KR19990067552A - 형질감염제로서의 리포폴리아민 및 이의 약학적 용도 - Google Patents

형질감염제로서의 리포폴리아민 및 이의 약학적 용도 Download PDF

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KR19990067552A
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제라르도 비크
다니엘 쉐르망
베르트랑 슈바르쯔
까떼리느 뒤베르트레
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자끄 사비나
로오느-푸우랜크 로레르 소시에테 아노님
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Abstract

화학식 I의 리포폴리아민은 하기와 같이 나타내어진다.
화학식 I
상기 식에서,
같거나 상이한 R1, R2 및 R3는 수소 원자 또는 그룹 -(CH2)q-NRR'을 나타내고,
이때 q는 그룹 R1, R2 및 R3각각에 대해 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며,
같거나 상이한 m, n 및 p는 0 내지 6의 정수이며,
R4는 화학식 II 그룹을 나타낸다.
화학식 II
상기 식에서,
같거나 상이한 R6 및 R7은 수소 원자 또는 수소를 제외한 두가지 그룹 중 적어도 하나인 것을 조건으로, 포화 및 불포화 C10 내지 C22 지방족 라디칼이고,
u는 0 내지 10의 정수이며,
X는 산소 또는 황 원자 또는 임의로는 모노알킬화된 아민 그룹이며,
Y는 카보닐 그룹 또는 메틸렌 그룹이며,
r이 1일 경우에, R5는 임의의 천연 아미노산의 측쇄이고, r이 1 이상인 경우에, R5는 수소 원자이다.
리포폴리아민을 함유하는 약학 조성물 및 시험관 내 또는 생체 내에서 세포 내의 핵산의 형질감염에 있어 이의 용도에 관해서도 나타내고 있다.

Description

형질감염제로서의 리포폴리아민 및 이의 약학적 용도
다수의 유전병은 발현 결함 및/또는 비정상적인 발현, 즉 하나 이상의 핵산의 결손 또는 과도한 발현과 관련이 있다. 유전자 치료의 주요 목표는 클로닝 유전자의 생체 내 또는 시험관 내에서의 세포 발현을 통해 이러한 유형의 유전 이상을 치료하는데 있다.
오늘날, 유전 정보의 이러한 유형의 세포내 전달을 위한 몇몇 방법이 제안되었다. 이들 중 한가지는 특히 화학적 또는 생화학적 벡터의 사용에 기초하고 있다. 합성 벡터는 형질감염 가능한 DNA를 결집하고 원형질막을 가로지르는 통과 및, 필요하다면, 두개의 핵막을 가로지르는 통과 뿐만 아니라 세포 결합을 촉진시키는 두가지 주요한 기능을 가진다.
양이온 지질의 사용에 기초한 기술의 발달로 인해, 이러한 형질감염의 유형에 있어 상당한 진보가 이루어졌다. 양으로 하전된 양이온 지질, N-[1-(2,3-디올레일옥시]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)는 리포솜 또는 소포의 형태로 음으로 하전된 DNA를 자연스럽게 방해하여, 세포막과 융합 가능한 지질-DNA 복합체를 형성하게 되고, 이로인해 DNA의 세포내 전달을 허용하게됨이 입증되었다. 그러나, 이 분자가 형질감염에 있어서는 효과적이지만, 생분해가 일어나지 않고 세포의 경우에 독성을 가지게 되는 결점을 지니고 있다.
DOTMA 이후로, 이러한 구조 모델을 기본으로 한 기타 양이온 지질이 개발되었다: 소위 "스페이서" 아암에 의한 아미노 그룹과 결합된 친지질성 그룹. 이중, 좀더 특히 친지질성 그룹, 두가지 지방산 또는 콜레스테롤 유도체를 포함한 것, 및 필요하다면, 아미노 그룹, 사급 암모늄 그룹을 추가로 함유하는 것이 언급될 수 있다. 특히 이러한 양이온 지질류의 대표격으로 DOTAP, DOBT 및 ChOTB가 언급될 수 있다. 예를 들어 DOSC 및 ChOSC과 같은 기타 화합물은 사급 암모늄 그룹을 대신하는 콜린 그룹의 존재에 의해 특징지워진다. 그러나, 일반적으로, 이러한 화합물의 형질감염 활성은 상당히 낮게 존재한다.
본 발명은 리포폴리아민류와 유사한 신규 화합물, 이를 함유하는 약학 조성물, 핵산의 생체 내 및/또는 시험관 내 형질감염에 대한 적용 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
도 1: 상이한 양이온 지질을 사용하여 NIH 3T3 세포(마우스 배 세포-섬유아세포)를 처리한 후의 형질감염력의 측정도.
도 2: 상이한 양이온 지질을 사용하여 토끼 SMC 세포(토끼의 대동맥으로부터 평활근 세포의 1차 배양)를 처리한 후의 형질감염력의 측정도.
도 3: 상이한 양이온 지질을 사용하여 3LL 세포(Lewis 폐종양)를 처리한 후의 형질감염력의 측정도.
도 4: 상이한 양이온 지질을 사용하여 NIH 3T3 세포(마우스 배세포-섬유아세포)를 처리한 후의 형질감염력의 측정도.
도 5: 3LL 세포의 형질감염력에 집결된 DOPE의 효과도.
도 6: 다양한 DNA의 양으로 NIH 3T3 세포의 형질감염 및 일정한 나노몰의 리포펙탄트/μg의 DNA의 비율도.
약어 및 기호
EtOAc : 에틸 아세테이트
BOC : 테르트-부톡시카보닐
BOP :벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트
DCC : 디사이클로헥실카보디이미드
DCU : 디사이클로헥실유레아
DMAP : 4-디메틸아미노피리딘
DMP : 디메틸포름아미드
DMSO : 디메틸 술폭사이드
DODA : 디옥타데실아민
PE : 석유 에테르
EtOH : 에탄올
Et3N : 트리에틸아민
Rf : 전두 보유 계수
TFA : 트리플루오로아세트산
THF : 테트라하이드로퓨란
TMS : 테트라메틸실란
UV : 자외선
SPPS : 고체상 펩티드 합성
HPLC : 고압 액체 크로마토그래피
Z : 벤질옥시카보닐
C1Z : p-클로로벤질옥시카보닐
A-화학 합성을 위한 장치 및 방법
1. 장치
a) 화합물
- 개시 폴리아민은 예를 들면, 스페르민, 트리스(2-아미노에틸)아민, 페닐렌디아민, 디아미노-에탄(-프로판, -부탄, -펜탄, -헥산 등)으로 시판되거나, 표준 방법, 측쇄 폴리아민을 제공하기 위해 예를 들면 디아미노-에탄(-프로판, -부탄, -펜탄, -헥산 등) 아민, 스페르미딘 또는 스페르민과 같은 시판용 아민의 철저한 시아노에틸화에 의해 합성될 수 있다.
- 알킬화제는 알킬화 방법의 기능에 따라 하기와 같이 선택된다:
표준 알킬화용: 브로모아세트산, ω-할로카복실산.
환원성 알킬화용: 글리옥실산, 숙신산 세미알데히드 등과 같은 ω-알데히드-카복실산, 또는 아세토아세트산 또는 피루브산 등과 같은 케토산.
- 사용된 중합체는 예를 들면 자유산 작용기를 포함한 산물을 제공하는 O-클로로트리틸 클로라이드 수지 및 HMP 수지, 또는 링크형 수지와 같이, 고체상 펩티드 합성(메리필드 합성)을 위해 시판되는 수지이다. 폴리아미노산은 고체상에서 미리합성된 펩티드상에서 직접적으로 합성될 수 있고 브로모알킬 작용기 또는 ω-알데히드 산을 포함한다.
- 디옥타데실아민, 트리에틸아민, 트리플루오로아세트산, BOP, DMAP 및 벤질 클로로포르메이트는 올드리치로부터 수득된 상업용 산물이다. NaCl 및 NaHCO3용액은 0.5 M의 KHSO4용액으로 포화된다.
b) 물리적인 측정
1 H NMR 스펙트럼은 브루커 400 및 600 MHz 스펙트로미터상에 기록된다.
질량 스펙트럼은 API-MS/III 기구상에서 획득된다.
c) 크로마토그래피 기술
HPLC 분석은 AS-2000A 자동샘플러, L-6200A 식별 펌프 및 분석용 분리를 위해 220 nm에 맞춰지고 예비용 분리를 위해 235 nm에 맞춰진 조절성 파장을 지닌 L-4000 UV-가시 검출기가 구비된 머크-히타치 기구상에서 수행된다. 분석용 분리를 위한 컬럼은 퍼킨-엘머로부터 BU-300 아쿠아포어 부틸 7 m, 300 A 300 x 4.6 mm의 컬럼이고 예비용 분리를 위한 컬럼은 바이로래드로부터 바이오실 C18 HL 90-10 250 x 10 mm의 컬럼이다. 이동상은 H2O(0.1% TFA) 및 아세토니트릴(0.1% TFA)이다. 분석용 분석을 위한 유동 속도는 1 mℓ/분로 조절되고, 예비용 분석을 위한 유동 속도는 4 mℓ/분으로 조절된다.
박층 크로마토그래피 (TLC)는 두께가 2 mm인 머크 실리카 겔 평판상에서 수행된다.
컬럼 크로마토그래피는 입자 크기가 0.063 내지 0.200 mm인 메르크 60 실리카 겔상에서 수행된다. 이는 UV(254 nm), 닌히드린을 이용해, 150℃까지 가열하여 아민 또는 아미드를 나타내도록 니히드린의 에탄올성 용액(40 mg/100 mℓ EtOH)을 분무(가볍게 분무)시키거나, 플루오레스카민을 이용해, 1차 아민을 나타내도록 용액(40 mg/100 ㎖ 아세톤)을 분무시키거나, 요오드를 이용해 요오드 분말로 평판을 덮어 나타내어진다.
컬럼 크로마토그래피는 입자 크기가 0.063 내지 0.200 ㎜의 메르크 60 실리카 겔상에서 수행된다.
d) 고체상 합성의 SPPS 기술
고체상 합성은 수제 SPPS 펩티드 합성 수동 반응기에서 행해지고 교반기는 플라스크 쉐이커 모델 A5-6021이다. 고체상과 폴리아민의 커플링의 진행 및 SPPS 중의 폴리아민 보호의 진행은 카이저 시험[참조 문헌; Kaiser, E., Colescolt, D.L., Bossinger, C.D. and Cook, P.I. Anal. Biochem. 34(2), 595 (1970)]에 의해 모니터링된다. SPPS를 위한 예로 적당한 수지는 Novabiochim-Suisse 사의 클로로트리틸 클로라이드 수지이다.
2. 일반적인 과정
a) (N, N, N', N'-테트라아미노프로필)-1,4-디아미노부탄의 제조에 의해 설명되는 대칭 폴리아민의 합성:
1,4-디아미노부탄 147 g과 탈광수 1000 ㎖를 2-리터용 삼각 플라스크에 로딩한다. 용액을 자기적으로 교반한다. 균압화된 적가 깔때기를 통해 아크릴로니트릴 443 g을 1 시간에 걸쳐 첨가하고, 온도는 38℃로 유지한다. 그 다음 플라스크상에 환류 콘덴서를 올려놓고 반응물을 수조상에서 1 시간동안 80℃로 유지시킨다. 플루오레스카민 시험은 음으로 나타나고 과도한 아크릴로니트릴은 40℃ 진공하에 증발된다.
두가지 상이 수득된다. 보다 낮은 유기상을 분리하고, 300 ㎖의 물로 세척한 다음 1000 ㎖의 둥근 바닥 플라스크로 옮긴다. 물/메탄올 혼합물(1 : 1 용적/용적) 170 ㎖를 첨가한다. 생성된 혼합물을 밤새 그대로 두어 결정화시킨다. 다음 날, 결정을 다공성 3의 500 ㎖ 소결 깔때기상에서 여과한다.
소결 깔때기상의 필터 케이크를 메탄올(2 x 170 ㎖) 및 에테르(2 x 150㎖)로 세척한다. 산물을 진공하에(26 ㎜) 건조기내의 접시상에서 밤새 건조한다. 461 g의 산물을 수득한다(93%의 수율). 산물을 NMR 및 MS로 분석하고 분석치를 일치시킨다. 산물을 추가적인 정제없이 수소화시킨다.
상기 폴리니트릴 30 g(0.1 몰)을 1-리터용 스테인레스 강 오토클레이브에 로딩시킨다. 동시에 에탄올 140 ㎖(95%) 및 NaOH 8 g(0.2 몰)의 용액을 비이커 내에서 제조한다. 나트륨 하이드록사이드를 용해시킬 때, 이 용액을 오토클레이브에 로딩시킨다. 오토클레이브에 질소를 통과시키고 목탄상의 라네이 니켈 8 ㎖를 로딩시킨다. 오토클레이브를 밀폐시킨다. 초기 수소화 압력은 52 기압이고 실온에서 5 시간에 걸쳐 28.5 기압으로 떨어진다. 현탁액을 종이에 여과시키고, 필터를 에탄올(2 x 25 ㎖)로 세척한 다음 진공하에 여액을 농축시켜 건조한다. 오일을 30 ㎖의 물로 혼합하고 100 ㎖의 CH2Cl2로 추출한다. 유기상을 MgSO4로 건조시키고, 여과시킨 다음 진공하에 증발시킨다. 황색을 띤 유체 오일을 수득한다(27 g, 85%의 수율).
