler og HeLa-celler. For disse tre typer celler ble det ikke påvist noen signifikant toksisitet for forbindelse 1, hvis fremstilling er beskrevet i eksempel 1. Transfeksjonseffektiviteten for forbindelse 1 og det kationiske sammenligningslipid i de tre celletyper er vist i fig. 2/15 for et mol-forhold for forbindelsen per ug DNA mellom 3 og 12.

Fra fig. 2/15 kan man se at den maksimale transfeksjonseffektivitet oppnås for et forhold på 6 nanomol kationisk lipid/ug DNA for NIH3T3-cellen og for et forhold på 9 nanomol kationisk lipid/ug DNA for HeLa- eller HepG2-cellene. For en transfeksjon i fravær av serum er ekspresjonsnivåene som oppnås i cellene HeLa- eller HepG2 2-4 ganger høyere for forbindelse 1 enn for forbindelsen som testes som sammenligning.

Fig. 3/15 viser effektiviteten for transfeksjonen av kompleksene forbindelse 1 : DNA sammenlignet med den samme kationiske referanselipid som tidligere (RPR120535) kompleksert til DNA. De hvite stolper viser effektiviteten for transfeksjonen for nukleolipidkompleksene under fråvær av serum i 2 timer. De fylte stolper representerer transfeksjonseffektiviteten for nukleolipidiske komplekser i nærvær av serum.

Fra fig. 3/15 kan man således se en av de spesielle fordeler for overføringsmidlene ifølge oppfinnelsen. Således observerer man at transfeksjonsnivåene med eller uten seriske proteiner er de samme når det gjelder forbindelse 1 ifølge oppfinnelsen, mens man for kationisk sammenligningslipid observerer en sterk inhibering på grunn av nærværet av seriske proteiner. Dette utgjør en spesielt interessant egenskap for in vivo transfeksjoner.

Eksempel 8 : anvendelse av forbindelsene 2,3,5 og 6 for transfeksjon in vitro av genetisk materiale

Benyttet genetisk materiale:

Den benyttede nukleinsyre er plasmidet pXL3031 som bærer genet som koder for luciferase under kontroll av den humane cytomegalovirus (CMV). Plasmidet pXL3031 er vist i fig. 15/15. Dette er isolert i henhold til standard protokoller som velkjent av fagmannen og særlig i henhold til T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook, "Methods in Molecular Biology : a Laboratory Manual", 1982, sidene 83-94, Cold Spring Harbor Lab., N.Y.

Mer konkret er de benyttede metoder den alkaliske lyseringsmetode og rensing på cesiumkloirdgradient.

Transfeksjon:

Cellene dyrkes under egnede betingelser på mikroplater med 24 brønner. Etter vekst 1 natt inneholder hver brønn ca. 100.000 celler.

I hver brønn innføres transfeksjonsblandingen inneholdende 1 ug DNA i 0,5 ml DMEM, i fravær av serum. 5 timer etter transfeksjonen blir vekstmediet supplert med den egnede mengde serum (DMEM og 10 % føtalt kalveserum). Cellelysatene gjenvinnes 24 timer etter transfeksjon og transfeksjonseffektiviteten bedømmes ved måling av ekspresjonen av luciferase, i henhold til de anbefalinger som er gitt for anvendelse av en Promega-kit (Luciferase Detection Kit).

Resultater:

Transfeksjonsnivåene er vist i fig. 4/15, 5/15, 6/15 og 7/15.

Hver gang måles transfeksjonseffektiviteten for lipid i form av miceller og i blanding med et co-lipid (DOPE eller også kolesterol). Fra tabellene kan man se at transfeksjonsnivåene er meget høye, også ved meget lave ladningsforhold, med de fordelaktige konsekvenser dette har på toksisiteten. Dette utgjør en av fordelene ved oppfinnelsens forbindelser. Således er det, med de kationiske lipider som ikke inneholder noen aminfunksjoner, hyppig nødvendig å gå til meget høye ladningsforhold for å oppnå slike transfeksjonsnivåer, noe som generelt medfører en øket toksisitet.

Eksempel 9 : studie av affiniteten for forbindelsene 2,3,5 og 6 mot DNA

Den benyttede nukleinsyre er plasmidet pXL3031 som beskrevet i det forutgående eksempel.

