PT861228E - Lipopoliaminas como agentes de transfeccao e suas aplicacoes farmaceuticas - Google Patents

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PT861228E
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PT96938291T
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Gerardo Byk
Daniel Scherman
Bertrand Schwartz
Catherine Dubertret
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Aventis Pharma Sa
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Description

&4 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ DESCRICÃO "Lipopoliaminas como agentes de transfecção e suas aplicações farmacêuticas" O presente invento refere-se a novos compostos aparentados com a família das lipopoliaminas, a composições farmacêuticas que os contêm, suas aplicações para a transfecção in vivo e/ou in vitro de ácidos nucleicos e seu processo de preparação.
Numerosas doenças genéticas estão associadas a um defeito de expressão e/ou a uma expressão anormal, quer dizer, deficiente ou excessiva, de um ou vários ácidos nucleicos. A terapia génica tem como principal objectivo corrigir este tipo de anomalias genéticas por meio da expressão celular in vivo ou in vitro de genes clonados.
Actualmente, propõem-se vários métodos para a libertação intracelular deste tipo de informação genética. Um de entre eles, em particular, assenta no emprego de vectores químicos ou bioquímicos. Os vectores sintéticos têm duas funções principais, compactar o ADN a transfectar e promover a sua fixação celular assim como a sua passagem através da membrana plasmática e, se for caso disso, através das duas membranas nucleares.
Neste modo de transfecção, chegou-se a um progresso importante com o desenvolvimento de uma tecnologia baseada no emprego de um lípido catiónico. Foi assim posto em evidência que um lípido catiónico carregado positivamente, o cloreto de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamónio (DOTMA), interferia, sob a forma de lipossomas ou de pequenas vesículas, espontaneamente com o ADN, que está carregado negativamente, para formar complexos lípidos-ADN, capazes de se fundirem com as membranas celulares, e permitia assim a libertação intracelular do ADN. Todavia, se bem que esta molécula seja eficaz ao nível da transfecção, apresenta a desvantagem de não ser biodegradável e de possuir um carácter tóxico relativamente a estas células.
Depois do DOTMA foram desenvolvidos outros lípidos catiónicos assentes neste modelo de estrutura: grupo lipófilo acoplado a um grupo amino através de um braço dito "espaçador". Entre estes podem citar-se mais
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 2 particularmente aqueles que compreendem, a título de grupo lipófilo, dois ácidos gordos ou um derivado do colesterol e que comportam, além disso e se for esse o caso, a título de grupo amino, um grupo de amónio quaternário. Podem designadamente ser citados os DOTAP, DOBT ou o ChOTB como representativos desta categoria de lípidos catiónicos. Outros compostos, como os DOSC e ChOSC, caracterizam-se pela presença de um grupo colina em vez do grupo de amónio quaternário. Em geral, a actividade transfectante destes compostos permanece contudo muito fraca.
Uma outra categoria de lípidos catiónicos, as lipopoliaminas, foi igualmente descrita, particularmente na patente EP 349 111. No presente invento, o termo lipopoliamina designa uma molécula anfifílica compreendendo pelo menos uma região hidrofíiica poliamina associada por uma região dita espaçador a uma região lipofNica. A região poliamina das lipopoliaminas, carregada cationicamente, é capaz de se associar de forma reversível com o ácido nucleico, carregado negativamente. Esta interacção compacta fortemente o ácido nucleico. A região lipofílica torna esta interacção iónica insensível ao meio externo, recobrindo a partícula nucleolipídica formada com uma película lipídica. Neste tipo de compostos, o grupo catiónico pode ser representado pelo radical L-5-carboxiespermina que contém quatro grupos de amónio, dois primários e dois secundários. Os DOGS e DPPES descritos na EP 394 111 fazem particularmente parte dela. As lipopoliaminas são muito particularmente eficazes para a transfecção de células endócrinas primárias.
Com efeito, um agente de transfecção sintético ideal deverá apresentar um elevado nível de transfecção e isto para um largo espectro de células, possuir uma toxicidade nula ou pelo menos uma toxicidade muito minimizada nas doses de utilização e, por fim, ser biodegradável para estar isento de qualquer efeito secundário ao nível das células tratadas. O presente invento tem precisamente por objectivo propor novas lipopoliaminas, originais pela sua fracção de poliamina, que sejam susceptíveis de ser utilizadas eficazmente na transfecção in vitro e/ou in vivo de células e designadamente para a vectorização de ácidos nucleicos. O presente invento tem como primeiro objectivo lipopoliaminas, sob a forma D, L ou LD e seus sais, caracterizadas por serem representadas pela
3 84 757 EPO 861 228/PT
fórmula gerai I R3
O
RI N — (CHj)
N
\
m _ (0¾) R4 R2 n
P
I onde: R1, R2 e R3 representam, independentemente uns dos outros, um átomo de hidrogénio ou um grupo -(CH2)q-NRR' onde q pode variar entre 1, 2, 3, 4, 5 e 6, de maneira independente, entre os diferentes grupos R1, R2 e R3 e R e R' representam, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um grupo -(CH2)q-NH2, podendo q' variar entre 1, 2, 3, 4, 5 e 6, de forma independente entre os diferentes grupos R e R', m, n e p, representam, independentemente uns dos outros, um número inteiro que pode variar entre 0 e 6 com a possibilidade de, quando n for superior a 1, m tomar valores diferentes e R3 tomar significados diferentes na fórmula geral I e
R4 representa um grupo de fórmula geral II
II
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 4 onde: R6 e R7 representam, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um radical alifático, saturado ou não, C10 a C22, sendo pelo menos um dos dois grupos diferente de hidrogénio, u é um número inteiro escolhido entre 0 e 10 e, sempre que u for um número inteiro superior a 1, R5, X, Y e r podem ter significados diferentes dentro dos diferentes motivos [X-(CHR5)r-Y] X representa um átomo de oxigénio, de enxofre ou um grupo amina monoalquilado ou não, Y representa um grupo carbonilo ou um grupo metileno R5 representa um átomo de hidrogénio ou uma cadeia lateral de aminoácido natural, substituída se for caso disso, e r representa um número inteiro variando entre 1 e 10 e, quando r for igual a 1, R5 representa uma cadeia lateral de aminoácido natural; e quando r for maior que 1, R5 representa um átomo de hidrogénio.
Como cadeia lateral de aminoácido natural, pretendem-se designar, especialmente, no sentido do invento, cadeias que contêm motivos amidfnio como por exemplo a cadeia lateral da arginina. Conforme foi mencionado anteriormente, esta cadeia pode estar substituída por grupos alifáticos saturados ou insaturados, lineares, ramificados ou cíclicos, C1 até C24, como por exemplo radicais colesterilo, araquidonilo ou retinoílo, grupos mono- ou poli-aromáticos, como por exemplo derivados benziloxicarbonilo, benzil-ésteres, rodaminilo, substituídos ou não.
Estes novos produtos de fórmula geral (I) podem apresentar-se sob a forma de sais não tóxicos e farmaceuticamente aceitáveis. Estes sais não tóxicos compreendem os sais com os ácidos inorgânicos (ácidos clorídrico, sulfúrico, bromídrico, fosfórico, nítrico) ou com os ácidos orgânicos (ácidos acético, propiónico, succínico, maleico, hidroximaleico, benzóico, fumárico, metanossulfónico ou oxálico) ou com as bases inorgânicas (soda, potassa, litina, cal) ou orgânicas (aminas terciárias como trietilamina, piperidina,
5 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ benzilamina). A título representativo dos compostos segundo o invento, podem mais particularmente citar-se os compostos de sub-fórmulas gerais seguintes: 0
o
IV
0
VI 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 6
Ο
VII
VIII
ο
IX
X 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 7
Ο
XI ο
onde R4, R6 e R7 são definidas como anteriormente. De preferência, R4 aí representa um grupo NR6R7 com R6 e R7 a representar, nas sub-fórmulas III a XII, um grupo idêntico escolhido entre (CH2)17CH3, (CH2)nCH3, (CH2)13CH3 ou <CH2)12CH3.
Numa concretização do invento particularmente vantajosa, os compostos reivindicados compreendem, além disso, um elemento de direccionamento a um alvo que permite orientar a transferência do ácido nucleico ao qual estão associados. Este elemento de direccionamento a um alvo está de preferência incorporado, sobre o composto de fórmula geral I, ao nível da cadeia lateral do aminoácido representado pelo substituinte R5. Com maior preferência, o elemento de direccionamento a um alvo está ligado, de forma covalente ou não covalente, ao composto de acordo com o invento.
Pode tratar-se de um elemento de direccionamento a um alvo
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 8 extracelular, permitindo orientar a transferência de ácido nucleico para certos tipos celulares ou certos tecidos desejados (células tumorais, células hepáticas, células hematopoiéticas, etc.). Assim, pode tratar-se de um ligando de receptor celular presente à superfície do tipo celular alvo como por exemplo um açúcar, um folato, uma transferrina, uma insulina, uma proteína asialo-orosomucóide ou qualquer molécula bioactiva reconhecida por receptores extracelulares. Pode igualmente tratar-se de um elemento de direccionamento para um alvo intracelular, permitindo orientar a transferência do ácido nucleico para certos compartimentos celulares privilegiados (mitocôndrias, núcleo, etc.) como por exemplo uma sequência de sinal de localização nuclear, (nls), que privilegia a acumulação de ADN transfectado no núcleo.
Mais geralmente, os elementos de direccionamento a um alvo, susceptíveis de serem empregues no âmbito deste invento, incluem açúcares, péptidos, oligonucleótidos, esteróides e lípidos. De preferência, trata-se de açúcares e/ou péptidos tais como anticorpos ou fragmentos de anticorpos, ligandos de receptores celulares, ou de fragmentos destes, receptores ou fragmentos de receptores, etc. Em particular, pode tratar-se de ligandos de receptores de factores de crescimento, de receptores de citóquinas, de receptores de lectinas celulares ou de receptores de proteínas de adesão tais como as integrinas. Podem igualmente citar-se o receptor da transferrina, lípidos HDL e LDL. O elemento de direccionamento a um alvo pode igualmente ser um açúcar que tenha como alvo lectinas tais como os receptores asialoglicoproteicos, ou ainda um fragmento Fab de anticorpos que tenha como alvo o receptor do fragmento Fc das imunoglobinas.
Da mesma forma, é possível considerar a associação a um composto de fórmula geral I de um agente marcador do tipo biotina, rodamina, folato, por exemplo sobre a cadeia lateral do aminoácido R5. Este agente marcador pode igualmente ser uma sequência peptídica ou pseudopeptídica linear ou cíclica, comportando o epítope Arg-Gli-Asp de reconhecimento dos receptores primários e/ou secundários das proteínas de adesão do tipo integrinas. A título ilustrativo das lipopoliaminas reivindicadas, podemos citar mais particularmente os compostos seguintes, descritos de forma mais detalhada nos exemplos a seguir: 9 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2)17CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CON[(CH2)17CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)17CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArg(Z)2N[(CH2)17CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(rodamina)N[(CH2)17CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(biotinil)N[(CH2)17CH3]2 {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2)17CH3]2 {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2CON[(CH2)17CH3]2 (H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2COGIyN[(CH2)17CH3]2 {H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2CON[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4N[(CH2)3NH2]CH2COGIyN[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLysN[(CH2)17CH3]2 . NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys[CI-Z]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys[CHO]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys[Colesteril]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys[Araquidonil]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIuN[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu[N(CH3)2]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu[0-Bz]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu[Galactosamida]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu[Glucosamida]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu[Manosamida]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH (CH2)3CON[(CH2)17CH3)]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CONH(CH2)5CON[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2)11CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2)12CH3]2 e NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)13CH3]2. A título de compostos particularmente representativos do presente invento, podemos citar, mais especialmente, aqueles cuja fórmula geral está representada aqui a seguir o
RPR120535 (6) 10 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ
ΝΗ NIIj
RPR127888A
Nllj
RPR 122760Α
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 11
(28)
(29) 12 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ
RPR130596a (31)
(33) 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 13
RPR131111a (34)
RPR122767a
(37) 14 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ
Ο RPR122786 (41)
(42) RPR128506a
No âmbito do presente invento foi além disso desenvolvida uma metodologia original em fase sólida para preparar poliaminas funcionalizadas assimétricas donde derivam as lipopoliaminas segundo o invento.
