JP4999784B2 - トランスフェクション剤としてのリポポリアミン及びその医薬的使用 - Google Patents
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Description
R1、R2及びR3は各々独立して水素原子又は−(CH2)q−NRR’基を表し、
qはR1、R2及びR3の各基で独立して1、2、3、4、5及び6であり、
R及びR’は各々独立して水素原子又は−(CH2)q’−NH2基を表し、q’はR及びR’の各基で独立して1、2、3、4、5及び6であり、
m、n及びpは各々独立して0〜6の整数を表し、但しnが2以上のとき、mは異なる値をとることができ、R3は一般式I中で異なる意味をもち、
R4は一般式II:
R6及びR7は各々独立して水素原子又は飽和もしくは不飽和C10〜C22脂肪族基を表し、2個の基の少なくとも一方は水素以外のものであり、
uは0〜10から選択される整数であり、但しuが2以上の整数であるとき、R5、X、Y及びrは各モチーフ[X−(CHR5)r−Y]中で異なる意味をもつことができ、
Xは酸素原子、硫黄原子又はモノアルキルもしくは非モノアルキルアミン基を表し、
Yはカルボニル基又はメチレン基を表し、
R5は水素原子又は場合により置換された天然アミノ酸側鎖を表し、
rは1〜10の整数を表し、但しrが1であるとき、R5は天然アミノ酸側鎖を表し、rが2以上であるとき、R5は水素原子を表す]により表されることを特徴とするD、L又はDL形リポポリアミン及びその塩を提供することである。
Arg−Gly−Aspを含む直鎖又は環状ペプチド又はプソイドペプチド配列でもよい。
AcOEt:酢酸エチル
BOC:t−ブトキシカルボニル
BOP:ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
DCC:ジシクロヘキシルカルボジイミド
DCU:ジシクロヘキシル尿素
DMAP:4−ジメチルアミノピリジン
DMF:ジメチルホルムアミド
DMSO:ジメチルスルホキシド
DODA:ジオクタデシルアミン
EP:石油エーテル
EtOH:エタノール
NEt3:トリエチルアミン
Rf:前端保持率
TFA:トリフルオロ酢酸
THF:テトラヒドロフラン
TMS:テトラメチルシラン
UV:紫外線
SPPS:固相ペプチド合成
HPLC:高圧液体クロマトグラフィー
Z:ベンジルオキシカルボニル
ClZ:p−クロロベンジルオキシカルボニル
A−化学合成用材料及び方法
1.材料
a)化合物
−出発ポリアミンは例えばスペルミジン、スペルミン、トリス(2−アミノエチル)アミン、フェニレンジアミン、ジアミノエタン(プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン等)等の市販品でもよいし、分枝鎖ポリアミン製造用として市販されている例えばジアミノエタン(プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン等)、アミン、スペルミジン、スペルミン等のアミンの完全なシアノエチル化により常法で合成してもよい。
−アルキル化剤はアルキル化方法に応じて次のように選択される。慣用アルキル化にはブロモ酢酸、ω−ハロゲノカルボン酸を使用し、還元アルキル化にはω−アルデヒドカルボン酸(例えばグリオキサル酸、コハク酸準アルデヒド等)又はケト酸(例えばアセト酢酸又はピルビン酸等)を使用する。
−使用するポリマーは固相ペプチド合成(メリフィールド合成)用に市販されている樹脂、例えば遊離酸基をもつ生成物を提供するO−クロロトリチルクロリド樹脂、HMP樹脂や、Rink型樹脂である。ポリアミノ酸は、固相で予備合成したブロモアルキル基をもつペプチド又はω−アルデヒド酸で直接合成することができる。
−Aldrich製品ジオクタデシルアミン、トリエチルアミン、トリフルオロ酢酸、BOP、DMAP、クロロギ酸ベンジルは市販品である。NaCl及びNaHCO3溶液は飽和溶液であり、KHSO4溶液は0.5Mである。
b)物理的測定
陽子NMRスペクトルはBruker 400スペクトロメーターで600MHzで記録した。
c)クロマトグラフィー技術
HPLC分析はMerck−Hitachi装置にオート
サンプラーAS−2000A、インテリジェントポンプL−6200A及び紫外−可視検出器L−4000を取り付け、分析用分離には220nm、分取用分離には235nmの波長に調節して実施した。分析用分離カラムはPerkin−Elmer製BU−300 aquapore Butyl 7m,300A 300×4.6mmカラムを使用し、分取用分離カラムはBiorad製Biosil C18 HL 90−10 250×10mmカラムを使用した。移動相はH2O(0.1%TFA)及びアセトニトリル(0.1%TFA)である。分析用分離流速は1ml/min、分取用分離流速は4ml/minに調節する。
d)固相合成SPPS法
固相合成は手動製造用SPPSペプチド合成用手動反応器で実施し、撹拌機はFlask Shaker モデルA5−6021である。SPPSでポリアミンの固相結合及びポリアミンの保護後にKaiser試験を行う[Kaiser,E.,Colescolt,D.L.,Bossiner,C.D.及びCook,P.I. Anal.Biochem.34(2),595(1970)]。実施例でSPPSに使用した樹脂はスイス、NOVABIOCHEM製クロロトリチルクロリド樹脂である。
2.一般操作方法
a)(N,N,N’,N’−テトラアミノプロピル)−1−4−ジアミノブタンの製造により例示する対称ポリアミンの合成
2リットル容三頚丸底フラスコに1−4−ジアミノブタン147gと脱イオン水1000mlを仕込む。溶液を磁気撹拌する。温度を38℃に維持しながら等圧フラスコによりアクリロニトリル443gを1時間かけて加える。次いで還流冷却器を取り付け、1時間かけて混合物を水浴で80℃まで昇温させる。フルオレサミン試験は陰性であり、過剰のアクリロニトリルを40℃で減圧蒸発させる。
b)方法A:酸基のポリマー支持体固定
クロロトリチルクロリド樹脂(5g、1.2mmol Cl/g樹脂)をSPPS反応器に仕込み、CH2Cl2 50mlを加え、混合物を5分間撹拌する。ブロモ酢酸(1.05g、7mmol)、次いでDIEA(0.95ml,7.5mmol)を加える。反応器を周囲温度で2時間撹拌する。液体を濾過し、樹脂をCH2Cl2とiPrOH(10×50)及びMeOH(2×50ml)で洗浄する。最後に樹脂を窒素流下に乾燥する。
c)方法B:ポリアミンとブロモアセチル樹脂の反応
ポリアミン(10モル倍)をCH2Cl2 50mlに溶かし、方法Aにより得られた生成物を収容する反応器に加える。反応器を周囲温度で2時間撹拌する。溶媒を濾過し、樹脂をCH2Cl2とiPrOH(10×50ml)で洗浄すると、Kaiser試験は陽性である。
d)樹脂上のポリアミノ酸の保護
方法C:
ジ−tert−ブチルジカーボネート(48mmol)とDIEA(50mmol)をCH2Cl2(50ml)に溶かし、方法Bにより得られた生成物を収容する反応器に加える。反応器を一晩撹拌する。翌日、Kaiser試験は陰性である。溶媒を濾過し、樹脂をCH2Cl2とiPrOH(10×50ml)、MeOH(2×50ml)及びエーテル(2×50ml)で交互に洗浄する。樹脂を窒素流下に乾燥する。Kaiser試験は依然として陰性である。
方法D:
方法Bにより得られた樹脂(1.5g)を丸底フラスコに入れ、CH2Cl2(20ml)、次いでDIEA(20mmol)を加える。混合物を磁気撹拌し、クロロギ酸ベンジル(14mmol)を5分間かけて滴下する。pHはDIEAを加えて11に維持する。一晩後、樹脂をSPPS反応器に移し、濾過し、CH2Cl2とiPrOH(10×20ml)及びエーテル(2×20ml)で交互に洗浄する。樹脂を窒素流下に乾燥する。
e)方法E:樹脂からの保護ポリアミノ酸の分離
磁気棒を備える250ml容丸底フラスコに、方法C及びDにより得られた樹脂を加える。CH2Cl2 50mlとCF3CH2OH 25mlからなる溶液を加え、混合物を2時間撹拌する。溶液を濾過し、樹脂をCH2Cl2(2×10ml)で洗浄し、こうして得られた有機相を集めて減圧蒸発させる。次に、CHCl3/MeOH(9:1)を溶離剤としてSiO2上でフラッシュクロマトグラフィーにより生成物を精製する。生成物を含むフラクションをTLCにより同定する。(詳細については下記実施例参照。)