Kompleksene fremstilles ved konsentrasjoner på 0,25 mg DNA/ml med en egnet mengde lipid som definert ifølge oppfinnelsen, i henhold til det ønskede ladningsforhold. Komplekset fremstilles i et medium inneholdende 5 % glukose og en 20 mM natriumkloridoppløsning. 50 ul nukleolipidisk kompleks fortynnes deretter 20 ganger i 950 ul oppløsning inneholdende 5 % glukose og en 20 mM natriumkloridoppløsning.

Størrelsen på kompleksene bestemmes ved å måle den hydrodynamiske diameter ved dynamisk diffusjon av lys ved hjelp av en Coulter N4+-apparatur.

For de tre forbindelser er det i henhold til ladningsforholdet påvist tre distinkte fysikokjemiske faser: - Fase A der DNA ikke er mettet med kationisk lipid, dvs. at det fremdeles foreligger nakent DNA i blandingen, noe som betyr at dette DNA ikke fullstendig er beskyttet av lipidet, og således kan være offer for nedbrytninger på grunn av enzymer. De dannede komplekser er totalt sett negativt ladet, noe som gjør passasjen gjennom cellemembraner vanskelig. Det er således foretrukket å ikke være i denne sone for transfeksjon av DNA. - Fase B der DNA fullstendig er mettet med kationisk lipid og kompleksene totalt sett er nøytrale eller lett positive. De ioniske repulsjoner er maksimale, denne fase er ustabil. Et "tverrbindings"-fenomen kan skje, noe som fører til presipitering av kompleksene. Kompleksene i denne tilstand kan således ikke benyttes ved injeksjon. - Fase C der DNA er overmettet med lipid og kompleksene totalt sett er positive. DNA er her fullstendig beskyttet av lipid og passasjen gjennom cellemembraner (totalt sett negative) er lettet. Kompleksene i C-fase er således spesielt egnet for anvendelse for overføring av nukleinsyrer til celler. Tabellene som antyder fasen i hvilken kompleksene befinner seg som funksjon av ladningsforholdet er vist i fig. 8/15, 9/15, 10/15 og 11/15. Tabellene i fig. 8/15, 9/15, 10/15 og 11/15 sammenligner fasene som funksjon av ladningsforholdene mellom forbindelsene ifølge oppfinnelsen og deres aminerte analoger, det vil si, kationiske lipider der amidin- eller guanidin-funksjonen er erstattet med en aminofunksjon. Man fastslår at fase B er forskjøvet mot langt lavere ladningsforhold. Således bidrar en innarbeiding av amidinfunksjoner i det kationiske hode til en økning av affiniteten for forbindelsene mot DNA. Dette utgjør en betydelig egenskap for forbindelsene ifølge oppfinnelsen fordi kompleksene som danner seg med DNA kan benyttes i fase C uten samtidig å befinne seg ved for høye ladningsforhold, med de fordelaktige effekter dette har på toksisiteten.

Affiniteten for forbindelsene ifølge oppfinnelsen for DNA er likeledes bedømt ved hjelp av måling av reduksjonen av fluorescens etter tilsetning av etidiumbromid. Således er substitusjonen av DNA-etidiumbromid med lipid en indikasjon på bindingen til DNA.

Således setter man til de fremstilte komplekser 4 ul av en 1 mg/ml etidiumbromid-oppløsning og måler deretter fluorescensen ved en eksitasjons-bølgelengde på 260 nm og en emmisjons-bølgelengde på 590 nm. Den oppnådde fluorescens for DNA alene er definert til 100%.

Resultatene er gitt i tabellene i fig. 12/15,13/15 og 14/15. Disse resultater antyder at forbindelsene ifølge oppfinnelsen har en meget god affinitet for DNA, noe som utgjør en spesielt interessant egenskap for forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Claims (21)

