JP4230539B2 - ピペラジンベースのサイトフェクチン - Google Patents
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Description
発明の背景
本発明は、複合両親媒性脂質に関する。本発明は特に、環内の少なくとも１つの窒素に結合するヘテロ原子および環上の窒素に結合する親油性部分を含む、炭化水素鎖を有するピペラジン環を包含する複合陽イオン性両親媒性脂質に関する。
発明の背景
両親媒性分子は、細胞内で治療用または生物活性分子を細胞中に輸送するために用いられる。例えば、ＷＯ ９５／１４３８１は、高分子の細胞内輸送のための両親媒性グアニジン誘導体の使用を開示する。陽イオン性脂質は、一般に１つまたはそれ以上の炭化水素またはアルキル基を含む親油性領域、および少なくとも１つの正に荷電した極性末端基を含む親水性領域を有する両親媒性分子である。陽イオン性脂質は、細胞の形質膜を通して細胞質中への高分子の輸送を促すのに有用である。インビトロならびにインビボで実行し得る方法は、トランスフェクションとして公知であり、このような技法に用いられる陽イオン性脂質はサイトフェクチンとして公知である。
トランスフェクション効率を統計学的に有意な程度に増強するサイトフェクチンは有益である。ＤＮＡのみを用いて得られるよりも２倍程度この活性が増大すれば有益であるが、好ましくはトランスフェクション効率は５〜１０倍増大し、さらに好ましくはトランスフェクション効率は１０倍以上増強される。
典型的には、２つの両親媒性脂質種は組合せると、サイトフェクチン単独よりもトランスフェクション時に有効である定序脂質二重層を含む小胞を形成し得るということが判明しているため、サイトフェクチンは中性両イオン性脂質、例えばリン脂質と組合される。これらの小胞またはリポソームは、それらがポリヌクレオチドまたはその他の陰イオン性分子、例えば負荷電タンパク質と複合体を形成するのを可能にするため表面上に多数の正電荷を有する。ポリヌクレオチド／サイトフェクチン／中性脂質複合体の表面に残存する総陽イオン電荷は、細胞膜表面で優勢な負電荷と強力に相互作用し得る。
両親媒性特性の基本的特徴および極性末端基を除くと、サイトフェクチンは親油性領域および親水性領域ではかなりの構造的多様性を有する。トランスフェクションに用いるために多数の異なるサイトフェクチン種が合成されており、現在市販されている。このようなサイトフェクチンとしては、例えばリポフェクチンTM、リポフェクチンＡＣＥTM、リポフェクトＡＭＩＮＥTM、トランスフィークタムTMおよびＤＯＴＡＰTMが挙げられる。サイトフェクチンの構造的多様性が有効性であるのは、サイトフェクチンの構造−機能−認識の様子が細胞中でそれぞれの適用に関して異なるという観察結果を、部分的には、反映する。ＤＯＴＭＡ化合物と構造的に類似のサイトフェクチンを用いた実験は、トランスフェクション活性が部分的にはトランスフェクトされる細胞型に依っていることを示す（Felgner et al., J. Biol. Chem. 84:7413-7417、1987; Wheeler et al.,Biochem. Biophys. Acta,1280:1-11（1996））。特に、アンモニウム基をスペルミンで置換した基を有する陽イオン性脂質は、いくつかの細胞系のトランスフェクションに関してＤＯＴＭＡより有効であることが分かった。この現象は、有効なトランスフェクションは陽イオン性脂質複合体と形質膜の構造的脂質二重層との受動的融合だけでなく、特異的な細胞特性および細胞成分と個々の陽イオン性脂質種との間の相互作用にも依っていることを示唆する。
したがって、サイトフェクチン種の中でのこの構造上の変異型は、サイトフェクチンと細胞との多面的な且つ複雑な相互作用のより高度の理解及び、１つまたはそれ以上のこれらの相互作用を利用する研究者の側の努力を示すものである。
米国特許第５，０４９，３８６号（Epstein）に開示されたＤＯＴＭＡ、即ちＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムは、開発された最初の陽イオン性脂質の１つであって、この群の脂質は、新規な構造上の変異型の開発において比較したサイトフェクチン能力を評価する場合の参照化合物になっている。ＤＯＴＭＡ脂質は、分子のプロピル骨格にエーテル結合される一対のＣ18炭化水素と共に、分子の陽イオン性部位を提供する第四級窒素を有するプロパナミニウム基を特徴とする。第四級窒素は、比較的短いアルキル鎖、例えばメチル基により三置換化される。構造的に類似の陽イオン性脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、エーテル結合したアルキル基よりむしろアシル基を包含し、標的細胞により容易に代謝されると考えられる。
陽イオン性脂質のいくつかの種、例えばアルキルまたはアシル基により直接置換されたアンモニウム塩は、主に経済的理由から開発された（米国特許第５，２７９，８３３号（Rose））。他のものは、低毒性効果を提供するために開発された。例えば、ホスファチジルコリンおよびスフィンゴミエリンから調製された高生物適合性サイトフェクチン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスフォコリン（Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, AL, Cat. Nos. 890700-706）がある。
Felgnerらに対する米国特許第５，２６４，６１８号は、ホスホリパーゼＡのローゼンタール阻害剤（ＲＩ）（Rosenthal et al., J. Biol. Chem. 235:2202-2206（1960））およびそのジアシルまたはアルキル／アシル種と構造的に類似したサイトフェクチンを開示する。ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンは、第四級窒素と結合した次式、
の置換基を有することを特徴とする。
ＲＩベースの一連の化合物は、以下のパターンを有する頭字語により公知であり、ＤＯＲＩＥ（Ｃ18）、ＤＰＲＩＥ（Ｃ16）およびＤＭＲＩＥ（Ｃ14）がある。これらの頭字語は共通の基本的化学構造を意味する。例えば、ＤＭＲＩＥ（dimyristoyl Rosenthal inhibitor ether）は１−プロパナミニウム，Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−，ブロミド，（＋）−（ＣＡＳ登録：１４６６５９）を意味し、他のものは、それらの置換アルキル基が異なる。第四級アンモニウム基を極性ヒドロキシエチルで置換した基を有するこれらのサイトフェクチンは、多くの場合にＤＯＴＭＡ型化合物より有効なトランスフェクションを提供する。ＲＩサイトフェクチンのトランスフェクション効能に及ぼすヒドロキシアルキル部分の置換基およびアルキル鎖長の変動の効果についての研究は、Felgnerら（J. Biol. Chem.269:2550-2561, 1994）によって示されている。さらにその研究は、最適のヒドロキシルアルキル鎖長が細胞型依存性であることを示した。
ＤＭＲＩＥのβＡＥ−ＤＭＲＩＥへの転換（Wheeler et al., 1280 Biochem. Biophys. Acta:1-11（1996））は、サイトフェクチン活性に有意的な効果を及ぼすことが判明した。第一アルコールに隣接する第四級窒素を有し、したがってｐＨ非依存性の正電荷を有するＤＭＲＩＥは、現在公知の最も高活性のサイトフェクチンの１つである。しかしながら、βＡＥ−ＤＭＲＩＥを生じるようＤＭＲＩＥ上のアルコールを第一アミン基に置換すると、ＤＭＲＩＥの場合とは構造的に全く別のＤＮＡ複合体を生成することが判明し、βＡＥ−ＤＭＲＩＥはヘルパー共脂質の非存在下で有効に多数の細胞系をトランスフェクトし得る。サイトフェクチン骨格内での一つの置換がトランスフェクション特性を顕著に変化し得るという観察結果は、他の修飾が遺伝子の輸送におけるほぼ同様の改良をもたらし得ることを示唆する。
トランスフェクション関連の継続した研究により、陽イオン性脂質が機能性分子の細胞の細胞質中への進入を促すだけでなく、さらに有益な能力、例えばリソソーム分解からの機能性分子の保護、核分画中への進入促進、または細胞質酵素によるＲＮＡ転写生成物の分解防止をさえ提供し得ることが示されている。陽イオン性分子のこれらの機能は、特定の構造的特徴に関連すると考えられる。したがって、特定の形の細胞中への外部分子のトランスフェクションに特に適したサイトフェクチンが必要である。さらに、特定の細胞内機能を行うことのできるサイトフェクチンを開発する必要がある。
ＷＯ ９５／１４６５１は、親油性炭化水素鎖が短い炭化水素リンカーを介して各々の窒素と結合したエーテルまたはエステルであるピペラジンベースのサイトフェクチンを開示する。さらに、窒素が正に荷電されるように、少なくとも１つの窒素が低級アルキル基とさらに結合する。しかしながら、ＷＯ９５／１４６５１に開示されたサイトフェクチンに結合した低級アルキル基は、付加的な生物活性基をサイトフェクチンに結合させず、それにより、サイトフェクチンに共有結合でつながっていない活性基に輸送され得る生物活性基を制限する。したがって、共有結合でつながった生物活性基を輸送し得るサイトフェクチンが必要とされる。さらに、トランスフェクション効率の改良を示すピペラジンベースのサイトフェクチンが必要とされる。
発明の概要
本発明は、以下の構造を有するピペラジンベースのサイトフェクチンに関する。
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ4は独立で、Ｈ、直鎖のＣ1〜Ｃ23基または分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基がアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されいないか又は置換されており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか、または環状基もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基が０〜５個のヘテロ原子を含有し、
Ｒ3は、存在しないか、またはＨ、上記で定義したＲ1、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤もしくはは以下の構造を有する基であり、
（式中、Ｒ7〜Ｒ12は独立で、存在しないか、Ｈ、アミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤、直鎖のＣ1〜Ｃ23基または分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基であり、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基はアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されいないか又は置換されており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するかまたは環状基もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基は０〜５個のヘテロ原子を含有し、
Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ1であり、
ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり、
ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである）
Ｙ1およびＹ2は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、
Ｘ1は、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、
ｍおよびｐは独立で１〜６であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであって、
Ｒ2−Ｘ1−Ｒ3は少なくとも１つのヘテロ原子を含有する］
前記の構造のサイトフェクチンの好ましい一実施態様では、ｍおよびｐは２である。この実施態様のさらに非常に好ましい態様は、Ｙ1およびＹ2は０である。非常に好ましい実施態様では、Ｒ1およびＲ4は、Ｃ10Ｈ21、Ｃ12Ｈ25およびＣ14Ｈ29から成る群から選択される。さらに好ましい実施態様では、Ｒ2は存在しないか、またはＣＨ2、（ＣＨ2）2、（ＣＨ2）3、（ＣＨ2）4、（ＣＨ2）5、（ＣＨ2）6およびＣＯ−ＣＨ−ＮＨ2から成る群から選択される。好ましくは、Ｘ1は存在しないか、ＮＨおよびＯから成る群から選択される。
前記の実施態様のさらに好ましい態様では、Ｘ1はＮＨであり、Ｒ3はＨ、ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ3およびＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ2から成る群から選択される。前記の実施態様の別の好ましい態様では、Ｘ1はＯであり、Ｒ3はＨである。
前記の実施態様のさらに好ましい態様では、Ｘ1は存在せず、Ｒ3はＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2である。その他の好ましい化合物は、Ｒ2が（ＣＨ2）2であり、Ｘ1はＯであり、Ｒ3はＨである。
前記の実施態様の別の好ましい態様では、Ｒ2は（ＣＨ2）3であり、Ｘ1はＮＨであり、Ｒ3はＨである。さらに好ましい化合物は、Ｒ2が（ＣＨ2）4であり、Ｘ1はＮＨであり、Ｒ3はＨである。別の好ましい化合物では、Ｒ2は（ＣＨ2）5であり、Ｘ1はＮＨであり、Ｒ3はＨである。好ましい化合物のさらに別の群では、Ｒ2は（ＣＨ2）6であり、Ｘ1はＮＨであり、Ｒ3はＨである。好ましい化合物のさらに別の群は、Ｒ2が（ＣＨ2）3であり、Ｘ1はＮＨであり、Ｒ3はＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ2であるものである。
さらに別の好ましい化合物では、Ｒ2は（ＣＨ2）3であり、Ｘ1はＮＨであり、Ｒ3はＣＯ−ＮＨ−ＣＨ3である。好ましい化合物の別の群では、Ｒ2はＣＯ−ＣＨ（ＮＨ2）であり、Ｘ1は存在せず、Ｒ3はＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2である。
本発明はさらに、以下の構造を有するピペラジンベースのサイトフェクチンに関する。
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4およびＲ5は独立で、Ｈ、直鎖のＣ1〜Ｃ23基または分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基がアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されいないか又は置換されており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか、または環状基もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基が０〜５個のヘテロ原子を含有し、
Ｒ3およびＲ6は各々独立で、存在しないか、またはＨ、上記で定義したＲ1、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤もしくは以下の構造を有する基であり、
（式中、Ｒ7〜Ｒ12は独立で、存在しないか、Ｈ、アミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤、直鎖のＣ1〜Ｃ23基または分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基であり、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基はアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されいないか又は置換されており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するかまたはは環状基もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基は０〜５個のヘテロ原子を含有し、
Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ1であり、
ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり
ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである）
Ｙ1およびＹ2は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、
Ｘ1およびＸ2は独立で、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、
ｍおよびｐは独立で１〜６であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであって、
Ｒ2−Ｘ1−Ｒ3およびＲ5−Ｘ2−Ｒ6は少なくとも１つのヘテロ原子を含有する］
前記の好ましい実施態様では、ｍおよびｐは２である。好ましくは、この好ましい態様では、Ｙ1およびＹ2は０である。さらに好ましい化合物は、Ｒ5およびＲ2は、存在しないか、ＣＨ2、（ＣＨ2）2、（ＣＨ2）3、（ＣＨ2）4、（ＣＨ2）5および（ＣＨ2）6から成る群から選択される。さらに好ましくは、Ｒ1およびＲ4は、Ｃ10Ｈ21、Ｃ12Ｈ25およびＣ14Ｈ29から成る群から選択される。非常に好ましい化合物では、Ｘ1およびＸ2は存在しないか、ＮＨおよびＯから成る群から選択される。
好ましい化合物の一群では、Ｒ1およびＲ4は、Ｃ12Ｈ25であり、Ｒ2はＣＨ3であり、Ｘ1およびＲ3は存在せず、Ｒ5はＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2であり、Ｘ2はＮＨであり、そしてＲ6はＨである。
本発明の別の態様は、細胞中へ分子を輸送する方法であって、