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ
Classicamente, ο acesso às poliaminas funcionalizadas assimétricas é limitado pela necessidade de introduzir selectivamente modificações nas. poliaminas simétricas, lineares ou ramificadas. As diferenças químicas entre os grupos aminados primários e secundários de uma poliamina requerem uma grande selectividade para efectuar reacções tais como alquilações, adições do tipo Michael ou acilações. Além disso, a selectividade imposta por tais diferenças químicas não é compatível com uma alquilação selectiva num grupo de várias aminas primárias e secundárias, como se encontra nas poliaminas. A resposta clássica a tais restrições é construir as poliaminas funcionalizadas assimétricas a partir de blocos monoméricos, tendo por um lado um grupo aminado susceptível de ser "poliaminado" e, por outro lado, a função assimétrica convenientemente protegida. Esta abordagem necessita portanto de uma estratégia de síntese fastidiosa, em várias etapas e, em particular, de uma protecção ortogonal dos grupos funcionais. O método desenvolvido no âmbito do presente invento tem precisamente como objectivo libertar-se dos inconvenientes encontrados até ao presente com este tipo de síntese. Tem como vantagem nítida conduzir cómoda e rapidamente a poliaminas que são funcionalizadas selectivamente sobre um único grupo aminado primário por alquilação ou alquilação redutora de poliaminas simétricas. O princípio do processo reivindicado fundamenta-se no emprego de um método de síntese em fase sólida para favorecer uma reacção bimolecular entre o reagente alquilante e a poliamina, o que evita a polialquilação deste. Mais precisamente, o presente invento refere-se a um processo caracterizado por se pôr em prática o acoplamento de pelo menos uma fracção lipídica a pelo menos uma fracção de poliamina assimétrica, tendo a citada fracção de poliamina sido obtida previamente por reacção bimolecular entre um agente alquilante ligado por covalência a um suporte sólido e a uma poliamina simétrica. De acordo com esta abordagem, o reagente alquilante liga-se por covalência a um suporte polimérico por esterificação ou amidação. A poliamina simétrica reage com o agente alquilante em fase sólida através de uma reacção bimolecular que conduz à poliamina assimétrica monofuncionalizada ligada ao suporte. As aminas livres do produto são habitualmente protegidas em fase sólida por grupos protectores do tipo BOC ou Z, e finalmente os produtos são clivados do suporte de fase sólida. Estes poliaminoácidos são, como convém, acoplados às
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ fracções lipídicas para fornecerem os agentes transfectantes desejados. Para este acoplamento, é possível utilizar os agentes de ligação peptídica usuais como BOP, Pybop, BopCI e DCC por exemplo. A metodologia permite igualmente associar o agente transfectante inteiro sobre o suporte sólido com a introdução eventual de péptidos marcadores de açúcares ou de sondas fluorescentes nas moléculas. Efectivamente, verifica-se ser possível proceder a este tipo de enxerto na lipopoliamina livre. A viabilidade do método foi demonstrada pela síntese de vários ácidos poliaminados, lineares ou ramificados, assimétricos e funcionalizados. O presente invento tem igualmente como objectivo qualquer aplicação terapêutica das lipopoliaminas tais como anteriormente se descreveu, quer directamente, quer incluídas em composições farmacêuticas.
Como explicitado anteriormente, os compostos de fórmula geral I apresentam-se muito particularmente interessantes para a transfecção in vitro e in vivo de ácidos nucleicos. Compactam eficazmente o ADN e apresentam a vantagem de uma toxicidade muito reduzida.
Para obter um efeito máximo das composições do invento, as proporções respectivas do composto de fórmula geral I e do ácido nucleico são de preferência determinadas de forma que a relação R, entre as cargas positivas da lipopoliamina considerada e as cargas negativas do citado ácido nucleico, seja óptima. Esta relação óptima, que varia em particular segundo o modo de utilização, in vivo ou in vitro, e segundo o tipo celular a transfectar, e é optimizada caso a caso. Esta optimização compete ao perito na arte.
Nas composições farmacêuticas do presente invento, o poiinucleótido tanto pode ser um ácido dèsoxirribonucleico como um ácido ribonucleico. Pode tratar-se de sequências de origem natural ou artificial e particularmente ADN genómico, ADNc, ARNm, ARNt, ARNr, sequências híbridas ou sequências sintéticas ou semi-sintéticas de oligonucleótidos modificados ou não. Estes ácidos nucleicos podem ser de origem humana, animal, vegetal, bacteriana, virai, etc. Podem ser obtidos por qualquer técnica conhecida do perito na arte e particularmente por pesquisa de bancos, por síntese química ou ainda por métodos mistos incluindo a modificação química ou enzimática de sequências
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 17 obtidas por pesquisa de bancos. Podem, por outro lado, ser incorporados em vectores tais como vectores plasmídicos.
Mais particularmente, no que respeita aos ácidos desoxirribonucleicos, podem ser de cadeia simples ou dupla, assim como oligonucleótidos curtos ou sequências mais longas. Estes ácidos desoxirribonucleicos podem ter genes terapêuticos, sequências reguladoras da transcrição ou da replicação, sequências anti-sentido modificadas ou não, regiões de ligação a outros componentes celulares, etc.
No âmbito do invento, entende-se por gene terapêutico, em particular, qualquer gene que codifica para um produto proteico que tenha um efeito terapêutico. O produto proteico assim codificado pode ser uma proteína, um péptido, etc. Este produto proteico pode ser homólogo face à célula alvo (o que significa um produto que é normalmente expresso na célula alvo quando esta não apresenta nenhuma patologia). Neste caso, a expressão de uma proteína permite por exemplo atenuar uma expressão insuficiente na célula ou a expressão de uma proteína inactiva ou fracamente activa por causa de uma modificação, ou ainda de super-expressar a referida proteína. O gene terapêutico pode também codificar para um mutante de uma proteína celular, tendo uma estabilidade acrescida, uma actividade modificada, etc. O produto proteico pode igualmente ser heterólogo face à célula alvo. Neste caso, um proteína expressa, pode por exemplo completar ou suscitar uma actividade deficiente na célula permitindo-lhe lutar contra uma patologia ou estimular uma resposta imunitária.
Entre os produtos terapêuticos de acordo com o presente invento, podemos citar mais particularmente as enzimas, os derivados sanguíneos, as hormonas, as linfóquinas: interleucinas, interferões, TNF, etc. (FR 9203120), os factores de crescimento, os neurotransmissores ou os seus precursores ou enzimas de síntese, os factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofina, etc., a distrofina ou uma minidistrofina (FR 9111947), a proteína CFTR associada à mucoviscidose, os genes supressores de tumores: p53, Rb, Rap1A, DCC, K-rev, etc. (FR 9304745), os genes que codificam para factores implicados na coagulação: Factores VII, VIII, IX, os genes intervenientes na reparação do ADN, os genes suicidas (timidina-quinase, citosina-desaminase), os genes da hemoglobina ou de outros transportadores
84 757
EPO 861 228/PT 18 proteicos, os genes que correspondem às proteínas implicadas no metabolismo dos lípidos, do tipo apolipoproteína escolhida entre as apolipoproteínas A-l, A-ll, A-IV, B, C-l, C-ll, C-lll, D, E, F, G, H, J e apo (a), as enzimas do metabolismo como por exemplo a lipoproteína-lipase, a lipase hepática, a lecitina-colesterol-aciltransferase, a 7 alfa-colesterol-hidrolase, a acidofosfatase fosfatídica, ou ainda proteínas de transferência de lípidos como a proteína de transferência dos ésteres de colesterol e a proteína de transferência dos fosfolípidos, uma proteína de ligações dos HDL ou ainda um receptor escolhido por exemplo entre os receptores LDL, receptores de quilomícron remanescentes e os receptores "scavenger", etc. O ácido nucleico terapêutico pode igualmente ser um gene ou uma sequência anti-sentido, cuja expressão na célula alvo permite controlar a expressão de genes ou a transcrição de ARNm celulares. Tais sequências podem, por exemplo, ser transcritas na célula alvo em ARN complementares de ARNm celulares e bloquear assim a sua tradução em proteína, segundo a técnica descrita na patente EP 140 308. Os genes terapêuticos compreendem igualmente as sequências que codificam para ribozimas, que são capazes de destruir selectivamente ARN alvo (EP 321 201).
Conforme aqui indicado mais acima, o ácido nucleico pode comportar igualmente um ou vários genes que codificam para um péptido antigénico, capaz de gerar no homem ou no animal uma resposta imunitária. Nesta forma particular de execução, o invento permite portanto a realização quer de vacinas quer de tratamentos imunoterapêuticos aplicados ao homem ou ao animal, especialmente contra microrganismos, vírus ou cancros. Pode tratar-se especialmente de péptidos antigénicos específicos do vírus de Epstein Barr, do vírus HIV, do vírus da hepatite B (EP 185 573) do vírus da pseudo-raiva, do "scyncitia forming virus", de outros vírus, ou ainda específicos de tumores (EP 259 212).
De preferência, o ácido nucleico compreende igualmente sequências que permitem a expressão do gene terapêutico e/ou do gene que codifica para o péptido antigénico na célula ou no órgão desejado. Pode tratar-se de sequências naturalmente responsáveis pela expressão do gene considerado quando estas sequências são susceptíveis de funcionar na célula infectada. Pode igualmente tratar-se de sequências de origem diferente (responsáveis pela expressão de
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ outras proteínas ou mesmo sintéticas). Particularmente, pode tratar-se de sequências promotoras de genes eucariotas ou virais. Por exemplo, pode tratar-se de sequências promotoras oriundas do genoma da célula que se deseja infectar. Também pode tratar-se de sequências oriundas do genoma de um vírus. A este respeito, podemos citar por exemplo os promotores dos genes EIA, MLP, CMV, RSV, etc. Por outro lado, estas sequências de expressão podem ser modificadas por adição de sequências de activação, de regulação, etc. Pode também tratar-se de promotor inductível ou repressível.
Por outro lado, o ácido nucleico pode comportar igualmente, em particular a montante do gene terapêutico, uma sequência de sinal que dirige o produto terapêutico sintetizado nas vias de secreção da célula alvo. Esta sequência de sinal pode ser a sequência de sinal natural do produto terapêutico, mas pode igualmente tratar-se de qualquer outra sequência de sinal funcional ou de uma sequência de sinal artificial. O ácido nucleico pode igualmente comportar uma sequência de sinal que dirige o produto terapêutico sintetizado para um compartimento particular da célula.
Numa outra concretização, o presente invento refere-se a composições que compreendem um ácido nucleico, uma lipopoliamina tal como reivindicada e um adjuvante capaz de se associar ao complexo lipopoliamina/ácido nucleico e de lhe melhorar o poder transfectante. A requerente com efeito mostrou que o poder transfectante das lipopoliaminas pode ser aumentado de forma inesperada em presença de certos adjuvantes (lípidos, péptidos ou proteínas por exemplo), capazes de se associarem ao complexo lipopoliamina/ácido nucleico.
Nesta óptica, as composições do invento podem compreender como adjuvante, um ou vários lípidos neutros. Estas composições são particularmente vantajosas, designadamente quando a relação R é fraca. A requerente mostrou, com efeito, que a adição de um lípido neutro permite melhorar a formação de partículas nucleolipídicas e, de forma surpreendente, favorecer a penetração da partícula na célula desestabilizando a sua membrana.
Com maior preferência, os lípidos neutros utilizados no âmbito do presente invento são lípidos com 2 cadeias gordas.
De forma particularmente vantajosa, utilizam-se lípidos naturais ou
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 20 sintéticos, zwiteriónicos ou desprovidos de carga iónica nas condições fisiológicas. Podem ser escolhidos mais particularmente entre a dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), a oleoilpalmitoilfosfatidiletanolamina (POPE), diestearoil, -palmitoil, -miristoil fosfatidiletanolaminas, assim como os seus derivados N-metilados 1 a 3 vezes; os fosfatidilglicerois, os diacilglicerois, os glicosildiaciiglicerois, os cerebrósidos (tais como especialmente os galactocerebrósidos), os esfingolípidos (tais como designadamente as esfingomielinas) ou ainda os asialogangliósidos (tais como designadamente os asialoGMI e GM2).
Estes diferentes lípidos podem ser obtidos quer por síntese, quer por extracção, a partir de órgãos (por exemplo, o cérebro) ou de ovos, por técnicas clássicas bem conhecidas do perito na arte. Em particular, a extracção dos lípidos naturais pode ser realizada por meio de solventes orgânicos (ver igualmente Lehninger, Biochemistry).
Muito recentemente, a requerente demonstrou que era igual e particularmente vantajoso empregar, a título de adjuvante, um composto que intervem, directamente ou não, ao nível da condensação do citado ácido nucleico (WO 96/25508). A presença daquele composto, numa composição transfectante à base de uma lipopoliamina, permitia diminuir consideravelmente a quantidade deste agente, com os consequentes benefícios que daí decorrem no plano toxicológico, sem qualquer prejuízo para a actividade transfectante da citada composição. Pelo contrário, esta possui vantajosamente um nível de transfecção superior.
Por composto que intervém ao nível da condensação do ácido nucleico, prentende-se definir um composto que compacta, directamente ou não, o ácido nucleico. Mais precisamente, este composto pode actuar directamente ao nível do ácido nucleico a transfectar ou pode intervir ao nível de um composto anexo que está directamente implicado na condensação deste ácido nucleico. De preferência, actua directamente ao nível do ácido nucleico.
Segundo uma concretização preferida, este agente que intervém ao nível da condensação dos ácidos nucleicos é constituído, no todo ou em parte, por 21 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ motivos peptídicos (ΚΤΡΚΚΑΚΚΡ) e/ou (ΑΤΡΑΚΚΑΑ), podendo ο número de motivos variar entre 2 e 10. Na estrutura do composto de acordo com o invento, estes motivos podem ser repetidos de forma contínua ou não. Assim, podem estar separados por ligações de natureza bioquímica, por exemplo por um ou vários ácidos aminados, ou de natureza química. Um agente assim pode igualmente derivar, no todo ou em parte, de uma histona, de uma nucleolina, de uma protamina e/ou de um dos seus derivados.
De preferência, as composições do invento compreendem de 0,01 a 20 equivalentes de adjuvante para um equivalente de ácidos nucleicos, em peso/peso, e mais preferivelmente de 0,5 a 5.