산물을 TLC(단일 점), NMR 및 MS로 분석하고 분석치를 일치시킨다. 산물은 추가적인 정제없이 사용된다.
b) 방법 A-중합 지지체로의 산성 작용기의 부착
클로로트리틸 클로라이드 수지(5 g, 1.2 mmol Cl/g 수지)를 SPPS 반응기에 로딩시키고, CH2Cl250㎖를 첨가한 다음 혼합물을 5 분간 교반한다. 브로모아세트산(1.05 g, 7 mmol)을 첨가한데 이어, DIEA(0.95 ㎖, 7.5 mmol)를 첨가한다. 반응기를 실온에서 두시간 동안 교반한다. 액체를 여과하고 수지를 CH2Cl2및 iPrOH(10 x 50 ㎖) 및 MeOH(2 x 50 ㎖)로 세척한다. 결국, 질소의 스트림하에 수지를 건조시킨다.
c) 방법 B-브로모아세틸 수지와 폴리아민의 반응
폴리아민(10 몰 이상)을 CH2Cl250 ㎖에 용해시키고 방법 A에 의해 수득된 산물을 함유한 반응기에 로딩시킨다. 반응기를 실온에서 두 시간 동안 교반한다. 용매를 여과하고 수지를 CH2Cl2및 iPrOH로 세척한다; 카이저 시험은 양성이다.
d) 수지상에서 폴리아미노산의 보호: 방법 C:
디-3급-부틸 디카보네이트(48 mmol) 및 DIEA(50 mmol)를 CH2Cl2(50 ㎖)에 용해시키고 방법 B에 따라 수득된 산물을 함유하는 반응기에 로딩시킨다. 반응기를 밤새 교반한다. 다음 날, 카이저 시험은 음성이다. 용매를 여과하고 수지를 대안적으로는 CH2Cl2및 iPrOH(10 x 50 ㎖), MeOH(2 x 50 ㎖) 및 에테르(2x 50 ㎖)로 세척한다. 수지를 질소의 스트림하에 건조한다. 카이저 시험은 여전히 음성이다.
방법 D:
방법 B에 의해 수득된 수지(1.5 g)를 둥근 바닥 플라스크에 로딩하고 CH2Cl2(20 ㎖)을 첨가한데 이어, DIEA(20 mmol)를 첨가한다. 혼합물을 자기적으로 교반하고 벤질 클로로포르메이트(14 mmol)를 5 분에 걸쳐 점적한다. DIEA를 첨가시켜 pH를 11로 유지시킨다. 다음날, 수지를 SPPS 반응기에 통과시키고, 여과시킨 다음 대안적으로 CH2Cl2및 iPrOH(10 x 20 ㎖) 및 에테르(2 x 20 ㎖)로 세척한다. 질소의 스트림하에 수지를 건조한다.
e) 방법 E: 수지로부터 보호된 폴리아미노산의 절단
방법 C 및 D에 의해 수득된 수지를 자기 교반기-바가 장치된 250 ㎖의 둥근 바닥 플라스크에 로딩한다. CH2Cl250 ㎖ 및 CF3CH2OH 25㎖로 구성된 용액을 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 용액을 여과하고, 수지를 CH2Cl2(2 x 10㎖)로 세척한 다음 수득된 유기상을 화합하고 진공하에 증발시킨다. 그 다음 산물을 용출제로 CHCl3/MeOH(9 : 1)를 지닌 SiO2상에서 플라스크 크로마토그래피에 의해 정제한다. 산물을 함유한 분획을 TLC에 의해 동정한다(추가적인 설명을 위해 하기 실시예 참조).
f) 방법 F: 디리피딜아민과 아미노산의 커플링:
Boc-아미노산(10 mmol) 및 C12-C22 디리피딜아민(10 mmol)을 250 ㎖의 둥근 바닥 플라스크에 로딩한다. CHCl3(100 ㎖)을 첨가하고 해리가 완료될 때까지 혼합물을 교반한다. 그 다음 TEA(30 mmol) 및 BOP(33 mmol)를 첨가한다. TEA를 이용해 pH를 10으로 유지시키고 2 시간 동안 반응을 교반한다. 반응이 완료될 무렵(TLC), 클로로포름이 증발되고 고체는 에틸 아세테이트(300 ㎖) 중에 취해진다. 유기상을 KHSO4(4 x 100 ㎖), NaHCO3(4 x 100 ㎖), 및 NaCl(4 x 100 ㎖)로 세척한다. 유기상을 MgSO4로 건조시키고, 여과시킨 후 진공하에 증발시킨다. 산물을 TLC, NMR 및 MS로 분석하고 추가적인 정제없이 사용한다. 수율은 약 90%이다.
g) 디리피딜산과 보호된 폴리아미노산의 커플링 및 Boc 및 Z 보호 그룹의 절단
방법 G
방법 F에 의해 수득된 산물(9 mmol)을 자기 교반기-바가 장치된 둥근 바닥 플라스크에 로딩하고 콜드(4℃)TFA(30 ㎖)를 첨가한다. 용액을 1 시간 동안 교반한다. TFA를 진공하에 증발시킨다. DMF(70 ㎖)를 첨가시켜 산물을 용해한다. TEA(30 mmol)를 첨가한데 이어, 방법 E에 의해 수득된 보호된 폴리아미노산(9 mmol)을 첨가한다. pH를 10으로 맞추고 BOP(33 mmol)를 첨가한다. 용액을 2 시간 동안 교반하고 TLC로 모니터한다. 커플링이 완료될 무렵(TLC), KHSO4용액을 첨가하고 산물을 에틸 아세테이트(3 x 100 ㎖)로 추출한다. 유기상을 KHSO4(3 x 50 ㎖), NaHCO3(3 x 50 ㎖) 및 NaCl(3 x 50 ㎖)로 세척하고, MgSO4로 건조시키며, 여과시킨 다음 진공하에 증발시킨다. 산물을 NMR, TLC 및 MS로 분석하고 앞서의 정제없이 탈보호시킨다. TFA(50 ㎖)를 산물에 첨가하고 용액을 1.5 시간 동안 교반한 다음, TFA를 증발시킨다. 산물이 TFA에 의해 절단될 수 없는 Z 또는 C12를 여전히 함유하고 있다면, 직접적으로 방법 H가 뒤따른다. 최종 산물을 반-제조 HPLC에 의해 정제한다(실시예 참조).
방법 H
Z 또는 C1Z 그룹을 함유하는 방법 G에 의해 수득된 산물을 자기 교반기-바가 장치된 둥근 바닥 플라스크에 로딩하고 10 ㎖ MeOH/g 산물중에 용해시킨다. 실온에서 Pd/C(10%, 1 g/g 산물) 및 암모늄 포르메이트(1 g/g 산물)를 첨가한다. HPLC에 의해 수소화를 모니터한다. 반응이 완료되는 2 시간 후에, 혼합물을 여과하고 필터를 10 ㎖의 MeOH로 세척한다. 이중-증류수를 첨가하고 용액을 동결시킨 다음 동결 건조한다. 최종 산물을 예비용 HPLC에 의해 정제한다.
h) Boc 보호 그룹의 탈보호를 위한 방법 I
트리플루오로아세트산(50 ㎖)을 둥근 바닥 플라스크 중에 Boc 그룹(1 mmol)을 함유하는 산물에 첨가한다. 용액을 1.5 시간 동안 교반하고 TFA를 증발시킨다. 아민을 완전히 탈보호시키고 추가적인 정제없이 커플링에서 사용되도록 준비한다.
B-생물학적 연구를 위한 장치 및 방법:
1. 실험관 내에서 유전자 전달을 위해 사용된 플라스미드
플라스미드 pCMV-LUC는 pcDNA3 플라스미드(Invitrogen)로부터 추출된 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 함유하는 Mlu I-Hind III 분획의 삽입에 의해 플라스미드 pGL2-기본 벡터(Promega) 또는 플라스미드 pGL2-조절 벡터(Promega)로부터 유도된 작제물이다.
2. 형질감염을 위해 사용된 용액의 제조 과정
본 발명에서 기술된 산물을 최종 에탄올성 농축액이 10% 이하가 되도록 주의하면서, 에탄올 또는 물 20 mM의 농출액에 용해시킨 다음, 물로 희석한다.
생리 식염수(0.15 M NaCl)에 희석된 핵산 용액을 1/1의(용적/용적) 비로 리포펙탄트 용액에 첨가한다. 실온에서 15 분간 와동 균질화 및 배양을 한 후, 최종 농도 9%(용적/용적)에서, 세포가 단백질이 없는 생장 배지(혈청)로 세척되고 혈청을 함유하거나 함유하지 않은 생장 배지에서 취해진 웰로 DNA/리포펙타트 용액을 분배한다.
C- 생체 내 시험을 위한 장치
1. 장치
a) 실험 모델:
- 6마리의 성인(> 8 주) 자성 C57/BL 마우스
- 동물에서 동물로 종양 분획을 통과시켜 수득되고, 피부하 측면상에 이식된 3LL 유형이 종양(Lewis 폐 종양)
b) 사용된 플라스미드:
pXL 2622: 이는 pCDNA3(Invitrogen)로부터 추출된 사이토메갈로바이러스() 프로모터가 루시페라제를 암호화하는 유전자의 업스트림에 삽입된 pGL2 기원(CMV)으로부터 유도된다. 이 플라스미드는 PEG(Ausubel)를 이용한 침전 기술에 의해 수득되고 약 10 μg DNA/㎕의 농도에서 10 mM 트리스 1 mM EDTA pH 8에 저장된다.
2. 과정
주입된 용액: 우선 형질감염 가능한 DNA를 완충액에 용해시키고, 펩티드(KTPKKAKKP)2서열 번호 1을 첨가하고, 20 분후, 높은 농도의 양이온 지질 용액(20 또는 40 mM)을 혼합물에 첨가한다. 모든 산물을 첨가한 후, 혼합물은 DNA(0.5 mg/㎖의 최종 농도에서)외에, 펩티드(0.75 mg/㎖) 및 양이온 지질, 150 mM NaCl, 5% D-글루코스 및 5 mM MES pH 6.2를 함유한다. 용액을 제조한 후 20 내지 30 분 동안 주입을 행한다.
양이온 지질, 리포폴리아민의 또다른 종류에 관해서도 기술되어 있다. 본 발명을 위해, 용어 "리포폴리아민"은 소위 스페이서 영역에 의해, 친지질성 영역과 결합된 친수성 폴리아민 영역 중 적어도 하나를 포함하는 양친매성 분자를 의미한다. 양으로 하전된 리포폴리아민의 폴리아민 영역은 음으로 하전된 핵산과 가역적으로 결합할 수 있다. 이러한 상호작용은 핵산을 상당한 정도로 결집시킨다. 친지질성 영역은 지질 필름으로 형성된 핵지질 입자를 코팅시킴으로써, 외부 매질에 영향을 받지 않는 이러한 이온 상호작용을 만든다. 이러한 유형의 화합물 중, 2개는 1급이고 2개는 2급인, 4개의 암모늄 그룹을 함유한 L-5-카복시스페르민 라디칼이 양이온 그룹을 대표한다. 특히 이러한 유형의 화합물 중에는 DOGS 및 DPPES가 있다. 이러한 리포폴리아민은 1차 내분비 세포를 형질감염시키기에 가장 특별히 효과적이다.
이러한 사실의 견지에서, 이상적인 합성 형질감염제는 높은 수준의 형질감염을 나타내어야하고, 광범위한 세포에서 이것이 행해져야하며, 무독성 또는, 이것이 안되면, 사용된 양에서 최소한의 독성을 가져야하며, 결국, 처리된 세포상에서의 부작용을 제거하기 위해 생분해가 가능해야한다.
본 발명의 목적은 엄밀하게는, 폴리아민 분획을 기본으로 유래되고, 시험관 내 및/또는 생체 내에서 세포의 형질감염, 및 특히 핵산의 벡터화에 효과적으로 사용될 수 있는 신규의 리포폴리아민을 제안하는 것이다.
본 발명의 제 1 주제는 화학식 I로 나타내어지고 D, L 또는 D,L 형태 및 이의 염으로 특징지워진 리포폴리아민이다.
상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 그룹 -(CH2)q-NRR'을 나타내는데,
이때 q는 1, 2, 3, 4, 5 및 6 범위가 가능하고, 다양한 그룹 R1, R2 및 R3 사이에서 독립적으로 존재하며,
R 및 R'는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 그룹 -(CH2)q'-NH2이고, q는 1, 2, 3, 4, 5 및 6 범위가 가능하며, 다양한 그룹 R 및 R'사이에서 독립적으로 존재하며,
m, n 및 p는 각각 독립적으로, 0 내지 6 사이로 변할 수 있는 정수이며, n이 1 이상인 경우에, m은 다양한 값을 취할 수 있고 R3는 화학식 1 범위 내에서 다양한 의미로 해석될 수 있으며,
R4는 화학식 II 그룹을 나타낸다.
상기 식에서,
R6 및 R7은 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 수소를 제외한 두가지 그룹 중 적어도 한가지를 가진 포화 및 불포화 C10 내지 C22 지방족 라디칼이고,
u는 0 내지 10 사이에서 선택된 정수이며, u가 1 이상의 정수일 경우에, R5, X, Y 및 r은 상이한 단위[X-(CHR5)r-Y] 내에서 서로 다른 의미를 가질 수 있으며,
X는 산소 또는 황 원자 또는 모노 알킬화가 가능하거나 가능하지 않은 아민 그룹을 나타내며,
Y는 카보닐 그룹 또는 메틸렌 그룹을 나타내며,
R5는 수소 원자 또는 필요하다면 치환되는 천연 아미노산의 측쇄를 나타내며,
r은 1 내지 10 범위의 정수를 나타내며, r이 1일 경우에, R5는 천연 아미노산의 측쇄를 나타내고, r이 1 이상인 경우에, R5는 수소 원자를 나타낸다.
본 발명을 위해, 천연 아미노산의 발현 측쇄는 특히 예를 들면, 아르기닌의 측쇄와 같은 아미디늄 단위를 함유하는 쇄를 의미하는 것으로 이해된다. 앞서 언급한 바와 같이, 이 쇄는 예를 들면, 콜레스테릴, 아라키도닐 또는 레티노일 라디칼과 같은 포화 또는 불포화, 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 C1 내지 C24의 지방족 그룹 및 예를 들면, 벤질옥시카보닐 유도체, 벤질 에스테르 유도체 및 치환 또는 비치환 로다미닐 유도체와 같은 모노- 또는 폴리방향족 그룹으로 치환될 수 있다.