（ａ）有効量の上記の式を有するあらゆる陽イオン性脂質とこの分子とを接触させて、脂質との複合体を形成させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）で形成された脂質複合体と細胞とを接触させて、それにより生物学的有効量の分子を細胞中に挿入する工程と、
を含む輸送方法に関する。
前記の方法の好ましい態様では、この分子は陰イオン分子である。
前記の方法の別の態様では、複合体はさらに、上記の一般式で示される構造を有する陽イオン性脂質の他に、１つまたはそれ以上の脂質を含む。好ましくは、脂質は、上記の一般式で示される構造を有する陽イオン性脂質の他に、中性脂質、リン脂質およびコレステロールから成る群から選択される。
本方法の一態様では、細胞はインビトロ条件下で接触させられる。本発明の別の態様では、細胞はインビボ条件下で接触させられる。好ましくは、細胞は、ネズミ肺トランスフェクション、ネズミ腹腔内腫瘍、ネズミ筋肉内、ブタ動脈内、ウサギ動脈内、ランス（Renca）腫瘍または皮下腫瘍検定から成る群から選択される検定にかけられる。
本方法の好ましい実施態様では、陰イオン分子はｍＲＮＡである。本方法の別の好ましい実施態様では、陰イオン分子はＤＮＡである。
本発明の別の態様は、細胞中に分子を輸送するのに用いるための次式の化合物である。
［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ4は独立で、Ｈ、直鎖のＣ1〜Ｃ23基または分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基がアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されいないか又は置換されており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか、または環状基もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基が０〜５個のヘテロ原子を含有し、
Ｒ3は、存在しないか、またはＨ、上記で定義したＲ1、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤もしくは以下の構造を有する基であり、
（式中、Ｒ7〜Ｒ12は独立で、存在しないか、Ｈ、アミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤、直鎖のＣ1〜Ｃ23基または分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基であり、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基はアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されいないか又は置換されており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するかまたは環状基もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基は０〜５個のヘテロ原子を含有し、
Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ1であり、
ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり、
ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである）
Ｙ1およびＹ2は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、
Ｘ1は、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、
ｍおよびｐは独立で１〜６であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであって、
Ｒ2−Ｘ1−Ｒ3は少なくとも１つのヘテロ原子を含有する］
本発明のさらに別の態様は、細胞中に分子を輸送するのに用いるための次式の化合物である。
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4およびＲ5は独立で、Ｈ、直鎖のＣ1〜Ｃ23基または分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基がアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されいないか又は置換されており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するか、または環状基もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基が０〜５個のヘテロ原子を含有し、
Ｒ3およびＲ6は各々独立で、存在しないか、またはＨ、上記で定義したＲ1、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤もしくは以下の構造を有する基であり、
（式中、Ｒ7〜Ｒ12は独立で、存在しないか、Ｈ、アミノ酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤、直鎖のＣ1〜Ｃ23基または分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基であり、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基はアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基であり、前記のアルキル、アシル、アルケンまたはヘテロアルキル基は、置換されいないか又は置換されており、０〜６個の不飽和部分を有し、０〜５個のヘテロ原子を含有するかまたは環状基もしくはアリール基を含有し、前記の環状基もしくはアリール基は０〜５個のヘテロ原子を含有し、
Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ1であり、
ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり、
ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである）
Ｙ1およびＹ2は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、
Ｘ1およびＸ2は独立で、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、
ｍおよびｐは独立で１〜６であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであって、
Ｒ2−Ｘ1−Ｒ3およびＲ5−Ｘ2−Ｒ6は少なくとも１つのヘテロ原子を含有する］
【図面の簡単な説明】
図１は、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰの合成を示す。
図２は、Ｍｅ、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰの合成を示す。
図３Ａ〜３Ｄは、ＣＯＳ７およびＣ２Ｃ１２細胞の両方におけるＤＭＲＩＥおよびＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰのトランスフェクション効率を比較する。
図４は、肺内および腹腔内トランスフェクション検定における数種のピペラジンベースのサイトフェクチンのトランスフェクション効率の分析を示す。
図５は、肺内トランスフェクション検定における第一アミンを有する数種のピペラジンベースのサイトフェクチンのトランスフェクション効率の分析である。
図６は、肺内トランスフェクション検定におけるトランスフェクション効率に及ぼすヘテロ原子部分および親油性部分のアルキル鎖長の変動の影響を示す。
図７は、腹腔内および皮下腫瘍検定におけるＤＮＡ単独の場合と比較して測定されたＧＡＰ−ＤＬＲＩＥおよびＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰのトランスフェクション効率の分析である。
好ましい態様の詳細な説明
第四級窒素化合物は、それらの特異的構造に起因する有益な特徴を有する有効なサイトフェクチンである、ということが知られている。本発明は、環上の窒素の少なくとも１つが四級化されたピペラジンベースのサイトフェクチンに関する。親油性部分の他に、本発明のサイトフェクチンは少なくとも１つの環上の窒素と結合した少なくとも一つのヘテロ原子を含む炭化水素鎖を有する。
炭化水素鎖でのヘテロ原子の包含によって、いくつかの利点が提供される。例えば、本発明の化合物はより特異的に細胞膜に相互作用し、より高いレベルのトランスフェクションを達成する能力を有するトランスフェクション剤を形成するよう誘導することができる。本発明の化合物は細胞表面上の標的キーレセプター及び酵素に結合することができ、それ故分子認識における重要な要因の探求、開発における使用に適している。
本発明の陽イオン性脂質はさらに、特定の生物学的目的を達成するために細胞内で輸送される物質と結合し得る。官能基、例えばカルバミル、カルボキシル、ウレイル、チオール、エステル、エーテル、チオウレイル、ホスホリルまたはグアニジル基は、細胞標的部分または治療的分子をサイトフェクチンに結合させるために用いられる。種々の種類の標的部分および治療的部分を以下で考察する。
付加的にまたは代替的に、官能基はサイトフェクチンの極性電荷密度を増大させ、したがってトランスフェクション効率を増強させ得る基を結合させるためのリンカーとして使用できる。
サイトフェクチンの生物活性末端基
（ａ）標的種
本発明のサイトフェクチンは、末端基として生物学的細胞標的活性を有する分子種を含み得る。この種に含まれるサイトフェクチンは、細胞受容体特異性分子を含有する。典型的には、受容体特異性ペプチドまたはアミノ酸はアミドとして結合される。本発明のサイトフェクチンに連結され得る好ましいペプチドの例としては、走化性ペプチド、メチオニン−ロイシン−フェニルアラニン（Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）、およびｐＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓが挙げられる。本発明のサイトフェクチンと結合され得る細胞表面受容体のためのその他の配位子は、ペプチド擬似類似体、多数のウイルス付着およびインターナリゼーションペプチド、ラクトースならびにその他の二および多糖類、アセチルコリン類似体、ならびに葉酸誘導体を包含する。
（ｂ）治療剤
本発明のサイトフェクチンは、末端基として生物活性分子種を含み得る。本発明の化合物と結合し得る好ましい生物活性種の例は、チロトロピン放出ホルモン
ｐグルタミン酸−ヒスチジン−プロリンである。
（ｃ）細胞および細胞内標的
本発明のサイトフェクチンは、細胞膜または細胞内標的と特異的に結合して所望の生理学的反応に影響を与えることのできる配位子を保有する末端基を含む。適切な配位子は、ウイルスエピトープ、ホルモン、酵素、基質、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、炭水化物、補因子、薬剤、レクチン、オリゴヌクレオチドおよび核酸であるペプチドを包含し得る。この基の中の好ましい種は、クロロキンおよびその他のリソソーム親和性剤、核局在性ペプチド、コルチコステロイドおよびウイルスペプチドまたはタンパク質を包含するサイトフェクチンである。
（ｄ）トランスフェクション効率に影響を及ぼす群
本発明のサイトフェクチンは、それらのトランスフェクション効率に影響を及ぼす群と結合し得る。このような群は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖または多糖類である。これらの構成単位をサイトフェクチンに付加するための伝統的および非伝統的結合法がともに考えられる。さらに、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、生体中には一般に見出されない異常なまたは修飾されたアミノ酸を含み得る。このような異常な又は修飾されたアミノ酸は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に列挙された異常な又は修飾されたアミノ酸に限られない。さらに、このようなアミノ酸は天然には見つからない合成アミノ酸である。本特許におけるサイトフェクチンに対する請求の範囲は、あらゆる部分がヘテロ原子炭化水素鎖を介してピペラジン骨格に結合した化合物を包含する。したがって、請求の範囲は、サイトフェクチンを別の部分と組合せるかまたは連結することによっても回避にされない。
さらに、ヘテロ原子基は単独で、トランスフェクション効率に有益に作用し得る。ＢＡＥ−ＤＭＲＩＥに関して前記したように、ヘテロ原子基の個性は、トランスフェクション効率に有意の影響を及ぼす。
（ｅ）薬剤
本発明の化合物は、インビトロおよびインビボで哺乳類細胞をトランスフェクションするための薬剤中に用い得る。トランスフェクション用の薬剤は当業者には公知であって、それらの製造方法と一緒に、例えば米国特許第５，２６４，６１８号（Felgner）、米国特許第５，３３４，７６１号（Gebeyehuら）、およびFelgner et al.（J.Biol. Chem. 269:2550-2561, 1994）に開示されている。これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる。本発明の陽イオン性脂質は、リン脂質等の両親媒性脂質、ならびにコレステロール等の中性脂質と組合されて脂質小胞を形成するが、これはリポソーム、単層板小胞、ミセルまたは簡単な薄膜である。
（ｆ）遺伝子治療、ワクチンおよびトランスフェクションのための請求の範囲の化合物の使用
陽イオン性リポソームは、血管、循環器系、肺上皮細胞、脳組織およびカエル胚（Xenopus）の細胞中へのポリヌクレオチド、高分子および小分子の進入を促すのに有用であることが公知である。本発明の陽イオン性脂質は、遺伝子治療を促進するのに特に有用である。生きている生体、例えば鳥類、哺乳類、魚類および両生類を含めた脊椎動物等へのｍＲＮＡまたはＤＮＡの導入を促進するための開示された陽イオン性脂質の使用が特に考えられる。とりわけヒト及び家畜への導入が考えられる。この目的ならびにトランスフェクションプロトコールのための陽イオン性脂質の使用は、Nabelら（Human Gene Therapy 3:399-410,1992）、米国特許第５，４５９，１２７（Felgner）及びWheelerら、1280 Biochem. Biophys. Acta:1-11（1996）に報告されている。
本発明のサイトフェクチンにより導入されるポリヌクレオチドは、好ましくは免疫原性または治療用ペプチドまたはポリペプチドをコードする。したがって、本方法は、ポリヌクレオチドワクチン接種ならびに遺伝子治療のために用い得る。本発明の陽イオン性脂質を用いてＤＮＡを宿主生物中に導入する場合、ＤＮＡはコード領域の他に、ＣＭＶ、ＲＳＶまたはＳＶ４０プロモーター等の適切なプロモーター、リボソーム結合部位およびポリアデニル化部位のような配列を含有し得る。
本発明のサイトフェクチンはインビトロで細胞にトランスフェクションを行うのに有用である、ということも注目される。本発明の範囲内の種々の化合物がインビボで多少組織特異性であるが、しかしほとんどまたはすべてがインビトロでの培養細胞のトランスフェクションに有用である。本発明のあらゆる特定の候補サイトフェクチンに関しては、インビトロおよびインビボでの種々の組織内におけるその相対的トランスフェクション効能は、例えば実施例２〜１１に開示されたようなスクリーニング検定またはその他の標準的なトランスフェクション検定を用いて容易に確かめ得る。この情報により、当業者は業界認知の薬剤および用量を用いて容易に本発明を実行し得る。
（ｈ）代表的ピペラジンベースのサイトフェクチンおよびその命名法
下記の表１は、以下の実施例に用いられる代表的ピペラジンベースのサイトフェクチンをその頭字語とともに列挙する。表１に列挙した一つの四級基を有する化合物は、ｍおよびｐがともに２であり、Ｙ1およびＹ2がともに０である下記の構造を有する。
表１に列挙した二つの四級基を有する化合物は、ｍおよびｐがともに２であり、Ｙ1およびＹ2がともに０である下記の構造を有する。
表１に示された命名法のシステムは、本出願を通して一貫して用いられる。ＢＰという呼称は、ビス−ピペラジン（bis-piperazine）骨格を示す。頭字語ＭＯＥ、ＬＯＥおよびＤＯＥはそれぞれ、親油性部分、ミリスチルオキシエチル（Ｃ14Ｈ29Ｏ（ＣＨ2）2）、ラウリルオキシエチル（Ｃ12Ｈ25Ｏ（ＣＨ2）2）およびデシルオキシエチルを示す。その他の頭字語は、少なくとも１つのヘテロ原子を有する炭化水素鎖に関する。その例を下記に示す。
ＨＥ＝ヒドロキシエチル； ＧＡ＝ガンマアミノ； ＤＡ＝デルタアミノ； ＦＡ＝ファンフアミノ（ｆｕｎｆ ａｍｉｎｏ）； ＨＡ＝ヘキシルアミノ； Ｍｅ＝メチル； Ｇｌｙ−Ｇ＝グリシンアミド； ＤＡＢ＝２，４−ジアミノ酪酸アミド； ＤｉＭｅ＝ジメチル；ＧＭＵ＝ガンマメチルウレア
表１に列挙した化合物は本発明の化合物の代表的なものであって、本発明は表１の化合物に限定されない、と当業者は理解するだろう。さらに、一つの四級基を有する化合物に関して表１に列挙した置換基の種々の組合せを有する２つの四級基を有するピペラジンサイトフェクチンが本発明により特に意図される、と当業者は理解するだろう。
下記の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、開示された方法は本発明の範囲に網羅されるすべての陽イオン性脂質の調製に適用可能であるが、その例に限定されない。実施例に示した温度はすべて摂氏であり、修正はなされない。
実施例１
ビス−ピペラジンサイトフェクチンの合成