As composições de acordo com o invento podem ser formuladas tendo em vista administrações por via tópica, cutânea, oral, rectal, vaginal, parentérica, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intraocular, transdérmica, etc. De preferência, as composições farmacêuticas do invento contêm um veículo farmaceuticamente aceitável para uma formulação injectável, particularmente para uma injecção directa ao nível do órgão desejado, ou para uma administração por via tópica (sobre a pele e/ou mucosas). Pode tratar-se em particular de soluções estéreis, isotónicas, ou de composições secas, particularmente liofilizadas que, por adição, segundo o caso, de água esterilizada ou de soro fisiológico, permitem a constituição de soluções injectáveis. As doses de ácido nucleico utilizadas para a injecção, bem como o número de administrações, podem ser adaptadas em função de diferentes parâmetros e particularmente em função do modo de administração utilizado, da patologia em questão, do gene a expressar, ou ainda da duração do tratamento pretendido. No que diz respeito mais particularmente ao modo de administração, pode tratar-se quer de uma injecção directa nos tecidos ou nas vias circulatórias, quer de um tratamento de células em cultura seguido da sua reimplantação in vivo, por injecção ou enxerto. 0 presente invento proporciona assim um método particularmente vantajoso para o tratamento de doenças, compreendendo a administração in vivo ou in vitro de um ácido nucleico apto a corrigir a citada doença, associado a um composto de fórmula geral I nas condições a seguir definidas. Mais particularmente, este método é aplicável às doenças resultantes de uma deficiência num produto proteico ou nucleico e o ácido nucleico administrado
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 22 codifica para ο citado produto proteico ou contém o citado produto nucleico. O invento abrange qualquer utilização de uma lipopoliamina segundo o invento, para a transfecção in vivo ou in vitro de células. O presente invento será descrito de forma mais completa com o auxílio dos exemplos e das figuras seguintes, que devem ser considerados como ilustrativos e não limitativos.
FIGURAS
Figura (1): Medida da eficácia de transfecção após o tratamento de células NIH 3T3 (células embrionárias de ratinho - fibroblastos) com diferentes lípidos catiónicos.
Figura (2): Medida da eficácia de transfecção após o tratamento de células SMC de coelho (cultura primária de células musculares lisas da aorta do coelho) com diferentes lípidos catiónicos.
Figura (3): Medida da eficácia de transfecção após o tratamento de células 3LL (carcinoma pulmonar de Lewis) com diferentes lípidos catiónicos.
Figura (4): Medida da eficácia de transfecção após o tratamento de células NIH 3T3 (células embrionárias de ratinho - fibroblastos) com diferentes lípidos catiónicos.
Figura (5): Efeito da concentração de DOPE sobre a eficácia de transfecção de células 3LL.
Figura (6): Transfecção de células NIH 3T3 com quantidades variáveis de ADN e uma relação constante em nanomoles, de lipofectante^g de ADN.
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AcOEt: BOC: BOP: DCC: DCU: DMAP: DMF: DMSO:
Acetato de etilo t-Butoxicarbonilo
Hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -iloxitris(dimetiiamino)fosfónio
Diciclo-hexilcarbodiimida
Diciclo-hexilureia 4-Dimetilaminopiridina
Dimetilformamida
Dimetilsulfóxido 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 23
DODA: Dioctadecilamina ΕΡ: . Éter de petróleo
EtOH: Etanol NEt3: Trietilamina
Rf: Coeficiente de retenção frontal TFA: Ácido trifluoroacético THF: Tetra-hidrofurano TMS: Tetrametilsilano UV: Ultravioleta SPPS: "Solid Phase Peptide Synthesis" CLHP: Cromatografia Líquida de Alta Pressão Z: Benziloxicarbonilo CIZ: p-Clorobenziloxicarbonilo
A - MATERIAIS E MÉTODOS PARA AS SÍNTESES QUÍMICAS 1 MATERIAL a) Compostos - As poliaminas de partida estão disponíveis no comércio, por exemplo: espermidina, espermina, tris(2-aminoetil)amina, fenilenodiamina, diaminoetano (propano, butano, pentano, hexano, etc.) ou podem ser sintetizadas por métodos clássicos, por exemplo por cianoetilação exaustiva de aminas disponíveis no comércio, tais como diaminoetano (propano, butano, pentano, hexano, etc.), amina, espermidina, espermina, para dar poliaminas ramificadas. - Os agentes alquilantes são escolhidos em função do método de alquilação como segue:
Para uma alquilação clássica: o ácido bromoacético, os ácidos ω-halogenocarboxílicos.
Para uma alquilação redutora: um ácido ω-aldeído-carboxílico, tal como o ácido glioxálico, o meio-aldeído succínico, etc., ou um ceto-ácido como o ácido acetoacético ou o ácido pirúvico, etc. - Os polímeros utilizados são resinas disponíveis no comércio para a síntese peptídica em fase sólida (síntese de Merrifield), por exemplo a resina de cloreto de O-clorotritilo, a resina HMP, que proporcionam produtos com funções ácidas livres ou uma resina do tipo Rink. Os ácidos poliaminados podem ser sintetizados directamente sobre um péptido pré-sintetizado, sobre a fase sólida,
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ e que contenha uma função bromoalquilo ou um ácido ω-aldeído. - Os dioctadecilamina, trietilamina, trifluoroacético, BOP, DMAP, cloroformiato de benzilo da Aldrich, são produtos comerciais. As soluções de NaCI e NaHC03 são saturadas; a solução de KHS04 é 0,5M. b) Avaliações Físicas
Os espectros de RMN-Protão foram registados com espectrómetros Bruker 400 e 600 MHz.
Os espectros de massa foram realizados num API-MS/III c) Técnicas de cromatografia
As análises CLHP são efectuadas num aparelho Merck-Hitachi equipado com um auto-amostrador AS-2000A, uma bomba inteligente L-6200A e um detector UV-vis L-4000 com comprimento de onda regulável, a 220 nm para separações analíticas e a 235 nm para separações preparativas. As colunas para as separações analíticas são colunas BU-300 aquaporo Butil 7m, 300A 300x4,6 mm a Perkin-Elmer e, para as separações preparativas, colunas Biosil C18 HL 90-10 250x10 mm da Biorad. As fases móveis são H20 (TFA a 0,1%) e Acetonitrilo (TFA a 0,1%). O caudal nas análises analíticas é regulado para 1 mi/min e nas preparativas para 4 ml/min.
As cromatoarafias em camada fina (CCM) foram efectuadas em placas de sílica-gel Merck com 0,2 mm de espessura.
As cromatoarafias em coluna foram efectuadas sobre sílica-gel 60 Merck de granulometria 0,063-0,200 mm. São reveladas quer com UV (254 nm); quer com ninidrina, vaporizando (vaporização leve) uma solução etanólica de ninidrina (40 mg/100 ml EtOH)para revelar as aminas ou as amidas aquecendo a 150°C; quer com fluoresceína, vaporizando uma solução (40 mg/100 ml Acetona) para revelar as aminas primárias ou com iodo, recobrindo a placa com pó de iodo.
As cromatoarafias em coluna foram efectuadas sobre sílica-gel 60 Merck de granulometria 0,063-0,200 mm.
d) Técnica de síntese em fase sólida SPPS A síntese em fase sólida é realizada num reactor manual de síntese de péptidos 25 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ SPPS de fabrico artesanal e o agitador é um "Flask Shaker" modelo A5-6021. A evolução do acoplamento das poliaminas à fase sólida, assim como a evolução da protecção das poliaminas na SPPS é seguida pelo ensaio de Kaiser [Kaiser, E., Colescolt, D.L., Bossinger, C.D., e Cook, P.l. Anal Biochem. 34 (2). 595 (1970)]. A resina utilizada nos exemplos para a SPPS é a resina de cloreto de clorotritilo da NOVABIOCHEM-Suiça.
2- MODO OPERATÓRIO GERAL a) Síntese de poliaminas simétricas ilustrada pela preparação da (Ν,Ν-Ν',Ν'-Tetra-aminopropil)-1,4-diaminobutano:
Num balão de três tubuladuras de 2 litros, introduzem-se 147 g de 1,4-diaminobutano e 1000 ml de água desmineralizada. A solução é submetida a uma agitação magnética. Por intermédio de uma ampola isobárica juntam-se 443 g de acrilonitrilo durante 1 hora, conservando a temperatura em 38°C. Monta-se em seguida um condensador para refluxo e leva-se a massa a 80°C com um banho-maria durante 1 hora. O teste da fluorescamina apresenta-se negativo e o excesso de acrilonitrilo é evaporado sob vácuo a 40°C.
Obtêm-se duas fases. A fase orgânica inferior é separada, lavada com 300 ml de água e transferida para um balão de 1000 ml. Adicionam-se 170 ml de uma mistura de água/metanol (1:1 v/v). Deixa-se cristalizar durante a noite. No dia seguinte, os cristais são filtrados sobre frita de vidro de porosidade 3 de 500 ml. O bolo é lavado sobre o frita de vidro com metanol (2x170 ml) e éter (2x150 ml). O produto é seco numa placa dentro de um excicador sob vácuo (26 mm) durante uma noite. Obtêm-se assim 461 g do produto (rendimento de 93%). O produto foi analisado por RMN e MS e as análises são compatíveis. O produto é hidrogenado sem mais purificação.
Numa autoclave de inox de 1 litro colocam-se 30 g do polinitrilo precedente (0,1 mol). Prepara-se ao mesmo tempo num copo uma solução de 140 ml de etanol (95%) e de 8 g de NaOH (0,2 mol). Quando a soda está estabilizada, coloca-se esta solução na autoclave. Passa-se uma corrente de
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 26 azoto dentro da autoclave e adicionam-se 8 ml de Níquel de Raney sobre carvão. Fecha-se a autoclave. A pressão inicial de hidrogenação é de 52 atm e desce até 28,5 em 5 horas, à temperatura ambiente. A suspensão é filtrada sobre papel, o filtro é lavado com etanol (2x25 ml), os filtrados são concentrados até à secura sob vácuo. O óleo é misturado com 30 ml de água e extraído com 100 ml.de CH2CI2. A fase orgânica é seca sob MgSOd, filtrada, depois evaporada sob vácuo. Obtém-se um óleo fluido amarelado (27 g; rendimento de 85%). O produto foi analisado por CCM (mono-mancha), RMN e MS e as análises eram compatíveis. O produto é utilizado sem mais purificação. b) - Método A: Ancoragem de uma função ácida sobre o suporte polimérico:
Carrega-se um reactor SPPS com resina cloreto de clorotritilo (5 g, 1,2 mmol Cl/g resina), juntam-se 50 ml de CH2CI2 e a mistura é agitada durante 5 minutos. Junta-se ácido bromoacético (1,05 g, 7 mmol) seguido de DIEA (0,95 ml, 7,5 mmol). O reactor é agitado durante duas horas à temperatura ambiente. O líquido é filtrado e a resina é lavada com CH2CI2 e iPrOH (10x50 ml) e MeOH (2x50 ml). Por fim a resina é seca sob corrente de azoto. c) - Método B: Reacção das poliaminas com a bromoacetil-resina: A poliamina (10 excessos molares) é dissolvida em 50 ml de CH2CI2 e colocada no reactor que contém o produto obtido pelo método A. O reactor é agitado durante 2 h à temperatura ambiente. 0 solvente é filtrado e a resina lavada com CH2CI2 e iPrOH (10x50 ml); o ensaio de Kaiser é positivo. d) - Protecção dos poliaminoácidos sobre a resina: Método C:
Os dicarbonato de di-terc-butilo (48 mmol) e DIEA (50 mmol) são dissolvidos em CH2CI2 (50 ml) e colocados no reactor que contém o produto obtido segundo o método B. 0 reactor é agitado durante uma noite. No dia seguinte o teste de Kaiser é negativo. O solvente é filtrado e a resina é lavada alternadamente com CH2CI2 e iPrOH (10x50 ml), MeOH (2x50 ml) e éter (2x50 ml). A resina é seca sob corrente de azoto. O ensaio de Kaiser é sempre
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 27 negativo. Método D: A resina obtida pelo método B (1,5 g) é colocada num balão e adiciona-se CH2CI2 (20 ml), seguido por DIEA (20 mmol). A mistura é submetida a agitação magnética e é adicionado, gota a gota durante 5 minutos, cloroformato de benzilo (14 mmol). O pH é mantido a 11 por adição de DIEA. Após uma noite, a resina é passada num reactor SPPS, filtrada e lavada alternadamente com CH2CI2 e iPrOH (10x20 ml) e éter (2x20 ml). A resina é seca sob corrente de azoto. e) - Método E: Clivagem dos poli aminoácidos protegidos, da resina:
As resinas obtidas pelos métodos C e D são colocadas num balão de 250 ml, equipado com uma barra magnética. Uma solução composta por 50 ml de CH2CI2 e 25 ml de CF3CH2OH é adicionada, e a mistura é agitada durante 2 h. A solução é filtrada, a resina é lavada com CH2CI2 (2x10 ml) e as fases orgânicas assim obtidas são reunidas e evaporadas sob vácuo. Os produtos são em seguida purificados por cromatografia "flash" sobre Si02 usando como eiuente CHCI3/MeOH (9:1). As fracções que contêm os produtos são identificadas por CCM (para mais detalhes consultar os exemplos que se seguem). f) - Método F: Acoplamento de aminoácidos com dilipidilaminas:
Colocam-se num balão de 250 ml Boc-aminoácido (10 mmol) e dilipidilamina C12-C22 (10 mmol). Adiciona-se CHCI3 (100 ml) e a mistura é agitada até dissolução completa. Em seguida juntam-se TEA (30 mmol) e BOP (33 mmol). O pH é mantido a 10 com TEA e a reacção é agitada durante 2 h. Após o fim da reacção (CCM), o clorofórmio é evaporado e o sólido é retomado em acetato de etilo (300 ml). A fase orgânica é lavada com KHS04 (4x100 ml), NaHC03 (4x100 ml) e NaCI (4x100 ml). A fase orgânica é seca sob MgS04, filtrada e evaporada sob vácuo. Os produtos são analisados por CCM, RMN e MS e são utilizados sem mais purificações. Os rendimentos são da ordem dos 90%.
g) - Acoplamento de poliaminoácidos protegidos com dilipidilamidas de ácidos e clivagem dos grupos de protecção Boc e Z
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Método G Ο produto obtido pelo método F (9 mmol) é colocado num balão equipado com uma barra magnética e adiciona-se TFA frio (4°C) (30 ml). A solução é agitada durante 1 hora. O TFA é evaporado sob vácuo. O produto é dissolvido por adição de DMF (70 ml). Adiciona-se TEA (30 mmol), depois poliaminoácido protegido, obtido pelo método E (9 mmol). 0 pH é ajustado a 10 e adiciona-se BOP (33 mmol). A solução é agitada durante 2 h e acompanhada por CCM. Após o fim do acoplamento (CCM), adiciona-se uma solução de KHS04 (700 ml) e extrai-se o produto com acetato de etilo (3x100 ml). A fase orgânica é lavada com KHS04 (3x50), NaHC04 (3x50) e NaCI (3x50 ml), seca sob MgS04, filtrada e evaporada sob vácuo. Os produtos são analisados por RMN, CCM e MS e são desprotegidos sem purificação prévia. Junta-se TFA (50 ml) ao produto, a solução é agitada durante 1,5 h, e o TFA é evaporado. Se o produto contiver ainda grupos Z ou CIZ que não são cliváveis pelo TFA, segue-se o método H directamente. Os produtos finais são purificados por CLHP semipreparativa (ver exemplos).
