DE69732037T2

DE69732037T2 - Cytofectine abgeleitet von piperazin

Info

Publication number: DE69732037T2
Application number: DE69732037T
Authority: DE
Inventors: J. Carl WHEELER
Original assignee: Vical Inc
Current assignee: Fresh Tracks Therapeutics Inc
Priority date: 1996-10-03
Filing date: 1997-09-24
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2017-09-25
Also published as: JP4230539B2; DE69732037D1; US6022874A; EP0929536A1; ATE285404T1; CA2266781C; JP2001511113A; US5861397A; CA2266781A1; EP0929536B1; WO1998014439A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft komplexe amphiphile Lipide. Sie betrifft insbesondere komplexe kationische amphiphile Lipide, umfassend einen Piperazinring mit einer Kohlenwasserstoffkette, einschließlich mindestens eines Heteroatoms, die mit mindestens einem der Stickstoffatome im Ring verknüpft ist, und lipophile Einheiten, die an die Ringstickstoffatome gebunden sind.
Amphiphile Moleküle können verwendet werden, um intrazellulär therapeutische und bioaktive Moleküle in die Zelle einzubringen. Zum Beispiel offenbart WO 95/14381 die Verwendung von amphiphilen Guanidinderivaten für das intrazelluläre Einbringen von Makromolekülen. Kationische Lipide sind amphiphile Moleküle mit einer lipophilen Region, die im Allgemeinen eine oder mehrere Kohlenwasserstoff- oder Alkylreste umfasst, und einer hydrophilen Region, die mindestens eine positiv geladene polare Kopfgruppe umfasst. Kationische Lipide sind geeignet, um den Transport von Makromolekülen durch die Plasmamembran von Zellen und in das Cytoplasma zu erleichtern. Das Verfahren, das sowohl in vivo als auch in vitro durch geführt werden kann, ist als Transfektion bekannt und die kationischen Lipide, die bei solchen Techniken verwendet werden, sind als Cytofectine bekannt.
Cytofectine, die die Effizienz der Transfektion um ein statistisch wesentliches Ausmaß verbesseren, sind vorteilhaft. Ein nur zweifach größerer Anstieg im Vergleich zur Wirkung, die mit nackter DNA erhalten wird, ist vorteilhaft, obwohl die Effizienz der Transfektion vorzugsweise um das 5–10fache gesteigert wird, und stärker bevorzugt um mehr als das 10fache verbessert wird.
Typischerweise werden die Cytofectine mit einem neutralen zwitterionischen Lipid, wie einem Phospholipid, kombiniert, da gefunden wurde, dass die zwei amphiphilen Lipidspezies in Kombination dazu fähig sind, geordnete Doppelschichten umfassende Vesikel zu bilden, die bei der Transfektion effektiver sind als die Cytofektine alleine. Diese Vesikel oder Liposome haben mehrfach positive Ladungen an der Oberfläche, die es ihnen ermöglichen, einen Komplex mit einem Polynucleotid oder anderen anionischen Molekülen, wie negativ geladenen Proteinen, zu bilden. Verbleibende kationische Nettoladungen an der Oberfläche des Polynucleotid/Cytofectin/neutrales Lipid-Komplexes sind zu starken Wechselwirkungen mit der überwiegenden negativen Ladung der Zellmembranoberfläche fähig.
Abgesehen von den Grundmerkmalen der amphiphilen Eigenschaften und der polaren Kopfgruppe, haben die Cytofectine eine beachtliche strukturelle Verschiedenheit in den lipophilen und den hydrophilen Regionen. Es wurden viele verschiedene Cytofectinspezies für die Verwendung bei der Transfektion synthetisiert und sind nun im Handel erhältlich. Solche Cytofectine schließen zum Beispiel Lipofectin^TM, Lipofectin ACE^TM, LipofectAMINE^TM, Transfeactam^TM und DOTAP^TM ein. Die strukturelle Verschiedenheit von effektiven Cytofectinen spiegelt, teilweise, die Beobachtung wider, dass sich Aspekte der Struktur-Funktion-Erkennung von Cytofectinen im Hinblick auf verschiedene Anwendungen in der Zelle unterscheiden. Erfahrungen mit Cytofectinen, die strukturell den DOTMA-Verbindungen ähnlich sind, zeigen, dass die Transfektionswirkung teilweise von dem transfizierten Zelltyp abhängt (Felgner et al. J. Biol. Chem., 84: 7413–7417, 1987; Wheeler et al. Biochem. Biophys. Acta, 1280: 1–11 (1988)). Insbesondere kationische Lipide mit einer Sperminsubstitution der Aminogruppen zeigten sich als effektiver als DOTMA für die Transfektion von einigen Zelllinien. Dieses Phänomen deutet darauf hin, dass eine wirksame Transfektion nicht nur von der passiven Fusion des kationischen Lipidkomplexes mit der strukturellen Lipiddoppelschicht der Plasmamembran abhängt, sondern auch von spezifischen zellulären Charakteristika und der Wechselwirkung zwischen Zellkomponenten und der einzelnen kationischen Lipidspezies.
Strukturelle Varianten unter den Cytofectinspezies sind daher ein Hinweis auf ein differenzierteres Verständnis der mehrfachen und komplexen Wechselwirkungen von Cytofectinen mit Zellen, und ein Bestreben eines Teils der Forscher Vorteile aus einer oder mehrerer dieser Wechselwirkungen zu ziehen.
Bei DOTMA, N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium, das im US-Patent Nr. 5,049,386 an Epstein offenbart wurde, handelte es sich um eines der ersten entwickelten kationischen Lipide, und die Lipide dieser Gruppe wurden zu Referenzverbindungen bei der vergleichenden Bewertung der Wirkungsstärke von Cytofectinen bei der Entwicklung von neuen strukturellen Varianten. DOTMA-Lipide sind durch eine Propanaminiumgruppe mit einem quaternären Stickstoffatom, das die kationische Stelle des Moleküls bereitstellt, zusammen mit einem Paar von C₁₈-Kohlenwasserstoffen, die über einen Ether mit dem Propylgrundgerüst des Moleküls verknüpft sind, gekennzeichnet. Das quaternäre Stickstoffatom ist mit relativ kürzeren Alkylketten, wie Methylgruppen, dreifach substituiert. Ein strukturell ähnliches kationisches Lipid, 1,2-Bis(oleoyloxy)-3-3-(trimethylammonia)propan (DOTAP), umfasst Acylreste statt über Ether verknüpfte Alkylreste und von ihm wird angenommen, dass es von den Zielzellen einfacher metabolisiert wird.
Einige Spezies kationischer Lipide, zum Beispiel Ammoniumsalze, die direkt durch Alkyl- oder Acylreste substituiert sind, wurden in erster Linie aus ökonomischen Zielsetzungen entwickelt (US-Patent Nr. 5,279,833 an Rose). Andere wurden bei den Bemühungen entwickelt, weniger toxische Wirkungen bereitzustellen; zum Beispiel ein hoch biokompatibeles Cytofectin, das aus Phosphatidylcholin und Sphingomyelin hergestellt wurde: 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin (Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, AL, Kat.-Nr. 890700-706).
Das US-Patent Nr. 5,264,618 an Felgner et al. offenbart Cytofectine, die dem Rosenthalinhibitor (RI) von Phospholipase A (Rosenthal et al. J. Biol. Chem. 235: 2202–2206 (1960)) strukturell ähnlich sind, sowie Diacyl- oder Alkyl/Acylspezies davon. Cytofectine auf der Basis des Rosenthalinhibitors sind dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Substituenten mit der Struktur
haben, der mit einem quaternären Stickstoffatom verknüpft ist.
Die Verbindungsserien auf RI-Basis sind durch die Akronyme mit dem Muster: DORIE (C₁₈); DPRIE (C₁₆) und DMRIE (C₁₄) bekannt. Die Akronyme inplizieren eine allgemeine chemische Grundstruktur, zum Beispiel handelt es sich bei DMRIE (Dimyristoyl-Rosenthal-Inhibitor-Ether) um (+)-1-Propanaminium-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-bromid (CAS-Register: 146659); die anderen unterscheiden sich bezüglich der Alkylgruppensubstituenten. Diese Cytofectine mit einem polaren Hydroxyethylsubstituenten an der quaternären Ammoniumgruppe stellen in vielen Fällen eine effektivere Transfektion bereit als die Verbindungen vom DOTMA-Typ. Eine Untersuchung der Wirkung von variierenden Substituenten an der Hydroxyleinheit und Änderungen in der Alkylkettenlänge auf die Transfektionswirksamkeit der RI-Cytofectine ist in Felgner et al. (J. Biol. Chem. 269: 2550–2561, 1994) dargelegt. Die Untersuchungen zeigten wiederum, dass die optimale Hydroxylalkylkettenlänge vom Zelltyp abhängig ist.
Es wurde gefunden, dass die Überführung von DMRIE in ☐AE-DMRIE (Wheeler et al. 1280 Biochem. Biophys. Acta: 1–11 (1996)) eine wesentliche Wirkung auf die Cytofectinwirksamkeit hat. DMRIE, das benachbart zum primären Alkohol ein quaternäres Stickstoffatom hat und somit eine pH-abhängige positive Ladung überträgt, ist eines der wirksamsten bisher bekannten Cytofectine. Jedoch wurde gefunden, dass der Ersatz des Alkohols an DMRIE durch eine primäre Aminogruppe unter Erhalt von βAE-DMRIE DNA-Komplexe bildet, die sich strukturell von denen unterscheiden, die mit DMRIE gebildet werden, und dass βAE-DMRIE viele Zelllinien in der Abwesenheit von Helfer-Colipiden effektiv transfizieren kann. Die Beobachtung, dass eine einfache Substitution in dem Cytofectinskelett bemerkenswerte Änderungen bei den Transfektionseigenschaften bereitstellen kann, legt es nahe, dass andere Modifikationen ähnliche Verbesserungen bei dem Einbringen von Gene bedingen.
Andauernde Untersuchungen des Transfektionsereignisses zeigen, dass kationische Lipide nicht nur den Eintritt des funktionellen Moleküls in das Cytoplasma der Zelle erleichtern können, sondern auch zusätzliche vorteilhafte Möglichkeiten bereitstellen können; zum Beispiel Schutz des funktionellen Moleküls vor lysosomalem Abbau, Erleichterung des Eintritts in das Kernkompartiment oder sogar Vorbeugung des Abbaus des RNA-Transkriptionsprodukts durch cytoplasmatische Enzyme. Es wird angenommen, dass diese Funktionen der kationischen Moleküle mit spezifischen strukturellen Eigenschaften in Beziehung stehen. Demgemäß besteht ein Bedarf für Cytofectine, die besonders für die Transfektion von fremden Molekülen in spezifische Zelltypen geeignet sind. Es besteht auch ein Bedarf, Cytofectine zu entwickeln, die spezifische intrazelluläre Funktionen ausführen können.