화학식 I의 이러한 신규 산물은 무독성 형태이고 약학적으로 수용 가능한 염이다. 이러한 무독성 염은 무기산(염산, 황산, 붕산, 인산 및 질산) 또는 유기산(아세트산, 프로피온산, 숙신산, 말레산, 하이드록시말레산, 벤조산, 푸마르산, 메탄술폰산 및 옥살산) 또는 무기 염기(나트륨 하이드록사이드, 칼륨 하이드록사이드, 리튬 하이드록사이드 및 석회) 또는 유기 염기(트리에틸아민, 피페리딘 및 벤질아민과 같은 3급 아민)와의 염을 포함한다.
본 발명에 따라 좀더 상세히 언급될 수 있는 화합물의 전형은 하기 화학식의 화합물이다.
상기 식에서,
R4, R6 및 R7은 앞서 정의한 바와 같다.
바람직하게는, R4는 (CH2)17CH3, (CH2)11CH3, (CH2)13CH3또는 (CH2)12CH3로부터 선택된 상동 그룹으로써 화학식 III 내지 XII에서 나타낸 R6 및 R7을 지닌 NR6R7 그룹을 나타낸다.
특히 유리한 양태에서, 청구된 화합물은 또한 이들과 결합된 핵산의 전달을 지시할 수 있는 표적화 요소를 포함한다. 바람직하게는 이러한 표적화 요소는 화학식 I의 화합물상의 치환체 R5로 표현된 아미노산 측쇄 중에 혼입된다. 좀더 특히, 이 표적화 요소는 본 발명에 따른 화합물에 공유적 또는 비공유결합된다.
이 요소는 임의의 원하는 세포 유형 또는 임의의 원하는 조직(종양 세포, 간 세포, 조혈 세포 등)으로 핵산의 전달을 지시할 수 있는 세포 외 표적 요소이다. 이러한 관점에서, 예를 들면, 세포 외 수용체에 의해 인식되는 당, 폴레이트, 트랜스페린, 인슐린, 아시알로-오로소뮤코이드 단백질 또는 임의의 생물학적 활성 분자와 같은 표적 세포 유형의 표면에 존재하는 세포 수용체 리간드일 수 있다. 또한 예를 들면, 핵속에서 형질감염된 DNA의 축적을 촉진하는 핵 위치 추정 시그널 서열(nls)과 같은 임의의 바람직한 세포 구획으로 핵산의 전달을 지시할 수 있는 세포 내 표적화 요소일 수 있다.
좀더 일반적으로, 본 발명의 내용에서 사용될 수 있는 표적 요소는 당, 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 스테로이드 및 지질을 포함한다. 바람직하게는 항체 또는 항체 단편, 세포 수용체 리간드 또는 이의 단편, 수용체 또는 수용체 단편 등과 같은 당 및/또는 펩티드이다. 특히, 이들은 생장 인자 수용체, 사이토킨 수용체, 세포 렉틴 수용체 또는 인테그린과 같은 부착 단백질을 위한 수용체용 리간드이다. 또한 트랜스페린, HDL 지질 및 LDL 지질에 대한 수용체도 언급될 수 있다. 표적 요소는 또한 아시알로글리코단백질 수용체와 같은 렉틴을 표적화할 수 있는 당, 또는 대안적으로 면역글로불린 Fc 단편 수용체를 표적화할 수 있는 항체 Fab 단편도 가능하다.
유사하게는, 예를 들면 아미노산 측쇄 R5 상에서, 화학식 I의 화합물과 바이오틴, 로다민 또는 폴레이트 형의 표지제와의 결합도 포함될 수 있다. 이 표지제는 또한 인테그린 형의 부착 단백질의 제 1 및/또는 제 2 수용체의 인식을 위해 에피토프 Arg-Gly-Asp을 함유하는 직쇄형 또는 환형 펩티드 또는 슈도펩티드 서열이다.
하기 실시예에서 좀더 상세히 기술된, 하기 화합물은 언급 가능한 청구된 리포폴리아민에 관해 설명하고 있다:
하기에서는 특히 본 발명의 전형이고 좀더 상세히 언급될 수 있는 화합물을 하기와 같은 화학식으로 나타내고 있다.
본 발명에 따른 리포폴리아민으로부터 유도된 비대칭 작용화 폴리아민을 제조하기 위한 독창적인 고체상 방법도 또한 본 발명의 내용 한도에서 개발되었다.
비대칭 작용화 폴리아민에 대한 접근법은 직쇄 또는 측쇄 대칭 폴리아민에 변형의 선택적인 도입에 대한 필요성으로 인해 통상적으로는 제한되어 있다. 폴리아민의 1급 및 2급 아민 그룹 사이의 화학적 차이는 알킬화, 미카엘형 첨가 또는 아실화와 같은 반응을 수행하기 위해 굉장한 선택성을 필요로 한다. 또한, 이러한 화학적 차이에 의해 부과된 선택성은 폴리아민에서 직면한 것과 같이, 몇몇 1급 및 2급 아민 그룹에서의 선택적인 알킬화와는 견줄 수 없다. 이러한 제한에 대한 통상적인 반응은 한편으로는, "폴리아민화"될 수 있는 아민 그룹이고, 다른 한편으로는, 적절하게 보호된 비대칭 작용 그룹을 함유한 단량체 블록으로부터 비대칭 작용화 폴리아민을 제작하는 것이다. 따라서 이러한 접근법은 지루한 다단계 합성법 및 특히 작용 그룹의 독립적인 보호를 요구한다.
본 발명의 내용 한도에서 개발된 방법은 엄밀하게는 이러한 유형의 합성시 직면하게 되는 결점을 제거하는데 목적이 있다. 이것의 뚜렷한 이점은 편리하면서도 빠르게 대칭 폴리아민의 알킬화 또는 환원성 알킬화에 의해 단일 1급 아민 그룹상에서 선택적으로 작용화되는 폴리아민을 야기시키는데 있다.
청구된 방법의 원리는 알킬화제 및 폴리아민 사이의 분자생물학적 반응을 촉진시켜, 후자의 폴리알킬화를 피하기 위한 고체상 합성법의 사용에 기초하고 있다. 좀더 정확하게는, 본 발명은 최소 하나의 지질 분획과 고체 지지체에 공유결합된 알킬화제와 대칭 폴리아민 간의 분자생물학적 반응에 의해 미리 수득된 비대칭 폴리아민 분획 중 최소 하나와의 커플링을 이용하는 것으로 특징지워진 방법에 관한 것이다. 이러한 접근법에 따라, 에스테르화 또는 아미드화에 의해 알킬화제를 중합 지지체에 공유결합시킨다. 대칭 폴리아민은 지지체에 부착된 모노-작용화 비대칭 폴리아민을 야기시키는 이분자 반응에 의해 고체상의 알킬화제와 반응한다. 일반적으로는 보호 그룹 BOC 또는 Z 형 및, 결국, 고체상 지지체로부터 절단된 산물을 이용해 고체상에서 산물의 자유 아민을 보호한다. 편리하게는, 이러한 폴리아미노산을 지질 분획과 커플링시켜 원하는 형질감염제를 제공한다. 이러한 커플링을 위해서는, 예를 들면, BOP, Pybop, BopCl 및 DCC와 같은 일반 펩티드 커플링제를 사용할 수 있다. 이 방법은 또한 미량의 펩티드, 당 또는 형광 탐침의 분자에로의 가능한 도입과 함께 고체 지지체상에서 전 형질감염제를 결집 가능하게도 해준다. 물론, 자유 리포폴리아민상에서 이러한 유형의 그래프팅이 수행될 수 있는 것으로 밝혀져 있다.
몇몇 직쇄 또는 측쇄, 비대칭 및 작용화 폴리아미노산의 합성에 의해 본 방법의 가능성을 입증하고 있다.
본 발명의 주제는 또한 앞서 언급한 바와 같이, 직접적으로 또는 약학적 조성물로서 리포폴리아민의 치료학적 적용이다.
앞서 설명한 바와 같이, 화학식 I의 화합물이 실험실 내 및 생체 내에서 핵산의 형질감염을 위해 가장 특별히 이로운 것으로 밝혀졌다. 이는 효과적으로 DNA를 응축시키고 이로울 정도로 굉장히 감소된 독성을 지닌다.
본 발명의 조성물에 대해 최대의 효과를 수득하기 위해, 바람직하게는 화학식 I의 화합물 및 핵산의 각각의 비율을 결정하여 고려된 리포폴리아민 중의 양전하 : 핵산 중의 음전하의 비 R을 최적화시킨다. 이러한 최적 비율은 특히 사용 양식, 즉 생체 내 또는 시험관 내에 따라, 그리고 형질감염 될 세포 유형에 따라 변하기 때문에, 각각의 특별한 경우를 위해 최적화된다. 이러한 최적화는 당해 분야의 숙련인의 능력 내이다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산이다. 이는 천연 또는 인공 기원 서열, 및 특히 변형 또는 무변형된 올리고뉴클레오티드의 게놈 DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, 하이브리드 서열 또는 합성 또는 반합성 서열이다. 이러한 핵산은 인간, 동물, 식물, 박테리아, 바이러스 등에서 기원된 것이다. 이는 당해 분야의 숙련인에게 공지된 임의의 기술, 및 특히 뱅크의 선별, 뱅크의 선별에 의해 수득된 서열의 화학적 또는 효소적 변형을 포함하는 화학 합성 또는 혼합 방법에 의해 수득될 수 있다. 또한 이는 플라스미드 벡터와 같은 벡터로 혼입될 수 있다.
데옥시리보핵산을 좀더 상세히 고려할 경우, 이는 일본쇄 또는 이본쇄, 및 짧은 올리고뉴클레오티드 또는 보다 긴 서열이 가능하다. 이러한 데옥시리보핵산은 치료 유전자, 전사 또는 복제를 조절하는 서열, 변형 또는 변형되지 않은 안티센스 서열, 기타 세포 성분과 결합하는 영역 등을 지닐 수 있다.
본 발명을 위해, 용어 "치료 유전자"는 특히 치료 효과를 지닌 단백질 산물을 암호화하는 임의의 유전자를 가리키는 것으로 인식된다. 암호화된 단백질 산물은 단백질, 펩티드 등이 가능하다. 이 단백질 산물은 표적 세포에 대해 상동적이다(즉 후자가 병리를 나타내지 않을 경우 일반적으로 표적 세포에서 발현되는 산물). 이 경우, 단백질의 발현은 예를 들면, 세포내에서의 불충분한 발현 또는 변형, 또는 대안적으로 단백질의 과발현으로 인해 불활성이거나 약하게 활성적인 단백질의 발현을 극복 가능하게 해준다. 치료 유전자는 증가된 안정성, 변형된 활성 등을 가진 세포 단백질의 돌연변이체를 암호화할 수 있다. 단백질 산물은 또한 표적 세포에 대해 이질적일 수 있다. 이 경우, 발현된 단백질은 예를 들면, 세포내에서 결여되고, 병리와 싸울 수 있거나 면역 반응을 자극하는 활성을 만들거나 제공할 수 있다.
본 발명의 범위 내에서, 좀더 상세히 언급될 수 있는 치료 산물로는 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인, 인터루킨, 인터페론, TNF 등(프랑스 92/03120), 생장 인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/플레오트로핀 등, 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(프랑스 9111947), 췌장섬유증과 관련된 CFTR 단백질, 종양-억제 유전자: p53, Rb, RapIA, DCC, k-rev 등(프랑스 93/04745), 응고와 관련된 인자를 암호화하는 유전자: 인자 VII, VIII, IX, DNA 수선과 관련된 유전자, 자살 유전자(타이미딘 키나제, 사이토신 데아미나제), 헤모글로빈 유전자 또는 기타 수송 단백질 유전자, 아포리포단백질 A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J 및 아포(a)로부터 선택된 아포리포단백질 유형인 지질의 대사와 관련된 단백질에 상응하는 유전자, 예를 들면, 리포단백질 리파제, 간 리파제, 레시틴 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제, 7 알파-콜레스테롤 하이드록실라제, 포스파트산 포스퍼타제와 같은 대사 효소, 또는 대안적으로 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질 및 인지질 전달 단백질과 같은 지질 전달 단백질, HDL 결합 단백질 또는 대안적으로 예를 들면, LDL 수용체, 카이로마이크론-잔유물 수용체 및 스캐빈저 수용체로부터 선택된 수용체가 있다.
치료 핵산은 또한 안티센스 서열 또는 표적 세포에서의 발현에 의해 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 조절할 수 있는 유전자이다. 이러한 서열은 유럽 특허 140, 308에 기재된 기술에 따라, 예를 들면, 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사될 수 있고 이로인해 단백질로의 해독을 막을 수 있다. 치료 유전자는 또한 표적 RNA를 선택적으로 파괴할 수 있는 리보좀을 암호화하는 서열을 포함한다(유럽 321, 201).
앞서 지적했듯이, 핵산은 또한 인간 또는 동물에서 면역 반응을 야기시킬 수 있는 항원성 펩티드를 암호화하는 유전자를 하나 이상 함유할 수 있다. 이러한 특별한 양태에서, 본 발명은 특히 미생물, 바이러스 또는 암에 대항하여, 인간 또는 동물에 적용되는 백신 또는 면역치료제를 생산할 수 있다. 이는 특히 엡스타인 바 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염 바이러스(유럽 185,573), 위광견병 바이러스에 특이적이거나 대안적으로 종양(유럽 259, 212)에 특이적인 항원성 펩티드이다.