f)方法F:アミノ酸とジリピジルアミンの結合
Boc−アミノ酸(10mmol)とC12〜C22ジリピジルアミン(10mmol)を250ml容丸底フラスコに加える。CHCl3(100ml)を加え、完全に溶解するまで混合物を撹拌する。次いでTEA(30mmol)とBOP(33mmol)を加える。TEAを加えてpHを10に維持し、反応物を2時間撹拌する。反応の完了後(TLC)、クロロホルムを蒸発させ、固形分を酢酸エチル(300ml)にとる。有機相をKHSO4(4×100ml)、NaHCO3(4×100ml)及びNaCl(4×100ml)で洗浄する。有機相をMgSO4で乾燥し、濾過し、減圧蒸発させる。生成物をTLC、NMR及びMSにより分析し、精製せずに使用する。収率は約90%である。
g)保護ポリアミノ酸とジリピジルアミド酸の結合と、Boc及びZ保護基の分離
方法G:
方法Fにより得られた生成物(9mmol)を磁気棒を備える丸底フラスコに入れ、冷TFA(4℃)を加える(30ml)。溶液を1時間撹拌する。TFAを減圧蒸発させる。DMF(70ml)を加えて生成物を溶かす。TEA(30mmol)を加えた後、方法Eにより得られた保護ポリアミノ酸(9mmol)を加える。pHを10に調整し、BOP(33mmol)を加える。溶液を2時間撹拌後、TLCを行う。結合の完了後(TLC)、KHSO4溶液(700ml)を加え、生成物を酢酸エチル(3×100ml)で抽出する。有機相をKHSO4(3×50)、NaHCO4(3×50)及びNaCl(3×50ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、減圧蒸発させる。生成物をNMR、TLC及びMSにより分析し、予備精製せずに脱保護する。TFA(50ml)を生成物に加え、溶液を1.5時間撹拌し、TFAを蒸発させる。生成物がTFAで分離可能なZ又はClZ基をまだ含んでいる場合には、方法Hを直接実施する。最終生成物を準分取HPLCにより精製する(実施例参照)。
方法H:
方法Gにより得られた生成物がZ又はClZ基を含んでいる場合には、磁気棒を備える丸底フラスコに入れ、10ml MeOH/g生成物に溶かす。Pd/C(10%、1g/g生成物)とギ酸アンモニウム(1g/g生成物)を周囲温度で加える。HPLCにより水素化を行う。2時間後に反応を終了し、混合物を濾過し、濾渣をMeOH 10mlで洗浄する。軟蒸留水を加え、溶液を凝固させ、凍結乾燥する。最終生成物を分取HPLCにより精製する。
h)方法I:Boc保護基の脱保護
丸底フラスコ中のBoc基(1mmol)を含む生成物にトリフルオロ酢酸(50ml)を加える。溶液を1.5時間撹拌し、TFAを蒸発させる。アミンを完全に脱保護し、精製せずに結合に使用する。
B−生物学的試験材料及び方法
1.in vitro遺伝子導入に使用したプラスミド
プラスミドpCMV−LUCは、ベクタープラスミドpcDNA3(Invitrogen)から抽出したヒトサイトメガロウイルス(CMV)のプロモーターを含むMlu I−Hind IIIフラグメントの挿入により、プラスミドpGL2−Basic Vector(Promega)又はプラスミドpGL2−Control Vector(Promega)から誘導される構築物である。
2.トランスフェクションに使用した溶液の調製プロトコール
本発明に記載する生成物はエタノール又は水に20mMに溶かした後、最終エタノール濃度が10%未満となるように水で希釈する。
C−in vivoアッセイ材料
1.材料
a)実験モデル:
−雌成体(>8週)マウスC57/BL6。
−腫瘍フラグメントを脇腹の皮下に移植して動物間で継代することにより得られる3LL(ルイス肺癌)型腫瘍。
b)使用したプラスミド:
pXL2622:ルシフェラーゼをコードする遺伝子の上流にpCDNA3(Invitrogen)から抽出したサイトメガロウイルス(CMV)のプロモーターを挿入することにより、基本プラスミドpGL2(Promega)から誘導される。このプラスミドはPEG沈殿法(Ausubel)により得られ、 DNA約10μg/μlの濃度で4℃で10mM Tris,1mM EDTA,pH8中に保存する。
2.プロトコール
注射溶液:まずトランスフェクトしようとするDNAを緩衝液に可溶化した後、配列番号1のペプチド(KTPKKAKKP)2を加え、20分後に高濃度(20又は40mM)のカチオン脂質溶液を混合物に加える。全生成物の添加後、混合物はDNA(最終濃度0.5mg/ml)、ペプチド(0.75mg/ml)及びカチオン脂質以外に、150mM NaCl、5% D−グルコース及び5mM MES,pH6.2を含有している。溶液の調製から20〜30分後に注射を行う。
H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2(6)の合成
a−{Boc−[3−(Boc−{4−[Boc−(3−Boc−アミノプロピル)アミノ]ブチル}アミノ)プロピル]アミノ}酢酸(3)の合成
方法Aにより得られた樹脂を方法B、C及びEによりスペルミンと反応させる。保護生成物をSiO2上でクロマトグラフィーにより精製する。収率は40%である。
TLC:Rf=0.32(CHCl3/MeOH,9:1)。
HPLC,Rt=4.22分(H2O/MeCN:3分[40/60]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6にCD3COOD d4数滴を滴下,d(ppm)):1.40(4s,36H:C(CH3)3); 1.46(mt,4H:ブチルの中心のCH2CH2); 1.64及び1.74(2mt,各2H:プロピルの中心のCH2); 2.96(t,J=7Hz,2H:CH2NCOO); 3.15(mt,8H:CH2NCH2); 3.23(t,J=7.5Hz,2H:CH2NCOO); 3.83(s,2H:OCONCH2COO)。
MH+:661。
b−{Z−[3−(Z−{4−[Z−(3−Z−アミノプロピル)アミノ]ブチル}アミノ)プロピル]アミノ}酢酸(4)の合成
方法Aにより得られた樹脂を方法B、C及びDによりスペルミンと反応させる。保護生成物をSiO2上でクロマトグラフィーにより精製する。収率は20%である。
TLC:Rf=0.85(CHCl3/MeOH,8:2)。
HPLC,Rt=6.92分(H2O/MeCN:3分[40/60]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6,温度413K,d(ppm)):1.49(mt,4H:ブチルの中心のCH2CH2); 1.74及び1.81(2mt,各2H:プロピルの中心のCH2); 3.07(q,J=7Hz,2H:CH2NCOOベンジル); 3.15−3.30(mt,8H:CH2NCH2); 3.33(t,J=7.5Hz,2H:NCH2COO); 3.70(s,2H:OCONCH2COO); 5.07,5.10,5.12及び5.13(4s,各2H:ArCH2OCON); 6.65(mf,1H:NHCO); 7.25−7.40(mt,20H:芳香族H)。
MH+:797。
c−Boc−Gly−ジオクタデシルアミド(5)
方法FによりBoc−Glyをジオクタデシルアミンに結合する(収率90%)。
TLC:Rf=0.9(CHCl3/MeOH,9:1)。
MH+:679。
1HNMRスペクトル(300MHz,CDCl3,d(ppm)):0.89(t,J=7Hz,6H:CH3); 1.29(mt,60H;脂肪鎖の中心のCH2); 1.49(s,9H:C(CH3)3); 1.55(mt,4H;各脂肪鎖の1CH2); 3.15及び3.33(2t,J=7.5Hz,各2H:脂肪鎖のNCH2); 3.95(d,J=5Hz,2H:OCONCH2CON); 5.57(mf,1H:CONH)。
d−H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)18]2(6)
生成物(3)と(5)又は(4)と(5)を方法Gにより結合する。生成物をBoc保護生成物は方法G、Z保護生成物は方法Hに記載したように脱保護する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションをHPLCにより分析する。