WO 95/14651 offenbart Cytofectine auf Piperazinbasis, in denen die lipophilen Kohlenwasserstoffketten über Ether oder Ester durch einen kurzen Kohlenwasserstofflinker mit den Stickstoffatomen verknüpft sind. Zusätzlich ist mindestens eines der Stickstoffatome auch mit einem Niederalkylrest verknüpft, so dass das Stickstoffatom positiv geladen ist. Jedoch erlauben die Niederalkylreste, die mit den in WO 95/14651 offenbarten Cytokinen verknüpft sind, nicht das Anbringen von zusätzlichen bioaktiven Gruppen an das Cytofectin, wodurch die bioaktiven Gruppen, die zugeführt werden kann, auf solche beschränkt sind die nicht konvalent an das Cytofectin angebracht sind, beschränkt sind. Somit besteht ein Bedarf für Cytofectine, die eine kovalent verknüpfte bioaktive Gruppe zuführen können. Zusätzlich gibt es einen Bedarf für Cytofectine auf Piperazinbasis mit verbesserter Transfektionseffizienz.
Die vorliegende Erfindung betrifft Cytofectine auf Piperazinbasis der folgenden Struktur:
wobei
R₁ und R₄ unabhängig lineare oder verzweigte C₁₀-, C₁₂- oder C₁₄-Reste sind, wobei die Reste Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste sind, wobei die Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste 0 bis 6 Stellen mit Nichtsättigung aufweisen, 0 bis 5 Heteroatome enthalten oder cyclische oder Arylreste enthalten, wobei die cyclischen oder Arylreste 0 bis 5 Heteroatome enthalten;
R₂ ein linearer C₁-C₂₃-Rest oder ein verzweigter C₁-C₂₃-Rest ist, wobei die linearen oder verzweigten C₁-C₂₃-Reste Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste sind, wobei die Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste 0 bis 6 Stellen mit Nichtsättigung aufweisen, 0 bis 5 Heteroatome enthalten oder cyclische oder Arylreste enthalten, wobei die cyclischen oder Arylreste 0 bis 5 Heteroatome enthalten;
R₃ ein Wasserstoffatom ist, R₂ wie oben definiert, eine Aminosäure, ein Peptid, Polypeptid, Protein, eine Nucleinsäure, ein Nucleotid, Nucleosid, Polynucleotid, Polynucleosid, Monosaccharid, Disaccharid, Polysaccharid, eine biologisch wirksame Substanz, ein Arzneimittel oder ein Rest mit der folgenden Struktur ist:
wobei R₇ bis R₁₂ unabhängig abwesend, ein Wasserstoffatom, eine Aminosäure, ein Nucleotid, Polynucleotid, Monosaccharid, Disaccharid, Polysaccharid, eine biologisch wirksame Substanz, ein Arzneimittel, lineare C₁-C₂₃-Reste oder verzweigte C₁-C₂₃-Reste sind, wobei die linearen oder verzweigten C₁-C₂₃-Reste Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste sind, wobei die Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste 0 bis 6 Stellen mit Nichtsättigung aufweisen, 0 bis 5 Heteroatome enthalten oder cyclische oder Arylreste enthalten, wobei die cyclischen oder Arylreste 0 bis 5 Heteroatome enthalten;
G abwesend, O, N, NH, S, SH, Se, C, CH oder CR₁ ist;
T gleich O, N, S, Se oder C ist;
A gleich O, N, S, Se oder C ist;
Y₁ und Y₂ unabhängig O, N, NH, S oder Se sind;
X₁ gleich O, N, NH, S oder Se ist;
m und p unabhängig 1 bis 6 sind; und
W ein pharmazeutisch verträgliches Anion ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Cytofectine der vorstehenden Struktur sind m und p 2. In einem stärker bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform sind Y₁ und Y₂ O. In einer höchst bevorzugten Ausführungsform sind R₁ und R₄ aus C₁₀H₂₁, C₁₂H₂₅ und C₁₄H₂₉ ausgewählt. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist R₂ aus abwesend, CH₂, (CH₂)₂, (CH₂)₃, (CH₂)₄, (CH₂)₅ und (CH₂)₆ ausgewählt. Vorzugsweise ist X₁ aus NH und O ausgewählt.
In weiteren bevorzugten Aspekten der vorstehenden Ausführungsform ist X₁ gleich NH ist und R₃ aus H, CO-NH-CH₃ und CO-CH₂-NH₂ ausgewählt. In einem weiteren bevorzugten Aspekt der vorstehenden Ausführungsform ist X₁ gleich O ist und R₃ gleich H.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt der vorstehenden Ausführungsform ist R₃ gleich H. Andere bevorzugte Verbindungen sind diejenigen, in denen R₂ gleich (CH₂)₂ ist, X₁ gleich O ist und R₃ gleich H ist.
In einem anderen bevorzugten Aspekt der vorstehenden Ausführungsform ist R₂ gleich (CH₂)₃, X₁ gleich NH und R₃ gleich H. Weitere bevorzugte Verbindungen sind diejenigen, in denen R₂ gleich (CH₂)₄ ist, X₁ gleich NH ist und R₃ gleich H ist. In weiteren bevorzugten Verbindungen ist R₂ gleich (CH₂)₅, X₁ gleich NH und R₃ gleich H. In einer weiteren Gruppe von bevorzugten Verbindungen ist R₂ gleich (CH₂)₆, X₁ gleich NH und R₃ gleich H. Noch eine andere Gruppe von bevorzugten Verbindungen sind diejenigen, in denen R₂ gleich (CH₂)₃ ist, X₁ gleich NH ist und R₃ gleich CO-CH₂-NH₂ ist.
In weiteren bevorzugten Verbindungen ist R₂ gleich (CH₂)₃, X₁ gleich NH und R₃ gleich CO-NH-CH₃. In einer anderen Gruppe von bevorzugten Verbindungen ist R₂ gleich (CH₂)₃, X₁ gleich NH und R₃ gleich CO-CH(NH₂)CH₂-CH₂NH₂.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Cytofectine auf Piperazinbasis der folgenden Struktur:
wobei
R₁ und R₄ unabhängig lineare oder verzweigte C₁₀-, C₁₂- oder C₁₄-Reste sind, wobei die Reste Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste sind, wobei die Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteralkylreste 0 bis 6 Stellen mit Nichtsättigung aufweisen, 0 bis 5 Heteroatome enthalten oder cyclische oder Arylreste enthalten, wobei die cyclischen oder Arylreste 0 bis 5 Heteroatome enthalten;
R₂ und R₅ unabhängig ein Wasserstoffatom, lineare C₁-C₂₃-Reste oder verzweigte C₁-C₂₃-Reste sind, wobei die linearen oder verzweigten C₁-C₂₃-Reste Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste sind, wobei die Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste 0 bis 6 Stellen mit Nichtsättigung aufweisen, 0 bis 5 Heteroatome enthalten oder cyclische oder Arylreste enthalten, wobei die cyclischen oder Arylreste 0 bis 5 Heteroatome enthalten;
R₃ und R₆ jeweils unabhängig Wasserstoffatome, R₂ wie oben definiert, eine Aminosäure, ein Peptid, Polypeptid, Protein, eine Nucleinsäure, ein Nucleotid, Nucleosid, Polynucleotid, Polynucleosid, Monosaccharid, Disaccharid, Polysaccharid, eine biologisch wirksame Substanz, ein Arzneimittel oder ein Rest mit der folgenden Struktur ist:
wobei R₇ bis R₁₂ unabhängig abwesend, ein Wasserstoffatom, eine Aminosäure, ein Nucleotid, Polynucleotid, Monosaccharid, Disaccharid, Polysaccharid, eine biologisch wirksame Substanz, ein Arzneimittel, lineare C₁-C₂₃-Reste oder verzweigte C₁-C₂₃-Reste sind, wobei die linearen oder verzweigten C₁-C₂₃-Reste Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste sind, wobei die Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste 0 bis 6 Stellen mit Nichtsättigung aufweisen, 0 bis 5 Heteroatome enthalten oder cyclische oder Arylreste enthalten, wobei die cyclischen oder Arylreste 0 bis 5 Heteroatome enthalten;
G abwesend, O, N, NH, S, SH, Se, C, CH oder CR₁ ist;
T gleich O, N, S, Se oder C ist;
A gleich O, N, S, Se oder C ist;
Y₁ und Y₂ unabhängig O, N, NH, S oder Se sind;
X₁ und X₂ unabhängig abwesend, O, N, NH, S oder Se sind;
m und p unabhängig 1 bis 6 sind;
W ein pharmazeutisch verträgliches Anion ist;
wobei entweder X₁ oder X₂ vorhanden ist oder sowohl X₁ als auch X₂ vorhanden sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind sowohl X₁ als auch X₂ vorhanden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind entweder X₁ oder X₂, aber nicht beide, vorhanden.
In einem bevorzugten Aspekt der vorstehenden Ausführungsform sind m und p 2. Vorzugsweise sind bei diesem bevorzugten Aspekt Y₁ und Y₂ gleich O. Weitere bevorzugte Verbindungen sind diejenigen, in denen R₅ und R₂ aus abwesend, CH₂, (CH₂)₂, (CH₂)₃, (CH₂)₄, (CH₂)₅ und (CH₂)₆ ausgewählt sind. Stärker bevorzugt sind R₁ und R₄ aus C₁₀H₂₁, C₁₂H₂₅ und C₁₄H₂₉ ausgewählt. In höchst bevorzugten Verbindungen sind X₁ und X₂ aus abwesend, NH und O ausgewählt.
In einer Gruppe von bevorzugten Verbindungen sind R₁ und R₄ gleich C₁₂H₂₅, ist R₂ gleich CH₂; ist X₁ abwesend, ist R₃ gleich H, ist R₅ gleich CH₂CH₂CH₂, ist X₂ gleich NH und ist R₆ gleich H.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein in vitro-Verfahren zum Einbringen eines Moleküls in eine Zelle, umfassend die Schritte

(a) Kontaktieren des Moleküls mit einer wirksamen Menge eines der kationischen Lipide mit den vorstehend angegebenen Formeln zur Bildung eines Komplexes mit dem Lipid; und
(b) Kontaktieren einer Zelle unter in vitro-Bedingungen mit dem in Schritt (a) gebildeten Lipid-Komplex;

In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines kationischen Lipids mit den vorstehend angegebenen Formeln zur Herstellung eines Komplexes mit einem in eine Zelle einzubringenden Molekül, wodurch bei Kontakt der Zelle mit dem Komplex das Molekül in die Zelle eingebracht wird.
In einer bevorzugten Ausführung des vorstehenden Verfahren oder der Verwendung ist das Molekül ein anionisches Molekül.
In einem anderen Aspekt des vorstehenden Verfahren oder der Verwendung, schließt der Komplex weiter ein oder mehrere Lipide zusätzlich zu den kationischen Lipiden mit den in den vorstehenden Formeln angegebenen Strukturen ein. Vorzugsweise sind die Lipide zusätzlich zu den kationischen mit den in den vorstehenden Formeln angegebenen Strukturen aus neutralen Lipiden, Phospholipiden und Cholesterin ausgewählt.
In einem Aspekt der Verwendung wird die Zelle unter in vitro-Bedingungen kontaktiert. In einem anderen Aspekt der erfindungsgemäßen Verwendung wird die Zelle unter in vivo-Bedingungen kontaktiert. Vorzugsweise werden die Zellen in einem Test, ausgewählt aus Lungentransfektionstests bei Mäusen, intraperitonealen Tumortests bei Mäusen, intramuskulären Tests bei Mäusen, intraarteriellen Tests bei Schweinen, intraarteriellen Tests bei Kaninchen, Renca-Tumortests oder subkutanen Tumortests, eingesetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens oder der Verwendung ist das anionische Molekül mRNA. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens oder der Verwendung ist das anionische Molekül DNA.