바람직하게는, 핵산은 또한 원하는 세포 또는 기관에서 치료 유전자 및/또는 항원성 펩티드를 암호화하는 유전자를 발현시키는 서열을 포함한다. 이는 이러한 서열이 감염 세포에서 작용할 수 있을 경우 원래 고려된 유전자의 발현에 책임이 있는 서열이다. 이는 또한 기타 기원(기타 단백질의 발현, 또는 심지어 합성에 책임이 있음)의 서열일 수도 있다. 특히, 이는 진핵세포 또는 바이러스 유전자에 대한 프로모터 서열이다. 예를 들면, 이는 감염되길 원하는 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 서열이다. 유사하게는, 이는 바이러스의 게놈으로부터 유래된 프로모터 서열이다. 이러한 관점에서, 예를 들면 유전자 E1A, MLP, CMP, RSV 등의 프로모터가 언급될 수 있다. 또한, 이러한 발현 서열은 활성 서열, 조절 서열 등의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 또한 유도 또는 억제 프로모터일 수도 있다.
또한, 핵산은 특히 치료 유전자의 상류에, 합성된 치료 산물이 표적 세포의 분비 경로로 나아가도록 하는 시그널 서열을 함유한다. 이 시그널 서열은 본래 치료 산물의 시그널 서열이지만, 기타 작용성 시그널 서열 또는 인공 시그널 서열도 가능하다. 핵산은 또한 합성된 치료 산물이 세포의 특별한 분획으로 나아가도록 하는 시그널 서열도 함유한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 핵산, 청구된 리포폴리아민 및 리포폴리아민/핵산 복합체와 결합할 수 있고 이의 형질감염력을 증진시킬 수 있는 보조제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 실제로 본 출원인은 리포폴리아민/핵산 복합체와 결합할 수 있는 임의의 보조제(예를 들면 지질, 펩티드 또는 단백질)의 존재하에 리포폴리아민의 형질감염력을 뜻밖에도 증가시킬 수 있음을 보여주고 있다.
이러한 점에서, 본 발명의 조성물은 보조제로서 하나 이상의 중성 지질을 포함한다. 이러한 조성물은 특히 비율 R이 낮을 경우에 유리하다. 실제로 본 출원인은 중성 지질의 첨가가 핵지질 입자의 형성을 촉진시키고, 놀랍게도, 막을 불안정화시켜 입자의 세포에로의 침투력을 촉진시킬 수 있음을 보여주고 있다.
좀더 바람직하게는, 본 발명의 내용에서 사용된 중성 지질은 2개의 지방쇄를 함유하는 지질이다.
특히 유리한 방법에서는, 생리적 조건하에 양쪽성이온 또는 이온 전하가 결여된 천연 또는 합성 지질을 사용한다. 이는 좀더 특히 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디-스테아로일, -팔미토일, -미리스토일 포스파티딜에탄올아민 및 1번 내지 3번 N-메틸화된 이들의 유도체, 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로사이드(예를 들면 특히 갈락토세레브로사이드), 스핑고리피드(예를 들면 특히 스핑고마이엘린) 또는 대안적으로 아시알로갱글리오사이드(예를 들면 특히 아시알로GM1 및 GM2)로부터 선택된다.
이러한 다양한 지질은 당해 분야의 숙련인에게 익히 공지된 표준 기술에 의해, 합성되거나 기관(예: 뇌) 또는 난으로부터 추출에 의해 수득된다. 특히, 천연 지질의 추출은 유기 용매(Lehniger "생화학" 참조)를 사용하여 수행될 수 있다.
최근에, 본 출원인은 보조제로서, 핵산의 응축과 관련되거나 직접적으로는 관련되지 않은 화합물을 적용하는 것이 특히 유리함을 입증하였다(WO 96/25508).
리포폴리아민에 기본한 형질감염 조성물 중의 이러한 화합물의 존재는 독물학적으로 이로운 결론을 도출함과 동시에, 조성물의 형질감염 활성에 악영향을 미침이 없이 이러한 시제의 양을 상당한 정도로 감소시킬 수 있다. 반면에, 이러한 조성물은 유리하게도 보다 높은 수준의 형질감염을 가진다.
"핵산의 응축과 관련된 화합물"은 직접 또는 간접적으로 핵산을 결집하는 화합물을 정의하는 것으로 이해된다. 좀더 정확하게는, 이 화합물은 형질감염 가능한 핵산에 직접 작용하거나 핵산의 응축에 직접적으로 관련된 연관성 화합물에 작용한다. 바람직하게는, 이는 핵산에 직접 작용한다.
바람직한 양태에 따라, 핵산의 응축에 작용하는 이 시제는 부분적 또는 전체적으로, 펩티드 단위 (KTPKKAKKP) 및/또는 (ATPAKKAA)로 구성되고, 이 단위수는 2 내지 10 범위가 가능하다. 본 발명에 따른 이 화합물의 구조에서, 이러한 단위는 연속적 또는 불연속적으로 반복된다. 따라서, 이는 생화학적 결합, 예를 들면 하나 이상의 아미노산, 또는 화학적 결합에 의해 분리된다. 이러한 시제는 또한 부분적 또는 전체적으로 히스톤, 소핵소, 프로타민 및/또는 이들의 유도체 중 하나로부터 유도될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 중량/중량을 기준으로 핵산 1 당량당 보조제 0.01 내지 20 당량, 바람직하게는, 0.5 내지 5 당량을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 국소, 피부, 경구, 직장, 질, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 등 주사를 위해 제형될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 주사 가능한 제형, 특히 원하는 기관으로의 직접 주사, 또는 국부 투여(피부 및/또는 점막)를 위해 약학적으로 수용 가능한 비히클을 함유한다.이는 특히 멸균 등장액 또는 사례에 따라 멸균수 또는 생리 식염수의 첨가에 의해, 주사 가능한 용액이 제조되도록 하게끔하는 건조 조성물, 특히 동결건조 조성물이다. 주사용으로 사용된 핵산의 투여량 및 투여 횟수는 다양한 파라미터, 특히 사용된 투여 양식, 관련 병리, 발현시키고자 하는 유전자, 또는 원하는 치료의 지속기간에 따라 조절된다. 좀더 특히 투여 양식과 관련해서는, 조직 또는 순환 경로로의 직접 주사, 또는 배양 세포의 처리에 이은 생체내에서의 재이식, 주사 또는 그래프트가 있다.
본 발명은 특히 앞서 규정된 조건하에 생체 내 또는 시험관 내에서 화학식 I의 화합물과 결합하여, 질병을 치료할 수 있는 핵산의 투여를 포함하는 유리한 질병 치료법을 제공한다. 좀더 특히, 본 방법은 단백질 또는 핵산 산물의 결여로 인한 질병에 적용되고 투여된 핵산은 단백질 산물을 암호화하거나 핵산 산물을 함유한다.
본 발명은 생체 내 또는 시험관 내에서 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따른 임의의 리포폴리아민의 사용을 포함한다.
본 발명은 하기의 실시예 및 도면을 사용하여 좀더 상세히 기술될 것이고, 이는 본 발명에 관한 설명을 제한하지 않는 것으로 간주되어야 한다.
실시예 1
H 2 N(CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COGlyN[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (6)의 합성
a-｛Boc-[3-(Boc-｛4-Boc-(3-Boc-아미노프로필)아미노]부틸｝아미노)프로필]아미노｝아세트산(3)의 합성
방법 A에 따라 수득된 수지를 방법 B, C 및 E에 따른 스페르민과 반응시킨다. 보호된 산물을 SiO2상에서 크로마토그래피에 의해 정제한다. 수율은 40%이다.
TLC: Rf= 0.32 (CHCl3/MeOH, 9 : 1)
HPLC, Rt= 4.22 분 (H2O/MeCN: 3 분 [40/60], 3 내지 20 분[0/100], 35 분[0/100])
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, CD3COOD-d4이 약간 첨가된 (CD3)2SO-d6,δppm): 1.40(4 s, 36 H : C(CH3)3); 1.46(mt, 4H : 부틸의 중앙 CH2CH2); 1.64 및 1.74(2 mts, 각각 2 H : 프로필의 중앙 CH2); 2.96(t, J = 7 Hz, 2H : CH2NCOO); 3.15(mt, 8H : CH2NCH2); 3.23(t, J = 7.5 Hz, 2H : CH2NCOO); 3.83(s, 2H : OCONCH2COO).
MH+: 661
b- ｛Z-[3-(Z-｛4-[Z-(3-아미노프로필)아미노]부틸｝아미노)프로필]아미노｝아세트산(4)의 제조
방법 A에 따라 수득된 수지를 방법 B, C 및 D에 따른 스페르민과 반응시킨다. 보호된 산물을 SiO2상에서 크로마토그래피에 의해 정제한다. 수율은 약 20%이다.
TLC: Rf= 0.85 (CHCl3/MeOH, 8 : 2)
HPLC, Rt= 6.92 분 (H2O/MeCN: 3 분 [40/60], 3 내지 20 분[0/100], 35 분[0/100])
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6,413 K 온도에서, δppm): 1.49(mt, 4 H : 부틸의 중앙 CH2CH2); 1.74 및 1.81(2mts, 각각 2H : 프로필의 중앙 CH2); 3.07(q, J = 7Hz, 2H : CH2NCOO벤질); 3.15 내지 3.30(mt, 8 H : CH2NCH2); 3.33(t, J = 7.5 Hz, 2H : NCH2COO); 3.70(s, 2H : OCONCH2COO); 5.07-5.10-5.12 및 5.13(4s, 각각 2H : ArCH2OCON); 6.65(미분리, 다중, 1H : NHCO); 7.25 내지 7.40(mt, 20H : 방향족 H).
MH+: 797
c- Boc-글라이신 -디옥타데실아민 (5).
Boc-글라이신을 방법 F에 따라 디옥타데실아민과 커플링한다; 90% 수율.
TLC: Rf= 0.9 (CHCl3/MeOH, 9 : 1)
MH+: 679
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, CDCl3,δppm): 0.89(t, J = 7Hz, 6 H : CH3); 1.29(mt, 60H : 지방쇄의 중앙 CH2); 1.49(s, 9 H : C(CH3)3); 1.55(mt, 4H : 각각의 지방쇄의 1 CH2); 3.15 및 3.33(2t, J = 7.5 Hz, 각각 2H : 지방쇄의 NCH2); 3.95(d, J = 5 Hz, 2H : OCONCH2CON); 5.57(미분해, 다중., 1H : CONH).
d- H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)18]2(6)
방법 G에 따라 산물 (3) 및 (5) 또는 (4) 및 (5)를 커플링한다. 산물을 Boc로 보호된 산물을 위해 방법 G에서 기술한 바에 따라 탈보호시키고 Z로 보호된 산물을 위해서는 방법 H에서 기술한 방법에 따라 탈보호시킨다. 산물을 반 예비용 HPLC로 정제하고 분획을 HPLC로 분석한다.
HPLC, Rt= 15.35 분 (H2O/MeCN: 3 분 [40/60], 3 내지 20 분[0/100], 35 분[0/100])
BYK 2 0531H NMR 스펙트럼 (400 MHz, CD3COOD-d4이 약간 첨가된 (CD3)2SO-d6,300 K 온도에서, δppm): 0.83(t, J = 7Hz, 6 H : CH3); 1.23(mt, 60H : 지방쇄의 중앙 CH2); 1.43 및 1.53(2 mts, 각각 2 H : 각각의 지방쇄의 1 CH2); 1.63(mt, 4H : 부틸의 중앙 CH2CH2); 1.96(mt, 4H : 프로필의 중앙 CH2); 2. 93 내지 3.00 및 3.22(3mts, 전체 16H : NCH2); 3.83(s, 2H : NCH2CON); 4.03(s, 2H : CONCH2CON).
MH+: 821
실시예 2
H 2 N(CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 CON[(CH 2 ) 18 ] 2 (7)의 제조
방법 F에 따라 산물 (3)을 디옥타데실아민과 커플링하고 방법 G에 따라 탈보호시킨다. 산물을 반-예비용 HPLC로 정제하고 분획을 HPLC로 분석한다.
HPLC, Rt= 15.2 분 (H2O/MeCN: 3 분 [40/60], 3 내지 20 분[0/100], 35 분[0/100])
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, 2/3 CF3COOD와 1/3 CD3COOD-d4의 혼합물,δppm): 0.78(t, J = 7 Hz, 6 H : CH3); 1.20(mt, 60H : 지방쇄의 중앙 CH2); 1.52 (mt, 4 H : 각각의 지방쇄의 1 CH2); 1.80(mt, 4H : 부틸의 중앙 CH2CH2); 2.23 및 2.32(2mts, 각각 2H : 프로필의 중앙 CH2); 3.10 내지 3.40 (3mts, 총 16H : NCH2); 4.15(s, 2H : NCH2CON).
MH+: 764
실시예 3
H 2 N(CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COArgN[(CH 2 ) 18 ] 2 (9)의 합성
a- Boc-Arg(Z2)디옥타데실아미드 (8)
방법 F에 의해 BocArg(Z2)과 디옥타데실아민의 커플링에 의해 산물을 합성하고 수율은 91%이다.
TLC, Rf = 0.9(CHCl3/MeOH, 9 : 1)
MH+: 1046
b-H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)18]2(9)
산물 (3) 및 (4)를 방법 G에 의해 산물 (8)과 커플링시키고 방법 G(Boc) 및/또는 H(Z)에 의해 탈보호시킨다. 최종 산물을 반-예비용 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석용 HPLC로 분석한다.
HPLC, Rt= 13.83 분 (H2O/MeCN: 3 분 [40/60], 3 내지 20 분[0/100], 35 분[0/100])
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6,δppm): 0.90(t, J = 7 Hz, 6 H : CH3); 1.28(mt, 60H : 지방쇄의 CH2); 1.40 내지 1.80(mt, 12H : CH2); 1.93(mt, 4H : 프로필의 중앙 CH2); 2.80 내지 3.10(mt, 16H : 지방쇄의 NCH2및 NCH2); 3.42(mt, 2H: 아미도의 CH2N); 3.77(mt, 2H: NCH2CON); 4.67(mt, 1H : NCHCON); 6.80 내지 7.50(광범위 미분해, 다중, 2H: NH2); 7.78-7.92-8.80 및 9.03(각각 mt 및 3 미분해, 다중, 각각 1H-2H-4H 및 1H : CONH-NH 및 NH2).