Método H
Os produtos obtidos pelo método G que contenham grupos Z ou CIZ são colocados num balão equipado com uma barra magnética e dissolvidos em 10 ml de MeOH/g de produto. Adicionou-se Pd/C (10%, 1 g/g produto) e formato de amónio (1 g/g produto), à temperatura ambiente. Acompanha-se a hidrogenação por CLHP. Após 2 h a reacção está acabada, a mistura é filtrada e o filtro é lavado com 10 ml de MeOH. Adiciona-se água bidestilada e a solução é congelada e liofilizada. Os produtos finais são purificados por CLHP preparativa. h) Método I de desprotecção dos grupos de protecção Boc
Adiciona-se ácido trifluoroacético (50 ml) ao produto que contém grupos Boc (1 mmol), dentro de um balão. A solução é agitada durante 1,5 h, e o TFA é evaporado. A amina está completamente desprotegida e pronta a ser usada em acoplamentos sem purificação adicional.
B - MATERIAL E MÉTODO PARA O ESTUDO BIOLÓGICO: 1 PLASMÍDEOS UTILIZADOS PARA A TRANSFERÊNCIA DE GENES IN VITRO 29 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ Ο plasmídeo pCMV-LUC é uma construção derivada, quer do plasmídeo pGL2-Basic Vector (Promega) quer do plasmídeo pGL2-Control Vector (Promega) por inserção de um fragmento Mlu l-Hind III contendo o promotor do Citomegalovírus humano (CMV) extraído do plasmídeo vector pcDNA3 (Invitrogen).
2 PROTOCOLO DE PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES UTILIZADAS PARA A TRANSFECÇÃO
Os produtos descritos no invento são postos em solução a 20 mM em etanol ou em água, depois diluídos em água assegurando que a concentração etanólica final seja inferior a 10%. As soluções de ácido nucleico diluídas em soro fisiológico (NaCI 0,1 5M) são adicionadas às soluções de lipofectante numa relação de 1/1 (v/v). Após homogeneização no vórtex e incubação durante 15 minutos à temperatura ambiente, as soluções de ADN/lipofectante são distribuídas a 9% (v/v) final nos poços onde as células foram lavadas por meio de crescimento desprovido de proteínas (soro) e repostas em crescimento num meio desprovido ou não de soro.
C- MATERIAL PARA OS ENSAIOS /N VIVO
1 MATERIAIS a) Modelos experimentais: - ratinhos C57/BL 6 adultos (>8 semanas) fêmeas - tumores do tipo 3LL ("Lewis Lung carcinoma") obtidos por passagem de fragmentos de tumor de animal para animal, implantados sob a pele ao nível do flanco. b) Plasmídeos utilizados: pXL 2622: deriva do pGL2 básico (Promega) no qual o promotor do citomegalovírus (CMV) extraído de pCDNA3 (Invitrogen) foi inserido a montante do gene que codifica para a luciferase. Este plasmídeo é obtido pela técnica de precipitação com PEG (Ausubel), e armazenado em Tris 10 mM EDTA 1 mM pH8 a 4°C, numa concentração de cerca de 10 μg de ADN por μΙ. 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 30
2 PROTOCOLOS
Soluções iniectadas: Ο ADN a transfectar é primeiro solubilizado no tampão, o péptido (KTPKKAKKP)2 SEQ ID N°1 é então adicionado e, após 20 minutos, adiciona-se uma solução de lípidos catiónicos em forte concentração {20 ou 40 mM) à mistura. Depois da adição de todos os produtos, a mistura contém, além do ADN (em concentração final de 0,5 mg/ml), o péptido (0,75 mg/ml) e o lípido catiónico, NaCI 150 mM, D-Glucose a 5% e MES 5 mM, pH 6,2. A injecção é realizada 20 a 30 minutos depois da preparação da solução. EXEMPLO 1 Síntese de H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3l\IHCH2COGIyN[{CH2)17CH3]2 (6) a- Síntese do ácido {Boc-[3-(Boc-{4-[Boc-(3-Boc-aminopropil)amino]butil}amino)-propiljamino} acético (3) A resina obtida segundo o método A é feita reagir com a espermina, segundo os métodos B, C e E. 0 produto protegido é purificado por cromatografia sobre Si02. 0 rendimento é de 40%. CCM: Rf = 0,32 (CHCI3/MeOH, 9:1) CLHP, Rt = 4,22 min, (H20/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
Espectro de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6 juntando algumas gotas de
centrais do butilo); 1,64 e 1,74 (2mts, 2H cada: CH2 central dos propilos); 2,96 (t, J = 7 Hz, 2H: CH2NCOO); 3,15 (mt, 8H: CH2NCH2); 3,23 (t, J = 7,5 Hz, 2H: CH2NCOO); 3,83 (s, 2H: OCONCH2COO). MH + : 661 b- Síntese do ácido {Z-[3-(Z-{4-[Z-(3-Z-aminopropil)amino]butil}amino)propil]-amino} acético (4) A resina obtida segundo o método A é feita reagir com a espermina segundo os métodos B, C e D. O produto protegido é purificado por cromatografia sobre Si02. O rendimento é da ordem dos 20%.
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 31 CCM: R, = 0.85 (CHCU/MeOH. 8:2) CLHP. Rt = 6,92 min, (H20/MeCN: 3 min [40/60]. 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
Espectro de RMN Ή (400 MHz, (CD3)2SO d6, a uma temperatura de 413K, d em ppm): 1,49 (mt, 4H: CH2CH2 centrais do butilo); 1,74 e 1,81 (2 mts, 2H cada: CH2 central dos propilos); 3,07 (q, J = 7 Hz, 2H: CH2NC00 benzilo); de 3,15 a 3,30 (mt, 8H: CH2NCH2); 3,33 (t, J = 7,5 Hz, 2H: NCH2C00); 3,70 (s, 2H: OCONCH2COO); 5,07-5,10-5,12 e 5,13 (4s, 2H cada: ArCH20C0N); 6,65 (mf, 1H: NHCO); de 7,25 a 7,40 (mt, 20H: H aromáticos). MH+ = 797 c- Boc-Gly-dioctadecilamida (5) O Boc-Gly é acoplado à dioctadecilamina segundo o método F, rendimento de 90%. CCM: Rf = 0,9 (CHCI3/MeOH, 9:1) MHC = 679
Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCI3, d em ppm): 0,89 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3); 1,29 (mt, 60H: CH2 centrais das cadeias gordas); 1,49 (s, 9H: C(CH3)3; 1,55 (mt, 4H: 1 CH2 de cada cadeia gorda); 3,15 e 3,33 (2t, J = 7,5 Hz, 2H cada: NCH2 das cadeias gordas); 3,95 (d, J = 5 Hz, 2H: OCONCH2CON); 5,57 (mf, 1 H: C0NH). d- H2N(CH2)3NH(CH2)4NH{CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2)18]2 (6)
Os produtos (3) e (5) ou (4) e (5) são acoplados segundo o método G. Os produtos são desprotegidos conforme descrito no método G para o produto protegido com Boc e no método H para o produto protegido com Z. O produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP. CLHP. Rt= 15,35 min, (H20/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] BYK 2 053 Espectro de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6 com a adição de algumas gotas de CD3COOD d4, a uma temperatura de 300K, d em ppm): 0,83 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3); 1,23 (mt, 60H: CH2 centrais das cadeias gordas); 1,43 e 1,53 (2mts, 2H cada: 1 CH2 de cada cadeia gorda); 1,63 (mt, 4H: CH2CH2
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 32 centrais do butilo); 1,96 (mt, 4H: CH2 central dos propilos); 2,93-3,00 e 3,22 (3mts, 16H na totalidade: NCH2); 3,83 (s, 2H: NCH2C0N); 4,03 (s, 2H: CONCH2CON): MH4- = 821 EXEMPLO 2: Síntese de H2N(CH2)3NH(CH2)4NH{CH2)3NHCH2CON[{CH2)18]2 (7) O produto (3) é acoplado com a dioctadecilamina segundo o método F e desprotegido segundo o método G. 0 produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP. CLHP, Rt = 15,2 min, (H20/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
Espectro RMN 1H (400 MHz, numa mistura 2/3 de CF3COOD e 1/3 de CD3COOD d4, d em ppm): 0,78 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3); 1,20 (mt, 60H: CH2 centrais das cadeias gordas); 1,52 (mt, 4H: 1 CH2 de cada cadeia gorda); 1,80 (mt, 4H: CH2CH2 centrais do butilo); 2,23 e 2,32 (2mts, 2H cada: CH2 central dos propilos); de 3,10 a 3,40 (3mts, 1 6H na totalidade: NCH2); 4,15 (s, 2H: NCH2C0N). MH+ = 764 EXEMPLO 3: Síntese de H2N(CH2)3NH{CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)18]2 (9) a- Boc-Arg(Z2)dioctadecilamida (8) 0 produto é sintetizado por acoplamento de BocArg(Z2) e de dioctadecilamina pelo método F com um rendimento de 91 %. CCM Rf = 0,9 (CHCI3/MeOH, 9:1) MH+ = 1046 b- H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)18]2 (9) O produto (3) ou (4) é acoplado ao produto (8) pelo método G e desprotegido pelo método G (Boc) e/ou Η (Z). 0 produto final é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP. Rt= 13,83 min, (H20/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ [0/100]
Espectro de RMN *Η (400 ΜΗζ, (CD3)2SO d6, δ em ppm); 0,90 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3); 1,28 (mt, 60H: CH2 das cadeias gordas); de 1,40 a 1,80 (mt, 12H: CH2); 1,93 (mt, 4H: CH2 centrai dos propilos); de 2,80 a 3,10 (mt, 16H: NCH2 e NCH2 das cadeias gordas); 3,42 (mt, 2H; CH2N do amido); 3,77 (mt, 2H: NCHjCON); 4,67 (mt, 1H: NCHC0N); de 6,80 a 7,50 (mf desdobrado, 2H: NH2); 7,78-7,92-8,80 e 9,03 (respectivamente mt e mfs, respectivamente 1H -2H - 4H e 1 H: CONH - NH e NH2). MH~ =920 EXEMPLO 4: Síntese de H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArg(Z)2N[(CH2)17CH3]2 (10) 0 produto (3) é acoplado ao produto (8) pelo método G e os grupos Boc são clivados pelo mesmo método. O produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP. R.= 17,75 min, (H20/MeCN: 3 min [40/60], 3-20 min [0/100] 35 min [0/100]
Espectro de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO, d em ppm): 0,87 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3); 1,25 (mt, 60H: CH2 centrais das cadeias gordas); 1,40 e 1,57 (2mts, 2H cada: 1 CH2 de cada cadeia gorda); 1,65 (mt, 8H: CH2CH2 centrais dos butilos); 1,95 (mt, 4H: CH2 central dos propilos); de 2,85 a 3,05 (mt, 14H na totalidade: NCH2); 3,23 (t, J = 7,5 Hz, 2H: NCH2); 3,75 (s, 2H: NCH2CON); 3,85 e 3,95 (2mts, 1H cada: CH2NC); 4,67 (mt, 1H: CONCHCON); 5,07 e 5,25 (respectivamente AB limite e s, J = 13,5 Hz, 2H cada: NCOOCH2Ar); de 7,25 a 7,45 (mt, 10H: H aromáticos); 7,95-8,85-9,00 e 9,20 (4mfs: H permutáveis). MH + = 1188 EXEMPLO 5: Síntese de H2N(CH2)3ISIH(CH2)4NH{CH2)3NHCH2COLys(rodamina)N[(CH2)17CH3]2 (13) a- Boc-Lys(Z)dioctadecilamida (11) O produto foi sintetizado por acoplamento de BocLys(CIZ) com a dioctadecilamina pelo método F com um rendimento de 89%.