1 zeigt die Synthese von GA-LOE-BP.
2 zeigt die Synthese von Me-GA-LOE-BP.
Die 3A–3D vergleichen die Transfektionseffizienzen von DMRIE und HE-MOE-BP sowohl in COS7- als auch in C2C12-Zellen.
4 stellt eine Analyse der Transfektionseffizienzen von mehreren Cytofectinen auf Piperazinbasis bei den Intralungen- oder intraperitonealen Transfektionstests dar.
5 stellt eine Analyse der Transfektionseffizienzen von mehreren Cytofectinen auf Piperazinbasis mit primären Aminen bei dem Intralungentransfektionstest dar.
6 zeigt die Wirkung der Variation der Alkylkettenlängen der Heteroatomeinheit und der lipophilen Einheit auf die Transfektionseffizienz bei dem Intralungentransfektionstest.
7 stellt eine Analyse der Transfektionseffizienzen von GAP-DLRIE und GA-LOE-BP dar, die relativ zu derjenigen der DNA alleine bei den intraperitonealen und subkutanen Tumortests gemessen wurden.
Es wurde entdeckt, dass quaternäre Stickstoffverbindungen wirksame Cytofectine sind, die als eine Folge ihrer spezifischen Strukturen vorteilhafte Charakteristiken haben. Die vorliegende Erfindung betrifft Cytofectine auf Piperazinbasis, in denen mindestens eines der Ringstickstoffatom quaternisiert ist. Zusätzlich zu den lipophilen Einheiten haben die erfindungsgemäßen Cytofectine eine Kohlenwasserstoffkette, die mindestens ein Heteroatom einschließt und die mit mindestens einem der Ringstickstoffatom verknüpft ist.
Der Einschluss eines Heteroatoms in die Kohlenwasserstoffkette stellt einige Vorteile bereit. Zum Beispiel können die vorliegenden Verbindungen derivatisiert werden, wobei Transfektionsmittel mit der Fähigkeit gebildet werden, spezifischer mit der Zellmembran in Wechselwirkung zu treten und höhere Transfektionsausmaße zu erreichen. Die vorliegenden Verbindungen können an das Abzielen auf Schüsselrezeptoren und Enzyme auf den Zelloberflächen angepasst werden und sind somit für die Verwendung bei der Entdeckung und Ausnutzung von wichtigen Faktoren der molekularen Erkennung geeignet.
Die vorliegenden kationischen Lipide können auch an Substanzen angehängt sein, die intrazellulär eingebracht werden, um einen besonderen biologischen Zweck zu erfüllen. Eine funktionelle Gruppe, wie eine Carbamyl-, Carboxyl-, Ureyl-, Thiol-, Ester-, Ether-, Thioureyl-, Phosphoryl- oder Guanidylgruppe, wird verwendet, um eine auf eine Zelle zielende Einheit oder ein therapeutisches Molekül an das Cytofectin anzubringen. Nachstehend werden verschiedene Typen von abzielenden Einheiten und therapeutischen Einheiten diskutiert.
Zusätzlich oder in einer anderen Ausführungsform können die funktionellen Gruppen als ein Linker verwendet werden, um Gruppen anzubringen, die die polare Ladungsdichte des Cytofectins erhöhen können und somit die Transfektionseffizienz steigern.
Bioaktive Kopfgruppen an den Cytofectinen
(a) Zielspezies
Ein erfindungsgemäßes Cytofectin kann eine molekulare Spezies mit einer auf die biologische Zelle zielenden Wirkung als eine endständige Gruppe umfassen. Innerhalb dieser Klasse befinden sich Cytofectine, die für die Zellrezeptoren spezifische Moleküle umfassen. Typischerweise sind die rezeptorspezifischen Peptide oder Aminosäuren als Amide verknüpft. Beispiele für bevorzugte Peptide, die an die erfindungsgemäßen Cytofectine gebunden sein könnten, schließen die chemotaktischen Peptide Methionin-Leucin-Phenylalanin (Met-Leu-Phe) und pGlu-Pro-His ein. Andere Liganden für Zelloberflächenrezeptoren, die an die erfindungsgemäßen Cytofectine gebunden werden können, umfassen peptidomimetische Analoga; viele Viren bindungs und internalisierungs Proteine; Lactose und andere Di- und Polysaccharide; Acetylcholinanaloga und Folsäurederivate.
(b) Therapeutische Mittel
Ein erfindungsgemäßes Cytofectin kann als eine endständige Gruppe eine bioaktive Molekülspezies umfassen. Ein Beispiel für eine bevorzugte bioaktive Spezies, die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen verknüpft werden könnte, ist das Thyrotropin-Releasing-Hormon pGlutamat-Histidin-Prolin.
(c) Zelluläres und Intrazelluläres Abzielen
Ein erfindungsgemäßes Cytofectin kann als eine endständige Gruppe einen Liganden tragen, der spezifisch an eine Zellmembran oder ein intrazelluläres Ziel binden kann, um die gewünschte physiologische Antwort zu bewirken. Passende Liganden können Peptide umfassen, die virale Epitope, Hormone, Enzymsubstrate, Monosaccharide, Disaccharide, Oligosaccharide, Kohlenhydrate, Cofaktoren, Arzneistoffe, Lectine, Oligonucleotide und Nukleinsäuren sind. Bevorzugte Spezies dieser Gruppe sind Cytofectine, die Chloroquin und andere lysosomotropische Mittel, Kernlokalisierungspeptide, Corticosteroide und virale Peptide oder Proteine umfassen.
(d) Die Transfektionseffizienz beeinflussende Gruppen
Die erfindungsgemäßen Cytofectine können mit Gruppen verknüpft sein, die ihre Transfektionseffizienzen beeinflussen können. Bei solchen Gruppen kann es sich um Aminosäuren, Peptide, Polypeptide, Proteine, Nukleinsäuren, Nucleotide, Polynucleotide, Mono-, Di- oder Polysaccharide handeln. Sowohl klassische als auch nicht-klassische Verknüpfungen zum Anhängen dieser Bausteine an die Cytofectine werden in Erwägung gezogen. Weiterhin können die Aminosäuren, Peptide, Polypeptide und Proteine ungewöhnliche oder abgeänderte Aminosäuren einschließen, die im Allgemeinen nicht in lebenden Organismen gefunden werden. Zu solchen ungewöhnlichen oder abgeänderten Aminosäuren gehören, sind jedoch nicht darauf beschränkt, die abgeänderten und ungewöhnlichen Aminosäure, die in 37 C. F. R. § 1.822 aufgeführt sind. Ferner können solche Aminosäure synthetische Aminosäuren sein, die nicht in der Natur gefunden werden. Es ist beabsichtigt, dass die Ansprüche für die Cytofectine in diesem Patent Verbindungen einschließen, in eine beliebige irgendeine Einheit mit einem Piperazingrundgerüst über eine Heteroatom-Kohlenwasserstoffkette verknüpft ist. Somit werden die Ansprüche nicht durch die Kombination oder Verknüpfung des Cytofectins mit einer anderen Einheit umgangen.
Ferner kann die Heteroatomgruppe alleine die Transfektionseffizienz vorteilhaft beeinflussen. Wie vorstehend im Hinblick auf BAE-DMRIE diskutiert, kann die Identität der Heteroatomgruppe wesentliche Wirkungen auf die Transfektionseffzienz haben.
(e) Formulierungen
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Formulierungen verwendet werden, um Säugerzellen sowohl in vitro als auch in vivo zu transfizieren. Formulierungen für die Transfektion sind Fachleuten bekannt und zusammen mit Verfahren zu ihrer Herstellung offenbart, zum Beispiel im US-Patent Nr. 5,264,618 an Felgner, im US-Patent 5,334,761 an Gebeyehu et al. und in Felgner et al. (J. Biol. Chem. 269: 2550–2561, 1994), die hier durch Bezugnahme aufgenommen werden. Die erfindungsgemäßen kationischen Lipide können mit amphiphatischen Lipiden, wie Phospholipiden, und mit neutralen Lipiden, wie Cholesterin, unter Bildung von Lipidvesikeln, wobei es es sich um Liposome, unilamellare Vesikel, Mizellen oder einfache Filme handeln kann, kombiniert werden.
(f) Verwendung der beanspruchten Verbindungen bei der Gentherapie, Impfungen und Transfektion
Von kationischen Liposomen ist bekannt, dass sie dafür geeignet sind, den Eintritt von Polynucleotiden, Makromolekülen und kleinen Molekülen in die Zellen der Blutgefäße, den systemischen Kreislauf, die Lungenepithelzellen, das Hirngewebe und in Froschembryos (Xenopus) zu erleichtern. Die erfindungsgemäßen kationischen Lipide sind besonders geeignet, die Gentherapie zu erleichtern. Die Verwendung der offenbarten kationischen Lipide zur Erleichterung des Einbringens von mRNA oder DNA in lebende Organismen, wie Vertebraten, einschließlich Vögel, Säuger, Fische und Amphibien wird besonders in Erwägung gezogen. Insbesondere das Einbringen in Menschen oder Haustiere wird in Erwägung gezogen. Über die Verwendung von kationischen Lipiden für diesen Zweck, ebenso wie die Transfektionprotokolle, wird von Nabel et al. (Human Gene Therapy 3: 399–410, 1992), US-Patent Nr. 5,459,127 an Felgner, und Wheeler et al. 1280 Biochem. Biophy. Acta: 1–11 (1996) berichtet.
Die durch die erfindungsgemäßen Cytofectine eingebrachten Polynucleotide kodieren vorzugsweise immunogene oder therapeutische Peptide oder Polypeptide. Dieses Verfahren kann somit sowohl für Polynucleotidimpfungen als auch für die Gentherapie verwendet werden. In den Fällen, in denen die erfindungsgemäßen kationischen Lipide verwendet werden, um DNA in einen Wirtsorganismus einzubringen, kann die DNA zusätzlich zu der Kodierungsregion Sequenzen enthalten, z. B. geeignete Promotoren, wie den CMV-, RSV- oder SV40-Promotor, Ribosombindungsstellen und Polyadenylierungsstellen.
Ebenso wird bemerkt, dass die erfindungsgemäßen Cytofectine geeignet sind, Zellen in vitro zu transfizieren. Obwohl verschiedene Verbindungen im Umfang der vorliegenden Erfindung in vivo einigermaßen gewebespezifisch sind, sind die meistens oder alle für die Transfektion von kultivierten Zellen geeignet. Für jedes einzelnes erfindungsgemäßes Cytofectin kann seine relative Transfektionseffizienz ohne weiteres in vitro und in verschiedenen Geweben in vivo unter Verwendung von Screeningtests, wie den in den Beispielen 2–11 oder anderen Standardtransfektionstests, bestimmt werden. Mit dieser Information kann ein Fachmann ohne weiteres unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Formulierungen und Dosierungen die Erfindung praktisch durchführen.
(h) Repräsentative Cytofectine auf Pigerazinbasis und ihre Nomenklatur
Die nachstehende Tabelle I führt charakteristische Cytofectine auf Piperazinbasis zusammen mit ihren Akronymen auf, die in den folgenden Beispielen verwendet werden. Die in Tabelle I aufgeführten, einfach quaternisierten Verbindungen haben die nachstehend gezeigte Struktur, in der m und p beide gleich 2 sind und Y₁ und Y₂ beide gleich O sind.