MH+: 920
실시예 4
H 2 N(CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COArg(Z) 2 N[(CH 2 ) 17 -CH 3 ] 2 (10)의 합성
산물(3)을 방법 G에 의해 산물(8)과 커플링시키고 동일한 방법으로 Boc 그룹을 절단한다. 산물을 반-예비용 HPLC로 정제하고 분획을 분석용 HPLC로 분석한다.
HPLC, Rt= 17.75 분 (H2O/MeCN: 3 분 [40/60], 3 내지 20 분[0/100], 35 분[0/100])
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO,δppm): 0.87(t, J = 7Hz, 6H: CH3); 1.25(mt, 60H: 지방쇄의 중앙 CH2); 1.40 및 1.57(2mts, 각각 2 H : 각각의 지방쇄의 1 CH2); 1.65(mt, 8H : 부틸의 중앙 CH2CH2); 1.95(mt, 4H, 프로필의 중앙 CH2); 2.85 내지 3.05(mt, 전체 14H : NCH2); 3.23(t, J = 7.5Hz, 2 H : NCH2); 3.75(s, 2H : NCH2CON); 3.85 및 3.95(2mts, 각각 1H : CH2NC); 4.67(mt, 1H: CONCHCON); 5.07 및 5.25(각각 한정 AB 및 s, J = 13.5 Hz, 각각 2H : NCOOCH2Ar); 7.25 내지 7.45(mt, 10H: 방향족 H); 7.95-8.85-9.00 및 9.20(4 미분리, 다중 : 교화가능한 H).
MH+: 1188
실시예 5
H 2 N(CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COLys(로다민)N[(CH 2 ) 17 -CH 3 ] 2 (13)의 합성
a-Boc-Lys(Z)디옥타데실아미드 (11)
방법 F에 의해 디옥타데실아민과 BocLys(C1Z)의 커플링에 의해 산물을 제조하면, 수율은 89%이다.
TLC, Rf = 92(CHCl3/MeOH, 9 : 1)
MH+: 918
b-BocHN(CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBocCH2COLys(C1Z)N[(CH2)17-CH3]2(12)
방법 G(Boc의 탈보호없이)에 의해 산물 (3)을 산물(11)과 커플링한다.
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, 423 K의 온도에서, δ(pm)): 0.92 (t, J = 6.5 Hz, 6H: CH3); 1.32 (mt, 60H: 지방쇄의 중앙 CH2); 1.44 (2s, 총 36H: C (CH3)3); 1.50 내지 1.80 (mt, 16H: 1 각각의 지방쇄의 CH2- 부틸의 중앙 CH2CH2- 프로필의 CH2CH2CH2및 중앙 CH2); 3.00 (q, J = 6.5 Hz, 2H: OCONCH2); 3.05 (q, J = 6.5 Hz, 2H: CH2NCOO); 3.15 내지 3.40 (mt, 14H: 지방쇄의 NCH2- CH2NCH2및 CH2NCH2CH2N); 3.80 (s, 2H: OCONCH2CON); 4.75 (mt, 1H: CONCHCON); 5.15 (s, 2H: NCOOCH2Ar); 5.97 및 6.53 (2 mts, 1H 각각: OCONH 및 NHCOO); 7.08 (d, J = 7.5 Hz, 1H: CONH); 7.30 내지 7.50 (mts, 4H: 방향족 H).
c-H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(로다민)-N[(CH2)17-CH3]2(13)
산물(12)의 리신 상의 ClZ 그룹을 방법 H에 의해 절단하고 이렇게하여 수득된 산물을 진공하에서 건조하고, 에테르에 용해시키고 NaHCO3및 NaCl로 세정한다. 에테르를 MgSO4로 건조하고 진공하에서 증발시킨다.
77 mg (60 μmol)의 탈보호 산물을 3 ml의 MeOH에 용해시키고, DIEA (64 μl)을 첨가하고, 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트 (30 mg, 68 μmol)을 첨가한 후, 용액을 17시간 동안 교반하고 반응을 TLC에 의해 모니터링한다. 다음날, 용액을 진공하에서 건조농축한다. 이어서 TFA(4 ml)를 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 교반하여 방치한다. TFA를 증발시키고 조 산물을 반-예비 HPLC에 의해 최종 수율 30%로 정제한다.
TLC, Rf= 0.05 (MeOH)
HPLC (반-예비) Rt= 61.55 분 (H2O/MeCN: 3 분 [100/0], 3-45 분 [0/100], 45-140 분 [0/100].
MH+: 1355
실시예 6
H 2 N(CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COLys-(바이오티닐)N[(CH 2 ) 17 -CH 3 ] 2 (14)의 합성
산물 (12)을 방법 H (271 mg, 0.21 mmol)에 의해서 탈보호하고 DMF(10 ml)에 용해시킨다. DIEA (0.11 ml)를 첨가한 후 바이오틴 (56.4 mg, 0.23 mmol) 및 BOP (102 mg, 0.23 mmol)를 첨가하고; pH를 10 (DIEA)으로 유지하고 반응 종료를 플루오레스카민 시험에 의해 확인한다. 산물을 방법 F에 기재된 바와 같이 회수하고 추가의 정제없이 TFA (5 ml)로 1시간 동안 탈보호한다. TFA를 증발시키고 산물을 반-예비 HPLC에 의해 50%의 수율로 정제한다.
HPLC, Rt= 13.12 분, (H2O/MeCN: 3 분 [40/60], 3-20 분 [0/100], 35 분 [0/100]
MH+: 1118
실시예 7
{H 2 N(CH 2 ) 3 } 2 N(CH 2 ) 4 N{(CH 2 ) 3 NH 2 }(CH 2 ) 3 NHCH 2 COGlyN[(CH 2 ) 17 -CH 3 ] 2 (16)의 합성
a- {BocNH(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NHBoc}(CH2)3NBocCH2COOH (15)
산물(1)을 방법 B에 의해 중합체에 고정하고, 방법 C에 의해 보호하고 방법 E에 의해 수지로부터 절단한다. 산물을 SiO2에서 수율 35%로 정제한다.
TLC: Rf= 0.2 (CHCl3MeOH, 8:2)
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, CD3COOD-d4가 몇방울 첨가된 (CD3)2SO-d6, 433 K의 온도에서, δ(ppm)): 1.42 (s, 36H: C(CH3)3); 1.56 (mt, 4H: 부틸의 중앙 CH2CH2); 1.65 내지 1.85 (mt, 8H: 프로필의 중앙 CH2); 2.76 (mt, 12H: CH2N(CH2)2); 3.06 (t, J = 6.5 Hz, 6H: OCONCH2); 3.29 (mt, 2H: NCH2); 3.86 (s, 2H: OCONCH2COO).
MH+= 775
b-{H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3-NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2(16)
산물(15)을 방법 G에 따라 산물(5)와 커플링한다. 산물을 방법 G에 의해 탈보호하고 반-예비 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석하고 동결-건조한다. 55% 수율.
HPLC (반-예비): Rt = 38.72 분 (H2O/MeCN, 10 분 [100/0], 10-45 분 [0/100], 45-140 분 [0/100]
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, 386 K의 온도에서, δ(ppm)): 0.90 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3); 1.30 (mt, 60H: 지방쇄의 중앙 CH2); 1.55 (mt, 4H: 1 각각의 지방쇄의 CH2); 1.65 (mt, 4H: 부틸의 중앙 CH2CH2); 1.97 (mt, 8H: 프로필의 중앙 CH2); 2.80 내지 3.05 - 3.06 및 3.28 (mt 및 2t 각각, J = 7.5 Hz, 18H -2H 및 4H: NCH2); 3.80 (s, 2H: NCH2CON); 4.03 (d, J = 5.5 Hz, 2H: CONCH2CON); 6.00 내지 9.00 (광범위 unres. mult.: NH2및 NH); 8.27 (mt, 1H: CONH).
MH+: 935
실시예 8
{H 2 N(CH 2 ) 3 } 2 N(CH 2 ) 4 N{(CH 2 ) 3 NH 2 }(CH 2 ) 3- NHCH 2 CON[(CH 2 ) 17 -CH 3 ] 2 (17)의 합성
이것을 산물 (3) 대신에 산물 (15)을 사용하여 산물 (7)에 대해서와 같이 합성한다. 산물을 반-예비 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석하고 동결건조한다.
HPLC (반-예비): Rt= 38 분 (H2O/MeCN, 10 분 [100/0], 10-45 분 [0/100], 45-140 분 [0/100]
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, CD3COOD-d4가 몇방울 첨가된 (CD3)2SO-d6, δ(ppm)): 0.88 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3); 1.29 (mt, 60H: 지방쇄의 중앙 CH2); 1.52 (mt, 4H: 1 각각의 지방쇄의 CH2); 1.68 (mt, 4H: 부틸의 중앙 CH2CH2); 1.90 내지 2.10 (mt, 8H: 프로필의 중앙 CH2); 2.90 내지 2.95 내지 3.15- 3.18 및 3.15 (t, mt 및 2 광범위 t 각각, J = 7.5 Hz, 총 24H: NCH2); 4.02 (s, 2H: NCH2CON).
MH+: 878
실시예 9
{H 2 N(CH 2 ) 2 } 2 N(CH 2 ) 2 NHCH 2 COGlyN[(CH 2 ) 17 -CH 3 ] 2 (19)의 합성
a-{BocNH(CH2)2}2N(CH2)2NBocCH2COOH (18)
이것을 산물 (1) 대신에 트리스(아미노에틸)아민을 사용하여 산물 (15)에 대해서와 같이 합성한다. 29% 수율.
TLC: Rf= 0.55 (CHCl3/MeOH, 8:2)
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, 393 K의 온도에서 (CD3)2SO-d6, δ (ppm)): 1.44 (s, 27H: C(CH3)3); 2.58 (t, J = 6.5 Hz, 4H: CH2NCH2); 2.66 (t, J = 7 Hz, 2H: NCH2); 3.04 (q, J = 6.5 Hz, 4H: OCONCH2); 3.28 (t, J = 7 Hz, 2H: OCONCH2); 3.76 (s, 2H: OCONCH2COO); 6.06 (unres. mult., 2H: CONH).
MH+= 505
b-{H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2COGlyN[(CH2)17-CH3]2) (19)
이것을 산물 (15) 대신에 산물 (18)을 사용하여 산물 (17)에 대해서와 같이 합성한다. 65% 수율.
HPLC, Rt= 122 분 (H2O/MeCN, 10 분 [100/0], 10-45 분 [0/100], 45-140 분 [0/100]
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, CD3COOD-d4가 몇방울 첨가된 (CD3)2SO-d6, δ (ppm)): 0.87 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3); 1.15 내지 1.35 (mt, 60H: 지방쇄의 중앙 CH2); 1.45 및 1.55 (2 mts, 각각 2H: 1 각각의 지방쇄의 CH2), 2.64 (t, J = 5.5 Hz, 4H: CH2NCH2); 2.75 (t, J = 6 Hz, 2H: NCH2); 2.95 (t, J = 5.5 Hz, 4H: NCH2); 3.08 (t, J = 6 Hz, 2H: NCH2); 3.25 (mt, 4H: 지방쇄의 NCH2); 3.88 (s, 2H: NCH2CON); 4.06 (d, J = 5 Hz, 2H: CONCH2CON); 7.75 (잔여 광범위 unres. mult.: NH); 8.68 (잔여 t, J = 5 Hz: CONH).
MH+: 765
실시예 10
{H 2 N(CH 2 ) 2 } 2 N(CH 2 ) 2 NHCH 2 CON[(CH 2 ) 17 -CH 3 ] 2 (20)의 합성
이것을 산물 (5) 대신에 디옥타데실아민을 사용하여 산물 (19)에 대해서와 같이 합성한다. 73% 수율.
HPLC, Rt= 100.1 분 (H2O/MeCN, 10 분 [100/0], 10-45 분 [0/100], 45-140 분 [0/100]
MH+: 708
실시예 11
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COLysN[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (21) (RPR 127888 A)의 합성
산물 (12)을 방법 H (Cl-Z), 이어서 방법 I에 의해 탈보호한다. 최종 산물을 반-예비용 HPLC에 의해서 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해서 분석한다.
HPLC, Rt= 11.76 분, (H2O/MeCN, 3 분 [60/40], 3-20 분 [0/100], 35 분 [0/100]
MH+: 892
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, 393 K의 온도에서, δ (ppm)): 0.91 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.31 (mt, 60H: 지방쇄의 중앙 (CH2)15); 1.35 내지 1.75 (mt, 10H: 1 각각의 지방쇄의 CH2, 라이실의 중앙 (CH2)3); 1.75 (mt, 4H: 부틸의 중앙 (CH2)2); 2.00 (mt, 4H: 프로필의 CH2); 2.82 - 2.98 - 3.06 및 3.10 내지 3.50 (2t - mt 및 2 unres. mult. 각각, J = 7 Hz, 총 18H: 라이실의 NCH2- 부틸의 NCH2- 프로필의 NCH2및 지방쇄의 NCH2); 3.62 (s, 2H: NCH2CON); 4.73 (q, J = 7 Hz, 1H: 라이실의 CONCHCON); 8.18 (d, J = 7 Hz, 라이실의 1H: CONH).