HPLC,Rt=15.35分(H2O/MeCN:3分[40/60]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
BYK20531HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6にCD3COOD d4数滴を滴下,温度300K,d(ppm)):0.83(t,J=7Hz,6H:CH3); 1.23(mt,60H:脂肪鎖の中心のCH2); 1.43及び1.53(2mt,各2H:各脂肪鎖の1CH2); 1.63(m,4H:ブチルの中心のCH2CH2); 1.96(mt,4H:プロピルの中心のCH2); 2.93,3.00及び3.22(3mt,合計16H:NCH2); 3.83(s,2H:NCH2CON); 4.03(s,2H:CONCH2CON)。
MH+:821。
H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CON[(CH2)18]2(7)の合成
生成物(3)を方法Fによりジオクタデシルアミンと結合し、方法Gにより脱保護する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションをHPLCにより分析する。
HPLC,Rt=15.2分(H2O/MeCN:3分[40/60]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
1HNMRスペクトル(400MHz,CF3COOD 2/3とCD3COODd4 1/3の混合物中,d(ppm)):0.78(t,J=7Hz,6H:CH3); 1.20(mt,60H:脂肪鎖の中心のCH2); 1.52(mt,4H:各脂肪鎖の1CH2); 1.80(mt,4H:ブチルの中心のCH2CH2); 2.23及び2.32(2mt,各2H:プロピルの中心のCH2); 3.10−3.40(3mt,合計16H:NCH2); 4.15(s,2H:NCH2CON)。
MH+:764。
H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)18]2(9)の合成
a−Boc−Arg(Z2)ジオクタデシルアミド(8)
本生成物は、方法FによりBocArg(Z2)とジオクタデシルアミンを結合して合成する(収率91%)。
TLC:Rf=0.9(CHCl3/MeOH,9:1)。
MH+:1046。
b−H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)18]2(9)
生成物(3)又は(4)を方法Gにより生成物(8)と結合し、方法G(Boc)及び/又はH(Z)により脱保護する。最終生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションを分析HPLCにより分析する。
HPLC,Rt=13.83分(H2O/MeCN:3分[40/60]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6,d(ppm))):0.90(t,J=7Hz,6H:CH3);1.28(mt,60H:脂肪鎖のCH2);1.40−1.80(mt,12H:CH2);1.93(m,4H:プロピルの中心のCH2);2.80−3.10(3mt,16H:NCH2及び脂肪鎖のNCH2);3.42(mt,2H:アミドのCH2N);3.77(mt,2H:NCH2CON);4.67(mt,1H:NCHCON);6.80−7.50(広幅mf,2H:NH2);7.78,7.92,8.80及び9.03(夫々mt及び3mf、夫々1H,2H,4H及び1H:CONH,NH及びNH2)。MH+:920。
H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArg(Z)2N[(CH2)17CH3]2(10)の合成
生成物(3)を方法Gにより生成物(8)と結合し、同一方法によりBoc基を分離する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションを分析HPLCにより分析する。
HPLC,Rt=17.75分(H2O/MeCN:3分[40/60]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO,d(ppm)):0.87(t,J=7Hz,6H:CH3);1.25(mt,60H:脂肪鎖の中心のCH2);1.40及び1.57(2mt,各2H:各脂肪鎖の1CH2);1.65(mt,8H:ブチルの中心のCH2CH2);1.95(mt,4H:プロピルの中心のCH2);2.85−3.05(mt,合計14H:NCH2);3.23(t,J=7.5Hz,2H:NCH2);3.75(s,2H:NCH2CON);3.85及び3.95(2mt,各1H:CH2NC);4.67(mt,1H:CONCHCON);5.07及び5.25(夫々限界AB及びs,J=13.5Hz,各2H:NCOOCH2Ar);7.25−7.45(mt,10H:芳香族H);7.95,8.85,9.90及び9.20(4mf:互換H)。
MH+:1188。
H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(ローダミン)N[(CH2)17CH3]2(13)の合成
a−Boc−Lys(Z)ジオクタデシルアミド(11)
本生成物は、方法FによりBocLys(ClZ)をジオクタデシルアミンと結合することにより合成した(収率89%)。
TLC:Rf=0.92(CHCl3/MeOH,9:1)。
MH+:918。
b−BocHN(CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBocCH2COLys(ClZ)N[(CH2)17CH3]2(12)
(Bocを脱保護せずに)生成物(3)を方法Gにより生成物(11)に結合する。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6,温度423K,d(ppm)):0.92(t,J=6.5Hz,6H:CH3);1.32(mt,60H:脂肪鎖の中心のCH2);1.44(2s,合計36H:C(CH3)3);1.50−1.80(mt,16H:各脂肪鎖の1CH2,ブチルの中心のCH2CH2,CH2CH2CH2及びプロピルの中心のCH2);3.00(q,J=6.5Hz,2H:OCONCH2);3.05(q,J=6.5Hz,2H:CH2NCOO);3.15−3.40(mt,14H:脂肪鎖のNCH2,CH2NCH2及びCH2NCH2CH2N);3.80(s,2H:OCONCH2CON);4.75(mt,1H:CONCHCON);5.15(s,2H:NCOOCH2Ar);5.97及び6.53(2mt,各1H:OCONH及びNHCOO);7.08(d,J=7.5Hz,1H:CONH);7.30−7.50(mt,4H:芳香族H)。
c−H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(ローダミン)N[(CH2)17CH3]2(13)
生成物(12)のリジン上のClZ基を方法Hにより分離し、こうして得られた生成物を減圧乾燥し、エーテルにとり、NaHCO3とNaClで濯ぐ。エーテルをMgSO4で乾燥し、減圧蒸発させる。
TLC:Rf=0.05(MeOH)。
HPLC(準分取),Rt=61.55分(H2O/MeCN:3分[100/0]、3〜45分[0/100]、45〜140分[0/100])。
MH+:1335。
H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(ビオチニル)N[(CH2)17CH3]2(14)の合成
生成物(12)を方法Hにより脱保護し(271mg,0.21mmol)、DMF(10ml)に溶かす。DIEA(0.11ml)を加えた後、ビオチン(56.4mg,0.23mmol)とBOP(102mg,0.23mmol;pHは10(DIEA)に維持)を加え、反応の終了をフルオレサミン試験により確認する。生成物を方法Fに記載したように回収し、精製せずにTFA(5ml)で1時間脱保護する。TFAを蒸発させ、生成物を準分取HPLCにより精製する(収率50%)。