Die in Tabelle I aufgeführten, doppelt quaternisierten Verbindungen haben die nachstehend gezeigte Struktur, in der m und p beide gleich 2 sind und Y₁ und Y₂ beide gleich O sind.

Das in der Tabelle I wiedergegebene Nomenklatursystem wird in der vorliegenden Beschreibung einheitlich verwendet. Die Bezeichnung BP bezieht sich auf das Bis-Piperazin-Grundgerüst. Die Akronyme MOE, LOE und DOE beziehen sich auf die lipophilen Einheiten MyristylOxyEthyl (C₁₄H₂₉O(CH₂)₂), LaurylOxyEthyl (C₁₂H₂₅(CH₂)₂) beziehungsweise DecylOxyEthyl. Andere Akronyme beziehen sich auf die Kohlenwasserstoffkette mit mindestens einem Heteroatom wie folgt:
HE = Hydroxyethyl; GA = gamma-Amino; DA = delta-Amino; FA = funf-Amino; HA = Hexylamino; Me = Methyl; Gly-G = Glycinamid; DAB = 2,4-Diaminobuttersäureamid; DiMe = Dimethyl und GMU = gamma-Methylharnstoff. Tabelle I Einfach quaternisierte Verbindungen

C-14-Alkylketten,	R₁ und R₄ = C₁₄H₂₉
HE-MOE-BP	R₂ = CH₂CH₂; X₁ = O; R₃ = H
GA-MOE-BP	R₂ = CH₂CH₂CH₂; X₁= NH; R₃ = H
DAB-G-MOE-BP	R₂ = (CH₂)₃; X₁= NH; R₃ = CO-CH(NH₂)-CH₂-CH₂-NH₂

C-12 Alkylketten,	R₁ und R₄ = C₁₂H₂₅
Me-LOE-BP	R₂ = CH₃; X₁ = abwesend; R₃ = abwesend
HE-LOE-BP	R₂ = CH₂CH₂; X₁ = O; R₃ = H
GA-LOE-BP	R₂ = CH₂CH₂CH₂; X₁ = NH; R₃ = H
DA-LOE-BP	R₂ = CH₂CH₂CH₂CH₂; X₁ = NH; R₃ = H
FA-LOE-BP	R₂ = CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂; X₁ = NH; R₃ = H
HA-LOE-BP	R₂ = CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂; X₁ = NH; R₃ = H
Gly-G-LOE-BP	R₂ = CH₂CH₂CH₂; X₁ = NH; R₃ = CO-CH₂NH₂
GMU-LOE-BP	R₂ = CH₂CH₂CH₂; X₁ = NH; R₃ = CO-NH-CH₃

C-10 Alkylketten,	R₁ und R₄ = C₁₀H₂₁
HE-DOE-BP	R₂ = CH₂CH₂; X₁ = O; R₃ = H
GA-DOE-BP	R₂ = CH₂CH₂CH₂; X₁ = NH; R₃ = H
DA-DOE-BP	R₂ = CH₂CH₂CH₂CH₂; X₁ = NH; R₃ = H

Doppelt quaternisierte Verbindungen

R₃ und R₄ = C₁₂H₂₅
DiMe-LOE-BP	R₂ und R₅ = CH₃; X₁, X₂, R₃ und R₆ = abwesend
Me, GA-LOE-BP	R₂ = CH₃; X₁ und R₃ = abwesend; R₅ = CH₂CH₂CH₂; X₂ = NH; R₆ = H

Fachleute werden richtig einschätzen, dass die in der Tabelle I aufgeführten Verbindungen für die erfindungsgemäßen Verbindungen repräsentativ sind und dass die vorliegende Erfindung nicht auf die Verbindung in Tabelle I beschränkt ist. Zusätzlich werden Fachleute richtig einschätzen, dass die doppelt quaternisierten Piperazin-Cytofectine mit verschiedenen Kombinationen der in der Tabelle I aufgeführten Substituenten im Hinblick auf die einfach quaternisierten Verbindungen von der vorliegenden Erfindung besonders in Erwägung gezogen werden.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlich unter Verwendung der folgenden Beispiele beschrieben, jedoch sind die offenbarten Verfahren für die Herstellung aller kationoschen Lipide, die durch den Umfang der Erfindung abgedeckt werden, anwendbar und nicht auf die Beispiele beschränkt. Alle Temperaturangaben, die in den Beispielen angegeben sind sind in Grad Celsius und nicht korrigiert.
BEISPIEL 1
Synthese von Bispiperazin-Cytofectinen
Die nachstehend beschriebenen chemischen Umsetzungen werden hinsichtlich ihrer allgemeinen Anwendung auf die Herstellung erfindungsgemäßer kationischer Lipide offenbart. Gelegentlich kann die Umsetzung nicht auf alle molekularen Spezies innerhalb des offenbarten Umfangs wie beschrieben anwendbar sein. Die Verbindungen, bei denen dies auftritt, werden von Fachleuten ohne weiteres erkannt werden. In allen diesen Fällen können die Umsetzungen erfolgreich durchgeführt werden, entweder nach herkömmlichen Abänderungen, die Fachleuten bekannt sind, das heißt durch Wechsel zu alternativen herkömmlichen Reagenzien, oder durch Routineabänderungen der Reaktionsbedingungen. Alternativ werden andere Umsetzungen, die hierin, in den zitieren Referenzen, die die Synthese von anderen Cytofectinklassen betreffen, wie die DOTMA-Verbindungen von Felgner et al. J. Biol. Chem. 84: 7413–7417, 1987, oder in der herkömmlichen chemischen Literatur offenbart sind, für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen anwendbar sein. Bei allen präparativen Verfahren sind die Ausgangsmaterialien bekannt oder ohne weiteres aus bekannten Ausgangsmaterialien herstellbar.
A. Synthese einer repräsentativen einfach quaternisierten Verbindung (GA-LOE-BP)
Das folgende Beispiel wird als eine repräsentative Synthese eines einfach quaternisierten Cytofectins auf Piperazinbasis bereitgestellt. Fachleute werden anerkennen, dass die Synthese von Cytofectinen auf Piperazinbasis mit anderen Gruppen als einer Laurylgruppe, die mit dem Piperazingrundgerüst verknüpft sind, ohne weiteres ausgeführt werden kann, indem lediglich das Alkylmethansulfonat durch das gewünschte ersetzt wird, zum Beispiel Myristylmethansulfonat oder Decylmethansulfonat anstelle von Dodecylmethansulfonat in der folgenden Synthese. Auf ähnliche Art und Weise kann, wenn es erwünscht ist, ein Cytofectin auf Piperazinbasis zu synthetisieren, in dem die lipophile Kette mit der Piperazingrundgerüst über eine Aminbindung verknüpft ist, einfach das Bishydroxyethylpiperazin in der nachstehenden Synthese durch Bis-aminoethylpiperazin ersetzt werden.
N,N¹-Bis-(2-dodecyloxyethyl) piperazin [LOE-BP]
Ein mit einen Magnetrührer ausgestatteter trockener Kolben wurde unter einer Argonatmosphäre gehalten und dann mit Natriumhydrid (60% in Öl, 1,47 g, 37 mmol) beschickt. Nach dem Verreiben mit trockenem Hexan (4 × 15 ml) wurde wasserfreies Tetrahydrofuran zugegeben und das Rühren wurde begonnen, wobei eine dünne Aufschlammung erhalten wurde. Bis-hydroxyethylpiperazin (2,79 g, 16 mmol) wurde auf ein Mal als ein Feststoff zugegeben, danach wurde das Reaktionsgemisch auf Rückfluss erhitzt und bei dieser Temperatur über Nacht gehalten. Zu der unter Rückfluss siedenden Aufschlammung wurde eine Lösung aus Dodecylmethansulfonat (10,2 g, 38 mmol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (25 ml) gegeben und das Reaktionsgemisch wurde weitere drei Tage unter Rückfluss gehalten. Die Reaktion wurde abgekühlt und die Aufschlammung wurde unter Vakuum durch einen 1 cm Celite-Stopfen filtriert, wobei das Reaktionsgefäß und die Filtrationsapparatur mit Tetrahydrofuran (100 ml) gespült wurde. Die Filtrate wurden vereinigt, dann eingedampft und der Rückstand wurde zwischen Ethylether (230 ml) und 0,2 N Natriumhydroxidlösung (50 ml) verteilt. Die Phasen wurden getrennt und die organische Schicht wurde zwei Mal mit Wasser (50 ml) gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde durch Filterpapier filtriert und das Filtrat wurde eingedampft, wobei das Rohprodukt erhalten wurde. Die Säulenchromatografie über Silicagel unter Verwendung einer Stufengradientenelution von 1 : 9 Ether : Hexan bis zu reinem Ether ergab ein laut DC homogenes Material (3,6 g, 44%).
¹H-NMR (300 mHz, CDCl₃, TMS); ☐ = 3,54 (t, J = 6 Hz, 4H), 3,41 (t, J = 6,6 Hz, 4H), 2,26–2,55 (überlappendes m, 12H), 1,55 (m, 4H), 1,26 (s, 36H), 0,88 (t, J = 6,6 Hz, 6H).
IR (KBr Pressling): cm^–1 2900, 2840, 1460, 1295, 1320, 1115, 715.
(±)-N-(3-Phthalimido)propyl-N,N'-(bis-2-dodecyloxyethyl)piperaziniumbromid [☐-Phth-LOE-BP]
In einem trockenen Kolben wurden LOE-BP (2,16 g, 4,2 mmol), wasserfreies Dimethylformamid (10 ml) und N-(3-Brompropyl)phthalimid (1,42 g, 5,3 mmol) in der angegebenen Reihenfolge unter Beibehaltung einer Argonatmosphäre vereinigt. Der Kolben wurde fest verschlossen und dann in ein Ölbad eingetaucht, das zuvor auf 105°C eingestellt war, und das Rühren mit einem Magnetrührer wurde begonnen. Die Lösung wurde innerhalb von 2 Minuten homogen. Nach 3tägigem Rühren bei der angegebenen Temperatur wurde die Reaktion abgekühlt und das Lösungsmittel wurde durch Vakuumdestillation entfernt. Die Chromatografie des Rückstands über Silicagel (90 : 10 : 0,25 : 0,25 Chloroform : Methanol : Ammoniumhydroxid : Wasser, isokratische Elution) ergab ein laut DC homogenes Material (1,70 g, 52%).
¹H-NMR (300 mHz, CDCl₃, TMS); ☐ = 7,86 (m, 2H), 7,75 (m, 2H), 4,16 (m, 2H), 3,95 (m, 2H), 3,87–3,82 (überlappendes m, 4H), 3,72 (m, 2H), 3,54–3,45 (überlappendes m, 4H), 3,39 (t, J = 6,6 Hz, 4H), 2,97 (m, 2H), 2,90 (m, 2H), 2,70 (t, J = 5 Hz, 2H), 2,31 (m, 2H), 1,54–1,45 (m, 4H), 1,25 (s, 36H), 0,88 (t, J = 6,6 Hz, 6H).
IR (Schmelze, Film auf NaCl): cm^–1 2900, 2850, 1770, 1700, 1460, 1390, 1365, 1110, 715.