실시예 12
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COLys(Cl-Z[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (22) (RPR 122759 A)의 합성
산물을 방법 I에 의해서 탈보호한다. 최종 산물을 반-예비용 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt= 16.79 분, (H2O/MeCN, 3 분 [60/40], 3-20 분 [0/100], 35 분 [0/100]
MH+: 1060
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, 393 K의 온도에서, d (ppm)): 0.91 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.31 (mt, 60H: 지방쇄의 중앙 (CH2)15); 1.30 내지 1.75 (mt, 10H: 1 각각의 지방쇄의 CH2, 라이실의 중앙 (CH2)3); 1.72 (mt, 4H: 부틸의 중앙 (CH2)2); 1.95 (mt, 4H: 프로필의 CH2); 2.98 - 3.06 및 2.90 내지 3.50 (2 mts 및 unres. mult. 각각, 총 18H: 라이실의 NCH2- 부틸의 NCH2- 프로필의 NCH2및 지방쇄의 NCH2); 3.59 (s, 2H: NCH2CON); 4.75 (q, J = 7 Hz, 1H: 라이실의 CONCHCON); 5.16 (s, 2H: COOCH2Ar); 6.85 (unres. mult., 1H: OCONH); 7.35 내지 7.55 (mt, 5H: 방향족 H); 8.15 (unres. mult., 1H: 라이실의 CONH).
실시예 13
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COLys(CHO)N[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (24) (RPR 122760 A)의 합성
a- NHBoc(CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBocCH2COLysN-[(CH2)17CH3]2(23)
산물(12)을 방법 H (Cl-Z)에 의해서 수율 65%로 탈보호하고, 추가의 정제없이 사용한다.
HPLC, Rt = 20.82 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
b- NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(CHO)N[(CH2)17CH3]2(24)
산물(23)을 방법 G에 의해서 포름산과 커플링한다. 산물을 반-예비 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 13.60 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 920
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, 383 K의 온도에서, d (ppm)): 0.92 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.31 (mt, 60H: 지방쇄의 중앙 (CH2)15); 1.35 내지 1.70 (mt, 10H: 1 각각의 지방쇄의 CH2, 라이실의 중앙 (CH2)3); 1.73 (mt, 4H: 부틸의 중앙 (CH2)2); 1.98 (mt, 4H: 프로필의 CH2); 2.85 내지 3.50 (mt, 18H: 라이실의 NCH2- 부틸의 NCH2- 프로필의 NCH2및 지방쇄의 NCH2); 3.62 (s, 2H: NCH2CON); 4.75 (mt, 1H: 라이실의 CONCHCON); 7.60 (unres. mult., 1H: CONH); 8.05 (광범위 s, 1H: 알데히드의 CH); 8.18 (unres. mult., 1H: 라이실의 CONH).
실시예 14
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COLys[콜레스테롤]N[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (25) (RPR 128142 A)의 합성
산물(23)을 방법 G에 따라서(BOP 시제를 사용하지 않고) 콜레스테롤 클로로포르메이트와 커플링한다. 산물을 반-예비 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 21.66 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 1304
1H NMR 스펙트럼 (600 MHz, (CD3)2SO-d6, 383 K의 온도에서, d (ppm)): 0.68 및 0.98 (2s, 3H 각각: 콜레스테롤의 18에서 CH3및 19에서 CH3); 0.86 (mt, 12H: 지방쇄의 CH3, 콜레스테롤의 26 및 27에서 CH3); 0.91 (d, J = 7 Hz, 3H: 콜레스테롤의 21에서 CH3); 1.31 (mt, 60H: 지방쇄의 중앙 (CH2)15); 0.80 내지 2.30 (mt, 42H: 1 각각의 지방쇄의 CH2-콜레스테롤의 1, 2, 4, 7, 11, 12, 15, 16, 22, 23 및 24에서 CH2- 콜레스테롤의 8, 9, 14, 17, 20 및 25에서 CH - 라이실의 중앙 (CH2)3및 프로필의 CH2) ; 1.65 (mt, 4H: 부틸의 중앙 (CH2)2); 2.88 및 2.96 (2 mts, 총 14H: 라이실의 NCH2- 부틸의 NCH2- 프로필의 NCH2); 3.20 내지 3.50 (mt, 4H: 지방쇄의 NCH2); 3.64 (s, 2H: NCH2CON); 4.23 (mt, 1H: 콜레스테롤의 3에서 CH); 4.63 (mt, 1H: 라이실의 CONCHCON); 5.30 (mt, 1H: 콜레스테롤의 6에서 CH), 6.98 (mt, 1H: NHCOO); 7.90 (mt, 1H: 라이실의 CONH); 8.60 내지 9.10 (교환가능한 unres. mults.).
실시예 15
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COLys[아라키도닐]-N[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (26) (RPR 130605)의 합성
산물(23)을 방법 G에 따라서 아라키돈산과 커플링하고 빛으로부터 보호한다. 산물을 반-예비 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 13.60 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 1177
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, CD3COOD-d4가 몇방울 첨가된 (CD3)2SO-d6, 393 K의 온도에서, d (ppm)): 0.90 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 0.91 (t, J = 7 Hz, 3H: 아라키도닐의 CH3); 1.31 (mt, 60H: 지방쇄의 중앙 (CH2)15); 1.35 내지 1.75 (mt, 18H: 1 각각의 지방쇄의 CH2- 아라키도닐의 중앙 (CH2)3및 중앙 CH2및 라이실의 중앙 (CH2)3); 1.75 (mt, 4H: 부틸의 중앙 (CH2)2); 2.02 (mt, 4H: 프로필의 CH2); 2.10 (mt, 6H: COCH2및 아라키도닐의 2 =CCH2); 2.85 - 2.97 - 3.06 및 3.10 내지 3.50 (mt - t - mt 및 2 unres. mults. 각각, J = 7 Hz, 총 24H: 아라키도닐의 =CCH2C= - 라이실의 NCH2- 부틸의 NCH2- 프로필의 NCH2및 지방쇄의 NCH2); 3.62 (s, 2H: NCH2CON); 4.73 (dd, J = 8 및 5 Hz, 1H: 라이실의 CONCHCON); 5.38 (mt, 8H: 아라키도닐의 CH=CH).
실시예 16
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COGluN[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (28) (RPR 126097 A)의 합성
a- Boc-Glu(O-Bz)-디옥타데실아민 (27)
산물을 방법 F에 의해서 Boc-Glu(OBz)와 디옥타데실아민의 커플링에 의해서 수율 90%로 합성한다.
TLC, Rf = 0.88 (CHCl3/MeOH, 9:1)
b- NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGluN[(CH2)17CH3]2(28)
산물 (3) 또는 (4)를 방법 G에 이어서 방법 H (Cl-Z 탈보호)에 의해서 산물 (27)과 커플링한다. 최종 산물을 반-예비 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 14.64 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 893
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, 383 K의 온도에서, d (ppm)): 0.90 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.30 (mt, 60H: 지방쇄의 중앙 (CH2)15); 1.56 (unres. mult., 4H: 1 각각의 지방쇄의 CH2); 1.60 내지 2.00 (mt, 2H: 글루타릴의 중앙 (CH2)); 1.73 (mt, 4H: 부틸의 중앙 (CH2)2); 1.98 (mt, 4H: 프로필의 CH2); 2.32 (t, J = 7 Hz, 2H: 글루타릴의 CONH2); 3.00 - 3.06 및 3.45 (t 및 2 mts 각각, J = 7 Hz, 총 16H: 부틸의 NCH2- 프로필의 NCH2및 지방쇄의 NCH2); 3.65 (광범위 s, 2H: NCH2CON); 4.85 (mt, 1H: 글루타릴의 CONCHCON); 8.19 (광범위 s, 1H: 글루타릴의 CONH).
실시예 17
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COGluN(O-Bz)N[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (29) (RPR 123027 A)의 합성
산물 (3)을 방법 G (Boc)에 의해서 산물(27)과 커플링하고 탈보호한다. 최종 산물을 반-예비용 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 16.02 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 983
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, 413 K의 온도에서, d (ppm)): 0.89 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.30 (mt, 60H: 지방쇄의 중앙 (CH2)15); 1.55 (unres. mult., 4H: 1 각각의 지방쇄의 CH2); 1.72 (mt, 4H: 부틸의 중앙 (CH2)2); 1.75 내지 2.00 (mt, 2H: 글루타릴의 중앙 CH2); 1.99 (mt, 4H: 프로필의 CH2); 2.47 (t, J = 7 Hz, 2H: 글루타릴의 CONH2); 2.95 - 3.05 및 3.40 (3 mts, 총 16H: 부틸의 NCH2- 프로필의 NCH2및 지방쇄의 NCH2); 3.62 (광범위 s, 2H: NCH2CON); 4.85 (mt, 1H: 글루타릴의 CONCHCON); 5.14 (한정 AB, J = 12 Hz, 2H: 벤질의 CH2); 7.35 (mt, 5H: 벤질의 방향족 H); 8.23 (unres. mult., 1H: 글루타릴의 CONH).
실시예 18
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COGlu[갈락토사미드]N[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (31) (RPR 130596 A)의 합성
a- BocNH(CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBocCH2COGluN[(CH2)17CH3]2(30)
산물(3)을 방법 H (Cl-Z)에 의해서 산물(27)로 커플링하고 측쇄의 OBz 보호 그룹을 절단하고, 산물을 추가의 정제없이 사용한다.
HPLC, Rt = 22.84 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 1293
b- NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlu(갈락토사미드)N[(CH2)17CH3]2(31)
산물 (30)을 방법 G에 따라서 D-(+)-갈락토사민 하이드로클로라이드와 커플링한다. 산물을 반-예비 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 13.71 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 1054
실시예 19
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COGlu[갈락토사미드]N[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (32) (RPR 130595 A)의 합성
산물 (30)을 방법 G에 따라서 D-(+)-갈락토사민 하이드로클로라이드와 커플링한다. 산물을 반-예비용 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 12.27 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 1054
실시예 20
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COGlu[맨노사미드]-N[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (33) (RPR 130598 A)의 합성
산물 (30)을 방법 G에 따라서 D-(+)-맨노사민 하이드로클로라이드와 커플링한다. 산물을 반-예비용 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 12.98 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 1054
실시예 21
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COGlu(N(CH 3 ) 2 N[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (34) (RPR 131111 A)의 합성
산물 (30)을 방법 G에 따라서 디메틸아민과 커플링한다. 산물을 반-예비 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 14.44 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 920
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, d (ppm)): 0.89 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.25 (mt, 60H: 지방쇄의 중앙 (CH2)15); 1.43 내지 1.60 (2 mts, 2H 각각: 1 각각의 지방쇄의 CH2) ; 1.65 (mt, 4H: 부틸의 중앙 (CH2)2; 1.65 및 1.85 내지 2.00 (2 mts, 1H 각각: 글루타릴의 중앙 CH2); 1.95 (mt, 4H: 프로필의 CH2); 2.32 (한정 AB, 2H: 글루타릴의 COCH2); 2.80 및 2.92 (2s, 3H 각각: CON(CH3)2); 2.85 내지 3.05 (mt, 12H: 부틸의 NCH2- 프로필의 NCH2); 3.00 - 3.22 - 3.45 및 3.58 (4 mts, 1H 각각: 지방쇄의 NCH2); 3.78 (AB, J = 16 Hz, 2H: NCH2CON); 4.75 (mt, 1H: 글루타릴의 CONCHCON); 8.72 (d, J = 7.5 Hz, 1H: 글루타릴의 CONH); 8.85 및 8.90 내지 9.15 (교환가능한 unres. mults.).
실시예 22
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COGlyN[(CH 2 ) 12 CH 3 ] 2 (35) (RPR 122767 A)의 합성
이것을 디옥타데실아민 대신에 디도데실아민을 사용함을 제외하고는 산물 (6)에서와 동일한 방법으로 합성한다. 산물을 반-예비용 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 9.54 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 653
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, 403 K의 온도에서, d (ppm)): 0.93 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.33 (mt, 36H: 지방쇄의 중앙 (CH2)9); 1.58 (mt, 4H: 1 각각의 지방쇄의 CH2) ; 1.75 (mt, 4H: 부틸의 중앙 (CH2)2); 1.95 및 2.00 (2 mts, 2H 각각: 프로필의 CH2); 2.98 및 3.00 (2 mts, 총 12H: 부틸의 NCH2- 프로필의 NCH2); 3.30 (t, J = 7 Hz, 4H: 지방쇄의 NCH2); 3.58 (s, 2H: NCH2CON); 4.05 (s, 2H: 글루타릴의 CONCH2CON).
실시예 23
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COGlyN[(CH 2 ) 12 CH 3 ] 2 (36) (RPR 122774 A)의 합성
이것을 디옥타데실아민 대신에 디트리데실아민을 사용함을 제외하고는 산물 (6)에서와 동일한 방법으로 합성한다. 산물을 반-예비용 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 10.64 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 681
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, 393 K의 온도에서, d (ppm)): 0.91 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.33 (mt, 40H: 지방쇄의 중앙 (CH2)10); 1.58 (mts, 4H: 1 각각의 지방쇄의 CH2) ; 1.75 (mt, 4H: 부틸의 중앙 (CH2)2); 2.00 (mt, 4H: 프로필의 중앙 CH2); 2.98 및 3.08 (2t, J = 7 Hz, 총 12H: 부틸의 NCH2및 프로필의 NCH2); 3.32 (t, J = 7 Hz, 4H: 지방쇄의 NCH2); 3.65 (s, 2H: NCH2CON); 4.06 (d, J = 4 Hz, 2H: 글루타릴의 CONCH2CON); 8.60 (광범위 s, 1H: 글라이실의 CONH).