下記の化学反応は、本発明の陽イオン性脂質の調製への一般的適用に関して開示される。時折、反応は、前記のように、開示された範囲内の各分子種に適用可能である訳ではない。これが生じる化合物は、当業者には容易に認識される。このような場合はすべて、反応は当業者に公知の慣用的修正により、即ち代替的慣用試薬に代えることにより首尾よく実行され得るか、または反応条件のルーチンの修正により首尾よく実行される。あるいは、本明細書中にＤＯＴＭＡ化合物（Felgner et al., J. Biol. Chem. 84:7413-7417, 1987）のようなその他の種類のサイトフェクチンの合成に関して本明細書中に引用された参考文献に、または慣用的化学文献に開示されたその他の反応は、本発明の化合物の調製に適用可能である。すべての製造方法において、出発物質はすべて、公知であるかまたは公知の出発物質から容易に調製可能である。
Ａ．代表的な一つの四級基を有する化合物（ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰ）の合成
一つの四級基を有するピペラジンベースのサイトフェクチンの代表的合成例として、以下の例を示す。ピペラジン骨格に結合したラウリル以外の基を有するピペラジンベースのサイトフェクチンの合成は、単に、所望のアルキルメタンスルホネート、例えばミリスチルメタンスルホネートまたはデシルメタンスルホネートを下記の合成のドデシルメタンスルホネートの代わりに置換することにより容易に成し遂げ得ると、当業者は理解するだろう。同様に、親油性鎖がアミン結合を介してピペラジン骨格に連接されるピペラジンベースのサイトフェクチンを合成することが望ましいものは、下記の合成において単にビス−アミノエチルピペラジンをビス−ヒドロキシエチルピペラジンの代わりに置き換え得る。
Ｎ，Ｎ‘−ビス−（２−ドデシルオキシエチル）−ピペラジン［ＬＯＥ−ＢＰ］：
マグネティックスターラーを備えた乾燥フラスコをアルゴン雰囲気にした後、水素化ナトリウム（油中に６０％、１．４７ｇ、３７ｍｍｏｌ）を投入した。ドライヘキサン（４×１５ｍｌ）を用いて粉砕後、無水テトラヒドロフラン（１２０ｍｌ）を加え、攪拌を開始して、薄いスラリーを得た。ビス−ヒドロキシエチル−ピペラジン（２．７９ｇ、１６ｍｍｏｌ）を固体として一度に加え、その後反応物を還流させて、一夜その温度を維持した。再還流スラリーに、無水テトラヒドロフラン（２５ｍｌ）に溶解したドデシルメタンスルホネート（１０．２ｇ，３８ｍｍｏｌ）の溶液を加え、反応物をさらに３日間還流し続けた。反応物を冷却し、スラリーをセライトの１ｃｍプラグを通して真空濾過し、反応容器および濾過装置をテトラヒドロフラン（１００ｍｌ）で洗浄した。濾液を合わせた後、蒸発させて、残渣をエチルエーテル（２３０ｍｌ）および０．２Ｎ水酸化ナトリウム（５０ｍｌ）に分配した。相を分離し、有機層を水（５０ｍｌ）で２回洗浄した後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶液を濾紙で濾過し、濾液を蒸発させて、粗製物質を得た。１：９のエーテル：ヘキサンから純粋なエーテルまで段階勾配溶離させてシリカゲル上でカラムクロマトグラフィー処理して、ＴＬＣ均質物質（３．６ｇ、４４％）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ｍＨｚ、ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ）：δ＝３．５４（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，４Ｈ）、３．４１（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），２．２６−２．５５（重複ｍ，１２Ｈ），１．５５（ｍ，４Ｈ），１．２６（ｓ，３６Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ）．ＩＲ（ＫＢｒペレット）：ＣＭ-1 ２９００，２８４０，１４６０，１２９５，１３２０，１１１５，７１５．
（±）−Ｎ−（３−フタルイミド）プロピル−Ｎ，Ｎ‘−（ビス−２−ドデシルオキシエチル）−ピペラジニウムブロミド［γ−Ｐｈｔｈ−ＬＯＥ−ＢＰ］
アルゴン雰囲気を維持しながら、指定された順序で、乾燥フラスコ中で、ＬＯＥ−ＢＰ（２．１６ｇ、４．２ｍｍｏｌ）、無水ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）およびＮ−（３−ブロモプロピル）フタルイミド（１．４２ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を混合した。フラスコにぴったり栓をした後、１０５℃に予め平衡化した油浴中つけ、マグネティックスターラーで攪拌を開始した。溶液は、２分以内に均一になった。指示された温度で３日間攪拌後、反応物を冷却し、溶媒を減圧濃縮により除去した。シリカゲル（９０：１０：０．２５：０．２５−クロロホルム：メタノール：水酸化アンモニウム：水、イソクラティク溶離）上で残渣をクロマトグラフィー処理して、ＴＬＣ均一物質（１．７０ｇ、５２％）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ｍＨｚ、ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ）：δ７．８６（ｍ，２Ｈ），７．７５（ｍ，２Ｈ），４．１６（ｍ，２Ｈ），３．９５（ｍ，２Ｈ），３．８７−３．８２（重複ｍ，４Ｈ），３．７２（ｍ，２Ｈ），３．５４−３．４５（重複ｍ，４Ｈ），３．３９（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），２．９７（ｍ，２Ｈ），２．９０（ｍ，２Ｈ），２．７０（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ），２．３１（ｍ，２Ｈ），１．５４−１．４５（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｓ，３６Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ）．ＩＲ（溶融、ＮａＣｌ上のフィルム）：ｃｍ-1 ２９００，２８５０，１７７０，１７００，１４６０，１３９０，１３６５，１１１０，７１５．
（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ‘−ビス−（ドデシルオキシエチル）−ピペラジニウムブロミド［「ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰ」］：
無水エタノール（３３ｍｌ）に溶解したγ−ＰＨｔｈ−ＬＯＥ−ＢＰ（１．７７ｇ、２．２７ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で攪拌して調製した。透明な混合物に、無水ヒドラジン（１．６ｍｌ、５１ｍｍｏｌ）を一定流で加えた。次にフラスコをアルゴンで置換して、ぴっちり栓をして、室温で一夜攪拌した。この期間の後、濃スラリーをクロロホルム（６５ｍｌ）で希釈して、約３０分間攪拌し、次に中間ガラスフリットを通して真空濾過した。反応容器および濾過装置をさらにべつの６５ｍｌのクロロホルムを２回に分けて用いて洗浄した。あわせた濾液を４０℃未満の温度で減圧濃縮させて、小容積にした。次に残渣をクロロホルム（３５０ｍｌ）および０．１Ｎ水酸化ナトリウム（１５０ｍｌ）に分配した。水相をクロロホルム（１５０ｍｌ、その後１２５ｍｌ）でさらに２回洗浄し、あわせた有機相を無水硫酸ナトリウムで一夜乾燥した。次に透明溶液を濾紙で濾過し、蒸発させた。残渣を高真空下で一夜処理した後、クロロホルム（１０ｍｌ）に溶解して、０．２μＰＴＦＥ濾紙を通して濾過した。濾液を蒸発させて、次に残渣を高真空下で一夜処理して、ＴＬＣ均質生成物１．３７ｇ（９３％）を得た（アミン被覆シリカゲル、８５：１５：０．２５：０．２５−クロロホルム：メタノール：水酸化アンモニウム：水、Ｒf＝０．５１）。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ｍＨｚ、ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ）：δ４．０１（ｍ，２Ｈ），３．９３−３．７４（重複ｍ，６Ｈ），３．６２−３．５０（重複ｍ，４Ｈ），３．４６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．４０（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．９４（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，４Ｈ），２．８８（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），２．７１（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），２．０（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｍ，４Ｈ），１．２６（ｓ，３６Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ）．ＩＲ（ＮａＣｌ上で融解）：ｃｍ-1 ３４００（ｂｒ），３３００（ｓ），１５２０，１３６０，１１１０，７１５．
ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰに関する合成概略図を図１に示す。
Ｂ．代表的な二つの四級基を有する化合物（Ｍｅ，ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰ）の合成
Ｎ，Ｎ‘−ビス−（２−ドデシルオキシエチル）−ピペラジン［ＬＯＥ−ＢＰ］および（±）−Ｎ−（３−フタルイミド）プロピル−Ｎ，Ｎ‘−（ビス−２−ドデシルオキシエチル）−ピペラジニウムブロミド［γ−Ｐｈｔｈ−ＬＯＥ−ＢＰ］を、前記と同様に合成した。
（＋）−Ｎ−メチル−Ｎ‘（３−フタルイミド）プロピル−Ｎ，Ｎ‘−（ビス−２−ドデシルオキシエチル）−ピペラジニウムブロミド［Ｍｅ，γ−Ｐｈｔｈ−ＬＯＥ−ＢＰ］
乾燥フラスコ中で、γ−Ｐｈｔｈ−ＬＯＥ−ＢＰ（０．４４ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、ジメチルホルムアミド（１．３ｍｌ）およびヨウ化メチル（０．１５ｍｌ、０．３４２ｇ、３ｍｍｏｌ）を加えた。フラスコにぴったり栓をした後、１０５℃に予め平衡した油浴中につけ、マグネティックスターラーで攪拌を開始した。指示された温度で３日間攪拌後、反応物を冷却し、溶媒を減圧濃縮により除去した。シリカゲル（９０：１０：０．２５：０．２５から８５：１５：０．２５：０．２５−クロロホルム：メタノール：水酸化アンモニウム：水、段階勾配）上で残渣をクロマトグラフィー処理して、ＴＬＣ均一物質（０．３３６ｇ、６７％）を得た（シリカゲル、８０：２０：０．２５：０．２５−クロロホルム：メタノール：水酸化アンモニウム：水、Ｒ1＝０．２８）。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ｍＨｚ、ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ）：δ７．８４（ｍ，２Ｈ），７．７３（ｍ，２Ｈ），４．７−４．３（重複ｍ，１４Ｈ），３．９（重複ｍ，９Ｈ），３．５−３．４（重複ｍ，４Ｈ），２．３４（ｍ，２Ｈ），１．５４−１．４５（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｓ，３６Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，６Ｈ）．ＩＲ（ＫＢｒ）：ｃｍ-1 ２９２０，２８５０，１７７０，１７１０，１４６０，１３９０，１３６０，１１２０，７１５．
（＋）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ‘−メチル−Ｎ，Ｎ‘−（ビス−２−ドデシルオキシエチル）−ピペラジニウムブロミド［「ＧＡ，Ｍｅ−ＬＯＥ−ＢＰ」］：
無水エタノール（１０ｍｌ）およびクロロホルム（５ｍｌ）に溶解したＭｅ，γ−Ｐｈｔｈ−ＬＯＥ−ＢＰ（０．３２ｇ、０．４９ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で攪拌して調製した。透明な混合物に、無水ヒドラジン（０．３ｍｌ、９．６ｍｍｏｌ）を一定流で加えた。次にフラスコをアルゴンで置換して、ぴっちり栓をして、室温で一夜攪拌した。この期間の後、濃スラリーをクロロホルム（３０ｍｌ）で希釈して、約３０分間攪拌し、次に中間ガラスフリットを通して真空濾過した。反応容器および濾過装置をさらにべつの６０ｍｌのクロロホルムを２回に分けて用いて洗浄した。あわせた濾液を４０℃未満の温度で減圧濃縮させて、小容積にした。クロロホルム（１００ｍｌ）を加えた後、真空除去して、残渣は４日間高真空下に置いた。その後、白色固体を９：１−クロロホルム：エタノール（２０ｍｌ）に溶解し、０．２μＰＴＦＥ濾紙を通して濾過した。濾液を蒸発させて、次に残渣を高真空下で一夜処理して、もろい白色固体を得た。この残渣をクロロホルム：メタノール（１１０ｍｌ、８：３比）中に溶解し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム（３０ｍｌ）で洗浄した。水相をクロロホルム（１５ｍｌ）で洗浄し、あわせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次に透明な溶液を濾紙を通して濾過し、蒸発させた。残渣を高真空下で一夜処理し、次に純粋なクロロホルム（１０ｍｌ）中に溶解し、０．２μＰＴＦＥ濾紙を通して濾過した。濾液を蒸発させて、次に残渣を高真空下で一夜処理して、生成物（０．２３ｇ、５９％）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ｍＨｚ、ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ）：δ４．７−４．３（重複ｍ，１４Ｈ），３．９（重複ｍ，５Ｈ），３．６−３．３（重複ｍ，６Ｈ），２．７−２．４（重複ｍ，６Ｈ），１．５４−１．４５（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｓ，３６Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，６Ｈ）．ＩＲ（ＮａＣｌ上で融解）：ｃｍ-1 ３４００（ｂｒ），２９１０，２８４０，１６３０，１４５５，１３６５，１１１０，７１５．
図２は、代表的な二つの四級基を有するピペラジンベースのサイトフェクチンＭｅ，ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰの合成に関する反応概略図を示す。
前記の方法は、種々の二つの四級基を有するピペラジンベースのサイトフェクチンを調製するために用いうる、と当業者は理解するだろう。四級窒素の各々に結合した非親油性部分は、同一であっても異なってもよい。本発明の二つの四級基を有するサイトフェクチンの一実施態様では、四級窒素に結合した非親油性部分はいずれも、ヘテロ原子である。代替的実施態様では、唯一の非親油性部分はヘテロ原子である。
もちろん、１つ以上の反応性官能基を有する分子の場合には、特定のカップリング反応に関与するよう意図されない１つまたはそれ以上の基をブロックまたはマスクする必要がある、ということに、当業者は気づくだろう。スクリーニングを活用した合成は、特定の適用に最も有効なサイトフェクチンを効率よく選択するために使用できる。
実施例２
インビトロトランスフェクションに及ぼす薬剤の作用：ＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰとＤＭＲＩＥとの比較
サイトフェクチン：クロロホルムに溶解した選択されたサイトフェクチンの溶液を重量対容量（ｗ／ｖ）ベースで調製した。陽イオン性脂質および中性脂質（用いた場合）のアリコートを、１ｍｌの水性媒体を用いた再構成時に所望される相対および絶対脂質濃度を提供するように無菌的に、計算した量で滅菌バイアルに移した。ドライ窒素流で大量のクロロホルムを除去し、バイアルを一夜高真空下で処理して、残留溶媒をすべて除去した。
ＤＮＡ−脂質複合体：プラスミドＤＮＡの５ｍｇ／リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）１ｍｌならびに乾燥した処方済みサイトフェクチン−中性脂質混合物をＯＰＴＩＭＥＭTM（Gibco BRL）中に懸濁し、示されたような所望の質量／モル比で９６ウエルプレート中で一緒に混合した。ＤＮＡ−脂質複合体を混合後２時間以内に細胞に加えた。
トランスフェクション
細胞系：使用した細胞系は、アメリカ型培養細胞コレクション（ＡＴＣＣ，Rockville, MD）から入手したＣＯＳ７サル腎臓細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、およびＣ２Ｃ12マウス筋原細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７７２）を用いた。
細胞はすべて、１：５〜１：１０で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）およびダルベッコ修正イーグル液（ＤＭＥＭ）中で継代した。全細胞は、受領時に１０回ダブリング継代させて広げ、アリコートを凍結保存した。再拡張して、全細胞をトランスフェクション試験に用い、その後さらに１０回継代した。
トランスフェクション検定：０日目に、１０％ＦＥＢＳ／９０％ＤＭＥＭ １００μｌ中２０，０００個の細胞を９６ウエル培養プレート（Nunc）の各ウエル中に植え付け、５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃で一夜培養した。１日目に、細胞が移動しないように注意深く培地を吸引し、血清無含有ＯＰＴＩＭＥＭTM（Gibco BRL）中のＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ／ｐＲＳＶ ｌａｃＺ／ＤＯＰＥ １００μｌを加えた。ＤＭＲＩＥは、参照標準として用いた。ｌａｃＺ遺伝子は比色計で検定される酵素β−ガラクトシダーゼをコードする。陽イオン性脂質：ＤＯＰＥ比は、各ウエルに関して変化した。４時間培養後、３０％ＦＢＳ／７０％ＯＰＴＩＭＥＭTM ５０μｌを各ウエルに加えた。２日目、各ウエルに１０％ＦＥＢＳ／９０％ＯＰＴＩＭＥＭTM １００μｌを加えた。３日目、培地を取り出し、５０μｌの溶解緩衝液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ８．０中の０．１％トリトン−Ｘ1００）を加え、このプレートを７０℃で少なくとも２０時間保存した。解氷後、Felgnerら（J. Biol. Chem. 269:2550-2561, 1994）にしたがって、ウエル培地中でのβ−ガラクトシダーゼ酵素活性量を検定した。