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 34 CCM. Rf = 0,92 (CHCI3/MeOH, 9:1) ΜΗ+ = 918 b- BocHN(CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBocCH2COLys(C!Z)N[(CH2)17CH3]2 (12) Ο produto (3) é acoplado ao produto (11) pelo método G (sem a desprotecção do Boc).
Espectro de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6, a uma temperatura de 423K, d em ppm): 0,92 (t, J = 6,5 Hz, 6H:CH3); 1,32 (mt, 60H: CH2 centrais das cadeias gordas); 1,44 (2s, 36H na totalidade: C(CH3)3); de 1,50 a 1,80 (mt, 16H: 1 CH2 de cada cadeia gorda -CH2CH2 centrais do butilo - CH2CH2CH2 e CH2 central do propilo); 3,00 (q,J = 6,5 Hz, 2H: 0C0NCH2); 3,05 (q, J = 6,5 Hz, 2H: CH2NCOO); de 3,15 a 3,40 (mt, 14H: NCH2 das cadeias gordas - CH2NCH2 e CH2NCH2CH2N); 3,80 (s, 2H: OCONCH2CON); 4,75 (mt, 1H: CONCHCON); 5,15 (s, 2H: NC00CH2Ar); 5,97 e 6,53 (2mts, 1H cada: OCONH e NHCOO); 7,08 (d, J = 7,5 Hz, 1H: CONH); de 7,30 a 7,50 (mts, 4H: H aromáticos). c- H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(rodamina)N[(CH2)17CH3]2 (13) 0 grupo CIZ sobre a lisina do produto (12) é clivado pelo método Η, o produto assim obtido é seco sob vácuo e retomado com éter e lavado com NaHC03 e NaCI. O éter é seco sobre MgS04 e evaporado sob vácuo. 77 mg (60 μηη) do produto desprotegido são dissolvidos em 3 ml de MeOH, o DIEA (64 μΙ) é adicionado, e depois o isotiocianato de tetrametilrodamina (30 mg, 68 μηη); a solução é agitada durante 17 horas e a reacção é acompanhada por CCM. No dia seguinte a solução é concentrada até à secura sob vácuo. O TFA (4 ml) é em seguida adicionado e deixa-se a agitar durante 1 hora. O TFA é evaporado e o produto bruto é purificado por CLHP semipreparativa com um rendimento final de 30%. CCM. Rf = 0,05 (MeOH) CLHP (semiprep.) R. = 61,55 min (H20/MeCN: 3 min [100/0], 3-45 min [0/100], 45-140 min [0/100]. MH+ = 1 335
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 35 EXEMPLO 6: Síntese de H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(biotinil)N[(CH2)17CH3]2 (14) O produto (12) é desprotegido pelo método H (271 mg, 0,21 mmol) e dissolvido em DMF (10 ml). 0 DIEA (0,11 ml) é adicionado, depois a biotina (56,4 mg, 0,23 mmol) e o BOP (102 mg, 0,23 mmol); o pH é mantido a 10 (DIEA) e o fim da reacção é verificado pelo teste da fluorescamina. 0 produto é recuperado conforme descrito no método F e desprotegido sem mais purificação com TFA (5 ml) durante 1 hora. 0 TFA é evaporado e o produto é purificado por CHLP semipreparativa com um rendimento de 50%. CLHP. Rt = 13,12 min, (H20/MeCN: 3.min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]. MH~ = 1118 EXEMPLO 7: Síntese de {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2CO-GlyN[(CH2)17CH3]2 (16) a- {BocNH(CH2)3}2N(CH2)4IM{(CH2)3IMHBoc}(CH2)3NBocCH2COOH (15) 0 produto (1) é fixado sobre o polímero pelo método B, protegido pelo método C e clivado da resina pelo método E. 0 produto é purificado sobre Si02 com um rendimento de 35%. CCM: Rf = 0,2 (CHCI3/MeOH, 8:2)
Espectro de RMN ^ (400 MHz, (CD3)2SO d6 com adição de algumas gotas de CD3COOD d4, a uma temperatura de 433K, d em ppm): 1,42 (s, 36H: C(CH3)3); 1,56 (mt, 4H: CH2CH2 centrais do butilo); de 1,65 e 1,85 (mt, 8H: CH2 central dos propilos); 2,76 (mt, 12H: CH2N(CH3)2); 3,06 (t, J = 6,5 Hz, 6H: OCONCH2); 3,29 (mt, 2H: NCH2); 3,86 (s, 2H: OCONCH2COO). MH+ = 775 b- {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{ (CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2)17CH3]2 (16) O produto (15) é acoplado ao produto (5) segundo o método G. O produto é desprotegido pelo método G e é purificado sobre CLHP semipreparativa, as fracções são analisadas por CLHP analítica e liofilizadas. Rendimento de 55%. CLHP (semiprep.): Rt = 38,72 min (H20/MeCN, 10 min [100/0], 10-45 min [0/100], 45-140 min [0/100]
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Espectro de RMN 'Η (400 ΜΗζ, (CD3)2SO d6, a uma temperatura de 386K, d em ppm): 0,90 (t, J = 7 Hz; 6H: CH3); 1,30 (mt, 60H: CH2 centrais das cadeias gordas); 1,55 (mt, 4H: 1 CH2 de cada cadeia gorda); 1,65 (mt, 4H: CH2CH2 centrais do butilo); 1,97 (mt, 8H: CH2 central dos propilos); de 2,80 a 3,05-3,06 e 3,28 (respectivamente mt e 2t, J = 7,5 Hz, 18H - 2H e 4H: NCH2); 3,80 (s, 2H: NCH2C0N); 4,03 (d, J = 5,5 Hz, 2H: C0NCH2C0N); de 6,00 a 9,00 (mf desdobrado: NH2 e NH); 8,27 (mt, 1H: CONH). MH+ = 935 EXEMPLO 8 Síntese de: {H2IM(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3lMHCH2CON[(CH2)17CH3]2(17) É sintetizado como o produto (7) utilizando o produto (15) em vez do (3). O produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica e liofilizadas. CLHP (semiprep.): Rt = 38 min (H20/MeCN, 10 min [100/0], 10-45 min [0/100], 45-140 min [0/100].
Espectro de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6 com adição de algumas gotas de CD3COOD d4, d em ppm): 0,88 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3); 1,29 (mt, 60H: CH2 centrais de cadeias gordas); 1,52 (mt, 4H: 1 CH2 de cada cadeia gorda); 1,68 (mt, 4H: CH2CH2 centrais do butilo); de 1,90 a 2,10 (mt, 8H: CH2 central dos propilos); 2,90- de 2,95 a 3,15- 3,18 e 3,15 (respectivamente t-mt e 2t largos, J = 7,5 Hz, 24H na totalidade: NCH2); 4,02 (s, 2H: NCH2C0N). MH" = 878 EXEMPLO 9 Síntese de {H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2COGIyl\l[(CH2)17CH3]2 (19) a- {BocNH(CH2)2}2N(CH2)2NBocCH2COOH (18) É sintetizado como 0 produto (15) utilizando a tris(aminoetil)amina em lugar do produto (1). Rendimento de 29%. CCM. Rf = 0,55 (CHCI3/MeOH, (8:2)
Espectro de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6, a uma temperatura de 393K, d em ppm): 1,44 (s, 27H: C(CH3)3); 2,58 (t, J = 6,5 Hz, 4H: CH2NCH2); 2,66 (t, J = 7 Hz, 2H: NCH2); 3,04 (q, J = 6,5 Hz, 4H: OCONCH2); 3,28 (t, J = 7 Hz; 2H:
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ OCONCH2); 3,76 (s, 2Η: OCONCH2COO); 6,06 (mf, 2H: CONH). MH+ = 505 b- {H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2COGIyN[(CH2)17CH3]2 (19) É sintetizado como o produto (17) utilizando (18) em vez de (15), com um rendimento de 65%. CLHP, R, = 122 min, (H20/MeCN, 10 min [100/0], 10-45 min [0/100], 45-140 min [0/100]
Espectro de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6 com adição de algumas gotas de CD3COOD d4, d em ppm): 0,87 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3); de 1,15 a 1,35 (mt, 60H: CH2 centrais das cadeias gordas); 1,45 e 1,55 (2mts, 2H cada: 1 CH2 de cada cadeia gorda); 2,64 (t, J = 5,5 Hz, 4H: CH2NCH2); 2,75 (t, J = 6 Hz, 2H: NCH2); 2,95 (t, J = 5,5 Hz, 4H: NCH2); 3,08 (t, J = 6 Hz, 2H: NCH2); 3,25 (mt, 4H: NCH2 das cadeias gordas); 3,88 (s, 2H: NCH2CON); 4,06 (d, J = 5 Hz, 2H: CONCH2CON); 7,75 (mf desdobrado residual: NH); 8,68 (t residual, J = 5 Hz: CONH). MH~ = 765 EXEMPLO 10 Síntese de {H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2CON[(CH2)17CH3]2 (20) É sintetizado como 0 produto (19) utilizando a dioctadecilamina em vez de (5). Rendimento de 73%. CLHP. Rt= 100,1 min (H20/MeCN, 10 min [100/0], 10-45 min [0/100], 45-140 min [0/100]. MH+ = 708 EXEMPLO 11 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLysN[(CH2)17CH3]2 (21) (RPR 127888 A) O produto (12) é desprotegido pelo método H (Cl-Z), seguido do método I. O produto final é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP, Rt= 11,76 min, (HzO/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
Espectro de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6, a uma temperatura de 393K, d em ppm): 0,91 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3 das cadeias gordas); 1,31 (mt, 60H: (CH2)15 centrais das cadeias gordas); de 1,35 a 1,75 (mt, 10H: 1 CH2 de cada cadeia gorda, (CH2)3 centrais do lisilo); 1,75 (mt, 4H: (CH2)2 centrais do butilo); 2,00 (mt, 4H: CH2 dos propilos); 2,82-2,98-3,06 e de 3,10 a 3,50 (respectivamente 2t -mt e 2mfs, J = 7 Hz, 18H na totalidade: NCH2 do lisilo -NCH2 do butilo - NCH2 dos propilos e NCH2 das cadeias gordas); 3,62 (s, 2H: NCH2C0N); 4,73 (q, J = 7 Hz, 1H: CONCHCON do lisilo); 8,18 (d, J = 7 Hz, 1H: CONH do lisilo): EXEMPLO 12 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(CI-Z)N[(CH2)17CH3]2 (22) (RPR 122759 A) 0 produto (12) é desprotegido segundo o método I. O produto final é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP, Rt= 16,79 min, (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] MH+ = 1060
Espectro RMN 1H (400 MHz; (CD3)2SO d6, a uma temperatura de 373K, d em ppm): 0,91 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3 das cadeias gordas); 1,31 (mt, 60H: (CH2)15 centrais das cadeias gordas); de 1,30 a 1,75 (mt, 10H: 1 CH2 de cada cadeia gorda, (CH2)3 centrais do lisilo); 1,72 (mt, 4H: (CH2)2 centrais do butilo); 1,95 (mt, 4H: CH2 dos propilos); 2,98-3,06 e de 2,90 a 3,50 (respectivamente 2mts e mf, 18H na totalidade: NCH2 do lisilo - NCH2 do butilo - NCH2 dos propilos e NCH2 das cadeias gordas); 3,59 (s, 2H: NCH2CON); 4,75 (q, J = 7Hz, 1H: CONCHCON do lisilo); 5,16 (s, 2H: COOCH2Ar); 6,85 (mf, 1H: 0C0NH); de 7,35 a 7,55 (mt, 5H: H Aromáticos); 8,15 (mf, 1H: CONH do lisilo). EXEMPLO 13 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(CHO)N[(CH2)17CH3]2 (24) (RPR 122760 A) a- NHBoc(CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBocCH2COLysN[(CH2)17CH3]2 (23) O produto (12) é desprotegido segundo o método H (Cl-Z) com um
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 39 rendimento de 65% e utilizado sem mais purificação. CLHP. Rt = 20,82 min, (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] b- NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(CHO)l\l[(CH2)17CH3]2 (24) O produto (23) é acoplado com o ácido fórmico pelo método G. O produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP, Rt= 13,60 min, (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] MHÍ = 920
Espectro de RMN ]H (400 MHz, (CD3)2SO d6, a uma temperatura de 383 K, d em ppm): 0,92 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3 das cadeias gordas), 1,31 (mt, 60H:_ (CH2)15 centrais das cadeias gordas); de 1,35 a 1,70 (mt, 10H: 1 CH2 de cada cadeia gorda, (CH2)3 centrais do lisilo); 1,73 (mt, 4H: (CH2)2 centrais do butilo); 1,98 (mt, 4H: CH2 dos propilos); de 2,85 a 3,50 (mt, 18H: NCH2 do lisilo -NCH2 do butilo - NCH2 dos propilos e NCH2 das cadeias gordas); 3,62 (s, 2H: NCH2C0N); 4,75 (mt, 1H: CONCHCON do lisilo); 7,60 (mf, 1H: CONH); 8,05 (s largo, 1H: CH do aldeído); 8,18 (mf, 1H: CONH do lisilo) EXEMPLO 14 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys[Cholesteryl]N[(CH2)17CH3]2 (25) (RPR 128142 A) 0 produto (23) é acoplado com o cloroformato de colesterilo segundo o método G (sem utilização do reagente BOP). 0 produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP. Rt = 21,66 min, (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] MH + = 1304
Espectro de RMN ΊΗ (600 MHz, (CD3)2SO d6, d em ppm): 0,68 e 0,98 (2s, 3H cada: CH3 em 18 e CH3 em 1 9 do colesterilo); 0,86 (mt, 12H: CH3 das cadeias gordas e CH3 em 26 e 27 do colesterilo); 0,91 (d, J = 7 Hz, 3H: CH3 em 21 do colesterilo); 1,31 (mt, 60H: (CH2)15 centrais das cadeias gordas); de 0,80 a 2,30 (mt, 42H: 1 CH2 de cada cadeia gorda -CH2 em 1, 2, 4, 7, 1 1, 1 2, 1 5, 16, 22, 23 e 24 do colesterilo - CH em 8, 9, 14, 17, 20 e 25 do colesterilo -