실시예 24
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COGlyN[(CH 2 ) 13 CH 3 ] 2 (37) (RPR 122766 A)의 합성
이것을 디옥타데실아민 대신에 디테트라데실아민을 사용함을 제외하고는 산물 (6)에서와 동일한 방법으로 합성한다. 산물을 반-예비용 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 9.92 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 709
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, 393 K의 온도에서, d (ppm)): 0.90 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.31 (mt, 44H: 지방쇄의 중앙 (CH2)11); 1.58 (mt, 4H: 1 각각의 지방쇄의 CH2) ; 1.76 (mt, 4H: 부틸의 중앙 (CH2)2); 2.00 (mt, 4H: 프로필의 중앙 CH2); 2.98 및 3.08 (mt 및 t 각각, J = 7 Hz, 총 12H: 부틸의 NH2및 프로필의 NCH2); 3.30 (t, J = 7 Hz, 4H: 지방쇄의 NCH2); 3.65 (s, 2H: NCH2CON); 4.06 (d, J = 4 Hz, 2H: 글루타릴의 CONCH2CON); 8.10 (unres. mult., 1H: 글라이실의 CONH).
실시예 25
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 N[(CH 2 ) 3 NH 2 ]CH 2 COGlyN[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (39) (RPR 126096 A)의 합성
a- BocNH(CH2)3NBoc(CH2)4N[(CH2)3NHBoc]CH2CO2H (38)의 합성
산물 (3)의 합성 동안에, 부산물(38)을 SiO2정제 도중 회수한다.
수율은 8%이다.
TLC Rf = 0.32 (CHCl3/MeOH, 9:1)
MH+: 561
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, d (ppm)): 1.30 내지 1.60 (mt, 4H: 부틸의 중앙 (CH2)2); 1.40 (s, 27H: C(CH3)3); 1.56 (mt, 4H: 프로필의 CH2); 2.68 및 3.11 (광범위 t 및 t 각각, J = 7 Hz, 4H 각각: 부틸의 NCH2및 프로필의 NCH2); 2.90 및 2.96 (2q, J = 7 Hz, 2H 각각: 프로필의 BocNHCH2); 3.18 (s, 2H: NCH2COO).
b- NH2(CH2)NH(CH2)4N[(CH2)3NH2]CH2COGlyN[(CH2)17CH3]2(39)
산물 (38) 및 (5)를 방법 G에 따라 커플링한다. 산물을 반-예비 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 13.60 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 821
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, CD3COOD-d4가 몇방울 첨가된 (CD3)2SO-d6, d (ppm)): 0.87 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.28 (mt, 60H: 지방쇄의 중앙 (CH2)15); 1.46 및 1.54 (2 mts, 2H 각각: 1 각각의 지방쇄의 CH2) ; 1.63 (mt, 4H: 부틸의 중앙 (CH2)2); 1.91 (mt, 4H: 프로필의 CH2); 2.85 내지 3.15 (mt, 12H: 부틸의 NH2및 프로필의 NCH2); 3.24 (mt, 4H: 지방쇄의 NCH2); 3.76 (unres. mult., 2H: NCH2CON); 4.05 (광범위 s, 2H: 글루타릴의 CONCH2CON).
실시예 26
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 3 CON[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (41) (RPR 122786 A)의 합성
a- BocNH(CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBoc(CH2)CO2H (40)
산물 (40)을 용액중의 NaCNBH3및 숙신산 세미알데히드의 존재하에 스퍼민에서의 환원성 알킬화를 사용하여 합성한다.
1.8 g의 스퍼민, 60 ml의 메탄올 및 0.138 g의 NaCNBH3를 200 ml 둥근 바닥 플라스크에 부여한다. 용액을 심한 자기 교반하에 배치한다. 30 ml의 메탄올 중의 5.5 ml의 숙신 세미알데히드 (15%)의 용액을 압력-동등화 적하 퓨넬에 의해서 100분에 걸쳐서 실행한다. 교반을 100분 동안 계속한다. 아민을 하기와 같이 Boc 그룹으로 보호한다: 2.8 ml의 TEA를 배지에서 수행한 후, 8.8 g의 디-3급-부틸 디카보네이트를 30 ml의 메탄올에 용해시킨다. 교반을 밤새 계속한다. 배지를 진공하에서 농축하고, 산물을 에틸 아세테이트에 용해시키고 NaHCO3의 분획 50 ml로 3회 추출하고 수성상을 결합하고 에테르 (3x100ml)로 세정한다. 수성상의 pH를 KHSO4로 3으로 낮추고, 산물 (41)의 침전으로 인한 탁도를 관찰하고 혼합물을 에틸 아세테이트 (3x100 ml)로 추출한다. 유기상을 MgSO4로 건조하고 진공하에 증발시킨다. 산물을 추가의 정제없이 사용한다.
b- NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH(CH2)3CON[(CH2)17CH3]2(41)
산물 (40)을 방법 G에 따라 커플링한다. 산물을 반-예비 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 15.04 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 792
1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, (CD3)2SO-d6, d (ppm)): 0.85 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.22 (mt, 60H: 지방쇄의 CH3); 1.48 (unres. mult., 4H: 1 각각의 지방쇄의 CH2); 1.72 (mt, 4H: 부틸의 중앙 (CH2)2); 1.88 (mt, 2H: 아미노펜타노일의 CH2); 1.99 (mt, 4H: 프로필의 CH2); 2.42 (t, J = 7 Hz, 2H: 아미노펜타노일의 COCH2); 2.96 - 3.03 및 3.22 (3 mts, 총 18H: 아미노펜타노일의 NCH2- 부틸의 NCH2- 프로필의 NCH2및 지방쇄의 NCH2).
실시예 27
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 CONH(CH 2 ) 5 CON[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (42) (RPR 128506 A)의 합성
이것을 BocGly 대신에 Boc-6-아미노카프로산을 사용함을 제외하고는 산물 (6)과 동일한 방법으로 합성한다. 산물을 반-예비용 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 13.94 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 877
1H NMR 스펙트럼 (300 MHz, (CD3)2SO-d6, d (ppm)): 0.87 (t, J = 7 Hz, 6H: 지방쇄의 CH3); 1.28 (mt, 60H: 지방쇄의 중앙 (CH2)15); 1.48 (mt, 10H: 1 각각의 지방쇄의 CH2및 아미노헥사노일의 중앙 (CH2)3) ; 1.65 (mt, 4H: 부틸의 중앙 (CH2)2); 1.95 (mt, 4H: 프로필의 CH2); 2.27 (t, J = 7 Hz, 2H: 아미노헥사노일의 COCH2); 2.85 내지 3.30 (mts, 18H: 아미노헥사노일의 NCH2- 부틸의 NCH2- 프로필의 NCH2및 지방쇄의 NCH2); 3.70 (광범위 s, 2H: NCH2CON); 7.90 내지 9.10 (교환가능한 unres. mults.).
실시예 28
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COGlu(11-아미드-언데카닐, 헵타, O 아세틸 락토즈) N[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (43) (RPR 130765 A)의 합성
산물(30)을 방법 G에 따라서 11-아미노언데카닐헵타-O-아세틸락토즈와 커플링한다. 산물을 반-예비용 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 15.91 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 1680
실시예 29
NH 2 (CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NHCH 2 COAsm(β-NAc(Ac) 3 )N[(CH 2 ) 17 CH 3 ] 2 (RPR 131283 A) (45)의 합성
a- Fmoc-Asm-β-Glc-NAc(Ac)3-디옥타데실아민 (44)
산물을 방법 F에 의해 Fmoc-Asm-β-Glc-NAc(Ac)3-OH과 디옥타데실아민의 커플링에 의해서 합성한다.
TLC Rf = 0.67 (CHCl3/MeOH, 9:1)
HPLC, Rt = 25.31 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
b-NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COAsm(β-NAc(Ac)3)N[(CH2)17CH3]2(45)
산물 (45)로부터 Fmoc 그룹을 절단한다.
20 ml의 DMF 및 2 ml의 디에틸아민을 0.7 g의 산물 (45)에 따른다. 6시간 동안 교반한 후, 배지를 진공에서 농축한다.
수득된 산물을 방법 G에 따라서 산물 (3)과 커플링한다. 산물을 반-예비 HPLC에 의해 정제하고 분획을 분석 HPLC에 의해 분석한다.
HPLC, Rt = 15.35 분, (H2O/MeCN: 3분 [60/40], 3-20분 [0/100], 35분 [0/100]
MH+: 1207
실시예 30
산물 (6) 용액중의 대규모 합성
산물 (6)을 용액중의 NaCNBH3및 글리옥살산의 존재하에 스퍼민에서의 환원성 알킬화를 실행함으로써 합성한다.
18.2 g의 스퍼민, 500 ml의 메탄올 및 2 g의 NaCNBH3를 2 l의 둥근 바닥 플라스크에 부여한다. 용액을 심하게 자기 교반하도록 한다. 300 ml의 메탄올 중의 8.45 g의 글리옥실산 용액을 균압 적가 깔때기에 의해서 100분에 걸쳐서 실행한다. 교반을 밤새 계속한다. 아민을 하기와 같이 Boc로 보호한다: 14 ml의 TEA를 배지에서 수행한 후, 100 g의 디-3급-부틸 디카보네이트를 200 ml의 THF에 용해시킨다. 교반을 밤새 계속한다. 배지를 진공하에 농축하고, 산물을 에틸 아세테이트 (250 ml)에 용해시키고 KHSO4(6x100 ml)과 이어서 포화 NaCl 용액 (3x100 ml)으로 세정하고, MgSO4로 건조하고 진공하에서 증발시킨다. 산물을 용출제로서 CHCl3/MeOH (9:1)의 실리카의 컬럼에서 정제한다. 산물을 함유하는 분획을 TLC에 의해서 동정하고, 합하고 진공하에서 증발시켜서 10 g의 산물 (6)을 생성한다 (총 합성에 대해 17% 수율).
분석 HPLC, 질량 스펙트럼 및 NMR 분석이 고체-상 방법에 의해 수득된 산물의 것들과 동일하다.
실시예 31
(7) RPR 120534A, (6) RPR 120535A 및 (9) RPR 120531A 형질감염의 효능에 대한 (아민/포스페이트) 전하 비의 영향
2 cm2의 지수 생장상의 1 x 105세포의 샘플 [NIH 3T3, 3LL 또는 SMC 토끼]을 다양한 전하비를 갖는 리포펙탄트/pCMV-LUC 용액으로 2시간 동안 37℃에서 5% CO2하에 처리하고; 각각의 샘플에 2 μg의 핵산을 제공한다. 리포터 유전자의 발현에 대한 조사는 태송아지 혈청을 8%의 최종 농도로 첨가하고 이어서 40 시간 동안 CO2오븐에서 배양한 후 수행한다.
루시페라제 활성을 루시페린, 조효소 A 및 ATP의 존재시에 10초 동안 광 방출 [RLU = 상대적인 광 단위]에 의해 분석하고 2000 처리 세포에 관하여 생성한다. 수득된 결과를 도 (1), (2) 및 (3)에 제시하였다.
이러한 도면을 연구함으로부터, 지질부와 폴리아민 간의 "스페이서" 암 내의 글라이신의 존재는 나노몰 양이온성 지질 대 낮은 μg DNA 비에 대한 더 양호한 형질감염 효능을 수득함을 가능하게 한다는 점이 명백히 나타난다.
실시예 32
(20) RPR 120527A, (19) RPR 120528A, (17) RPR 120526 및 (16) RPR 120525A 형질감염의 효능에 대한 (아민/포스페이트) 전하 비의 영향
2 cm2의 지수 생장상의 1 x 105세포의 샘플을 다양한 전하비를 갖는 리포펙탄트/pCMV-LUC 용액으로 2시간 동안 37℃에서 5% CO2하에 처리하고; 각각의 샘플에 1 μg의 핵산을 제공한다. 리포터 유전자의 발현에 대한 조사는 태송아지 혈청을 8%의 최종 농도로 첨가하고 이어서 40 시간 동안 CO2오븐에서 배양한 후 수행한다.
루시페라제 활성을 10초 동안 광 방출 [RLU = 상대적인 광 단위]에 의해 분석하고 단백질 mg에 관하여 생성한다. 수득된 결과를 도 (4)에 제시하였다. "스페이서" 암 내의 글라이신 잔기의 존재의 장점이 이러한 실시예에서 다시 설명된다.
실시예 33
(6) RPR 120535, (41) RPR 122786 및 (42) RPR 128506 형질감염의 효능에 대한 스페이서 암의 길이의 영향
2 cm2의 지수 생장상의 1 x 105세포의 샘플 [NIH3T3 및 HeLa]을 다양한 양이온성 지질의 농도를 갖는 양이온 지질/pCMV-Luc 혼합물로 혈청 단백질의 부재하에 2시간 동안 5% CO2하의 습한 대기의 37℃에서 처리한다. 이어서 세포 생장을 최종 농도 8%로 태송아지 혈청으로 보충하고 트랜스진 발현을 CO2오븐에서 추가의 40시간 배양 후 측정한다.
스페이서 암의 구조적인 특성은 하기와 같다:
RPR No. 스페이서 암
122786 -
120535 Gly
128506 NH2(CH2)5CO
하기의 표 1은 각각의 시험 산물로 수득된 최대 효능에 대해 발현되는 수득된 결과를 생성한다.
양이온 지질 HeLa 세포 NH3T3 세포
실험 1 RPR120535 (6) 1.2x106±9.7x104(4) 8.7x107±4.5x106(4)
RPR122786 (41) 2.3x106±1.6x105(8) 4.6x107±5.0x106(8)
실험 2 RPR120535 (6) 2.4x106±3.2x105(6) 7.2x107±8.3x106(6)
RPR128506 (42) 1.8x106±1.3x105(6) 5.0x107±1.5x106(6)
형질감염 효능을 처리된 RLU/10s/2x103세포에 부여한다. 지질의 나노몰/ DNA μg의 비를 괄호에 나타내었다.
상이한 플라스미드를 실험 1과 2에 대해, 실험 1과 2에서 각각 1 μg 및 0.5 μg의 DNA/1x105세포의 용량으로 사용한다.