(±)-N-(3-Aminopropyl)-N,N'-bis-(dodecyloxyethyl)piperaziniumbromid ["GA-LOE-BP"]
Eine Lösung aus ☐-Phth-LOE-BP (1,77 g, 2,27 mmol) in absolutem Ethanol (33 ml) wurde unter Rühren bei Umgebungstemperatur hergestellt. Zu dem klaren Gemisch wurde in einem gleichmäßigem Strom wasserfreies Hydrazin (1,6 ml, 51 mmol) zugegeben. Der Kolben wurde dann mit Argon durchspült, fest verschlossen und über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach diesem Zeitraum wurde die dicke Aufschlammung mit Chloroform (65 ml) verdünnt, etwa 30 Minuten gerührt und dann durch eine mittlere Glasfritte filtriert. Das Reaktiongefäß und die Filtrationsapparatur wurden mit weiteren 65 ml Chloroform in zwei Portionen gespült. Die vereinigten Filtrate wurden unter Vakuum bei weniger als 40°C auf ein kleines Volumen eingedampft. Der Rückstand wurde dann zwischen Chloroform (350 ml) und 0,1 N Natriumhydroxidlösung (150 ml) verteilt. Die wässrige Phase wurde noch zwei Mal mit Chloroform (150 ml, dann 125 ml) gewaschen und die vereinigten organischen Phasen wurden über wasserfreiem Natriumsulfat über Nacht getrocknet. Die klare Lösung wurde dann durch Filterpapier filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde über Nacht mit Hochvakuum behandelt, dann in Chloroform (10 ml) gelöst und durch einen 0,2 μ-PTFE-Filter filtriert. Das Filtrat wurde eingedampft und der Rückstand wurde über Nacht mit Hochvakuum behandelt, wobei 1,37 g (93%) laut DC homogenes Material erhalten wurden (mit Amin überzogenes Silicagel, 85 : 15 : 0,25 : 0,25 Chloroform : Methanol : Ammoniumhydroxid : Wasser, R_f = 0,51).
¹H-NMR (300 mHz, CDCl₃, TMS); ☐ = 4,01 (m, 2H), 3,93–3,74 (überlappendes m, 6H) 3,62–3,50 (überlappendes m, 4H), 3,46 (t, J = 6,6 Hz), 3,40 (t, J = 6,7 Hz, 2H), 2,94 (t, J = 4,7 Hz, 4H), 2,88 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 2,71 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 2,0 (m, 2H), 1,55 (m, 4H), 1,26 (s, 36H), 0,88 (t, J = 6,3 Hz, 6H).
IR (Schmelze, Film auf NaCl): cm^–1 3400 (br), 3300 (s), 1520, 1360, 1110, 715.
Das Syntheseschema für GA-LOE-BP ist in 1 dargestellt.
B. Synthese einer repräsentativen zweifach quaternisierten Verbindung (Me-GA-LOE-BP)
N,N¹-Bis-(2-dodecyloxyethyl)piperazin [LOE-BP] und (±)-N-(3-Phthalimido)propyl-N,N'-(bis-2-dodecyloxyethyl)piperaziniumbromid [☐-Phth-LOE-BP] wurden wie vorstehend beschrieben hergestellt.
(+)-N-Methyl-N'-(3-phthalimido)propyl-N,N'-(bis-2-dodecyloxyethyl)piperaziniumbromid [Me-☐-Phth-LOE-BP]
In einem trockenen Kolben wurden ☐-Phth-LOE-BP (0,44 g, 0,56 mmol), Dimethylformamid (1,3 ml) und Methyliodid (0,15 ml, 0,342 g, 3 mmol) vereinigt. Der Kolben wurde fest verschlossen und dann in ein Ölbad eingetaucht, das zuvor auf 105°C eingestellt war, und das Rühren mit einem Magnetrührer wurde begonnen. Nach 3tägigem Rühren bei der angegebenen Temperatur wurde das Reaktionsgemisch abgekühlt und das Lösungsmittel wurde durch Vakuumdestillation entfernt. Die Chromatografie des Rückstands über Silicagel (90 : 10 : 0,25 : 0,25 bis 85 : 15 : 0,25 : 0,25 Chloroform : Methanol : Ammoniumhydroxid : Wasser, Stufengradient) ergab ein laut DC homogenes Material (0,336 g, 67%) (Silicagel 80 : 20 : 0,25 : 0,25 Chloroform : Methanol : Ammoniumhydroxid : Wasser, R_f = 0,28).
¹H-NMR (300 mHz, CDCl₃, TMS); ☐ = 7,84 (m, 2H), 7,73 (m, 2H), 4,7–4,3 (überlappendes m, 14H), 3,9 (überlappendes m, 9H), 3,5–3,4 (überlappendes m, 4H), 2,34 (m, 2H), 1,54–1,45 (m, 4H), 1,25 (s, 36H), 0,88 (t, J = 6,2 Hz, 6H).
IR (KBr): cm^–1 2920, 2850, 1770, 1710, 1460, 1390, 1360, 1120, 715.
(+)-N-(3-Aminopropyl)-N'-methyl-N,N'-(bis-2-dodecyloxyethyl)piperaziniumbromid [GA-Me-LOE-BP]
Eine Lösung aus Me-☐-Phth-LOE-BP (0,32 g, 0,49 mmol) in absolutem Ethanol (10 ml) und Chloroform (5 ml) wurde unter Rühren bei Umgebungstemperatur hergestellt. Zu der klaren Lösung wurde in einem gleichmäßigem Strom wasserfreies Hydrazin (0,3 ml, 9,6 mmol) zugegeben. Der Kolben wurde dann mit Argon durchspült, fest verschlossen und über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach diesem Zeitraum wurde die dicke Aufschlammung mit Chloroform (30 ml) verdünnt und etwa 30 Minuten gerührt und dann durch eine mittlere Glasfritte filtriert. Das Reaktiongefäß und und die Filtrationsapparatur wurden mit weiteren 60 ml Chloroform in zwei Portionen gespült. Die vereinigten Filtrate wurden unter Vakuum bei weniger als 40°C auf ein kleines Volumen eingedampft. Chloroform (100 ml) wurde zugegeben und dann unter Vakuum entfernt und der Rückstand wurde 4 Tage unter Hochvakuum gegeben. Der weiße Feststoff wurde dann in 9 : 1 Chloroform : Methanol (20 ml) gelöst und durch einen 0,2 μ-PTFE-Filter filtriert. Das Filtrat wurde eingedampft und der Rückstand wurde über Nacht mit Hochvakuum behandelt, wobei ein spröder weißer Feststoff erhalten wurde. Dieser Rückstand wurde in Chloroform : Methanol (110 ml, 8 : 3-Verhältnis) gelöst und mit 0,2 N Natriumhydroxidlösung (30 ml) gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Chloroform (15 ml) gewaschen und die vereinigten organischen Phasen wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die klare Lösung wurden dann durch Filterpapier filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde über Nacht mit Hochvakuum behandelt, dann in reinem Chloroform (10 ml) gelöst und durch einen 0,2 μ-PTFE-Filter filtriert. Das Filtrat wurde eingedampft und der Rückstand wurde über Nacht mit Hochvakuum behandelt, wobei das Produkt erhalten wurde (0,23 g, 59%).
¹H-NMR (300 mHz, CDCl₃, TMS); ☐ = 4,7–4,3 (überlappendes m, 14H), 3,9 (überlappendes m, 5H), 3,6–3,3 (überlappendes m, 6H), 2,7–2,4 (überlappendes m, 6H), 1,54–1,45 (m, 4H), 1,25 (s, 36H), 0,88 (t, J = 6,2 Hz, 6H).
IR (Schmelze, Film auf NaCl): cm^–1 3400 (br), 2910, 2840, 1630, 1455, 1365, 1110, 715.
2 zeigt das Reaktionsschema für die Synthese eines repräsentativen, doppelt quaternisierten Cytofectins auf Piperazinbasis, Me-GA-LOE-BP.
Fachleute werden erkennen, dass die vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet werden können, um eine Vielzahl von doppelt quaternisierten Cytofectinen auf Piperazinbasis herzustellen. Die an jedes der quaternisierten Stickstoffatome angebrachten nicht-lipophilen Einheiten können identisch oder verschieden sein. In einer Ausführungsform der vorliegenden, doppelt quaternisierten Cytofectine sind beide nicht-lipophilen Einheiten, die an den quaternisierten Stickstoffatomen angebracht sind, Heteroatomeinheiten. In einer alternativen Ausführungsform ist nur eine der nicht-lipophilen Einheiten eine Heteroatomeinheit.
Natürlich sind sich Fachleute darüber bewußt, dass in dem Fall, in dem die Moleküle mehr als eine reaktive funktionelle Gruppe haben, es nötig ist, eine oder mehrere dieser Gruppen, die nicht bei der einzelnen Kupplungsreaktion beteiligt sein sollen, zu blockieren oder zu maskieren. Die Synthese in Verknüpfung mit dem Screening kann angewendet werden, um wirkungsvoll die wirksamsten Cytofectine für eine definierte Anwendung auszuwählen.
BEISPIEL 2
Wirkung der Formulierung auf die in vitro-Transfektion: Vergleich von HE-MOE-BP mit DMRIE
Cytofectin: Lösungen eines ausgewählten Cytofectins in Chloroform wurden auf der Basis von Gewicht zu Volumen (w/v) hergestellt. Aliquote Mengen an kationischem Lipid und neutralem Lipid (wenn es verwendet wurde) wurden aseptisch in sterile Fläschen gefüllt, und zwar in einer Menge, die berechnet wurde, um die relativen und absoluten Lipidkonzentrationen bereitzustellen, die bei der Wiederherstellung mit 1 ml wässrigem Träger gewünscht sind. Der Großteil des Chloroforms wurden mit einem Strom aus trockenem Stickstoff entfernt, und die Fläschchen wurden über Nacht mit Hochvakuum behandelt, um alle verbliebenen Lösungsmittel zu entfernen.
DNA-Lipid-Komplexe: Plasmid-DNA mit 5 mg/ml Phosphat-gepufferer Kochsalzlösung (PBS) wurde ebenso wie das getrocknete, formulierte Cytofectin-neutrales Lipid-Gemisch in OPTIMEM^TM (Gibco BRL) suspendiert und wie angegeben auf Platten mit 96 Vertiefungen im gewünschten Massen/molaren Verhältnis gemischt. Die DNA-Lipid-Komplexe wurden innerhalb von 2 Stunden nach dem Mischen zu den Zellen gegeben.
Transfektion
Zelllinien: Die verwendeten Zelllinien wurden wie folgt von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) erhalten: COS7 Nierenzellen von Affen (ATCC CRL 1651) und C2C12 Myoblastmuskelzellen von Mäusen (ATCC CRL 1772).
Alle Zellen wurden im Verhältnis 1 : 5 bis 1 : 10 in 10%iges fötales Rinderserum (FBS) und Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) passagiert. Alle Zellen wurden nach Erhalt durch 10 Verdopplungspassagen expandiert und aliquote Mengen wurden gefroren gelagert. Nach Re-Expansion wurden alle Zellen vor weiteren 10 Passagen für die Transfektionsuntersuchungen verwendet.