結果（図３Ａ〜３Ｄ）は、ＣＯＳ７細胞中のβ−ｇａｌの総発現およびピーク発現はともに、５０：５０のＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ：ＤＯＰＥ比で最適であり、Ｃ２Ｃ12細胞においては２５：７５のＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ：ＤＯＰＥ比で最適であったことを示す。ＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰは、これらのインビトロ検定では、ＤＭＲＩＥに比較してこの好ましかった。これらの実施例は、本発明のピペラジンベースのサイトフェクチンがインビトロでの細胞膜を通過するＤＮＡの効率のよい輸送と、その後の細胞内での遺伝子の機能性発現を促進することを示す。これらの試験に用いたスクリーニング検定は、トランスフェクション活性を実証するのに、そしてサイトフェクチン／共脂質比を最適化するのに有用である。
実施例３
肺内および腹腔内トランスフェクション検定におけるピペラジンベースのサイトフェクチンの分析
Ａ．肺内トランスフェクション検定
成熟（４〜１６週）雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをメトファンで軽く麻酔し、１００μｌのＵＳＰ生理的食塩水または水中の１３２μｇのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ＤＮＡ±陽イオン性脂質を、小型プラスチックカテーテル付きの使い捨て滅菌プラスチック製インシュリン注射器を用いて鼻腔内投与した。陽イオン性脂質をクロロホルム中の１モル当量のＤＯＰＥと混合し、溶媒を蒸発させた後、残渣を高真空下で処理して、脂質薄膜を得た。この薄膜に水を加え、約１分間攪拌して、陽イオン性リポソームを調製した。水中の適切な容量のプラスミドＤＮＡおよび水中の陽イオン性リポソームを室温で混合し、約３０秒間かき混ぜて、２：１（ｍｏｌ：ｍｏｌ）ヌクレオチド：サイトフェクチン比で複合体を得た。液体および注射器はすべて、室温に平衡させ、１００μｌ容量のＤＮＡを１回投与するのに要する時間は１分未満であった。投与の２または３日後、ナトリウムペントバルビタールを過剰投与してマウスを屠殺し、下記のように肺を抽出した。
肺を直に凍結し、−７８℃で保存した。試験管内にぴったり合った可逆ドリルおよびビットを用いて１．５ｍｌ試験管内の０．４ｍｌ凍結溶解緩衝液上で磨砕することにより、凍結肺を独立で微細粉末に粉砕し、粉末を同一試験管中で、抽出するまで−７８℃で保存した。凍結粉末を解氷し、１００μｌのＲｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号 Ｅ３９７Ａ、Promega）を各々に加えた。標本を１５分間攪拌し、液体窒素と室温水浴を交互に用いて３回凍結−解氷し、１０，０００ｘｇで３分間遠心分離した。上清を別の１．５ｍｌ試験管に移し、さらに５００μｌの溶解緩衝液をペレットに加えた後に、抽出工程を（凍結−解氷せずに）反復した。二番目の上清を最初の上清とあわせて、−７８℃で保存した。
使用した陽イオン性ピペラジンベースの脂質は、ＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ−、ＧＡ−ＭＯＥ−ＢＰ、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰおよびＢＡ−ＬＯＥ−ＢＰであって、ＧＡＰＤＬＲＩＥを比較のために含めた。
Sankaran（Anal. Biochem., 200:180-186, 1992）の放射能分配法により、またはＣＡＴ ＥＬＩＳＡキット（Boehringer Mannheim,Indianapolis, IN）を用いて、ＣＡＴ検定を実施した。要するに、ＣＡＴ組織ホモジネートをエタノール／ドライアイス浴中で３回凍結−解氷して、破裂させた。遠心分離により細胞破屑を取り除き、タンパク質抽出物を14ＣクロラムフェニコールおよびアセチルＣｏＡと一緒にインキュベートした。クロラムフェニコールを酢酸エチルで抽出し、薄層クロマトグラフィーを実施して、抽出細胞タンパク質により転換された14Ｃクロラムフェニコールのパーセンテージを確定した。細胞抽出物を２０分間インキュベートした２μｇのタンパク質に対して標定した。組織抽出物を、４時間インキュベートした２００μｇのタンパク質に対して標定した。
肺抽出物中にスパイクされた精製酵素（Sigma, St. Louis, MO）またはＥＬＩＳＡキットで提供された酵素を用いて、標準曲線を構築した。２つのＣＡＴ検定法は、同一組の抽出物からの標本当たり等価ｐｇのＣＡＴを生じた。
Ｂ．腹腔内トランスフェクション検定
前記の肺内検定で試験したピペラジンベースのサイトフェクチンのトランスフェクション効率を、ネズミ腹腔内モデルで評価した。５００μｌのＲＰＭＩ中の２００，０００個のネズミＢ１６腫瘍細胞を、０日目にＣ５７／Ｂ１６マウスに腹腔内注射した。７〜１４日目に、ＤＮＡ／サイトフェクチン／生理的食塩水溶液をマウスに腹腔内注射した。ＤＮＡ ０．５ｍｇを１．５ｍｌの生理的食塩水中にＤＮＡ：サイトフェクチンのモル比が１０：１となるように種々のサイトフェクチンと混合した。ＤＮＡ注入後２日目に、腫瘍を収集し、抽出して、前記の肺内検定に関する記載と同様に、ＣＡＴ活性に関して検定した。
Ｃ．結果
肺内および腹腔内トランスフェクション検定において、ＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ、ＨＥ−ＬＯＥ−ＢＰ、ＧＡ−ＭＯＥ−ＢＰ、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰおよびＢＡ−ＬＯＥ−ＢＰを用いて得られた結果を、表４に要約する。肺内検定では、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰおよびＢＡ−ＬＯＥ−ＢＰはＧＡＰ−ＤＬＲＩＥよりも大きいトランスフェクション効率を提供した。ＨＥ−ＬＯＥ−ＢＰ、ＧＡ−ＭＯＥ−ＢＰおよびＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰは、肺内検定ではほとんど有効でなかった。
腹腔内検定では、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰは試験したピペラジンベースのサイトフェクチンのうち最大のトランスフェクション効率を提供したが、しかしそのトランスフェクション効率は本検定におけるＧＡＰ−ＤＬＲＩＥにより得られた結果と同じ程に高いわけではなかった。試験した残りのピペラジンベースのサイトフェクチンは、腹腔内検定においてほとんど活性がなかった。
ここに報告した試験は、請求の範囲の化合物がトランスフェクションにおいて活性であることを示すだけでなく、特定の組織のトランスフェクションに対してサイトフェクチンを選択し、最適化する方法を示している。特定の最適構造はこの検定に関して容易に明らかになるが、しかし、これらの結果は組織特異的であると理解される。言い換えれば、この検定で次善的に実施されたサイトフェクチンでも、インビトロトランスフェクション、ネズミ腹腔内腫瘍、ネズミ筋肉内、ブタまたはウサギ動脈内、一般的皮下腫瘍またはランス（Renca）腫瘍検定などの他の検定においても有益な活性を有し得る。
実施例４
第一級アミンを有するピペラジンベースのサイトフェクチンの分析
ＤＭＲＩＥ類サイトフェクチンでは、アルコール基を第一級アミンに置換すると、トランスフェクション効率が増強される（Wheeler et al., 1280 Biochem.Biophys. Acta:1-11（1996））。このために、四級窒素と結合した第一級アミンを有するピペラジンベースのサイトフェクチンのトランスフェクション効率を、肺内検定においてＤＮＡ単独のトランスフェクション効率に対して評価した。肺内検定は、前記の実施例３と同様に実施した。対照として、１３２μｇのＤＮＡ単独で得られたトランスフェクション効率を確定した。
図５は、この比較の結果を示す。各々が第一級アミンを有するＧＡ−ＬＯＥおよびＧｌｙ−Ｇ−ＬＯＥはともに、ＤＮＡ単独より有意に大きいトランスフェクションレベルを提供した。ＧＭＵ−ＬＯＥを用いて得られたトランスフェクション効率は第一級アミンを有するサイトフェクチンと同様程度には高くはなかったが、しかしＤＮＡ単独で得られた結果に比べて上昇した。
実施例５
トランスフェクション効率に及ぼすヘテロ原子部分および親油性部分のアルキル鎖長の変動の影響
異なる種類の細胞におけるトランスフェクション効率は、親油性およびヘテロ原子鎖長の個性により影響される。このために、親油性およびヘテロ原子基の鎖長が異なるピペラジンベースのサイトフェクチンのトランスフェクション効率を、肺内検定で比較した。肺内検定は、前記の実施例３に記載したのと同様に実行した。図６は結果を示す。
第一級アミン基を有するピペラジンベースのサイトフェクチンの中で、最高トランスフェクション効率はＧＡ−ＬＯＥにより得られた。親油性鎖の長さだけがＧＡ−ＬＯＥと異なるＧＡ−ＭＯＥおよびＧＡ−ＤＯＥは低活性を示したが、しかしＧＡ−ＭＯＥはＤＮＡ単独より有効であった。
同様に、第一級アミンの鎖長が増大すると、トランスフェクション効率は低減した。ＧＡ−ＬＯＥはＤＡ−ＬＯＥより大きい活性を示したが、一方ＤＡ−ＬＯＥはＦＡ−ＬＯＥまたはＨＡ−ＬＯＥより有効であった。試験した第一級アミンを有するピペラジンベースのサイトフェクチンはすべて、ＤＮＡ単独より有効であった。
ヘテロ原子部分にアルコール基を有するピペラジンベースのサイトフェクチンの中では、ＨＥ−ＬＯＥが最も有効であった。しかしながら、肺内検定では、第一級アミンを有するサイトフェクチンは、アルコール基を有するものより有効であった。
実施例６
一般的皮下腫瘍トランスフェクション検定
特定の腫瘍型に適合性であるマウス系統の側腹に腫瘍細胞の懸濁液を皮下注入して、腫瘍を調製した。腫瘍を定期的に測定した。それらが注入に適したサイズに達すると、腫瘍を球形と仮定して測定した直径を基礎にして腫瘍容積を近似させた。処置すべき腫瘍の容積と等しい容積の生理的食塩水中の評価されるサイトフェクチンとレポーター遺伝子をコードするプラスミドとの複合体を次に、特定腫瘍型に最適の流速で注入した。適切な時間後、腫瘍を収集し、凍結した後、粉砕した。レポーター遺伝子生成物をその後抽出し、前記と同様に活性を定量した。
実施例７
皮下腫瘍中および腹腔内トランスフェクション検定におけるピペラジンベースのサイトフェクチンの分析
ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥおよびＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰのトランスフェクション効率を、腹腔内および皮下腫瘍検定においてＤＮＡ単独の場合と比較して測定した。腹腔内検定は、実施例３に記載したように実行した。皮下腫瘍検定は、ネズミＢ１６黒色腫細胞を用いて、上記の実施例６と同様に実行した。
結果を図７に示す。皮下腫瘍検定では、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰはＧＡＰ−ＤＬＲＩＥより大きいトランスフェクション効率を得た。ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥおよびＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰの両方で観察されたトランスフェクション効率は、プラスミド単独で観察されたよりも大きかった。
腹腔内検定では、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰはＧＡＰ−ＤＬＲＩＥより低効率であったが、しかしＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰおよびＧＡＰ−ＤＬＲＩＥはともに、プラスミド単独に比してトランスフェクション効率を増大した。
実施例８
皮下ランス（Renca）腫瘍モデル
９０％ＲＰＭＩ１６４０／１０％ウシ胎仔血清中で、ランス（Renca）腫瘍を増殖させた。約１０6個細胞／組織培地１ｍｌを含有する懸濁液７５μｌで腫瘍を、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの側腹に皮下注射した。腫瘍が直径４．５〜７ｍｍに達した時に、球形腫瘍と想定して、腫瘍の直径を測定して、各々の個々の腫瘍の容積を算出した。個々の腫瘍の各々に関して、腫瘍の算出容積と等しい容積の生理的食塩水中サイトフェクチン／ＣＡＴプラスミド複合体を、２ｍｌ／分の速度で腫瘍に注入した。４８時間後、腫瘍を収集し、凍結し、すり砕いて、実施例３に記載したように、１．５ｍｌの抽出緩衝液で抽出した。実施例３に記載したように、ＣＡＴ活性を定量した。
実施例９
動脈内検定
動脈遺伝子転移を、以下のように、ヨークシャーブタまたはウサギで実行した。動脈遺伝子転移を、Nabel, Science 249:1285-1288（1990）に記載されたように、各ブタの右および左腸骨大腿骨動脈で実行した。要するに、麻酔後、右および左腸骨大腿骨動脈を外科的技法により曝露し、二重バルーンカテーテル（ＵＳＣＩ）を各動脈に配置した。１分間に５００ｍｍＨｇに近位バルーンを膨張させて動脈を損傷させた。次に、動脈の損傷領域で遺伝子転移を実行するために、カテーテルを再配置した。動脈セグメントを、試験されるサイトフェクチン、ベクターＤＮＡおよびｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Gibco/BRL）から成るベクター溶液で洗い流した。１００μｇのＤＮＡおよび３００μｇの脂質の混合物を滴注した。ベクター溶液を、１５０ｍｍＨｇで２０分間、損傷部位中に滴注した。滴注後、カテーテルを除去し、動物を回復させた。トランスフェクションの４８時間後、動脈を取り出した。ガラス乳棒で組織を押し潰し、その後３回、凍結解氷した。標本を６５℃で１０分間インキュベートして、内因性アセチラーゼを不活性化した。タンパク質を抽出し、比色検定（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いてそれらの濃度を確定した。各検定では、４時間のインキュベーション時間を用いて、実施例３で前記した手順にしたがって、ＣＡＴ活性に関して、２００μｇの総タンパク質を検定した。
実施例１０
ブタ動脈およびアテローム硬化症ウサギ動脈中への遺伝子転移
ブタまたはウサギ動脈のリポソームトランスフェクションを、前記（Nabel et al., Science, 249:1285-1288, 1990）のように腸骨大腿骨動脈の麻酔、挿管および滅菌曝露により実行した。二重バルーンカテーテルを腸骨大腿骨動脈中に挿入し、近位バルーンを５分間で５００ｍｍＨｇに膨張させた。バルーンをしぼませ、近位および遠位バルーン間の中心間隙がヘパリン化生理的食塩水で洗浄されるように、カテーテルを進行させた。ＣＡＴ ＤＮＡ溶液（ＣＡＴ ＤＮＡ±サイトフェクチン）をカテーテルの中心間隙に２０分間滴注した。カテーテルを除去し、抗傾斜血流を復帰させた。組換えＣＡＴ発現に関して、２日後に動脈を分析した。陽イオン性脂質の存在下でＣＡＴ ＤＮＡでトランスフェクションを行った動脈は、ＤＮＡ単独に接触した動脈と比較して、ＣＡＴ遺伝子発現の有意の増大を示した。
アテローム硬化症ウサギ腸骨動脈の遺伝子転移を、Faxonら（Arteriosclerosis, 4:189-195, 1984）が記載した二重損傷モデルを用いて実行した。２回の血管形成術損傷完了後、カテーテルの末端保持注入口が損傷の近位端にくるように、血管形成バルーンをわずかに引き抜いた。損傷の遠位端に結紮を置き、損傷セグメントをヘパリン化生理的食塩水で洗って、ＣＡＴ ＤＮＡ±陽イオン性脂質リポソーム溶液を単離損傷セグメント中に２０分間滴注した。カテーテルを除去し、抗傾斜血流を復帰させた。組換えＣＡＴ発現に関して、２日後に動脈を分析した。この検定は、特定の組織での使用のための特定のサイトフェクチンの構造を最適化するための別のスクリーニング検定を説明する。
実施例１１
筋肉内検定
２８Ｇ １／２針（Becton-Dickinson）、および黄色Eppendorf マイクロピペット先端から切断したプラスチックカラーを備えた使い捨て滅菌プラスチック製インシュリン注射器を用いて、５０μｌのＵＳＰ生理的食塩水中の５０μｇのルシフェラーゼまたはＣＡＴ ＤＮＡ±サイトフェクチンを、拘束覚醒マウスの四頭筋に注射した。カラー長を調整して、直径３ｍｍの大腿直筋の中心部に約２ｍｍの深さまでに針孔貫通を制限した。注射液および注射器を室温に平衡させ、５０μｌ容量の生理的食塩水−ＤＮＡの１回の注射に要する時間は数秒であった。四頭筋群全体（重量１４０〜１８０ｍｇ）を注射後の種々の時間に各マウス足から収集した。実施例３に記載したように、筋肉を凍結させ、溶解した。
自動マイクロプレート発光計（Dynatech Model ML2250）を用いて、ルシフェラーゼ活性を検定した。１００μｌのルシフェラーゼ基質を、発光計の注入系により２０μｌ抽出物に加え、標本の光単位（light unit）を記録した。標本のルシフェラーゼ含量は、非注射筋肉抽出物の存在下で実施した精製ホタルルシフェラーゼの標準曲線を用いて相対光単位（light unit）から算出した。注射筋肉抽出物中に存在するルシフェラーゼ活性は、非注射筋肉抽出物の場合より非常に高かった。
この検定は、特定組織に用いるための特定のサイトフェクチンの構造を最適化するための別のスクリーニング検定を説明する。
これ以上詳細に説明しなくても、前述の説明を用いて、当業者は本発明を十二分に利用し得ると考えられる。本発明は、本質的な特徴を有するその精神を逸脱しない限り、その他の特定の形態で具体化され得る。説明してきた実施態様は本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲に示されている。請求の範囲の合法的等価物の意味および範囲内にある修正はすべて、本発明の範囲内に含まれる。