실시예 34
(6) RPR 120535 형질감염 효능에 대한 스페이서 암의 구조의 영향
추가의 세포주 (3LL 세포)의 도입을 제외하고는 상기 실시예에 기재된 것과 동일한 실험 조건하에서, 수득된 형질감염 효능을 Arg-형, Lys-형 또는 Glu-형 그룹을 갖는 "스페이서 암"에서의 치환에 의해 변경된 양이온성 지질 (6) RPR 120535와 비교한다.
다양한 스페이서 암의 구조는 하기와 같다.
120535 Gly
123027 GluOBz
126097 Glu
형질감염 효능을 처리된 RLU/10초/2x103세포에 부여한다.
상이한 플라스미드를 실험 1과 2에 대해, 실험 1과 2에서 각각 0.5 μg 및 1 μg의 DNA/1x105세포의 용량으로 사용한다. 결과의 분석으로부터, 고려된 세포에 따라 바람직하게 치환된 아미노산의 존재가 더 양호한 형질감염 효능을 유도함이 나타난다.
지질 HeLa 세포 NIH3T3 세포 3LL 세포
실험 1 RPR120535 1.0x106±1.9x105 6.5x107±4.8x106
RPR120531 3.7x105±1.0x105 1.6x107±2.0x106
RPR121650 2.6x106±1.8x105 9.1x107±2.7x107
실험 2 RPR120535 2.2x106±3.3x105 1.7x106±1.0x105
RPR127888 3.1x105±2.9x104 1.4x105±1.7x104
RPR122760 1.4x106±2.2x105
RPR122759 7.7x105±1.1x105 3.7x105±5.4x104
RPR128142 6.3x106±6.3x105 9.1x104±9.3x103
RPR126097 3.6x106±3.6x105 3.0x105±9.3x103
RPR123027 1.0x106±4.1x104 6.9x105±1.1x105
실시예 34
리포펙탄트 혼합물/DNA 혼합물 (9) RPR 120531A내의 DOPE의 존재의 영향
실시예 31에 사용된 것과 동일한 절차에 따라서, DOPE(디올레오일포스파티딜에탄올아민)을 DNA를 형질감염 혼합물에 첨가하기 전에 다양한 비로 양이온 지질 (9) RPR 120531A에 첨가한다.
루시페라제 활성을 세포의 용해 후 상등액에서 분석하고 단백질 mg에 대하여 생성한다 (도 5).
리포펙탄트 혼합물내 DOPE의 존재가 (9) RPR 120531A의 농도가 낮은 때 형질감염 효능을 개선함을 가능하게 한다.
실시예 35
(6) RPR 120535, (9) RPR 120531A 및 (10) RPR 121650A 형질감염 효능에 대한 혈청의 영향
2 cm2의 지수 생장상의 1 x 105세포의 샘플 [NIH 3T3 또는 HeLa]을 배지내 2시간 동안 혈청의 부재하에 또는 혈청의 존재하에 리포펙탄트/pCMV-LUC 용액 (3 나노몰 리포펙탄트/ μg DNA)으로 처리한다. 이 실시예에서, 각각의 샘플에 2 μg의 DNA를 제공한다. 루시페라제의 발현을 세포 용해물의 상등액에서 연구하고, RLU/10s로서 표현하고 단백질 mg에 관하여 생성한다. 결과의 분석으로부터, 혈청의 존재가 형질감염에 대해 감지할만한 효과를 지니지 않음이 나타난다.
실시예 36
DNA 리포펙탄트 혼합물 (20) RPR 120527A, (19) RPR 1205028A, (17) RPR 120526 A 및 RPR 120525A내 핵산 농도의 영향
실시예 31에 기재된 조건 하에서, NIH 3T3 세포의 샘플을 나노몰 리포펙탄트/DNA의 μg의 비가 최고로 활용되는 조건 하에서 형질감염시킨다 - 실시예 30 참조 - [(20) RPR 120527A 및 (19) RPR 120528A에 대한 비 = 6 - (17) RPR 120526A 및 (16) RPR 120525A에 대한 비율 = 3]. 각각의 샘플에 제공되는 DNA의 양은 0.5 내지 2 μg의 범위이다. 결과를 도 6에 제시하였다.
지수 생장상의 1 x 105세포의 1μg의 플라스미드 DNA로의 형질감염이 양호한 선택으로 보인다; 사실상, 사용된 DNA 양의 증가가 세포와 접촉하는 양이온성 지질의 농도의 증가를 유발하고 이렇게하여 특정한 경우에 독성 문제를 야기한다. 더 낮은 DNA 농도에서, 형질감염 효능과의 비례는 더이상 수득되지 않는다.
실시예 37
본 발명에 따른 리포폴리아민의 생체내 형질감염 시험
상술된 바와 같이 제조된 본 발명에 따른 리포폴리아민을 함유하는 용액을 이식 7일후의 종양으로 주사하고 쥐를 케타민과 자일라진 혼합물로 마취시킨다. 주사 2일 후, 종양 조직을 제거하고, 무게를 달고 이어서 잘게 잘라서 500 μl의 용해 완충제(Promega Cell Lysis Buffer E 153 A)에서 연마한다. 원심분리(10분 동안 20,000 g)한 후, 10 μl를 취하고 10초에 걸친 통합과 더불어 Lumat LB 9501 발광측정기 (Berthold)내 50 μl의 시제 (Promega Luciferase Assay Substrate)와 혼합한 후 수득된 총 광 방출을 측정함으로써 루시페라제 활성을 측정하기 위해서 사용한다. 생성된 활성을 전체 종양 용해 상등액에 대해 측정된 RLU (상대적인 광 단위)로서, 또는 주사된 DNA의 μg 당 RLU로서 표현한다. 표 3은 수득된 결과를 기재한다.
플라스미드 펩티드 양이온성 지질 결과 (RLU/종양) n
참고 μg/종양 [DNA]μg/μl 참고 pept/DNA(w/w) 참고 nmol/μg DNA 평균 표준편차
pXL2622 10 0.5 (KTPKKAKP)2 1.5 (9) 3 679 258 414 286 9
pXL2622 10 0.5 (KTPKKAKP)2 1.5 (6) 3 395 433 219 333 10
pXL2622 10 0.5 (KTPKKAKP)2 1.5 (16) 3 67 994 82 527 8
pXL2622 10 0.5 (KTPKKAKP)2 1.5 (19) 3 59 209 54 375 9

Claims (31)

  1. 화학식 I로 표시됨을 특징으로 하는 D, L 또는 LD 형태의 리포폴리아민 및 이의 염.
    화학식 I
    상기식에서,
    R1, R2 및 R3는 서로 독립적으로 수소 원자 또는 그룹 -(CH2)q-NRR'을 나타내고 q는 1, 2, 3, 4, 5 및 6 사이의 범위일 수 있고 다양한 그룹 R1, R2 및 R3 사이에서 매우 독립적으로 행동할 수 있으며,
    R 및 R'는 서로 독립적으로 수소 원자 또는 그룹 -(CH2)q'-NH2를 나타내며 q는 1, 2, 3, 4, 5 및 6 사이의 범위일 수 있고 다양한 그룹 R과 R' 사이에서 매우 독립적으로 행동할 수 있으며,
    m, n 및 p는 서로 독립적으로 0 내지 6 사이에서 변할 수 있는 정수를 나타내고, n이 1 이상일 때, 화학식 I 내에서 m은 다른 값을 지닐 수 있고 R3는 다른 의미를 지닐 수 있으며,
    R4는 화학식 II의 그룹을 나타낸다.
    화학식 II
    상기식에서,
    R6와 R7은 서로 독립적으로 수소 원자 또는 포화 또는 불포화 C10 내지 C22 지방족 라디칼을 나타내고 두 그룹 중의 적어도 하나는 수소가 아니며,
    u는 0 내지 10 중에서 선택된 정수이며, u가 1 이상의 정수일 경우, R5, X, Y 및 r은 다른 단위 [X-(CHR5)r-Y] 내에서 다른 의미를 지닐 수 있으며,
    X는 산소 또는 황 원자 또는 모노알킬화될 수 있거나 될 수 없는 아민 그룹을 나타내며,
    Y는 카보닐 그룹 또는 메틸렌 그룹을 나타내며,
    R5는 수소 원자 또는 필요시 치환되는 천연 아미노산의 측쇄를 나타내며,
    r은 1 내지 10 사이 범위의 정수를 나타내며, r이 1일 때, R5는 치환 또는 비치환된 천연 아미노산의 측쇄를 나타내며, r이 1 이상일 때, R5는 수소 원자를 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 하기 화학식의 하나로 표시됨을 특징으로 하는 리포폴리아민.
    화학식 III
    화학식 IV
    화학식 V
    화학식 VI
    화학식 VII
    화학식 VIII
    화학식 IX
    화학식 X
    화학식 XI
    상기식에서,
    R4, R6 및 R7은 제 1항에서 정의한 바와 같다.
  3. 제 2 항에 있어서, R4가 NR6R7 그룹을 나타내고 R6 및 R7이 화학식 III 내지 XII에서 (CH2)17CH3, (CH2)11CH3, (CH2)13CH3또는 (CH2)12CH3중에서 선택된 동일한 그룹으로서 나타남을 특징으로 하는 리포폴리아민.
  4. 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 또는 세포내 표적화 요소와 결합됨을 특징으로 하는 리포폴리아민.
  5. 제 4 항에 있어서, 표적화 요소를 치환체 R5로 특징되는 아미노산 측쇄에 포함함을 특징으로 하는 리포폴리아민.
  6. 제 4 항 또는 5 항에 있어서, 표적 세포 유형의 표면에 존재하는 세포 수용체의 리간드임을 특징으로 하는 리포폴리아민.
  7. 제 4 항 내지 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 이러한 표적화 요소가 당, 항체 또는 항체 단편과 같은 펩티드, 세포 수용체 리간드 또는 이의 단편, 생장 인자 수용체, 시토카인 수용체, 세포 렉틴 수용체 또는 인테그린형의 접착 단백질 수용체, 트랜스페린 수용체에 대한 리간드와 같은 수용체 또는 수용체 단편, HDL 또는 LDL 지질 및/또는 올리고뉴클레오티드 중에서 선택됨을 특징으로 하는 리포폴리아민.
  8. 제 4 항 또는 5 항에 있어서, 이러한 표적화 요소가 핵 편재 시그널 서열에 의해 표시됨을 특징으로 하는 리포폴리아민.
  9. 제 1 항 내지 8 항 중 어느 한 항에 있어서, R5로 특징되는 아미노산 측쇄에 바이오틴, 로다민 또는 폴레이트형의 표지제 또는 Arg-Gly-Asp 에피토프를 함유하는 선형 또는 사이클릭 펩티드 또는 슈도펩티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 리포폴리아민.
  10. 제 1 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    중에서 선택됨을 특징으로 하는 리포폴리아민.
  11. 제 1 항 내지 10항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 리포폴리아민 및 적어도 하나의 핵산을 함유함을 특징으로 하는 약학 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 핵산이 데옥시리보핵산임을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 11 항에 있어서, 핵산이 리보핵산임을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 11, 12 또는 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 화학적으로 변형됨을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 11항 내지 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 안티센스 서열임을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 11 항 내지 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 치료 유전자를 함유함을 특징으로 하는 조성물.
  17. 핵산, 제 1 항 내지 6 항 중 어느 한 항에 따른 리포폴리아민 및 리포폴리아민/핵산 복합체와 결합될 수 있고/있거나 형질감염력을 개선할 수 있는 보조제를 포함하는 약학 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 보조제가 하나 이상의 중성 지질임을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서, 중성 지질이 천연 또는 합성 양쪽성이온 지질 또는 생리학적 조건 하에서 이온 전하가 부족한 지질 중에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 중성 지질이 2개의 지방쇄를 갖는 지질임을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 19 항 또는 20 항에 있어서, 중성 지질이 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민 (POPE), 디스테아로일, -팔미토일, -미리스토일 포스파티딜- 에탄올아민 및 1 내지 3회 N-메틸화된 이들의 유도체; 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로사이드 (예를 들면, 특히 갈락토세레브로사이드), 스핑고리피드 (예를 들면, 특히 스핑고마이엘린) 및 아시알로갱글리오사이드 (예를 들면, 특히 아시알로GM1 및 GM2) 중에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 11 항 내지 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제가 핵산의 응축을 방해하는 화합물이거나 이를 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서, 화합물이 히스톤으로부터, 소핵소로부터 및/또는 프로타민으로부터 부분적으로 또는 전적으로 유도됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
  24. 제 22 항에 있어서, 화합물이 연속적으로 또는 불연속으로 반복된 펩티드 단위 (KTPKKAKKP) 및/또는 (ATPAKKAA)로 부분적으로 또는 전적으로 이루어지고 단위의 수가 2 내지 10의 범위임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  25. 제 11 항 내지 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 중량/중량 기준으로 핵산 1 당량 당 0.01 내지 20 당량, 좀더 바람직하게는 0.5 내지 5 당량의 보조제를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제 11 항 내지 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 주사 제형에 약학적으로 허용되는 비히클을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  27. 제 11 항 내지 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 및/또는 점막으로의 적용에 약학적으로 허용되는 비히클을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  28. 세포의 생체내 또는 시험관내 형질감염을 위한 제 1 항 내지 10 항 중 어느 한 항에 따른 리포폴리아민의 용도.
  29. 고체 지지체에 공유결합된 알킬화제와 대칭성 폴리아민 간의 이분자 반응에 의해서 사전에 수득된 적어도 하나의 비대칭성 폴리아민 분획과 적어도 하나의 지질 분획의 커플링을 이용함을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 10 항 중 어느 한 항에 따른 리포폴리아민의 제조 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 비대칭성 폴리아민 분획과 지질 분획의 커플링을 비대칭성 폴리아민 분획이 결합되는 고체 지지체 상에서 수행하고 이렇게 하여 수득된 리포폴리아민을 회수함을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 고체 지지체에 결합되거나 되지 않은 리포폴리아민 상에 표지제, 당 또는 형광 탐침을 도입함을 또한 수반함을 특징으로 하는 방법.
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