Transfektionstests: Am Tag 0 wurden 20000 Zellen in 100 Mikroliter 10% EBS/90% DMEM in jede Vertiefung einer -Kulturplatte mit 96 Vertiefungen (Nunc) ausgesät und über Nacht in einem Inkubator 5% CO₂ bei 37°C inkubiert. Am Tag 1 wurde das Medium vorsichtig abgesaugt, ohne die Zellen zu entfernen, und es wurden 100 Mikroliter HE-MOE-BP/pRSV lacZ/DOPE in serumfreiem OPTIMEM^TM (Gibco BRL) zugegeben. DMRIE wurde als Standardreferenz verwendet. Das lacZ-Gen kodiert das Enzym ☐-Galaktosidase, das kalorimetrisch getestet werden kann. Das Verhältnis von kationischem Lipid : DOPE variierte für jede Vertiefung. Nach 4stündiger Kultur wurden in jede Vertiefung 50 Mikroliter 30% EBS/70% OPTIMEM^TM gegeben. Am Tag 2 erhielt jede Vertiefung 100 Mikroliter 10% EBS/90% OPTIMEM^TM. Am Tag 3 wurde das Medium entfernt und 50 Mikroliter Lyse-Puffer (0,1% Triton-X100 in 250 mM Tris, pH 8,0) wurden zugegeben und die Platten wurden mindestens 20 Stunden bei 70°C gelagert. Nach dem Auftauen wurden die Medien in den Vertiefungen auf ihren Gehalt an ☐-Galaktosidase-Enzymwirkung nach Felgner et al. (J. Biol. Chem. 269: 2550–2561, 1994) getestet.
Die Ergebnisse (3A–3D) zeigen, dass sowohl die Gesamtexpression als auch die Peakexpression von ☐-Gal in COS7-Zellen bei einem HE-MOE-BP : DOPE-Verhältnis von 50 : 50 und in C2C12-Zellen bei einem HE-MOE-BP : DOPE-Verhältnis von 25 : 75 optimal waren. HE-MOE-BP wurden in diesen in vitro-Tests vorteilhaft mit DMRIE verglichen. Diese Experimente zeigen, dass die vorliegenden Cytofectine auf Piperazinbasis einen wirkungsvollen Transfer von DNA über die Zellmembran in vitro unterstützen, gefolgt von der funktionalen Expression des Gens innerhalb der Zelle. Der in diesen Tests verwendete Screeningtest ist geeignet, um die Transfektionswirkung zu zeigen und das Verhältnis Cytofectin/Colipid zu optimieren.
BEISPIEL 3
Analyse von Cytofectinen auf Piperazinbasis in einem Intralungentransfektionstest und einem intraperitonealen Transfektionstest
A. Intralungentransfektionstest
Erwachsene (4–16 Wochen alte) weibliche BALB/c-Mäuse wurden mit Metophan leicht anästhetisiert und ihnen wurden 132 μg Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) DNA ± kationisches Lipid in 100 μl USP-Kochsalzlösung oder Wasser intranasal unter Verwendung einer sterilen Insulineinwegspritze aus Plastik, die mit einem kleinen Plastikkatheder ausgerüstet war, verabreicht. Die kationischen Lipide wurden mit 1 molaren Äquivalent DOPE in Chloroform gemischt, das Lösungsmittel wurde verdampft und dann wurde der Rückstand mit Hochvakuum behandelt, wobei ein Lipidfilm erhalten wurde. Die kationischen Liposome wurden hergestellt, indem Wasser zu diesem Film gegeben und etwa 1 Minute gründlich verwirbelt wurde. Passende Volumina von Plasmid-DNA in Wasser und kationische Liposome in Wasser wurden bei Umgebungstemperatur vereinigt und etwa 30 Sekunden gründlich verwirbelt, um Komplexe in einem Verhältnis von 2 : 1 (mol : mol) Nucleotid : Cytofectin zu erhalten. Alle Flüssigkeiten und Spritzen wurden auf Raumtemperatur eingestellt und die Verabreichung der einmaligen Volumeneinheit von 100 μl benötige weniger als eine Minute. Zwei oder drei Tage nach der Verabreichung wurden die Mäuse durch eine Natriumpentobarbitalüberdosis getötet und die Lungen wurden wie folgt extrahiert.
Die Lungen wurden sofort gefroren und bei –78°C gelagert. Die gefrorenen Lungen wurden einzeln zu einem feinen Pulver pulverisiert, indem sie über 0,4 ml gefrorenem Lysepuffer in einem 1,5 ml-Röhrchen unter Verwendung eines reversiblen Bohrers und eines Bohrmeißels, der genau in das Röhrchen passt, vermahlen wurden, und das Pulver wurde bis zur Extraktion in dem gleichen Röhrchen bei –78°C gelagert. Die gefrorenen Pulver wurden aufgetaut und zu jedem wurden 100 μl Reporter Lysepuffer von Promega (Katalog #E397A) gegeben. Die Proben wurden 15 Minuten gründlich verwirbelt, drei Mal einem Einfrier/Auftau-Verfahren unterzogen, indem abwechselnd ein Bad aus flüssigem Stickstoff und ein Wasserbad bei Raumtemperatur verwendet wurde, und drei Minuten bei 10000 × g zentrifugiert wurden. Der Überstand wurde in ein anderes 1,5 ml-Röhrchen überführt und das Extraktionsverfahren wurde wiederholt (ohne das Einfrier/Auftau-Verfahren), nachdem zu dem Pellet weitere 500 μl Lysepuffer gegeben wurden. Der zweite Überstand wurde mit dem ersten vereinigt und bei –78°C gelagert.
Die verwendeten kationischen Lipide auf Piperazinbasis waren HE-MOE-BP; GA-MOE-BP; GA-LOE-BP und BA-LOE-BP. GAP-DLRIE wurde für Vergleichszwecken verwendet.
CAT-Tests wurden mittels des radioaktiven Verteilungsverfahrens von Sankaran (Anal. Biochem., 200: 180–186, 1992) oder unter Verwendung eines CAT-ELISA-Kits (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) durchgeführt. Kurz zusammengefaßt wurden die CAT-Gewebehomogenisate durch dreimaliges Einfrieren und Auftauen in einem Ethanol/Trockeneisbad aufgespalten. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren entfernt und der Proteinextrakt wurde mit ¹⁴C-Chloramphenicol und Acetyl-CoA inkubiert. Das Chloramphenicol wurde mit Ethylacetat extrahiert und es wurde eine Dünnschichtchromatografie durchgeführt, um den prozentualen Anteil von ¹⁴C-Chloramphenicol, das durch das extrahierte Zellprotein überführt wurde, zu bestimmen. Die Zellextrakte wurden auf 2 μg Protein, das für 20 Minuten inkubiert wurde, standardisiert. Die Gewebeextrakte wurden auf 200 μg Protein, das für vier Stunden inkubiert wurde, standardisiert.
Unter Verwendung von gereinigtem Enzym (Sigma, St. Louis, MO), das in die Lungenextrakte geimpft wurde, oder von dem im ELISA-Kit bereitgestelltem Enzym wurden Standardkurven erstellt. Die beiden CAT-Testverfahren ergaben äquivalente pg CAT-Werte für die Probe aus dem gleichen Satz von Extrakten.
B. Intraperitonealer Transfektionstest
Die Transfektionseffizienzen der Cytofectine auf Piperazinbasis, die in dem vorstehenden Intralungentest getestet wurden, wurden auch in dem intraperitonealen Modell bei Mäusen bewertet. Zweihunderttausend B16-Tumorzellen von Mäusen in 500 μl RPMI wurden am Tag 0 intraperitoneal C57/B16-Mäusen injiziert. An den Tagen 7–14 wurde den Mäusen intraperitoneal eine DNA/Cytofectin/Kochsalzlösung injiziert. 0,5 mg DNA wurden mit verschiedenen Cytofectinen in einem molaren Verhältnis von 10 : 1 von DNA : Cytofectin in 1,5 ml Kochsalzlösung gemischt. Zwei Tage nach der Injektion von DNA wurden die Tumore gesammelt, extrahiert und wie vorstehend für den Lungentest beschrieben auf die CAT-Wirkung getestet.
C. Ergebnisse
Die mit HE-MOE-BP, HE-LOE-BP, GA-MOE-BP, GA-LOE-BP und BA-LOE-BP erhaltenen Ergebnisse in dem Lungentransfektionstest und dem intraperitonealen Transfektionstest sind in 4 zusammengefasst. Bei dem Intralungentest stellen GA-LOE-BP und BA-LOE-BP größere Transfektionseffizienzen bereit als GAP-DLRIE. HE-LOE-BP, GA-MOE-BP und HE-MOE-BP waren bei dem Intralungentest weniger wirksam.
Bei dem intraperitonealen Test stellt GA-LOE-BP die größte Transfektionseffizienz der getesteten Cytofectine auf Piperazinbasis bereit, jedoch war die Transfektionseffizienz nicht so hoch wie diejenige, die mit GAP-DLRIE in diesem Test erreicht wurde. Die restlichen Cytofectine auf Piperazinbasis, die getestet wurden, stellten bei dem intraperitonealen Test eine geringe Wirkung bereit.
Die Tests, über die hier berichtet wird, zeigen nicht nur, dass die beanspruchten Verbindungen bei der Transfektion wirksam sind, sondern zeigen auch, wie Cytofectine für die Transfektion von bestimmten Geweben ausgewählt und optimiert werden. Obwohl für diesen Test ohne weiteres bestimmte optimale Strukturen deutlich werden, wird es richtig eingeschätzt werden, dass diese Ergebnisse gewebespezifisch sind; anders ausgedrückt, selbst Cytofectine, die in diesem Test nicht ganz optimal arbeiten, können sie in anderen Test nützliche Wirkungen haben, wie bei der in vitro-Transfektion, den intraperitonealen Tumortests bei Mäusen, den intramuskulären Tests bei Mäusen, intraarteriellen Tests bei Schweinen und Kaninchen, allgemeinen subkutanen Tumortests oder Renca-Tumortests.
BEISPIEL 4
Analyse von Cytofectinen auf Piperazinbasis mit primären Aminen
Bei der DMRIE-Klasse von Cytofectinen stellt der Ersatz einer Alkoholgruppe durch ein primäres Amin eine erhöhte Transfektionseffizienz bereit (Wheeler et al., 1280 Biochem. Biophys. Acta: 1–11 (1996)). Aus diesem Grund wurden die Transfektionseffizienzen von Cytofectinen auf Piperazinbasis mit einem primären Amin, das an ein quaternäres Stickstoffatom gebunden ist, relativ zu den Transfektionseffizienzen von DNA alleine in dem Intralungentest bewertet. Der Intralungentest wurde wie im vorstehenden Beispiel 3 durchgeführt. Als eine Kontrolle wurde die Transfektionseffizienz, die mit 132 μg DNA alleine erhalten wurde, bestimmt.
5 zeigt die Ergebnisse dieses Vergleichs. Sowohl GA-LOE und Gly-G-LOE, die beide ein primäres Amin haben, stellten wesentlich größere Transfektionspiegel bereit als DNA alleine. Die Transfektionseffizienz, die mit GMU-LOE erhalten wurde, war nicht so groß wie diejenigen von Cytofectinen mit einem primären Amin, war jedoch relativ zu derjenigen, die mit DNA alleine erhalten wurde, erhöht.