本発明は、複合両親媒性脂質に関する。本発明は特に、環内の少なくとも１つの窒素に結合するヘテロ原子および環上の窒素に結合する親油性部分を含む、炭化水素鎖を有するピペラジン環を包含する複合陽イオン性両親媒性脂質に関する。
発明の背景
両親媒性分子は、細胞内で治療用または生物活性分子を細胞中に輸送するために用いられる。例えば、ＷＯ ９５／１４３８１は、高分子の細胞内輸送のための両親媒性グアニジン誘導体の使用を開示する。陽イオン性脂質は、一般に１つまたはそれ以上の炭化水素またはアルキル基を含む親油性領域、および少なくとも１つの正に荷電した極性末端基を含む親水性領域を有する両親媒性分子である。陽イオン性脂質は、細胞の形質膜を通して細胞質中への高分子の輸送を促すのに有用である。インビトロならびにインビボで実行し得る方法は、トランスフェクションとして公知であり、このような技法に用いられる陽イオン性脂質はサイトフェクチンとして公知である。
トランスフェクション効率を統計学的に有意な程度に増強するサイトフェクチンは有益である。ＤＮＡのみを用いて得られるよりも２倍程度この活性が増大すれば有益であるが、好ましくはトランスフェクション効率は５〜１０倍増大し、さらに好ましくはトランスフェクション効率は１０倍以上増強される。
典型的には、２つの両親媒性脂質種は組合せると、サイトフェクチン単独よりもトランスフェクション時に有効である定序脂質二重層を含む小胞を形成し得るということが判明しているため、サイトフェクチンは中性両イオン性脂質、例えばリン脂質と組合される。これらの小胞またはリポソームは、それらがポリヌクレオチドまたはその他の陰イオン性分子、例えば負荷電タンパク質と複合体を形成するのを可能にするため表面上に多数の正電荷を有する。ポリヌクレオチド／サイトフェクチン／中性脂質複合体の表面に残存する総陽イオン電荷は、細胞膜表面で優勢な負電荷と強力に相互作用し得る。
両親媒性特性の基本的特徴および極性末端基を除くと、サイトフェクチンは親油性領域および親水性領域ではかなりの構造的多様性を有する。トランスフェクションに用いるために多数の異なるサイトフェクチン種が合成されており、現在市販されている。このようなサイトフェクチンとしては、例えばリポフェクチンTM、リポフェクチンＡＣＥTM、リポフェクトＡＭＩＮＥTM、トランスフィークタムTMおよびＤＯＴＡＰTMが挙げられる。サイトフェクチンの構造的多様性が有効性であるのは、サイトフェクチンの構造−機能−認識の様子が細胞中でそれぞれの適用に関して異なるという観察結果を、部分的には、反映する。ＤＯＴＭＡ化合物と構造的に類似のサイトフェクチンを用いた実験は、トランスフェクション活性が部分的にはトランスフェクトされる細胞型に依っていることを示す（Felgner et al., J. Biol. Chem. 84:7413-7417、1987; Wheeler et al.,Biochem. Biophys. Acta,1280:1-11（1996））。特に、アンモニウム基をスペルミンで置換した基を有する陽イオン性脂質は、いくつかの細胞系のトランスフェクションに関してＤＯＴＭＡより有効であることが分かった。この現象は、有効なトランスフェクションは陽イオン性脂質複合体と形質膜の構造的脂質二重層との受動的融合だけでなく、特異的な細胞特性および細胞成分と個々の陽イオン性脂質種との間の相互作用にも依っていることを示唆する。
したがって、サイトフェクチン種の中でのこの構造上の変異型は、サイトフェクチンと細胞との多面的な且つ複雑な相互作用のより高度の理解及び、１つまたはそれ以上のこれらの相互作用を利用する研究者の側の努力を示すものである。
米国特許第５，０４９，３８６号（Epstein）に開示されたＤＯＴＭＡ、即ちＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムは、開発された最初の陽イオン性脂質の１つであって、この群の脂質は、新規な構造上の変異型の開発において比較したサイトフェクチン能力を評価する場合の参照化合物になっている。ＤＯＴＭＡ脂質は、分子のプロピル骨格にエーテル結合される一対のＣ18炭化水素と共に、分子の陽イオン性部位を提供する第四級窒素を有するプロパナミニウム基を特徴とする。第四級窒素は、比較的短いアルキル鎖、例えばメチル基により三置換化される。構造的に類似の陽イオン性脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、エーテル結合したアルキル基よりむしろアシル基を包含し、標的細胞により容易に代謝されると考えられる。
陽イオン性脂質のいくつかの種、例えばアルキルまたはアシル基により直接置換されたアンモニウム塩は、主に経済的理由から開発された（米国特許第５，２７９，８３３号（Rose））。他のものは、低毒性効果を提供するために開発された。例えば、ホスファチジルコリンおよびスフィンゴミエリンから調製された高生物適合性サイトフェクチン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスフォコリン（Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, AL, Cat. Nos. 890700-706）がある。
Felgnerらに対する米国特許第５，２６４，６１８号は、ホスホリパーゼＡのローゼンタール阻害剤（ＲＩ）（Rosenthal et al., J. Biol. Chem. 235:2202-2206（1960））およびそのジアシルまたはアルキル／アシル種と構造的に類似したサイトフェクチンを開示する。ローゼンタール阻害剤ベースのサイトフェクチンは、第四級窒素と結合した次式、
ＲＩベースの一連の化合物は、以下のパターンを有する頭字語により公知であり、ＤＯＲＩＥ（Ｃ18）、ＤＰＲＩＥ（Ｃ16）およびＤＭＲＩＥ（Ｃ14）がある。これらの頭字語は共通の基本的化学構造を意味する。例えば、ＤＭＲＩＥ（dimyristoyl Rosenthal inhibitor ether）は１−プロパナミニウム，Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−，ブロミド，（＋）−（ＣＡＳ登録：１４６６５９）を意味し、他のものは、それらの置換アルキル基が異なる。第四級アンモニウム基を極性ヒドロキシエチルで置換した基を有するこれらのサイトフェクチンは、多くの場合にＤＯＴＭＡ型化合物より有効なトランスフェクションを提供する。ＲＩサイトフェクチンのトランスフェクション効能に及ぼすヒドロキシアルキル部分の置換基およびアルキル鎖長の変動の効果についての研究は、Felgnerら（J. Biol. Chem.269:2550-2561, 1994）によって示されている。さらにその研究は、最適のヒドロキシルアルキル鎖長が細胞型依存性であることを示した。
ＤＭＲＩＥのβＡＥ−ＤＭＲＩＥへの転換（Wheeler et al., 1280 Biochem. Biophys. Acta:1-11（1996））は、サイトフェクチン活性に有意的な効果を及ぼすことが判明した。第一アルコールに隣接する第四級窒素を有し、したがってｐＨ非依存性の正電荷を有するＤＭＲＩＥは、現在公知の最も高活性のサイトフェクチンの１つである。しかしながら、βＡＥ−ＤＭＲＩＥを生じるようＤＭＲＩＥ上のアルコールを第一アミン基に置換すると、ＤＭＲＩＥの場合とは構造的に全く別のＤＮＡ複合体を生成することが判明し、βＡＥ−ＤＭＲＩＥはヘルパー共脂質の非存在下で有効に多数の細胞系をトランスフェクトし得る。サイトフェクチン骨格内での一つの置換がトランスフェクション特性を顕著に変化し得るという観察結果は、他の修飾が遺伝子の輸送におけるほぼ同様の改良をもたらし得ることを示唆する。
トランスフェクション関連の継続した研究により、陽イオン性脂質が機能性分子の細胞の細胞質中への進入を促すだけでなく、さらに有益な能力、例えばリソソーム分解からの機能性分子の保護、核分画中への進入促進、または細胞質酵素によるＲＮＡ転写生成物の分解防止をさえ提供し得ることが示されている。陽イオン性分子のこれらの機能は、特定の構造的特徴に関連すると考えられる。したがって、特定の形の細胞中への外部分子のトランスフェクションに特に適したサイトフェクチンが必要である。さらに、特定の細胞内機能を行うことのできるサイトフェクチンを開発する必要がある。
ＷＯ ９５／１４６５１は、親油性炭化水素鎖が短い炭化水素リンカーを介して各々の窒素と結合したエーテルまたはエステルであるピペラジンベースのサイトフェクチンを開示する。さらに、窒素が正に荷電されるように、少なくとも１つの窒素が低級アルキル基とさらに結合する。しかしながら、ＷＯ９５／１４６５１に開示されたサイトフェクチンに結合した低級アルキル基は、付加的な生物活性基をサイトフェクチンに結合させず、それにより、サイトフェクチンに共有結合でつながっていない活性基に輸送され得る生物活性基を制限する。したがって、共有結合でつながった生物活性基を輸送し得るサイトフェクチンが必要とされる。さらに、トランスフェクション効率の改良を示すピペラジンベースのサイトフェクチンが必要とされる。
発明の概要
本発明は、以下の構造を有するピペラジンベースのサイトフェクチンに関する。
Ｒ3は、存在しないか、またはＨ、上記で定義したＲ1、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤もしくはは以下の構造を有する基であり、
Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ1であり、
ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり、
ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである）
Ｙ1およびＹ2は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、
Ｘ1は、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、
ｍおよびｐは独立で１〜６であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであって、
Ｒ2−Ｘ1−Ｒ3は少なくとも１つのヘテロ原子を含有する］
前記の構造のサイトフェクチンの好ましい一実施態様では、ｍおよびｐは２である。この実施態様のさらに非常に好ましい態様は、Ｙ1およびＹ2は０である。非常に好ましい実施態様では、Ｒ1およびＲ4は、Ｃ10Ｈ21、Ｃ12Ｈ25およびＣ14Ｈ29から成る群から選択される。さらに好ましい実施態様では、Ｒ2は存在しないか、またはＣＨ2、（ＣＨ2）2、（ＣＨ2）3、（ＣＨ2）4、（ＣＨ2）5、（ＣＨ2）6およびＣＯ−ＣＨ−ＮＨ2から成る群から選択される。好ましくは、Ｘ1は存在しないか、ＮＨおよびＯから成る群から選択される。
前記の実施態様のさらに好ましい態様では、Ｘ1はＮＨであり、Ｒ3はＨ、ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ3およびＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ2から成る群から選択される。前記の実施態様の別の好ましい態様では、Ｘ1はＯであり、Ｒ3はＨである。
前記の実施態様のさらに好ましい態様では、Ｘ1は存在せず、Ｒ3はＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2である。その他の好ましい化合物は、Ｒ2が（ＣＨ2）2であり、Ｘ1はＯであり、Ｒ3はＨである。
前記の実施態様の別の好ましい態様では、Ｒ2は（ＣＨ2）3であり、Ｘ1はＮＨであり、Ｒ3はＨである。さらに好ましい化合物は、Ｒ2が（ＣＨ2）4であり、Ｘ1はＮＨであり、Ｒ3はＨである。別の好ましい化合物では、Ｒ2は（ＣＨ2）5であり、Ｘ1はＮＨであり、Ｒ3はＨである。好ましい化合物のさらに別の群では、Ｒ2は（ＣＨ2）6であり、Ｘ1はＮＨであり、Ｒ3はＨである。好ましい化合物のさらに別の群は、Ｒ2が（ＣＨ2）3であり、Ｘ1はＮＨであり、Ｒ3はＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ2であるものである。
さらに別の好ましい化合物では、Ｒ2は（ＣＨ2）3であり、Ｘ1はＮＨであり、Ｒ3はＣＯ−ＮＨ−ＣＨ3である。好ましい化合物の別の群では、Ｒ2はＣＯ−ＣＨ（ＮＨ2）であり、Ｘ1は存在せず、Ｒ3はＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2である。
本発明はさらに、以下の構造を有するピペラジンベースのサイトフェクチンに関する。
Ｒ3およびＲ6は各々独立で、存在しないか、またはＨ、上記で定義したＲ1、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤もしくは以下の構造を有する基であり、
Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ1であり、
ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり
ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである）
Ｙ1およびＹ2は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、
Ｘ1およびＸ2は独立で、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、
ｍおよびｐは独立で１〜６であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであって、
Ｒ2−Ｘ1−Ｒ3およびＲ5−Ｘ2−Ｒ6は少なくとも１つのヘテロ原子を含有する］
前記の好ましい実施態様では、ｍおよびｐは２である。好ましくは、この好ましい態様では、Ｙ1およびＹ2は０である。さらに好ましい化合物は、Ｒ5およびＲ2は、存在しないか、ＣＨ2、（ＣＨ2）2、（ＣＨ2）3、（ＣＨ2）4、（ＣＨ2）5および（ＣＨ2）6から成る群から選択される。さらに好ましくは、Ｒ1およびＲ4は、Ｃ10Ｈ21、Ｃ12Ｈ25およびＣ14Ｈ29から成る群から選択される。非常に好ましい化合物では、Ｘ1およびＸ2は存在しないか、ＮＨおよびＯから成る群から選択される。
好ましい化合物の一群では、Ｒ1およびＲ4は、Ｃ12Ｈ25であり、Ｒ2はＣＨ3であり、Ｘ1およびＲ3は存在せず、Ｒ5はＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2であり、Ｘ2はＮＨであり、そしてＲ6はＨである。
本発明の別の態様は、細胞中へ分子を輸送する方法であって、
（ａ）有効量の上記の式を有するあらゆる陽イオン性脂質とこの分子とを接触させて、脂質との複合体を形成させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）で形成された脂質複合体と細胞とを接触させて、それにより生物学的有効量の分子を細胞中に挿入する工程と、
を含む輸送方法に関する。
前記の方法の好ましい態様では、この分子は陰イオン分子である。
前記の方法の別の態様では、複合体はさらに、上記の一般式で示される構造を有する陽イオン性脂質の他に、１つまたはそれ以上の脂質を含む。好ましくは、脂質は、上記の一般式で示される構造を有する陽イオン性脂質の他に、中性脂質、リン脂質およびコレステロールから成る群から選択される。
本方法の一態様では、細胞はインビトロ条件下で接触させられる。本発明の別の態様では、細胞はインビボ条件下で接触させられる。好ましくは、細胞は、ネズミ肺トランスフェクション、ネズミ腹腔内腫瘍、ネズミ筋肉内、ブタ動脈内、ウサギ動脈内、ランス（Renca）腫瘍または皮下腫瘍検定から成る群から選択される検定にかけられる。
本方法の好ましい実施態様では、陰イオン分子はｍＲＮＡである。本方法の別の好ましい実施態様では、陰イオン分子はＤＮＡである。
本発明の別の態様は、細胞中に分子を輸送するのに用いるための次式の化合物である。
Ｒ3は、存在しないか、またはＨ、上記で定義したＲ1、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤もしくは以下の構造を有する基であり、
Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ1であり、
ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり、
ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである）
Ｙ1およびＹ2は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、
Ｘ1は、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、
ｍおよびｐは独立で１〜６であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであって、
Ｒ2−Ｘ1−Ｒ3は少なくとも１つのヘテロ原子を含有する］
本発明のさらに別の態様は、細胞中に分子を輸送するのに用いるための次式の化合物である。
Ｒ3およびＲ6は各々独立で、存在しないか、またはＨ、上記で定義したＲ1、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、単糖類、二糖類、多糖類、生物活性剤、薬剤もしくは以下の構造を有する基であり、
Ｇは存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、Ｓ、ＳＨ、Ｓｅ、Ｃ、ＣＨまたはＣＲ1であり、
ＴはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣであり、
ＡはＯ、Ｎ、Ｓ、ＳｅまたはＣである）
Ｙ1およびＹ2は独立で、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、
Ｘ1およびＸ2は独立で、存在しないか、Ｏ、Ｎ、ＮＨ、ＳまたはＳｅであり、
ｍおよびｐは独立で１〜６であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであって、