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 40 (CH2)3 centrais do lisilo e CH2 dos propilos); 1,65 (mt, 4H: (CH2)2 centrais do butilo); 2,88 e 2,96 (2mts, 14H na totalidade: NCH2 do lisilo - NCH2 do butilo -NCH2 dos propilos); de 3,20 a 3,50 (mt, 4H: NCH2 das cadeias gordas); 3,64 (s, 2H: NCH2CON); 4,23 (mt, 1H: CH em 3 do colesterilo); 4,63 (mt, 1H: CONCHCON do lisilo); 5,30 (mt, 1H: CH em 6 do colesterilo); 6,98 (mt, 1H: NHCOO); 7,90 (mt, 1H: CONH do lisilo); 8,60 a 9,10 (mfs permutáveis) EXEMPLO 15 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys[Araquidonil]N[(CH2)17CH3]2 (26) (RPR 130605) O produto (23) é acoplado com o ácido araquidónico sob corrente de azoto e ao abrigo da luz segundo o método G. O produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP, R.= 20,67 min, (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] MH+ = 1177
Espectro de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6 com adição de algumas gotas de CD3COOD d4, a uma temperatura de 393K, d em ppm): 0,90 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3 das cadeias gordas); 0,91 (t, J = 7 Hz, 3H: CH3 do araquidonilo); 1,31 (mt, 60H: (CH2)15 centrais das cadeias gordas); de 1,35 a 1,75 (mt, 18H: 1 CH2 de cada cadeia gorda - (CH2)3 centrais e CH2 central do araquidonilo e (CH2)3 centrais do lisilo); 1,75 (mt, 4H: (CH2)2 centrais do butilo); 2,02 (mt, 4H: CH2 dos propilos); 2,10 (mt, 6H: C0CH2 e os dois =CCH2 do araquidonilo); 2,80 -2,97 - 3,06 e de 3,10 a 3,50 (respectivamente mt - t - mt e 2mfs, J = 7 Hz, 24H na totalidade: =CCH2C= do araquidonilo - NCH2 do lisilo - NCH2 do butilo - NCH2 dos propilos e NCH2 das cadeias gordas); 3,62 (s, 2H: NCH2CON), 4,73 (dd, J = 8 e 5 Hz, 1H: CONCHCON do lisilo); 5,38 (mt, 8H: CH = CH do araquidonilo). EXEMPLO 16 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIuN[(CH2)17CH3]2 (28) (RPR 126097 A) a- Boc-Glu(0-Bz)-díoctadecilamina (27) O produto é sintetizado por acoplamento de Boc-Glu(O-Bz) e de
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 41 dioctadecilamina pelo método F com um rendimento de 90%. CCM Rf = 0,88 (CHCI3/MeOH, 9:1) b- NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIuN[(CH2)17CH3]2 (28) O produto (3) ou (4) é acoplado ao produto (27) pelo método G, seguido do método H (desprotecção Cl-Z). O produto final é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP. Rt= 14,64 min, [H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] MH+ =893
Espectro de RMN 7H (400 MHz, (CD3)2SO d6, a uma temperatura de 383K, d em ppm): 0,90 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3 das cadeias gordas); 1,30 (mt, 60H: (CH2)15 centrais das cadeias gordas); 1,56 (mf, 4H: 1 CH2 de cada cadeia gorda); de 1,60 a 2,00 (mt, 2H: CH2 central do glutarilo); 1,73 (mt, 4H: (CH2)2 centrais do butilo); 1,98 (mt, 4H: CH2 dos propilos); 2,32 (t, J = 7 Hz, 2H: COCH2 do glutarilo); 3,00 - 3,06 e 3,45 (respectivamente t e 2mts, J = 7 Hz, 1 6H na totalidade: NCH2 do butilo - NCH2 dos propilos e NCH2 das cadeias gordas); 3,65 (s largo, 2H: NCH2CON); 4,85 (mt, 1H: CONCHCON do glutarilo); 8,19 (s largo, 1H: CONH do glutarilo). EXEMPLO 17 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu(0-Bz)N[(CH2)17CH3]2 (29) (RPR 123027 A) O produto (3) é acoplado ao produto (27) e desprotegido pelo método G (Boc). O produto final é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP Rt= 16,02 min (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] MH* =983
Espectro de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6, a uma temperatura de 413K, d em ppm): 0,89 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3 das cadeias gordas); 1,30 (mt, 60H: (CH2)15 centrais das cadeias gordas); 1,55 (mf, 4H: 1 CH2 de cada cadeia gorda); 1,72 (mt, 4H: (CH2)2 centrais do butilo); de 1,75 a 2,00 (mt, 2H: CH2 central do glutarilo); 1,99 (mt, 4H: CH2 dos propilos); 2,47 (t, J = 7 Hz, 2H: COCH2 do glutarilo); 2,95 - 3,05 e 3,40 (3mts, 16H na totalidade: NCH2 do
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ butilo - NCH2 dos propilos e NCH2 das cadeias gordas); 3,62 (s largo, 2H: NCH2CON); 4,85 (mt, 1H: CONCHCON do glutarilo); 5,14 (AB limite, J = 12 Hz, 2H: CH2 do benzilo); 7,35 (mt, 5H: H Aromáticos do benzilo); 8,23 (mf, 1H: CONH do glutarilo). EXEMPLO 18 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu(Galactosamida)N[(CH2)17CH3]2 (31) (RPR 130596 A) a- BocNH{CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBocCH2COGIuN[(CH2)17CH3]2 (30) O produto (3) é acoplado ao produto (27) e o grupo de protecção OBz da cadeia lateral é clivado pelo método H (Cl-Z) e utilizado sem mais purificação. CLHP Rt = 22,84 min (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] MH+ = 1293 b- NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu(Galactosamida)N[(CH2)17CH3]2 (31) O produto (30) é acoplado com cloridrato de D-( + )-Galactosamina segundo o método G. 0 produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP. Rt= 13,71 min, (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] MH" = 1054 EXEMPLO 19 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu(Galactosamida)N[(CH2)17CH3]2 (32) (RPR 130595 A) O produto (30) é acoplado ao cloridrato de D-(+ )-glucosamina segundo o método G. O produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP Rt= 12,27 min, (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] 43 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ ΜΗ+ = 1054 EXEMPLO 20 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu(Manosamida)N[(CH2)17CH3]2 (33) (RPR 130598 A) O produto (30) é acoplado com cloridrato de D-( + )-Manosamina segundo o método G. O produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP. Rt= 12,98 min, <H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] MH" = 1054 EXEMPLO 21 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu(N(CH3)2)N[(CH2)17CH3]2 (34) (RPR 131111 A) 0 produto (30) é acoplado com a dimetiiamina segundo o método G. O produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP, Rt= 14,44 min, (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] MH+ = 920
Espectro de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6, d em ppm): 0,89 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3 das cadeias gordas); 1,25 (mt, 60H: (CH2)15 centrais das cadeias gordas); 1,43 e 1,60 (2mts, 2H cada: 1 CH2 de cada cadeia gorda); 1,65 (mt, 4H: (CH2)2 centrais do butilo); 1,65 e de 1,85 a 2,00 (2mts, 1H cada: CH2 central do glutarilo); 1,95 (mt, 4H: CH2 dos propilos); 2,32 (AB limite, 2H: C0CH2 do glutarilo); 2,80 e 2,92 (2s, 3H cada: CON(CH3)2); de 2,85 a 3,05 (mt, 12H: NCH2 do butilo - NCH2 dos propilos); 3,00 - 3,22 - 3,45 e 3,58 (4mts, 1H cada: NCH2 das cadeias gordas); 3,78 (AB, J=16 Hz, 2H: NCH2C0N); 4,75 (mt, 1H: CONCHCON do glutarilo); 8,72 (d, J = 7,5 Hz, 1H: CONH do glutarilo); 8,85 e de 8,90 a 9,15 (mfs permutáveis)
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 44 EXEMPLO 22 Síntese de NHjíCH^NHíCH^NHíCH^NHCHjCOGIyNKCH^-CHak (35) (RPR 122767 A)
Sintetizado da mesma forma que o produto (6), mas utilizando didodecilamina em vez de dioctadecilamina. 0 produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP, Rt = 9,54 min (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] MH" = 653
Espectro de RMN ]H (400 MHz, (CD3)2SO d6, a uma temperatura de 403K, d em ppm): 0,93 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3 das cadeias gordas); 1,33 (mt, 36H: (CH2)9 centrais das cadeias gordas ); 1,58 (mt, 4H: 1 CH2 de cada cadeia gorda); 1,75 (mt, 4H: (CH2)2 centrais do butilo); 1,95 e 2,00 (2mts, 2H cada: CH2 central dos propilos); 2,98 e 3,00 (2mts, 12H na totalidade: NCH2 do butilo e NCH2 dos propilos); 3,30 (t, J = 7 Hz, 4H: NCH2 das cadeias gordas); 3,58 (s, 2H: NCH2CON); 4,05 (s, 2H: CONCH2CON do glicilo). EXEMPLO 23 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIylM[(CH2)12CH3]2 (36) (RPR 122774 A)
Sintetizados da mesma maneira que o produto (6), mas utilizando ditridecilamina em vez de dioctadecilamina. 0 produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP Rt= 10,64 min, (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] MH~ = 681
Espectro de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6, a uma temperatura de 393K, d em ppm): 0,91 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3 das cadeias gordas); 1,33 (mt, 40H: (CH2)10 centrais das cadeias gordas); 1,58 (mts, 4H: 1 CH2 de cada cadeia gorda); 1,75 (mt, 4H: (CH2)2 centrais do butilo); 2,00 (mt, 4H: CH2 central dos propilos); 2,98 e 3,08 (2t, J = 7 Hz, 12H na totalidade: NCH2 do butilo e NCH2 dos propilos); 3,32 (t, J = 7 Hz, 4H: NCH2 das cadeias gordas); 3,65 (s, 2H: NCH2C0N); 4,06 (d, J = 4 Hz, 2H: C0NCH2C0N do glicilo); 8,60 (s largo, 1H: CONH do glicilo)
(37) 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 45 EXEMPLO 24 Síntese de ISIH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2)13CH3]2 (RPR 122766 A)
Sintetizado da mesma maneira que o produto (6), mas utilizando ditetradecilamina em vez de dioctadecilamina. 0 produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP. 0 produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP. CLHP. R, = 9,92 min, (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] MH+ = 709
Esoectro de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6, a uma temperatura de 393K, d em ppm): 0,90 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3 das cadeias gordas); 1,31 (mt, 44H: (CH2)n centrais das cadeias gordas); 1,58 (mt, 4H: 1 CH2 de cada cadeia gorda); 1,76 (mt, 4H: (CH2)2 centrais do butilo); 2,00 (mt, 4H: CH2 central dos propilos); 2,98 e 3,08 (respectivamente mt et, J = 7 Hz, 12H na totalidade: NCH2 do butilo e NCH2 dos propilos); 3,30 (t, J = 7 Hz, 4H: NCH2 das cadeias gordas); 3,65 (s, 2H: NCH2C0N); 4,06 (d, J=4 Hz, 2H: CONCH2CON do glicilo); 8,10 (mf, 1H: CONH do glicilo). EXEMPLO 25 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4N[(CH2)3NH2]CH2COGIyN[(CH2)17CH3]2 (39) (RPR 126096 A) a- Síntese de BocNH(CH2)3NBoc(CH2)4N[(CH2)3NHBoc]CH2C02H (38)
Durante a síntese do produto (3), recupera-se, aquando da purificação sobre Si02, o subproduto (38). 0 rendimento é de 8%. CCM R, = 0,32 (CHCI3/MeOH, 9:1) MH+ =561
Espectro de RMN Ή (400 MHz, (CD3)2SO d6, d em ppm): de 1,30 a 1,60 (mt, 4H: (CH2)2 centrais do butilo); 1,40 (s, 27H: C(CH3)3); 1,56 (mt, 4H: CH2 dos. propilos); 2,68 e 3,11 (respectivamente t largo et, J = 7 Hz, 4H cada: NCH2 do butilo e NCH2 dos propilos); 2,90 e 2,96 (2t, J = 7 Hz, 2H cada: BocNHCH2 dos propilos); 3,18 (s, 2H: NCH2COO).
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 46 b- NH2(CH2)3NH(CH2)4N[{CH2)3NH2]CH2COGIyN[(CH2)17CH3]2 (39)
Os produtos (38) e (5) são acoplados segundo o método G. O produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP. CLHP. Rt= 13,60 min, (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] M PT =821
Espectro de RMN Ή (400 MHz, (CD3)2SO d6 com adição de algumas gotas de CD3COOD d4, d em ppm): 0,87 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3 das cadeias gordas); 1,28 (mt, 60H: (CH2)15 centrais das cadeias gordas); 1,46 e 1,54 (2mts, 2H cada: 1 CH2 de cada cadeia gorda); 1,63 (mt, 4H: (CH2)2 centrais do butilo); 1,91 (mt, 4H: CH2 dos propilos); de 2,85 a 3,15 (mt, 12H: NCH2 do butilo e NCH2 dos propilos); 3,24 (mt, 4H: NCH2 das cadeias gordas); 3,76 (mf, 2H: NCH2CON); 4,05 (s largo, 2H: C0NCH2C0N do glicilo). EXEMPLO 26 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH(CH2)3CON[(CH2)17CH3]2 (41) (RPR 122786 A) a- BocNH(CH2)3NBoc(CH2)4NBoc(CH2)3NBoc(CH2)3C02H (40)
Sintetiza-se 0 produto (40) fazendo uma redução alquilativa sobre a espermina em presença de NaCNBH3 e de semialdeído succínico em solução.