BEISPIEL 5
Wirkung der Variation der Alkylkettenlänge der Heteroatomeinheit und der lipophilen Einheit auf die Transfektionseffizienz
Die Transfektionseffizienzen in unterschiedlichen Zelltypen werden durch die Identitäten der lipophilen Kettenlängen und derjenigen der Heteroatomeinheit beeinflusst. Aus diesem Grund werden die Transfektionseffizienzen von Cytofectinen auf Piperazinbasis, die sich in der Kettenlänge von lipophilen Gruppen und Heteroatomgruppen unterscheiden, in dem Intralungentest verglichen. Der Intralungentest wurde wie im vorstehenden Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. 6 zeigt die Ergebnisse.
Unter den Cytofectinen auf Piperazinbasis, die eine primäre Amingruppe haben, wurde die größte Transfektionseffizienz mit GA-LOE erhalten. GA-MOE und GA-DOE, die sich von GA-LOE nur durch die Länge der lipophilen Kette unterscheiden, zeigten eine geringere Wirkung, jedoch war GA-MOE wirksamer als DNA alleine.
Gleichermaßen, wie die Kettenlänge des primären Amins anstieg, verminderte sich die Transfektionseffizienz. GA-LOE zeigte eine größer Wirkung als DA-LOE, während DA-LOE wirksamer war als FA-LOE oder HA-LOE. Alle der getesteten Cytofectine auf Piperazinbasis waren wirksamer als DNA alleine.
Unter den Cytofectinen auf Piperazinbasis mit einer Alkoholgruppe an der Heteroatomeinheit war HE-LOE das wirksamste. Jedoch waren bei dem Intralungentest die Cytofectine mit einem primären Amin wirksamer als diejenigen mit einer Alkoholgruppe.
BEISPIEL 6
Allgemeiner subkutaner Tumortransfektionstest
Es wurden Tumore erzeugt, indem eine Suspension von Tumorzellen in die Seite von Mäusen eines Stammes injiziert wurden, der mit dem spezifischen Tumortyp kompatibel ist. Die Tumore wurden in periodischen Zeitabständen gemessen. Wenn sie einmal eine für eine Injektion geeignete Größe hatten, wurde das Tumorvolumen näherungsweise auf der Grundlage des gemessenen Durchmessers bestimmt, wobei ein kugelförmiger Tumor angenommen wurde. Ein Komplex des zu bewertenden Cytofectins mit einem Plasmid, das ein Reportergen kodiert, in einem Volumen an Kochsalzlösung, das gleich dem Volumen des zu behandelnden Tumors ist, wird dann in einer für den einzelnen Tumortyp optimierten Flussrate injiziert. Nach einer geeigneten Zeit werden die Tumore gesammelt, gefroren und dann gemahlen. Das Reportergenprodukt wird anschließend extrahiert und die Wirkung wird wie vorstehend beschreiben quantifiziert.
BEISPIEL 7
Analyse von Cytofectinen auf Piperazinbasis in dem subkutanen Tumortransfektionstest und dem intraperitonealen Transfektionstest
Die Transfektionseffizienzen von GAP-DLRIE und GA-LOE-BP wurden relativ zu derjenigen von DNA alleine in dem subkutanen Tumortransfektionstest und dem intraperitonealen Transfektionstest gemessen. Der intraperitoneale Test wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Der subkutane Tumortest wurde wie im vorstehenden Beispiel 6 beschrieben unter Verwendung von B16-Melanomazellen von Mäusen durchgeführt.
Die Ergebnisse werden in 7 gezeigt. In dem subkutanen Tumortest ergab GA-LOE-BP eine größere Transfektionseffizienz als GAP-DLRIE. Die Transfektionseffizienzen sowohl von GAP-DLRIE als auch von GA-LOE-BP waren größer als diejenigen die mit dem Plasmid alleine beobachtet wurden.
Bei dem intraperitonealen Test war GA-LOE-BP weniger effizient als GAP-DLRIE, jedoch erhöhten sowohl GA-LOE-BP als auch GAP-DLRIE die Transfektionseffizienzen relativ zu dem Plasmid alleine.
BEISPIEL 8
Subkutanes Renca-Tumormodell
Renca-Tumore wurden in 90% RMPI 1649/10% fötalem Rinderserum vermehrt. Die Tumore wurde subkutan in die Seite von BALB/C-Mäusen in einer Menge von 75 μl einer Suspension von etwa 10⁶ Zellen/ml Gewebekulturmedium injiziert. Wenn die Tumore einen Durchmesser von 4,5 bis 7 mm erreicht hatten, wurde das Volumen eines jeden einzelnen Tumor berechnet, indem der Durchmesser des Tumor gemessen und ein kugelförmiger Tumor angenommen wurde. In jeden einzelnen Tumor wird ein Volumen des Cytofectin/Plasmid-Komplexes in Kochsalzlösung, das äquivalent zu dem Tumorvolumen ist, in einer Rate von 2 ml/Minute injiziert. Nach 48 Stunden werden die Tumore gesammelt, gefroren, gemahlen und dann mit 1,5 ml Extraktionspuffer wie in Beispiel 3 beschrieben extrahiert. Die CAT-Wirkung wird, wie in Beispiel 3 beschrieben, quantifiziert.
BEISPIEL 9
Intraarterieller Test
Der arterielle Gentransfer wird wie folgt in Yorkshire-Schweinen oder Kaninchen durchgeführt. Der arterielle Gentransfer wird, wie von Nabel, Science 249: 1285–1288 (1990) beschrieben, in der rechten und der linken Iliofemoralarterie eines jeden Schweins durchgeführt. Kurz zusammengefasst werden nach einer Anästhesie die rechte und die linke Iliofemoralarterie durch Operation freigelegt und in jeder Arterie wird ein doppelter Ballonkatheter (USCI) positioniert. Die Arterie wird verletzt, indem der proximate Ballon 1 Minute auf 500 mm Hg aufgeblasen wird. Der Katheter wird dann erneut positioniert, um den Gentransfer in das verletzte Gebiet der Arterie durchzuführen. Das Arteriensegment wird mit einer Vektorlösung, die aus dem zu testenden Cytofectin, der Vektor-DNA und Opti-MEM (Gibco/BRL) gespült. Ein Gemisch aus 100 μg DNA und 300 μg Lipid wird eingeträufelt. Die Vektorlösung wird 20 Minuten bei 150 mm Hg an den Ort der Verletzung eingeträufelt. Auf das Einträufeln folgend, wird der Katheter entfernt und das Tier kann sich erholen. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion werden die Arterien entfernt. Das Gewebe wird zerdrückt, indem ein Glaspistill und anschließend ein dreimaliges Einfrieren/Auftauen-Verfahren verwendet wurde. Die Proben werden 10 Minuten bei 65°C inkubiert, um endogene Acetylase zu inaktivieren. Die Proteine werden extrahiert und ihre Konzentration wird unter Verwendung eines kalorimetrischen Tests (Bio-Rad, Hercules, CA) bestimmt. Bei jedem Test werden nach dem Verfahren, das vorstehend in Beispiel 3 beschrieben wurde, unter Verwendung eines Inkubationszeitraums von 4 Stunden 200 μg Gesamtprotein auf CAT-Wirkung getestet.
BEISPIEL 10
Gentransfer in Schweinearterien und atherosklerotische Kaninchenarterien
Die Liposomtransfektion von Schweine- oder Kaninchenarterien wird, wie beschrieben (Nabel, et al. Science 249: 1285–1288 (1990)) durch Anästhesie, Intubation und Freilegung der Iliofemoralarterien durchgeführt. Ein doppelter Ballonkatheter wird in die Iliofemoralarterie eingebracht und der proximate Ballon wird 5 Minuten auf 500 mm Hg aufgeblasen. Der Ballon wird entlüftet und der Katheter wird so weiter verschoben, das der mittlere Raum zwischen dem proximalen und distalen Ballon mit heparinisierter Kochsalzlösung gespült wird. Die CAT-DNA-Lösung (CAT-DNA ± Cytofectin) wird 20 Minuten in den mittleren Raum des Katheters eingeträufelt. Der Katheter wird entfernt und der antigradielle Blutfluss wird wiederhergestellt. Die Arterien werden zwei Tage später auf rekombinante CAT-Expression analysiert. Die Arterien, die mit CAT-DNA in Gegenwart von kationischen Lipiden transfiziert wurden, zeigen eine wesentliche Steigerung bei der CAT-Genexpression, verglichen mit den Arterien, die mit DNA alleine in Kontakt gebracht wurden.
Der in vivo-Gentransfer von atherosklerotischen Ilioarterien von Kaninchen wird durchgeführt, indem ein doppeltes Verletzungsmodell verwendet wird, wie es von Faxon et al. (Arteriosclerosis, 4: 189–195, 1984) beschrieben wurde. Nachdem die zweite Angioplastieverletzung vollständig ist, wird der Angioplastieballon leicht verschoben, so dass sich der am Ende befindliche Infusionsanschluss des Katheters am proximalen Ende der Verletzung ist. Es wird eine Ligatur am distalen Ende der Verletzung angebracht, das verletzte Segment wird mit heparinisierter Kochsalzlösung gespült und Liposomlösung aus CAT-DNA ± kationischem Lipid wird 20 Minuten in das isolierte verletzte Segment eingeträufelt. Der Katheter wird entfernt und der antigradielle Blutfluss wird wiederhergestellt. Die Arterien werden zwei Tage später auf rekombinante CAT-Expression analysiert. Dieser Test veranschaulicht ein anderes Screeningverfahren, um die Struktur eines bestimmten Cytofectins für ein bestimmtes Gewebe zu optimieren.
BEISPIEL 11
Intramuskulärer Test
In die Quadriceps von fixierten, wachen Mäusen werden unter Verwendung einer sterilen Einweginsulinspritze aus Plastik, die mit einer 28G 1/2-Nadel (Becton-Dickinson) und einer aus einer gelben Eppendorf-Mikropipettenspitze geschnittenen Plastikmanschette ausgestattet ist, 50 μg Luciferase oder CAT-DNA ± Cytofectin in 50 μl USP-Kochsalzlösung injiziert. Die Manschettenlänge wird eingestellt, um das Eindringen der Nadelöffnung in den mittleren Teil des Rectus femoris-muskes mit 3 mm Durchmesser auf etwa 2 mm zu beschränken. Die Injektionsflüssigkeiten und Spritzen werden auf Raumtemperatur auilibiert und die Verabreichung der einmaligen Volumeneinheit von 50 μl Kochsalz-DNA benötigt wenige Sekunden. Die gesamte Quadriceps-Muskelgruppe (140–180 mg Nassgewicht) wird von jedem Mäusebein zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Injektion gesammelt. Die Muskeln werden eingefroren und wie in Beispiel 2 beschrieben lysiert.
Die Luciferaseeffektivität wird unter Verwendung eines automatisierten Mikroplatten-Luminometers (Dynatech Model ML2250) getestet. Einhundert μl Luciferasesubstrat werden durch das Injektionssystem des Luminometers zu 20 μl Extrakt gegeben und die Lichteinheiten der Proben werden aufgezeichnet. Der Luciferasegehalt der Proben wird aus den relativen Lichteinheiten unter Verwendung einer Standardkurve von gereinigter Glühwürmchen-Luciferase in Gegenwart von Muskelextrakt, in den nicht injiziert wurde, berechnet. Die in dem Muskelextrakt, in den injiziert wurde, vorhandene Luciferasewirkung ist viel höher als diejenige im Muskelextrakt, in den nicht injiziert wurde.