HPLC,Rt=13.12分(H2O/MeCN:3分[40/60]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:1118。
{H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2(16)の合成
a−{BocNH(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NHBoc}(CH2)3NBocCH2COOH(15)
生成物(1)を方法Bによりポリマーに固定し、方法Cにより保護し、方法Eにより樹脂から分離する。生成物をSiO2上で精製する(収率35%)。
TLC:Rf=0.2(CHCl3/MeOH,8:2)。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6にCD3COOD d4数滴を滴下,温度433K,d(ppm)):1.42(s,36H:C(CH3)3);1.56(mt,4H:ブチルの中心のCH2CH2);1.65−1.85(mt,8H:プロピルの中心のCH2);2.76(mt,12H:CH2N(CH2)2);3.06(t,J=6.5Hz,6H:OCONCH2);3.29(mt,2H:NCH2);3.86(s,2H:OCONCH2COO)。
MH+:775。
b−{H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2(16)
生成物(15)を方法Gにより生成物(5)と結合する。生成物を方法Gにより脱保護し、準分取HPLCにより精製し、フラクションを分析HPLCにより分析し、凍結乾燥する(収率55%)。
HPLC(準分取),Rt=38.72分(H2O/MeCN:10分[100/0]、10〜45分[0/100]、45〜140分[0/100])。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6,温度386K,d(ppm)):0.90(t,J=7Hz,6H:CH3);1.30(m,60H:脂肪鎖の中心のCH2);1.55(mt,4H:各脂肪鎖の1CH2);1.65(mt,4H:ブチルの中心のCH2CH2);1.97(mt,8H:プロピルの中心のCH2);2.80−3.05,3.06及び3.28(夫々mt及び2t,J=7.5Hz,18H,2H及び4H:NCH2);3.80(s,2H:NCH2CON);4.03(d,J=5.5Hz,2H:CONCH2CON);6.00−9.00(広幅mf:NH2及びNH);8.27(mt,1H:CONH)。
MH+:935。
{H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2CON[(CH2)17CH3]2(17)の合成
(3)の代わりに生成物(15)を使用することにより生成物(7)と同様に合成する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションを分析HPLCにより分析し、凍結乾燥する。
HPLC(準分取),Rt=38分(H2O/MeCN:10分[100/0]、10〜45分[0/100]、45〜140分[0/100])。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6にCD3COOD d4数滴を滴下,d(ppm)):0.88(t,J=7Hz,6H:CH3);1.29(mt,60H:脂肪鎖の中心のCH2);1.52(mt,4H:各脂肪鎖の1CH2);1.68(mt,4H:ブチルの中心のCH2CH2);1.90−2,10(mt,8H:プロピルの中心のCH2);2.90,2.95−3.15,3.18及び3.15(夫々t,mt及び広幅2t,J=7.5Hz,合計24H:NCH2);4.02(s,2H:NCH2CON)。
MH+:878。
{H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2(19)の合成
a−{BocNH(CH2)2}2N(CH2)2NBocCH2COOH(18)
生成物(1)の代わりにトリス(アミノエチル)アミンを使用することにより生成物(15)と同様に合成する(収率29%)。
TLC:Rf=0.55(CHCl3/MeOH,8:2)。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6,温度393K,d(ppm)):1.44(s,27H:C(CH3)3);2.58(t,J=6.5Hz,4H:CH2NCH2);2.66(t,J=7Hz,2H:NCH2);
3.04(q,J=6.5Hz,4H:OCONCH2);
3.28(t,J=7Hz,2H:OCONCH2);
3.76(s,2H:OCONCH2COO);6.06(mf,2H:CONH)。
MH+:505。
b−{H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2(19)
(15)の代わりに(18)を使用することにより生成物(17)と同様に合成する(収率65%)。
HPLC,Rt=122分(H2O/MeCN:10分[100/0]、10〜45分[0/100]、45〜140分[0/100])。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6にCD3COOD d4数滴を滴下,d(ppm)):0.87(t,J=7Hz,6H:CH3);1.15−1.35(mt,60H:脂肪鎖の中心のCH2);1.45及び1.55(2mt,各2H:各脂肪鎖の1CH2);2.64(t,J=5.5Hz,4H:CH2NCH2);2.75(t,J=6Hz,2H:NCH2);2.95(t,J=5.5Hz,4H:NCH2);3.08(t,J=6Hz,2H:NCH2);3.25(mt,4H:脂肪鎖のNCH2); 3.88(s,2H:NCH2CON);4.06(d,J=5Hz,2H:CONCH2CON);7.75(残留広幅mf:NH);8.68(残留t,J=5Hz:CONH)。
MH+:765。
{H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2CON[(CH2)17CH3]2(20)の合成
(5)の代わりにジオクタデシルアミンを使用することにより生成物(19)と同様に合成する(収率73%)。
HPLC,Rt=100.1分(H2O/MeCN:10分[100/0]、10〜45分[0/100]、45〜140分[0/100])。
MH+:708。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLysN[(CH2)17CH3]2(21)(RPR127888A)の合成
生成物(12)を方法H(Cl−Z)、次いで方法Iにより脱保護する。最終生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションを分析HPLCにより分析する。
HPLC,Rt=11.76分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:892。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6,温度393K,d(ppm)):0.91(t,J=7Hz,6H:脂肪鎖のCH3);1.31(mt,60H:脂肪鎖の中心の(CH2)15);1.35−1.75(mt,10H:各脂肪鎖の1CH2,リシルの中心の(CH2)3);1.75(mt,4H:ブチルの中心の(CH2)2);2.00(mt,4H:プロピルの中心のCH2);2.82,2.98,3.06及び3.10−3.50(夫々2t,mt及び2mf、J=7Hz,合計18H:リシルのNCH2,ブチルのNCH2,プロピルのNCH2及び脂肪鎖のNCH2);3.62(s,2H:NCH2CON);4.73(q,J=7Hz,1H:リシルのCONCHCON);8.18(d,J=7Hz,1H:リシルのCONH)。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(Cl−Z)N[(CH2)17CH3]2(22)(RPR122759A)の合成