1. Lipopolyamin i D-, L- eller DL-form samt salter derav, karakterisert ved den generelle formel (I): der Ri, R2 ogR3 uavhengig av hverandre betyr et hydrogenatom eller en gruppe -(CH2)q-NRR', der q er et helt tall fra og med 1 til og med 6, idet verdiene av q er uavhengige av hverandre for de forskjellige grupper Ri, R2 ogR3, og R betyr en gruppe med formel (II): der R er hydrogen og gruppene Rs et hydrogenatom, forutsatt at minst en av gruppene Ri, R2 og R3 bærer minst en gruppe med formel (II), m og n uavhengig av hverandre betyr et helt tall fra og med 1 til og med 6, der, når n er større enn 1, m kan ha forskjellige verdier, og R3 forskjellige betydninger i den generelle formel (I), p betyr et helt tall fra og med 1 til og med 6, og R4 betyr en gruppe med den generelle formel (III): der: . RjOgRg uavhengig av hverandre betyr Ci2.22-alkyl5. t er et helt tall fra og med 0 til og med 10, . X betyr en aminogruppe, . Y betyr en karbonylgruppe, . R$ betyr et hydrogenatom, . s betyr et helt tall fra og med 1 til og med 10.

2. Forbindelser ifølge krav 1, karakterisert ved atnårRi, R2 og/eller R3 er forskjellig fra hydrogen og omfatter formel (II), har q verdien 2 eller 3.

3. Forbindelser ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at i den generelle formel (I), er m valgt blant 2, 3 og 4.

4. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at Ri bærer en gruppe med formel (II) og R2 og R3 er hydrogenatomer.

5. Forbindelse ifølge krav i, karakterisert ved atRjOg R2 hver bærer en gruppe med formel (II), og R3 er et hydrogenatom.

6. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at R] og R3 hver bærer en gruppe med formel (II), og R2 er et hydrogenatom.

7. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved atR|,R2 og R3 hver bærer en gruppe med formel (II).

8. Forbindelse ifølge kravl, karakterisert ved atdener valgt blant de følgende forbindelser der R4 og R5 har den betydning som er gitt i krav I:

9. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er valgt blant:

10. Preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge et hvilket som helst av de foregående krav og en nukleinsyre.

11. Preparat ifølge krav 10,' karakterisert ved at den i tillegg omfatter en eller flere adjuanter.

12. Preparat ifølge krav 11, karakterisert ved at adj uvanten er et eller flere nøytrale lipider.

13. Preparat ifølge krav 11 og 12, karakterisert ved at de nøytrale lipider er lipider med to fettsyrekjeder.

14. Preparat ifølge kravene 11 til 13, karakterisert ved at de nøytrale lipider er nøytrale eller syntetiske lipider, zwitterioniske eller ioneladningsberøvet under fysiologiske betingelser, for eksempel valgt blant dioleylfosfatidyl-etanolamin (DOPE), oleylpalmitoyl-fosfatidyletanolamin (POPE), di-stearoyl-, -palmitoyl-, eller -myrisotyl-fosfatidyl-etanolaminer samt deres 1-3 ganger N-metylerte derivater, fosfatidylglyceroler, diacylglyceroler, glykosyldiacylglyceroler, cerebrosider (som særlig galaktocerebrosider), sfingolipider (som særlig sfingomyeliner) eller også asialogangliosider (som særlig asialoGMl og GM2).

15. Preparat ifølge krav 11, karakterisert ved adj uvanten er en forbindelse som eventuelt direkte intervenerer i kondensasjonen av nukleinsyren.

16. Preparat ifølge kravene 11 til 13, karakterisert ved at adj uvanten helt eller delvis stammer fra et protamin, et histon eller et nukleolin og/eller et derivat derav, eller helt eller delvis består av peptidiske deler (KTPKKAKKP) og/eller (ATPAKKAA) idet antallet deler kan variere fra 2 til 10 og kan repeteres eventuelt kontinuerlig.

17. Preparat ifølge krav 10, karakterisert ved det i tillegg omfatter et målsøkingselement.

18. Preparat ifølge kravene 10 til 17, karakterisert ved at det omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer for en injiserbar formulering.

19. Preparat ifølge kravene 10 til 17, karakterisert ved at det omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer for applikasjon på huden og/eller slimhinnene.

20. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse som angitt i kravene 1 - karakterisert ved at man tildanner en amidingruppe ved innvirkning av tio- eller oksourea-derivat på et lipopolyamin, eller at man poder et polyaminoamidin til et lipid ved peptidisk kopling.

21. Anvendelse av et preparat ifølge kravene 10 til 19 for fremstilling av et medikament for behandling av en sykdom som er resultatet av en defektivitet i et protein eller et nukleinprodukt.