Ｒ2−Ｘ1−Ｒ3およびＲ5−Ｘ2−Ｒ6は少なくとも１つのヘテロ原子を含有する］
【図面の簡単な説明】
図１は、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰの合成を示す。
図２は、Ｍｅ、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰの合成を示す。
図３Ａ〜３Ｄは、ＣＯＳ７およびＣ２Ｃ１２細胞の両方におけるＤＭＲＩＥおよびＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰのトランスフェクション効率を比較する。
図４は、肺内および腹腔内トランスフェクション検定における数種のピペラジンベースのサイトフェクチンのトランスフェクション効率の分析を示す。
図５は、肺内トランスフェクション検定における第一アミンを有する数種のピペラジンベースのサイトフェクチンのトランスフェクション効率の分析である。
図６は、肺内トランスフェクション検定におけるトランスフェクション効率に及ぼすヘテロ原子部分および親油性部分のアルキル鎖長の変動の影響を示す。
図７は、腹腔内および皮下腫瘍検定におけるＤＮＡ単独の場合と比較して測定されたＧＡＰ−ＤＬＲＩＥおよびＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰのトランスフェクション効率の分析である。
好ましい態様の詳細な説明
第四級窒素化合物は、それらの特異的構造に起因する有益な特徴を有する有効なサイトフェクチンである、ということが知られている。本発明は、環上の窒素の少なくとも１つが四級化されたピペラジンベースのサイトフェクチンに関する。親油性部分の他に、本発明のサイトフェクチンは少なくとも１つの環上の窒素と結合した少なくとも一つのヘテロ原子を含む炭化水素鎖を有する。
炭化水素鎖でのヘテロ原子の包含によって、いくつかの利点が提供される。例えば、本発明の化合物はより特異的に細胞膜に相互作用し、より高いレベルのトランスフェクションを達成する能力を有するトランスフェクション剤を形成するよう誘導することができる。本発明の化合物は細胞表面上の標的キーレセプター及び酵素に結合することができ、それ故分子認識における重要な要因の探求、開発における使用に適している。
本発明の陽イオン性脂質はさらに、特定の生物学的目的を達成するために細胞内で輸送される物質と結合し得る。官能基、例えばカルバミル、カルボキシル、ウレイル、チオール、エステル、エーテル、チオウレイル、ホスホリルまたはグアニジル基は、細胞標的部分または治療的分子をサイトフェクチンに結合させるために用いられる。種々の種類の標的部分および治療的部分を以下で考察する。
付加的にまたは代替的に、官能基はサイトフェクチンの極性電荷密度を増大させ、したがってトランスフェクション効率を増強させ得る基を結合させるためのリンカーとして使用できる。
サイトフェクチンの生物活性末端基
（ａ）標的種
本発明のサイトフェクチンは、末端基として生物学的細胞標的活性を有する分子種を含み得る。この種に含まれるサイトフェクチンは、細胞受容体特異性分子を含有する。典型的には、受容体特異性ペプチドまたはアミノ酸はアミドとして結合される。本発明のサイトフェクチンに連結され得る好ましいペプチドの例としては、走化性ペプチド、メチオニン−ロイシン−フェニルアラニン（Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）、およびｐＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓが挙げられる。本発明のサイトフェクチンと結合され得る細胞表面受容体のためのその他の配位子は、ペプチド擬似類似体、多数のウイルス付着およびインターナリゼーションペプチド、ラクトースならびにその他の二および多糖類、アセチルコリン類似体、ならびに葉酸誘導体を包含する。
（ｂ）治療剤
本発明のサイトフェクチンは、末端基として生物活性分子種を含み得る。本発明の化合物と結合し得る好ましい生物活性種の例は、チロトロピン放出ホルモン
ｐグルタミン酸−ヒスチジン−プロリンである。
（ｃ）細胞および細胞内標的
本発明のサイトフェクチンは、細胞膜または細胞内標的と特異的に結合して所望の生理学的反応に影響を与えることのできる配位子を保有する末端基を含む。適切な配位子は、ウイルスエピトープ、ホルモン、酵素、基質、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、炭水化物、補因子、薬剤、レクチン、オリゴヌクレオチドおよび核酸であるペプチドを包含し得る。この基の中の好ましい種は、クロロキンおよびその他のリソソーム親和性剤、核局在性ペプチド、コルチコステロイドおよびウイルスペプチドまたはタンパク質を包含するサイトフェクチンである。
（ｄ）トランスフェクション効率に影響を及ぼす群
本発明のサイトフェクチンは、それらのトランスフェクション効率に影響を及ぼす群と結合し得る。このような群は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、単糖、二糖または多糖類である。これらの構成単位をサイトフェクチンに付加するための伝統的および非伝統的結合法がともに考えられる。さらに、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、生体中には一般に見出されない異常なまたは修飾されたアミノ酸を含み得る。このような異常な又は修飾されたアミノ酸は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に列挙された異常な又は修飾されたアミノ酸に限られない。さらに、このようなアミノ酸は天然には見つからない合成アミノ酸である。本特許におけるサイトフェクチンに対する請求の範囲は、あらゆる部分がヘテロ原子炭化水素鎖を介してピペラジン骨格に結合した化合物を包含する。したがって、請求の範囲は、サイトフェクチンを別の部分と組合せるかまたは連結することによっても回避にされない。
さらに、ヘテロ原子基は単独で、トランスフェクション効率に有益に作用し得る。ＢＡＥ−ＤＭＲＩＥに関して前記したように、ヘテロ原子基の個性は、トランスフェクション効率に有意の影響を及ぼす。
（ｅ）薬剤
本発明の化合物は、インビトロおよびインビボで哺乳類細胞をトランスフェクションするための薬剤中に用い得る。トランスフェクション用の薬剤は当業者には公知であって、それらの製造方法と一緒に、例えば米国特許第５，２６４，６１８号（Felgner）、米国特許第５，３３４，７６１号（Gebeyehuら）、およびFelgner et al.（J.Biol. Chem. 269:2550-2561, 1994）に開示されている。これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる。本発明の陽イオン性脂質は、リン脂質等の両親媒性脂質、ならびにコレステロール等の中性脂質と組合されて脂質小胞を形成するが、これはリポソーム、単層板小胞、ミセルまたは簡単な薄膜である。
（ｆ）遺伝子治療、ワクチンおよびトランスフェクションのための請求の範囲の化合物の使用
陽イオン性リポソームは、血管、循環器系、肺上皮細胞、脳組織およびカエル胚（Xenopus）の細胞中へのポリヌクレオチド、高分子および小分子の進入を促すのに有用であることが公知である。本発明の陽イオン性脂質は、遺伝子治療を促進するのに特に有用である。生きている生体、例えば鳥類、哺乳類、魚類および両生類を含めた脊椎動物等へのｍＲＮＡまたはＤＮＡの導入を促進するための開示された陽イオン性脂質の使用が特に考えられる。とりわけヒト及び家畜への導入が考えられる。この目的ならびにトランスフェクションプロトコールのための陽イオン性脂質の使用は、Nabelら（Human Gene Therapy 3:399-410,1992）、米国特許第５，４５９，１２７（Felgner）及びWheelerら、1280 Biochem. Biophys. Acta:1-11（1996）に報告されている。
本発明のサイトフェクチンにより導入されるポリヌクレオチドは、好ましくは免疫原性または治療用ペプチドまたはポリペプチドをコードする。したがって、本方法は、ポリヌクレオチドワクチン接種ならびに遺伝子治療のために用い得る。本発明の陽イオン性脂質を用いてＤＮＡを宿主生物中に導入する場合、ＤＮＡはコード領域の他に、ＣＭＶ、ＲＳＶまたはＳＶ４０プロモーター等の適切なプロモーター、リボソーム結合部位およびポリアデニル化部位のような配列を含有し得る。
本発明のサイトフェクチンはインビトロで細胞にトランスフェクションを行うのに有用である、ということも注目される。本発明の範囲内の種々の化合物がインビボで多少組織特異性であるが、しかしほとんどまたはすべてがインビトロでの培養細胞のトランスフェクションに有用である。本発明のあらゆる特定の候補サイトフェクチンに関しては、インビトロおよびインビボでの種々の組織内におけるその相対的トランスフェクション効能は、例えば実施例２〜１１に開示されたようなスクリーニング検定またはその他の標準的なトランスフェクション検定を用いて容易に確かめ得る。この情報により、当業者は業界認知の薬剤および用量を用いて容易に本発明を実行し得る。
（ｈ）代表的ピペラジンベースのサイトフェクチンおよびその命名法
下記の表１は、以下の実施例に用いられる代表的ピペラジンベースのサイトフェクチンをその頭字語とともに列挙する。表１に列挙した一つの四級基を有する化合物は、ｍおよびｐがともに２であり、Ｙ1およびＹ2がともに０である下記の構造を有する。
ＨＥ＝ヒドロキシエチル； ＧＡ＝ガンマアミノ； ＤＡ＝デルタアミノ； ＦＡ＝ファンフアミノ（ｆｕｎｆ ａｍｉｎｏ）； ＨＡ＝ヘキシルアミノ； Ｍｅ＝メチル； Ｇｌｙ−Ｇ＝グリシンアミド； ＤＡＢ＝２，４−ジアミノ酪酸アミド； ＤｉＭｅ＝ジメチル；ＧＭＵ＝ガンマメチルウレア
下記の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、開示された方法は本発明の範囲に網羅されるすべての陽イオン性脂質の調製に適用可能であるが、その例に限定されない。実施例に示した温度はすべて摂氏であり、修正はなされない。
実施例１
ビス−ピペラジンサイトフェクチンの合成
下記の化学反応は、本発明の陽イオン性脂質の調製への一般的適用に関して開示される。時折、反応は、前記のように、開示された範囲内の各分子種に適用可能である訳ではない。これが生じる化合物は、当業者には容易に認識される。このような場合はすべて、反応は当業者に公知の慣用的修正により、即ち代替的慣用試薬に代えることにより首尾よく実行され得るか、または反応条件のルーチンの修正により首尾よく実行される。あるいは、本明細書中にＤＯＴＭＡ化合物（Felgner et al., J. Biol. Chem. 84:7413-7417, 1987）のようなその他の種類のサイトフェクチンの合成に関して本明細書中に引用された参考文献に、または慣用的化学文献に開示されたその他の反応は、本発明の化合物の調製に適用可能である。すべての製造方法において、出発物質はすべて、公知であるかまたは公知の出発物質から容易に調製可能である。
Ａ．代表的な一つの四級基を有する化合物（ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰ）の合成
一つの四級基を有するピペラジンベースのサイトフェクチンの代表的合成例として、以下の例を示す。ピペラジン骨格に結合したラウリル以外の基を有するピペラジンベースのサイトフェクチンの合成は、単に、所望のアルキルメタンスルホネート、例えばミリスチルメタンスルホネートまたはデシルメタンスルホネートを下記の合成のドデシルメタンスルホネートの代わりに置換することにより容易に成し遂げ得ると、当業者は理解するだろう。同様に、親油性鎖がアミン結合を介してピペラジン骨格に連接されるピペラジンベースのサイトフェクチンを合成することが望ましいものは、下記の合成において単にビス−アミノエチルピペラジンをビス−ヒドロキシエチルピペラジンの代わりに置き換え得る。
Ｎ，Ｎ‘−ビス−（２−ドデシルオキシエチル）−ピペラジン［ＬＯＥ−ＢＰ］：
マグネティックスターラーを備えた乾燥フラスコをアルゴン雰囲気にした後、水素化ナトリウム（油中に６０％、１．４７ｇ、３７ｍｍｏｌ）を投入した。ドライヘキサン（４×１５ｍｌ）を用いて粉砕後、無水テトラヒドロフラン（１２０ｍｌ）を加え、攪拌を開始して、薄いスラリーを得た。ビス−ヒドロキシエチル−ピペラジン（２．７９ｇ、１６ｍｍｏｌ）を固体として一度に加え、その後反応物を還流させて、一夜その温度を維持した。再還流スラリーに、無水テトラヒドロフラン（２５ｍｌ）に溶解したドデシルメタンスルホネート（１０．２ｇ，３８ｍｍｏｌ）の溶液を加え、反応物をさらに３日間還流し続けた。反応物を冷却し、スラリーをセライトの１ｃｍプラグを通して真空濾過し、反応容器および濾過装置をテトラヒドロフラン（１００ｍｌ）で洗浄した。濾液を合わせた後、蒸発させて、残渣をエチルエーテル（２３０ｍｌ）および０．２Ｎ水酸化ナトリウム（５０ｍｌ）に分配した。相を分離し、有機層を水（５０ｍｌ）で２回洗浄した後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶液を濾紙で濾過し、濾液を蒸発させて、粗製物質を得た。１：９のエーテル：ヘキサンから純粋なエーテルまで段階勾配溶離させてシリカゲル上でカラムクロマトグラフィー処理して、ＴＬＣ均質物質（３．６ｇ、４４％）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ｍＨｚ、ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ）：δ＝３．５４（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，４Ｈ）、３．４１（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），２．２６−２．５５（重複ｍ，１２Ｈ），１．５５（ｍ，４Ｈ），１．２６（ｓ，３６Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ）．ＩＲ（ＫＢｒペレット）：ＣＭ-1 ２９００，２８４０，１４６０，１２９５，１３２０，１１１５，７１５．
（±）−Ｎ−（３−フタルイミド）プロピル−Ｎ，Ｎ‘−（ビス−２−ドデシルオキシエチル）−ピペラジニウムブロミド［γ−Ｐｈｔｈ−ＬＯＥ−ＢＰ］
アルゴン雰囲気を維持しながら、指定された順序で、乾燥フラスコ中で、ＬＯＥ−ＢＰ（２．１６ｇ、４．２ｍｍｏｌ）、無水ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）およびＮ−（３−ブロモプロピル）フタルイミド（１．４２ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を混合した。フラスコにぴったり栓をした後、１０５℃に予め平衡化した油浴中つけ、マグネティックスターラーで攪拌を開始した。溶液は、２分以内に均一になった。指示された温度で３日間攪拌後、反応物を冷却し、溶媒を減圧濃縮により除去した。シリカゲル（９０：１０：０．２５：０．２５−クロロホルム：メタノール：水酸化アンモニウム：水、イソクラティク溶離）上で残渣をクロマトグラフィー処理して、ＴＬＣ均一物質（１．７０ｇ、５２％）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ｍＨｚ、ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ）：δ７．８６（ｍ，２Ｈ），７．７５（ｍ，２Ｈ），４．１６（ｍ，２Ｈ），３．９５（ｍ，２Ｈ），３．８７−３．８２（重複ｍ，４Ｈ），３．７２（ｍ，２Ｈ），３．５４−３．４５（重複ｍ，４Ｈ），３．３９（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），２．９７（ｍ，２Ｈ），２．９０（ｍ，２Ｈ），２．７０（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ），２．３１（ｍ，２Ｈ），１．５４−１．４５（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｓ，３６Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ）．ＩＲ（溶融、ＮａＣｌ上のフィルム）：ｃｍ-1 ２９００，２８５０，１７７０，１７００，１４６０，１３９０，１３６５，１１１０，７１５．
（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ‘−ビス−（ドデシルオキシエチル）−ピペラジニウムブロミド［「ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰ」］：
無水エタノール（３３ｍｌ）に溶解したγ−ＰＨｔｈ−ＬＯＥ−ＢＰ（１．７７ｇ、２．２７ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で攪拌して調製した。透明な混合物に、無水ヒドラジン（１．６ｍｌ、５１ｍｍｏｌ）を一定流で加えた。次にフラスコをアルゴンで置換して、ぴっちり栓をして、室温で一夜攪拌した。この期間の後、濃スラリーをクロロホルム（６５ｍｌ）で希釈して、約３０分間攪拌し、次に中間ガラスフリットを通して真空濾過した。反応容器および濾過装置をさらにべつの６５ｍｌのクロロホルムを２回に分けて用いて洗浄した。あわせた濾液を４０℃未満の温度で減圧濃縮させて、小容積にした。次に残渣をクロロホルム（３５０ｍｌ）および０．１Ｎ水酸化ナトリウム（１５０ｍｌ）に分配した。水相をクロロホルム（１５０ｍｌ、その後１２５ｍｌ）でさらに２回洗浄し、あわせた有機相を無水硫酸ナトリウムで一夜乾燥した。次に透明溶液を濾紙で濾過し、蒸発させた。残渣を高真空下で一夜処理した後、クロロホルム（１０ｍｌ）に溶解して、０．２μＰＴＦＥ濾紙を通して濾過した。濾液を蒸発させて、次に残渣を高真空下で一夜処理して、ＴＬＣ均質生成物１．３７ｇ（９３％）を得た（アミン被覆シリカゲル、８５：１５：０．２５：０．２５−クロロホルム：メタノール：水酸化アンモニウム：水、Ｒf＝０．５１）。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ｍＨｚ、ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ）：δ４．０１（ｍ，２Ｈ），３．９３−３．７４（重複ｍ，６Ｈ），３．６２−３．５０（重複ｍ，４Ｈ），３．４６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、３．４０（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．９４（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，４Ｈ），２．８８（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），２．７１（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），２．０（ｍ，２Ｈ），１．５５（ｍ，４Ｈ），１．２６（ｓ，３６Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ）．ＩＲ（ＮａＣｌ上で融解）：ｃｍ-1 ３４００（ｂｒ），３３００（ｓ），１５２０，１３６０，１１１０，７１５．
ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰに関する合成概略図を図１に示す。
Ｂ．代表的な二つの四級基を有する化合物（Ｍｅ，ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰ）の合成
Ｎ，Ｎ‘−ビス−（２−ドデシルオキシエチル）−ピペラジン［ＬＯＥ−ＢＰ］および（±）−Ｎ−（３−フタルイミド）プロピル−Ｎ，Ｎ‘−（ビス−２−ドデシルオキシエチル）−ピペラジニウムブロミド［γ−Ｐｈｔｈ−ＬＯＥ−ＢＰ］を、前記と同様に合成した。
（＋）−Ｎ−メチル−Ｎ‘（３−フタルイミド）プロピル−Ｎ，Ｎ‘−（ビス−２−ドデシルオキシエチル）−ピペラジニウムブロミド［Ｍｅ，γ−Ｐｈｔｈ−ＬＯＥ−ＢＰ］
乾燥フラスコ中で、γ−Ｐｈｔｈ−ＬＯＥ−ＢＰ（０．４４ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、ジメチルホルムアミド（１．３ｍｌ）およびヨウ化メチル（０．１５ｍｌ、０．３４２ｇ、３ｍｍｏｌ）を加えた。フラスコにぴったり栓をした後、１０５℃に予め平衡した油浴中につけ、マグネティックスターラーで攪拌を開始した。指示された温度で３日間攪拌後、反応物を冷却し、溶媒を減圧濃縮により除去した。シリカゲル（９０：１０：０．２５：０．２５から８５：１５：０．２５：０．２５−クロロホルム：メタノール：水酸化アンモニウム：水、段階勾配）上で残渣をクロマトグラフィー処理して、ＴＬＣ均一物質（０．３３６ｇ、６７％）を得た（シリカゲル、８０：２０：０．２５：０．２５−クロロホルム：メタノール：水酸化アンモニウム：水、Ｒ1＝０．２８）。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ｍＨｚ、ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ）：δ７．８４（ｍ，２Ｈ），７．７３（ｍ，２Ｈ），４．７−４．３（重複ｍ，１４Ｈ），３．９（重複ｍ，９Ｈ），３．５−３．４（重複ｍ，４Ｈ），２．３４（ｍ，２Ｈ），１．５４−１．４５（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｓ，３６Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，６Ｈ）．ＩＲ（ＫＢｒ）：ｃｍ-1 ２９２０，２８５０，１７７０，１７１０，１４６０，１３９０，１３６０，１１２０，７１５．
（＋）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ‘−メチル−Ｎ，Ｎ‘−（ビス−２−ドデシルオキシエチル）−ピペラジニウムブロミド［「ＧＡ，Ｍｅ−ＬＯＥ−ＢＰ」］：
無水エタノール（１０ｍｌ）およびクロロホルム（５ｍｌ）に溶解したＭｅ，γ−Ｐｈｔｈ−ＬＯＥ−ＢＰ（０．３２ｇ、０．４９ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で攪拌して調製した。透明な混合物に、無水ヒドラジン（０．３ｍｌ、９．６ｍｍｏｌ）を一定流で加えた。次にフラスコをアルゴンで置換して、ぴっちり栓をして、室温で一夜攪拌した。この期間の後、濃スラリーをクロロホルム（３０ｍｌ）で希釈して、約３０分間攪拌し、次に中間ガラスフリットを通して真空濾過した。反応容器および濾過装置をさらにべつの６０ｍｌのクロロホルムを２回に分けて用いて洗浄した。あわせた濾液を４０℃未満の温度で減圧濃縮させて、小容積にした。クロロホルム（１００ｍｌ）を加えた後、真空除去して、残渣は４日間高真空下に置いた。その後、白色固体を９：１−クロロホルム：エタノール（２０ｍｌ）に溶解し、０．２μＰＴＦＥ濾紙を通して濾過した。濾液を蒸発させて、次に残渣を高真空下で一夜処理して、もろい白色固体を得た。この残渣をクロロホルム：メタノール（１１０ｍｌ、８：３比）中に溶解し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム（３０ｍｌ）で洗浄した。水相をクロロホルム（１５ｍｌ）で洗浄し、あわせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。次に透明な溶液を濾紙を通して濾過し、蒸発させた。残渣を高真空下で一夜処理し、次に純粋なクロロホルム（１０ｍｌ）中に溶解し、０．２μＰＴＦＥ濾紙を通して濾過した。濾液を蒸発させて、次に残渣を高真空下で一夜処理して、生成物（０．２３ｇ、５９％）を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ｍＨｚ、ＣＤＣｌ3、ＴＭＳ）：δ４．７−４．３（重複ｍ，１４Ｈ），３．９（重複ｍ，５Ｈ），３．６−３．３（重複ｍ，６Ｈ），２．７−２．４（重複ｍ，６Ｈ），１．５４−１．４５（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｓ，３６Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，６Ｈ）．ＩＲ（ＮａＣｌ上で融解）：ｃｍ-1 ３４００（ｂｒ），２９１０，２８４０，１６３０，１４５５，１３６５，１１１０，７１５．
図２は、代表的な二つの四級基を有するピペラジンベースのサイトフェクチンＭｅ，ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰの合成に関する反応概略図を示す。
前記の方法は、種々の二つの四級基を有するピペラジンベースのサイトフェクチンを調製するために用いうる、と当業者は理解するだろう。四級窒素の各々に結合した非親油性部分は、同一であっても異なってもよい。本発明の二つの四級基を有するサイトフェクチンの一実施態様では、四級窒素に結合した非親油性部分はいずれも、ヘテロ原子である。代替的実施態様では、唯一の非親油性部分はヘテロ原子である。
もちろん、１つ以上の反応性官能基を有する分子の場合には、特定のカップリング反応に関与するよう意図されない１つまたはそれ以上の基をブロックまたはマスクする必要がある、ということに、当業者は気づくだろう。スクリーニングを活用した合成は、特定の適用に最も有効なサイトフェクチンを効率よく選択するために使用できる。
実施例２
インビトロトランスフェクションに及ぼす薬剤の作用：ＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰとＤＭＲＩＥとの比較
サイトフェクチン：クロロホルムに溶解した選択されたサイトフェクチンの溶液を重量対容量（ｗ／ｖ）ベースで調製した。陽イオン性脂質および中性脂質（用いた場合）のアリコートを、１ｍｌの水性媒体を用いた再構成時に所望される相対および絶対脂質濃度を提供するように無菌的に、計算した量で滅菌バイアルに移した。ドライ窒素流で大量のクロロホルムを除去し、バイアルを一夜高真空下で処理して、残留溶媒をすべて除去した。
ＤＮＡ−脂質複合体：プラスミドＤＮＡの５ｍｇ／リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）１ｍｌならびに乾燥した処方済みサイトフェクチン−中性脂質混合物をＯＰＴＩＭＥＭTM（Gibco BRL）中に懸濁し、示されたような所望の質量／モル比で９６ウエルプレート中で一緒に混合した。ＤＮＡ−脂質複合体を混合後２時間以内に細胞に加えた。
トランスフェクション
細胞系：使用した細胞系は、アメリカ型培養細胞コレクション（ＡＴＣＣ，Rockville, MD）から入手したＣＯＳ７サル腎臓細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、およびＣ２Ｃ12マウス筋原細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７７２）を用いた。
細胞はすべて、１：５〜１：１０で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）およびダルベッコ修正イーグル液（ＤＭＥＭ）中で継代した。全細胞は、受領時に１０回ダブリング継代させて広げ、アリコートを凍結保存した。再拡張して、全細胞をトランスフェクション試験に用い、その後さらに１０回継代した。
トランスフェクション検定：０日目に、１０％ＦＥＢＳ／９０％ＤＭＥＭ １００μｌ中２０，０００個の細胞を９６ウエル培養プレート（Nunc）の各ウエル中に植え付け、５％ＣＯ2インキュベーター中で３７℃で一夜培養した。１日目に、細胞が移動しないように注意深く培地を吸引し、血清無含有ＯＰＴＩＭＥＭTM（Gibco BRL）中のＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ／ｐＲＳＶ ｌａｃＺ／ＤＯＰＥ １００μｌを加えた。ＤＭＲＩＥは、参照標準として用いた。ｌａｃＺ遺伝子は比色計で検定される酵素β−ガラクトシダーゼをコードする。陽イオン性脂質：ＤＯＰＥ比は、各ウエルに関して変化した。４時間培養後、３０％ＦＢＳ／７０％ＯＰＴＩＭＥＭTM ５０μｌを各ウエルに加えた。２日目、各ウエルに１０％ＦＥＢＳ／９０％ＯＰＴＩＭＥＭTM １００μｌを加えた。３日目、培地を取り出し、５０μｌの溶解緩衝液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ８．０中の０．１％トリトン−Ｘ1００）を加え、このプレートを７０℃で少なくとも２０時間保存した。解氷後、Felgnerら（J. Biol. Chem. 269:2550-2561, 1994）にしたがって、ウエル培地中でのβ−ガラクトシダーゼ酵素活性量を検定した。
結果（図３Ａ〜３Ｄ）は、ＣＯＳ７細胞中のβ−ｇａｌの総発現およびピーク発現はともに、５０：５０のＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ：ＤＯＰＥ比で最適であり、Ｃ２Ｃ12細胞においては２５：７５のＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ：ＤＯＰＥ比で最適であったことを示す。ＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰは、これらのインビトロ検定では、ＤＭＲＩＥに比較してこの好ましかった。これらの実施例は、本発明のピペラジンベースのサイトフェクチンがインビトロでの細胞膜を通過するＤＮＡの効率のよい輸送と、その後の細胞内での遺伝子の機能性発現を促進することを示す。これらの試験に用いたスクリーニング検定は、トランスフェクション活性を実証するのに、そしてサイトフェクチン／共脂質比を最適化するのに有用である。
実施例３
肺内および腹腔内トランスフェクション検定におけるピペラジンベースのサイトフェクチンの分析
Ａ．肺内トランスフェクション検定
成熟（４〜１６週）雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをメトファンで軽く麻酔し、１００μｌのＵＳＰ生理的食塩水または水中の１３２μｇのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ＤＮＡ±陽イオン性脂質を、小型プラスチックカテーテル付きの使い捨て滅菌プラスチック製インシュリン注射器を用いて鼻腔内投与した。陽イオン性脂質をクロロホルム中の１モル当量のＤＯＰＥと混合し、溶媒を蒸発させた後、残渣を高真空下で処理して、脂質薄膜を得た。この薄膜に水を加え、約１分間攪拌して、陽イオン性リポソームを調製した。水中の適切な容量のプラスミドＤＮＡおよび水中の陽イオン性リポソームを室温で混合し、約３０秒間かき混ぜて、２：１（ｍｏｌ：ｍｏｌ）ヌクレオチド：サイトフェクチン比で複合体を得た。液体および注射器はすべて、室温に平衡させ、１００μｌ容量のＤＮＡを１回投与するのに要する時間は１分未満であった。投与の２または３日後、ナトリウムペントバルビタールを過剰投与してマウスを屠殺し、下記のように肺を抽出した。
肺を直に凍結し、−７８℃で保存した。試験管内にぴったり合った可逆ドリルおよびビットを用いて１．５ｍｌ試験管内の０．４ｍｌ凍結溶解緩衝液上で磨砕することにより、凍結肺を独立で微細粉末に粉砕し、粉末を同一試験管中で、抽出するまで−７８℃で保存した。凍結粉末を解氷し、１００μｌのＲｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号 Ｅ３９７Ａ、Promega）を各々に加えた。標本を１５分間攪拌し、液体窒素と室温水浴を交互に用いて３回凍結−解氷し、１０，０００ｘｇで３分間遠心分離した。上清を別の１．５ｍｌ試験管に移し、さらに５００μｌの溶解緩衝液をペレットに加えた後に、抽出工程を（凍結−解氷せずに）反復した。二番目の上清を最初の上清とあわせて、−７８℃で保存した。
使用した陽イオン性ピペラジンベースの脂質は、ＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ−、ＧＡ−ＭＯＥ−ＢＰ、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰおよびＢＡ−ＬＯＥ−ＢＰであって、ＧＡＰＤＬＲＩＥを比較のために含めた。
Sankaran（Anal. Biochem., 200:180-186, 1992）の放射能分配法により、またはＣＡＴ ＥＬＩＳＡキット（Boehringer Mannheim,Indianapolis, IN）を用いて、ＣＡＴ検定を実施した。要するに、ＣＡＴ組織ホモジネートをエタノール／ドライアイス浴中で３回凍結−解氷して、破裂させた。遠心分離により細胞破屑を取り除き、タンパク質抽出物を14ＣクロラムフェニコールおよびアセチルＣｏＡと一緒にインキュベートした。クロラムフェニコールを酢酸エチルで抽出し、薄層クロマトグラフィーを実施して、抽出細胞タンパク質により転換された14Ｃクロラムフェニコールのパーセンテージを確定した。細胞抽出物を２０分間インキュベートした２μｇのタンパク質に対して標定した。組織抽出物を、４時間インキュベートした２００μｇのタンパク質に対して標定した。
肺抽出物中にスパイクされた精製酵素（Sigma, St. Louis, MO）またはＥＬＩＳＡキットで提供された酵素を用いて、標準曲線を構築した。２つのＣＡＴ検定法は、同一組の抽出物からの標本当たり等価ｐｇのＣＡＴを生じた。
Ｂ．腹腔内トランスフェクション検定
前記の肺内検定で試験したピペラジンベースのサイトフェクチンのトランスフェクション効率を、ネズミ腹腔内モデルで評価した。５００μｌのＲＰＭＩ中の２００，０００個のネズミＢ１６腫瘍細胞を、０日目にＣ５７／Ｂ１６マウスに腹腔内注射した。７〜１４日目に、ＤＮＡ／サイトフェクチン／生理的食塩水溶液をマウスに腹腔内注射した。ＤＮＡ ０．５ｍｇを１．５ｍｌの生理的食塩水中にＤＮＡ：サイトフェクチンのモル比が１０：１となるように種々のサイトフェクチンと混合した。ＤＮＡ注入後２日目に、腫瘍を収集し、抽出して、前記の肺内検定に関する記載と同様に、ＣＡＴ活性に関して検定した。
Ｃ．結果
肺内および腹腔内トランスフェクション検定において、ＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰ、ＨＥ−ＬＯＥ−ＢＰ、ＧＡ−ＭＯＥ−ＢＰ、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰおよびＢＡ−ＬＯＥ−ＢＰを用いて得られた結果を、表４に要約する。肺内検定では、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰおよびＢＡ−ＬＯＥ−ＢＰはＧＡＰ−ＤＬＲＩＥよりも大きいトランスフェクション効率を提供した。ＨＥ−ＬＯＥ−ＢＰ、ＧＡ−ＭＯＥ−ＢＰおよびＨＥ−ＭＯＥ−ＢＰは、肺内検定ではほとんど有効でなかった。
腹腔内検定では、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰは試験したピペラジンベースのサイトフェクチンのうち最大のトランスフェクション効率を提供したが、しかしそのトランスフェクション効率は本検定におけるＧＡＰ−ＤＬＲＩＥにより得られた結果と同じ程に高いわけではなかった。試験した残りのピペラジンベースのサイトフェクチンは、腹腔内検定においてほとんど活性がなかった。
ここに報告した試験は、請求の範囲の化合物がトランスフェクションにおいて活性であることを示すだけでなく、特定の組織のトランスフェクションに対してサイトフェクチンを選択し、最適化する方法を示している。特定の最適構造はこの検定に関して容易に明らかになるが、しかし、これらの結果は組織特異的であると理解される。言い換えれば、この検定で次善的に実施されたサイトフェクチンでも、インビトロトランスフェクション、ネズミ腹腔内腫瘍、ネズミ筋肉内、ブタまたはウサギ動脈内、一般的皮下腫瘍またはランス（Renca）腫瘍検定などの他の検定においても有益な活性を有し得る。
実施例４
第一級アミンを有するピペラジンベースのサイトフェクチンの分析