生成物(12)を方法Iにより脱保護する。最終生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションを分析HPLCにより分析する。
HPLC,Rt=16.79分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:1060。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6,温度373K,d(ppm)):0.91(t,J=7Hz,6H:脂肪鎖のCH3);1.31(mt,60H:脂肪鎖の中心の(CH2)15);1.30−1.75(mt,10H:各脂肪鎖の1CH2,リシルの中心の(CH2)3);1.72(mt,4H:ブチルの中心の(CH2)2);1.95(mt,4H:プロピルのCH2);2.98,3.06及び2.90−3.50(夫々2mt及びmf,合計18H:リシルのNCH2,ブチルのNCH2,プロピルのNCH2及び脂肪鎖のNCH2);3.59(s,2H:NCH2CON);4.75(q,J=7Hz,1H:リシルのCONCHCON);5.16(s,2H:COOCH2Ar);6.85(mf,1H:OCONH);7.35−7.55(mt,5H:芳香族H);8.15(mf,1H:リシルのCONH)。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(CHO)N[(CH2)17CH3]2(24)(RPR122760A)の合成
a−NHBoc(CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBocCH2COLysN[(CH2)17CH3]2(23)
生成物(12)を方法H(Cl−Z)により脱保護し(収率65%)、精製せずに使用する。
HPLC,Rt=20.82分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
b−NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(CHO)N[(CH2)17CH3]2(24)
生成物(23)を方法Gによりギ酸と結合する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションを分析HPLCにより分析する。
HPLC,Rt=13.60分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:920。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6,温度383K,d(ppm)):0.92(t,J=7Hz,6H:脂肪鎖のCH3);1.31(mt,60H:脂肪鎖の中心の(CH2)15);1.35−1.70(mt,10H:各脂肪鎖の1CH2,リシルの中心の(CH2)3);1.73(mt,4H:ブチルの中心の(CH2)2);1.98(mt,4H:プロピルのCH2);2.85−3.50(mt,18H:リシルのNCH2,ブチルのNCH2,プロピルのNCH2及び脂肪鎖のNCH2); 3.62(s,2H:NCH2CON);4.75(mt,1H:リシルのCONCHCON);7.60(mf,1H:CONH);8.05(広幅s,1H:アルデヒドのCH);8.18(mf,1H:リシルのCONH)。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys[コレステリル]N[(CH2)17CH3]2(25)(RPR128142A)の合成
(BOP試薬を使用せずに)生成物(23)を方法Gによりクロロギ酸コレステリルと結合する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションを分析HPLCにより分析する。
HPLC,Rt=21.66分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:1304。
1HNMRスペクトル(600MHz,(CD3)2SO d6,d(ppm)):0.68及び0.98(2s,各3H:コレステリルの18位CH3及び19位CH3);0.86(mt,12H:脂肪鎖のCH3並びにコレステリルの26及び27位CH3);0.91(d,J=7Hz,3H:コレステリルの21位CH3);1.31(mt,60H:脂肪鎖の中心の(CH2)15);0.80−2.30(mt,42H:各脂肪鎖の1CH2,コレステリルの1、2、4、7、11、12、15、16、22、23及び24位のCH2,コレステリルの8、9、14、17、20及び25位のCH,リシルの中心の(CH2)3並びにプロピルのCH2);1.65(mt,4H:ブチルの中心の(CH2)2);2.88及び2.96(2mt,合計14H:リシルのNCH2,ブチルのNCH2,プロピルのNCH2);3.20−3.50(mt,4H:脂肪鎖のNCH2);3.64(s,2H:NCH2CON);4.23(mt,1H:コレステリルの3位CH);4.63(mt,1H:リシルのCONCHCON);5.30(mt,1H:コレステリルの6位CH);6.98(mt,1H:NHCOO);7.90(mt,1H:リシルのCONH);8.60−9.01(互換mf)。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys[アラキドニル]N[(CH2)17CH3]2(26)(RPR130605)の合成
生成物(23)を方法Gにより窒素流下で遮光下にアラキドン酸と結合する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションを分析HPLCにより分析する。
HPLC,Rt=20.67分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:1177。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6にCD3COOD d4数滴を滴下,温度393K,d(ppm)):0.90(t,J=7Hz,6H:脂肪鎖のCH3); 0.91(t,J=7Hz,3H:アラキドニルのCH3);
1.31(mt,60H:脂肪鎖の中心の(CH2)15);
1.35−1.75(mt,18H:各脂肪鎖の1CH2,アラキドニルの中心の(CH2)3,アラキドニルの中心のCH2及びリシルの中心の(CH2)3);1.75(mt,4H:ブチルの中心の(CH2)2);2.02(mt,4H:プロピルのCH2);2.10(mt,6H:COCH2及びアラキドニルの2個の=CCH2);2.80,2.97,3.06及び3.10−3.50(夫々mt,t,mt及び2mf,J=7Hz,合計24H:アラキドニルの=CCH2C=,リシルのNCH2,ブチルのNCH2,プロピルのNCH2及び脂肪鎖のNCH2);3.62(s,2H:NCH2CON);4.73(dd,J=8及び5Hz,1H:リシルのCONCHCON);5.38(mt,8H:アラキドニルのCH=CH)。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGluN[(CH2)17CH3]2(28)(RPR126097A)の合成
a−Boc−Glu(O−Bz)−ジオクタデシルアミン(27)
本生成物は方法FによりBoc−Glu(OBz)とジオクタデシルアミンを結合して合成する(収率90%)。
TLC:Rf=0.88(CHCl3/MeOH,9:1)。
b−NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGluN[(CH2)17CH3]2(28)
生成物(3)又は(4)を方法G、次いで方法H(Cl−Z脱保護)により生成物(27)と結合する。最終生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションを分析HPLCにより分析する。