Dieser Test veranschaulicht ein anderes Screeningverfahren, um die Struktur eines bestimmten Cytofectins für ein bestimmtes Gewebe zu optimieren.
Ohne weitere Ausführungen wird angenommen, dass ein Fachmann unter Verwendung der vorstehenden Beschreibung die Erfindung in vollstem Umfang nutzen kann. Die Erfindung kann in anderen spezifische Formen enthalten sein, ohne vom Geist ihrer wesentlichen Charakteristika abzuweichen. Die beschriebenen Ausführungsformen sollen in jeder Hinsicht nur als beschreibend und nicht als einschränkend erachtet werden, und der Umfang der Erfindung wird daher eher durch die beigefügten Ansprüche als durch die vorstehende Beschreibung angegeben. Alle Modifikationen, die innerhalb der Bedeutung und dem Bereich der rechtlichen Gleichwertigkeit der Ansprüche auftreten, sollen in deren Umfang einbezogen sein.

Claims

Cytofectin auf Piperazinbasis mit der folgenden Struktur:
wobei R₁ und R₄ unabhängig lineare oder verzweigte C₁₀-, C₁₂- oder C₁₄-Reste sind, wobei die Reste Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste sind, wobei die Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste 0 bis 6 Stellen mit Nichtsättigung aufweisen, 0 bis 5 Heteroatome enthalten oder cyclische oder Arylreste enthalten, wobei die cyclischen oder Arylreste 0 bis 5 Heteroatome enthalten; R₂ ein linearer C₁-C₂₃-Rest oder ein verzweigter C₁-C₂₃-Rest ist, wobei die linearen oder verzweigten C₁-C₂₃-Reste Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste sind, wobei die Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste 0 bis 6 Stellen mit Nichtsättigung aufweisen, 0 bis 5 Heteroatome enthalten oder cyclische oder Arylreste enthalten, wobei die cyclischen oder Arylreste 0 bis 5 Heteroatome enthalten; R₃ ein Wasserstoffatom ist, R₂ wie oben definiert, eine Aminosäure, ein Peptid, Polypeptid, Protein, eine Nucleinsäure, ein Nucleotid, Nucleosid, Polynucleotid, Polynucleosid, Monosaccharid, Disaccharid, Polysaccharid, eine biologisch wirksame Substanz, ein Arzneimittel oder ein Rest mit der folgenden Struktur ist:
wobei R₇ bis R₁₂ unabhängig abwesend, ein Wasserstoffatom, eine Aminosäure, ein Nucleotid, Polynucleotid, Monosaccharid, Disaccharid, Polysaccharid, eine biologisch wirksame Substanz, ein Arzneimittel, lineare C₁-C₂₃-Reste oder verzweigte C₁-C₂₃-Reste sind, wobei die linearen oder verzweigten C₁-C₂₃-Reste Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste sind, wobei die Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste 0 bis 6 Stellen mit Nichtsättigung aufweisen, 0 bis 5 Heteroatome enthalten oder cyclische oder Arylreste enthalten, wobei die cyclischen oder Arylreste 0 bis 5 Heteroatome enthalten; G abwesend, O, N, NH, S, SH, Se, C, CH oder CR₁ ist; T gleich O, N, S, Se oder C ist; A gleich O, N, S, Se oder C ist; Y₁ und Y₂ unabhängig O, N, NH, S oder Se sind; X₁ gleich O, N, NH, S oder Se ist; m und p unabhängig 1 bis 6 sind; und W ein pharmazeutisch verträgliches Anion ist.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 1, wobei m und p gleich 2 sind.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 2, wobei Y₁ und Y₂ gleich O sind.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 3, wobei R₁ und R₄ aus C₁₀H₂₁, C₁₂H₂₅ und C₁₄H₂₉ ausgewählt sind.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 4, wobei R₂ aus abwesend, CH₂, (CH₂)₂, (CH₂)₃, (CH₂)₄, (CH₂)₅ und (CH₂)₆ ausgewählt ist.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 5, wobei X₁ aus NH und O ausgewählt ist.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 6, wobei X₁ gleich NH ist und R₃ aus H, CO-NH-CH₃ und CO-CH₂-NH₂ ausgewählt ist.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 6, wobei X₁ gleich O ist und R₃ gleich H ist.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 6, wobei R₃ gleich H ist.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 6, wobei R₂ gleich (CH₂)₂ ist, X₁ gleich O ist und R₃ gleich H ist.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 6, wobei R₂ gleich (CH₂)₃ ist, X₁ gleich NH ist und R₃ gleich H ist.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 6, wobei R₂ gleich (CH₂)₄ ist, X₁ gleich NH ist und R₃ gleich H ist.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 6, wobei R₂ gleich (CH₂)₅ ist, X₁ gleich NH ist und R₃ gleich H ist.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 6, wobei R₂ gleich (CH₂)₆ ist, X₁ gleich NH ist und R₃ gleich H ist.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 6, wobei R₂ gleich (CH₂)₃ ist, X₁ gleich NH ist und R₃ gleich CO-CH₂-NH₂ ist.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 6, wobei R₂ gleich (CH₂)₃ ist, X₁ gleich NH ist und R₃ gleich CO-NH-CH₃ ist.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 6, wobei R₂ gleich (CH₂)₃ ist, X₁ gleich NH ist und R₃ gleich CO-CH(NH₂)CH₂-CH₂NH₂ ist.
Cytofectin auf Piperazinbasis mit der folgenden Struktur:
wobei R₁ und R₄ unabhängig lineare oder verzweigte C₁₀-, C₁₂- oder C₁₄-Reste sind, wobei die Reste Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste sind, wobei die Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteralkylreste 0 bis 6 Stellen mit Nichtsättigung aufweisen, 0 bis 5 Heteroatome enthalten oder cyclische oder Arylreste enthalten, wobei die cyclischen oder Arylreste 0 bis 5 Heteroatome enthalten; R₂ und R₅ unabhängig H, lineare C₁-C₂₃-Reste oder verzweigte C₁-C₂₃-Reste sind, wobei die linearen oder verzweigten C₁-C₂₃-Reste Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste sind, wobei die Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste 0 bis 6 Stellen mit Nichtsättigung aufweisen, 0 bis 5 Heteroatome enthalten oder cyclische oder Arylreste enthalten, wobei die cyclischen oder Arylreste 0 bis 5 Heteroatome enthalten; R₃ und R₆ jeweils unabhängig Wasserstoffatome sind, R₂ wie oben definiert, eine Aminosäure, ein Peptid, Polypeptid, Protein, eine Nucleinsäure, ein Nucleotid, Nucleotid, Polynucleotid, Polynucleotid, Monosaccharid, Disaccharid, Polysaccharid, eine biologisch wirksame Substanz, ein Arzneimittel oder ein Rest mit der folgenden Struktur ist:
wobei R₇ bis R₁₂ unabhängig abwesend, H, eine Aminosäure, ein Nucleotid, Polynucleotid, Monosaccharid, Disaccharid, Polysaccharid, eine biologisch wirksame Substanz, ein Arzneimittel, lineare C₁-C₂₃-Reste oder verzweigte C₁-C₂₃-Reste sind, wobei die linearen oder verzweigten C₁-C₂₃-Reste Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste sind, wobei die Alkyl-, Acyl-, Alken- oder Heteroalkylreste 0 bis 6 Stellen mit Nichtsättigung aufweisen, 0 bis 5 Heteroatome enthalten oder cyclische oder Arylreste enthalten, wobei die cyclischen oder Arylreste 0 bis 5 Heteroatome enthalten; G abwesend, O, N, NH, S, SH, Se, C, CH oder CR₁ ist; T gleich O, N, S, Se oder C ist; A gleich O, N, S, Se oder C ist; Y₁ und Y₂ unabhängig O, N, NH, S oder Se sind; X₁ und X₂ unabhängig abwesend, O, N, NH, S oder Se sind; m und p unabhängig 1 bis 6 sind; W ein pharmazeutisch verträgliches Anion ist; wobei entweder X₁ oder X₂ vorhanden ist oder sowohl X₁ als auch X₂ vorhanden sind.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 18, wobei sowohl X₁ als auch X₂ vorhanden sind.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 18, wobei entweder X₁ oder X₂, aber nicht beide, vorhanden sind.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 18, wobei m und p 2 sind.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 21, wobei Y₁ und Y₂ gleich O sind.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 22, wobei R₅ und R₂ aus abwesend, CH₂, (CH₂)₂, (CH₂)₃, (CH₂)₄, (CH₂)₅ und (CH₂)₆ ausgewählt sind.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 23, wobei R₁ und R₄ aus C₁₀H₂₁, C₁₂H₂₅ und C₁₄H₂₉ ausgewählt sind.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 24, wobei X₁ und X₂ aus abwesend, NH und O ausgewählt sind.
Cytofectine auf Piperazinbasis nach Anspruch 25, wobei R₁ und R₄ gleich C₁₂H₂₅ sind, R₂ gleich CH₂ ist; X₁ abwesend ist, R₃ gleich H ist, R₅ gleich CH₂CH₂CH₂ ist, X₂ gleich NH ist und R₆ gleich H ist.
In vitro-Verfahren zum Einbringen eines Moleküls in eine Zelle, umfassend die Schritte (a) Kontaktieren des Moleküls mit einer wirksamen Menge eines der kationischen Lipide nach einem der Ansprüche 1 bis 26 zur Bildung eines Komplexes mit dem Lipid; und (b) Kontaktieren einer Zelle unter in vitro-Bedingungen mit dem in Schritt (a) gebildeten Lipid-Komplex; wodurch eine biologisch wirksame Menge des Moleküls in die Zelle eingebracht wird.
Verwendung eines kationischen Lipids nach einem der Ansprüche 1 bis 26 zur Herstellung eines Komplexes mit einem in eine Zelle einzubringenden Molekül, wodurch bei Kontakt der Zelle mit dem Komplex das Molekül in die Zelle eingebracht wird.
Verfahren oder Verwendung nach den Ansprüchen 27 oder 28, wobei das Molekül ein anionisches Molekül ist.
Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei der Komplex weiter ein oder mehrere Lipide zusätzlich zu den kationischen Lipiden nach einem der Ansprüche 1 bis 26 beinhaltet.
Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 30, wobei die Lipide zusätzlich zu den kationischen Lipiden nach einem der Ansprüche 1 bis 26 aus neutralen Lipiden, Phospholipiden und Cholesterin ausgewählt sind.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die Zelle unter in vitro-Bedingungen kontaktiert wird.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die Zelle unter in vivo-Bedingungen kontaktiert wird.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei die Zellen in einem Test, ausgewählt aus Lungentransfektionstests bei Mäusen, intraperitonealen Tumortests bei Mäusen, intramuskulären Tests bei Mäusen, intraarteriellen Tests bei Schweinen, intraarteriellen Tests bei Kaninchen, Renca-Tumortests oder subkutanen Tumortests, eingesetzt werden.
Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 34, wobei das anionische Molekül mRNA ist.
Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 34, wobei das anionische Molekül DNA ist.
Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 26 zur Verwendung beim Einbringen eines Moleküls in eine Zelle.