Num balão de 200 ml, colocam-se 1,8 g de espermina, 60 ml de metanol e 0,138 g de NaCNBH3. A solução é submetida a uma viva agitação magnética. Por intermédio de uma ampola isobárica verte-se ao longo de 100 minutos, uma solução de 5,5 ml de semialdeído succínico (15%) com 30 ml de metanol. Mantém-se a agitação durante 100 minutos. Protegem-se as aminas pelo grupo Boc da seguinte maneira: vertem-se sobre o meio 2,8 ml de TEA, depois 8,8 g de bicarbonato de diterc-butilo solubilizados em 30 ml de metanol. Mantém-se durante a noite sob agitação. O meio é concentrado sob vácuo, o produto é retomado em acetato de etilo e extraído com três fracções de 50 ml de NaHC03, as fases aquosas são reunidas e lavadas com éter (3x100 ml). O pH da fase aquosa é levado a 3 com KHS04, verifica-se uma turvação devida à precipitação do produto (41), a mistura é extractada com acetato de etilo (3x100 ml). A fase orgânica é seca sobre MgS04 e evaporada sob vácuo. O produto é utilizado sem mais purificação.
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 47 b- NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH(CH2)3C0N[(CH2)17CH3]2 (41) Ο produto (40) e a dioctadecilamina são acoplados segundo o método G. O produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP. CLHP. Rt = 15,04 min (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] MH~ = 792
Espectro de RMN 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6, a uma temperatura de 383K, d em ppm): 0,85 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3 das cadeias gordas); 1,22 (mt, 60H: (CH2)15 centrais das cadeias gordas); 1,48 (mf, 4H: 1 CH2 de cada cadeia gorda); 1,72 (mt, 4H: (CH2)2 centrais do butilo); 1,88 (mt, 2H: CH2 central do aminopentanoílo); 1,99 (mt, 4H: CH2 dos propilos); 2,42 (t, J = 7 Hz, 2H: C0CH2 do aminopentanoílo); 2,96 - 3,03 e 3,22 (3mts, 18H na totalidade: NCH2 do aminopentanoílo - NCH2 do butilo - NCH2 dos propilos e NCH2 das cadeias gordas). EXEMPLO 27 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CONH(CH2)5CON[(CH2)17CH3]2 (42) (RPR 128506 A)
Sintetizado da mesma maneira que o produto (6), mas utilizando ácido Boc-6-aminocaproico em vez de Boc-Gly. 0 produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP. CLHP. Rt= 13,94 min, (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] MH" =877
Espectro de RMN 1H (300 MHz, (CD3)2SO d6, d em ppm): 0,87 (t, J = 7 Hz, 6H: CH3 das cadeias gordas); 1,28 (mt, 60H: (CH2)15 centrais das cadeias gordas); 1,48 (mt, 10H: 1 CH2 de cada cadeia gorda e (CH2)3 centrais do amino-hexanoílo); 1,65 (mt, 4H: (CH2)2 centrais do butilo); 1,95 (mt, 4H: CH2 dos propilos); 2,27 (t, J = 7 Hz, 2H: COCH2 do amino-hexanoílo); de 2,85 a 3,30 (mts, 18H: NCH2 do amino-hexanoílo - NCH2 do butilo - NCH2 dos propilos e NCH2 das cadeias gordas); 3,70 (s largo, 2H: NCH2CON); de 7,90 a 9,10 (mfs permutáveis).
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ EXEMPLO 28 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu( 11 -amido-undecanil,hepta,0-acetil-lactose)N[(CH2)17CH3]2 (43) (RPR 130765 A) O produto (30) é acoplado com o 11 -amino-undecanil-hepta-O-acetil-lactose segundo o método G. O produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP. Rt = 15,91 min, (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] MH~ = 1 680 EXEMPLO 29 Síntese de NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COAsm(p-NAc(Ac)3)N[(CH2)17CH3]2 (45) (RPR 131283 A) a- Fmoc-Asm-p-Glc-NAc(Ac)3-dioctadecilamina (44) 0 produto é sintetizado por acoplamento de Fmoc-Asm-p-Glc-NAc(Ac)3-OH e de dioctadecilamina pelo método F. CCM R, = 0.67 (CHCIo/MeOH, 9:1) CLHP, Rt = 25,31 min, (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100] b- NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CO-Asm-(p-NAc(Ac)3)N[{CH2)17CH3]2 (45)
Clivagem do grupo Fmoc do produto (45).
Vertem-se sobre 0,7 g de produto (45)/ 20 ml de DMF e 2 ml de dietilamina. Após 6 horas de manutenção sob agitação, o meio é concentrado sob vácuo. 0 produto obtido é acoplado ao produto (3) segundo o método G. 0 produto é purificado por CLHP semipreparativa e as fracções são analisadas por CLHP analítica. CLHP. Rt= 15,35 min, (H20/MeCN: 3 min [60/40], 3-20 min [0/100], 35 min [0/100]
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Ml-Γ = 1 207 EXEMPLO 30 Síntese em solução do produto (6) em grande escala.
Sintetiza-se o produto (6) efectuando uma redução alquilativa sobre a espermina em presença de NaCNBH3 e de ácido glioxílico em solução.
Num balão de 2 I colocam-se 18,2 g de espermina, 500 ml de metanol e 2 g de NaCNBH3. A solução é submetida a uma viva agitação magnética. Por intermédio de uma ampola isobárica verte-se ao longo de 100 minutos, uma solução de 8,45 g de ácido glioxílico em 300 ml de metanol. Mantém-se a agitação durante uma noite. Protegem-se as aminas com o grupo Boc da seguinte maneira: vertem-se sobre o meio 14 ml de TEA, depois 100 g de bicarbonato de diterc-butilo solubilizado em 200 ml de THF. Mantém-se durante a noite sob agitação. O meio é concentrado sob vácuo, o produto é retomado em acetato de etilo (250 ml), lavado com KHS04 (6x100 ml), depois com uma solução saturada de NaCI (3x100), seco sobre MgS04 e evaporado sob vácuo. 0 produto é purificado sobre coluna de sílica usando como eluente CHCI3/MeOH (9:1). As fracções contendo o produto são identificadas por CCM, reagrupadas e evaporadas sob vácuo para obter 10 g do produto (6) (rendimento de 17% para a síntese total). As análises de CLHP analítica, espectro de massa e RMN são idênticas às do produto obtido pelo método em fase sólida. EXEMPLO 31
Influência da relação de carqa (aminas/fosfatos) sobre a eficácia de transfeccão ÍZ1
RPR 120534 A. (6) RPR 120535 A e (9) RPR 120531 A
Tratam-se amostras de 1x105 células [NIH 3T3, 3LL ou SMC de coelho] em fase exponencial de crescimento sobre 2 cm2, com soluções lipofectante/pCMV-LUC, apresentando relações de carga variáveis, durante 2 horas a 37°C sob 5% C02; cada amostra recebe 2 pg de ácido nucleico. A procura da expressão do gene repórter efectua-se após adição de soro de vitela fetal a 8% final, seguida de uma incubação durante 40 horas em estufa de C02.
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 50 A actividade da luciferase é doseada pela emissão de luz [RLU = "relative light unit"] na presença de luciferina, coenzima A e ATP durante 10 segundos e referida a 2000 células tratadas. Os resultados obtidos são apresentados nas figuras (1), (2) e (3).
Da observação destas figuras ressalta claramente que a presença de uma glicina no "espaçador" entre a parte lipídica e a poliamina permite obter uma melhor eficácia de transfecção para proporções fracas de nanomoles de lípido catiónico/pg de ADN. EXEMPLO 32
Influência da relação de caraa (aminas/fosfatos) sobre a eficácia de transfeccão 1201
RPR 120527 A. (19) RPR 120528 A. (17) RPR 120526 A e (16) RPR 120525 A
Tratam-se amostras de 1x105 células NIH 3T3 em fase exponencial de crescimento sobre 2 cm2 com soluções lipofectante/pCMV-LUC, apresentando relações de carga variáveis, durante 2 horas a 37°C, sob 5% C02; cada amostra recebe 1 pg de ácido nucleico. A procura da expressão do gene repórter é efectuada após adição de soro de vitela fetal a 8% final, seguida de uma incubação durante 40 horas na estufa de C02. A actividade da luciferase é doseada no sobrenadante obtido após lise das células pela emissão de luz [RLU = relative light unit] durante 10 segundos e referida ao mg de proteína. Os resultados obtidos são apresentados na figura (4). A vantagem da presença do resíduo glicina no espaçador é ainda posta em evidência neste exemplo.
Exemplo 33
Influência do comprimento do espaçador sobre a eficácia de transfeccão (6) RPR 120535, (41) RPR 122786 e (42) RPR 128506
Amostras de 1x105 células [NIH 3T3 e HeLa] em fase exponencial de crescimento sobre 2 cm2, são tratadas com misturas de lípido catiónico/pCMV-LUC, apresentando concentrações variáveis de lípido catiónico, a 37°C em
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 51 atmosfera húmida sob 5% C02, durante 2 horas, na ausência de proteínas séricas. O meio de crescimento das células é suplementado em seguida com soro de vitela fetal a 8% final e é efectuada a medição da expressão do transgene após 40 horas suplementares da incubação na estufa de C02.
As características estruturais dos espaçadores são como segue:
N° RPR Espaçador 122786 - 120535 Gly 128506 NH2(CH2)5CO O quadro I seguinte apresenta os resultados obtidos que são expressos pelas eficácias máximas obtidas com cada um dos produtos estudados.
lípido catiónico células HeLa células NIH3T3 Experiência 1 RPR1 20535 (6) RPR122786 (41) 1,2.10δ±9,7.1 O4 (4) 2,3.106±1,6.105 (8) 8,7.107±4,5.106 (4) 4,6.107±5,0.106 (8) Experiência 2 RPR1 20535 (6) RPR1 28506 (42) 2,4.106±3,2.105 (6) 1,8.106±1,3.105 (6) 7,2.107±8,3.106 (6) 5,0.107±1,5.106 (6) Ql IADRO I
As eficácias de transfecção são dadas em RLU/1 Os./2103 células tratadas. Entre parêntesis são indicadas as relações de nanomoles de lípido/pg de ADN.
Foram utilizados plasmídeos diferentes para as experiências 1 e 2, na dose de 1 pg e 0,5 pg ADN/1105 células, respectivamente nas experiências 1 e 2.
Exemplo 34:
Influência da estrutura do esoacador sobre a eficácia de transfeccão (6) RPR 120535
Nas condições de experimentação idênticas às que foram descritas no
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 52 exemplo anterior, mas com a introdução de uma linha suplementar (células 3LL), comparámos as eficácias de transfecção obtidas com o lípido catiónico (6) RPR 1 20535 modificado por substituição sobre o "espaçador" com um grupo tipo Arg, tipo Lys ou tipo Glu.
As estruturas dos diferentes espaçadores são como segue: N° RPR ESPAÇADOR 120531 Arg 121650 Arg(Z2)· 127888 Lys 122759 «J > r / crr 122760 ***** H 128142 120535 Gly 123027 GluOBz 126097 Glu
As eficácias de transfecção são dadas em RLU/10s./2103 células tratadas.
Foram utilizados diferentes plasmídeos para as experiências 1 e 2, na dose de 0,5 μg e 1 pg ADN/1105 células, respectivamente nas experiências 1 e 2. Da análise dos resultados ressalta que segundo as células consideradas, a presença de uma cadeia de aminoácido de preferência substituída induz uma melhor eficácia de transfecção.