HPLC,Rt=14.64分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:893。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6,温度383K,d(ppm)):0.90(t,J=7Hz,6H:脂肪鎖のCH3);1.30(mt,60H:脂肪鎖の中心の(CH2)15);1.56(mf,4H:各脂肪鎖の1CH2);1.60−2.00(mt,2H:グルタリルの中心のCH2);1.73(mt,4H:ブチルの中心のCH2)2);1.98(mt,4H:プロピルのCH2);2.32(t,J=7Hz,2H:グルタリルのCOCH2);3.00,3.06及び3.45(夫々t及び2mt,J=7Hz,合計16H:ブチルのNCH2,プロピルのNCH2及び脂肪鎖のNCH2);3.65(広幅s,2H:NCH2CON);4.85(mt,1H:グルタリルのCONCHCON);8.19(広幅s,1H:グルタリルのCONH)。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlu(O−Bz)N[(CH2)17CH3]2(29)(RPR123027A)の合成
生成物(3)を方法Gにより生成物(27)と結合し、脱保護(Boc)する。最終生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションを分析HPLCにより分析する。
HPLC,Rt=16.02分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:983。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6,温度413K,d(ppm)):0.89(t,J=7Hz,6H:脂肪鎖のCH3);1.30(mt,60H:脂肪鎖の中心の(CH2)15);1.55(mf,4H:各脂肪鎖の1CH2);1.72(mt,4H:ブチルの中心の(CH2)2);1.75−2.00(mt,2H:グルタリルの中心のCH2);1.99(mt,4H:プロピルのCH2);2.47(t,J=7Hz,2H:グルタリルのCOCH2);2.95,3.05及び3.40(3mt,合計16H:ブチルのNCH2,プロピルのNCH2及び脂肪鎖のNCH2);3.62(広幅s,2H:NCH2CON);4.85(mt,1H:グルタリルのCONCHCON);5.14(限界AB,J=12Hz,2H:ベンジルのCH2);7.35(mt,5H:ベンジルの芳香族H);8.23(mf,1H:グルタリルのCONH)。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlu(ガラクトサミド)N[(CH2)17CH3]2(31)(RPR130596A)の合成
a−BocNH(CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBocCH2COGluN[(CH2)17CH3]2(30)
生成物(3)を生成物(27)に結合し、側鎖のOBz保護基を方法H(Cl−Z)により分離し、精製せずに使用する。
HPLC,Rt=22.84分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:1293。
b−NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlu(ガラクトサミド)N[(CH2)17CH3]2(31)
生成物(30)を方法Gにより塩酸D(+)−ガラクトサミンと結合する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションを分析HPLCにより分析する。
HPLC,Rt=13.71分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:1054。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlu(ガラクトサミド)N[(CH2)17CH3]2(32)(RPR130595A)の合成
生成物(30)を方法Gにより塩酸D(+)−ガラクトサミンと結合する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションを分析HPLCにより分析する。
HPLC,Rt=12.27分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:1054。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlu(マンノサミド)N[(CH2)17CH3]2(33)(RPR130598A)の合成
生成物(30)を方法Gにより塩酸D(+)−マンノサミンと結合する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションを分析HPLCにより分析する。
HPLC,Rt=12.98分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:1054。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlu(N(CH3)2)N[(CH2)17CH3]2(34)(RPR131111A)の合成
生成物(30)を方法Gによりジメチルアミンと結合する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションを分析HPLCにより分析する。
HPLC,Rt=14.44分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:920。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6,d(ppm)):0.89(t,J=7Hz,6H:脂肪鎖のCH3);1.25(mt,60H:脂肪鎖の中心の(CH2)15);1.43及び1.60(2mt,各2H:各脂肪鎖の1CH2);1.65(mt,4H:ブチルの中心の(CH2)2);1.65及び1.85−2.00(2mt,各1H:グルタリルの中心のCH2);1.95(mt,4H:プロピルのCH2);2.32(限界AB,2H:グルタリルのCOCH2);2.80及び2.92(2s,各3H:CON(CH3)2);2.85−3.05(mt,12H:ブチルのNCH2,プロピルのNCH2);3.00,3.22,3.45及び3.58(4mt,各1H:脂肪鎖のNCH2);3.78(AB,J=16Hz,2H:NCH2CON);4.75(mt,1H:グルタリルのCONCHCON);8.72(d,J=7.5Hz,1H:グルタリルのCONH);8.85及び8.90−9.15(互換mf)。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)11CH3]2(35)(RPR122767A)の合成
ジオクタデシルアミンの代わりにジドデシルアミンを使用する以外は生成物(6)と同様に合成する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションをHPLCにより分析する。
HPLC,Rt=9.54分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:653。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6,温度403K,d(ppm)):0.93(t,J=7Hz,6H:脂肪鎖のCH3);1.33(mt,36H:脂肪鎖の中心の(CH2)9);1.58(mt,4H:各脂肪鎖の1CH2);1.75(mt,4H:ブチルの中心の(CH2)2);1.95及び2.00(2mt,各2H:プロピルの中心のCH2);2.98及び3.00(2mt,合計12H:ブチルのNCH2及びプロピルのNCH2);3.30(t,J=7Hz,4H:脂肪鎖のNCH2);3.58(s,2H:NCH2CON);4.05(s,2H:グルシルのCONCH2CON)。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)12CH3]2(36)(RPR122774A)の合成
ジオクタデシルアミンの代わりにジトリドデシルアミンを使用する以外は生成物(6)と同様に合成する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションをHPLCにより分析する。