ＤＭＲＩＥ類サイトフェクチンでは、アルコール基を第一級アミンに置換すると、トランスフェクション効率が増強される（Wheeler et al., 1280 Biochem.Biophys. Acta:1-11（1996））。このために、四級窒素と結合した第一級アミンを有するピペラジンベースのサイトフェクチンのトランスフェクション効率を、肺内検定においてＤＮＡ単独のトランスフェクション効率に対して評価した。肺内検定は、前記の実施例３と同様に実施した。対照として、１３２μｇのＤＮＡ単独で得られたトランスフェクション効率を確定した。
図５は、この比較の結果を示す。各々が第一級アミンを有するＧＡ−ＬＯＥおよびＧｌｙ−Ｇ−ＬＯＥはともに、ＤＮＡ単独より有意に大きいトランスフェクションレベルを提供した。ＧＭＵ−ＬＯＥを用いて得られたトランスフェクション効率は第一級アミンを有するサイトフェクチンと同様程度には高くはなかったが、しかしＤＮＡ単独で得られた結果に比べて上昇した。
実施例５
トランスフェクション効率に及ぼすヘテロ原子部分および親油性部分のアルキル鎖長の変動の影響
異なる種類の細胞におけるトランスフェクション効率は、親油性およびヘテロ原子鎖長の個性により影響される。このために、親油性およびヘテロ原子基の鎖長が異なるピペラジンベースのサイトフェクチンのトランスフェクション効率を、肺内検定で比較した。肺内検定は、前記の実施例３に記載したのと同様に実行した。図６は結果を示す。
第一級アミン基を有するピペラジンベースのサイトフェクチンの中で、最高トランスフェクション効率はＧＡ−ＬＯＥにより得られた。親油性鎖の長さだけがＧＡ−ＬＯＥと異なるＧＡ−ＭＯＥおよびＧＡ−ＤＯＥは低活性を示したが、しかしＧＡ−ＭＯＥはＤＮＡ単独より有効であった。
同様に、第一級アミンの鎖長が増大すると、トランスフェクション効率は低減した。ＧＡ−ＬＯＥはＤＡ−ＬＯＥより大きい活性を示したが、一方ＤＡ−ＬＯＥはＦＡ−ＬＯＥまたはＨＡ−ＬＯＥより有効であった。試験した第一級アミンを有するピペラジンベースのサイトフェクチンはすべて、ＤＮＡ単独より有効であった。
ヘテロ原子部分にアルコール基を有するピペラジンベースのサイトフェクチンの中では、ＨＥ−ＬＯＥが最も有効であった。しかしながら、肺内検定では、第一級アミンを有するサイトフェクチンは、アルコール基を有するものより有効であった。
実施例６
一般的皮下腫瘍トランスフェクション検定
特定の腫瘍型に適合性であるマウス系統の側腹に腫瘍細胞の懸濁液を皮下注入して、腫瘍を調製した。腫瘍を定期的に測定した。それらが注入に適したサイズに達すると、腫瘍を球形と仮定して測定した直径を基礎にして腫瘍容積を近似させた。処置すべき腫瘍の容積と等しい容積の生理的食塩水中の評価されるサイトフェクチンとレポーター遺伝子をコードするプラスミドとの複合体を次に、特定腫瘍型に最適の流速で注入した。適切な時間後、腫瘍を収集し、凍結した後、粉砕した。レポーター遺伝子生成物をその後抽出し、前記と同様に活性を定量した。
実施例７
皮下腫瘍中および腹腔内トランスフェクション検定におけるピペラジンベースのサイトフェクチンの分析
ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥおよびＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰのトランスフェクション効率を、腹腔内および皮下腫瘍検定においてＤＮＡ単独の場合と比較して測定した。腹腔内検定は、実施例３に記載したように実行した。皮下腫瘍検定は、ネズミＢ１６黒色腫細胞を用いて、上記の実施例６と同様に実行した。
結果を図７に示す。皮下腫瘍検定では、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰはＧＡＰ−ＤＬＲＩＥより大きいトランスフェクション効率を得た。ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥおよびＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰの両方で観察されたトランスフェクション効率は、プラスミド単独で観察されたよりも大きかった。
腹腔内検定では、ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰはＧＡＰ−ＤＬＲＩＥより低効率であったが、しかしＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰおよびＧＡＰ−ＤＬＲＩＥはともに、プラスミド単独に比してトランスフェクション効率を増大した。
実施例８
皮下ランス（Renca）腫瘍モデル
９０％ＲＰＭＩ１６４０／１０％ウシ胎仔血清中で、ランス（Renca）腫瘍を増殖させた。約１０6個細胞／組織培地１ｍｌを含有する懸濁液７５μｌで腫瘍を、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの側腹に皮下注射した。腫瘍が直径４．５〜７ｍｍに達した時に、球形腫瘍と想定して、腫瘍の直径を測定して、各々の個々の腫瘍の容積を算出した。個々の腫瘍の各々に関して、腫瘍の算出容積と等しい容積の生理的食塩水中サイトフェクチン／ＣＡＴプラスミド複合体を、２ｍｌ／分の速度で腫瘍に注入した。４８時間後、腫瘍を収集し、凍結し、すり砕いて、実施例３に記載したように、１．５ｍｌの抽出緩衝液で抽出した。実施例３に記載したように、ＣＡＴ活性を定量した。
実施例９
動脈内検定
動脈遺伝子転移を、以下のように、ヨークシャーブタまたはウサギで実行した。動脈遺伝子転移を、Nabel, Science 249:1285-1288（1990）に記載されたように、各ブタの右および左腸骨大腿骨動脈で実行した。要するに、麻酔後、右および左腸骨大腿骨動脈を外科的技法により曝露し、二重バルーンカテーテル（ＵＳＣＩ）を各動脈に配置した。１分間に５００ｍｍＨｇに近位バルーンを膨張させて動脈を損傷させた。次に、動脈の損傷領域で遺伝子転移を実行するために、カテーテルを再配置した。動脈セグメントを、試験されるサイトフェクチン、ベクターＤＮＡおよびｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Gibco/BRL）から成るベクター溶液で洗い流した。１００μｇのＤＮＡおよび３００μｇの脂質の混合物を滴注した。ベクター溶液を、１５０ｍｍＨｇで２０分間、損傷部位中に滴注した。滴注後、カテーテルを除去し、動物を回復させた。トランスフェクションの４８時間後、動脈を取り出した。ガラス乳棒で組織を押し潰し、その後３回、凍結解氷した。標本を６５℃で１０分間インキュベートして、内因性アセチラーゼを不活性化した。タンパク質を抽出し、比色検定（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いてそれらの濃度を確定した。各検定では、４時間のインキュベーション時間を用いて、実施例３で前記した手順にしたがって、ＣＡＴ活性に関して、２００μｇの総タンパク質を検定した。
実施例１０
ブタ動脈およびアテローム硬化症ウサギ動脈中への遺伝子転移
ブタまたはウサギ動脈のリポソームトランスフェクションを、前記（Nabel et al., Science, 249:1285-1288, 1990）のように腸骨大腿骨動脈の麻酔、挿管および滅菌曝露により実行した。二重バルーンカテーテルを腸骨大腿骨動脈中に挿入し、近位バルーンを５分間で５００ｍｍＨｇに膨張させた。バルーンをしぼませ、近位および遠位バルーン間の中心間隙がヘパリン化生理的食塩水で洗浄されるように、カテーテルを進行させた。ＣＡＴ ＤＮＡ溶液（ＣＡＴ ＤＮＡ±サイトフェクチン）をカテーテルの中心間隙に２０分間滴注した。カテーテルを除去し、抗傾斜血流を復帰させた。組換えＣＡＴ発現に関して、２日後に動脈を分析した。陽イオン性脂質の存在下でＣＡＴ ＤＮＡでトランスフェクションを行った動脈は、ＤＮＡ単独に接触した動脈と比較して、ＣＡＴ遺伝子発現の有意の増大を示した。
アテローム硬化症ウサギ腸骨動脈の遺伝子転移を、Faxonら（Arteriosclerosis, 4:189-195, 1984）が記載した二重損傷モデルを用いて実行した。２回の血管形成術損傷完了後、カテーテルの末端保持注入口が損傷の近位端にくるように、血管形成バルーンをわずかに引き抜いた。損傷の遠位端に結紮を置き、損傷セグメントをヘパリン化生理的食塩水で洗って、ＣＡＴ ＤＮＡ±陽イオン性脂質リポソーム溶液を単離損傷セグメント中に２０分間滴注した。カテーテルを除去し、抗傾斜血流を復帰させた。組換えＣＡＴ発現に関して、２日後に動脈を分析した。この検定は、特定の組織での使用のための特定のサイトフェクチンの構造を最適化するための別のスクリーニング検定を説明する。
実施例１１
筋肉内検定
２８Ｇ １／２針（Becton-Dickinson）、および黄色Eppendorf マイクロピペット先端から切断したプラスチックカラーを備えた使い捨て滅菌プラスチック製インシュリン注射器を用いて、５０μｌのＵＳＰ生理的食塩水中の５０μｇのルシフェラーゼまたはＣＡＴ ＤＮＡ±サイトフェクチンを、拘束覚醒マウスの四頭筋に注射した。カラー長を調整して、直径３ｍｍの大腿直筋の中心部に約２ｍｍの深さまでに針孔貫通を制限した。注射液および注射器を室温に平衡させ、５０μｌ容量の生理的食塩水−ＤＮＡの１回の注射に要する時間は数秒であった。四頭筋群全体（重量１４０〜１８０ｍｇ）を注射後の種々の時間に各マウス足から収集した。実施例３に記載したように、筋肉を凍結させ、溶解した。
自動マイクロプレート発光計（Dynatech Model ML2250）を用いて、ルシフェラーゼ活性を検定した。１００μｌのルシフェラーゼ基質を、発光計の注入系により２０μｌ抽出物に加え、標本の光単位（light unit）を記録した。標本のルシフェラーゼ含量は、非注射筋肉抽出物の存在下で実施した精製ホタルルシフェラーゼの標準曲線を用いて相対光単位（light unit）から算出した。注射筋肉抽出物中に存在するルシフェラーゼ活性は、非注射筋肉抽出物の場合より非常に高かった。
この検定は、特定組織に用いるための特定のサイトフェクチンの構造を最適化するための別のスクリーニング検定を説明する。
これ以上詳細に説明しなくても、前述の説明を用いて、当業者は本発明を十二分に利用し得ると考えられる。本発明は、本質的な特徴を有するその精神を逸脱しない限り、その他の特定の形態で具体化され得る。説明してきた実施態様は本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範囲に示されている。請求の範囲の合法的等価物の意味および範囲内にある修正はすべて、本発明の範囲内に含まれる。
Claims (31)
- 次式の構造：
［式中、Ｒ1およびＲ4は独立で、直鎖のＣ10〜Ｃ23基または分枝鎖のＣ10〜Ｃ23基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ10〜Ｃ23基がアルキル、アシルまたはアルケニル基であり、前記のアルキル、アシルまたはアルケニル基は、置換されていないか又は置換されており、０〜６個の不飽和部分を有し、または環状基もしくはアリール基を含有し、
Ｒ2は、直鎖のＣ1〜Ｃ23基または分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基がアルキル、アシルまたはアルケニル基であり、前記のアルキル、アシルまたはアルケニル基は、置換されていないか又は置換されており、０〜６個の不飽和部分を有し、または環状基もしくはアリール基を含有し、
Ｒ3は、Ｈ，−CO−NH−CH 3 または−CO−CH 2 −NH 2 であり、
Ｙ1およびＹ2は、Ｏであり、
Ｘ1はＯまたはNHであり、
ｍおよびｐは独立で１〜６であり、そして
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンである］を有するピペラジンベースのサイトフェクチン。 - ｍおよびｐが２である、請求項１記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- Ｒ1およびＲ4が、Ｃ10Ｈ21，Ｃ12Ｈ25およびＣ14Ｈ29から成る群から選択される、請求項２記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- Ｒ2は、CH2，（CH2）2，（CH2）3，（CH2）4，（CH2）5および（CH2）6から成る群から選択される、請求項３記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- Ｘ1がＯであり、Ｒ3がＨである、請求項４記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- Ｒ3がＨである、請求項４記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- Ｒ2が（CH2）2であり、Ｘ1がＯであり、そしてＲ3がＨである、請求項４記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- Ｒ2が（CH2）3であり、Ｘ1がNHであり、そしてＲ3がＨである、請求項４記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- Ｒ2が（CH2）4であり、Ｘ1がNHであり、そしてＲ3がＨである、請求項４記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- Ｒ2が（CH2）5であり、Ｘ1がNHであり、そしてＲ3がＨである、請求項４記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- Ｒ2が（CH2）6であり、Ｘ1がNHであり、そしてＲ3がＨである、請求項４記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- Ｒ2が（CH2）3であり、Ｘ1がNHであり、そしてＲ3がCO−CH2−NH2である、請求項４記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- Ｒ2が（CH2）3であり、Ｘ1がNHであり、そしてＲ3がCO−NH−CH3である、請求項４記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- 次式の構造：
［式中、Ｒ1およびＲ4は独立で、直鎖のＣ10〜Ｃ23基または分枝鎖のＣ10〜Ｃ23基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ10〜Ｃ23基がアルキル、アシルまたはアルケニル基であり、前記のアルキル、アシルまたはアルケニル基は、置換されていないか又は置換されており、０〜６個の不飽和部分を有し、または環状基もしくはアリール基を含有し、
Ｒ2およびＲ5は独立で、直鎖のＣ1〜Ｃ23基または分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基であって、前記の直鎖のまたは分枝鎖のＣ1〜Ｃ23基がアルキル、アシルまたはアルケニル基であり、前記のアルキル、アシルまたはアルケニル基は、置換されていないか又は置換されており、０〜６個の不飽和部分を有し、または環状基もしくはアリール基を含有し、
Ｒ3およびＲ6は各々、Ｈであり、
Ｙ1およびＹ2は、Ｏであり、
Ｘ1およびＸ2は独立で、存在しないか、ＯまたはNHであり、
ｍおよびｐは独立で１〜６であり、
Ｗは、製薬上許容可能な陰イオンであり、
Ｘ1もしくはＸ2のいずれか一方が存在するか又はＸ1およびＸ2の両方が存在する］を有するピペラジンベースのサイトフェクチン。 - Ｘ1およびＸ2の両方が存在する、請求項14記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- 両方ではなく、Ｘ1もしくはＸ2のいずれか一方が存在する、請求項14記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- ｍおよびｐが２である、請求項14記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- Ｙ1およびＹ2がＯである、請求項17記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- Ｒ5およびＲ2が、CH2，（CH2）2，（CH2）3，（CH2）4，（CH2）5および（CH2）6から成る群から選択される、請求項18記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- Ｒ1およびＲ4がＣ10Ｈ21，Ｃ12Ｈ25およびＣ14Ｈ29から成る群から選択される、請求項19記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- Ｒ1およびＲ4がＣ12Ｈ25であり、Ｒ2がCH2であり、Ｘ1は存在せず、Ｒ3がＨであり、Ｒ5がCH2CH2CH2であり、Ｘ2がNHであり、そしてＲ6がＨである、請求項20記載のピペラジンベースのサイトフェクチン。
- 細胞中へ分子を導入するインビトロにおける方法であって、
（ａ）有効量の請求項１または請求項14のいずれか１項記載の陽イオン性脂質のいずれかと分子とを接触させて脂質との複合体を形成させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）で形成された脂質複合体と細胞とを接触させて、それにより生物学的有効量の分子を細胞中に挿入する工程と、
を含む導入する方法。 - 前記分子が陰イオン性分子である、請求項22記載の方法。
- 前記複合体が請求項１または請求項14記載の前記陽イオン性脂質の他にさらに１つまたはそれ以上の脂質を含む、請求項22記載の方法。
- 前記脂質が請求項１または請求項14記載の前記陽イオン性脂質の他に、中性脂質、リン脂質およびコレステロールから成る群から選択される、請求項24記載の方法。
- 前記細胞がネズミ肺トランスフェクション、ネズミ腹腔内腫瘍、ネズミ筋肉内、ブタ動脈内、ウサギ動脈内、ランス（Renca）腫瘍または皮下腫瘍の検定から成る群から選択される検定にかけられる、請求項22記載の方法。
- 前記陰イオン性分子がmRNAである、請求項23記載の方法。
- 前記陰イオン性分子がDNAである、請求項23記載の方法。
- 細胞中に分子を導入するのに用いる、請求項１記載の化合物。
- 細胞中に分子を導入するのに用いる、請求項14記載の化合物。
- mRNAまたはDNAと複合体化された請求項14記載のサイトフェクチンを含む複合体。
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