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 53 lípido Células HeLa Células NIH3T3 Células 3LL Experiência 1 Experiência 2 RPR 120535 RPR 120531 RPR 121650 RPR 120535 RPR 127888 RPR 122760 RPR 122759 RPR 128142 RPR 1 26097 RPR 123027 1.0. 106±1,9.105 3,7.105±1,0.105 2,6.106±1,8.105 2,2.106±3,3.105 3,1.105±2,9.104 1,4.10e±2,2.105 7,7.10s±1,1.105 6,3.106±6,3.105 3,6.106±3,6.10s 1.0. 106±4,1.104 6,5.107±4,8.106 1,6.107±2,0.106 9,1.107±2,7.107 1,7.106±1,0.105 1,4.105±1,7.104 3,7.105±5,4.104 9,1.104±9,3.103 3,0.105±2,3.104 6,9.105±1,1.105
QUADRO II EXEMPLO .34
Influência da presença de DOPE na mistura lipofectante/ADIM (9) RPR 120531 A
Seguindo o mesmo protocolo que foi utilizado no exemplo 31, adiciona-se DOPE (Dioleoilfosfatidiletanolamina) ao líquido catiónico (9) RPR 120531 A com relações molares variáveis antes da adição do DNA à mistura de transfecção. A actividade da luciferase é doseada no sobrenadante após lise das células e expressa em mg de proteína (figura 5). A presença de DOPE nas misturas lipofectantes permite melhorar a eficácia de transfecção quando a concentração em (9) RPR 120531 A é fraca. EXEMPLO 35
Efeito do soro sobre a eficácia de transfecção (6) RPR 120535 A, (9) RPR 120531 A e (10) RPR 121650 A São tratadas amostras de 1.105 células [NIH3T3 ou HeLa] em fase exponencial de crescimento sobre 2 cm2 com soluções de lipofectante/pCMV-LUC (3 nanomoles de lipofectante/pg de ADN) na ausência de soro durante 2 horas ou em presença de soro no meio de cultura. Neste exemplo cada amostra recebe 2 pg de ADN. A expressão da luciferase é pesquisada no sobrenadante dos lisados celulares, expressa em RLU/10s. e referida ao mg de proteína. Da análise dos resultados ressalta que a presença de soro não tem efeito notável
84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 54 sobre a transfecção. EXEMPLO 36
Influência da concentração de ácido nucleico nas misturas de ADN/lipofectante. (20) RPR 120527 A. (19) RPR 120528 A. (17) RPR 120526 A e (16) RPR 120525 A
Nas condições descritas no exemplo 31 amostras de células NIH 3T3 são transfectadas nas condições em que as relações nanomoles de lipofectante/pg de ADN são optimizadas - ver exemplo 32 - [relação = 6 para (20) RPR 1 20527 A e (1 9) RPR 1 20528 A - relação = 3 para (1 7) RPR 1 20526 A e (1 5) RPR 120525 A], As quantidades de ADN transportadas para cada amostra variam de 0,5 a 2 ,ug. Os resultados são apresentados na figura (6). A transfecção de 1.105 células em fase exponencial de crescimento com 1 pg de ADN plasmídico parece uma boa escolha; com efeito o aumento da quantidade de ADN utilizado implica um aumento da concentração de lípido catiónico em contacto com as células e portanto problemas de toxicidade em certos casos. A uma mais fraca concentração em ADN a proporcionalidade com a eficácia da transfecção deixa de se obter. EXEMPLO 37
Ensaios de transfecção in vivo com lipopoliaminas segundo o invento
Procede-se a uma injecção no tumor de uma solução contendo uma lipopoliamina segundo o invento, preparada como foi acima descrito, 7 dias após a implantação, estando o ratinho anestesiado com uma mistura de cetamina + xilazina. Dois dias após a injecção colhe-se tecido tumoral que é pesado, depois picado e triturado em 500 μΙ de tampão de lise (Promega Cell Lysis Buffer E153 A). Após centrifugação (20000 g durante 10 minutos) colhem-se 10 μΙ que servem para avaliação da actividade da luciferase por medição da emissão luminosa total obtida após mistura com 50 μΙ de reagente (Promega Luciferase Assay Substrate) num luminómetro Lumat LB 9501 (Berthold), integração em 10 segundos. A actividade resultante exprime-se em RLU (Relative Light Units) estimadas na totalidade do sobrenadante de lise tumoral ou em RLU por μg de ADN injectado. O quadro III apresenta os resultados obtidos. 55 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ
C 03 O CO 03 Resultado, RLU/tumor desvio padrão 414 286 219 333 82 527 54 375 médio 679 258 395 433 67 994 59 209 ο 03 ο -5- 2 C õ Q co - - “ ;0 *3 E < (0 c Ο ο Τ3 _ _ Ω. In ref. CD 03 z Q < Q- LO _ __ M Q. Q. 03 CL ο +* Ο. '03 α. oT X X CD >-μ- < X : ; : 03 X CL I— X Z "5. LO LO LO LO < n a O O O ο α) Τ3 O CT p o o O o ^— *— Ε +-» (0 (0 α. CN CN CN CN CN CN CN CN δ CO CO CO CO M— CN CN CN CN 0 _J _l —I _1 cc X X X X CL Q_ CL CL
QUADRO III 56 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ
Lisboa, 22. rn 2000
Por AVENTIS PHARMA S.A. - O AGENTE OFICIAL -

Claims (31)

  1. 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 1/10 REIVINDICAÇÕES 1. Lipopoliamina, sob a forma D, L ou LD e seus sais, caracterizada por ser representada pela fórmula geral I: R3 O RI\/R2 N N
    R4 (CH2) η P I na qual: o··: R1, R2 e R3 representam, independentemente uns dos outros, um átomo de hidrogénio ou um grupo -(CH2)q-NRR’ onde q pode variar entre 1, 2, 3, 4, 5 e 6, isto de forma independente entre os diferentes grupos R1, R2 e R3 e R e R' representam, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um grupo -(CH2)q.-NH2, podendo q' variar entre 1, 2, 3, 4, 5 e 6, de forma independente entre os diferentes grupos R e R', m, n e p representam, independentemente uns dos outros, um número inteiro que pode variar entre 0 e 6 quando n é superior a 1, podendo m tomar valores diferentes e podendo R3 tomar significados diferentes na fórmula geral I e R4 representa um grupo de fórmula geral II R6 / \r? R5 -f x—CS) ~ II 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 2/10
    na qual: R6 e R7 representam, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um radical alifático, saturado ou não, C10 a C22, sendo pelo menos um dos dois grupos diferente de hidrogénio, u é um número inteiro escolhido entre 0 e 10; e quando u é um número inteiro superior a 1, R5, X, Y e r podem ter significados diferentes nos diferentes motivos [X-(CHR5)r-Y] X representa um átomo de oxigénio, de enxofre ou um grupo amina, monoalquilado ou não, Y representa um grupo carbonilo ou um grupo metileno R5 representa um átomo de hidrogénio ou uma cadeia lateral de aminoácido natural, substituído se for caso disso, e r representa um número inteiro variando entre 1 e 10; e quando r é igual a 1, R5 representa uma cadeia lateral de aminoácido natural, substituído ou não, e, quando r é superior a 1, R5 representa um átomo de hidrogénio.
  2. 2. Lipopoliamina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por estar representada por uma das subfórmulas seguintes H.N
    R4 o III 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 3/10
    Η,Ν Ν ΝΗ NHj ΝΗ2
    Η.Ν
    VIII HLN
    IX HjN
    R4 X
    84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 5/10
    XI nas quais R4, R6 e R7, são definidos como na reivindicação 1.
  3. 3. Lipopoliamina de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por R4 aí representar um grupo NR6R7 onde R6 e R7 figuram nas subfórmulas III a XII como um grupo idêntico escolhido entre (CH2)17CH3, (CH2)nCH3, (CH2)13CH3 ou (CH2)12CH3.
  4. 4. Lipopoliamina de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizada por estar associada a um elemento de direccionamento para um alvo extra ou intracelular.
  5. 5. Lipopoliamina de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por incorporar o elemento de direccionamento para um alvo ao nível da cadeia lateral de aminoácido representado pelo substituinte R5.
  6. 6. Lipopoliamina de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada por se tratar de um ligando de receptor celular presente na superfície do tipo celular alvo.
  7. 7. Lipopoliamina de acordo com uma das reivindicações 4 a 6, caracterizada por este elemento de direccionamento para um alvo ser escolhido 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 6/10 entre açúcares, péptidos tais como anticorpos ou fragmentos de anticorpos, ligandos de receptores celulares ou fragmentos destes, receptores ou fragmentos de receptores tais como ligandos de receptores de factores de crescimento, de receptores de citóquinas, de receptores de lectinas celulares ou de receptores de proteínas de adesão do tipo integrinas, de receptor da transferrina, dos lípidos HDL ou LDL e/ou dos oligonucleótidos.
  8. 8. Lipopoliamina de acordo com uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizada por este elemento de direccionamento para um alvo ser representado por uma sequência de sinal de localização nuclear,
  9. 9. Lipopoliamina de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizada por incorporar um agente marcador do tipo biotina, rodamina, folato ou uma sequência peptídica ou pseudopeptídica linear ou cíclica, comportando o epítopo Arg-Gly-Asp ao nível da cadeia lateral do aminoácido representado por R5.
  10. 10. Lipopoliamina de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizada por ser escolhida entre: H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2)17CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CON[(CH2)17CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4 NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)17CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArg(Z)2N[(CH2)17CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys (rodamina) N[(CH2)17CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(biotinil)N[(CH2)17CH3]2 (H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2)17CH3]2 {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2CON[(CH2)17CH3]2 {H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2COGIyN[(CH2)17CH3]2 {H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2CON[(CH2)17CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2)17]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CON[(CH2)17]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)17]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArg(Z)2N[(CH2)17CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(rodamina)N[(CH2)17CH3]2 H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys(biotinil)N[(CH2)17CH3]2 {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2)17CH3]2
    84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 7/10 {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2}(CH2)3NHCH2CON[{CH2)17CH3]2 {H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2COGIyN[(CH2)17CH3]2 {H2N(CH2)2}2N(CH2)2NHCH2CON[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4N[(CH2)3NH2]CH2COGIyN-[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLysN-[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys[CI-Z]N[(CH2)17CH3)]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys[CHO]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys[Colesteril]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COLys[Araquidonil]N[{CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIuN[(CH2)17CH3]2 I\ÍH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu[N(CH3)2]N[(.CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu[0-Bz]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu[Galactosamida]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu[Glucosamida]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIu[Manosamida]N[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH(CH2)3CON[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2CONH(CH2)5CON[(CH2)17CH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2)nCH3]2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2)12CH3]2 e NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2)13CH3]2
  11. 11. Composição farmacêutica, caracterizada por conter pelo menos uma lipopoliamina segundo uma das reivindicações 1 a 10 e, pelo menos, um ácido nucleico.
  12. 12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por o ácido nucleico ser um ácido desoxirribonucleico.
  13. 13. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por o ácido nucleico ser o ácido ribonucleico.
  14. 14. Composição de acordo com a reivindicação 11, 12 ou 13, caracterizada por o ácido nucleico estar modificado quimicamente.
  15. 15. Composição de acordo com uma das reivindicações 11 a 14, caracterizada por o ácido nucleico ser anti-sentido. 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 8/10
  16. 16. Composição de acordo com uma das reivindicações 11 a 14, caracterizada por o ácido nucleico comportar um gene terapêutico.
  17. 17. Composição farmacêutica, compreendendo um ácido nucleico, uma lipopoliamina segundo uma das reivindicações 1 a 6 e um adjuvante capaz de se associar ao complexo lipopoliamina/ácido nucleico e/ou de melhorar o seu poder transfectante.
  18. 18. Composição de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por o adjuvante ser um ou vários lípidos neutros.
  19. 19. Composição de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por o ou os lípidos neutros serem escolhidos entre os lípidos sintéticos ou naturais zwiteriónicos ou desprovidos de carga iónica nas condições fisiológicas.
  20. 20. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracterizada por o ou os lípidos neutros serem lípidos com 2 cadeias gordas.
  21. 21. Composição de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizada por o ou os lípidos neutros serem escolhidos entre a dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), o oleoilpalmitoilfosfatidil-etanolamina (POPE), o diestearoil, -palmitoil, -miristoil fosfatidiletanolamina assim como os seus derivados N-metilados 1 a 3 vezes; os fosfatidilglicerois, os diacilglicerois, os glicosildiacilglicerois, os cerebrósidos (tais como designadamente os galactocerebrósidos), os esfingolípidos (tais como designadamente as esfingomielinas) e os asialogangliósidos (tais como designadamente os asialoGMI e GM2).
  22. 22. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindicações 11 a 21, caracterizada por o adjuvante ser ou compreender um composto interveniente ao nível da condensação do citado ácido nucleico.
  23. 23. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por o citado composto derivar, no todo ou em parte, de uma histona, de uma nucleolina e/ou de uma protamina.
  24. 24. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 22, 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 9/10 caracterizada por ο citado composto ser constituído, no todo ou em parte, por motivos peptídicos (KTPKKAKKP) e/ou (ATPAKKAA) repetidos de forma contínua ou não, podendo o número dos motivos variar entre 2 e 10.
  25. 25. Composição de acordo com uma das reivindicações 11 a 24, caracterizada por compreender entre 0,01 e 20 equivalentes de adjuvante para um equivalente de ácido nucleico em peso/peso e, mais preferencialmente, de 0,5 a 5.
  26. 26. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 25, caracterizada por compreender um veículo farmaceuticamente aceitável para uma formulação injectável.
  27. 27. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 25, caracterizada por compreender um veículo farmaceuticamente aceitável para uma aplicação sobre a pele e/ou mucosas.
  28. 28. Utilização de uma lipopoliamina de acordo com uma das reivindicações de 1 a 10 para a preparação de um medicamento destinado à transfecção de células.
  29. 29. Processo de preparação de uma lipopoliamina de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por se efectuar o acoplamento de pelo menos uma fracção lipídica a pelo menos uma fracção de poliamina assimétrica, tendo a citada fracção de poliamina sido previamente obtida por reacção bimolecular entre um agente alquilante ligado por covalência a um suporte sólido e uma poliamina simétrica.
  30. 30. Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por o acoplamento da fracção lipídica à fracção de poliamina assimétrica ser efectuado ao nível do suporte sólido ao qual está fixada a referida fracção de poliamina assimétrica e por ser recuperada a citada lipopoliamina assim obtida.
  31. 31. Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por se 84 757 ΕΡ Ο 861 228/ΡΤ 10/10 efectuar além disso a introdução de agentes marcadores, açúcares ou sondas fluorescentes sobre a lipopoliamina, fixada ou não sobre o suporte sólido. Lisboa, 22. f!3V. 'n Por AVENTIS PHARMA S.A. - O AGENTE OFICIAL -
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