HPLC,Rt=10.64分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:681。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6,温度393K,d(ppm)):0.91(t,J=7Hz,6H:脂肪鎖のCH3);1.33(mt,40H:脂肪鎖の中心の(CH2)10);1.58(mt,4H:各脂肪鎖の1CH2);1.75(mt,4H:ブチルの中心の(CH2)2);2.00(mt,4H:プロピルの中心のCH2);2.98及び3.00(2t,J=7Hz,合計12H:ブチルのNCH2及びプロピルのNCH2);3.32(t,J=7Hz,4H:脂肪鎖のNCH2);3.65(s,2H:NCH2CON);4.06(d,J=4Hz,2H:グルシルのCONCH2CON);8.60(広幅s,1H:グルシルのCONH)。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)13CH3]2(37)(RPR122766A)の合成
ジオクタデシルアミンの代わりにジテトラドデシルアミンを使用する以外は生成物(6)と同様に合成する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションをHPLCにより分析する。
HPLC,Rt=9.92分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:709。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6,温度393K,d(ppm)):0.90(t,J=7Hz,6H:脂肪鎖のCH3);1.31(mt,44H:脂肪鎖の中心の(CH2)11);1.58(mt,4H:各脂肪鎖の1CH2);1.76(mt,4H:ブチルの中心の(CH2)2);2.00(mt,4H:プロピルの中心のCH2);2.98及び3.08(夫々mt及びt,J=7Hz,合計12H:ブチルのNCH2及びプロピルのNCH2);3.30(t,J=7Hz,4H:脂肪鎖のNCH2);3.65(s,2H:NCH2CON);4.06(d,J=4Hz,2H:グルシルのCONCH2CON); 8.10(mf,1H:グルシルのCONH)。
NH2(CH2)3NH(CH2)4N[(CH2)3NH2]CH2COGlyN[(CH2)17CH3]2(39)(RPR126096A)の合成
a−BocNH(CH2)3NBoc(CH2)4N[(CH2)3NHBoc]CH2CO2H(38)の合成
生成物(3)の合成中にSiO2上で精製時に副産物(38)を回収する。収率は8%である。
TLC:Rf=0.32(CHCl3/MeOH,9:1)。
MH+:561。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6,d(ppm)):1.30−1.61(mt,4H:ブチルの中心の(CH2)2);1.40(s,27H:C(CH3)3);1.56(mt,4H:プロピルのCH2);2.68及び3.11(夫々広幅t及びt、J=7Hz,各4H:ブチルのNCH2及びプロピルのNCH2);2.90及び2.96(2q,J=7Hz,各2H:プロピルのBocNHCH2);3.18(s,2H:NCH2COO)。
b−NH2(CH2)3NH(CH2)4[N(CH2)3NH2]CH2COGlyN[(CH2)17CH3]2(39)
生成物(38)と(5)を方法Gにより結合する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションをHPLCにより分析する。HPLC,Rt=13.60分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:821。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6にCD3COOD d4数滴を滴下,d(ppm)):0.87(t,J=7Hz,6H:各脂肪鎖のCH3);1.28(mt,60H:脂肪鎖の中心の(CH2)15);1.46及び1.54(2mt,各2H:各脂肪鎖の1CH2);1.63(mt,4H:ブチルの中心の(CH2)2);1.91(mt,4H:プロピルのCH2);2.85−3.15(mt,12H:ブチルのNCH2及びプロピルのNCH2);3.24(mt,4H:脂肪鎖のNCH2);3.76(mf,2H:NCH2CON);4.05(広幅s,2H:グリシルのCONCH2CON)。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH(CH2)3CON[(CH2)17CH3]2(41)(RPR122786A)の合成
a−BocNH(CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBoc(CH2)3CO2H(40)
溶液としてのNaCNBH3とコハク酸準アルデヒドの存在下にスペルミンでアルキル還元を実施することにより生成物(40)を合成する。
b−NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH(CH2)3CON[(CH2)17CH3]2(41)
生成物(40)とジオクタデシルアミンを方法Gにより結合する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションをHPLCにより分析する。
HPLC,Rt=15.04分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:792。
1HNMRスペクトル(400MHz,(CD3)2SO d6,温度383K,d(ppm)):0.85(t,J=7Hz,6H:脂肪鎖のCH3);1.22(mt,60H:脂肪鎖の中心の(CH2)15);1.48(mt,4H:各脂肪鎖の1CH2);1.72(mt,4H:ブチルの中心の(CH2)2);1.88(mt,2H:アミノペンタノイルの中心のCH2);1.99(mt,4H:プロピルのCH2);2.42(t,J=7Hz,2H:アミノペンタノイルのCOCH2);2.96,3.03及び3.22(3mt,合計18H:アミノペンタノイルのNCH2,ブチルのNCH2,プロピルのNCH2及び脂肪鎖のNCH2)。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CONH(CH2)5CON[(CH2)17CH3]2(42)(RPR128506A)の合成
BocGlyの代わりにBoc6−アミノカプロン酸を使用する以外は生成物(6)と同様に合成する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションをHPLCにより分析する。
HPLC,Rt=13.94分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:877。
1HNMRスペクトル(300MHz,(CD3)2SO d6,d(ppm)):0.87(t,J=7Hz,6H:脂肪鎖のCH3);1.28(mt,60H:脂肪鎖の中心の(CH2)15);1.48(mt,10H:各脂肪鎖の1CH2及びアミノヘキサノイルの中心の(CH2)3);1.65(mt,4H:ブチルの中心の(CH2)2);1.95(mt,4H:プロピルのCH2);2.27(t,J=7Hz,2H:アミノヘキサノイルのCOCH2);2.85−3.30(mt,18H:アミノヘキサノイルのNCH2,ブチルのNCH2,プロピルのNCH2及び脂肪鎖のNCH2);3.70(広幅s,2H:NCH2CON);7.90−9.10(互換mf)。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlu(11−アミドウンデカニルヘプタ−O−アセチルラクトース)N[(CH2)17CH3]2(43)(RPR130765A)の合成
生成物(30)を方法Gにより11−アミノウンデカニルヘプタ−O−アセチルラクトースと結合する。生成物を準分取HPLCにより精製し、フラクションを分析HPLCにより分析する。
HPLC,Rt=15.91分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:1680。
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COAsm(β−NAc(Ac)3)N[(CH2)17CH3]2(45)(RPR131283A)の合成
a−Fmoc−Asm−β−Glc−NAc(Ac)3−ジオクタデシルアミン(44)
本生成物は方法FによりFmoc−Asm−β−Glc−NAc(Ac)3−OHとジオクタデシルアミンを結合することにより合成する。
TLC:Rf=0.67(CHCl3/MeOH,9:1)。
HPLC,Rt=25.31分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
b−NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COAsm(β−NAc(Ac)3)N[(CH2)17CH3]2(45)
生成物(45)のFmoc基を分離する。
HPLC,Rt=15.35分(H2O/MeCN:3分[60/40]、3〜20分[0/100]、35分[0/100])。
MH+:1207。
生成物(6)の大規模溶液合成
溶液としてのNaCNBH3とグリオキシル酸の存在下にスペルミンでアルキル還元を実施することにより生成物(6)を合成する。
(7)RPR120534A、(6)120535A及び(9)RPR120531Aによるトランスフェクション効率に及ぼす電荷比(アミン/リン酸)の効果
2cm2の指数増殖期の細胞[NIH 3T3、3LL又はウサギSMC]1×105個のサンプルを、5%CO2下で電荷比を変えてリポフェクタント/pCMV−LUC溶液により37℃で2時間処理し、各サンプルに核酸2μgを投与する。最終濃度8%のウシ胎児血清を添加後、CO2インキュベーターで40時間インキュベーション後にリポーター遺伝子の発現を調べる。
(20)RPR120527A、(19)120528A、(17)RPR120526A及び(16)RPR120525Aによるトランスフェクション効率に及ぼす電荷比(アミン/リン酸)の効果
2cm2の指数増殖期のNIH 3T3細胞1×105個のサンプルを、5%CO2下で電荷比を変えてリポフェクタント/pCMV−LUC溶液により37℃で2時間処理し、各サンプルに核酸1μgを投与する。最終濃度8%のウシ胎児血清を添加後、CO2インキュベーターで40時間インキュベーション後にリポーター遺伝子の発現を調べる。
(6)120535、(41)RPR122786及び(42)RPR128506によるトランスフェクション効率に及ぼすスペーサー長の効果
2cm2の指数増殖期の細胞[NIH 3T3及びHeLa]1×105個のサンプルを、血清タンパク質の不在下で37℃、5%CO2下の湿潤雰囲気でカチオン脂質濃度を変えてカチオン脂質/pCMV−Luc混合物により2時間処理する。次いで細胞増殖培地に最終濃度8%のウシ胎児血清を加え、CO2インキュベーターで更に40時間インキュベーション後にトランス遺伝子の発現を測定する。
(6)RPR120535によるトランスフェクション効率に及ぼすスペーサー構造の効果
補助細胞系(3LL細胞)を導入した以外は上記実施例に記載したと同一の実験条件下で、Arg型、Lys型又はGlu型の基で「スペーサー」を置換することにより修飾したカチオン脂質(6)RPR120535を用いて得られたトランスフェクション効率を比較した。
実験1及び2では異なるプラスミドを使用し、実験1及び2で夫々細胞1105個当たりDNA0.5μg及び1μgの用量とした。結果を分析した処、該当細胞に応じて、好ましくは置換したアミノ酸鎖の存在は良好なトランスフェクション効率をもたらすことが判明した。
(9)RPR120531Aによるリポフェクタント/DNA混合物中のDOPEの存在の効果
実施例31で使用したと同一のプロトコールに従い、トランスフェクション混合物にDNAを添加する前にカチオン脂質(9)RPR120531Aに種々のモル比でDOPE(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)を加えた。
細胞の溶解後に上清中のルシフェラーゼ活性を定量し、タンパク質1mgに対する割合を計算する(図5)。
リポフェクタント混合物中にDOPEが存在すると、(9)RPR120531Aの濃度が低い場合にトランスフェクション効率を改善することができる。
(6)RPR120535A、(9)120531A及び(10)RPR121650Aによるトランスフェクション効率に及ぼす血清の効果
2cm2の指数増殖期の細胞[NIH 3T3又はHeLa]1×105個のサンプルを、血清の不在下で2時間又は培地中の血清の存在下でリポフェクタント/pCMV−LUC溶液(リポフェクタント3ナノモル/μgDNA)により処理する。本実施例では各サンプルに核酸2μgを投与する。細胞溶解液の上清中のルシフェラーゼの発現を調べ、RLU/10秒で表し、タンパク質1mgに対する割合を計算する。結果を分析した処、血清の存在はトランスフェクションにさほど影響しないことが判明した。
(20)RPR120527A、(19)120528A、(17)RPR120526A及び(16)RPR120525AによるDNA/リポフェクタント混合物中の核酸濃度の効果
実施例31に記載した条件下で、ナノモルリポフェクタント/μgDNA比を最適化し、NIH 3T3細胞のサンプルにトランスフェクトする(実施例32参照、(20)RPR120527A及び(19)RPR120528Aでは比=6、(17)RPR120526A及び(16)RPR120525Aでは比=3)。各サンプルに加えるDNAの量は0.5〜2μgとする。結果を図6に示す。
指数増殖期の細胞1×105個にプラスミドDNA1μgをトランスフェクトするのが好ましい選択であると思われ、実際に、DNAの使用量が増加すると細胞に接触するカチオン脂質の濃度が増加し、場合によっては毒性の問題を生じる。DNA濃度が低いと、トランスフェクション効率との比例が得られなくなる。
本発明によるリポポリアミンのin vivoトランスフェクション試験
腫瘍移植後7日のマウスをケタミン+キシラジンで麻酔し、上記のように調製した本発明によるリポポリアミンを含む溶液を注射する。注射から2日後に腫瘍組織を取り出し、計量後に細切し、溶解用緩衝液(Promega Cell Lysis Buffer E153 A)500μl中で粉砕する。遠心分離(20000gで10分間)後、10μlを分取し、試薬(Promega Luciferase Assay Substrate)50μlと混合後に得られた合計発光をルミノメーターLumat LB 9501(Berthold)で測定し、10秒間積分することによりルシフェラーゼ活性を評価する。得られた活性を腫瘍溶解液の合計上清中の推定RLU(相対光単位)又は注射DNAμg当たりのRLUとして表す。表IIIは得られた結果を示す。
Claims (4)
- 下記の式:
R4は一般式II:
R6及びR7は各々独立して水素原子又は飽和もしくは不飽和C10〜C22脂肪族基を表し、2個の基の少なくとも一方は水素以外のものであり、
uは0〜10から選択される整数であり、但しuが2以上の整数であるとき、R5、X、Y及びrは各モチーフ[X−(CHR5)r−Y]中で異なる意味をもつことができ、
Xは酸素原子、硫黄原子又はモノアルキルもしくは非モノアルキルアミン基を表し、
Yはカルボニル基又はメチレン基を表し、
R5は水素原子又は場合により置換された天然アミノ酸側鎖を表し、
rは1〜10の整数を表し、但しrが1であるとき、R5は置換又は非置換天然アミノ酸側鎖を表し、rが2以上であるとき、R5は水素原子を表す])の1個により表されることを特徴とする、D、L若しくはDL型リポポリアミン又はその塩。 - R4がNR6R7基であり、R6及びR7は式III〜XIにおいて(CH2)17CH3、(CH2)11CH3、(CH2)13CH3又は(CH2)12CH3から選択される同一基を表すことを特徴とする請求項1に記載のリポポリアミン。
- R5により表されるアミノ酸側鎖のレベルにビオチン、ローダミン、葉酸又はエピトープArg−Gly−Aspを含む直鎖もしくは環状ペプチドもしくはプソイドペプチド配列型のマーカー物質を含むことを特徴とする請求項1又は2に記載のリポポリアミン。
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